ES2395032B1

ES2395032B1 - PHENOLIC EXTRACT OF THE SUBPRODUCTS OF THE OLIVE THERMALLY TREATED.

Info

Publication number: ES2395032B1
Application number: ES201131041A
Authority: ES
Inventors: Juan FERNÁNDEZ -BOLAÑOS GUZMÁN; Guillermo RODRÍGUEZ GUTIÉRRREZ; Antonio Lama Muñoz; Fátima SENENT RUBIO
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2013-12-13
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: ES2395032A1; WO2012175771A1

Abstract

Extracto fen?lico de los subproductos de la aceituna tratados t?rmicamente.#Es objeto de esta invenci?n un extracto fen?lico obtenido a partir de subproductos derivados de la extracci?n del aceite de oliva y/o de la industria de aderezo de la aceituna, caracterizado porque comprende una composici?n media en alcoholes fen?licos totales por encima del 5% en peso seco y una composici?n media en ?cidos fen?licos totales por encima del 0.3% en peso seco. Asimismo, es objeto de la invenci?n el proceso de obtenci?n de dicho extracto y su uso como antioxidante para la preparaci?n de preparados con uso alimentario, cosm?tico y/o farmace?tico, como agente inhibitorio de la acci?n de la enzima L-tirosinasa, o como agente inhibitorio de la agregaci?n plaquetaria en la prevenci?n de enfermedades coronarias. Finalmente, es objeto de la invenci?n una fracci?n o fracciones parcial o totalmente aisladas obtenibles a partir de dicho extracto fen?lico.Phenolic extract of the by-products of the olive treated chemically. # A subject of this invention is a phenolic extract obtained from by-products derived from the extraction of olive oil and / or from the olive oil industry. olive dressing, characterized in that it comprises an average composition in total phenolic alcohols above 5% by dry weight and an average composition in total phenolic acids above 0.3% by dry weight. Likewise, the process of obtaining said extract and its use as an antioxidant for the preparation of preparations with food, cosmetic and / or pharmaceutical use, as an inhibitory agent of the action is object of the invention. ? of the enzyme L-tyrosinase, or as an inhibitory agent of platelet aggregation in the prevention of coronary heart disease. Finally, a partially or totally isolated fraction or fractions obtainable from said phenolic extract is the subject of the invention.

Description

Extracto fenólico de los subproductos de la aceituna tratados térmicamente Phenolic extract of thermally treated olive by-products

Technical sector

La presente solicitud está dirigida al sector de la alimentación, farmacéutico, de la cosmética y de la agricultura. The present application is addressed to the food, pharmaceutical, cosmetics and agriculture sector.

State of the art

Recientes estudios demuestran que los fenoles son poderosos antioxidantes y poseen otras actividades biológicas que podrían explicar en parte los efectos saludables observados en la dieta Mediterránea. Estos compuestos también juegan un importante papel en la estabilidad, inhibiendo la peroxidación lipídica, y en las propiedades químicas y organolépticas de los productos de las aceitunas (aceite de oliva y aceituna de mesa), y tienen significativos efectos nutricionales, fisiológicos y farmacéuticos sobre la salud humana. Estudios epidemiológicos han asociado la baja incidencia de enfermedades coronarias, ateroesclerosis, y algunos tipos de cáncer (pecho y colon) con el consumo de aceite de oliva en la dieta Mediterránea (López-Miranda, J. et al., (2010), Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 20, 284-294). La ingesta habitual de aceite de oliva proporciona un continuo aporte de antioxidantes, que pueden reducir el estrés oxidativo en el cuerpo humano. Numerosos estudios relacionan los efectos beneficiosos del aceite de oliva, con una gran variedad de antioxidantes fenólicos (fenoles simples, secoroideos, flavonoides, lignanos), y su contenido fenólico. Todas estas sustancias son potentes inhibidores del ataque de especies de oxígeno reactivas y en la actualidad hay evidencias que ponen de manifiesto que las especies oxidantes (oxígeno activo, radicales libres, etc.) están implicadas en la etiología de enfermedades tales como el cáncer (Menéndez,J.A. et al., (2007), BMC Cancer, 7, 80). Además, incrementan los niveles de disponibilidad de óxido nítrico, suprimen la agregación plaquetaria, disminuyen la presencia de moléculas de adhesión y promueven el contenido fenólico total de las LDL retrasando así su oxidación y, por tanto, la formación y el crecimiento de la placa de ateroma. Recent studies show that phenols are powerful antioxidants and have other biological activities that could partly explain the healthy effects observed in the Mediterranean diet. These compounds also play an important role in stability, inhibiting lipid peroxidation, and in the chemical and organoleptic properties of olive products (olive oil and table olives), and have significant nutritional, physiological and pharmaceutical effects on the Human health. Epidemiological studies have associated the low incidence of coronary heart disease, atherosclerosis, and some types of cancer (breast and colon) with the consumption of olive oil in the Mediterranean diet (López-Miranda, J. et al., (2010), Nutrition , Metabolism & Cardiovascular Diseases, 20, 284-294). The usual intake of olive oil provides a continuous supply of antioxidants, which can reduce oxidative stress in the human body. Numerous studies relate the beneficial effects of olive oil, with a wide variety of phenolic antioxidants (simple phenols, secoroids, flavonoids, lignans), and their phenolic content. All these substances are potent inhibitors of the attack of reactive oxygen species and at present there are evidences that show that the oxidizing species (active oxygen, free radicals, etc.) are involved in the etiology of diseases such as cancer (Menéndez , JA et al., (2007), BMC Cancer, 7, 80). In addition, they increase the levels of nitric oxide availability, suppress platelet aggregation, decrease the presence of adhesion molecules and promote the total phenolic content of LDL thus delaying their oxidation and, therefore, the formation and growth of the plaque. atheroma

Las aceitunas poseen una composición fenólica característica. La existencia y cantidad de fenoles específicos en la aceituna dependen de la variedad y estado de madurez, condiciones climáticas, estacionales y geográficas. Sólo una pequeña cantidad (1-2%) entran a formar parte de la fase oleosa durante la extracción del aceite de oliva mientras que el resto permanece en el residuo o alperujo (Rodis, P.S., Karathanos, V.T. y Mantzavinou, A. (2002), J. Agric. Food Chem., 50, 596–601). Hasta el momento el alperujo no ha sido adecuadamente explotado debido en cierta manera a la dificultad que entraña su manipulación. Por lo tanto, la extracción de estos fenoles como productos de alto valor añadido podría ser considerada como una interesante alternativa para hacer provechosos los residuos de almazaras. Se han desarrollado y patentado diversos métodos y sistemas encaminados a la obtención de extractos que contienen compuestos fenólicos desde la aceituna y sus subproductos, así como la purificación de algunos de ellos (hidroxitirosol, tirosol y oleuropeína fundamentalmente). Olives have a characteristic phenolic composition. The existence and quantity of specific phenols in the olive depend on the variety and state of maturity, climatic, seasonal and geographical conditions. Only a small amount (1-2%) become part of the oil phase during the extraction of olive oil while the rest remains in the residue or alperujo (Rodis, PS, Karathanos, VT and Mantzavinou, A. (2002 ), J. Agric. Food Chem., 50, 596–601). So far the alperujo has not been properly exploited due in some way to the difficulty involved in its manipulation. Therefore, the extraction of these phenols as high value-added products could be considered as an interesting alternative to make mill waste profitable. Various methods and systems have been developed and patented to obtain extracts containing phenolic compounds from the olive and its by-products, as well as the purification of some of them (hydroxytyrosol, tyrosol and oleuropein mainly).

En muchos casos se utilizan técnicas de extracción con solvente o procedimientos de separación y concentración selectiva por ultrafiltración, ósmosis inversa, evaporación, separación cromatográfica y extracción de fluidos supercríticos, a partir tanto de las aguas de vegetación separadas del alperujo, como de las aguas de procesado de la aceituna de mesa. Estas técnicas pueden ser usadas individualmente o de modo integrado. Así, después de efectuar una ultrafiltración de las aguas generadas en el procesado de la aceituna de mesa se procedía a efectuar un proceso de adsorción en resina no iónica (tipo XAD) para obtener un extracto rico en hidroxitirosol (ES 2186467). También se han descrito técnicas de separación por membrana de microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración y ósmosis inversa, seguido de un proceso de purificación en columna (US 2006/0070953). In many cases solvent extraction techniques or separation and selective concentration procedures by ultrafiltration, reverse osmosis, evaporation, chromatographic separation and extraction of supercritical fluids are used, both from the vegetation waters separated from the alperujo, and from the waters of Table olive processing. These techniques can be used individually or in an integrated way. Thus, after ultrafiltration of the waters generated in the processing of the table olive, an adsorption process was carried out on non-ionic resin (type XAD) to obtain an extract rich in hydroxytyrosol (ES 2186467). Microfiltration membrane separation, ultrafiltration, nanofiltration and reverse osmosis techniques have also been described, followed by a column purification process (US 2006/0070953).

Otros procedimientos emplean una extracción sólido-líquido sometiendo directamente el alperujo a una extracción con una mezcla de etanol-agua, para posteriormente la fase orgánica ser sometida a una extracción en fluido supercrítico (WO 2007/013032). Por otro lado también se obtienen extractos de hidroxitirosol a partir de las aguas de vegetación de la aceituna mediante fluidos supercríticos, tal como el dióxido de carbono (US 2002/0198415). Other procedures employ a solid-liquid extraction by directly subjecting the alperujo to an extraction with a mixture of ethanol-water, and then the organic phase is subjected to a supercritical fluid extraction (WO 2007/013032). On the other hand, hydroxytyrosol extracts are also obtained from the vegetation waters of the olive by means of supercritical fluids, such as carbon dioxide (US 2002/0198415).

Uno de los procedimientos más simple, práctico y económico de los descritos es el que permite obtener un hidroxitirosol con alto grado de pureza a partir de cualquier fuente acuosa (alpechín, fase acuosa del proceso hidrotérmico del alperujo, agua de lavado de la elaboración de las aceitunas de mesa, etc.) mediante una cromatografía en dos pasos, una primera con una resina de intercambio iónico y una segunda con una resina adsorbente del tipo XAD (US 2004/0102657). One of the most simple, practical and economical procedures described is that which allows a hydroxytyrosol with a high degree of purity to be obtained from any aqueous source (alpechin, aqueous phase of the hydrothermal process of the alperujo, wash water from the preparation of table olives, etc.) by two-step chromatography, a first with an ion exchange resin and a second with an XAD type adsorbent resin (US 2004/0102657).

También se ha descrito la extracción del aglicón de la oleuropeína a partir del alpechín mediante una extracción con hexano:acetona (50/50, v:v) (US 2005/01037111), así como otros procedimientos que permiten obtener extractos polifenólicos mediante extracciones líquido-líquido a partir de productos derivados de la aceituna (concentrado de alpechín o fase acuosa de las aceitunas), utilizando acetato de etilo (ES 2051238) o mezcla de acetato de etilo y etanol o acetato de etilo, etanol y agua (ES 2311401) para posteriormente llevar a cabo tratamientos de la fase orgánica con una cromatografía It has also been described the extraction of oleuropein aglycon from the vegetable water by an extraction with hexane: acetone (50/50, v: v) (US 2005/01037111), as well as other procedures that allow obtaining polyphenolic extracts by liquid extractions - liquid from products derived from the olive (concentrate of alpechin or aqueous phase of the olives), using ethyl acetate (ES 2051238) or mixture of ethyl acetate and ethanol or ethyl acetate, ethanol and water (ES 2311401) to subsequently carry out treatments of the organic phase with chromatography

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de alta eficacia en fase reversa en el caso de la primera invención o en una resina del tipo XAD para la segunda, que permiten obtener unos extractos con una alta concentración de hidroxitirosol. High efficiency in the reverse phase in the case of the first invention or in a resin of the XAD type for the second, which allows to obtain extracts with a high concentration of hydroxytyrosol.

Descripción de la invención Description of the invention

El objeto de la presente invención es un nuevo extracto procedente de los residuos o subproductos generados a partir de la extracción del aceite de oliva o de la aceituna de mesa, una vez éstos han sido sometidos a un tratamiento térmico. The object of the present invention is a new extract from residues or by-products generated from the extraction of olive oil or table olives, once they have undergone a heat treatment.

El nuevo extracto posee un contenido fenólico distinto a los extractos que se puedan obtener a partir de los mismos subproductos sin tratar térmicamente, y se caracteriza por aumentar significativamente ciertos fenoles y además por la presencia de compuestos que se forman durante dicho tratamiento y que contribuyen en gran medida a la mejora de sus propiedades (antioxidantes, anti-inflamatorias, secuestrante de radicales libres, etc.). The new extract has a phenolic content different from the extracts that can be obtained from the same by-products without heat treatment, and is characterized by significantly increasing certain phenols and also by the presence of compounds that are formed during said treatment and that contribute to greatly to the improvement of its properties (antioxidants, anti-inflammatory, free radical sequestrant, etc.).

La aplicación de determinados procesos, como es el caso de tratamientos térmicos, ayuda a la solubilización de los fenoles y con ello facilita su posterior extracción. Se han estudiado procedimientos en un alto rango de temperaturas que facilitan sustancialmente no sólo la liberación de los fenoles y otros compuestos interesantes, sino que además, favorecen la hidrólisis en fenoles más simples y la aparición de otros nuevos con un alto valor añadido. The application of certain processes, such as thermal treatments, helps the solubilization of phenols and thus facilitates their subsequent extraction. Procedures have been studied in a high temperature range that substantially facilitate not only the release of phenols and other interesting compounds, but also favor hydrolysis in simpler phenols and the appearance of new ones with a high added value.

La novedad de la aplicación de tratamientos térmicos radica en la obtención de un extracto fenólico con una mayor cantidad de fenoles simples y nuevos, favorecido por el tratamiento térmico, al mismo tiempo que facilita la separación de fases y con ello se simplifica la extracción. A partir del extracto fenólico se pueden llegar a obtener distintas fracciones ricas en diferentes tipos de fenoles que proporcionan una amplia variedad de propiedades, o incluso aislar determinados compuestos de alto valor añadido. The novelty of the application of heat treatments lies in obtaining a phenolic extract with a greater amount of simple and new phenols, favored by heat treatment, while facilitating phase separation and thereby simplifying extraction. From the phenolic extract different fractions rich in different types of phenols can be obtained that provide a wide variety of properties, or even isolate certain compounds of high added value.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Partiendo de cualquier tipo de subproducto del aceite de oliva o de la industria de aderezo, ya sea el caso del alperujo, alpechín, orujo, mezcla de ellos, o salmueras, la aplicación de un tratamiento térmico favorece sustancialmente a la posterior extracción de compuestos fenólicos y de interés presentes en los mismos. Durante el tratamiento no sólo se facilita la extracción sino también la formación de nuevos y activos compuestos al mismo tiempo que se hidrolizan fenoles en su forma más activa. El resultado final es un extracto enriquecido en compuestos bioactivos y con una mayor actividad antioxidante que un extracto obtenido a partir de un subproducto del aceite de oliva sin tratar térmicamente. Starting from any type of by-product of olive oil or from the dressing industry, be it the case of alperujo, alpechín, orujo, mixture of them, or brines, the application of a thermal treatment substantially favors the subsequent extraction of phenolic compounds and of interest present in them. During the treatment not only the extraction is facilitated but also the formation of new and active compounds while hydrolyzing phenols in their most active form. The final result is an extract enriched in bioactive compounds and with a greater antioxidant activity than an extract obtained from a byproduct of olive oil without heat treatment.

La masa de subproducto se trata en un rango de temperatura de entre 50ºC y 250ºC, más preferentemente entre 70ºC y 200ºC, por aporte directo o indirecto de calor, ya sea a través de una entrada de vapor u otro gas inerte, o bien a través de una camisa calefactora o resistencia eléctrica que esté en contacto con el material a tratar. El tiempo de reacción puede ser muy variable dependiendo del tipo de calentamiento, la temperatura y diseño del reactor térmico, pero puede oscilar entre los dos minutos hasta tratamientos más largos de hasta 3 ó 5 horas. The by-product mass is treated in a temperature range of between 50 ° C and 250 ° C, more preferably between 70 ° C and 200 ° C, by direct or indirect heat input, either through a steam or other inert gas inlet, or through of a heating jacket or electrical resistance that is in contact with the material to be treated. The reaction time can vary greatly depending on the type of heating, temperature and design of the thermal reactor, but it can range from two minutes to longer treatments of up to 3 or 5 hours.

Tras el tratamiento térmico puede procederse a una separación sólido-líquido con el fin de obtener el extracto de cada fase por separado, o bien se puede proceder a la obtención del extracto de ambas fases sin separarlas previamente. La separación facilita la extracción en el caso de llevarse ésta a cabo con disolventes orgánicos y es la vía para obtener el extracto concentrado de la fracción líquida como producto final rico en fenoles. After the heat treatment, a solid-liquid separation can be carried out in order to obtain the extract of each phase separately, or the extract of both phases can be obtained without previously separating them. The separation facilitates the extraction in the case of this being carried out with organic solvents and is the way to obtain the concentrated extract of the liquid fraction as the final product rich in phenols.

Por lo tanto se puede partir de cualquier subproducto de la aceituna, sólido o líquido. Therefore, it can be derived from any by-product of the olive, solid or liquid.

Breve descripción de las figuras Brief description of the figures

La Figura 1 muestra la inhibición de la agregación plaquetaria de un extracto de alperujo (EA) usando colágeno (a) y TRAP (b) como agentes agonistas o estimulantes de la agregación. La inhibición plaquetaria está expresada en % de disminución de las áreas bajo la curva control de agregación plaquetaria. El número de muestras n=12-13 incubaciones por test. Todos los valores muestran una alta inhibición estadísticamente significativa frente al control (p<0.05). (-) Valor promedio. Figure 1 shows the inhibition of platelet aggregation of an extract of alperujo (EA) using collagen (a) and TRAP (b) as agonist or aggregation stimulating agents. Platelet inhibition is expressed in% decrease in areas under the control curve of platelet aggregation. The number of samples n = 12-13 incubations per test. All values show a statistically significant high inhibition against control (p <0.05). (-) Average value.

Ejemplos de la invención Examples of the invention

A continuación se muestran a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo tratamientos térmicos aplicados a una muestra de alperujo como subproducto del aceite de oliva y la obtención a partir de los mismos del extracto fenólico. The following are illustrative and non-limiting examples of heat treatments applied to a sample of alperujo as a byproduct of olive oil and the obtaining thereof of the phenolic extract.

Ejemplo Example

Una muestra de 20 kg de alperujo fresco fue sometida a varios procesos de tratamientos térmicos. Las condiciones fueron en este caso de 160ºC durante 30, 60 y 90 minutos mediante un calentamiento directo con vapor de agua. A sample of 20 kg of fresh alperujo was subjected to several heat treatment processes. The conditions were in this case of 160 ° C for 30, 60 and 90 minutes by direct heating with steam.

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Tras dicho proceso se obtiene una fracción sólida y otra líquida que son separadas mediante centrifugación, obteniéndose 51 litros de fracción líquida. Se toma una alícuota de 10 litros de la fracción líquida y se concentra a 1 litro. Se extraen los compuestos apolares (grasa) con hexano (2x100 ml por cada 200 ml de fracción soluble). After said process, a solid and a liquid fraction are obtained, which are separated by centrifugation, obtaining 51 liters of liquid fraction. A 10-liter aliquot of the liquid fraction is taken and concentrated to 1 liter. The apolar compounds (fat) are extracted with hexane (2x100 ml per 200 ml of soluble fraction).

A continuación se procede a la extracción de los compuestos fenólicos, para ello se realiza una extracción en caliente 5 y a contracorriente con acetato de etilo durante 8 horas, empleándose 500 ml de acetato de etilo por cada 200 ml de muestra. De la fase orgánica se obtienen las cantidades señaladas en la tabla 1 de extracto fenólico seco (EF). Then the phenolic compounds are extracted, for this purpose a hot and countercurrent extraction is carried out with ethyl acetate for 8 hours, using 500 ml of ethyl acetate for every 200 ml of sample. The amounts indicated in Table 1 of dry phenolic extract (EF) are obtained from the organic phase.

La misma extracción se realiza directamente sobre la muestra original de alperujo sin tratar térmicamente (EFNT) para que sirva como control y poder establecer los efectos del tratamiento térmico: The same extraction is performed directly on the original sample of non-heat treated lupine (EFNT) to serve as a control and to establish the effects of heat treatment:

Para ello se somete el alperujo sin tratar a una extracción con etanol (EtOH) al 80% (v/v) en agua. Se parte de 2.690 To do this, the untreated alperujo is subjected to an extraction with 80% ethanol (EtOH) in water. Be part of 2,690

10 kg del alperujo fresco no tratado térmicamente, que ha sido previamente desgrasado con hexano. El alperujo desgrasado se pone en contacto bajo agitación suave con EtOH 80% a temperatura ambiente durante 30 minutos, empleando 15 ml de EtOH 80% por cada 10 g de alperujo, la extracción es repetida dos veces más, utilizando 10 ml de EtOH 80% por cada 10 g de alperujo. Las fracciones son filtradas a través de un filtro de papel en Buchner, reunidas y el EtOH es evaporado hasta obtener un extracto acuoso. Al concentrado obtenido se le extraen los compuestos fenólicos con acetato de etilo, para ello 10 kg of the fresh non-heat treated lupine, which has been previously defatted with hexane. The defatted lupine is brought into contact under gentle agitation with 80% EtOH at room temperature for 30 minutes, using 15 ml of 80% EtOH for every 10 g of lupine, the extraction is repeated twice more, using 10 ml of 80% EtOH for every 10 g of alperujo. The fractions are filtered through a paper filter in Buchner, combined and the EtOH is evaporated until an aqueous extract is obtained. To the concentrate obtained the phenolic compounds are extracted with ethyl acetate, for this

15 se realiza una extracción en caliente y a contracorriente con acetato de etilo durante 8 horas, se emplean 500 ml de acetato de etilo por cada 200 mL de muestra. De la fase orgánica se obtienen 15.56 g de extracto fenólico seco no tratado (EFNT). In a hot and countercurrent extraction with ethyl acetate for 8 hours, 500 ml of ethyl acetate are used per 200 mL of sample. From the organic phase 15.56 g of dry untreated phenolic extract (EFNT) are obtained.

La cantidad de extracto fenólico obtenido a partir del alperujo tratado y no tratado térmicamente se muestra en la tabla 1, en donde se aprecia un significativo aumento con el tratamiento. Tres de los extractos tratados más el control sin tratar han sido caracterizados en cuanto a su composición total en la tabla 2. The amount of phenolic extract obtained from the treated and non-heat treated lupine is shown in Table 1, where a significant increase can be seen with the treatment. Three of the extracts treated plus the untreated control have been characterized in terms of their total composition in Table 2.

20 Tabla 1. Gramos de extracto obtenido por kilogramo de alperujo fresco tratado o no térmicamente (AFNT). 20 Table 1. Grams of extract obtained per kilogram of fresh or non-thermally treated lupine (AFNT).

Sin tratar Without treating: Tratamiento térmico a 160ºC 160 ° C heat treatment

AFNT AFNT: 15(min) 30(min) 45(min) 60(min) 75(min) 90(min) 15 (min) 30 min) 45 (min) 60 (min) 75 (min) 90 (min)

5,784 5,784: 4,089 7,037 8,345 7,102 11,195 9,051 4,089 7,037 8,345 7,102 11,195 9,051

Tabla 2. Composición de los extractos fenólicos obtenidos a partir de un alperujo sin tratar (EFNT) y tratado a 160ºC para tres tiempos (n.d., no detectado). Fracción fenólica polimérica (FFP). Table 2. Composition of phenolic extracts obtained from an untreated alperujo (EFNT) and treated at 160 ° C for three times (n.d., not detected). Phenolic polymeric fraction (FFP).

Componentes (%) Components (%): Sin tratar Tratamiento térmico a 160ºC Without treating 160 ° C heat treatment

AFNTAFNT: 30(min) 60(min) 90(min) 30 (min) 60 (min) 90 (min)

HumedadFenoles FFP ProteínasCenizasAzúcaresLípidosÁcidos urónicos Humidity FFP Phenols Proteins Ashes Sugars Lipids Uronic acids: 8,62 25,70 n.d. 1,41 0,01 7,30 52,64 n.d. 12,36 15,60 48,40 19,93 7,32 1,09 1,81 3,09 0,02 0,04 5,75 5,54 20,25 42,64 n.d. n.d. 13,02 22,68 14,21 3,90 0,03 3,52 35,08 n.d. 8.62 25.70 n.d. 1.41 0.01 7.30 52.64 n.a. 12.36 15.60 48.40 19.93 7.32 1.09 1.81 3.09 0.02 0.04 5.75 5.54 20.25 42.64 n.a. n.d. 13.02 22.68 14.21 3.90 0.03 3.52 35.08 n.d.

Total Total: 95,68 95,91 87,93 92,44 95.68 95.91 87.93 92.44

El porcentaje en humedad es mayor en el caso de los extractos tratados térmicamente, mientras que el contenido en fenoles totales y lípidos no parece variar significativamente. Gracias al tratamiento térmico y posterior extracción aparece un nuevo componente que consiste en una mezcla de polímeros fenólicos (FFP), entre otros, que puede presentar importantes propiedades bioactivas. La cantidad de proteínas aumenta con los tratamientos mientras que la de azúcares disminuye. The moisture percentage is higher in the case of heat treated extracts, while the content of total and lipid phenols does not seem to vary significantly. Thanks to the heat treatment and subsequent extraction, a new component appears consisting of a mixture of phenolic polymers (FFP), among others, which can have important bioactive properties. The amount of protein increases with treatments while the amount of sugar decreases.

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Para estos mismos extractos se llevó a cabo una caracterización más detallada sobre el contenido de compuestos fenólicos como se detalla en la tabla 3a y en la tabla 3b. Las notables diferencias de composición así como la aparición de nuevos compuestos fenólicos y otros de degradación de azúcares marcan una importante diferencia con los extractos fenólicos que se pueden llegar a obtener a partir de los subproductos sin tratar. Estas diferencias se traducen en una mayor actividad por una mayor presencia de fenoles más activos y otros nuevos con importantes propiedades para la salud, entre otras. A continuación se detallan más a fondo las nuevas características de los extractos tratados térmicamente. For these same extracts, a more detailed characterization of the content of phenolic compounds was carried out as detailed in Table 3a and Table 3b. The notable differences in composition as well as the appearance of new phenolic and other sugar degradation compounds make an important difference with the phenolic extracts that can be obtained from untreated by-products. These differences translate into greater activity due to a greater presence of more active and new phenols with important health properties, among others. The new features of the heat treated extracts are detailed below.

Tabla 3a. Componentes fenólicos y de degradación de azúcares presente en los diferentes extractos EF a distintas temperaturas y para el EFNT expresados en mg de compuesto por kilogramo de alperujo fresco. Table 3a. Phenolic and sugar degradation components present in the different EF extracts at different temperatures and for the EFNT expressed in mg of compound per kilogram of fresh alperujo.

mg/Kg alperujo fresco mg / kg fresh lupine

Cantidades totales Total quantities: EFNT 160ºC/30 160ºC/60 160ºC/90 EFNT 160ºC / 30 160ºC / 60 160ºC / 90

3,4-Dihidroxi-fenilglicol3,4-Dihydroxy-phenyl glycol: 24,907 123,433 70,18 71,64 24,907 123,433 70.18 71.64

Hidroxitirosol Hydroxytyrosol: 15,733 1624,825 776,548 1127,53 15,733 1624,825 776,548 1127.53

Tirosol Tyrosol: 14,970 108,072 80,648 168,038 14,970 108,072 80,648 168,038

Vainillina Vanillin: n.d. 0,095 n.d 11,122 n.d. 0.095 n.d 11,122

4-metilcatecol 4-methylcatecol: n.d. 1,921 n.d n.d n.d. 1,921 n.d n.d

Alcoholes fenólicos totales Total phenolic alcohols: 55,610 1858,347 927,376 1378,329 55,610 1858,347 927,376 1378,329

Hidroximetil-furfural Hydroxymethyl furfural: n.d. 1,325 4,68 21,29 n.d. 1,325 4.68 21.29

Ácido 3,4 Dihidroxi- fenilacetico 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid: n.d. 15,563 n.d 19,59 n.d. 15,563 n.d 19.59

Ácido protocateico Protocateic acid: 9,174 24,464 18,462 2,74 9,174 24,464 18,462 2.74

Ácido cafeico Caffeic acid: n.d. 7,115 2,658 0,957 n.d. 7,115 2,658 0.957

Ácido p-Ohbenzoico P-Ohbenzoic acid: 0,4 1,657 1,432 1,067 0.4 1,657 1,432 1,067

Derivados del ácido protocateico Protocateic acid derivatives: n.d. 5,137 n.d n.d n.d. 5,137 n.d n.d

4-metilcatecol 4-methylcatecol: n.d. 1,921 n.d n.d n.d. 1,921 n.d n.d

Ácido p-cumárico P-cumaric acid: 2,929 n.d 1,496 n.d 2,929 n.d 1,496 n.d

Der ac p-cumárico Der ac p-cumaric: n.d. n.d 0,049 n.d n.d. n.d 0.049 n.d

Ácido clorogénico Chlorogenic acid: n.d. n.d n.d 19,572 n.d. n.d n.d 19,572

Ácido siríngico Syringic acid: n.d. n.d n.d 1,786 n.d. n.d n.d 1,786

Ácido vainíllico Vanillic acid: 3,362 n.d 5,013 2,089 3,362 n.d 5,013 2,089

Ácidos fenólicos totales Total Phenolic Acids: 15,865 55,857 29,11 47,802 15,865 55,857 29.11 47,802

Hemiacetal de la aglicona de la oleuropeina Heurocetal oleuropein aglycone: n.d n.d 0,019 n.d n.d n.d 0.019 n.d

Derivados de la oleuropeina 4C Derivatives of oleuropein 4C: n.d 8,382 1,39 n.d n.d 8,382 1.39 n.d

Oleuropeina Oleuropein: 2,743 0,922 0,461 n.d 2,743 0.922 0.461 n.d

Desmetiloleuropeina Desmethylouropein: n.d n.d n.d 14,535 n.d n.d n.d 14,535

SecologanosidoSecologanoside: n.d 7,355 n.d n.d n.d 7,355 n.d n.d

Oleuropeina aglicón derivado Oleuropein aglycone derivative: n.d n.d 0,196 n.d n.d n.d 0.196 n.d

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

10-Hidroxi-metiloleuropeina Derivados de la oleuropeina, totales 10-Hydroxy-methylleuropein Oleuropein derivatives, total: n.d 2,743 4,277 20,937 n.d 0,676 n.d 14,535 n.d 2,743 4,277 20,937 n.d 0.676 n.d 14,535

Derivado del ácido elenoico A Derived from elenoic acid A: 1339,749 664,381 191,299 527,404 1339,749 664,381 191,299 527,404

Derivado del ácido elenoico C Derived from elenoic acid C: n.d 294,459 123,562 n.d n.d 294,459 123,562 n.d

Derivado del ácido elenoico B Derived from elenoic acid B: n.d 26,48 0,577 9,39 n.d 26.48 0.577 9.39

Derivados del ácido elenoico totales Total Elenoic Acid Derivatives: 1339,749 985,32 315,438 536,794 1339,749 985.32 315,438 536,794

Ligstrosido Desmetilligstrosido Derivados del ligstrosido, totales Ligstroside Demethylligstroside Ligrostroside derivatives, total: n.d n.d n.d n.d18,716 18,716 0,042 2,207 2,25 n.d 111,395 111,395 n.d n.d n.d n.d18,716 18,716 0.042 2.207 2.25 n.d 111,395 111,395

Luteolin-7-O-Rutinosido Luteolin-7-O-Rutinoside: n.d 1,34 0,072 0,125 n.d 1.34 0.072 0.125

Apigenin-7-O-Rutinosido Apigenin-7-O-Rutinoside: n.d n.d 0,179 n.d n.d n.d 0.179 n.d

Luteolin-7-O-Glucosido Luteolin-7-O-Glucoside: 3,697 n.d 0,58 n.d 3,697 n.d 0.58 n.d

Cianidina-3-OruriosidoCyanidine-3-Orurioside: n.d 0,055 n.d n.d n.d 0.055 n.d n.d

Cfeoil-6'-O-Secologanosido Cfeoil-6'-O-Secologanoside: n.d 8,752 n.d 0,809 n.d 8,752 n.d 0.809

Flavonoides totales Total flavonoids: 3,697 10,147 0,831 0,934 3,697 10,147 0.831 0.934

1-Acetoxipinoresinol PinoresinolLignanos totales 1-Acetoxypinoresinol Pinoresinol Total Lignans: n.d n.d n.d 154,67125,021 179,692 59,8315,939 65,77 174,922 n.d 174,922 n.d n.d n.d 154.67125.021 179.692 59,8315,939 65.77 174,922 n.d 174,922

1-Fenil-6,7-dihidroisocromona1-Phenyl-6,7-dihydroisocromone: n.d 5,097 36,926 21,056 n.d 5,097 36,926 21,056

VerbascósidoVerbascoside: n.d 2,025 8,432 n.d n.d 2,025 8,432 n.d

6’-O-[(2E)-2,6-Dimetil-8-hidroxi2octonoiloxi] secologanosido 6’-O - [(2E) -2,6-Dimethyl-8-hydroxy2octonoyloxy] secologanoside: n.d 2,141 n.d n.d n.d 2,141 n.d n.d

Comsegolosido Comsegolide: 184,427 58,93 22,684 5,121 184,427 58.93 22,684 5,121

NuzherinaÁcido 3-Hidroximetil-2,3-dihidroxiNuzherine 3-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxy acid: n.d 2,432 n.d n.d n.d 2,432 n.d n.d

5-(metoxicarbonil)-2-metil-2Hpiran-4-acetico metil éster 5- (methoxycarbonyl) -2-methyl-2Hpiran-4-acetic methyl ester: n.d 207,18 n.d n.d n.d 207.18 n.d n.d

Varios, totales Several, total: 184,427 277,805 68,042 26,177 184,427 277,805 68,042 26,177

FFPFFP: n.d 515,823 77,658 1286,409 n.d 515,823 77,658 1286,409

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Tabla 4b.Componentes fenólicos y de degradación de azúcares presente en los diferentes extractos EF a distintas temperaturas y para el EFNT expresados porcentaje (gramos de componente por 100g de extracto fenólico). Table 4b. Phenolic and sugar degradation components present in the different EF extracts at different temperatures and for the expressed EFNT percentage (grams of component per 100g of phenolic extract).

% en el extracto % in the extract

3,4-Dihidroxi-fenilglicol 3,4-Dihydroxy-phenyl glycol: 0,431 1,754 0,988 0,792 0.431 1,754 0.988 0.792

Hidroxitirosol Hydroxytyrosol: 0,272 23,088 10,935 9,58 0.272 23,088 10,935 9.58

Tirosol Tyrosol: 0,259 1,536 1,136 1,857 0.259 1,536 1,136 1,857

VainillinaVanillin: n.d. 0,001 n.d 0,123 n.d. 0.001 n.d 0.123

4-metilcatecol 4-methylcatecol: n.d. 0,027 n.d n.d n.d. 0.027 n.d n.d

Alcoholes fenólicos totales Total phenolic alcohols: 0,961 26,406 13,058 12,351 0.961 26,406 13,058 12,351

Hidroximetil-furfural Hydroxymethyl furfural: n.d. 0,019 0,066 0,235 n.d. 0.019 0.066 0.235

Ácido 3,4 Dihidroxi- fenilacetico 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid

Ácido protocateico Protocateic acid: n.d 0,221 n.d 0,217 n.d 0.221 n.d 0.217

Ácido cafeico Caffeic acid: 0,159 0,073 0,26 0,03 0.159 0.073 0.26 0.03

Ácido p-Ohbenzoico P-Ohbenzoic acid: n.d 0,101 0,037 0,011 n.d 0.101 0.037 0.011

Derivados del ácido protocateico Protocateic acid derivatives: 0,007 0,024 0,02 0,012 0.007 0.024 0.02 0.012

4-metilcatecol 4-methylcatecol: n.d 0,348 n.d n.d n.d 0,348 n.d n.d

Ácido p-cumárico P-cumaric acid: n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d

Der ac p-cumárico Der ac p-cumaric: 0,051 n.d 0,021 n.d 0.051 n.d 0.021 n.d

Ácido clorogénico Chlorogenic acid: n.d n.d 0,001 n.d n.d n.d 0.001 n.d

Ácido siríngico Syringic acid: n.d n.d n.d 0,216 n.d n.d n.d 0.216

Ácido vainíllico Vanillic acid: n.d n.d n.d 0,023 n.d n.d n.d 0.023

Ácidos fenólicos totales Total Phenolic Acids: 0,058 n.d 0,071 0,02 0.058 n.d 0.071 0.02

Hemiacetal de la aglicona de la Hemiacetal aglicone of the: 0,274 0,766 0,41 0,528 0.274 0.766 0.41 0.528

oleuropeina oleuropein

Derivados de la oleuropeina 4C Derivatives of oleuropein 4C: n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d

OleuropeinaOleuropein: n.d 0,119 0,02 n.d n.d 0.119 0.02 n.d

DesmetiloleuropeinaDesmethylouropein: 0,047 0,013 0,006 n.d 0.047 0.013 0.006 n.d

Secologanosido Secologanoside: n.d n.d n.d 0,161 n.d n.d n.d 0.161

Oleuropeina aglicón derivado Oleuropein aglycone derivative: n.d 0,105 n.d n.d n.d 0.105 n.d n.d

10-Hidroxi-metiloleuropeina10-Hydroxy-methylleuropein: n.d n.d 0,003 n.d n.d n.d 0.003 n.d

Derivados de la oleuropeina, Derivatives of oleuropein,: n.d 0,061 n.d n.d n.d 0.061 n.d n.d

totales totals

Derivado del ácido elenoico A Derivado del ácido elenoico C Derived from elenoic acid A Derived from elenoic acid C: 0,047 23,161 0,297 9,441 0,029 2,694 0,161 5,829 0.047 23.161 0.297 9.441 0.029 2,694 0.161 5,829

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Derivado del ácido elenoico B Derivados del ácido elenoico totales Elenoic acid derivative B Total elenoic acid derivatives: n.d n.d 4,184 0,376 1,74 0,008 n.d 0,104 n.d n.d 4,184 0,376 1.74 0.008 n.d 0.104

LigstrosidoDesmetilligstrosidoDerivados del ligstrosido, totales Ligstroside Desmetilligstrosido Ligrostroside derivatives, totals: 23,161 n.d n.d 14,001 n.d 0,266 4,442 0,001 0,031 5,933 n.d 1,231 23,161 n.d n.d 14,001 n.d 0,266 4,442 0.001 0.031 5,933 n.d 1,231

Luteolin-7-O-RutinosidoLuteolin-7-O-Rutinoside: n.d 0,266 0,032 1,231 n.d 0.266 0.032 1,231

Apigenin-7-O-Rutinosido Apigenin-7-O-Rutinoside: n.d 0,019 0,001 0,001 n.d 0.019 0.001 0.001

Luteolin-7-O-GlucosidoLuteolin-7-O-Glucoside: n.d n.d 0,003 n.d n.d n.d 0.003 n.d

Cianidina-3-Oruriosido Cyanidine-3-Orurioside: 0,064 n.d 0,008 n.d 0.064 n.d 0.008 n.d

Cfeoil-6'-O-SecologanosidoCfeoil-6'-O-Secologanoside: n.d 0,001 n.d n.d n.d 0.001 n.d n.d

Flavonoides totales Total flavonoids: n.d 0,124 n.d 0,009 n.d 0.124 n.d 0.009

1-AcetoxipinoresinolPinoresinol Lignanos totales 1-Acetoxypinoresinol Pineresinol Total lignans: 0,064 n.d n.d 0,144 2,198 0,356 0,012 0,842 0,084 0,01 1,933 n.d 0.064 n.d n.d 0.144 2,198 0.356 0.012 0.842 0.084 0.01 1,933 n.d

1-Fenil-6,7-dihidroisocromona1-Phenyl-6,7-dihydroisocromone: n.d 2,553 0,926 1,933 n.d 2,553 0.926 1,933

VerbascósidoVerbascoside: n.d 0,072 0,52 0,233 n.d 0.072 0.52 0.233

6’-O-[(2E)-2,6-Dimetil-8-hidroxi2octonoiloxi] secologanosido 6’-O - [(2E) -2,6-Dimethyl-8-hydroxy2octonoyloxy] secologanoside: n.d 0,029 0,119 n.d n.d 0.029 0.119 n.d

Comsegolosido Comsegolide: n.d 0,03 n.d n.d n.d 0.03 n.d n.d

NuzherinaNuzherina: 1,198 0,837 0,319 0,057 1,198 0.837 0.319 0.057

Ácido 3-Hidroximetil-2,3-dihidroxi-5-(metoxicarbonil)-2-metil-2Hpiran-4-acetico metil éster 3-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxy-5- (methoxycarbonyl) -2-methyl-2Hpiran-4-acetic acid methyl ester: n.d 0,035 n.d n.d n.d 0.035 n.d n.d

Varios, totales Several, total: n.d 2,944 n.d n.d n.d 2,944 n.d n.d

FFP FFP: 1,198 3,947 0,958 0,2892342 1,198 3,947 0.958 0.2892342

Main advantages of the new extract

De la caracterización se pueden destacar los siguientes puntos o ventajas del tratamiento térmico que diferencian al nuevo extracto obtenido: The following points or advantages of heat treatment that distinguish the new extract obtained can be highlighted from the characterization:

5· La cantidad de extracto obtenido aumenta con el tratamiento térmico y en el caso del presente ejemplo aumenta con el tiempo de tratamiento; 5 · The amount of extract obtained increases with the heat treatment and in the case of the present example increases with the treatment time;

· En el EF obtenido tras el tratamiento térmico se produce un incremento de la concentración de los alcoholes fenólicos. El 3,4-dihidroxifenilglicol aumenta su concentración de 3 a 5 veces en el extracto. En el caso del hidroxitirosol la concentración aumenta hasta 100 veces con respecto a la concentración inicial. La concentración de tirosol se · In the EF obtained after heat treatment there is an increase in the concentration of phenolic alcohols. 3,4-Dihydroxyphenyl glycol increases its concentration 3 to 5 times in the extract. In the case of hydroxytyrosol the concentration increases up to 100 times with respect to the initial concentration. The tyrosol concentration is

10 incrementa hasta más de 10 veces con respecto al EFNT. Por lo tanto, se observa que el extracto fenólico obtenido tras el tratamiento térmico se encuentra altamente enriquecido en estos antioxidantes naturales; 10 increases up to more than 10 times compared to the EFNT. Therefore, it is observed that the phenolic extract obtained after the heat treatment is highly enriched in these natural antioxidants;

· De forma global se experimenta un incremento de las concentraciones de los fenoles ácidos presentes en EF con respecto al EFNT, aumentando su porcentaje hasta 3.5 veces en el extracto. Hay que destacar que tras el tratamiento · An overall increase in the concentrations of acidic phenols present in EF with respect to EFNT is experienced, increasing its percentage up to 3.5 times in the extract. It should be noted that after treatment

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

térmico se observa la presencia de ácido cafeíco, el cual antes del tratamiento no había sido detectado. Aunque se encuentra presente en otras muestras su concentración aumenta notablemente tras el tratamiento térmico. Esta molécula se encuentra formando parte de estructuras más complejas como el comsegolosido, el cual puede sufrir una ruptura en el reactor liberando la especie. El ácido protocateico experimenta un aumento de la concentración y porcentaje de más del doble en el extracto; thermal presence of caffeic acid is observed, which before treatment had not been detected. Although it is present in other samples, its concentration increases markedly after heat treatment. This molecule is part of more complex structures such as comsegolide, which can suffer a break in the reactor releasing the species. Protocateic acid experiences an increase in the concentration and percentage of more than double in the extract;

· En el EF también destaca la nueva presencia de compuestos como el pinoresinol y 1-acetoxipinoresinol (hasta un · The new presence of compounds such as pinoresinol and 1-acetoxyproinoresinol (up to a

0.36 y 2.2% respectivamente) que no han sido identificados en el EFNT. En el alperujo el pinoresinol y 1-acetoxipinoresinol solo han sido descritos por primera vez en un artículo reciente (Suárez, M. et al., (2009), J Agric Food Chem., 57, 1463-72.), aunque las concentraciones a las que se encuentran son mucho menores que las presentes en el extracto fenólico aquí tratado. Es importante señalar que prácticamente ningún autor identifica a estas especies en el alperujo, probablemente debido a las bajas concentraciones en las que se encuentran; 0.36 and 2.2% respectively) that have not been identified in the EFNT. In the alperujo, pinoresinol and 1-acetoxyproinoresinol have only been described for the first time in a recent article (Suárez, M. et al., (2009), J Agric Food Chem., 57, 1463-72.), Although concentrations those found are much smaller than those present in the phenolic extract treated here. It is important to note that practically no author identifies these species in the alperujo, probably due to the low concentrations in which they are found;

· Se observa la presencia de nuevos compuestos en el EF obtenido tras el tratamiento térmico que no se observan en EFNT, tales como el hidroximetilfurfural y el 1-fenil-6,7-dihidroisocromona, que alcanzan porcentajes de hasta un 0.24 y 0.52% en el EF respectivamente. El hidroximentilfurfural no ha sido descrito como componente del alperujo. Su presencia se debe a la degradación de hexosas que tienen lugar en el reactor como consecuencia del calentamiento; · The presence of new compounds is observed in the EF obtained after heat treatment that are not observed in EFNT, such as hydroxymethylfurfural and 1-phenyl-6,7-dihydroisocromone, which reach percentages of up to 0.24 and 0.52% in the EF respectively. Hydroxymethylfurfural has not been described as a component of the alperujo. Its presence is due to the degradation of hexoses that take place in the reactor as a result of heating;

· El 1-Fenil-6,7-dihidroisocromona pertenece a la familia de los hidroxi-isocromanos, los cuales forman parte de los componentes de naturaleza fenólica procedente del aceite de oliva (Bianco, A., et al., (2001), Food Chem. 77, pp. 405–411). Sin embargo no han sido descritos con anterioridad en el alperujo; · 1-Phenyl-6,7-dihydroisocromone belongs to the hydroxy-isochroman family, which are part of the phenolic components from olive oil (Bianco, A., et al., (2001), Food Chem. 77, pp. 405-411). However, they have not been previously described in the alperujo;

· Compuestos como el comsegolosido, verbascósido, los derivados de la Oleuropeína y del Ligstrosido sufren un descenso en su concentración. Este hecho se justifica debido a que el tratamiento térmico provoca la ruptura de estas moléculas complejas, provocando la liberación de otras de menor tamaño tales como el hidroxitirosol o el tirosol, que forman parte de su estructura, aumentando la concentración de éstas como ya se ha visto con anterioridad; · Compounds such as comsegolide, verbascoside, derivatives of Oleuropein and Ligstroside suffer a decrease in their concentration. This fact is justified because the heat treatment causes the breakdown of these complex molecules, causing the release of other smaller ones such as hydroxytyrosol or tyrosol, which are part of its structure, increasing the concentration of these as it has already been seen before;

· El tratamiento térmico seguido por una extracción fenólica favorece la aparición de una nueva fracción fenólica polimérica (FFP), hasta un 14% en el extracto y con interesantes propiedades para la salud. · The heat treatment followed by a phenolic extraction favors the appearance of a new polymeric phenolic fraction (FFP), up to 14% in the extract and with interesting health properties.

El incremento tan importante que ocurre para los compuestos fenólicos con tan importantes propiedades bioactivas así como la aparición de nuevos componentes hacen que el nuevo extracto presente nuevas y mejores propiedadesbeneficiosas para la salud. Éstas quedan claramente reflejadas en los ensayos de actividad que a continuación se muestran. The very important increase that occurs for phenolic compounds with such important bioactive properties as well as the appearance of new components make the new extract present new and better beneficial properties for health. These are clearly reflected in the activity tests shown below.

Ensayos de Actividad Activity Essays

Actividad de los nuevos extractos fenólicos tratados térmicamente (EF) y de sus fracciones. Activity of the new heat-treated phenolic extracts (EF) and their fractions.

El EF es rico en una gran variedad de compuestos que pueden presentar distintas actividades, contribuyendo todas ellas en suma a la actividad final del extracto. El fraccionamiento de dicho extracto puede resultar beneficioso para potenciar ciertas actividades concretas de los componentes fraccionados. Por ello, se ha realizado también un estudio sobre la actividad de las fracciones del EF tratado térmicamente. A modo de ejemplo se presentan las fracciones en las cuales se dividen el extracto 160ºC/60min y se le realizan los ensayos de actividad antioxidante a cada una de ellas. La composición de las distintas fracciones obtenidas se muestra a modo de ejemplo en la tabla 4. The EF is rich in a great variety of compounds that can present different activities, all contributing in sum to the final activity of the extract. The fractionation of said extract may be beneficial to enhance certain specific activities of the fractionated components. Therefore, a study has also been carried out on the activity of the heat treated EF fractions. As an example, the fractions into which the extract is divided 160ºC / 60min are presented and the antioxidant activity tests are carried out on each of them. The composition of the different fractions obtained is shown by way of example in Table 4.

Se expone en la tabla 5 como ejemplo de la actividad in vitro de la actividad antioxidante y secuestrante de radicales libres del nuevo extracto y de sus distintas fracciones los siguientes ensayos cuyos resultados obtenidos son comparados con el extracto fenólico no tratado como control (EFNT), la vitamina E (VE), el hidroxitirosol (HT) y el 3,4-dihidroxifenilglicol (DHFG), siendo éstos últimos dos de los fenoles simples más activos presentes en la aceituna. Table 5 is an example of the in vitro activity of the antioxidant and free radical sequestrant activity of the new extract and its different fractions, the following tests whose results are compared with the untreated phenolic extract as a control (EFNT), Vitamin E (VE), hydroxytyrosol (HT) and 3,4-dihydroxyphenylglycol (DHFG), the latter being two of the most active single phenols present in the olive.

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Tabla 4: Composición de cada una de las fracciones en las cuales se divide el extracto fenólico obtenido tras tratar el alperujo a 160ºC durante 60 minutos. Se especifica las especies de naturaleza fenólica presentes en cada fracción y la concentración de las mismas en ng/µl. (Fr.= Fracción) Table 4: Composition of each of the fractions into which the phenolic extract obtained after treating the alperujo at 160 ° C for 60 minutes is divided. Species of a phenolic nature present in each fraction and their concentration in ng / µl are specified. (Fr. = Fraction)

Fr. Fr.: Compuestos [ng/µl] Fr. Compuestos [ng/µL] Compounds [ng / µl] Fr. Compounds [ng / µL]

1one: DHFG 2457,377 3F Ácido protocateico 150,142 DHFG 2457,377 3F Protocateic acid 150,142

2A 2A: DHFG 74,445 Ácido p-hidroxibenzoico 10,663 DHFG 74,445 P-hydroxybenzoic acid 10,663

Hidroximetilfurfural Hydroxymethylfurfural: 93,015 3G Ácido Cafeico 106,863 93,015 3G Caffeic Acid 106,863

Hidroxi-tirosol Hydroxy tyrosol: 99,883 4A Glicol 5,445 99,883 4A Glycol 5,445

Tirosol Tyrosol: 664,213 Hidroxitirosol 12,276 664,213 Hydroxytyrosol 12,276

2B 2B: DHFG 284,163 Tirosol 2,775 DHFG 284,163 Tyrosol 2,775

Hidroximetilfrfural Hydroxymethylfrfural: 53,505 Derivado Ácido Elenoico A 211,814 53,505 Derivative Elenoic Acid A 211,814

Hidroxi-tirosol Hydroxy tyrosol: 29890,674 4B Hidroxitirosol 78,815 29890,674 4B Hydroxytyrosol 78,815

Tirosol Tyrosol: 861,222 Derivado Ácido Elenoico C 4967,175 861,222 Derivative Elenoic Acid C 4967,175

2C 2 C: Ácido Protocateico 534,619 Derivado de Oleuropeina 56,105 Protocateic Acid 534,619 Oleuropein derivative 56,105

3A 3A: Hidroximetilfurfural 38,753 4C Hidroxitirosol 78,820 Hydroxymethylfurfural 38,753 4C Hydroxytyrosol 78,820

3B 3B: Hidroximetilfurfural 2,953 1-Acetoxipinoresinol 2260,066 Hydroxymethylfurfural 2,953 1-Acetoxypinoresinol 2260,066

Hidroxi-tirosol Hydroxy tyrosol: 9,547 Oleuropeina 18,548 9,547 Oleuropein 18,548

Derivado Ácido Elenoico A Derivative Elenoic Acid A: 3639,062 Ligstrosido 1,705 3639,062 Ligstroside 1,705

Hemiacetal de la aglicona de la oleuropeina Heurocetal oleuropein aglycone: 0,760 Oleuropeina aglicon derivado 7,870 0.760 Oleuropein aglicon derivative 7,870

3C 3C: Hidroxi-tirosol 888,204 4D Hidroxitirosol 64,102 Hydroxy tyrosol 888,204 4D Hydroxytyrosol 64,102

Derivado Ácido Elenoico A Derivative Elenoic Acid A: 582,152 Derivado Ácido Elenoico B 23,194 582,152 Derivative Elenoic Acid B 23,194

Tirosol Tyrosol: 1489,292 1-Acetoxipinoresinol 153,009 1489,292 1-Acetoxypinoresinol 153,009

Pinoresinol Pinoresinol: 238,763 4E FFP 238,763 4E FFP

3D 3D: Hidroxi-tirosol 51,951 4F Hidroxitirosol 42,644 Hydroxy tyrosol 51,951 4F Hydroxytyrosol 42,644

Derivado del Ácido p-cumárico P-Cumaric Acid Derivative: 1,964 Ácido Vainíllico 107,208 1,964 Vanillic Acid 107,208

Tirosol Tyrosol: 224,514 Apigenin-7-O Rutinosido 7,191 224,514 Apigenin-7-O Rutinoside 7,191

Derivado Ácido Elenoico A Derivative Elenoic Acid A: 2631,371 Verbascósido 293,091 2631,371 Verbascoside 293,091

1-fenil-6,7-dihidroisocromona 1-phenyl-6,7-dihydroisocromone: 1484,426 4G Ácido p-Cumárico 60,168 1484,426 4G P-Cumaric acid 60,168

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Verbascósido Verbascoside: 45,877 Luteolin-7-O Glucósido 23,298 45,877 Luteolin-7-O Glycoside 23,298

3E 3E: Ácido protocateico 53,506 Comsegolosido 911,887 Protocateic acid 53,506 Comsegolide 911,887

Ácido p-hidroxi-benzoico P-hydroxy-benzoic acid: 46,905 46,905

Derivado ác. Elenoico A Derivative ac. Elenoic A: 625,750 625,750

Luteolin-7-O Rutinosido Luteolin-7-O Rutinoside: 2,908 2,908

Ác. Vainíllico Ac. Vanillic: 94,309 94,309

Tabla 5. Ensayos de actividad biológica de los extractos obtenidos tras distintos tratamiento térmicos y sus fracciones comparados con el extracto sin tratamiento y compuestos como el HT, el DHFG y la vitamina E. (1= Poder Reductor; 2= Actividad antirradical DPPH; 3= Captación de radicales libres ABTS; 4= Inhibición a la Oxidación 1ª; 5= Inhibición a la Oxidación 2ª; 6= Inhibición a la actividad tirosinasa) Table 5. Biological activity tests of the extracts obtained after different thermal treatments and their fractions compared with the extract without treatment and compounds such as HT, DHFG and vitamin E. (1 = Reducing Power; 2 = DPPH anti-radical activity; 3 = ABTS free radical uptake; 4 = 1st oxidation inhibition; 5 = 2nd oxidation inhibition; 6 = Tyrosinase activity inhibition)

1 one: 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6

mg/ml trolox mg / ml trolox: EC50 TEAC EC 50 EC50 Abs EC50 TEAC EC 50 EC50 Abs

EFNT EFNT: 0,15 5,59 0,22 1,80 0,79 0,84 0.15 5.59 0.22 1.80 0.79 0.84

EF(160/15)EF (160/15): 0,45 1,64 0,53 1,46 0,97 0,48 0.45 1.64 0.53 1.46 0.97 0.48

EF(160/30)EF (160/30): 0,34 1,50 0,46 1,31 1,14 0,51 0.34 1.50 0.46 1.31 1.14 0.51

EF(160/45)EF (160/45): 0,48 1,11 0,51 1,06 0,94 0,43 0.48 1.11 0.51 1.06 0.94 0.43

EF(160/60)EF (160/60): 0,49 1,23 0,54 0,96 1,13 0,44 0.49 1.23 0.54 0.96 1.13 0.44

EF(160/75)EF (160/75): 0,42 1,06 0,42 1,38 1,02 0,35 0.42 1.06 0.42 1.38 1.02 0.35

EF(160/90)EF (160/90): 0,50 1,72 0,51 1,64 1,05 0,51 0.50 1.72 0.51 1.64 1.05 0.51

Fracción 1 Fraction 1: 0,32 1,08 0,40 1,08 0,60 - 0.32 1.08 0.40 1.08 0.60 -

Fracción 2A 2A fraction: 0,17 6,03 0,20 6,03 1,06 - 0.17 6.03 0.20 6.03 1.06 -

Fracción 2B 2B fraction: 1,29 0,81 1,38 0,80 0,14 - 1.29 0.81 1.38 0.80 0.14 -

Fracción 2C 2C fraction: 1,79 2,79 0,70 2,79 0,08 - 1.79 2.79 0.70 2.79 0.08 -

Fracción 3A 3A fraction: 0,06 1,75 0,17 1,76 1,66 - 0.06 1.75 0.17 1.76 1.66 -

Fracción 3B 3B fraction: 0,09 3,22 0,17 3,22 1,88 - 0.09 3.22 0.17 3.22 1.88 -

Fracción 3C 3C fraction: 0,78 0,81 0,71 0,81 0,35 - 0.78 0.81 0.71 0.81 0.35 -

Fracción 3D 3D fraction: 0,97 0,94 0,28 0,94 0,29 - 0.97 0.94 0.28 0.94 0.29 -

Fracción 3E 3E fraction: 0,84 0,67 0,67 0,67 0,16 - 0.84 0.67 0.67 0.67 0.16 -

Fracción 3F 3F fraction: 0,96 0,60 0,29 0,59 0,35 - 0.96 0.60 0.29 0.59 0.35 -

Fracción 3G 3G fraction: 0,43 7,24 0,28 7,24 0,34 - 0.43 7.24 0.28 7.24 0.34 -

Fracción 4A 4A fraction: 0,03 8,58 0,06 8,57 5,65 - 0.03 8.58 0.06 8.57 5.65 -

Fracción 4B 4B fraction: 0,24 3,29 0,24 3,29 0,84 - 0.24 3.29 0.24 3.29 0.84 -

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Fracción 4C 4C fraction: 0,83 0,32 0,69 0,32 0,10 - 0.83 0.32 0.69 0.32 0.10 -

Fracción 4D 4D fraction: 0,66 1,01 0,47 1,01 0,11 - 0.66 1.01 0.47 1.01 0.11 -

Fracción 4E 4E fraction: 0,54 0,57 0,45 0,57 0,24 - 0.54 0.57 0.45 0.57 0.24 -

Fracción 4F 4F fraction: 0,80 0,44 1,29 0,44 0,33 - 0.80 0.44 1.29 0.44 0.33 -

Fracción 4G 4G fraction: 0,52 0,86 0,95 0,86 0,41 - 0.52 0.86 0.95 0.86 0.41 -

HT HT: 1,60 0,11 1,53 0,68 0,07 - 1.60 0.11 1.53 0.68 0.07 -

DHFG DHFG: 1,96 0,17 0,99 0,83 0,03 - 1.96 0.17 0.99 0.83 0.03 -

Vit E Vit E: - 0,83 0,50 0,52 0,23 - - 0.83 0.50 0.52 0.23 -

1.-Poder reductor: El poder reductor de los extractos estudiados se expresa como equivalentes en mg/ml de Trolox que se requieren para llevar a cabo una inhibición de la oxidación de igual magnitud a la que se produce con una concentración de 1 mg/ml de compuesto/extracto. Se observa (Tabla 5) que los extractos fenólicos obtenidos a partir de alperujo tratado térmicamente (EF) presentan una actividad muy superior al del obtenido a partir del alperujo no tratado térmicamente, e inferior en este caso a la actividad mostrada por el HT y el DHFG como compuestos control. 1.-Reducing power: The reducing power of the studied extracts is expressed as equivalents in mg / ml of Trolox that are required to carry out an oxidation inhibition of equal magnitude to that produced with a concentration of 1 mg / ml of compound / extract. It is observed (Table 5) that the phenolic extracts obtained from the heat-treated lupine (EF) have an activity much higher than that obtained from the non-heat-treated lupine, and in this case inferior to the activity shown by the HT and the DHFG as control compounds.

En cuanto a la actividad de las distintas fracciones se puede comprobar algunas como la 2B y 2C cuyo valor reductor se encuentra por encima del Trolox, siendo la 2B la más rica en hidroxitirosol, y la 2C está constituida exclusivamente por ácido protocateíco. La mayoría de las fracciones poseen un valor superior al del propio EF tratado térmicamente, por lo que se verifica que en casos como éste un posterior fraccionamiento ayuda a aumentar las propiedades del extracto. Regarding the activity of the different fractions, some such as 2B and 2C, whose reducing value is above Trolox, can be verified, with 2B being the richest in hydroxytyrosol, and 2C is exclusively made up of protocatechic acid. Most of the fractions have a higher value than the thermally treated EF itself, so it is verified that in cases like this a subsequent fractionation helps to increase the properties of the extract.

2.-Captación de radicales DPPH: Los resultados se expresan como EC50, de forma que se indica la concentración de los extractos/compuestos necesarias para inhibir la oxidación en un 50%. Cuanta más capacidad antirradical posea la especie a estudio menos cantidad de la misma se requiere para disminuir la oxidación en un 50%. Como puede comprobarse en la tabla 5, los extractos obtenidos tras el tratamiento poseen mayor capacidad de captación que el extracto control sin tratar y a su vez los valores son próximos a los valores que proporciona la vitamina E. 2.-DPPH radical uptake: The results are expressed as EC50, so that the concentration of extracts / compounds necessary to inhibit oxidation by 50% is indicated. The more antiradical capacity the species under study has, the less amount of it is required to reduce oxidation by 50%. As can be seen in Table 5, the extracts obtained after the treatment have a higher uptake capacity than the untreated control extract and in turn the values are close to the values provided by vitamin E.

Los resultados muestran que las fracciones 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4C, 4D, 4E, 4F y 4G son aquellas fracciones que presentan una mayor capacidad de captación de radicales DPPH, superando al propio EF tratado térmicamente. Estas fracciones son ricas en DHFG, hidroxitirosol, 1-fenil-6,7-dihidroxisocromona, ácido vainíllico, 1-acetoxipinoresinol y comsegolosido. Hay que destacar que también presenta actividad la fracción 4E que es la que está formada por FFP. Los resultados de actividad antirradical son comparables a los resultados obtenidos con la vitamina E. The results show that fractions 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4C, 4D, 4E, 4F and 4G are those fractions that have a greater capacity to capture DPPH radicals, exceeding the heat treated EF itself. These fractions are rich in DHFG, hydroxytyrosol, 1-phenyl-6,7-dihydroxyschromone, vanillic acid, 1-acetoxypyrosinol and comsegolide. It should be noted that the 4E fraction is also active, which is the one formed by FFP. The results of antiradical activity are comparable to the results obtained with vitamin E.

3.- La captación de radicales ABTS+ es comparada con la capacidad del Trolox bajo las mismas condiciones. Los resultados se expresan como “Capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox” (TEAC). Como se puede comprobar en la tabla 5 la capacidad captadora de los EF tratados superan ampliamente al no tratado y presentan una actividad similar a la vitamina E. Por otro lado la actividad mostrada por los extractos tratados no solo de debe a la presencia de HT. 3.- The uptake of ABTS + radicals is compared with the capacity of Trolox under the same conditions. The results are expressed as "Antioxidant capacity in Trolox equivalents" (TEAC). As can be seen in Table 5, the capacity of the treated EFs is far superior to the untreated and they have an activity similar to vitamin E. On the other hand, the activity shown by the treated extracts is not only due to the presence of HT.

Los resultados muestran que las fracciones 2B, 4F y 4G poseen una capacidad de captación de radicales ABTS del mismo orden que el observado en el caso del HT y DHFG, y que junto con el 2C, 3C, 3E y 4C mejoran la actividad del extracto. La fracción 2B se caracteriza por poseer un elevado porcentaje de HT. La fracción 4F además de hidroxitirosol contiene otras especies como el ácido vaínillico o el verbascósido que probablemente actúen de forma sinérgica. La fracción 4G se caracteriza por poseer un elevado porcentaje de comsegolosido. Por otro lado, las fracciones 2C, 3C, 3E, 4C, 4D y 4E poseen una capacidad de captación de radicales ABTS similar a la observada por la vitamina E, debido a la presencia de compuestos como el ácido protocateico, el ácido vainillíco, el 1-acetoxipinoresinol, el pinoresinol, el verbascósido, el comsegolosido y la FFP. The results show that fractions 2B, 4F and 4G have an ability to capture ABTS radicals of the same order as observed in the case of HT and DHFG, and that together with 2C, 3C, 3E and 4C improve extract activity . Fraction 2B is characterized by having a high percentage of HT. The 4F fraction in addition to hydroxytyrosol contains other species such as vanillic acid or verbascoside that are likely to act synergistically. The 4G fraction is characterized by having a high percentage of comsegoloside. On the other hand, fractions 2C, 3C, 3E, 4C, 4D and 4E have an ABTS radical scavenging capacity similar to that observed by vitamin E, due to the presence of compounds such as protocateic acid, vanillic acid, 1-acetoxypyrosinol, pinoresinol, verbascoside, comsegolide and FFP.

4.-Inhibición de la oxidación primaria: Se determina la inhibición a la oxidación primaria del ácido linoleico. Los resultados se expresan como EC50. En la Tabla 5 se muestra que los valores obtenidos para todos los EF tratados térmicamente superan al extracto no tratado y se encuentran próximos a los obtenidos con HT y DHFG. De nuevo se verifica que la actividad que presentan los extractos tratados no se puede justificar sólo por la presencia de HT. 4.-Inhibition of primary oxidation: Determination of primary oxidation of linoleic acid is determined. The results are expressed as EC50. Table 5 shows that the values obtained for all thermally treated EFs exceed the untreated extract and are close to those obtained with HT and DHFG. Again it is verified that the activity presented by the treated extracts cannot be justified only by the presence of HT.

En la fracción 4C la capacidad de inhibición de la oxidación primaria se encuentra incluso por encima de los valores obtenidos para la vitamina E. Esta fracción es rica en 1-acetoxipinoresinol. Las fracciones 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4D, 4E, 4F y 4G también poseen una capacidad de inhibición de la oxidación primaria por encima del extracto tratado térmicamente. En la fracción 1, 2B y 3C este efecto se puede deber a las elevadas concentraciones de HT y DHFG. En los demás casos la In fraction 4C the capacity for inhibition of primary oxidation is even above the values obtained for vitamin E. This fraction is rich in 1-acetoxyproinoresinol. Fractions 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4D, 4E, 4F and 4G also have an ability to inhibit primary oxidation above the heat treated extract. In fraction 1, 2B and 3C this effect may be due to the high concentrations of HT and DHFG. In the other cases the

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

actividad puede deberse al igual que en los casos previos a la presencia de 1-fenil-6,7-dihidroisocromona, al ácido protocateico, ácido vainíllico, 1-acetoxipinotesinol, verbascósido, comsegolosido y FFP. Activity may be due to the same as in the cases prior to the presence of 1-phenyl-6,7-dihydroisocromone, protocateic acid, vanillic acid, 1-acetoxypinotesinol, verbascoside, comsegolide and FFP.

5. Inhibición de la oxidación secundaria: Se basa en la medida de la cantidad de malondialdehído (MDA), un subproducto formado en sistemas de lipoperoxidación. En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos de EC50. Los resultados ponen de manifiesto que los valores obtenidos de los EF se encuentran por debajo de los compuestos de referencia y también del EFNT. A pesar de ello tras el fraccionamiento una gran cantidad de fracciones presentan valores de EC50 muy por debajo del extracto sin tratar térmicamente, mejorando bastante las propiedades en la prevención a la oxidación en medios lipídicos. 5. Inhibition of secondary oxidation: It is based on the measurement of the amount of malondialdehyde (MDA), a byproduct formed in lipoperoxidation systems. Table 5 shows the results obtained from EC50. The results show that the values obtained from the EFs are below the reference compounds and also from the EFNT. Despite this, after fractionation, a large number of fractions have EC50 values well below the extract without heat treatment, greatly improving the oxidation prevention properties in lipid media.

6.-Inhibición de la actividad de la tirosinasa de hongos in vitro: Esta enzima cataliza las primeras dos reacciones de la síntesis de la melanina, la hidroxilación de la L-tirosinasa para dar 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de la L-DOPA a dopaquinona. Esta quinona es altamente reactiva y puede polimerizar espontáneamente a melanina. Los efectos de los extractos sobre las actividades de monofenolasa, utilizando L-tirosinasa como sustrato y de difenolasa sobre L-DOPA, se siguieron mediante la inhibición de la formación de dopacromo mediante medidas espectrofotométricas. Se muestran los resultados de absorbancia mostrados a 300 segundos, como tiempo final, para concentraciones de 0.75mg/ml de los extractos en la tabla 5. Cuanto menor sea la absorbancia desarrollada mayor es la capacidad de inhibición. Todos los extractos tratados térmicamente se encuentran dentro del mismo rango y poseen mayor capacidad de inhibición que el extracto fenólico no tratado térmicamente. 6.-Inhibition of fungal tyrosinase activity in vitro: This enzyme catalyzes the first two reactions of melanin synthesis, the hydroxylation of L-tyrosinase to give 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and the oxidation of L-DOPA to dopaquinone. This quinone is highly reactive and can spontaneously polymerize melanin. The effects of the extracts on monophenolase activities, using L-tyrosinase as a substrate and diphenolase on L-DOPA, were followed by inhibiting the formation of dopachrome by spectrophotometric measurements. The absorbance results shown at 300 seconds are shown, as the final time, for concentrations of 0.75mg / ml of the extracts in Table 5. The lower the absorbance developed, the greater the inhibitory capacity. All heat treated extracts are within the same range and have a greater capacity for inhibition than the heat-treated phenolic extract.

7. Inhibición de la agregación plaquetaria: Se estudió un rango de concentraciones de entre 50-2000 mg/l del extracto EF, usando colágeno y TRAP (péptido agonista del receptor de la trombina) como agonistas o estimulantes de la agregación. Los porcentajes de inhibición observados (Figura 1) son bastante altos, incrementándose éstos con la concentración usada de EF, los cuales llegan hasta un 90% en el caso de usar colágeno o de un 70% para el TRAP, o de un 10% en el caso de concentraciones de EA a las que sus componentes lo están a nivel fisiológico (100-200 mg de EA/l). 7. Inhibition of platelet aggregation: A range of concentrations between 50-2000 mg / l of the EF extract was studied, using collagen and TRAP (thrombin receptor agonist peptide) as agonists or aggregation stimulants. The percentages of inhibition observed (Figure 1) are quite high, increasing with the concentration of EF used, which reach up to 90% in the case of using collagen or 70% for TRAP, or 10% in the case of concentrations of EA at which its components are at the physiological level (100-200 mg of EA / l).

El alto porcentaje de inhibición muestra al nuevo extracto fenólico como un posible agente para la prevención de enfermedades cardiovasculares. The high percentage of inhibition shows the new phenolic extract as a possible agent for the prevention of cardiovascular diseases.

ES 2 395 032 Al ES 2 395 032 Al

Claims

1. one.: Extracto fenólico obtenido a partir de subproductos derivados de la extracción del aceite de oliva y/o de la industria de aderezo de la aceituna, caracterizado por que comprende una composición media en alcoholes fenólicos totales por encima del 5% en peso seco y una composición media en ácidos fenólicos totales por encima del 0.3% en peso seco. Phenolic extract obtained from by-products derived from the extraction of olive oil and / or from the olive dressing industry, characterized in that it comprises an average composition in total phenolic alcohols above 5% by dry weight and an average composition in total phenolic acids above 0.3% by dry weight.

2. 2.: Extracto fenólico, de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado por que comprende al menos un compuesto fenólico seleccionado entre pinoresinol, 1-acetoxipinoresinol, hidroximetilfurfural, 1-fenil-6,7-dihisocromona o una fracción fenólica polimérica FFP, así como cualquiera de sus combinaciones. Phenolic extract according to claim 1, characterized in that it comprises at least one phenolic compound selected from pinoresinol, 1-acetoxypinoresinol, hydroxymethylfurfural, 1-phenyl-6,7-dihisocromone or a polymeric phenolic fraction FFP, as well as any of its combinations

3. 3.: Proceso de obtención de un extracto fenólico a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que comprende una etapa previa de tratamiento térmico entre 50ºC y 250ºC del subproducto de aceituna, seguido de una etapa de extracción del extracto fenólico. Process for obtaining a phenolic extract according to any one of claims 1 to 2, characterized in that it comprises a previous stage of heat treatment between 50 ° C and 250 ° C of the olive by-product, followed by a stage of extraction of the phenolic extract.

4. Four.: Proceso de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizado por que comprende una etapa adicional de separación sólido-líquido, posterior al tratamiento térmico, dando lugar a una fase sólida y a una fase líquida, seguida de una etapa de extracción por separado del extracto fenólico de la fase líquida y de la fase sólida. Process according to claim 3, characterized in that it comprises an additional solid-liquid separation stage, after the heat treatment, giving rise to a solid phase and a liquid phase, followed by a separate extraction stage of the phenolic extract of the liquid phase and solid phase.

5. 5.: Proceso de acuerdo a la reivindicación 3 ó 4, donde dicha extracción se lleva a cabo mediante el empleo de al menos un disolvente orgánico. Process according to claim 3 or 4, wherein said extraction is carried out by using at least one organic solvent.

6. 6.: Proceso, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde durante la extracción se lleva a cabo la aplicación de temperatura entre 50ºC y 100ºC. Process, according to any one of claims 3 to 5, wherein during the extraction the temperature application between 50 ° C and 100 ° C is carried out.

7. 7.: Proceso, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado por que comprende una etapa adicional de concentración total o parcial del extracto fenólico. Process, according to any one of claims 3 to 6, characterized in that it comprises an additional stage of total or partial concentration of the phenolic extract.

8. 8.: Proceso, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado por que comprende una etapa adicional de microencapsulación o nanoencapsulación del extracto fenólico; de absorción o adsorción del extracto fenólico en cualquier tipo de soporte; o de formación de una emulsión del extracto fenólico. Process, according to any one of claims 3 to 7, characterized in that it comprises an additional step of microencapsulation or nanoencapsulation of the phenolic extract; of absorption or adsorption of the phenolic extract in any type of support; or for the formation of an emulsion of the phenolic extract.

9. 9.: Extracto fenólico obtenible a partir de un proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8. Phenolic extract obtainable from a process according to any one of claims 3 to 8.

10. 10.: Formulación alimentaria, cosmética y/o farmaceútica caracterizada por que comprende un extracto fenólico de acuerdo a las reivindicaciones 1, 2 ó 9. Food, cosmetic and / or pharmaceutical formulation characterized in that it comprises a phenolic extract according to claims 1, 2 or 9.

11. eleven.: Uso de un extracto fenólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 9 como antioxidante para la preparación de preparados tanto lipófilos como hidrófilos, con uso alimentario, cosmético y/o farmaceútico. Use of a phenolic extract according to any one of claims 1, 2 or 9 as an antioxidant for the preparation of both lipophilic and hydrophilic preparations, with food, cosmetic and / or pharmaceutical use.

12. 12.: Uso de un extracto fenólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 9 como agente inhibitorio de la acción de la enzima L-tirosinasa, implicada en procesos de pardeamiento. Use of a phenolic extract according to any one of claims 1, 2 or 9 as an inhibitory agent for the action of the enzyme L-tyrosinase, involved in browning processes.

13. 13.: Uso de un extracto fenólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 9 como agente inhibitorio de la agregación plaquetaria en la prevención de enfermedades coronarias. Use of a phenolic extract according to any one of claims 1, 2 or 9 as an inhibitor of platelet aggregation in the prevention of coronary heart disease.

14. 14.: Fracción o fracciones parcial o totalmente aisladas obtenibles a partir de un extracto fenólico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 9. Partial or totally isolated fraction or fractions obtainable from a phenolic extract according to any one of claims 1, 2 or 9.

ES 2 395 032 Al

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application no .: 201131041

SPAIN

Date of submission of the application: 06.21.2011

Priority Date:

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: See Additional Sheet

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected

A TO: FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Total recovery of the waste of two-phase olive oil processing: isolation of added-value compounds. J. Agric. Food Chem, 2004. Vol. 52, nº 19, páginas 5849-5855. DOI: 10.1021/jf030821y. 1-5,9-11,14 FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Total recovery of the waste of two-phase olive oil processing: isolation of added-value compounds. J. Agric. Food Chem, 2004. Vol. 52, No. 19, pages 5849-5855. DOI: 10.1021 / jf030821y. 1-5,9-11,14

A TO: LAMA-MUÑOZ, A. et al. New Hydrothermal treatment of alperujo enhances the content of bioactive minor components in crude pomace olive oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 25.01.2011. Vol. 59, nº 4, páginas 1115-1123. Doi: 10.1021/jf103555h. 1-6,9,10,14 LAMA-MUÑOZ, A. et al. New Hydrothermal treatment of alperujo enhances the content of bioactive minor components in crude pomace olive oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 01.25.2011. Vol. 59, no. 4, pages 1115-1123. Doi: 10.1021 / jf103555h. 1-6,9,10,14

A TO: FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Potential use of olive by-products. Grasas y Aceites, 2006. Vol. 57, nº 1, páginas 95-106. ISSN 0017 3495. 1,3,9-11,13 FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Potential use of olive by-products. Fats and Oils, 2006. Vol. 57, nº 1, pages 95-106. ISSN 0017 3495. 1,3,9-11,13

A TO: ES 2199069 A1 (CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGÉTICAS MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLÓGICAS (C.I.E.M.A.T.)) 01.12.2004, columnas 3-6; reivindicaciones 1,2. 1,3,9-11 EN 2199069 A1 (ENVIRONMENTAL AND TECHNOLOGICAL ENERGY RESEARCH CENTER (C.I.E.M.A.T.)) 01.12.2004, columns 3-6; claims 1,2. 1,3,9-11

A TO: TRIPOLI, E. et al. The phenolic compounds of olive oil: structure, biological activity and beneficial effects on human health. Nutrition Research Reviews, 2005. Vol. 18, nº 1, páginas 98-112. Doi: 10.1079/NRR200495. 1,2,11,13,14 TRIPOLI, E. et al. The phenolic compounds of olive oil: structure, biological activity and beneficial effects on human health. Nutrition Research Reviews, 2005. Vol. 18, No. 1, pages 98-112. Doi: 10.1079 / NRR200495. 1,2,11,13,14

A TO: ES 2051238 A1 (INGENIERÍA Y DESARROLLO AGRO INDUSTRIAL S. A.) 01.06.1994, columnas 2,3; reivindicaciones 1,5,8,11. 1 EN 2051238 A1 (ENGINEERING AND DEVELOPMENT AGRO INDUSTRIAL S.A.) 01.06.1994, columns 2,3; claims 1,5,8,11. one

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 05.10.2012 Date of realization of the report 05.10.2012: Examinador A. Sukhwani Página 1/5 Examiner A. Sukhwani Page 1/5

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201131041

CLASSIFICATION OBJECT OF THE APPLICATION

A61K36 / 63 (2006.01) A61K8 / 92 (2006.01) A23L1 / 30 (2006.01) A61P9 / 10 (2006.01)

Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols)

A61K, A23L, A61P

Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, search terms used)

INVENES, EPODOC, WPI, X-FULL, NPL, CAPLUS, FSTA, AGRICOLA, CABA, CROPU, SCISEARCH

State of the Art Report Page 2/5

WRITTEN OPINION

Application number: 201131041

Date of Written Opinion: 05.10.2012

Statement

Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986) Claims 1 -14 YES Claims NO

Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986) Claims 1-14 YES Claims NO

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

Considerations:

A subject of the present invention is a phenolic extract obtained from by-products derived from the extraction of olive oil and / or from the olive dressing industry comprising an average composition in total phenolic alcohols above 5% by dry weight and an average composition in total phenolic acids above 0.3% by dry weight (claim 1).

The phenolic extract comprises at least one phenolic compound selected from pinoresinol, 1-acetoxypinoresinol, hydroxymethylfurfural, 1-phenyl-6,7-dihydroisocromone or a polymeric phenolic fraction FFP, as well as any combination thereof (reiv. 2).

The process of obtaining the claimed phenolic extract comprising a previous stage of heat treatment between 50 ° C and 250 ° C of the olive by-product is also protected, followed by a stage of extraction of the phenolic extract (reiv. 3).

The process comprises an additional solid-liquid separation stage, after heat treatment, resulting in a solid phase and a liquid phase, followed by a separate extraction stage of the phenolic extract from the liquid phase and the solid phase (reiv . 4).

The extraction is carried out by using at least one organic solvent (reiv. 5) and during said extraction the temperature between 50oC and 100oC (reiv. 6) is applied.

The process comprises an additional stage of total or partial concentration of the phenolic extract (reiv. 7) and an additional stage of microencapsulation or nanoencapsulation of the phenolic extract; of absorption or adsorption of the phenolic extract in any type of support; or for the formation of an emulsion of phenolic extract (reiv. 8).

Likewise, the phenolic extract obtainable from the claimed process (reiv. 9) and the food, cosmetic and / or pharmaceutical formulation comprising a phenolic extract according to claims 1, 2 or 9 (reiv. 10) are protected.

Finally, the use of the claimed phenolic extract as an antioxidant for the preparation of both lipophilic and hydrophilic preparations, with food, cosmetic and / or pharmaceutical use (reiv. 11), the use as an inhibitory agent of the L-enzyme is protected. tyrosinase, involved in browning processes (reiv. 12) and the use as an inhibitor of platelet aggregation in the prevention of coronary heart disease (reiv. 13), as well as the partially or totally isolated fraction or fractions obtainable from the phenolic extract claimed (reiv. 14).

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WRITTEN OPINION

Application number: 201131041

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Total recovery of the waste of twophase olive oil processing: isolation of added-value compounds. J. Agric. Food Chem. Vol. 52, nº 19, páginas 5849-5855. 2004 FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Total recovery of the waste of twophase olive oil processing: isolation of added-value compounds. J. Agric. Food Chem. Vol. 52, No. 19, pages 5849-5855. 2004

D02 D02: LAMA-MUÑOZ, A. et al. New Hydrothermal treatment of alperujo enhances the content of bioactive minor components in crude pomace olive oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 59, nº 4, páginas 1115-1123. 25.01.2011 LAMA-MUÑOZ, A. et al. New Hydrothermal treatment of alperujo enhances the content of bioactive minor components in crude pomace olive oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 59, No. 4, pages 1115-1123. 01.25.2011

D03 D03: FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Potential use of olive by-products. Grasas y Aceites. Vol. 57, nº 1, páginas 95-106. . 2006 FERNANDEZ-BOLAÑOS, J. et al. Potential use of olive by-products. Fats and oils. Vol. 57, No. 1, pages 95-106. . 2006

D04 D04: ES 2199069 A1 (CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGÉTICAS MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLÓGICAS (C.I.E.M.A.T.)) 01.12.2004 EN 2199069 A1 (ENVIRONMENTAL AND TECHNOLOGICAL ENERGY RESEARCH CENTER (C.I.E.M.A.T.)) 01.12.2004

D05 D05: TRIPOLI, E. et al. The phenolic compounds of olive oil: structure, biological activity and beneficial effects on human Health. Nutrition Research Reviews. Vol. 18, nº 1, páginas 98-112. 2005 TRIPOLI, E. et al. The phenolic compounds of olive oil: structure, biological activity and beneficial effects on human Health. Nutrition Research Reviews. Vol. 18, No. 1, pages 98-112. 2005

D06 D06: ES 2051238 A1 (INGENIERÍA Y DESARROLLO AGRO INDUSTRIAL S. A.) 01.06.1994 EN 2051238 A1 (ENGINEERING AND DEVELOPMENT AGRO INDUSTRIAL S. A.) 01.06.1994

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

NOVELTY

The documents cited D01 to D04, D06 are intended to treat the residues of olive oil or its by-products in order to extract bioactive compounds; D05 refers to the different phenolic compounds found in olive oil. So:

--: D01 divulga un proceso de recuperación de compuestos de valor añadido en el proceso de recuperación de residuos en dos fases del aceite de oliva, en el que hay un tratamiento hidrotermal seguido de una separación de productos sólidos y líquidos (página 5850) tal como propone la solicitud en estudio. Obtiene monosacáridos y, en particular, entre los compuestos obtenidos está el hidroximetilfurfural pero sin cuantificar, por lo que no anticipa el extracto fenólico reivindicado (página 5852, columna 2-página 5853, columna 1). D01 discloses a recovery process of value-added compounds in the two-phase waste recovery process of olive oil, in which there is a hydrothermal treatment followed by a separation of solid and liquid products (page 5850) as proposed by the application under study It obtains monosaccharides and, in particular, among the compounds obtained is hydroxymethylfurfural but not quantified, so it does not anticipate the claimed phenolic extract (page 5852, column 2-page 5853, column 1).

--: D02 se refiere a que la aplicación de nuevo proceso basado en el tratamiento hidrotermal de residuos de aceite de oliva lleva a un sólido final ricos en componentes menores con actividades funcionales como alcoholes alifáticos, triterpenos, etc, pero no divulga la composición de alcoholes fenólicos ni de ácidos fenólicos como lo hace la solicitud en estudio (página 1115, 1116, 1121). D02 refers to the fact that the application of a new process based on the hydrothermal treatment of olive oil residues leads to a final solid rich in minor components with functional activities such as aliphatic alcohols, triterpenes, etc., but does not disclose the composition of phenolic alcohols or of phenolic acids as the application under study does (page 1115, 1116, 1121).

--: D03 divulga una estrategia de reciclado aplicado al alpeorujo para la recuperación integral de productos valiosos que consiste en un tratamiento hidrotermal a temperatura entre 160-240oC. Este método hace más fácil la separación sólidolíquido; permite la recuperación de otros compuestos con valor añadido de la fracción soluble en agua, además de hidroxitirosol con importancia potencial para la salud humana como flavonoides, lignanos, esteroles, tocoferoles, escualeno, ácidos y alcoholes triterpénico (página 102) de interés en los sectores alimenticios, farmacéuticos y cosméticos (página 103, último párrafo). D03 discloses a recycling strategy applied to the alpeorujo for the integral recovery of valuable products consisting of a hydrothermal treatment at a temperature between 160-240oC. This method makes solid liquid separation easier; it allows the recovery of other compounds with added value of the water soluble fraction, in addition to hydroxytyrosol with potential importance for human health such as flavonoids, lignans, sterols, tocopherols, squalene, acids and triterpenic alcohols (page 102) of interest in the sectors food, pharmaceutical and cosmetic products (page 103, last paragraph).

--: D04 divulga un procedimiento para la extracción de compuestos fenólicos a partir de un material vegetal residual mediante un tratamiento hidrotérmico. El citado material vegetal residual bruto se selecciona entro los residuos del proceso de obtención de aceite de oliva, tales como huesos, cáscaras, alpeorujo, o mezclas (reivindicación 2). D04 discloses a process for the extraction of phenolic compounds from a residual plant material by means of a hydrothermal treatment. Said raw residual plant material is selected from among the residues of the process of obtaining olive oil, such as bones, shells, alpeorujo, or mixtures (claim 2).

In this material or by-product are the majority of the polyphenols present in the pulp and the olive bone, so they constitute a source of natural phenolic antioxidants (column 2). The application of hydrothermal treatment from 180 to 240 ° C to the recovery of soluble phenols is a novelty compared to the state of the art since it does not use solvents (column 6); By applying this treatment, hydroxytyrosol and tyrosol are extracted, which are used as antioxidants for the food and pharmaceutical industry (page 2, column 1, lines 1-21).

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WRITTEN OPINION

Application number: 201131041

--: D05 divulga los compuestos fenólicos del aceite de oliva, tanto su estructura, actividad biológica como los efectos beneficiosos en la salud humana. Entre estos compuestos están los tocoferoles, los ácidos fenólicos, los alcoholes fenólicos, los flavonoides, también la oleuropeina, el hidroxitirosol. También, se encuentran en el aceite extra virgen de oliva, lignanos como pinoresinol y 1-acetoxypinoresinol, ausentes en los aceites refinados (páginas 99-101). La actividad biológica de esos compuestos fenólicos no se limita a su habilidad antioxidante sino que inhiben la agregación plaquetaria y previene la ateroesclerosis y el cáncer y son antiinflamatorios y antimicrobianos (páginas 104-107). D05 discloses the phenolic compounds of olive oil, both its structure, biological activity and the beneficial effects on human health. Among these compounds are tocopherols, phenolic acids, phenolic alcohols, flavonoids, also oleuropein, hydroxytyrosol. Also, they are found in extra virgin olive oil, lignans such as pinoresinol and 1-acetoxypinoresinol, absent in refined oils (pages 99-101). The biological activity of these phenolic compounds is not limited to their antioxidant ability but they inhibit platelet aggregation and prevent atherosclerosis and cancer and are anti-inflammatory and antimicrobial (pages 104-107).

--: D06 describe un procedimiento de aprovechamiento del alpechín para la obtención de ácidos, fenoles, alcoholes y derivados mediante extracción en contracorriente. El procedimiento empleado no coincide con el reivindicado por lo que el extracto obtenido difiere del extracto fenólico objeto de la invención (columnas 2, 3; reivindicaciones 1, 5, 8, 11).D06 describes a process for using alpechin to obtain acids, phenols, alcohols and derivatives by countercurrent extraction. The procedure used does not coincide with the one claimed, so the extract obtained differs from the phenolic extract object of the invention (columns 2, 3; claims 1, 5, 8, 11).

None of these cited documents disclose a phenolic extract from by-products derived from the extraction of olive oil and / or from the olive dressing industry that comprises an average composition in total phenolic alcohols above 5% by dry weight. and an average composition in total phenolic acids above 0.3% by dry weight as the application under study does.

Therefore, in view of documents D01 to D06, it can be concluded that claims 1-14 are novel in accordance with Article 6 LP 11/86.

INVENTIVE ACTIVITY

The object of obtaining a phenolic extract from by-products derived from the extraction of olive oil and / or from the olive dressing industry comprising a mean composition in total phenolic alcohols above 5% by dry weight and a composition Average in total phenolic acids above 0.3% by dry weight, is not evident to the person skilled in the art in view of the cited documents.

In fact, the documents cited D01 to D03 disclose procedures to take advantage of the waste from the olive oil industry by applying a hydrothermal treatment before separating the phases. The objective is not to achieve the claimed phenolic extract but monosaccharides or hydroxytyrosol.

On the other hand, in D04 if there is an application of the hydrothermal treatment of 180 to 240oC for the recovery of soluble phenols but does not use the solvents later, so that following a different procedure the extract obtained is not the same.

In document D05, various phenolic compounds containing olive oil, including pinoresinol and 1-acetoxypinoresinol, are disclosed, but no extraction procedure from residues or by-products is disclosed.

In D06, the extraction procedure to obtain alcohols and phenolic acids is countercurrent and there is no previous phase of hydrothermal treatment.

For the person skilled in the art, in view of these documents, the claimed phenolic extract and the process for obtaining it would not be evident.

Therefore, in view of documents D01 to D06, it can be concluded that claims 1-14 have inventive activity according to Article 8 LP 11/86.

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