ES2392742T3 - Polipéptidos que tienen una actividad en la vía de degradación del metil-terc.butil-éter (MTBE) y sus utilizaciones - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el alcohol tercbutílico (TBA), el 2-metil-1, 2-propanodiol (2-M-1, 2-PD), el hidroxiisobutiraldehído y el ácido hidroxiisobutírico (HIBA), seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:10, b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2, el polipéptido tal como el definido en a) o b) de la secuencia SEQ ID NO:2 que tiene une actividad de deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA, y el polipéptido tal como el definido en a) de la secuencia SEQ ID NO:10 que tiene una actividad de regulador transcripcional

Description

Polipéptidos que tienen una actividad en la vía de degradación del metil-terc.butil-éter (MTBE) y sus utilizaciones.

La presente solicitud se refiere al dominio de la microbiología, y más particularmente a la utilización de microorganismos para tratar efluentes contaminados por contaminantes químicos, principalmente el metil-terc-butiléter (MTBE) y/o intermedios catabólicos de este compuesto.

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y sus fragmentos, así como a los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos aislados de microorganismos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el alcohol terc-butílico (TBA), el 2-metil-1,2-propanodiol (2-M-1,2-PD), el hidroxiisobutiraldehído, el ácido hidroxiisobutírico (HIBA). La invención se refiere igualmente a vectores de clonación y/o de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos, células bacterianas transformadas por dichos ácidos nucleicos o dichos vectores, así como sus utilizaciones.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de identificación de microorganismos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE. Más particularmente, la presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, Mycobacterium austroafricanum, registrada en la colección CNCM bajo el número I-3401.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de tratamiento de efluentes contaminados por el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE.

El compuesto químico MTBE se utiliza como aditivo en las gasolinas sin plomo. Desde que está prohibida la utilización de los alquil- plomo debido a su toxicidad, el MTBE se añade a las gasolinas con el fin de aumentar su índice de octano. El índice de octano mide la "resistencia al cascabeleo o picado" de los carburantes cuando se queman mezclados con aire en la cámara de combustión de los motores. El MTBE se utiliza igualmente como compuesto oxigenado que permite aumentar el contenido en oxígeno de las gasolinas, y por esto, mejorar su eficacia de combustión. Esto permite reducir la expulsión a la atmósfera de los hidrocarburos no quemados, así como el de monóxido de carbono. Así, concentraciones de MTBE de 15% (v/v) se utilizan corrientemente en los carburantes oxigenados. El MTBE ha sido clasificado como compuesto cancerígeno potencial par la agencia de EE.UU. para la protección de medio ambiente (US E.P.A., Decembre 1997 EPA/822/F-97/008. Office of Water, Washington, DC, USA). La contaminación por este compuesto del medio ambiente puede ser debida al almacenamiento inadecuado de la gasolina en los depósitos no estancos o a vertidos accidentales. Este tipo de residuos puede causar serios problemas de contaminación medioambiental, tal como la contaminación de los acuíferos subterráneos. Los consumidores pueden estar expuestos a débiles concentraciones cuando beben un agua no potable procedente de una fuente contaminada por el MTBE. Por otra parte, el gusto o sabor desagradables que el MTBE confiere al agua, incluso a débiles concentraciones, la hace inapropiada para el consumo, haciendo de este compuesto xenobiótico un contaminante importante. La contaminación por el MTBE parece ser principalmente atribuible al hecho de que sea eliminado difícilmente del medio ambiente. El MTBE se revela persistente por su elevada solubilidad en el agua y su débil biodegradabilidad. La semi-vida del MTBE en los acuíferos se estima en al menos 2 años (Wilson J. T., 2003, 19-61: In E. E. Moyer and P. T. Kostecki (ed.), MTBE Remediation Handbook. Amherst Scientific Publishers, Amherst, MA.); este valor se puede comparar con el del benceno que es de 2 a 3 meses en condiciones idénticas. La contaminación de los acuíferos puede engendrar serios riesgos para la salud pública. Por tanto es necesario desarrollar procedimientos eficaces que permitan tratar los acuíferos contaminados por el MTBE o cualquier otro intermedio catabólico del MTBE.

Desde hace algunos años se han emprendido varios estudios tendentes a determinar la biodegradabilidad del MTBE. Se han identificado y aislado cierto número de microorganismos capaces de asimilar completamente o parcialmente el MTBE. Por ejemplo, ciertos microorganismos son capaces de catabolizar el MTBE por cometabolismo. Dos vías de degradación, que implican las dos la oxidación inicial del MTBE, conducen a la producción del alcohol terc.butílico (TBA) que, más generalmente se acumula en el medio. La cepa bacteriana Mycobacterium vaccae JOB5, cuando se cultiva sobre propano es capaz de oxidar el TBA aunque esto no permita generar compuestos útiles para su crecimiento. Se han podido aislar algunas cepas de microorganismos capaces de asimilar el MTBE como fuente de carbono y de energía (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762; Hanson, J. R., et al. Appl. Environ. Microbiol., 1999. 65: 4788-4792 Hatzinger, P. B., et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67: 5601-5607). Todavía no han sido aclarados los mecanismos enzimáticos del ataque inicial del MTBE en estas bacterias.

La cepa bacteriana Mycobacterium austroafricanum I-2562 es una de las bacterias conocidas por su capacidad de crecer en condiciones aerobias, en presencia del MTBE. Esta cepa es en efecto capaz de catabolizar el MTBE en fuente de carbono y de energía (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762; patente de EE. UU. nº 6.849.445). Se han identificado cierto número de intermedios de degradación o catabolitos del MTBE, tales como el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA. La vía de degradación del MTBE para esta cepa bacteriana está descrita en la Figura 1.

La cinética de degradación del MTBE y del crecimiento que le acompaña en M. austroafricanum I-2562 presenta dos fases bien distintas (Figura 2). La cinética de degradación del MTBE se caracteriza por una velocidad de degradación muy rápida en el curso de las primeras 48 horas, que disminuye del día 2º al 16º. Durante esta etapa de transformación del MTBE en TBA, el TBA se acumula y por tanto no se observa ningún crecimiento. Del día 16º al 21º, el TBA acumulado se degrada induciendo al crecimiento del microorganismo.

Hay que advertir que la primera etapa de degradación comprende Ia mineralización del formiato en CO2 lo que necesita que el microorganismo sea metilótrofo (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762). La formiato- deshidrogenasa dependiente de NAD(P)+ (o FDH) es una enzima que desempeña un papel importante en la producción de energía en los microorganismos metilótrofos. Esta enzima, es por otra parte, frecuentemente utilizada en la regeneración del cofactor del tipo NAD(P)+ en las reacciones de biocatálisis (Tishkov, V. I. et al. Biochemistr. (Moscú), 2004, 69: 1537-1554). Esta primera etapa del catabolismo no genera ATP. François et al., han mostrado que el TBF tenía un efecto negativo sobre la velocidad de degradación del MTBE en M. austroafricanum I2562 (François et al., App Microbiol. Biotechnol. 2003, 62: 256-262). Se ha sugerido que el déficit en equivalentes reducidos de coenzimas y en energía era igualmente responsable de la ralentización de las reacciones enzimáticas (Salanitro, Curr. Op. Biotechnol., 1995, 6: 337-340). Estas dos razones son probablemente las responsables principales de la ralentización de la velocidad de degradación del MTBE.

La segunda etapa, al permitir la producción neta de 2 NAD(P)H y de 2H+, alimenta así la cadena de transporte de electrones con el O2 como aceptor final de electrones en aerobiosis. Esta etapa parecería pues esencial en el metabolismo del MTBE. El resultado final de esta cadena de transporte de electrones es regenerar el NAD(P)+ a partir del NAD(P)H, reducir el O2 a H2O, creando un gradiente de transporte de protones que se utilizan para la formación de ATP por la ATP -sintasa (bomba de protones). Esto corresponde al mecanismo de fosforilación oxidante y permite la síntesis de ATP que es el compuesto energético de los microorganismos (30,5 kJ producto/mol de ATP degradado debido a un enlace de alto nivel energético).

Un objetivo de la invención es disponer de polipéptidos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, y eventualmente modificarlos y utilizarlos con el fin de tratar efluentes contaminados por el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA.

Los trabajos de François et al., han permitido poner de manifiesto que varios polipéptidos eran específicamente inducidos en presencia de MTBE o TBA en M. austroafricanum IFP 2012 (I-2562). Estos polipéptidos específicamente inducidos han sido purificados, digeridos con tripsina y después microsecuenciados. El análisis de las secuencias resultantes con ayuda de las herramientas de alineamiento, los programas informáticos Blast y Fasta, ha sugerido que estos polipéptidos corresponden a óxido-reductasas implicadas en la degradación del MTBE y del TBA.

La firma solicitante ha realizado nuevas secuenciaciones peptídicas a partir de polipéptidos específicamente inducidos en presencia de MTBE, con el fin de obtener una primera sonda de 204 pares de bases. Sin embargo, esta sonda de 204 pares de bases se ha revelado demasiado corta para una hibridación sobre colonias. Por tanto se han realizado numerosos alineamientos por el programa BLAST con las proteínas más similares a la secuencia de aminoácidos deducida del fragmento de DNA de 204 pb. Después de la identificación de las secuencias de aminoácidos fuertemente conservadas en todas estas proteínas, se han realizado por PCR numerosas amplificaciones utilizando cebadores degenerados que permite obtener una nueva sonda de 604 pares de bases. Esta sonda de 604 pares de bases ha permitido realizar le clonación de un fragmento de DNA que comprende el gen mpdC, el orf1, el gen mpdB, el orf2 y una secuencia correspondiente a una supuesta transposasa. La clonación de este fragmento de DNA se ha revelado difícil, puesto que después de la una primera clonación, los clones obtenidos después de la transformación en E. Coli no eran estables, lo que hacía problemática la extracción del DNA plasmídico. Después de numerosos experimentos la firma solicitante ha emitido la hipótesis que la inestabilidad de los clones obtenidos procedía de la expresión del gen de la transposasa, y por tanto ha clonado un fragmento de DNA en el cual el gen de la transposasa está suprimido y que corresponde a la secuencia SEQ ID NO:11. Así, se han podido obtener clones estables que comprenden la secuencia SEQ ID NO:11.

Por tanto la firma solicitante ha debido enfrentarse a numerosas dificultades de clonación y secuenciación para obtener los polipéptidos de acuerdo con la invención.

La presente invención considera cualquier polipéptido aislado o purificado que tenga una actividad en la vía de degradación del MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA.

Al precisar que los polipéptidos o los ácidos nucleico que codifican al menos un polipéptido conforme a la invención son «aislados o purificados», se indica que son colocados en un ambiente diferente de que se encuentran naturalmente. Pueden ser aislados o purificados de una cepa bacteriana capaz de crecer en otro medio que comprende MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, siendo algunos de ellas principalmente las cepas Mycobacterium austroafricanum registradas en la colección CNCM bajo los números I-3401 y I-2532. Se entienden igualmente que las moléculas que han sido alteradas por la presente invención están «aisladas». Se recuerda que estos calificativos «aislado o purificado» se utilizan igualmente para las células hospedantes.

En el contexto de la invención, los términos «polipéptido, enzima» y «proteína» pueden ser utilizados de manera intercambiable y designan moléculas caracterizadas por secuencias de aminoácidos de cualquier longitud, eventualmente modificadas por vía química o bioquímica. Igualmente se incluye en el término «polipéptido» el conjunto de polipéptidos mutados que pueden existir naturalmente o variantes, en particular en la bacteria de la cepa

M. austroafricanum, y que corresponden a sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de al menos un aminoácido. En el caso de una sustitución, uno o varios aminoácidos consecutivos o no consecutivos, pueden estar reemplazados por aminoácidos «equivalentes». La expresión aminoácido «equivalente» pretende aquí designar cualquier aminoácido susceptible de ser sustituido por uno de los aminoácidos de la estructura de base, sin modificar, no obstante, la actividad biológica de los polipéptidos según la invención. Estos aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea apoyándose en su homología de estructura con los aminoácidos a los cuales sustituyen, o bien sea sobre los resultados de los ensayos de actividad biológica cruzada a los cuales los diferentes polipéptidos son susceptibles de dar lugar.

El polipéptido según la invención se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:10,

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presente al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2, el polipéptido tal como el definido en a) o b) de la secuencia SEQ ID NO:2 que tiene una actividad de deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA, y

el polipéptido tal como el definido en a) de secuencia SEQ ID NO:10 que tiene una actividad de regulador transcripcional.

Se han descrito diferentes protocolos conocidos por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en los polipéptidos. Típicamente para modificar una secuencia de aminoácidos de un polipéptido, se actúa sobre la molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Es posible para modificar el ácido nucleico que codifica un polipéptido conforme a la invención, someterlo a un tratamiento por un agente mutágeno, es decir, un agente físico o químico capaz de provocar mutaciones que alteren el significado de los codones, lo que por el juego del código genético modifica la secuencia de aminoácidos. Ventajosamente, se recurre a una técnica de mutagénesis dirigida para modificar la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido del gen, así como las de polinucleótidos conformes a la invención; se trata entonces de introducir específicamente una o varias mutaciones en el ácido nucleico estudiado, lo que por el juego del código genético implica la sustitución de uno o varios aminoácidos por uno o varios otros aminoácidos en el polipéptido codificado por el polinucleótido mutado. El interés de realizar estas mutaciones es no solamente estudiar la actividad biológica de uno de los polipéptidos conformes a la invención en la vía de degradación del MTBE y/o al menos uno de los intermedios catalíticos, sino eventualmente optimizar dicha actividad del polipéptido bajo forma recombinante en vista de su aplicación industrial.

Por «fragmento de polipéptido», se designa un polipéptido que comprende como mínimo 15 aminoácidos consecutivos, de preferencia 17, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100, 250 o 300 aminoácidos consecutivos. Los fragmentos de polipéptido conforme a la invención se pueden obtener por escisión de dicho polipéptido por una enzima proteolítica, por un reactivo químico, o incluso al colocar dicho polipéptido en un ambiente muy ácido forma igualmente parte de la invención.

Por «fragmento biológicamente activo», se entiende un fragmento de secuencias de aminoácidos de un polipéptido conforme a la invención que tiene al menos una de las características o propiedades funcionales de dicho polipéptido, principalmente una actividad en la vía de degradación del MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA.

Según un modo preferido de realización, la expresión de los polipéptidos conformes a la invención es inducida cuando las bacterias susceptibles de asimilar el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, de las cuales principalmente las bacterias de la cepa M. austroafricanum, más preferentemente las bacterias I-2562

o I-3401, están en un medio que comprende el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA. Preferentemente, los polipéptidos cuya expresión es fuertemente inducida son los polipéptidos de la SEQ ID NO:2, tal como se ha definido en a) o b), de las SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, como se indica en la Figura 3.

Ventajosamente, el polipéptido de la SEQ ID NO:2 tal como se ha definido en a) o b) denominado MpdC tiene una actividad de aldehído-deshidrogenasa. En la vía catabólica del MTBE, el polipéptido MpdC conforme a la invención es preferentemente susceptible de deshidrogenar el hidroxiisobutiraldehído a HIBA.

Ventajosamente, el polipéptido de la SEQ ID NO:6 denominado MpdB tiene una actividad de alcoholdeshidrogenasa. En la vía catabólica del MTBE, el polipéptido MpdB conforme a la invención es preferentemente susceptible de deshidrogenar el 2-M-1,2-PD a hidroxiisobutiraldehído.

Ventajosamente, el polipéptido de la SEQ ID NO:8 tiene una actividad de permeasa, preferentemente de di/tripéptido-permeasa. Dicho polipéptido comprende preferentemente 5 segmentos transmembranales.

Ventajosamente, el polipéptido de la SEQ ID NO:10 tal como se ha definido en a) y denominado MpdR tiene una actividad de regulador transcripcional.

La presente invención se refiere igualmente a cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifica al menos un polipéptido conforme a la invención. Preferentemente, la presente invención tiene por objeto cualquier ácido nucleico aislado o purificado que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE,

o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA.

En el contexto de la invención, los términos «ácido nucleico» y «DNA» se utilizan de manera intercambiable. Por « ácido nucleico», se designa un encadenamiento preciso de nucleótidos, modificados o no, que permiten definir un fragmento o une región de un ácido nucleico, que comprende o no nucleótidos no naturales, y que pueden corresponder también a una DNA bicatenario, un DNA monocatenario, así como a productos de transcripción de dichos DNA, y/o un fragmento de RNA.

El ácido nucleico según la invención se selecciona del grupo que consiste en:

e) un ácido nucleico que comprende al menos una cualquiera de las secuencias nucleotídicas seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:9, o un complemento de éstas,

f) un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia nucleotídica que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico tal como se ha definido en e).

Por «complemento» se designa cualquier ácido nucleico cuyos nucleótidos son complementarios de los de la secuencia SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:9, y cuya orientación está invertida.

Por «porcentaje de identidad» entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos en el sentido de la presente invención, se designa un porcentaje de nucleótidos o de aminoácidos idéntico entre las dos secuencias que se comparan. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera significativa, pudiendo comprender la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se comparan adiciones o deleciones con relación a la secuencia de referencia para un alineamiento significativo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de de posiciones idénticas por el número total de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por «alineamiento significativo», se designa el alineamiento para el cual el porcentaje de identidad determinado como se ha indicado es el más elevado. Preferentemente, se utilizará el programa informático BLAST para obtener un alineamiento significativo.

Ventajosamente, el ácido nucleico conforme a la invención, comprende las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO:1 tal como se ha definido en e) o f) y la SEQ ID NO:5, preferentemente la SEQ ID NO:1 tal como se ha definido en e)

o f), la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:5.

Ventajosamente, el ácido nucleico conforme a la invención comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:11.

Según un modo preferido de realización, la transcripción del ácido nucleico conforme a la invención está bajo el control de un promotor único. Por «promotor», se designa una región de regulación situada en dirección 5' de un marco de lectura abierto (ORF), en la proximidad de su extremo 5'. En la presente solicitud, se utilizarán los términos «ORF» y « gen» de manera intercambiable. Un promotor comprende ciertas secuencias nucleotídicas características que permiten la fijación del complejo de iniciación de la transcripción así como la fijación de reguladores transcripcionales.

Según otro modo preferido de realización, el ácido nucleico conforme a la invención se caracteriza porque su transcripción es inducida por la presencia de MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA. Ventajosamente, el ácido nucleico conforme a la invención está organizado en operón.

Según un modo preferido de realización, el ácido nucleico conforme a la invención corresponde a un grupo que comprende los ácidos nucleicos que codifican las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:9, siendo dicho grupo denominado grupo mpd. El grupo mpd está esquematizado en la Figura 7.

Según un modo preferido de realización, el ácido nucleico conforme a la invención es un ácido nucleico recombinante. Por «ácido nucleico recombinante», se designa una molécula de ácido nucleico, monocatenario o bicatenario, que ha sido modificada par une intervención humana de manera que contenga fragmentos de ácidos nucleicos combinados o yuxtapuestos según una disposición no existente en el estado natural.

La invención tiene igualmente por objeto cualquier vector de expresión y/o de clonación que comprenda un ácido nucleico conforme a la invención. Por «vector» se designa una molécula de ácido nucleico extracromosómico, principalmente un plásmido, que tenga una replicación autónoma y que pueda ser incorporada en una «célula hospedante».

Típicamente, se concibe un vector de clonación para permitir el transporte de un fragmento de DNA clonado y contiene uno o varios sitios de reconocimiento por enzimas de restricción que permiten la inserción o clonación de un fragmento de ácido nucleico, así como una o varias secuencias nucleotídicas codificantes para genes que permiten la identificación y la selección de células hospedantes transformadas por dicho vector, tales como genes de resistencia a antibióticos.

Según un modo preferido de realización, el vector de expresión conforme a la invención es concebido para permitir la expresión de una secuencia nucleotídica codificante insertada en dirección 3' de un promotor. La secuencia insertada o inserto es entonces transcrita, y después traducida a polipéptido. Ventajosamente, el vector conforme a la invención está flanqueado por elementos que aseguran la expresión de al menos un ácido nucleico conforme a la invención en la célula hospedante. Ventajosamente ciertos vectores de expresión tienen una secuencia que codifica una etiqueta en dirección 5' o en dirección 3' del sitio de inserción o de clonación; el ácido nucleico insertado es entonces transcrito y después traducido bajo la forma de una proteína de fusión. Por «proteína de fusión» se designa un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido codificado por un ácido nucleico conforme a la invención y un polipéptido capaz de fijarse a matrices de afinidad y/o de ser reconocido por anticuerpos que permiten detectar y/o de purificar el polipéptido al cual está fusionado.

Según un otro modo preferido de realización, el vector conforme a la invención comprende al menos una secuencia homóloga de una secuencia de ácido nucleico presente en el genoma de una célula hospedante y que asegura su integración en dicho genoma.

La invención se refiere además a una célula hospedante aislada que comprende al menos uno de los ácidos nucleicos conforme a la invención y/o al menos uno de los vectores conforme a la invención. Entre las células hospedantes utilizables en el sentido de la presente invención, se puede citar une célula procariota, preferentemente une célula bacteriana, más preferentemente une célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en Mycobacterium smegmatis mc2 155, Escherichia Coli, Rhodococcus ruber (registrada en la colección CNCM bajo el nombre Gordonia terrae y el número CIP I-1885).

Los polipéptidos conformes a la invención pueden ser preparados y/o obtenidos por cualesquiera técnicas dominadas por los expertos. Dichos polipéptidos se pueden obtener principalmente por síntesis química pero igualmente por técnicas de biología molecular, utilizando principalmente la PCR, vectores de expresión y células hospedantes apropiadas tales como las descritas anteriormente. Preferentemente, los polipéptidos conformes a la invención se caracterizan porque su expresión en células hospedantes, principalmente células bacterianas, permiten satisfacer la exigencia de degradación del MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos y permiten el crecimiento de dichas bacterias.

La secuencia SEQ ID NO:12 corresponde a la secuencia nucleotídica del rDNA 16S de la cepa M. austroafricanum I2532.

Par «sonda» se entiende un fragmento de ácido nucleico marcado por la incorporación de átomos radiactivos o de grupos fluorescentes y cuya secuencia es sensiblemente complementaria a la secuencia de un ácido nucleico buscado; este último será descubierto/detectado por hibridación con la sonda, produciéndose dicha hibridación cuando se aparean las dos secuencias complementarias. Por «secuencia complementaria» se designa una secuencia nucleotídica constituida por una sucesión de bases complementarias a la de otra secuencia con la cual es por tanto capaz de híbridarse. Preferentemente, la hibridación de una sonda cuyo tamaño sea superior a 200 nucleótidos se realiza a una temperatura de aproximadamente 60ºC según la enseñanza adaptada de Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001).

La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de identificación de una célula o de un ácido nucleico de una célula susceptible de degradar el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, que comprende:

-

opcionalmente una etapa de siembra de la célula en un medio suplementado en MTBE, y/o al menos uno de los

intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-

PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA,

-

una etapa de cribado de los ácidos nucleicos de dicha célula por hibridación con al menos una sonda, comprendiendo dicha sonda la secuencia nucleotídica complementaria de un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:9, o comprendiendo dicha sonda un fragmento del gen mpdB de 591 pares de bases que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.

Según un modo preferido de realización, una célula de una nueva cepa capaz de degradar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, será identificada gracias a cebadores oligonucleotídicos que permitan la amplificación del rRNA 16S de dicha célula.

Ventajosamente, se ha concebido una pareja de cebadores (5'-TGCACACAGGCCACAACCCA-3') y (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') a partir de dos regiones variables de la secuencia nucleotídica del rDNA 16S de la cepa M. austroafricanum. Esta pareja de cebadores es específica de la especie M. austroafricanum en la medida en la que no permite amplificar el rDNA 16S de microorganismos de otras especies, de las cuales principalmente la especie de las Nocardiacae, incapaces de asimilar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE (Figura 12).

Empleando el procedimiento conforme a la invención se ha identificado un nueva cepa bacteriana M. austroafricanum; está registrada en la colección CNCM bajo el número I-3401. Ha sido aislada del agua de chorreo del prelavado del fondo de un depósito de almacenamiento de una gasolina aditivada con MTBE. El crecimiento de

M. austroafricanum I-3401 en MTBE sigue una vía de degradación similar a la de M. austroafricanum I-2562 (Figura 10). Preferentemente, la nueva cepa M. austroafricanum I-3401 se caracteriza porque sea capaz de asimilar el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionados en el grupo que consiste de el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA. Más preferentemente, la nueva cepa I-3401 se caracteriza por una secuencia nucleica del rDNA 16S que comprende la secuencia SEQ ID NO:13.

El aislamiento independiente de dos cepas de M. austroafricanum, I-2562 y I-3401, ambas dos capaces de crecer en MTBE y aisladas de dos orígenes geográficos distintos y alejados (lodos activados de una estación de depuración de una factoría de tratamiento de aguas urbanas de la región parisiense y agua de chorreo del prelavado del fondo de un depósito de almacenamiento de una gasolina aditivada con MTBE localizada en el sudoeste de Francia, respectivamente) muestra que tales microorganismos, que se aíslan frecuentemente de muestras de suelos y de aguas (Jones y Jenkins, Can. J. Microbiol., 1965, 11: 127-133; Viallier y Viallier, Ann. Soc. Belge Med. Trop., 1973,

53: 361-371), pueden pues desempeñar un papel significativo en la degradación del MTBE en los acuíferos contaminados.

La presente invención se refiere igualmente a la utilización del polipéptido SEQ ID NO:2 tal como se ha definido en a) o b) en calidad de aldehído-deshidrogenasa, preferentemente para la deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA.

La presente invención se refiere finalmente a un procedimiento de tratamiento de efluentes acuosos que comprenden del MTBE, el ETBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, con el fin de reducir su concentración, que comprende la siembra de dicho efluente acuoso con al menos una célula conforme a la invención o identificada por el procedimiento de identificación conforme a la invención. Ventajosamente, el procedimiento conforme a la invención se caracteriza porque la célula es fijada sobre un soporte adaptado, preferentemente un soporte mineral, más preferentemente un soporte que comprende al menos 50% en masa de partita.

El procedimiento según la invención está particularmente adaptado para tratar un acuífero o un suelo contaminado por del MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE.

LISTA DE LAS FIGURAS DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Vía metabólica de degradación del MTBE por M. austroafricanum I-2562. En grueso, los intermedios de degradación que han sido identificados en el curso de nuestras experimentaciones.

Figura 2. Crecimiento de M. austroafricanum I-2562 sobre MTBE. Durante el crecimiento se midieron la D.O. a 600 nm (◊-◊) así como las concentraciones en MTBE (�-�), TB (∆-∆) y TBA ( - ).

Figura 3. Electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 10% (A) o 15% (B) en presencia de SDS (SDS-PAGE) de los extractos celulares de M. austroafricanum I-2562 obtenidos después de crecimiento sobre glucosa o sobre MTBE. Los pesos moleculares (en kDa) están indicados a la derecha de la figura.

Figura 4. Amplificación por PCR sobre DNA genómico de M. austroafricanum I-2562 con los cebadores degenerados creados a partir de las secuencias peptídicas internas del polipéptido de 64 KDa inducido en el MTBE.

Figura 5. Hibridación por transferencia Southern del DNA genómico de M. austroafricanum I-2562 después de digestión utilizando la sonda de 204 pb. El tamaño de las bandas reveladas está indicado en kb. 5 µg de DNA genómico de M. austroafricanum I-2562 son digeridos por los enzimas de restricción BamHl, EcoRI, Fspl, Knpl, Nhel, Nru, Pstl, Pvu II o SmaI (pistas 2-8, respectivamente) y 50 ng de sonda de 204 pb (pista 12) son analizados por Southern Blot utilizando la sonda de 204 pb. Las posiciones correspondientes a la migración del DNA del marcador de peso molecular III marcado con digoxigenina (Roche; pista 1 y pista 9) son indicadas a la izquierda de la figura.

Figura 6. "Hibridación sobre colonias" de los clones recombinantes de E. coli DH10B con una sonda de 604 pb.

A) Luminografía de las membranas que contienen los primeros clones que proceden de la digestión por Smal de

M. austroafricanum I-2562. Los clones positivos (manchas negras) son detectados con la sonda mpdC marcada con digoxigenina.

B) Luminografía de las membranas que contienen los segundos clones procedentes de la digestión por PstI de

M. austroafricanum I-2562. Los clones positivos (manchas negras) son detectados con la sonda mpdB marcada con digoxigenina.

Figura 7. Organización del grupo de los genes implicados en la vía de degradación del MTBE y aislado a partir del DNA genómico de M. austroafricanum I-2562 (A) y su mapa de restricción correspondiente (B).

El ORF mpdR codifica un regulador transcripcional, los ORF mpdC y mpdB codifican respectivamente una enzima aldehído-deshidrogenasa y una enzima alcohol-deshidrogenasa. Tres polipéptidos de 64, 55 y 27 kDa son todos fuertemente expresados después del crecimiento de M. austroafricanum I-2562 sobre MTBE. El polipéptido de 25 kDa es una permeasa. Los fragmentos de PCR procedentes de las amplificaciones realizada con ayuda de parejas de cebadores RT-PCR-F1/-R1, RT-PCR-F2/-R2 y RT-PCR-F3/-R3 están representados esquemáticamente en la Figura 7 (fragmentos numerados I, II y III).

Figura 8. RT-PCR sobre M. austroafricanum I-2562 después del crecimiento sobre TBA utilizando los cebadores correspondientes al grupo mpd.

Los cebadores utilizados se citan en la Tabla que se encuentra más adelante.

Leyenda: Pista 1: C- PCR I, Pista 2: C+ PCR I, Pista 3:(-) RT-PCR I, Pista 4: (+) RT-PCR I, Pista 5: C+ PCR II, Pista

6: (-) RT-PCR II, Pista 7: (+) RT-PCR II, Pista 8: C+ PCR III, Pista 9: (-) RT-PCR III, Pista 10: (+) RT-PCR III, Pista

11: marcador de DNA (100 pb).

Figura 9. Cinética de degradación del 2-M-1,2-PD por células de M. smegmatis mc2 155-clon 9 (cuadrados) y de M. smegmatis mc2 155-pCL4D (triángulos).

Degradación del 2-M-1,2-PD (símbolos rellenos) y producción del HIBA (símbolos vacíos). Control abiótico (◊-◊). Células de M. smegmatis mc2 155-clon 9 en presencia de 400 mg.L- 1 de cloranfenicol (x-x).

Las concentraciones celulares de M. smegmatis mc2 155-clon 9 y de M. smegmatis mc2 155-pCL4D eran 233,33 ± 14,09 y 214,63 ± 21,95 mg.L-1, respectivamente.

Figura 10. Crecimiento de M. austroafricanum I-3401 sobre MTBE.

Durante el crecimiento, se midieron la D.O.600nm (�-�), y las concentraciones residuales en MTBE (�-�), TBF (∆∆) y TBA (▲-▲). Figura 11. Amplificación por PCR del grupo mpd en el DNA genómico e de M. austroafricanum I-3401. Leyenda: MM: marcador de DNA 1 kb, Pistas 1 y 6: amplificación de SEQ ID NO:9 que codifica el polipéptido de 47 kDa. Pistas 2 y 7: amplificación de SEQ ID NO:1 que codifica la aldehído-deshidrogenasa de 55 kDa. Pistas 3 y 8: amplificación de SEQ ID NO:3 que codifica la proteína de 27 kDa Pistas 4 y 9: amplificación de SEQ ID NO:5 que codifica la alcohol-deshidrogenasa de 64 kDa.

Pistas 5 y 10: amplificación de SEQ ID NO:7 que codifica la proteína de 25 kDa, la supuesta permeasa. C 1 y C2: controles negativos sin cebadores de los DNA genómicos de M. austroafricanum I-2562 y I-3401, respectivamente.

Figura 12. Amplificación de secuencias específicas del rDNA 16S en diversos microorganismos.

El tamaño esperado del producto de PCR es 331 pb.

Los DNA genómicos de las cepas de Rhodococcus ruber (Pista 1), Rhodococcus sp. B-1 (Pista 2), Pseudomonas resinovorans CA10 (Pista 3), Mycobacterium smegmatis mc2 155 (Pista 4), Escherichia coli DH10B (Pista 5), Mycobacterium austroafricanum I-2562 (Pista 6), Mycobacterium austroafricanum I-3401 (Pista 7) y muestras que proceden del medio de la casete 1 (Pista 9) y del medio de la casete 2 (Pista 10) de una biobarrera piloto sembrada con M. austroafricanum I-2562 para la degradación del MTBE se utilizaron para efectuar las reacciones de amplificación por PCR. Como marcador de pesos moleculares del DNA (Pista 8) se utilizó GeneRulerTM DNA escalera de 1 kb.

La presente invención será mejor comprendida con ayuda de los ejemplos que siguen; estos ejemplos se dan únicamente a modo de ilustración de los objetos de la invención, y por tanto de ningún modo constituyen una limitación.

EJEMPLO 1: IDENTIFICACIÓN DE LOS POLIPÉPTIDOS INDUCIDOS DESPUÉS DEL CRECIMIENTO DE LA

CEPA M. AUSTROAFRICANUM I-2562 EN MTBE

Con el fin de identificar y de detectar la presencia de proteínas inducidas específicamente después del crecimiento de las bacterias M. austroafricanum en un medio que comprende el MTBE, se han obtenido extractos de proteínas citoplásmicas a partir de cultivo en MTBE o en glucosa (Figura 2).

1.1. Preparación de los extractos proteicos

Células de la cepa M. austroafricanum I-2562 se cultivan en 300 mL de medio mineral (MM) definido precedentemente descrito (Piveteau et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55: 369-373) en presencia de MTBE o de glucosa como fuente de carbono. Los cultivos se incuban en condiciones aerobias a 30ºC en frascos cónicos bajo agitación. El crecimiento se evalúa por medida de la absorbancia (D.O.600nm) en un espectrofotómetro UV-1601 (Shimadzu Corporación, Kyoto, Japón). Cuando la D.O..600 es 1, las células son recogidas por centrifugación a 20,000 x g durante 15 minutos, se lavan dos veces en tampón de fosfato tampón (20 mM, pH 7) y se vuelven a poner en suspensión en 5 mL de tampón Tris-HCl a 50 mM (pH=8,0) que contiene de ditiotreitol (DTT) 0,1M. Las células son atenuadas por tres pases en la prensa French (20.000 psi = 137,895 MPa) y mantenidas siempre en hielo. Los residuos celulares se eliminan por dos centrifugaciones a 1.000 x g durante 2 minutos. El líquido sobrenadante se utiliza luego para análisis del perfil proteico. La concentración en proteínas totales se mide por el kit Bio-Rad (Dye reagent, Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania).

1.2. Análisis de las proteínas solubles

La electroforesis de estos extractos se efectúa en geles de SDS-PAGE con 10 o 15% de poliacrilamida que contiene SDS según el método puesto a punto por Laemmli empleado en parte para las condiciones de migración (V =150 voltios durante la primera hora y después A=33 mA de modo constante durante las horas siguientes de la migración). 12,5 µg de proteínas totales se depositan por pista en el gel, para cada fuente de carbono ensayada (Laemmli, Nature, 1970, 227: 680-685).

Los perfiles proteicos de altos y bajos pesos moleculares revelados en los geles de SDS-PAGE con 10 o 15% de acrilamida, respectivamente, han permitido detectar 9 proteínas de pesos moleculares diferentes especialmente inducidas por la presencia del MTBE (Figura 3).

1.3. Identificación de dos secuencias peptídicas del polipéptido MpdC (64 kDa) inducido durante el crecimiento en MTBE

Protocolo del secuenciación interna:

Cada banda de gel correspondiente a un polipéptido inducido específicamente en el perfil proteico después del crecimiento en MTBE de M. austroafricanum I-2562 se recorta y después se somete a una reducción por DTT "en el gel" y después a una alquilación de los puentes disulfuro por yodoacetamida (Jenö et al., Analytical Biochemistry. 1995, 224: 75-82) antes de la digestión con tripsina. La enzima utilizada es la tripsina de calidad "de secuenciación de Promega (Helman et al., 1995, William et al., In: Techniques VIII, Marshak, D., ed. Academic Press, San Diego, 1997, 79-90). Los péptidos así generados son entonces extractos de trozos de gel residuales por 3 tratamientos de 30 minutos a 60ºC, cada uno en presencia de 100 µL de TFA al 1% y acetonitrilo al 60% seguido de un pase por el aparato de ultrasonidos durante 10 minutos. Una última extracción se efectúa en 50 µL de acetonitrilo puro durante 10 minutos. Los 4 extractos se mezclan y el volumen líquido se reduce en un evaporador rotatorio (Savant AES 1010) para obtener un volumen final de 5 µL.

Los péptidos se separan entonces por HPLC (Vydac) en una columna Microbore C18 (300ºA; 1 X 50mm Nº 218TP5105) utilizando el sistema de separación de Applied Biosystems 130A. Los péptidos se eluyen a 100 µL/min por una mezcla de de disolventes A y B con un gradiente de mezcla de los disolventes programado así: 3-63 min (050% B), 63-72 min (50-100% B) y 72-75 min (100% B). El disolvente A está constituido por TFA al 0,1% en el agua y el disolvente B está compuesto por TFA al 0,08 % en 70% de acetonitrilo y agua, y los péptidos son detectados por un detector UV a 220 nm. Las diferentes fracciones se recogen manualmente en tubos de 1,5 mL y se depositan en discos de fibra de vidrio pretratados por adición de 7 µL de biobreno (Applied Biosystems Inc.). Los discos se someten a la degradación de Edman en un secuenciador Procise (modelo 494 cLC) según el protocolo descrito por Hewick et al., (J. Biol. Chem., 1981, 256:7990-7997).

Una cantidad de péptido equivalente a aproximadamente 1 pmol se deposita en el secuenciador y se utiliza para la secuenciación un programa estándar que utiliza TFA como fase líquida. Los derivados aminoácidosfeniltiohidantoína (PTH-aa) se determinan por comparación con patrones (PTH-standards, ABI) y análisis en línea gracias a un sistema de separación capilar (ABI 140D) desde el arranque de la secuenciación.

Resultados:

Entre las proteínas identificadas, una proteína que migra de 64 kDa (denominada MpdC) es la más fuertemente inducida. La extracción a partir de la banda de gel correspondiente, la digestión con tripsina seguida de microsecuenciaciones peptídicas internas ha permitido la obtención de 2 secuencias de este polipéptido.

La comparación con ayuda del programa informático BLAST de la primera secuencia interna (KQRGWAYDPNVRGLPE) no reveló similitudes significativas. Por el contrario el análisis por BLAST de la segunda secuencia interna (STEHGLEGTIDWPISYEELAPYYDENDAIY) muestra una fuerte similitud (93%) con numerosas oxidasas y deshidrogenasas que pertenecen a la familia de las GMC-óxido-reductasas (Cavener, J. Mol. Biol., 1992,

223: 811-814).

EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DE LAS SONDAS

2.1. Extracción del DNA genómico

El DNA genómico se aisló de las diferentes cepas ensayadas según el protocolo de Pospiech y Neumann modificado de la manera siguiente: un cultivo efectuado en 50 mL de medio LB (caldo de Luria) (D.O. a 600 nm de 0,7) se recoge por centrifugación a 10000 g durante 15 minutos a 4ºC (Pospiech and Neumann, Trends In Genetics., 1995, 11: 217-218). El sedimento se vuelve a poner en suspensión en 5 mL de tampón SET (NaCl 75 mM, EDTA 25 mM, Tris-HCl 20 mM a pH 8). Se añade lisozima a una concentración final de 1 mg.mL-1 así como lisostafina de 112 U.µL-1 (Sigma). Esta mezcla de reacción se incuba durante 1 h a 37ºC. Después de tratamiento por la mezcla SDS/Proteinasa K, se efectúa una etapa de extracción en la mezcla de reacción dependiendo de donde se añaden secuencialmente los diferentes reactivos: ¼ de volumen de NaCl 5 M seguido de 1/7,5 volumen de CTAB al 10% -NaCl 0,7 M (pre-calentado a 65ºC) y la mezcla se incuba durante 1 hora a 65ºC. Se añade a continuación un volumen de cloroformo (CHCl3) y las etapas subsiguientes se realizan según el protocolo original.

2.2. Preparación de una sonda de 204 pb

Las dos secuencias peptídicas obtenidas en el EJEMPLO 1 se utilizaron para crear varios pares de cebadores degenerados de acuerdo con el código genético universal y teniendo en cuenta dos posibilidades de apareamiento de las secuencias en el seno de la secuencia polipeptídica. El conocimiento de estas secuencias peptídicas permite, por el código genético, deducir las secuencias nucleotídicas correspondientes. El código genético equivale a la correspondencia entre las secuencias nucleotídicas y las secuencias peptídicas. Así, cada triplete de nucleótidos de la secuencia nucleotídica o codón corresponde a un aminoácido único. Se habla de degeneración del código genético en la medida en la que varios codones sinónimos pueden especificar un mismo aminoácido. En consecuencia, por el código genético, varias secuencias nucleotídicas pueden ser deducidas para una secuencia peptídica única. A partir de esta informaciones, se conciben y sintetizan cebadores oligonucleotídicos degenerados: dichos cebadores sirven como tales en el cuadro de una reacción de amplificación como resultado de la cual se obtiene una sonda que tiene una gran especificidad para el o los ácidos nucleicos buscados.

Una sola pareja de cebadores (MadFl/MadRl) permitió la obtención por PCR, a partir de DNA genómico puro de M. austroafricanum I-2562, de un fragmento de ácido nucleico de 204 pb (Figura 4).

La secuencia nucleotídica del cebador MadF1 es:

5'-GGNTGGGCNTAYGAYCC-3'

La secuencia nucleotídica del cebador MadRl es:

5'-GCRTCRTTYTCRTCSTAST-3'

La secuencia de aminoácidos se obtuvo gracias a un programa informático denominado ORF finder, véase la web:

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Dicha secuencia está representada:

K Q R G W A Y D P N V R G L P E D Y P V T G F T T P Y L M N N V G G S T MH Y A G H W P R Y K P V D F R K G T E H G L E G T I D W P I S Y E E L A P Y Y D E N D.

El análisis por el programa BLAST de esta secuencia de aminoácidos confirma la pertenencia de la proteína MpdC a la familia de las GMC-óxido-reductasas puesto que el análisis muestra 62 % de similitud (44% de identidad en 45 aminoácidos) con una supuesta colina-deshidrogenasa de Bradyrhizobium japonicum, 53 % de similitud (38% de identidad en 76 aminoácidos) con una glucosa-deshidrogenasa de una cepa de Burkholderia cepacia y 61 % de similitud (38% de identidad en 47 aminoácidos) con una óxido-reductasa, todas pertenecientes a esta misma familia.

2.3. Preparación de una sonda de 604 pb

Como consecuencia de las informaciones obtenidas a partir de esta primera amplificación por PCR, se concibieron y sintetizaron cebadores degenerados teniendo en cuenta ciertos restos conservados que están presentes en las proteínas de la familia de las GMC-óxido-reductasas. Una de estas parejas de cebadores (MadF2/MadR2) permitió obtener un nuevo ácido nucleico de 604 pb.

La secuencia nucleotídica del cebador MadF2 es:

5'-TTCACCTTGTTGGAACCGCTGGG-3'

La secuencia nucleotídica del cebador MadR2 es:

5'-TCATTACCGAGCCGACCTGC-3'

Las sondas se marcan con dUTP-digoxigenina (DIG DNA Labelling and Detection Kit; Roche Diagnostics, Laval Canadá).

EJEMPLO 3: CLONACIÓN DE UN ÁCIDO NUCLEICO DE LA SEQ ID NO:11

3.1. Transferencia Southern

Los experimentos de transferencia Southern se realizaron en el DNA genómico de la cepa M. austroafricanum I2562 tal como se preparó en el EJEMPLO 1. 5 µg de DNA genómico se digerió parcialmente con ayuda de enzimas de restricción elegidas en función de su sitio de restricción BamHI, EcoRI, Fspl, Knpl, Nhel, Nru, Pstl, Pvu II o SmaI (Pistas 2-8, respectivamente en la Figura 5). Después de migración en gel, los DNA digeridos se transfirieron en una membrana de nilón. Con ayuda de la sonda de 204 pb marcada con dUTP-digoxigenina (DIG DNA Labelling and Detection Kit; Roche Diagnostics, Laval, Canadá), se procedió al cribado por hibridación de los ácidos nucleicos digeridos. La sonda de 204 pb se hibridó específicamente con fragmentos de ácidos nucleicos comprendidos entre 2 y 12 kb (Figura 5). Las posiciones correspondientes a la migración del DNA del marcador de peso molecular III marcado con digoxigenina (Roche; Pista 1 y Pista 9) están indicadas en la parte izquierda de la figura).

3.2. Construcción de mini-bancos, cribado y clonación

Estos fragmentos de ácidos nucleicos se clonan en el plásmido pBluescript II KS (pBKS) (+/-) después de digestión por Smal. Los plásmidos recombinantes se utilizan para transformar bacterias competentes DH10B de E.coli preparadas (Hanahan, D et al., Methods Enzymol. 1991, 204:63-113). Cada colonia bacteriana procedente de un clon bacteriano que contiene un plásmido recombinante se transfiere a un membrana de nitrocelulosa y se criba por hibridación en colonia con la sonda de 604 pb, tal como se obtiene en el EJEMPLO 2.3. Para cada clon positivo, es decir que se hibrida con la sonda, el plásmido recombinante (pKS1) se extrajo y purificó gracias al kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Mississauga, Canadá). Debido a la fuerte inestabilidad del fragmento SmaI en el seno del plásmido pBKS, que implica la aparición de plásmidos de tamaños variados, se realizó una digestión por Smal de 10 µg de plásmido pBKS 1 seguida por una extracción en gel. La extracción de la banda SmaI se obtuvo gracias a una extracción después de migración en un gel «de bajo punto de fusión». Se obtuvieron aproximadamente 600 a 1000 pares de bases por cada extracción, por consiguiente fueron necesarias una docena de extracciones para obtener una secuencia completa. Después del análisis de la secuenciación, faltaba la parte hacia el extremo 5' del gen mpdC, se realizó un nuevo minibanco con el fin de obtener un fragmento Pstl de 5,6 kb utilizando las mismas técnicas que precedentemente, pero utilizando la sonda de 914 pb que se encuentra en el primer inserto y obtenida con ayuda del par de cebadores MF3/MR3. El plásmido pKS3 se aisló a partir de un clon positivo revelado por «hibridación en colonias» (Figura 6). El fragmento Pstl-Pstl detectado por la sonda fue pues clonado según el mismo protocolo que precedentemente para obtener un plásmido recombinante pKS3.

La totalidad del inserto PstI presente en este plásmido se secuenció según la técnica de «primer-walking (recorrido del cebador» con ayuda de una T7 DNA-polimerasa (T7-DNA sequencing kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) y de un secuenciador (secuenciador con fluorescencia automático ABT prism 377; Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes se compararon con las contenidas en las bases de datos EMBL, Swissprot y GenBank utilizando los programas informáticos BLASTN y BLASTX del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

EJEMPLO 4: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS DIFERENTES MARCOS DE LECTURA ABIERTOS (ORF) COMPRENDIDOS EN LA SECUENCIA SEQ ID NO:11 DE M. AUSTROAFRICANUM I-2562

El análisis de los marcos de lecturas abiertos presentes en la secuencia de DNA PstI/SmaI, SEQ ID NO:11 obtenida después de las dos clonaciones descritas en el EJEMPLO 3 se realizó con ayuda del programa informático «ORF finder». Se identificaron cinco secuencias codificantes SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:9; dichas secuencias codifican respectivamente los polipéptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10 (véase la tabla siguiente).

Secuencia nucleotídica

ORF Secuencia de aminoácidos del polipéptido Nombre del polipéptido Peso molecular

SEQ ID NO:1 1515 pb

mpdC SEQ ID NO:2 552 aminoácidos MpdC 55 kDa

SEQ ID NO:3 648 pb

orf1 SEQ ID NO:4 215 aminoácidos 27 kDa

SEQ ID NO:5 1659 pb

mpdB SEQ ID NO:6 552 aminoácidos MpdB 64 kDa

SEQ ID NO:7 672 pb

orf2 SEQ ID NO:8 223 aminoácidos 25 kDa

SEQ ID NO:9 1233 pb

mpdR SEQ ID NO:10 410 aminoácidos MpdR 47 kDa

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6 del polipéptido MpdB de 64 kDa por tanto pudo ser correlacionada con

10 las primeras secuencias polipeptídicas y las amplificaciones por PCR de 204 y 604 pb. Este gen mpdB está comprendido en une organización genética que comprende otros 3 ORF en la misma orientación, mpdC, orf1 y orf2, que codifican respectivamente las proteínas de 55, 27 y 25 kDa. Aguas arriba (o sea en dirección 5') de este grupo, se identificó un nuevo gen orientado en el sentido opuesto al primer grupo y que codifica una proteína de 47 kDa y se denominó mpdR. La organización de este sistema se esquematiza en la Figura 7.

15 4.1. ORF mpdC, SEQ ID NO:1

El análisis por el programa BLAST esquematizado a continuación muestra fuertes similitudes con numerosas deshidrogenasas que pertenecen a la familia de los aldehído-deshidrogenasas. El polipéptido SEQ ID NO:2 codificado por este ORF corresponde a un polipéptido de 55 kDa, cuya expresión es inducida en MTBE. Este polipéptido es capaz de deshidrogenar el hidroxibutiraldehído a HIBA.

20 Resultado obtenido por programa informático "NCBI domain search":

Aldedh, Familia de las aldehído-deshidrogenasas

e-valor = 3e-114

PutA, aldehído-deshidrogenasas dependientes de NAD

e valor = 5e-106

COG4230, Delta-1-pirrolina-5-carboxilato-deshidrogenasa

e valor = 3e-44

4.2. ORF orf1, SEQ ID NO:3

El polipéptido SEQ ID NO:4 codificado por este ORF corresponde a un polipéptido de 27 kDa, cuya expresión es inducida en MTBE.

4.3. ORF mpdB, SEQ ID NO:5

5 El polipéptido SEQ ID NO:6 codificado por este ORF corresponde a un polipéptido de 64 kDa, cuya expresión es inducida en MTBE. Hay fuertes similitudes con numerosas oxidasas y deshidrogenasas que pertenecen a la familia de las GMC (Glucosa-Metanol-Colina)-óxido-reductasas. El análisis por el programa "NCBI Conserved Domain Search" detectó más precisamente similitudes con la proteína codificada por el gen betA, que codifica la colinadeshidrogenasa que pertenece a esta misma familia. La secuencia de aminoácidos deducida puede ser

10 correlacionada con la secuencia N-terminal y las dos secuencias internas de la proteína de 64 kDa inducida específicamente en MTBE y responsable de la transformación del 2-M-1,2-PD en hidroxibutiraldehído.

Resultado del programa informático NCBI conserved domain search: Resultado obtenido para una búsqueda de dominios conservados por NCBI

BetA, Colina-deshidrogenasa y flavoproteínas relacionadas

e-valor = 3e-48

KOG1238, Glucosa-deshidrogenasa/colina-deshidrogenasa

e-value = 2e-07

KOG1335, Dihidrolipoamida-deshidrogenasa [Producción de energía]...

e-value = 6e-05

GMC_oxred_N, GMC óxido-reductasa

e-value = 2e-03

GMC_oxred_C, GMC óxido-reductasa

e-value = 4e-03

4.4. ORF orf2, SEQ ID NO:7

El polipéptido SEQ ID NO:8 codificado por este ORF corresponde a un polipéptido de 25 kDa. El análisis por el programa BLAST reveló una homología con una di/tripéptido permeasa (COG3104: Dipéptido/tripéptido-permeasa

20 [Rubrivivax gelatinosus PM1] Longitud = 372, Valor esperado = 2e-24). El análisis de la hidropatía de esta proteína por el programa "Predict Protein" reveló la presencia de 5 segmentos transmembranales cuya organización se esquematiza a continuación:

La expresión de este polipéptido es inducida probablemente en presencia de MTBE.

Esta proteína se encuentra pues en el seno de la membrana de las bacterias de la especie M. austroafricanum.

4.5. ORF mpdR. SEQ ID NO:9

El polipéptido SEQ ID NO:10 codificado por este ORF corresponde a un polipéptido de 47 kDa. Este ORF está situado en dirección 5' respecto a las cuatro ORF precedentes y está orientado en el otro sentido como muestra la Figura 7. El análisis por el programa BLAST reveló una similitud del primer resto de la secuencia con numerosos reguladores transcripcionales σ54, principalmente del tipo AcoR:

Después de estos análisis no es posible detectar si la expresión de este polipéptido es inducida específicamente o no en el perfil MTBE, pero es posible detectar su expresión en el momento del análisis por RT-PCR. Dicha expresión desempeña potencialmente un papel en la regulación de la expresión de los genes mpd.

EJEMPLO 5: EXPRESIÓN POR RT-PCR DEL GRUPO DE LOS GENES mpd

5.1. Extracción del mRNA de M. austroafricanum I-2562

Para los experimentos de extracción de RNA, todas las herramientas, todas las soluciones y el recipiente se prepararon de manera que se evitara la contaminación por RNAasas según los métodos estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York, 2001)

El RNA total de M. austroafricanum I-2562 se extrajo a partir de 20 mL de un cultivo a D.O.600nm de 0,7. Después de una incubación en hielo de 30 minutos, las células se centrifugaron (8000 x g durante 10 minutos a 4ºC) y se conservaron sobre hielo. A continuación, se añadieron al sedimento de células 600 µL de lisozima (Roche Diagnostics, Laval, Canadá) de 3 mg.mL-1 y 600 µL de lisostafina (Sigma, St. Louis, Missouri) de 50 µg.mL-1 y la mezcla se incubó a 37ºC durante 10 minutos. A continuación se añadieron 10 mL de RNAwizTM (Ambion, Austin, Texas) y la mezcla se sometió a agitación con vórtice durante 15 segundos. A continuación la mezcla se fraccionó en tubos de 2 mL (14000 µL/tubo) que contenían 250 mg de bolas de zirconio-sílice (0,1 mm de diámetro) colocadas en un adaptador para vórtice (Ambion) y se sometieron a agitación con vórtice durante 10 minutos. Después de haber centrifugado (1300 x g a 4ºC durante 5 minutos), el lisado bacteriano correspondiente a los líquidos sobrenadantes de cada tubo se transfirió a nuevos tubos de 2 mL y se añadieron 2 mL y 0,2 volúmenes de CHCl3 en cada tubo. Los tubos se sometieron a continuación a agitación con vórtice durante 30 segundos, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y después se centrifugaron (13000 x g a 4ºC durante 5 minutos) con el fin de recuperar los líquidos sobrenadantes en los nuevos tubos de 2 mL. Los extractos de RNA se precipitaron añadiendo secuencialmente 0,5 volúmenes de H2O tratada con DEPC, 1 volumen de isopropanol y 1/50 de volumen de glicógeno exento de RNasa de 5 mg.mL-1 (Ambion), se mezclaron bien y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. El RNA se centrifugó (13000 x g a 4ºC durante 5 minutos), se lavó dos veces con etanol del 70%, se secó 30 segundos (DNA Speed Vac, Savant) y se volvió a suspender en H2O-DEPC (25 mL/tubo). La calidad del RNA se determinó por electroforesis con ayuda de un gel de agarosa al 1% no desnaturalizante en un tampón TBE 0,5X (Trizma Base 45 mM, ácido bórico 45 mM, Na2EDTA 1 mM a pH=8,3). El RNA se precipitó con 1/10 volumen de acetato de sodio 3M de pH=7,0 y 2,5 volúmenes de etanol al 95%, y después se conservó a 80ºC.

5.2. Tratamiento con DNasa y transcriptasa inversa - PCR (RT-PCR)

Dos mg de extractos de RNA de M. austroafricanum I-2562 se trataron con el kit «DNA-Free» (Ambion, Austin, Texas) según las recomendaciones del fabricante. La eliminación del DNA se verificó con ayuda de amplificación por PCR utilizando los cebadores específicos creados en el grupo mpd y por electroforesis en gel de agarosa al 1%. La concentración final del RNA se cuantificó a 260 nm con ayuda de un Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, USA). Los experimentos de transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) se emplearon según el protocolo del kit «One step RT-PCR» de QIAGEN (QIAGEN, Mississauga, Canadá) tal como se describe por el fabricante. Se utilizaron 120 ng de RNA en cada tentativa de RT-PCR con, cada vez en paralelo, una amplificación por PCR con control positivo (y negativo) con (o sin) 100 ng de gDNA de M. austroafricanum I-2562. Las condiciones de RT-PCR se describen a continuación.

-

etapa de transcripción inversa: 1) 30 minutos a 50ºC

2) a 50ºC

-

etapa de PCR: 15 minutos a 95ºC 30 a 40 ciclos (variables en función de la intensidad de la señal): 1) 30 segundos a 94ºC 2) 1 minuto a 55ºC 3) 1 minuto a 72ºC

-

etapa de elongación final: 1) 10 minutos a 72ºC

2) a 4ºC

5.3. Expresión por RT-PCR del grupo de los genes mpd durante el crecimiento de M.austroafricanum I-2562 en TBA

La expresión de los genes mpd es analizada después del crecimiento de las bacterias en TBA, el principal intermedio de la biodegradación del MTBE (veáse la Figura 1). Se crean pares de cebadores que se encuentran en los diferentes genes mpd (véase la Tabla) siguiente con el fin de verificar que el mRNA que corresponde a este grupo era transcrito en un monocistrón. El RNA total se extrae de los cultivos después del crecimiento en TBA y las RT-PCR se efectúan con los diferentes cebadores. El resultado de esta experimentación que se presenta en la Figura 8 muestra que muy probablemente la transcripción del grupo de los genes mpd es monocistrónica; estando los genes organizados en operón. (Ma et al. J. Bacteriol., 2002, 184: 5733-5745).

Tabla: Cebadores utilizados en el conjunto de experimentos de amplificación por PCR y RT-PCR:

6.1. Construcción del vector de expresión que contiene los genes mpd y transformación de las bacterias

Los genes comprendidos en la organización genética mpd fueron insertados en el seno del vector pCL4D en dos etapas (Picardeau et al., Microbiology, 2000, 146: 305-313). En un primer tiempo el fragmento Notl-Notl de 4401 pares de bases contenido en el plásmido pKS 1 se digerió por Notl (NEB, Pickering, Canadá) y se clonó en el sitio Hincll de pCL4D. Las células quimiocompetentes de E. coli DH10B se utilizaron para la transformación y la selección de los transformantes en el medio LB que contiene 20 µg.mL-1 de kanamicina. La detección de los clones positivos que contenían el plásmido recombinante p4D1 se realizó por la amplificación por PCR con ayuda de los cebadores Forward y Reverse (Tabla en el EJEMPLO 5). En la segunda etapa el fragmento Pstl de 5574 pb que contenía la parte que falta del gen mpdC, el gen mpdR y el orf3 se extrajo por digestión del plásmido pKS3 con ayuda de la enzima PstI. Este fragmento se introdujo en el seno del plásmido p4D1 digerido previamente por Pstl que permite así llevarse el fragmento PstI correspondiente a la sonda de 914 pb presente en el plásmido p4D1. La orientación del fragmento Pstl en el plásmido recombinante p4D2 que contiene la totalidad del grupo mpd se verificó por PCR.

Con el fin de expresar el conjunto de los genes clonados, el vector p4D2 se introdujo en células competentes de la cepa M. smegmatis mc2 155 utilizando la técnica de electroporación. Un transformante (cepa M. smegmatis mc2 155-clon 9) procedente de esta transformación se aisló en una caja con LB que contenía kanamicina (20 µg.mL-1). El plásmido pCL4D que no comprende inserto fue introducido igualmente en bacterias de la cepa M. smegmatis mc2 155 (cepa M. smegmatis mc2 155-pCL4D) y sirvió de control.

6.2. Expresión funcional de los genes mpdB y mpdC en M. smegmatis mc2 155

Las bacterias M. smegmatis mc2 155-clon 9 (con inserto) y M. smegmatis mc2 155-pCL4D (control) se conservan en el medio LB que contienen 20 mg.L-1 de kanamicina. Las dos cepas se cultivan en 200 mL de medio LB que contiene 20 mg.L-1 de kanamicina durante 72 horas a 30ºC. Las células de M. smegmatis mc2 155-clon 9 y M. smegmatis mc2 155-pCL4D se recogen por centrifugación (13.000 g durante 15 minutos), se lavan dos veces y se ponen en suspensión en 40 mL de tampón de fosfato (20 mM, pH 7) que contiene el sustrato a ensayar (MTBE, TBA, 2-M-1,2PD o HIBA) en frascos sellados de 120 mL. Después de la siembra los frascos se incuban a 37ºC en un agitador rotatorio. Cuando es necesario, se añade cloranfenicol a partir de una solución en agua esterilizada por filtración (0,22 µm) con el fin de obtener una concentración final de 400 mg.L-1. Las muestras filtradas de estos cultivos son analizadas por CPG o HPLC. La degradación del sustrato es seguida por un periodo de 24 horas. Las actividades específicas (mg de sustrato degradado. g-1 de biomasa.h-1) se calculan a partir de las velocidades máximas de degradación.

6.3. Expresión en M. smegmatis mc2 155 del grupo de los genes mpd aislados de M. austroafricanum I-2562

Un fragmento de 9,1 kb, SEQ ID NO:11 que contiene el grupo de los genes mpd de M. austroafricanum I-2562 se clonó en el plásmido pCL4D (Picardeau et al., 2000). Este plásmido, denominado p4D2, se utilizó seguidamente para efectuar la transformación de M. smegmatis mc2 155. La transformación se realizó con el plásmido pCL4D, como control. Se seleccionaron dos transformantes: M. smegmatis mc2 155-clon 9 (que contenía p4D2 y que lleva por tanto los genes mpd) y M. smegmatis mc2 155-pCL4D (que lleva el vector, pCL4D). Las dos cepas se cultivan en el medio LB que contiene kanamicina y después se ensayan en dos experimentos en células en reposo para analizar la capacidad de degradar el MTBE, el TBA, el 2-M-1,2-PD y el HIBA. No se observó ninguna degradación del MTBE, del TBA o del HIBA con las cepas M. smegmatis mc2 155-clon 9 y M. smegmatis mc2 155-pCL4D (Tabla 2).

La degradación del 2-M-1,2-PD y la producción estequiométrica de HIBA (312,1 ± 2,3 µM degradado y 311,6 ± 4,5 µM producido, respectivamente) se observó solamente en presencia de la cepa M. smegmatis mc2 155-clon 9 (Figura 9). No se observó ninguna degradación del 2-M-1,2-PD en presencia de la cepa M. smegmatis mc2 155pCL4D o en el control abiótico. Al ser las dos cepas cultivadas en medio completo de LB, la inducción de los genes era necesaria para producir las enzimas correspondientes y esto es porque la degradación no comienza más que después de 4 horas de incubación en presencia de 2-M-1,2-PD. No se observa ninguna degradación del 2-M-1,2-PD cuando las células de M. smegmatis mc2 155-clon 9 se incuban en presencia de 2-M-1,2-PD y de cloranfenicol que se sabe que puede inhibir la traducción de los mRNA a proteínas.

Se calculó la velocidad máxima de degradación del 2-M-1,2-PD por la cepa M. smegmatis mc2 155-clon 9 y es 2,34 ± 0,41 µmol.g-1 (peso seco).min -1.

EJEMPLO 7: IDENTIFICACIÓN DE UNA NUEVA CEPA DE M. AUSTROAFRICANUM I-3401, CAPAZ DE CRECER EN MTBE

El agua de lluvia recogida en el fondo de un depósito de almacenamiento de una gasolina aditivada con MTBE se utilizó para sembrar el medio mineral MM que contenía 200 mg.L-1 de MTBE. El MTBE fue lentamente pero totalmente consumido en 140 días. Todas las bacterias que forman colonias después de esparcimiento en cajas de medio LB, se re-aíslan individualmente en placas y después se analizan para ver su capacidad de crecer en MM que contiene MTBE como única fuente de carbono y de energía. Se aisló una bacteria Gram-positiva y aerobia estricta que forma bastoncillos, y que crece en forma de colonias amarillas en cajas de medio LB y se reveló capaz de de crecimiento en MTBE.

El rDNA 16S de la cepa I-3401 fue totalmente secuenciado para las dos cadenas y el gen hsp65 fue parcialmente secuenciado. La secuencia del rDNA 16S muestra que la nueva cepa I-3401, SEQ ID NO:13, es muy próxima a M. austroafricanum I-2562, con siete nucleótidos diferentes (5 sustituciones y 2 inserciones en I-3401). La secuencia del gen hsp65 difiere en ocho nucleótidos de la del gen hsp65 de la cepa-tipo (de referencia) de M. austroafricanum. Se ha mostrado la capacidad de M. austroafricanum I-3401 de crecer en MTBE (Figura 10).

EJEMPLO 8: CREACIÓN DE CEBADORES ESPECÍFICOS DEL rDNA 16S DE M. AUSTROAFRICANUM Y CONDICIONES ESPECÍFICAS DE LA PCR

8.1. Análisis del rDNA 16S y del gen hsp65 de la cepa M. austroafricanum I-2562

Con el fin de identificar la nueva cepa I-3401, se realizó una amplificación por PCR del rDNA 16S utilizando la pareja de cebadores Bott 1 forward / Bott 2 reverse (véase tabla del EJEMPLO 5). El producto de amplificación se purificó utilizando el kit Qiagen (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá) y se realizó la secuenciación nucleotídica utilizando el cebador 244 (véase tabla del EJEMPLO 5). La amplificación por PCR del gen hsp65 se realizó utilizando el cebador forward Tb 11 y el cebador reverse Tb12 (véase tabla del EJEMPLO 5). El producto de amplificación se purificó con el kit Qiagen y la secuenciación se efectuó utilizando el cebador Tb 11. La reacción de secuenciación se efectuó con el kit BigDye ciclo terminator (Version 3.1, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) como se describe por el fabricante utilizando 25 ng de DNA purificado y 15 µmol de los cebadores universales utilizados para la secuenciación del rDNA 16S de las Eubacterias. La reacción se programa como sigue: 25 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC, y 4 minutos a 60ºC. Los productos de la secuenciación se purifican en columnas Centri-Sep como se ha descrito por el fabricante (Princeton Separations, Inc., Adelphia, NJ, USA) para eliminar el exceso de terminadores. Las secuenciaciones se realizan en un secuenciador automático con detección por fluorescencia ABT Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se comparan con las contenidas en el banco de datos de genes EMBL/GenBank y las identidades se evalúan utilizando el sistema de alineamiento BLAST (Altschul et al., 1997).

8.2. Creación de cebadores y condiciones específicas de PCR

Se alinean las secuencias del rDNA 16S de M. austroafricanum I-2562 y de especies próximas de micobacterias y se comparan las secuencias conservadas y variables. Sobre la base de los análisis de estos alineamientos múltiples, Se comparan varios pares de cebadores específicos de la especie M. austroafricanum con las secuencias del rDNA 16S disponibles utilizando el programa de búsqueda en los bancos de datos BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3389-3402). Estas secuencias se analizaron también con el fin de determinar su temperatura de desnaturalización (Tm), la posibilidad de formación de dímeros y su contenido en (G+C) utilizando el programa Amplify. La pareja de cebadores más eficaz era: MaFV2 forward y MaRV6 reverse (véase Tabla del EJEMPLO 5). El tamaño del producto de PCR esperado es 331 pb.

Las PCR se realizan de la manera siguiente: cada tubo contiene 5 µL de DNA genómico que procede de una lisis por calentamiento ("boiling lysis") durante 10 minutos de colonias aisladas en cajas recientemente esparcidas con las cepas de colección, las cepas de Mycobacterium austroafricanum o las muestras procedentes de una biobarrera sembrada con M. austroafricanum I-2562, 2,5 unidades de DNA-polimerasa Taq (Amersham Pharmacia Biotech), 5 µL del tampón de DNA-polimerasa Taq diluido 10X (Amersham Pharmacia Biotech), 25 pmol de cada uno de los cebadores, 4 µL de desoxirribonucleótidos-trifosfatos a 2,5 mM (a 200 pM cada uno: dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 2 µL de MgCl2 a 25 mM, y de agua destilada estéril para tener un volumen final de 50 µL. El control negativo contiene la misma mezcla que se ha descrito antes salvo que el DNA es reemplazado por agua estéril. Las muestras se calientan previamente 3 minutos a 95ºC en un aparato Bio-Rad Thermal iCycler (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) y después la temperatura se baja a 80ºC antes de su adición a la mezcla enzimática DNA-polimerasa Taq/tampón diluido 10X. Con el fin de obtener condiciones de amplificación específica, las condiciones de amplificación son las siguientes: 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 68ºC, 1 minuto a 72ºC repetido durante 30 ciclos y la extensión final se efectúa a 72ºC durante 7 minutos. Los tubos de PCR se conservan a 4ºC hasta el momento de efectuar la electroforesis en gel de agarosa. 10 µL de cada uno de los productos de la PCR se mezclan con 2 µL de tampón de deposición que contiene glicerol al 30% (v/v), azul de bromofenol al 0,15% (p/v), xileno-cianol al 0,15% (p/v). Los diferentes productos de la PCR así preparados y el marcador de DNA de 1 kb GeneRulerTM (MBI Fermentas, Inc., Burlington, Ontario, Canadá) se depositan en un gel de agarosa al 1% (p/v) preparado en TAE. Después de la migración, el gel se colorea con bromuro de etidio y se revela con rayos UV a 254 nm sobre un transiluminador. Los geles se fotografían utilizando un película Polaroid de tipo 57.

EJEMPLO 9: DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DE LA ORGANIZACIÓN GENÉTICA mpd EN EL SENO DE LA NUEVA CEPA M. AUSTROAFRICANUM I-3401.

Se ha estudiado la biodegradación del MTBE por la cepa M. austroafricanum I-3401 al ser similar a la de M. austroafricanum I-2562, la presencia o no del «grupo» mpd en el seno de la nueva cepa. Así se crearon parejas de cebadores, MF1/MR1, MF2/MR2, MF3/MR3 y MF4/MR4 que amplifican específicamente en los diferentes genes del grupo mpd (Tabla del EJEMPLO 5). Se realizaron amplificaciones por PCR efectuadas sobre el DNA genómico de

M. austroafricanum I-3401 o I-2562 (este último como control positivo) (Figura 11) y muestran amplificaciones positivas para todas las parejas de cebadores. Esto demuestra la presencia de una organización genética similar a la de los genes mpd de M. austroafricanum 1-2562 en el seno del genoma de la nueva cepa M. austroafricanum I3401. Es pues cierto que la nueva cepa utiliza el mismo camino de reacción para asimilar el 2-M-1,2-PD en el curso

del catabolismo del MTBE.

EJEMPLO 10: DETECCIÓN ESPECÍFICA DE M. AUSTROAFRICANUM I-2562 Y I-3401 POR PCR.

Se crearon los cebadores MaFV2 y MaRV6 específicos de la especie M. austroafricanum (véase la tabla del EJEMPLO 5). Se evaluó la especificidad de estos cebadores fijándose en dos regiones variables V2 y V6 del rDNA 16S de M. austroafricanum I-2562 utilizando el DNA genómico de cepas más o menos próximas. Los resultados presentados en la Figura 12 muestran que solo los DNA genómicos de dos cepas de M. austroafricanum, I-2562 y I3401, que metabolizan el MTBE permiten obtener una amplificación por PCR positiva. Estos cebadores permiten pues detectar específicamente los microorganismos de esta especie. Otros microorganismos del género Nocardiaceae no presentan amplificación por PCR.

EJEMPLO 11: COMPARACIÓN ENTRE LAS CEPAS I-2562 y 1-3401

M. austraafricanum

I-2562

I-3401

Capacidad de degradación del ETBE (130 mg/L)

100 días 33 días

Metabolismo del MTBE: asimilación de los intermedios

. acumulación del 2-M-1,2-PD

Velocidad de degradación del 2-metil-1,2 propanodiol

413 mg.g-1. peso seco.h-1 60 mg.g-1 peso seco.h-1

Una diferencia importante entre la cepa I-2562 y la cepa I-3401 reside en su capacidad de degradación del ETBE: para una concentración equivalente de ETBE (130 mg/L), M. austroafricanum I-2562 degrada el ETBE en 100 días mientras que I-3401 realiza esta degradación tres veces más rápido. Por otra parte, la velocidad de degradación del 2-M-1,2-PD cuando se utiliza directamente como sustrato es aproximadamente 7 veces más rápida en 1-2562 que en I-3401. Finalmente, es posible detectar la presencia de 2-M-1,2-PD en el curso de la degradación del alcohol terc.butílico (TBA) en I-3401 debido al hecho de esta diferencia de velocidad de degradación del 2-M-1,2-PD.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Institut Français du Pétrole National Research Council of Canada

5 <120> Polipéptidos que tienen una actividad en la vía de degradación del metil-terc.butil-éter (MTBE) y sus utilizaciones

<130> BCT060237 10 <160> 35

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 15 <211> 1515

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 1

<210> 2

<211> 504 25 <212> PRT

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 2

<210> 3

<211> 648 <212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 3

<210> 4

<211> 215

<212> PRT 10 <213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 4

<210> 5

<211> 1659

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 5 5 <210> 6

<211> 552

<212> PRT

<213> Mycobacterium austroafricanum

10 <400> 6

<210> 7

<211> 672

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 7

10 <210> 8

<211> 223

<212> PRT

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 8

<210> 9 5 <211> 1233

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 9

10 <210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 10

<210> 11

<211> 10327

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 11

<210> 12

<211> 1480

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 12 <210> 13

<211> 1362

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 13 <210> 14

<211> 591

<212> DNA

<213> Mycobacterium austroafricanum

<400> 14

10

<210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

15

<220> <223> cebador Bott1

20 25

<400> 15 tgcacacagg ccacaaccca <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> cebador Bott2 20

30

<400> 16 gagagtttga tcctggctca g 21

35

<210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador 244

40

<400> 17 cccactgctg cctcccgtag 20

45

<210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador Tb11

<400> 18 accaacgatg gtgtgtccat

20

<210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador Tb12

<400> 19 cttgtcgaac cgcataccct

20

<210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador MaFV2

<400> 20 gtctaatacc gaatacaccc ttct

24

<210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador MaRV6

<400> 21 gtagttggcc ggtccttctt ctcc

24

<210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador MF1

<400> 22 tgagaagcct cgtgtattac

20

<210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> cebador MR1

<400> 23 gagataaggc gtggtgaa

18

<210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial

<220>

<223> cebador MF2

<400> 24 agtgacggca cccataagtg

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador MR2

<400> 25 tcgaggtgtt gaggtccgaa t

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador MF3

<400> 26 atcatcccgt ggaactac

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> artifïcial

<220>

<223> cebador MR3

<400> 27 tgacctgggc gatgtgtt

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador MF4

<400> 28 atcagacctg ggatgtgc

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador MR4

<400> 29 ggctgtgaaa gtcggatga

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-F1

<400> 30 agtgacggca cccataagtg

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-R1

<400> 31 tcgaggtgtt gaggtccgaa t

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-F2

<400> 32 gcaggtcggc tcggtaatga

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-R2

<400> 33 gtaatacacg aggcttctca

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-F3

<400> 34 acggtctcgt cggcaaatac

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> cebador RT-PCR-R3

<400> 35 gcacatccca ggtctgat

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el alcohol tercbutílico (TBA), el 2-metil-1,2-propanodiol (2-M-1,2-PD), el hidroxiisobutiraldehído y el ácido hidroxiisobutírico (HIBA), seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en:

   a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:10,

   b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2, el polipéptido tal como el definido en a) o b) de la secuencia SEQ ID NO:2 que tiene une actividad de deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA, y

   el polipéptido tal como el definido en a) de la secuencia SEQ ID NO:10 que tiene una actividad de regulador transcripcional
2. 2. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque codifica al menos un polipéptido según la reivindicación

   1.
3. 3. Ácido nucleico aislado o purificado que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE, o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, seleccionado del grupo que consiste en :

   e) un ácido nucleico que comprende al menos una cualquiera de las secuencias nucleotídicas seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:9, o un complemento de estas,

   f) un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia nucleotídica que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico tal como el definido en e).

4. 4.

   Ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:11.

5. 5.

   Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque su transcripción está bajo el control de un promotor único.

6. 6.

   Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque su transcripción está inducida por la presencia de MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutraldehído y el HIBA.

7. 7.

   Ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizado porque está organizado en operón.

8. 8.

   Polipéptido según la reivindicación 1 o ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque es aislado y purificado de una cepa bacteriana elegida entre las cepas Mycobacterium austroafricanum registradas en la colección CNCM bajo los números I-3401 y I-2562.

9. 9.

   Ácido nucleico recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

10. 10.

    Vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

11. 11.

    Célula hospedante aislada que comprende bien al menos uno de los ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, o bien al menos uno de los vectores según la reivindicación 10.

12. 12.

    Procedimiento de identificación de una célula o de un ácido nucleico de una célula susceptible de degradar el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, que comprende:

    -

    opcionalmente una etapa de siembra de la célula sobre el medio suplementado en MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA,

    -

    una etapa de cribado de los ácidos nucleicos de dicha célula por hibridación con al menos una sonda, comprendiendo dicha sonda la secuencia nucleotídica complementaria de un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:9, o comprendiendo dicha secuencia un fragmento del gen mpdB de 591 pares de bases que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.

13. 13.

    Cepa bacteriana Mycobacterium austroafricanum registrada en la colección CNCM bajo el número I-3401.

14. 14.

    Utilización del polipéptido de la SEQ ID NO:2 según la reivindicación 1, para la deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA.

15. 15.

    Procedimiento de tratamiento de efluentes acuosos que comprenden MTBE, ETBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1,2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, con el fin de reducir su concentración, caracterizado porque comprende la siembra de dicho efluente acuoso por al menos une célula según una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 o identificada por el procedimiento según la reivindicación 12.