ES2391765T3 - Método para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés ambiental - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico que codifica una proteína DBF1 de una planta o un fragmento de la misma capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo de: (a) ácido nucleico que contiene la secuencia de ADN como la presentada en la SEQ ID NO 2, (b) ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID NO 3, (c) un fragmento del ácido nucleico de (a), que codifica una proteína de al menos 50 aminoácidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE, y (d) un fragmento del ácido nucleico de (b) que codifica una proteína de al menos 50 aminoácidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE.

Description

Metodo para mejorar la tolerancia de las plantas al estres ambiental. Campo de la invencion

La presente solicitud se refiere en general a un metodo para mejorar la tolerancia de las plantas al estres ambiental, incluyendo pero sin limitarse a estres por sequia, y/o salinidad, y/o deshidratacion, y/o calor, y/o frio, y/o congelacion, y/o anegacion, y/o lesiones, y/o estres mecanico, y/o estres oxidativo, y/u ozono, y/o luz alta, y/o metales pesados, y/o privacion de nutrientes, y/o productos quimicos toxicos y/o patogeno (incluyendo virus, bacterias, hongos, insectos y nematodos) y/o combinaciones de los mismos, dicho metodo comprendiendo la expresion de una proteina de enlzamiento de DRE regulada por acido abscicico (ABA), de la familia del factor de transcripcion AP2/EREBP, tal como DBF1 del maiz, en la planta, operativamente bajo el control de una secuencia del promotor constitutiva o regulable tal como un promotor inducible por estres, un promotor especifico de la celula, un promotor especifico del tejido, o secuencia del promotor especifica del organo. Preferiblemente, las caracteristicas modificadas por la presente invencion se relacionan con crecimiento, y/o rendimiento, y/o con supervivencia bajo condiciones de crecimiento por debajo del optimo. La presente invencion se extiende a constructos geneticos, que son utiles para llevar a cabo el metodo de la invencion y para las plantas transgenicas producidas con el mismo que tienen propiedades alteradas de crecimiento y/o rendimiento, y/o de supervivencia en comparacion con sus contrapartes isogenicas.

Antecedentes de la invencion El crecimiento, la produccion de biomasa, el rendimiento, el desarrollo, la morfologia y la supervivencia de las plantas esta determinada por las condiciones de crecimiento. Los factores que afectan estas caracteristicas de importancia agricola incluyen, entre otros, la disponibilidad de agua, minerales y nutrientes, temperatura, intensidad de luz, la presencia de competidores o patogenos, y de suciedad o la contaminacion del aire. En agricultura, las condiciones de crecimiento por debajo del optimo a menudo se puede remediar. Por ejemplo, los suelos secos se irrigan, los suelos pobres se fertilizan, mientras se aplican pesticidas y herbicidas para controlar plagas de patogenos y competidores, respectivamente. Sin embargo, la preocupacion creciente por una agricultura sostenible y respetuoso con el medio ambiente demanda cambios en las practicas agricolas. La irrigacion masiva de tierras de cultivo, comunmente utilizada para el cultivo de algodon y de otros cultivos, esta siendo cada vez menos aceptada porque conduce a la salinizacion de los suelos y a la reduccion de los niveles de agua en zonas bajas. Del mismo modo, el uso intensivo de agroquimicos es fuertemente criticado, debido a presuntos efectos negativos para el bienestar de los seres humanos y los animales. Al mismo tiempo, la creciente poblacion mundial esta obligando a la agricultura al uso de tierras marginales, lo que amplia el rango de ambientes en los cuales se siembran cultivos. Como resultado de esto, la produccion de variedades tolerantes al estres se ha convertido en una prioridad en todo el mundo para la mayoria de los cultivos importantes. Aunque los programas convencionales de fitomejoramiento han mejorado los rendimientos de los cultivos en ambientes estresantes, hay una creencia cada vez mayor de que se obtendran ganancias adicionales principalmente a traves de la manipulacion dirigida de los genes involucrados en la tolerancia al estres. Se han identificado muchos genes inducibles por estres en los ultimos aros, algunos de los cuales han demostrado que confieren un cierto aumento de la tolerancia al estres, cuando se sobreexpresan en las plantas transgenicas. Sin embargo, a partir de estos estudios surgio la idea de que la tolerancia al estres ambiental es altamente compleja, que requiere de una activacion coordinada de multiples genes. Esto ha llevado a la adopcion de estrategias transgenicas que hacen uso de componentes de transduccion de serales que controlan la expresion o la actividad de proteinas para defenderse del estres, mas que de las proteinas para defenderse del estres en si mismas. Ejemplos exitosos de este tipo son la sobreexpresion de factores de transcripcion del dominio AP2, CBF1 y DREB1 A, y de los factores de choque termico HSF1 y 3 en Arabidopsis. CBF1 ha demostrado que mejora la tolerancia a la congelacion (Jaglo-Ottosen et al., Science 280: 104 - 106, 1998; Thomashow, patente de los Estados Unidos No. 5.929.305), mientras que la tolerancia al estres por frio y sequia inducida por DREB1A (Kasuga et al., Nature Biotechnol 19: 287 - 291, 1999) en Arabidopsis. HSF1 y 3, confieren ambos tolerancia al calor en plantas transgenicas (Lee y Schoffl, Plant J 8: 603 - 612, 1995; Prandl et al., Mol Gen Genet 258: 269 - 278, 1998). Resumen de la invencion La presente invencion incluye una secuencia aislada de ADN con una secuencia de nucleotidos tal como la presentada en la SEQ ID NO 2, que codifica al factor de transcripcion con una secuencia de aminoacidos como la presentada en la SEQ ID NO 3, que es capaz de enlazarse al elemento regulador cis DRE2 del promotor Rab17 del maiz. Este factor de transcripcion pertenece a un nuevo tipo de factores de transcripcion que contienen el dominio AP2 y se denominan adicionalmente como DBF1. Se muestran en la presente invencion que DBF1 y el elemento DRE2 median la respuesta del acido abscisico (ABA) en las plantas. ABA es una hormona de las plantas implicada en muchos procesos de las mismas, entre los cuales estan la induccion de tolerancia al estres. Es la primera vez

que se establece un vinculo entre una proteina sensible a ABA o una ruta sensible a ABA y un elemento que actua sobre cis en DRE. Ademas, este enlace se establece por medio de la identificacion de una proteina de enlazamiento DRE que, sorprendentemente, pertenece a la clase de proteina que contiene el dominio AP2, de cuyos miembros anteriormente conocidos estan todos involucrados de manera independiente de ABA.

La presente invencion incluye tambien metodos para identificar proteinas de maiz y de otras plantas que pueden unirse el elemento regulador DRE2, asi como los metodos para identificar las proteinas y los compuestos que interactuan con DBF1.

Una primera realizacion de la presente invencion comprende una secuencia aislada de acido nucleico que codifica una proteina DBF1 de la planta o un fragmento de la misma de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse a una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo que consiste de:

(a)

acido nucleico que comprende la secuencia de ADN, como la representada en la SEQ ID NO 2, y

(b)

acido nucleico que codifica una proteina que comprende una secuencia de aminoacidos como la representada en la SEQ ID NO 3.

Incorporada en la presente invencion estan tambien metodos para modificar la tolerancia al crecimiento, el rendimiento, y el estres de las plantas, que comprende la modificacion de la expresion en celulas, tejidos u organos particulares de una planta, de una secuencia de acido nucleico como la definida anteriormente, expresada bajo el control de un promotor constitutivo y/o ubicuo o regulado. El promotor regulado puede ser controlado por factores sensibles al estres o especificos de celulas / tejidos / organos.

La presente invencion se refiere tambien a una celula o planta que contiene dicho constructo genetico.

La presente invencion ademas abarca metodos para modificar el crecimiento, el rendimiento y la tolerancia al estres de las plantas, que comprende la modificacion de la expresion de secuencias de DBF1 como se describio anteriormente.

Descripcion detallada de la invencion

El estres por deshidratacion es probablemente el estres abiotico mas importante en la agricultura. Una celula padece estres por deshidratacion cuando experimenta una escasez de agua. Por lo general, esta situacion se produce como consecuencia de la sequia. Sin embargo, tambien el estres por sal y frio (en particular congelacion) conducen a estres por deshidratacion a nivel celular. Ademas, cualquier lesion del tejido (como consecuencia de heridas, tension mecanica, patogenos), asi como el calor, puede conducir a una mayor evaporacion del agua y por lo tanto a estres por deshidratacion. La perdida de agua a nivel celular tambien puede ocurrir como resultado de daro de la membrana, por ejemplo como consecuencia de la peroxidacion de lipidos durante el estres oxidativo.

La hormona vegetal acido abscisico (ABA) juega un papel importante en la proteccion de las plantas frente al estres por deshidratacion. ABA estimula el cierre de los estomas, y, a nivel celular, induce la sintesis de proteinas que protegen a los componentes celulares contra el daro por deshidratacion. La invencion descrita en la presente memoria mejora la sintesis de tales proteinas protectoras en las plantas. Mediante el uso de los metodos de la presente invencion, tales proteinas protectoras se sintetizan sin inducir todos los efectos pleiotropicos de ABA en la planta, ya que estos metodos no involucran la aplicacion de ABA en si misma.

Se ha demostrado que la induccion de respuestas de defensa por medio de ABA involucra dos vias de seralizacion, una de ellas involucra a los factores de transcripcion MYC / MYB (Urao et al., Plant Cell 5: 1529 -1539, 1993), y los segundos involucran a los factores BZIP, que se enlazan a los ABRE (elementos sensibles a ABA; Guiltinan et al., Science 250: 267 -271, 1990). Los elementos individuales ABRE tambien han sido identificados como elementos que actuan sobre cis en los promotores de genes que no estan regulados por ABA. Sin embargo, se ha demostrado que la union de factores BZIP a repeticiones de ABRE en respuesta a ABA requiere de repeticiones de elementos ABRE (revisado por Busk y Pages, Plant Mol. Biol. 37: 425 -435, 1998).

El gen rab17 (sensible al acido abscisico) es un ejemplo bien conocido de un gen sensible a ABA en el maiz. El promotor Rab17 contiene 5 elementos putativos ABRE, y por lo tanto, clasifica como un elemento BZIP funcional que se enlaza sobre cis, involucrado en la seralizacion de ABA (Busk et al., Plant J 11: 1285 -1295, 1997). El promotor rab17 tambien contiene elementos DRE, de los cuales la secuencia de nucleo es identica a la de DRE (sensible a la sequia) y elementos CRT (elementos de respuesta al frio) en Arabidopsis. Los elementos DRE / CRT se encuentran en los promotores de genes tales como rd29A, rd17, cor6.6, cor15a, erd10 y kin1, y la induccion de estos genes implica a los elementos DRE / CRT. Sin embargo, parece que diferentes factores de transcripcion son reclutados para estos elementos, dependiendo de la naturaleza de la situacion de estres. Estos factores de transcripcion pertenecen al tipo AP2/EREBP (proteina de enlazamiento al elemento de respuesta a apetala 2 / etileno) y se designan DREB (factor de enlazamiento DRE; Liu et al., Plant Cell 10:. 1391 -1406, 1998) o CBF (factor de enlazamiento CRT; Stockinger et al., Proc Natl Acad Sci 94: 1035 -1040, 1997). Por ejemplo, la expresion de DREB1A es fuertemente inducida frio y debilemente por sequia, mientras que DREB2A es principalmente sensible a la sequia (Liu et al., Plant Cell 10: 1391 - 1406, 1998). CBF (identica a DREB1B) es expresada constitutivamente (Stockinger et al., Proc Natl Acad Sci 94: 1035 -1040, 1997), si bien hay cierta controversia sobre si es adicionalmente inducida por frio (Stockinger et al., Proc Natl Acad. Sci. 94: 1035 -1040, 1997; Liu et al., Plant Cell 10: 1391 - 1406, 1998).

Curiosamente, ABA no parece desemperar un papel en la activacion de DREB/CBF1 en Arabidopsis, ya que el control de la transcripcion mediada por DRE se produce en una forma independiente de ABA. Fue sorprendente por lo tanto encontrar que los elementos DRE en el promotor rab17 de maiz toman parte en la activacion de la expresion genica por parte de ABA (Busk et al., Plant J 11: 1285 -1295,1997). Este hallazgo nos llevo a iniciar investigaciones para lograr la elucidacion de los factores de transcripcion que se enlazan al elemento DRE2 en maiz y que activan la expresion genica a traves de DRE2 en respuesta a ABA. La caracterizacion de tal factor es la base de la presente invencion.

La presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado que codifica una proteina DBF1 de la planta o un fragmento de la misma de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo de:

(a)

acido nucleico que comprende la secuencia de ADN como como la presentada en la SEQ ID NO 2, y

(b)

acido nucleico que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoacido como la presentada en la SEQ ID NO 3.

La presente invencion tambien se refiere a un acido nucleico aislado como se definio anteriormente que codifica un polipeptido o un fragmento del mismo de al menos 50 aminoacidos de longitud que se enlaza a una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE, por ejemplo una secuencia de DRE como la presentada en la SEQ ID NO 1.

La secuencia de DRE como la presentada en la SEQ ID NO 1 comprende tres repeticiones en tandem del elemento DRE2.

La presente invencion tambien se refiere a una secuencia aislada de acido nucleico que codifica un factor de transcripcion que contiene un dominio AP2/EREBP o un fragmento del mismo como se definio anteriormente que se enlaza a una secuencia de ADN reguladora de cis y para la cual la intensidad de dicho enlazamiento esta regulada por ABA. Un ejemplo de tal secuencia de ADN reguladora de cis de acuerdo con la invencion es un elemento DRE, por ejemplo un elemento DRE como se presenta en la SEQID NO 1. La intensidad del enlazamiento puede medirse por medio de varios metodos conocidos por la persona capacitada en el arte. Un ejemplo de un metodo in vivo es el uso de la tecnica de un solo hibrido en levadura como se describe en el ejemplo 1. Aqui la intensidad del color producido por la enzima del gen reportero es representativo de la intensidad del enlazamiento entre la proteina al oligonucleotido. Un metodo alternativo es, por ejemplo, un experimento del enlazamiento ADN-poteina in vitro. Los resultados pueden ser medidos a traves de tecnicas de ensayo de desplazamiento en gel de electroforesis como se describe en el ejemplo 6. Ademas, la intensidad del enlazamiento puede medirse por medio de ensayos de competicion, por ejemplo como se describe en el ejemplo 6.

La presente invencion tambien se refiere a un acido nucleico aislado que codifica un factor de transcripcion que contiene el dominio AP2/EREBP o un fragmento del mismo como se definio anteriormente que se enlaza a una secuencia de ADN reguladora de cis y que activa la transcripcion de las secuencias reguladas por dicho elemento regulador de cis en respuesta a ABA. Un ejemplo de tal secuencia de ADN reguladora de cis es un elemento DRE, por ejemplo un elemento DRE como se presenta en la SEQID NO 1.

La memoria descriptiva tambien describe un acido nucleico aislado que codifica un factor de transcripcion que contiene un dominio AP2/EREBP o un fragmento funcional o inmunologicamente activo del mismo que comprende una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 14, o que comprende una secuencia que es al menos 50%, mas preferiblemente 60%, y lo mas preferiblemente al menos 70% o 75% identica a la SEQ ID NO 14: PLXXXV(D/N) AKL(Q/E)XIC. La presente invencion tambien se refiere a un acido nucleico aislado de la invencion como se definio anteriormente que es ADNc, ADN, ADN genomico o ADN sintetico, o ARN en donde T es reemplazado por U.

La presente invencion tambien se refiere a cualquiera de los acidos nucleicos aislados como se definieron anteriormente, pero que se derivan de una planta monocotiledonea.

La presente invencion tambien se refiere a un polipeptido codificado por cualquiera de los acidos nucleicos de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende cualquiera de las secuencias de acido nucleico de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a un vector de la invencion de la invencion como se describio anteriormente que es un vector de expresion en donde dicha secuencia de acido nucleico esta operativamente enlazada a una o mas secuencias de control que permite la expresion en celulas huesped procariotas y/o eucariotas.

La presente invencion tambien se refiere a una celula huesped que contiene un transgen DBF1 que comprende una molecula de acido nucleico o un vector de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a una celula huesped de la invencion como se describio anteriormente seleccionada del grupo que consiste de una celula bacteriana, de insecto, de hongo, de planta o de animal.

La presente invencion se refiere tambien a un metodo para la produccion de plantas transgenicas, celulas de plantas

o tejido de plantas que comprende la introduccion de un acido nucleico de la invencion como se describio anteriormente o de un vector de la invencion como se describio anteriormente en el genoma de una planta, celula de una planta o tejido de una planta.

La presente invencion se refiere tambien a un metodo de la invencion como se describio anteriormente que comprende ademas la regeneracion de una planta a partir de dicho tejido de la planta o celula de la planta.

La presente invencion tambien se refiere a una celula de una planta transgenica que comprende un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de la invencion como se describio anteriormente, que esta enlazado operativamente a elementos reguladores que permiten la transcripcion y/o expresion de la secuencia de acido nucleico en celulas de plantas o que puede obtenerse de acuerdo con el metodo de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a la celula de planta transgenica de la invencion como se describio anteriormente en el que dicha secuencia de acido nucleico o dicho vector se integran de manera estable en el genoma de la celula de la planta.

La presente invencion tambien se refiere a una planta transgenica o a un tejido de una planta que comprende celulas vegetales de la invencion como se describio anteriormente.

La presente memoria descriptiva tambien se refiere a homologos, analogos o paralogos de las proteinas DBF1 (y los acidos nucleicos) de la invencion y a los usos de los mismos.

Un ejemplo interesante es un homologo DBF1 de arroz que se agrupa cercanamente con DBF1 como se muestra en la figura 7. La secuencia de ADN del homologo de arroz se representa en la SEQ ID NO 15 y la correspondiente secuencia de proteina se representa en la SEQ ID NO 16 (vease el ejemplo 8).

La memoria descriptiva se refiere tambien a un metodo para la produccion de plantas transgenicas, dichas plantas caracterizadas por tener un mayor crecimiento y/o rendimiento bajo condiciones de estres y/o no estresadas, comprendiendo dicho metodo:

a) introducir un acido nucleico o un vector de la invencion como se describio anteriormente en el genoma de una celula de una planta o tejido de una planta, o, b) introducir un acido nucleico que comprende una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 15, o un homologo o analogo o paralogo dela misma, o un vector que comprende una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 15 en una celula de una planta o tejido de una planta, c) regenerar plantas a partir de dichas celulas o tejidos de la planta transformada, y, d) seleccionar una planta que exhiba dicho aumento en el crecimiento y/o el rendimiento.

La memoria descriptiva tambien describe un metodo para la produccion de plantas transgenicas, dichas plantas caracterizadas por tener una mayor expresion de al menos una proteina relacionada con el estres, comprendiendo dicho metodo:

a) introducir un acido nucleico o un vector de la invencion como se describio anteriormente en el genoma de una celula de una planta o tejido de una planta, o, b) introducir un acido nucleico que comprende una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 15, o un homologo o analogo o paralogo dela misma, o un vector que comprende una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 15 en una celula de una planta o tejido de una planta, c) regenerar plantas a partir de dichas celulas o tejidos de la planta transformada, y, d) seleccionar una planta que exhiba dicha mayor expresion de dicha proteina relacionada con el estres.

La presente invencion tambien se refiere a una planta transgenica que puede ser obtenida mediante cualquiera de los metodos de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a una planta transgenica de la invencion como se describio anteriormente o

que puede ser obtenida por medio de cualquiera de los metodos de la invencion como se describio anteriormente en el que dicha planta es una planta monocotiledonea.

La presente invencion tambien se refiere al tejido de una planta que comprende un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico o un vector como se definio anteriormente derivado de una planta de la invencion como se describio anteriormente o de una planta que puede ser obtenida por un metodo de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a una parte cosechable o propagulo derivado de una planta de la invencion como se describio anteriormente o de una planta obtenible por un metodo de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a una parte cosechable o a un propagulo derivado de una planta de la invencion como se describio anteriormente, o de una planta que puede ser obtenida por un metodo de la invencion como se describio anteriormente, dicha parte cosechable o propagulo que comprende un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico o un vector como se definio anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a la parte cosechable de la invencion como se describio anteriormente que se selecciona del grupo que consiste de semillas, hojas, raices, flores, frutos, tallos, rizomas, tuberculos y bulbos, dichas partes cosechables comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico o un vector como se definio anteriormente.

La presente invencion se refiere tambien a la progenie dicha progenie comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico o un vector como se definio anteriormente derivados de cualquiera de las plantas, tejidos de las plantas o partes de las plantas de la invencion como se describio anteriormente.

La presente invencion se refiere tambien a un metodo para identificacion de polipeptidos que interactuan con un polipeptido de la invencion como se describio anteriormente, que comprende un ensayo de seleccion de doble hibrido en donde al menos un polipeptido de la invencion, como cebo y una biblioteca de ADNc de una planta o parte de una planta como presa se expresan.

La memoria descriptiva describe tambien un metodo para identificar y obtener acidos nucleicos que codifican polipeptidos que enlazan DRE(2) que comprende un ensayo de seleccion de un hibrido en donde un elemento DRE, tal como una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 1 que contiene uno o mas elementos DRE, como cebo y una biblioteca de ADNc de una planta monocotiledonea o parte de una planta como presa se expresan.

La memoria descriptiva describe tambien un metodo para identificar y obtener acidos nucleicos que codifican polipeptidos que enlazan ADN que modifica ABA y respuestas relacionadas con el estres en plantas que comprende un ensayo de seleccion de un hibrido en donde un elemento DRE, tal como una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 1 que contiene uno o mas elementos DRE, o una secuencia que es al menos 70% identica a la SEQ ID NO 1 se usa como cebo y una biblioteca de ADNc de una planta monocotiledonea o parte de una planta como presa se expresan.

La presente invencion se refiere tambien al vector de la invencion como se describio anteriormente que es un vector de expresion en donde dicho acido nucleico esta operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que permite la expresion en celulas huesped procariotas y/o eucariotas. La presente memoria descriptiva describe tambien un metodo para la produccion de plantas monocotiledoneas transgenicas, dichas plantas caracterizadas por tener, mayor expresion de al menos una proteina relacionada con el estres, y/o que muestran mayor tolerancia al estres, y/o que producen un mayor rendimiento y mejor crecimiento, comprendiendo dicho metodo:

(a)

introducir un acido nucleico o un vector de la invencion como se describio anteriormente en el genoma de una celula de una planta o tejido de una planta,

(b)

regenerar plantas a partir de dichas celulas o tejidos de una planta transformada, y

(c)

seleccionar una planta que exhiba dicha expresion incrementada.

Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que el promotor rab17 de maiz no es inducible mas por ABA cuando se expresa en Arabidopsis, lo que demuestra que los componentes de seralizacion involucrados en el control de ABA de elementos DRE2 o bien estan ausentes en Arabidopsis o no estan funcionalmente conservados entre Arabidopsis y maiz. Alternativamente, los componentes de seralizacion involucrados en el control de ABA de elementos DRE2 estan presentes en Arabidopsis, pero el contexto del promotor rab17 del maiz no es el contexto apropiado para permitir el enlazamiento de estas proteinas ortologas de Arabidopsis como las identificadas en la presente invencion en el genoma de Arabidopsis con el elemento DRE. Por lo tanto, en una realizacion interesante de la presente invencion, los acidos nucleicos o los polipeptidos de la presente invencion se derivan de una planta monocotiledonea; las celulas huesped y las plantas transgenicas de la presente invencion son celulas o plantas monocotiledoneas; y los metodos de la presente invencion se van a utilizar en celulas, tejidos o plantas monocotiledoneas.

Alternativamente, en una realizacion particular relacionada de la presente invencion, los acidos nucleicos de la presente invencion o los polipeptidos se deriva de una dicotiledonea, las celulas huesped y las plantas transgenicas de la presente invencion son una dicotiledonea, o los metodos de la presente invencion son para ser usados en dicotiledoneas.

Los experimentos para obtencion de la impronta (footprinting) revelaron que el enlazamiento de la proteina con el elemento DRE2 se produjo tanto en embriones de maiz como en hojas bajo condiciones no estresadas, pero que el enlazamiento se incremento y/o se intensifico despues de estres hidrico o la aplicacion de ABA (Busk et al., Plant J.

11: 1285 - 1295, 1997). Con el fin de caracterizar las proteinas de enlazamiento con el elemento DRE2, se llevaron a cabo selecciones de un solo hibrido en levadura usando tres repeticiones en tandem del elemento DRE2 de 19 pb (SEQ ID NO 1) como cebo (vease el Ejemplo 1). Dos clones diferentes que se enlazan a DRE2 fueron identificados a partir de una biblioteca de ADNc de hojas estresadas por humedad. Cada uno de estos clones fue aislado varias veces a partir de un experimento independiente, que apoya la validez de la interaccion. Este resultado demuestra que el elemento DRE2 constituye un elemento promotor funcional que actua sobre cis para la expresion genica y ensera como aislar proteinas que enlazan DRE2 de maiz o de otras especies. La identificacion de DRE2 como un elemento regulador de cis involucrado en las respuestas de ABA tambien permite seleccionar promotores de otros genes para secuencias que son identicas o muy similares a DRE2 y para aislar polipeptidos que se enlazan a tales elementos. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe un metodo para identificar y obtener polipeptidos que se enlazan con DRE-2 que comprende un ensayo de seleccion de un solo hibrido en el que se utilizan la SEQ ID NO 1 como cebo y una biblioteca de ADNc de una planta monocotiledonea o parte de una planta como presa. Del mismo modo, la memoria descriptiva describe un metodo para identificar y obtener polipeptidos que enlazan ADN que modifican las respuestas relacionadas con ABA y con el estres en plantas que comprende un ensayo de seleccion de un solo hibrido en el que una secuencia que es al menos 70% identica a la SEQ ID NO 1 se utiliza como un cebo y una biblioteca de ADNc de una planta o parte de una planta monocotiledonea se utilizan como una presa.

Uno de los clones de enlazamiento de DRE2 fue denominado DBF1, que significa Factor 1 de Enlazamiento de DRE. El ADN y las secuencias de aminoacido de DBF1 se da en la SEQ ID NO 2 y la SEQ ID NO 3 (vease el Ejemplo 2). DBF1 contiene una region de sesenta aminoacidos que constituye un dominio de enlazamiento del ADN, el dominio AP2, que esta altamente conservado en los miembros de la familia AP2/EREBP de factores de transcripcion de la planta (Figura 1). Sorprendentemente, las secuencias de aminoacidos de DBF1 no muestran homologia significativa por fuera de esta region con los miembros reportados de la familia AP2/EREBP, incluyendo CBF1, DREB1A, y DREB2A, que enlazan los elementos DRE / CRT en Arabidopsis. Esto implica que el papel de DBF1 como proteina de enlazamiento de DRE2 y como una proteina seral en las respuestas de ABA (vease mas adelante) no solamente pueden ser deducidas a partir de la similitud del ADN o de la secuencia de aminoacidos con los miembros conocidos de la familia AP2/EREBP. Esto se ilustra adicionalmente mediante una busqueda Blast de similitud de secuencia contra una base de datos de proteina no redundante (Ejemplo 3): las mayores similitudes con DBF1 fueron encontradas con 6 proteinas AP2/EREBP de Arabidopsis de funcion desconocida (valores de E de e-44 hasta e-39). Todas las proteinas AP2/EREBP de funcion conocida tenian puntajes similares de e-20 o inferiores. Las CBF1, DREB1A, y DREB2A tenian valores de E de e-16 hasta e-15 y habian aproximadamente otras 50 proteinas de la familia AP2/EREBP en Arabidopsis que tenian valores similares a DBF1 que caen dentro del mismo rango. La mayoria de estas son de funcion desconocida, mientras que algunas otras han sido implicadas en las respuestas hormonales, principalmente con etileno. Solo una de ellas, denominada AB14, habia sido previamente implicado en respuestas de ABA, pero su funcion precisa o el modo de accion siguen siendo desconocidos en la actualidad (Finkelstein et al., Plant Cell 10: 1043 -1054, 1998). AB14 tiene un valor de E de e-19, y por lo tanto no esta particularmente estrechamente relacionada en estructura con DBF1.

El papel de DBF1 en las respuestas de ABA y el estres por deshidratacion fue adicionalmente corroborado por medio de los datos siguientes. En primer lugar, el patron de expresion de DBF1 esta en linea con tal funcion (Ejemplo 4). DBF1 se transcribio fuertemente despues del tratamiento de deshidratacion en todas las partes vegetativas y tambien fue inducido por salinidad y ABA, con los niveles de expresion mas altos en las raices (Figura 2). Este patron de expresion es similar a aquel de rab17, de acuerdo con el papel de DBF1 mas arriba de rab17. El analisis de la cinetica de esta induccion mostro que los niveles de ARNm para DBF1 aumentaron en menos de una hora (Figura 3). DBF1 tambien se expreso fuertemente en embriones de maiz, y esta expresion fue tambien inducible por ABA. Los genes relacionados con la deshidratacion, incluyendo rab17, tambien se expresan durante la embriogenesis, con el fin de proteger al embrion durante la desecacion de la semilla. Por lo tanto, estos datos indican que DBF1 no solo controla las respuestas de deshidratacion durante un estres ambiental, sino tambien durante el desarrollo. Los perfiles de la proteina DBF1, detectados usando anticuerpos producidos contra la proteina DBF1, fueron congruentes con los patrones de ARNm para DBF1 antes mencionados (Figura 4). En segundo lugar, se demostro que la sobreexpresion de DBF1 potencia la respuesta de ABA en celulas de callo de maiz (Ejemplo 5). La fusion promotor rab17-GUS se expreso en celulas de callo de maiz, la mitad de las cuales se cultivaron cultivaron en presencia de ABA y la otra mitad sin. La expresion de DBF1 indujo actividad promotora, tanto en presencia como en ausencia de ABA (Figura 5). Ademas, la mutacion del elemento DRE2 en la fusion promotor rab17-GUS redujo la actividad del promotor y su sensibilidad a ABA. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que DBF1, a traves del enlazamiento con el elemento DRE2, regula las respuestas de ABA y los mecanismos de defensa contra el estres.

Aparte del enlazamiento con DRE2, no se excluyen otros modos de accion de DBF1. DBF1 no se enlaza con elementos DRE1 o ABRE (Figura 6, Ejemplo 6), que tambien se localizan en el promotor rab17. Sin embargo, se propone que DBF1 puede promover el enlazamiento y/o la actividad de los factores de enlazamiento con DRE1, ABRE u otros elementos promotores rab17. De conformidad con ese modelo, se han demostrado interacciones entre factores b-ZIP, que se enlazan con elementos ABRE, y las proteinas del dominio AP2/EREBP en relacion con otros elementos reguladores de cis (Buttner y Singh, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94: 5961 -5966, 1997). Por lo tanto, sin estar ligado a un modo de accion, proponemos que DBF1 toma parte en el control de las respuestas de ABA y la activacion de los mecanismos de defensa contra el estres en maiz.

No obstante, no se excluye que DBF1 sea capaz de enlazarse tambien con otros elementos que actuan en cis diferentes a DRE2. Tomados en conjunto, los datos presentados aqui son los primeros en demostrar que la regulacion de ABA de los elementos que actuan en cis de DRE en maiz involucran factores de transcripcion del dominio AP2/EREBP factores de transcripcion de dominio. Los datos de esta invencion son tambien los primeros en describir la secuencia de ADN y de la proteina de un factor de transcripcion del dominio AP2/EREBP con una funcion en la seralizacion de ABA y en demostrar que esta proteina es estructuralmente muy divergente de los dominios AP2/EREBP de funcion conocida. Tanto el papel de los factores de transcripcion del dominio AP2/EREBP en la seralizacion de ABA como la secuencia especifica de un factor de transcripcion del dominio AP2/EREBP con tal funcion eran hasta ahora desconocidos y, en consecuencia, la invencion presentada y sus realizaciones no podria ser previstas.

Dada la estrecha relacion filogenetica de especies de cereales, una persona capacitada en la tecnica sera capaz de identificar proteinas con una funcion similar a DBF1 de otros cereales, o de otras monocotiledoneas. Ademas, los factores de enlazamiento de DRE en Arabidopsis son parte de familias de genes, por lo tanto, es probable que el maiz y otros cereales contengan varios genes que codifican para proteinas que estan estructural y funcionalmente relacionadas con DBF1. Los metodos para identificar homologos de DBF1 de la misma o de otras especies incluyen, pero no se limitan a, la alineacion de secuencias, las hibridaciones de ADN o ARN, selecciones con un hibrido con el elemento DRE1 o purificacion de proteinas por afinidad con el elemento DRE1.

Las modalidades descritas mas adelante se refieren a: una secuencia de polipeptidos que comprende al menos parte (al menos 50 aminoacidos de longitud) de la secuencia de la proteina, como se presenta en la SEQ ID NO 3.

En una realizacion descrita aqui, la expresion modificada de DBF1, en las plantas transgenicas proporcionara tales plantas con una caracteristica de valor comercial. La modificacion de la expresion de DBF1, se logra preferentemente por medio de la fusion de la secuencia que codifica a un promotor heterologo y la transformacion de tal fusion en un modo expresable en plantas transgenicas. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo.

En otra realizacion de la invencion, se reivindica un metodo para la produccion de plantas monocotiledoneas transgenicas, dichas plantas caracterizadas por tener mayor expresion de al menos una proteina relacionada con el estres, tal como Rab17, comprendiendo dicho metodo la transformacion de un acido nucleico que codifica DBF1 en una forma expresable en una planta transgenica, preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. En otra realizacion de la invencion, la expresion de DBF1, bajo el control de un promotor constitutivo fuerte mejorara la tolerancia de las plantas al estres ambiental, en particular estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion de DBF1, bajo el control de un promotor inducible por estres aumentara la tolerancia de las plantas al estres ambiental, en particular estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo.

En otra realizacion de la invencion, la expresion de DBF1, bajo el control de un promotor especifico del tejido mejorara la tolerancia de los organos de la planta que son particularmente propensos al estres ambiental, en particular al estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. El promotor se expresa preferiblemente ya sea en raices, tallos o en anteras.

En otra realizacion de la invencion, la expresion de DBF1, bajo el control de un promotor controlado por desarrollo mejorara la tolerancia de las plantas en etapas especificas de desarrollo que son particularmente propensas al estres medioambiental, en particular, estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. El promotor se expresa preferiblemente ya sea en polen, ovulos, o en semillas.

En otra realizacion de la invencion, la expresion de DBF1, bajo el control de un promotor que contiene DRE1 aumentara la tolerancia de las plantas frente al estres ambiental, en particular, estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Curiosamente, los presentes resultados mostraron que la mutacion del elemento DRE2 no elimina completamente la actividad del promotor Rab17 o la sensibilidad a ABA, aunque anula el enlazamiento de DBF1. Esto indica que la actividad del promotor Rab17 y la sensibilidad a ABA es una superposicion de diferentes rutas de regulacion, que ejercen efectos aditivos. Se propone por lo tanto que la sobreexpresion combinada de DBF1 con factores de transcripcion que median las respuestas de ABA a traves de elementos que actuan en cis diferentes a DRE, tendra efectos mas fuertes sobre la expresion de proteinas de respuesta al estres, tales como Rab17, que la sobreexpresion de DBF1 solo. Las proteinas candidatas para coexpresion con DBF1 son moleculas que se conocen en el estado del arte existente como moleculas de seralizacion de la ruta sensible a ABA de respuesta al estres, tal como los factores de enlazamiento de ABRE de la familia b-zip, tales como EMBP-1 (Guiltinan et al., Science 250: 267 -271, 1990; Gupta et al., Plant Mol. Biol. 37: 629 -637, 1998) y las proteinas MYB / MYC involucradas en la seralizacion de ABA (Abe et al., Plant Cell 9: 1859 1868, 1999). Ya que el enlazamiento de factores BZIP con elementos ABRE se ve reforzada por la interaccion con las proteinas dedo de zinc del tipo C2H2, tales como SCOF-1 (Jong et al., Abstract S31 -46, Libro de Resumenes de la reunion ISPMB en Quebec, junio 18 -24, 2000, Suplemento del Reporte 18: 2), incluso se proponen niveles mas altos de expresion de genes sensibles al estres, tales como Rab17, cuando la sobreexpresion de DBF1, factores b-zip y proteinas dedo de zinc del tipo C2H2, se combina en una sola planta.

Las realizaciones preferidas de la invencion por lo tanto tambien incluyen la sobreexpresion de DBF1 en combinacion con las proteinas de seralizacion de otras rutas de ABA que controlan la activacion genica.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion modificada de DBF1, en combinacion con la expresion modificada de un factor de enlazamiento de ABRE de la familia BZIP, en plantas transgenicas mejorara la tolerancia de las plantas frente al estres ambiental, en particular, estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente ya sea constitutivos y/o ubicuos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion de la invencion, la expresion modificada de DBF1, en combinacion con la expresion modificada de un factor MYC que es inducible por ABA, en plantas transgenicas mejorara la tolerancia de las plantas frente al estres ambiental, en particular, estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente o bien constitutivos y/o ubicuos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion modificada de DBF1, en combinacion con la expresion modificada de una proteina dedo de zinc del tipo C2H2 que enlaza a los factores de enlazamiento de ABRE de la familia BZIP, en plantas transgenicas mejorara la tolerancia de las plantas frente al estres ambiental, en particular al estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente o bien constitutivos y/o ubicuos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion de la invencion, la expresion modificada de DBF1, en combinacion con la expresion modificada de un factor MYB que es inducible por ABA, en plantas transgenicas mejorara la tolerancia de las plantas frente al estres ambiental, en particular, estres por deshidratacion. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente constitutivos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion modificada de proteinas de las siguientes clases en una planta transgenica individual mejorara la tolerancia frente al estres ambiental, en particular, al estres por deshidratacion: DBF1, en combinacion con un factor de enlazamiento de ABRE de la familia bZIP, en combinacion con una proteina dedo de zinc del tipo C2H2 que enlaza factores de enlazamiento de ABRE de la familia bZIP. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente o bien constitutivos y/o ubicuos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion modificada de proteinas de las siguientes clases en una planta transgenica individual mejorara la tolerancia frente al estres ambiental, en particular, al estres por deshidratacion: DBF1, en combinacion con un factor MYC a partir del cual la expresion es inducible por ABA, en combinacion con un factor MYB a partir del cual la expresion es inducible por ABA. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente o bien constitutivos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

En otra realizacion descrita aqui, la expresion modificada de proteinas de las siguientes clases en una planta transgenica individual mejorara la tolerancia frente al estres ambiental, en particular, estres por deshidratacion: DBF1, en combinacion con factores de enlazamiento de ABRE de la familia bZIP, en combinacion con una proteina dedo de zinc del tipo C2H2 que enlaza factores de enlazamiento de ABRE de la familia bZIP, en combinacion con un factor MYC a partir del cual la expresion es inducible por ABA, en combinacion con un factor de MYB que la expresion es inducible por ABA. La planta es preferiblemente un cereal, tal como maiz, trigo, arroz, cebada, o sorgo. Los promotores utilizados para dirigir la expresion de estas proteinas son preferentemente o bien constitutivos, inducibles por estres, especificos del tejido o controlados por desarrollo.

Alternativamente, la expresion de DBF1 se combina con la expresion con (al menos una) otra molecula de seralizacion de la ruta independiente de ABA (tal como proteinas de enlazamiento DRE) con el fin de potenciar el efecto sobre la expresion de genes que llevan en su promotor un elemento DRE, tal como genes sensibles al estres (rd29A o Rab17 etc.). Los ejemplos de tales proteinas de enlazamiento de DRE que se combinan con la proteina DBF1 de la presente invencion son: proteinas del tipo CBF1 (Stockinger et al., Proc Natl Acad Sci 94: 1035 -1040, 1997) o DREB1A o DREB2A (Liu et al. , Plant Cell 10: 1391 - 1406, 1998).

Ademas, en una realizacion particular descrita aqui, el proposito es combinar ambas rutas conocidas sensibles al estres, es decir, combinar la ruta que depende de ABA y la ruta independiente de ABA. Esto se hace particularmente combinando la expresion de moleculas de seralizacion involucradas en estas rutas, ejemplos de las cuales se han descrito anteriormente. Por consiguiente, en una realizacion particular descrita aqui, la expresion de la molecula de DBF1 se combina con una molecula de seralizacion de la ruta que depende de ABA, asi como con una molecula de seralizacion de la ruta independiente de ABA.

La proteina zmDBF1 como la identificada en la presente invencion tambien tiene homologos en otras especies de plantas. Los inventores fueron capaces de identificar los homologos mas cercanos de Arabidopsis: AAF87854 y T02511, el homologo mas cercano de Atriplex hortensis: AAF76898 y el homologo mas cercano de Lupinus polyphyllis PZ02-LUPPO. Como para las plantas monocotiledoneas, mas particularmente plantas de cultivo, tambien se encontraron homologos de DBF1 de la cara de azucar y homologos de DBF1 del arroz. Un ejemplo de un homologo de DBF1 del arroz que se agrupa cercanamente con DBF1 se muestra en la figura 7. La secuencia de ADN del homologo de arroz se representa en la SEQ ID NO 15 y la correspondiente secuencia de proteina se representa en la SEQ ID NO 16 (vease el ejemplo 8).

Por consiguiente, la memoria descriptiva describe el uso de homologos de los acidos nucleicos y proteinas ZmDBF1 para todas las aplicaciones descritas para los acidos nucleicos y proteinas ZmDBF1 pero con dichos acidos nucleicos y proteinas derivados de otras especies de plantas.

La memoria descriptiva describe mas particularmente el uso de los homologos de DBF1 del arroz tal como se presentan en la SEQ ID NO 15, por ejemplo, en un vector descrito aqui y/o en las celulas huesped y en las plantas transgenicas descritas aqui y/o en los metodos descritos en la presente invencion.

La memoria descriptiva describe un vector, una celula huesped o una celula, tejido, o planta transgenicos que contienen un acido nucleico que tiene una secuencia como la representada en la SEQ ID NO 15.

La memoria descriptiva describe ademas el uso de cualquiera de las secuencias como las representadas en la SEQ ID NO 15 o 16, o un vector o una celula huesped que comprende cualquiera de dichas secuencias, en cualquiera de los metodos descritos aqui.

Los genes y los metodos de la presente invencion son particularmente utiles para la produccion de celulas huesped u organismos huesped con crecimiento y/o rendimiento modulado (por ejemplo, mayor) bajo condiciones estresadas y/o no estresadas. Esto se puede lograr al influir directamente en el nivel de expresion y/o el nivel de actividad de los genes DBF1 o proteinas DBF1 de la presente invencion en dicha celula huesped u organismo huesped. Mas particularmente, se puede lograr influir en el nivel de expresion y/o de actividad de DBF1 mediante el uso del gen endogeno DBF1 o la proteina DBF1 de la celula huesped, o mediante el uso de un transgen DBF1, o mediante el uso de una proteina exogena DBF1.

Alternativamente, la modulacion del crecimiento y/o el rendimiento con los genes y los metodos de la presente invencion tambien se puede lograr indirectamente influyendo sobre el nivel de expresion y/o actividad de otros genes de interes, por ejemplo otros genes de tolerancia al estres o inducibles por estres, u otros genes reguladores del crecimiento. Esto se puede hacer elaborando un constructo en el que se pone ese gen particular bajo el control de un promotor que contiene al menos un elemento DRE, e introducir simultaneamente ese constructo en una celula huesped junto con la proteina DBF1 de la presente invencion. El efecto es que la proteina DBF1 puede ser capaz de activar la expresion de dicho gen y para conferir caracteristicas alteradas de crecimiento para esa celula huesped.

La introduccion simultanea de la proteina DBF1 con dicho constructo puede lograrse de diferentes maneras: el gen endogeno DBF1 o la proteina de la celula huesped pueden ser activados, se puede introducir un transgen que codifica DBF1 en la celula huesped, o se puede administrar la proteina DBF1 a la celula huesped.

Definiciones y elaboraciones de las realizaciones A todo lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", y sus variaciones se entendera que implican la inclusion de un numero entero establecido o etapa o grupo de enteros

o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas.

Tal como se utiliza aqui, el termino "derivado de" debe entenderse que indica que un entero particular o grupo de numeros enteros se ha originado a partir de las especies especificadas, pero no necesariamente ha sido obtenido directamente a partir de la fuente especificada.

10 Los terminos "proteina(s)", "peptido(s)" u "oligopeptido(s)", cuando se usan en la presente memoria se refieren a aminoacidos en una forma polimerica de cualquier longitud. Dichos terminos incluyen tambien modificaciones conocidas de aminoacidos tales como la formacion de enlaces disulfuro, cisteinilacion, oxidacion, glutationilacion, metilacion, acetilacion, farnesilacion, biotinilacion, estearoilacion, formilacion, adicion de acido lipoico, fosforilacion, sulfatacion, fosforilacion, ubiquitinacion, miristoilacion, palmitoilacion, geranilgeranilacion, ciclacion (por ejemplo,

15 formacion de acido piroglutamico), oxidacion, desamidacion, deshidratacion, glicosilacion (por ejemplo pentosas, hexosaminas, N-acetilhexosaminas, desoxihexosas, hexosas, acido sialico, etc.), acilacion y marcadores radiactivos (por ejemplo 125I, 131I, 35S, 14C, 32P, 33P, 3H), asi como residuos de aminoacidos de origen no natural, residuos de Laminoacidos y residuos de D-aminoacidos.

20 Tabla 1: Propiedades de los aminoacidos de origen natural.

Propiedades de carga / hidrofobicidad

Grupo lateral Aminoacido

hidrofobos no polares

alifatico alifatico, contiene S aromatico imino Ala, Ile, Leu, Val Met Phe, Trp Pro

polares no cargados

alifatico amida aromatico hidroxilo sulfhidrilo Gly Asn, Gln Tyr Ser, Thr Cys

cargados positivamente

basico Arg, His, Lys

acido

Asp, Gly

"Homologos" de una proteina son aquellos peptidos, oligopeptidos, polipeptidos, proteinas y enzimas que contienen sustituciones de aminoacidos, supresiones y/o adiciones con relacion a dicha proteina con respecto a cual de ellos 25 son un homologo sin alterar una o mas de sus propiedades funcionales, en particular sin reducir la actividad de la resultante. Por ejemplo, un homologo de dicha proteina consistira de una variante bioactiva de una secuencia de aminoacidos de dicha proteina. Para producir tales homologos, los aminoacidos presentes en dicha proteina pueden ser reemplazados por otros aminoacidos que tengan propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrofobo, antigenicidad, propension a formar o romper estructuras helicoidales a o

30 estructuras de lamina �, y asi sucesivamente. Una vision general de las propiedades fisicas y quimicas de los aminoacidos se presenta en la Tabla 1.

Dos formas especiales de homologia, ortologos y paralogos, son conceptos evolutivos utilizados para describir relaciones ancestrales de los genes. El termino "paralogos" se refiere a las duplicaciones de genes dentro del 35 genoma de una especie, que conduce a genes paralogos. El termino "ortologos" se relaciona con genes homologos en organismos diferentes, debido a una relacion ancestral. La memoria descriptiva tambien se refiere a homologos, paralogos y ortologos de las proteinas de acuerdo con la invencion. Las variantes de sustitucion de una proteina descrita aqui son aquellas en las que al menos un residuo en dicha secuencia de aminoacidos de la proteina ha sido removido y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoacidos son tipicamente de

40 residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipeptido; las inserciones normalmente seran del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoacidos y las supresiones variaran en un rango de aproximadamente 1 a 20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoacidos comprenderan sustituciones conservadoras de aminoacidos, tales como aquellas descritas mas arriba.

Las variantes por insercion de la secuencia de aminoacidos de una proteina de la invencion son aquellas en las que se introducen uno o mas residuos de aminoacidos en un sitio predeterminado en dicha proteina. Las inserciones pueden comprender fusiones en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo asi como inserciones dentro de la secuencia de aminoacidos individuales o multiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoacidos seran mas pequeras que las fusiones en el terminal amino o en el terminal carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteinas o peptidos de fusion en los terminales amino o carboxilo incluyen el dominio de enlazamiento o el dominio de activacion de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de doble hibrido en levadura, las proteinas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, glutationa S-transferasa, proteina A, proteina de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epitopo Tag·100 (EETARFQPGYRS), epitopo c-myc (EQKLISEEDL), epitopo FLAG® (DYKDDDK), lacZ, CMP (peptido de enlazamiento de calmodulina), epitopo HA (YPYDVPDYA), epitopo de proteina C (EDQVDPRLIDGK) y epitopo de VSV (YTDIEMNRLGK).

Las variantes de supresion de una proteina de la invencion se caracterizan por la remocion de uno o mas aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de dicha proteina.

Las variantes de aminoacidos de una proteina de la invencion se pueden elaborar facilmente utilizando tecnicas de sintesis de peptidos bien conocidas en la tecnica, tales como sintesis de peptidos en fase solida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Las manipulaciones de secuencias de ADN para producir variantes de proteinas, que se manifiestan como variantes por sustitucion, insercion o supresion son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las tecnicas para elaborar mutaciones por sustitucion en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas por aquellos capacitados en la tecnica, tales como por mutagenesis M13, el kit de mutagenesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), la mutagenesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenesis dirigida al sitio. Otra alternativa para manipular secuencias de ADN para producir proteinas variantes, que se manifiestan como variantes por sustitucion, de insercion o de supresion comprende una modificacion genica dirigida in vivo que puede ser lograda por medio de oligonucleotidos quimericos de ARN / ADN como se describe por ejemplo en (Palmgren 1997; Yoon et al. 1996).

El "valor E" se utiliza para indicar el valor esperado. El numero de alineaciones diferentes con puntuaciones equivalentes a o mejores que S que se espera que ocurran en una busqueda de base de datos por casualidad. Cuanto menor sea el valor E, mas significativa es la puntuacion (http://www.Ncbi.Nlm.Nih. gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html # head2). Los "derivados" de una proteina descritos aqui son aquellos peptidos, oligopeptidos, polipeptidos, proteinas y enzimas que comprenden al menos aproximadamente cinco residuos de aminoacidos contiguos de dicho polipeptido pero que retienen la actividad biologica de dicha proteina. Un "derivado" puede comprender ademas residuos de aminoacidos adicionales de origen natural, glicosilados alterados, acilados o de origen no natural en comparacion con la secuencia de aminoacidos de una forma de origen natural de dicho polipeptido. Alternativa o adicionalmente, un derivado puede comprender uno o mas sustituyentes no aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos de una forma de origen natural de dicho polipeptido, por ejemplo una molecula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoacidos tal como, por ejemplo, una molecula reportera que esta enlazada a la misma para facilitar su deteccion.

Por "inmunologicamente activo" se entiende que una molecula o fragmentos especificos de la misma, tales como epitopos o haptenos son reconocidos por, es decir, enlazados a anticuerpos.

La memoria descriptiva tambien describe homologos, derivados y/o fragmentos inmunologicamente activos de cualquiera entre el factor de enlazamiento de DRE (DBF1) o un homologo, derivado o fragmento del mismo tal como se define mas arriba.

Los "anticuerpos" incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, sinteticos, o de camello de cadena pesada asi como fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por medio de tecnicas como se describio anteriormente por ejemplo, (Liddle & Cryer 1991), que comprende la fusion de celulas de mieloma de raton con celulas de bazo derivadas de animales inmunizados. Ademas, pueden obtenerse anticuerpos o fragmentos de los mismos con una molecula o fragmentos de la misma mediante el uso de metodos como los descritos, por ejemplo en (Harlow & Carril 1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra peptidos pequeros tales como fragmentos de una proteina de la invencion, dichos peptidos se acoplan generalmente a una proteina portadora antes de la inmunizacion de los animales. Tales portadores de proteina incluyen a la hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA), ovoalbumina y toxoide tetanico. La proteina portadora mejora la respuesta inmune del animal y proporciona epitopos para los sitios de enlazamiento del receptor de celulas T. El termino "anticuerpos" incluye ademas derivados de los mismos tales como anticuerpos marcados. Las etiquetas de anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceina (FITC), Hoechst 33258, R-ficoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Quantum Red, Rojo Texas, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa, esferas de oro y marcadores radiactivos (por ejemplo, 125I, 131I, 35S, 14C, 32P, 33P, 3H). Las herramientas en biologia molecular que dependen de anticuerpos contra una proteina incluyen analisis de transferencias en gel de la proteina, la seleccion de bibliotecas de expresion que permite la identificacion de genes, metodos cuantitativos de proteinas incluyendo ELISA y RIA, purificacion por inmunoafinidad de proteinas, inmunoprecipitacion de proteinas, por ejemplo (Magyar et al. 1997) e inmunolocalizacion. Otros usos de los anticuerpos y especialmente de anticuerpos de peptidos incluyen el estudio del procesamiento proteolitico (Loffler et al. 1994; Woulfe et al. 1994), la determinacion de sitios activos de la proteina (Lerner 1982), el estudio del procesamiento del precursor y post-traduccional (Baron & Baltimore 1982; Lerner et al. 1981; Semler et al. 1982), la identificacion de dominios de las proteinas involucrados en las interacciones proteina-proteina (Murakami et al. 1992) y el estudio del uso del exon en la expresion genica (Tamura et al. 1991).

Incorporados en la presente memoria descriptiva estan los anticuerpos que reconocen un factor de enlazamiento DRE tales como DBF1 o un homologo, derivado o fragmento del mismo tal como se definio mas arriba.

Los terminos "gen(es)", "polinucleotido(s)", "secuencia(s) de acido nucleico", "secuencia(s) de nucleotidos", "secuencia(s) de ADN" o "molecula(s) de acido nucleico", cuando se usan aqui, se refieren a los nucleotidos, ya sea ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos o una combinacion de ambos, en una forma polimerica de cualquier longitud. Dichos terminos incluyen ademas ADN y ARN monocatenarios y bicatenarios. Dichos terminos incluyen tambien modificaciones conocidas de nucleotidos, tales como metilacion, ciclizacion y 'taponamientos' y la sustitucion de uno o mas de los nucleotidos de origen natural con un analogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleotidos incluyen la adicion de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, Cy3®, Cy5®, Cy5.5®, Dabcilo, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoresceina 3'-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, psoraleno fosfato, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue®, Oregon Green®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Green® y Texas Red®. Las modificaciones de la columna vertebral de los polinucleotidos incluyen metilfosfonato, ARN 2'-OMe-metilfosfonato, fosforotiorato, ARN, 2'-OMeARN. Las modificaciones de bases incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA (cordicepina), 7deaza-dA, 8-Br-dA, 8-oxo-dA, N6-Me-dA, sitio abasico (dEspaciador), biotina dT, 2'-OMe-5ME-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-Me-dC), 3'-(ddC), 5-Br-dC, 5-I-dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O6-Me-dG, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inosina, 2'-dl, O6-fenil-dl, 4-metil-indol, 2'-desoxinebularina, 5-nitroindol, 2-aminopurina, dP (analogo de purina), dK (analogo de la pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotina-dT, carboxi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-l-dU, O4-triazol dU y marcadores radioactivos (por ejemplo, 125I, 131I, 35S,14C, 32P, 33P, 3H). Dichos terminos tambien abarcan acidos nucleicos peptidicos (PNA), un analogo de ADN en el que la columna vertebral es un pseudopeptido que consiste de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina en lugar de un azucar. Los PNA imitan el comportamiento del ADN y enlazan las cadenas complementarias de acidos nucleicos. La columna vertebral neutra de PNA resulta en un enlazamiento mas fuerte y en una mayor especificidad de lo que normalmente se alcanzaria. Ademas, las propiedades quimicas, fisicas y biologicas unicas del PNA han sido explotadas para producir herramientas biomoleculares poderosas, agentes antisentido y antigenos, sondas moleculares y biosensores. Por "molecula de ADN recombinante" o "gen quimerico" se entiende un ADN hibrido producido por union de piezas de ADN de diferentes fuentes. Por "secuencia heterologa de nucleotidos" se entiende una secuencia que no es de origen natural con la secuencia del promotor. Si bien esta secuencia de nucleotidos es heterologa a la secuencia del promotor, puede ser homologa, o nativa, o heterologa, o foranea, a la planta huesped. "Cadena de sentido" se refiere a la cadena de una molecula de ADN bicatenaria que es homologa a una transcripcion de ARNm de la misma. La "cadena anti-sentido" contiene una secuencia invertida, que es complementaria a aquella de la "cadena sentido".

Una "secuencia de codificacion" o "marco de lectura abierto" u "ORF" se define como una secuencia de nucleotidos que puede ser transcrita en ARNm y/o traducida en un polipeptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, es decir, cuando dicha secuencia de codificacion u ORF esta presente en un formato expresable. Dicha secuencia de codificacion de ORF esta delimitada por un codon de inicio de la traduccion 5' y un codon de detencion de la traduccion 3'. Una secuencia de codificacion u ORF puede incluir, pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias recombinantes de nucleotidos, secuencias de nucleotidos fabricadas en forma sintetica o ADN genomico. Dicha secuencia de codificacion u ORF puede ser interrumpida por medio de secuencias de acido nucleico intervinientes.

Los genes y secuencias de codificacion que codifican esencialmente la misma proteina pero aislados de diferentes fuentes pueden consistir en secuencias de acido nucleico sustancialmente divergentes. Reciprocamente, las secuencias de acido nucleico sustancialmente divergentes pueden ser diseradas para efectuar la expresion de esencialmente la misma proteina. Dichas secuencias de acido nucleico son el resultado, por ejemplo de la existencia de diferentes alelos de un gen dado, de la degeneracion del codigo genetico o de diferencias en el uso de codones. Por lo tanto, como se indica en la Tabla 2, aminoacidos tales como la metionina y el triptofano son codificados por un solo codon mientras que otros aminoacidos tales como arginina, leucina y serina pueden ser traducidos cada uno a partir hasta de seis codones diferentes. Las diferencias en el uso de codones preferidos se ilustra a continuacion para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), A. thaliana, M. sativa (dos plantas dicotiledoneas) y Oryza sativa (una planta monocotiledonea). Estos ejemplos fueron extraidos de (http://www.kazusa.or.jp/codon). Para dar un ejemplo, el codon GGC (para glicina) es el codon mas frecuentemente utilizado en A. tumefaciens (36,2%), es el segundo codon mas frecuentemente utilizado en O. sativa pero se utiliza con frecuencias mucho mas bajas en A. thaliana y M. sativa (9% y 8,4%, respectivamente). De los cuatro posibles codones que codifican glicina (vease la Tabla 2), dicho codon GGC es mas preferiblemente utilizado en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, en A. thaliana este es el codon GGA (y GGU) mientras que en M. sativa este es el codon GGU (y GGA).

Tabla 2. La degeneracion del codigo genetico.

Aminoacido

Codigo de tres letras Codigo de una letra Codones posibles

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Asparagina

Asn N AAC AAU

Acido aspartico

Asp D GAC GAU

Cisteina

Cys C UGC UGU

Acido glutamico

Glu E GAA GAG

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Metionina

Met M AUG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Serina

Ser S AGC AGU UCA ucc UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Triptofano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Posibles codones de "DETENCION"

UAA

UAG UGA

"Hibridacion" es el proceso en el que las secuencias de nucleotidos complementarias sustancialmente homologas

10 hibridan entre si. El proceso de hibridacion puede ocurrir enteramente en solucion, es decir ambos acidos nucleicos complementarios estan en solucion. Las herramientas en biologia molecular que confian en tal proceso incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, y todos los metodos basados en la misma), hibridacion sustractiva, extension aleatoria del cebador, mapeo de la nucleasa S1, extension de cebador, transcripcion inversa, sintesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinacion de la secuencia de ADN. El proceso de hibridacion

15 tambien puede ocurrir con uno de los acidos nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz tal como cuentas magneticas, cuentas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biologia molecular que confian en tal proceso incluyen el aislamiento de ARNm con una cola de poli (A+). El proceso de hibridacion puede ocurrir ademas con uno de los acidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte solido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado por ejemplo por fotolitografia, por ejemplo a un soporte de vidrio siliceo (este

20 ultimo conocido como arreglos de acido nucleico o microarreglos o como chips de acido nucleico). Las herramientas en biologia molecular que confian en tal proceso incluyen analisis de transferencias en gel de ARN y ADN, hibridacion de colonias, hibridacion en placa, hibridacion in situ e hibridacion de microarreglos. A fin de permitir que se produzca la hibridacion, las moleculas de acido nucleico son generalmente desnaturalizadas termica o quimicamente para fundir una cadena doble en dos cadenas sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de acidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridacion esta influenciada por condiciones tales como la temperatura, concentracion de sal y composicion del amortiguador de hibridacion. Las condiciones de alta rigurosidad para la hibridacion incluyen alta temperatura y/o baja concentracion de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na3) y/o la inclusion de formamida en el amortiguador de hibridacion y/o disminucion de la concentracion de compuestos tales como SDS (detergente) en el amortiguador de hibridacion y/o exclusion de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilenglicol (promocion de hacinamiento molecular) del amortiguador de hibridacion. Condiciones especificas para "hibridacion especificamente" son por ejemplo: hibridacion en condiciones rigurosas, tal como a una temperatura de 60° C seguido de lavados en 2xSSC, 0,1XSDS y 1X SSC, 0,1X SDS. Las condiciones convencionales de hibridacion se describen por ejemplo en (Sambrook et al. 1989), pero la persona capacitada se dara cuenta que numerosas condiciones diferentes de hibridacion se pueden diserar en funcion de la homologia conocida o la esperada y/o la longitud de la secuencia de acido nucleico. Se prefieren particularmente condiciones de rigurosidad de hibridacion suficientemente bajas para aislar acidos nucleicos heterologos a las secuencias de ADN de la invencion definidas mas arriba. Los elementos que contribuyen a dicha heterologia incluyen alelismo, degeneracion del codigo genetico y diferencias en el uso del codon preferido como se discutio mas arriba.

La memoria descriptiva describe el uso de secuencias de ADN de la invencion que codifican un factor DBF1 de enlazamiento de DRE, un homologo, un derivado y/o un fragmento inmunologicamente activo del mismo tal como se define mas arriba en cualquier metodo de hibridacion. Las secuencias de ADN tal como se definen en la presente invencion puede estar interrumpidas por secuencias intervinientes. Por "secuencias intervinientes" se entiende cualquier secuencia de acido nucleico que interrumpe una secuencia de codificacion que comprende dicha secuencia de ADN de la invencion o que interrumpe el formato expresable de una secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la invencion. La remocion de la secuencia de interviniente restaura dicha secuencia de codificacion o dicho formato expresable. Los ejemplos de secuencias intervinientes incluyen intrones, secuencias moviles de ADN tales como transposones y etiquetas de ADN, tales como por ejemplo, un ADN-T. Por "secuencia movil de ADN" se entiende cualquier secuencia de ADN que puede ser movilizada como resultado de un evento de recombinacion.

Para efectuar la expresion de una proteina en una celula, tejido u organo, preferiblemente de origen vegetal, o bien la proteina puede ser introducida directamente en dicha celula, tal como por medio de microinyeccion o por medios balisticos o alternativamente, se puede introducir en dicha celula, tejido u organo una molecula aislada de acido nucleico que codifica dicha proteina, en un formato expresable.

Preferiblemente, la secuencia de ADN de la invencion comprende una secuencia de codificacion o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un factor DBF1 de enlazamiento de DRE o un fragmento del mismo como se definio mas arriba. La proteina preferida de la invencion comprende la secuencia de aminoacidos de dicho factor de transcripcion del dominio AP2/EREBP.

Por "vector" o "secuencia del vector" se entiende una secuencia de ADN, que puede ser introducida en un organismo mediante transformacion y puede ser mantenida de forma estable en dicho organismo. El mantenimiento del vector es posible por ejemplo en cultivos de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tales como fagemidos y vectores cosmidos pueden ser mantenidos y multiplicados en bacterias y/o en virus. Las secuencias del vector generalmente comprenden un conjunto de sitios unicos reconocidos por enzimas de restriccion, el sitio de clonacion multiple (MCS), en donde se pueden insertar una

o mas secuencias que no son del vector.

Por "secuencia que no es del vector" se entiende en consecuencia una secuencia de ADN que se integra en uno o mas de los sitios del MCS comprendidos dentro de un vector. Los "vectores de expresion" forman un subconjunto de vectores que, en virtud de incluir las secuencias reguladoras apropiadas que permiten la creacion de un formato expresable para la(s) secuencia(s) insertada(s) que no es(son) del vector, lo que permite la expresion de la proteina codificada por dicha(s) secuencia(s) que no es(son) del vector. Los vectores de expresion son conocidos en la tecnica que permiten la expresion de proteinas en organismos incluidas bacterias (por ejemplo, E. coli), hongos (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), celulas de insecto (por ejemplo vectores de expresion de baculovirus), celulas animales (por ejemplo, celulas COS o CHO) y celulas de plantas (por ejemplo, vectores de expresion basados en el virus X de la patata, vease, por ejemplo Vance et al. 1998 - W09844097).

La presente invencion incluye claramente cualquier vector o vector de expresion que contenga una secuencia de ADN que no es de vector que incluye la secuencia del promotor de acuerdo con la presente invencion o una secuencia que no es del vector que codifica un factor DBF1 de enlazamiento de DRE, o un fragmento del mismo como se definio mas arriba.

Como una alternativa a la produccion de proteinas mediada por un vector de expresion en sistemas biologicos, se puede aplicar la sintesis quimica de proteinas. Los peptidos sinteticos se pueden fabricar en fase de solucion o en fase solida. La sintesis de peptidos en fase solida (Merrifield, 1963) es, sin embargo, la forma mas comun e involucra la adicion secuencial de aminoacidos para crear una cadena lineal de peptidos. La sintesis de peptidos en fase solida incluye ciclos que constan de tres etapas: (i) la inmovilizacion del aminoacido del terminal carboxilo de la cadena peptidica en crecimiento a un soporte solido o resina; (ii) ensamblaje de la cadena, un proceso que consiste de activacion, acoplamiento y desproteccion del aminoacido que va a ser aradido a la cadena peptidica en crecimiento; y (iii) la escision que incluye la remocion de la cadena peptidica completada de la resina y la remocion de los grupos protectores de las cadenas laterales de aminoacidos. Los enfoques comunes en la sintesis de peptidos en fase solida incluyen Fmoc / tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonil/t-butilo) y Boc (t-butiloxicarbonilo) como los grupos protectores del terminal amino de los aminoacidos. Los grupos protectores de la cadena lateral de aminoacidos incluyen metilo (Me), formilo (CHO), etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo (t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluroacetilo (Tfa), N-hidroxisuccinimida (ONSu, OSu), benzoilo (Bz), 4-metilbencilo (Meb), tioanizilo, tiocresilo, benciloximetilo (Bom), 4-nitrofenilo (ONp), benciloxicarbonilo (Z), 2-nitrobenzoilo (NBz), 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4toluenosulfonilo (tosilo, Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-clorobenciloxicarbonilo (CI-Z), 2,4,5triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z), trifenilmetilo (tritilo, Trt), y 2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc). Durante el ensamblaje de la cadena, se remueven Fmoc o Boc dando lugar a un terminal amino activado del residuo aminoacido enlazado a la cadena en crecimiento. El extremo terminal carboxilo del aminoacido entrante es activado por conversion en un ester altamente reactivo, por ejemplo, por HBTU. Con las tecnologias actuales (por ejemplo, un sintetizador PerSeptive Biosystems 9050, un sintetizador de peptidos de Applied Biosystems Modelo 431), se puede fabricar peptidos lineales de hasta 50 residuos. Una serie de directrices estan disponibles para producir peptidos que sean adecuados para uso en sistemas biologicos incluyendo (i) limitar el uso de aminoacidos dificiles tales como Cys, Met, Trp (se oxidan facilmente y/o degradan durante la sintesis de peptidos) o arg; (ii) minimizar los aminoacidos hidrofobos (puede perjudicar la solubilidad del peptido), y (iii) evitar un acido glutamico en el terminal amino (puede ciclarse hasta piroglutamato).

Por "formato expresable" se entiende que la molecula aislada de acido nucleico esta en una forma adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir una proteina, ya sea constitutivamente o despues de induccion por medio de una seral intracelular o extracelular, tal como un estimulo o estres ambiental (mitogenos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, deshidratacion, etc.) o un compuesto quimico tal como IPTG (isopropil-�-Dtiogalactopiranosido) o tal como un antibiotico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, kanamicina), hormona (por ejemplo, giberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoides, brasinoesteroides, etileno, acido abscisico, etc.), analogo de la hormona (acido yodoacetico (IAA), 2,4-D, etc.), metal (zinc, cobre, hierro, etc.), o dexametasona, entre otros. Como sera conocido para aquellos capacitados en la tecnica, la expresion de una proteina funcional tambien puede requerir de una o mas modificaciones posteriores a la traduccion, tales como glicosilacion, fosforilacion, desfosforilacion, o una o mas interacciones proteina-proteina, entre otros. Todos estos procesos estan incluidos dentro del alcance del termino "formato expresable".

Preferiblemente, la expresion de una proteina en una celula, tejido, u organo especificos, preferiblemente de origen vegetal, se efectua mediante la introduccion y expresion de una molecula aislada de acido nucleico que codifica dicha proteina, tal como una molecula de ADNc, un gen genomico, una molecula sintetica de oligonucleotido, una molecula de ARNm o un marco de lectura abierto, en dicha celula, tejido u organo, en donde se coloca dicha molecula de acido nucleico operativamente en conexion con secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo un promotor, preferiblemente un promotor expresable en plantas, y una secuencia de terminacion.

"Secuencia reguladora" se refiere a secuencias de ADN de control, que son necesarias para afectar la expresion de las secuencias de codificacion a las que estan ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huesped. En procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen promotores, sitios de enlazamiento ribosomal, y terminadores. En eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y potenciadores o silenciadores. El termino "secuencia de control" pretende incluir, como minimo, a todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresion, y tambien puede incluir componentes adicionales convenientes y que determinan cuando, cuanto y donde se expresa un gen especifico.

Referencia que se hace aqui a un "promotor" se debe tomar en su contexto mas amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripcion derivadas de un gen genomico eucariotico clasico, que incluye la caja TATA que se requiere para la iniciacion precisa de la transcripcion, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras secuencia arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresion genica en respuesta a estimulos de desarrollo y/o externos, o en una forma especifica del tejido.

El termino "promotor" incluye tambien las secuencias reguladoras de la transcripcion de un gen procariota clasico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripcion de caja -10.

El termino "promotor" se utiliza tambien para describir una molecula sintetica o de fusion o un derivado que confiere, activa o potencia la expresion de una molecula de acido nucleico en una celula, tejido u organo.

Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o mas elementos reguladores especificos, para mejorar aun mas la expresion y/o para alterar la expresion espacial y/o la expresion temporal de una molecula de acido nucleico a la que estan conectados operativamente. Tales elementos reguladores puede colocarse en forma adyacente a una secuencia heterologa del promotor para dirigir la expresion de una molecula de acido nucleico en respuesta por ejemplo, a cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, cAMP, acido abscisico, auxina, lesiones, etileno, jasmonato o acido salicilico o para conferir expresion de una molecula de acido nucleico a celulas, tejidos u organos especificos tales como meristemos, hojas, raices, embriones, flores, semillas o frutos.

En el contexto de la presente invencion, preferiblemente el promotor es una secuencia del promotor expresable en una planta. Los promotores, sin embargo, que tambien funcionan o unicamente funcionan en celulas que no son de una planta tales como bacterias, celulas de levadura, celulas de insecto y celulas animales no estan excluidos de la invencion. Por "expresable en plantas" se entiende que la secuencia del promotor, incluyendo cualquiera de los elementos reguladores adicionales aradidos a la misma o contenidos en la misma, es al menos capaz de inducir, conferir, activar o mejorar la expresion en una celula, tejido u organo de una planta, preferiblemente una celula, tejido u organo de una planta monocotiledonea o dicotiledonea. El termino "operable en una planta" cuando se utiliza aqui, con respecto a una secuencia de promotor, se tomara como equivalente a una secuencia de promotor expresable en una planta.

En el presente contexto, un "promotor regulado" o una "secuencia regulable de promotor " es un promotor que es capaz de conferir expresion sobre un gen estructural en una celula, tejido, u organo particular o grupo de celulas, tejidos u organos de una planta, opcionalmente bajo condiciones especificas, sin embargo generalmente no confiere expresion a traves de la planta bajo todas las condiciones. Por consiguiente, una secuencia regulable de promotor puede ser una secuencia de promotor que confiere expresion sobre un gen al que esta operativamente conectado en un lugar particular dentro de la planta o alternativamente, a traves de la planta bajo un conjunto especifico de condiciones, tales como despues de la induccion de la expresion genica por un compuesto quimico u otro provocador.

Preferiblemente, el promotor regulable utilizado en la realizacion de la presente invencion confiere expresion en una ubicacion especifica dentro de la planta, ya sea constitutivamente o despues de la induccion, sin embargo no en la planta completa bajo ninguna circunstancia. Incluidos dentro del alcance de tales promotores estan las secuencias del promotor especifico de la celula, las secuencias del promotor especifico del tejido, las secuencias del promotor especifico del organo, las secuencias del promotor del gen especifico del ciclo celular, secuencias inducibles del promotor y secuencias constitutivas del promotor que han sido modificadas para conferir expresion en una determinada parte de la planta en un momento dado, tal como mediante la integracion de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genetico transponible (Ac, Ds, Spm, En, u otro transposon). Aquellas personas capacitadas en la tecnica seran conscientes de que un "promotor inducible" es un promotor cuya actividad transcripcional se incrementa o se induce en respuesta a un estimulo de desarrollo, quimico, ambiental o fisico. De manera similar, la persona capacitada entendera que un "promotor constitutivo" es un promotor que es transcripcionalmente activo en la mayor parte, pero no necesariamente en todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo. Contrariamente el termino "promotor ubicuo" se entiende que hace referencia a un promotor que es transcripcionalmente activo en la mayor parte, pero no necesariamente todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta.

Generalmente por "promotor debil" se entiende un promotor que dirige la expresion de una secuencia de codificacion a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 de transcripciones hasta aproximadamente 1/100.000 de transcripciones, hasta aproximadamente 1/500.0000 de transcripciones. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresion de una secuencia de codificacion a un nivel alto, o hasta aproximadamente 1/10 de transcripciones hasta aproximadamente 1/100 de transcripciones hasta aproximadamente 1/1.000 de transcripciones.

El termino "especifico de la celula" se usa para indicar que la expresion es predominantemente en una celula o tipo de celula particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente de forma exclusiva en dicha celula o tipo de celula.

Asimismo, el termino "especifico del tejido" se usa para indicar que la expresion es predominantemente en un tejido

o tipo de tejido particular, preferentemente de origen vegetal, aunque no necesariamente de forma exclusiva en dicho tejido o tejido de tipo.

Asimismo, el termino "especifico del organo" se usa para indicar que la expresion es predominantemente en un organo particular, preferentemente de origen vegetal, aunque no necesariamente de forma exclusiva en dicho organo. "Especifico de la raiz" significa que el promotor se expresa en la raiz unicamente y no en otros tejidos de la planta.

Por "preferido de la raiz" se entiende que la expresion de la secuencia heterologa de nucleotidos es mas abundante en la raiz, pero tambien podria tener bajos niveles de expresion en otras partes de la planta. Aunque un cierto nivel de expresion de la secuencia heterologa de nucleotidos se produce en otros tipos de tejidos vegetales, la expresion se presenta en forma mas abundante en la raiz incluyendo las raices primarias, laterales y adventicias.

Por "raiz" se entiende cualquier parte de la estructura de la raiz, que comprende la cofia, el meristemo apical, el protoderma, el meristemo a nivel del suelo, el procambium, la endodermis, la corteza, la corteza vascular, la epidermis, y similares.

Aquellos capacitados en la tecnica facilmente seran capaces de seleccionar secuencias apropiadas de promotores para uso en la regulacion de la expresion apropiada del factor DBF1 de enlazamiento de DRE descrito anteriormente a partir de fuentes publicamente disponibles o facilmente disponibles, sin una experimentacion excesiva.

La colocacion de una molecula de acido nucleico bajo el control regulador de una secuencia del promotor, o en conexion operativa con una secuencia del promotor significa posicionar dicha molecula de acido nucleico de tal manera que la expresion sea controlada por la secuencia del promotor. Un promotor esta usualmente, pero no necesariamente, situado secuencia arriba, o en el extremo 5', y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripcion, de la molecula de acido nucleico que la regula. En la construccion de las combinaciones promotor heterologo / gen estructural se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripcion del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en su entorno natural (es decir, el gen a partir del cual se deriva el promotor). Como es conocido en la tecnica, se puede acomodar alguna variacion en esta distancia sin perdida de funcion del promotor. De manera similar, el posicionamiento preferido de un elemento de la secuencia reguladora con respecto a un gen heterologo que va a ser colocado bajo su control esta definido por el posicionamiento del elemento en su entorno natural (es decir, el gen a partir del cual se deriva). De nuevo, como se conoce en la tecnica, puede presentarse alguna variacion en esta distancia.

"Expresion" significa la produccion de una proteina o secuencia de nucleotidos en la propia celula o en un sistema libre de celulas. Incluye la transcripcion en un producto de ARN, una modificacion posterior a la transcripcion y/o la traduccion a un producto de proteina o polipeptido a partir de un ADN que codifica ese producto, asi como posibles modificaciones postraduccionales.

"Operativamente enlazada(o)" se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes asi descritos estan en una relacion que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia de codificacion esta ligada de tal manera que la expresion de la secuencia de codificacion se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, es obvio para una persona capacitada que se usa preferiblemente un acido nucleico bicatenario.

Los ejemplos de promotores adecuados para su uso en construcciones genicas de la presente invencion incluyen a aquellos enumerados en la Tabla 3, entre otros. Los promotores enlistados en la Tabla 3 se proporcionan para los propositos de ejemplificacion unicamente y la presente invencion no esta limitada por la lista proporcionada aqui. Aquellos capacitados en la tecnica estaran facilmente en posicion de proporcionar promotores adicionales que son utiles en la realizacion de la presente invencion.

En el caso de promotores constitutivos o promotores que inducen la expresion a traves de toda la planta, se prefiere que tales secuencias sean modificadas por medio de la adicion de secuencias de nucleotidos derivadas de uno o mas de los promotores especificos de los tejidos enlistados en la Tabla 3, o alternativamente, secuencias de nucleotidos derivadas de uno o mas de los promotores inducibles especificos del tejido mencionados anteriormente, que confieren especificidad del tejido sobre el mismo. Por ejemplo, el promotor 35S del CaMV puede ser modificado por medio de la adicion de la secuencia del promotor Adh1 de maiz, para conferir expresion especifica de la raiz regulada anaerobicamente sobre el mismo, como se describio anteriormente (Ellis et al. 1987). Otro ejemplo describe como conferir expresion genica especifica de la raiz o abundante de la raiz mediante la fusion del promotor 35S de CaMV a elementos del gen GRP3 para la proteina rica en glicina del maiz (Feix y Wulff 2000 -W00015662). Tales modificaciones se pueden lograr mediante experimentacion rutinaria por parte de aquellos capacitados en la tecnica.

El termino "terminador" se refiere a una secuencia de ADN al extremo de una unidad transcripcional que serala la terminacion de la transcripcion. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas 3' que contienen una seral de poliadenilacion, que facilita la adicion de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcrito primario. Los terminadores activos en celulas derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamiferos y plantas son conocidos y estan descritos en la literatura. Pueden ser aislados de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Los ejemplos de terminadores particularmente adecuados para uso en las construcciones genicas de la presente invencion incluyen al terminador del gen de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, a la secuencia terminadora del gen de la octopina sintasa (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, a la secuencia terminadora del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), la secuencia terminadora de la ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa (t3'Bt2), la secuencia terminadora del gen de la zeina de Zea mays, el terminador del gen rbcs-1A, y las secuencias terminadoras del gen rbcs-3A, entre otras.

Aquellos capacitados en la tecnica seran conscientes de secuencias adicionales del promotor y secuencias adicionales de terminacion que pueden ser adecuadas para ser usadas en la realizacion de la invencion. Tales 5 secuencias pueden ser facilmente utilizadas sin ninguna experimentacion excesiva.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, "expresion ectopica" o "sobreexpresion ectopica" de un gen o de una proteina que les confieren a los patrones de expresion y/o a los niveles de expresion de dicho gen o proteina normalmente no se presentan en condiciones naturales. La expresion ectopica se puede lograr en una cantidad de 10 formas, incluyendo enlazar operativamente una secuencia de codificacion que codifica dicha proteina a un promotor homologo o heterologo aislado con el fin de crear un gen quimerico y/o enlazar operativamente dicha secuencia de codificacion a su propio promotor aislado (es decir, el promotor no aislado que dirige naturalmente la expresion de dicha proteina) con el fin de crear una duplicacion del gen recombinante o un efecto de multiplicacion genica. Por "coexpresion ectopica" se entiende la expresion ectopica o sobreexpresion ectopica de dos o mas genes o

15 proteinas. El mismo o, mas preferiblemente, promotores diferentes se utilizan para conferir expresion de dichos genes o proteinas.

Tabla 3. Ejemplos de promotores expresables en plantas para uso en la realizacion de la presente invencion

I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE LA CELULA, ESPECIFICOS DEL TEJIDO Y ESPECIFICOS DE UN ORGANO

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESION REFERENCIA

a-amilasa (Amy32b)

aleurona Lanahan et al., Plant Cell 4: 203 - 211, 1992; Skriver et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266 -7270,1991

gen tipo catepsina �

aleurona Cejudo et al., Plant Mol Biol 20: 849 - 856, 1992

rolB de Agrobacterium rhizogenes

cambium Nilsson et al., Physiol Plant 100: 456 - 462, 1997

AtPRP4

flores http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/html

chalcona sintasa (chsA)

flores Van der Meer et al, Plant Mol Biol 15: 95 -109, 1990

LAT52

antera Twell et al., Mol Gen Genet 217: 240-245, 1989

apetala-3

flores

quitinasa

fruto (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http://winetitles.com.au/ gwrdc/csh95-1.html

rbcs-3A

tejido verde (por ejemplo hoja) Lam et al., Plant Cell 2: 857 -866, 1990; Tucker et al., Plant Physiol 113: 1303 -1308, 1992

genes especificos de la hoja

hoja Baszczynski et al, Nucl Acid Res 16: 4732, 1988

AtPRP4

hoja http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/html

promotor del gen para adenina metiltransferasa del virus clorela

hoja Mitra y Higgins, Plant Mol Biol 26: 85 -93, 1994

promotor del gen aldP de arroz

hoja Kagaya et al., Mol Gen Genet 248: 668 -674, 1995

promotor rbcs de arroz o tomate

hoja Kyozuka at al., Plant Physiol 102: 991 - 1000, 1993

Pinus cab-6

hoja Yamamoto et al., Plant Cell Physiol 35: 773 -778, 1994

promotor de la rubisco

hoja

cab (proteina de enlazamiento de clorofila a/b)

hoja

gen Blec4 de guisante

tejidos epidermico floral y vegetativo Mandaci y Dobres, Plant Mol Biol 34: 961 - 965

SAM22

hoja senescente Crowell et al, Plant Mol Biol 16: 459 466, 1992

gen Itp (gen de transferencia de lipido)

Fleming et al., Plant J 2: 855 -862, 1992

gen nif de R. japonicum

nodulo Patente de los Estados Unidos No 4 803165

gen nifH de B. japonicum

nodulo Patente de los Estados Unidos No 5008194

GmENOD40

nodulo Yang et al., Plant J 3: 573 - 585, 1993

PEP carboxilasa (PEPC)

nodulo Pathirana et al., Plant Mol Biol 20: 437 -450, 1992

legaemoglobina (Lb)

nodulo Gordon et al, J Exp Bot 44: 1453 - 1465, 1993

gen del virus baciliforme Tungro

floema Bhattacharyya-Pakrasi et al, Plant J 4: 71 - 79, 1992

genes especificos del polen

polen; microespora Albani et al., Plant Mol Biol 15: 605, 1990; Albani et al., Plant Mol Biol 16: 501, 1991

Zm13

polen Guerrero et al, Mol Gen Genet 224: 161-168, 1993

gen apg

microespora Twell et al., Sex Plant Reprod 6: 217 - 224, 1993

gen especifico del polen del maiz

polen Hamilton et al., Plant Mol Biol 18: 211 - 218, 1992

gen expresado en el polen de girasol

polen Baltz et al., Plant J 2: 713 - 721, 1992

gen especifico del polen de B. napus

polen; antera; tapetum Arnoldo et al., J Cell Biochem, Resumen No. Y101, 204, 1992

genes expresables en la raiz

raices Tingey et al., EMBO J 6: 1, 1987

gen inducible por la auxina del tabaco

punta de la raiz Van der Zaal et al., Plant Mol Biol 16: 983, 1991

�-tubulina

raiz Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988

(continuacion)

I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE LA CELULA, ESPECIFICOS DEL TEJIDO Y ESPECIFICOS DE UN ORGANO

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESION REFERENCIA

genes especificos de la raiz de tabaco

raiz Conkling et al, Plant Physiol 93:1203, 1990

gen G1-3b de B. napus

raiz Patente de los Estados Unidos No 5401836

SbPRP1

raices Suzuki et al, Plant Mol Biol 21: 109 -119, 1993

AtPRP1; AtPRP3

raices; pelos radiculares http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/html

gen RD2

cortex de la raiz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

gen TobRB7

vasculatura de la raiz http://wwwcortex.edu/ncsu/research

AtPRP4

hojas; flores; primordios lateral de la raiz http://salus.medium.edu/mmg/ terney/html

gens especificos de la semilla

semilla Simon et at., Plant Mol Biol 5: 191, 1985; Scofield et al., J Biol Chem 262: 12202, 1987; Baszczynski et al., Plant Mol Biol 14:633, 1990

albumina de la nuez del Brasil

semilla Pearson et al., Plant Mol Biol 18: 235 - 245, 1992

legumina

semilla Ellis et al., Plant Mol Biol 10: 203 - 214, 1988

glutelina (arroz)

semilla Takaiwa et al., Mol Gen Genet 208: 15 -22, 1986; Takaiwa et al., FEBS Lett 221: 43 -47, 1987

zeina

semilla Matzke et al., Plant Mol Biol 14: 323 - 32, 1990

napA

semilla Stalberg et al., Planta 199: 515 - 519, 1996

glutenina-1 de LMW y HMW del trigo

endospermo Mol Gen Genet 216: 81 90, 1989; Nucl Acids Res 17: 461 - 462, 1989

SPA del trigo

semilla Albani et al., Plant Cell 9: 171 - 184, 1997

zeina de 19 kDa del maiz, cZ19B1

semilla WO0011177

mioinositol-1-Pi sintasa del maiz mi1ps

semilla WO0011177

a, �, �-gliadinas del trigo

endospermo EMBO J 3: 1409 - 1415, 1984

promotor Itr1 de la cebada

endospermo

hordeina B1, C, D, de la cebada

endospermo Theor Appl Gen 98: 1253 - 1262, 1999; Plant J 4: 343 - 355, 1993; Mol Gen Genet 250: 750 -60, 1996

DOF de la cebada

endospermo Mena et al., Plant J 116: 53 - 62, 1998

blz2

endospermo EP99106056.7

promotor sintetico

endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J 13: 629 -640, 1998

prolamina NRP33 del arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39: 885 889, 1998

a-globulina Glb-1 del arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39: 885 889, 1998

genes END del maiz

endospermo WO0012733

END1 de cebada

endospermo WO9808961

NUC1 de cebada

nucela W09808961

OSH1 del arroz

embrion Sato et al, Proc Natl Acad Sci USA 93: 8117 -8122, 1996

a-globulina REB/OHP-1 del arroz

endospermo Nakase et al, Plant Mol Biol 33: 513 522, 1997

ADP-glucosa PP del arroz

endospermo Trans Res 6: 157 - 168, 1997

familia de genes ESR del maiz

endospermo Plant J 12: 235 - 246, 1997

a-kafirina del sorgo

endospermo Plant Mol Biol 32: 1029 - 1035, 1996

KNOX

embrion Postma-Haarsma et al., Plant Mol Biol 39: 257 -271,1999

oleosina del arroz

embrion y aleurona Wu et al., J Biochem 123: 386, 1998

oleosina de girasol

semilla (embrion y semilla seca) Cummins et al., Plant Mol Biol 19: 873 - 876, 1992

LEAFY

meristemo de brote Weigel et al., Cell 69: 843 - 859, 1992

knat1 de Arabidopsis thaliana

meristemo de brote Numero de acceso AJ131822

kn1 de Malus domestica

meristemo de brote Numero de acceso Z71981

CLAVATA1

meristemo de brote Numero de acceso AF049870

genes especificos del estigma

estigma Nasrallah et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5551, 1988; Trick et al., Plant Mol Biol 15: 203, 1990

Gen de la patatina clase I

tuberculo Liu et al., Plant Mol Biol 153: 386 - 395, 1991

arroz PCNA

meristemo Kosugl et al., Nucl Acids Res 19: 1571 - 1576, 1991; Kosugi y Ohashi, Plant Cell 9: 1607 -1619,1997

tubulina TubA1 del guisante

celulas en division Stotz y Long, Plant Mol Biol 41: 601 -614, 1999

cdc2a de Arabidopsis

Celulas que se ciclizan Chung y Parish, FEBS Lett 362: 215 - 219, 1995

Rop1A de Arabidopsis

Anteras; polen maduro + tubos de polen Li et al., Plant Physiol 118: 407 - 417, 1998

AtDMC1 de Arabidopsis

Asociado de meiosis Klimyuk y Jones, Plant J 11: 1 - 14, 1997

PS-IAA4/5 y PS-IAA6 de guisante

Inducible por auxina Wong et al., Plant J 9: 587 - 599, 1996

Farnesiltransferasa de guisante

Tejidos meristematicos; floema cercano a los tejidos en crecimiento; reprimido por azucar y luz Zhou et al., Plant J 12: 921 - 930,1997

ciclina B1;1 (N. sylvestris) de tabaco

Celulas en division / tejido meristematico Trehin et al., Plant Mol.Biol. 35: 667 672, 1997

Ciclinas mitoticas CYS (tipo A) y CYM (tipo B) de Catharanthus roseus

Celulas en division / tejido meristematico Ito et al., Plant J 11: 983 -992, 1997

cyc1 At (= cyc B1;1) y cyc3aAt (tipo A) de Arabidopsis

Celulas en division / tejido meristematico Shaul et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 4868 -4872, 1996

Caja del promotor tef1 de Arabidopsis

Celulas en division / tejido meristematico Regad et al., Mol Gen Genet 248: 703 - 711, 1995

cyc07 de Catharanthus roseus

Celulas en division / tejido meristematico Ito et al., Plant Mol Biol 24: 863 - 878, 1994

II: EJEMPLOS DE PROMOTORES CONSTITUTIVOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESION REFERENCIA

Actina

constitutivo McElroy et al., Plant Cell 2: 163 - 171, 1990

35S del CAMV

constitutivo Odell et al., Nature 313: 810 - 812, 1985

19S del CaMV

constitutivo Nilsson et al., Physiol Plant 100: 456 - 462, 1997

GOS2

constitutivo de Pater et al, Plant J 2:837-844, 1992

ubiquitina

constitutivo Christensen et al., Plant Mol Biol 18: 675 -689, 1992

ciclofilina del arroz

constitutivo Buchholz et al., Plant Mol Biol 25: 837 - 843, 1994

histona H3 del maiz

constitutivo Lepetit et al., Mol Gen Genet 231: 276 - 285, 1992

histona H3 de alfalfa

constitutivo Wu et al., Nucleic Acids Res 17: 3057 - 3063, 1989; Wu et al., Plant Mol Biol 11: 641 - 649, 1988

actina 2

constitutivo An et al., Plant J 10: 107 - 121, 1996

III: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR ESTRES

NOMBRE

ESTRES REFERENCIA

P5CS (delta(1)-pirrolina-5carboxilato sintasa)

sal, agua Zhang et al., Plant Sci 129: 81- 89, 1997

cor15a

frio Hajela et al., Plant Physiol 93: 1246 -1252, 1990

cor15b

frio Wlihelm et al., Plant Mol Biol 23: 1073 - 1077, 1993

cor15a (-305 a +78 nt)

frio, sequia Baker et al., Plant Mol Biol 24: 01 - 713, 1994

rd29

sal, sequia, frio Kasuga et al., Nature Biotechnol 18: 287 -291, 1999

Proteinas de choque por calor, incluyendo promotores artificiales que contienen el elemento de choque por calor (HSE)

calor Barros et al., Plant Mol Biol 19 665 -75, 1992. Marrs et al., Dev Genet 14: 27 - 41, 1993. Schoffl et al., Mol Gen Genet 217: 246 - 53, 1989.

smHSP (proteinas pequeras de choque por calor)

calor Waters et al., J Exp Bot 47: 325 -338, 1996

(continuacion)

III: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR ESTRES

NOMBRE

ESTRES REFERENCIA

wcs120

frio Ouellete et al., FEBS Lett 423: 324 -328, 1998

ci7

frio Kirch et al, Plant Mol Biol 33: 897 - 909, 1997

Adh

frio, sequia, hipoxia Dolferus et al., Plant Physiol 105: 1075 -87, 1994

pwsi18

sal y sequia Joshee et al., Plant Cell Physiol 39: 64 72, 1998

ci21A

frio Schneider et al., Plant Physiol 113: 335 -45, 1997

Trg-31

sequia Chaudhary et al., Plant Mol Biol 30: 1247 - 57, 1996

osmotina

osmotico Raghothama et al., Plant Mol Biol 23: 1117 28, 1993

lapA

lesiones, ambiente WO99/03977 University of California/ INRA

IV: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR PATOGENOS

NOMBRE

PATOGENO REFERENCIA

RB7

Nematodos de los nudos de la raiz (Meloidogyne spp.) US5760386 - North Carolina State University; Opperman et al, Science 263: 221 -23, 1994

PR-1, 2, 3, 4, 5, 8, 11

hongos, virus, bacterias Ward et al, Plant Cell 3: 1085 1094, 1991; Reiss et al., 1996; Lebel et al, Plant J 16: 223 -233, 1998; Melchers et al, Plant J 5: 469 480, 1994; Lawton et al, Plant Mol Biol, 19: 735 - 743, 1992

HMG2

nematodos WO9503690 - Virginia Tech Intellectual Properties Inc.

Abi3

Nematodos de quistes (Heterodera spp.) No publicada

ARM1

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9: 2119 - 2134, 1997 WO 98/31822 -Plant Genetic Systems

Att0728

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9: 2119 - 2134, 1997 PCT/EP98/07761

Att1712

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9, 2119 - 2134, 1997 PCT/EP98/07761

Gst1

Diferentes tipos de patogenos Strittmatter et al, Mol Plant-Microbe Interact 9: 68 - 73, 1996

LEMMI

nematodos WO 92/21757 -Plant Genetic Systems

CLE

geminivirus PCT/EP99/03445 -CINESTAV

PDF1.2

Hongos incluyendo Alternaria brassicicola y Botryrtis cinerea Manners et al., Plant Mol Biol, 38: 1071 -1080, 1998

Thi2.1

Hongos -Fusarium oxysporum f sp. matthiolae Vignutelli et al, Plant J 14: 285 - 295, 1998

DB#226

nematodos Bird and Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7:419-442, 1994 WO 95.322888

DB#280

nematodos Bird and Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7:419-442, 1994 WO 95.322888

Cat2

nematodos Niebel et al, Mol Plant-Microbe Interact 8: 371378, 1995

uTub

nematodos Aristizabal et al (1996), 8th International Congress on Plant - Microbe Interaction, Knoxville US B- 29

sHSP

nematodos Fenoll et al (1997) En: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F. M. W. Grundler y S.A. Ohl (Eds.),

Tsw12

nematodos Fenoll et al (1997) En: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F. M. W. Grundler y S.A. Ohl (Eds.)

Hs1(pro1)

nematodos WO 98/122335 - Jung

nsLTP

viral, hongos, bacterias Molina y Garcia-Olmedo FEBS Lett, 316: 119 -122, 1993

RIP

viral, hongos Tumer et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 3866 -3871,1997

Preferiblemente, la secuencia del promotor descrita aqui esta operativamente enlazada a una secuencia de codificacion o marco de lectura abierto (ORF) que codifica un factor DBF1 de enlazamiento de DRE o un homologo, derivado y/o un fragmento inmunologicamente activo del mismo como se definio mas arriba.

"Version negativa dominante o variante" se refiere a una proteina mutante, que interfiere con la actividad de la correspondiente proteina de tipo silvestre.

"Reduccion de la expresion" como se usa aqui, significa la disminucion de los niveles de expresion genica y/o de los

10 niveles de producto genico activo y/o de los niveles de actividad del producto genico. La disminucion en la expresion puede llevarse a cabo por ejemplo por medio de la adicion de secuencias de codificacion o partes de las mismas en una orientacion sentido (si resulta en supresion conjunta), o en una orientacion antisentido con respecto a una secuencia del promotor y, ademas, por ejemplo, por medio de mutagenesis de insercion (por ejemplo, insercion de ADN-T o insercion de un transposon) o por medio de estrategias de silenciamiento de genes como describen por

15 ejemplo Angell y Baulcombe 1998 (W09836083), Lowe et al. 1989 (W09853083), Lederer et al. 1999 (W09915682) o Wang et al. 1999 (W09953050). Las construcciones geneticas destinadas a silenciar la expresion genica pueden tener la secuencia de nucleotidos de dicho gen (o una o mas partes del mismo) contenida en la misma en una orientacion sentido y/o antisentido con respecto a la secuencia del promotor. Otro metodo para reducir la expresion genica comprende el uso de ribozimas, por ejemplo como se describe en Atkins et al. 1994 (W09400012), Lenee et

20 al. 1995 (W09503404), Lutziger et al. 2000 (WO0000619), Prinsen et al. 1997 (W09713865) y Scott et al. 1997 (W09738116).

La modulacion, incluyendo la disminucion, del nivel de productos genicos activos o de actividad del producto genico se puede lograr mediante la administracion o la exposicion de celulas, tejidos, organos u organismos a dicho 25 producto genico, un homologo, analogo, derivado y/o fragmento inmunologicamente activo del mismo. La inmunomodulacion es otro ejemplo de una tecnica capaz de reducir los niveles de producto genico activo y/o la actividad del producto genico y comprende la administracion de o la exposicion a, o de anticuerpos que se expresan a dicho producto genico o en celulas, tejidos, organos u organismos en donde los niveles de dicho producto genico y/o actividad del producto genico van a ser modulados. Tales anticuerpos comprenden "planticuerpos", anticuerpos

30 de cadena sencilla, anticuerpos IgG y anticuerpos de camello de cadena pesada asi como fragmentos de los mismos.

La modulacion, incluyendo la disminucion, del nivel de productos genicos activos o de actividad del producto genico se puede lograr adicionalmente mediante la administracion o la exposicion de celulas, tejidos, organos u organismos a un inhibidor o activador de dicho producto genico o la actividad del mismo. Tales inhibidores o activadores incluyen proteinas (que incluyen por ejemplo, proteinasas y quinasas) y compuestos quimicos.

En el contexto de la memoria descriptiva, el termino "agonista" se refiere a una sustancia que puede ser o bien un protagonista o un antagonista, es decir, puede tener efectos positivos o negativos, puede ser un potenciador o un inhibidor o tambien un modulador.

Por "destino de la celula y/o desarrollo de la planta y/o morfologia de la planta y/o bioquimica y/o fisiologia" se entiende que una o mas de las caracteristicas de desarrollo y/o morfologicas y/o bioquimicas y/o fisiologicas de una planta se ven alteradas por la realizacion de una o mas etapas relacionadas con la invencion descrita en la presente memoria.

El "destino de la celula" se refiere al tipo de celula o a las caracteristicas celulares de una celula particular que se produce durante el desarrollo de la planta o de un proceso celular para la misma. El "desarrollo de la planta" o el termino "caracteristica de desarrollo de la planta" o terminos similares, cuando se usa en este documento, debera entenderse que significa cualquier proceso celular de una planta que esta involucrado en la determinacion del destino de desarrollo de una celula vegetal, en particular el tipo especifico de tejido u organo dentro del cual se desarrollara una celula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el desarrollo de las plantas seran conocidos por aquellos capacitados en la tecnica. Tales procesos incluyen, por ejemplo, morfogenesis, fotomorfogenesis, desarrollo de brotes, desarrollo de la raiz, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, alargamiento del tallo, floracion, y mecanismos reguladores involucrados en la determinacion del destino celular, en particular un proceso o un proceso regulador que involucra el ciclo celular.

"Morfologia de la planta" o el termino "caracteristica morfologica de la planta" o un termino similar, cuando se usa aqui, sera entendido por las personas capacitadas en la tecnica para referirse a la apariencia externa de una planta, incluyendo una o mas caracteristicas estructurales o combinacion de caracteristicas estructurales de la misma. Tales caracteristicas estructurales incluyen la forma, tamaro, numero, posicion, color, textura, disposicion, y formacion de patrones de cualquier tipo de celula, tejido u organos o grupos de celulas, tejidos u organos de una planta, incluyendo la raiz, tallo, hoja, brote, peciolo, tricoma, flor, petalo, estigma, estilo, estambre, polen, ovulo, semilla, embrion, endospermo, recubrimiento de la semilla, aleurona, fibra, fruto, cambium, madera, pulpa, parenquima, aerenquima, elemento de tamizaje, floema o tejido vascular , entre otros.

"Bioquimica de la planta" o el termino "caracteristica bioquimica de la planta" o un termino similar, cuando se usa aqui, se entendera por parte de las personas capacitadas en la tecnica que se refiere a los procesos metabolicos y cataliticos de una planta, incluido el metabolismo primario y secundario y los productos de los mismos, incluyendo cualquiera de las moleculas pequeras, macromoleculas o compuestos quimicos, tales como, pero sin limitarse a almidones, azucares, proteinas, peptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas de acido nucleico, celulosas, hemicelulosas, polimeros de glucosa, lectinas, fibras, pigmentos tales como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrientes, o macronutrientes, que son producidos por las plantas.

"Fisiologia vegetal" o el termino "caracteristica fisiologica vegetal" o un termino similar, cuando se usan en este documento, se entendera que se refieren a los procesos funcionales de una planta, incluyendo procesos de desarrollo, tales como crecimiento, expansion y diferenciacion, desarrollo sexual, reproduccion sexual, conjunto de semillas, desarrollo de semillas, llenado del grano, reproduccion asexual, division celular, latencia, germinacion, adaptacion a la luz, fotosintesis, expansion de la hoja, produccion de fibra, crecimiento secundario o produccion de madera, entre otros; las respuestas de una planta a factores aplicados externamente, tales como metales, compuestos quimicos, hormonas, factores de crecimiento, el medio ambiente y factores de estres ambiental (por ejemplo, anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidratacion, luz, duracion del dia, inundaciones, salinidad, metales pesados, entre otros), incluyendo respuestas adaptativas de las plantas a dichos factores aplicados externamente.

"Estres ambiental" es una circunstancia provocada por los elementos presentes en el entorno que pueden incluir pero no se limitan a estres por sequia, sal, deshidratacion, calor, frio, congelacion, anegamiento, lesiones, mecanico, estres oxidativo, ozono, luz alta, metales pesados, privacion de nutrientes, productos quimicos toxicos, patogenos (incluyendo virus, bacterias, hongos, insectos y nematodos) y combinaciones de estos.

El termino "estres ambiental" ha sido definido de diferentes maneras en el estado del arte y coincide en gran medida con el termino "estres osmotico". (Holmberg y Bulow, 1998, Trends plant sci. 3, 61 -66), por ejemplo define diferentes factores de estres ambiental que dan lugar a estres abiotico. Salinidad, sequia, calor, enfriamiento y congelacion son todos descritos como ejemplos de condiciones que inducen estres osmotico. El termino "estres ambiental" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva se refiere a cualquier efecto adverso sobre el metabolismo, el crecimiento o la viabilidad de la celula, tejido, semilla, organo o planta completa que se produce por un factor de estres ambiental no viviente o no biologico. Mas particularmente, tambien abarca factores ambientales tales como estres hidrico (inundaciones, anegamiento, sequia, deshidratacion), estres anaerobico (bajo nivel de oxigeno, CO2, etc.), estres aerobico, estres osmotico, estres por salinidad, estres por temperatura (calor / calor abrasador, frio, congelacion, heladas) o la privacion de nutrientes, estres por contaminantes (metales pesados, productos quimicos toxicos), ozono, luz alta, patogenos (incluyendo virus, bacterias, hongos, insectos y nematodos) y combinaciones de los mismos.

El termino "estres anaerobico" significa cualquier reduccion en los niveles de oxigeno suficiente para producir un estres como se definio aqui anteriormente, incluyendo hipoxia y anoxia.

El termino "estres por inundacion" se refiere a cualquier estres que esta asociado con o inducido por inmersion prolongada o transitoria de una planta, parte de una planta, tejido o celula aislada en un medio liquido tal como ocurre durante el monzon, una estacion humeda, inundaciones repentinas o riego excesivo de las plantas, etc.

"Estres por frio" y "estres por calor" son estreses inducidos por temperaturas que estan, respectivamente, por debajo

o por encima del intervalo optimo de temperaturas para el crecimiento de una especie vegetal particular. Tales rangos optimos de temperatura de crecimiento se determinan facilmente o son conocidas por aquellos capacitados en la tecnica.

"Estres por deshidratacion" es cualquier estres que esta asociado con o inducido por la perdida de agua, turgencia reducida o contenido reducido de agua de una celula, tejido, organo o planta entera. El "estres por sequia" se refiere a cualquier estres, que es inducido por o esta asociado con la privacion de agua o el suministro reducido de agua a una celula, tejido, organo u organismo. "Estres oxidativo" se refiere a cualquier estres, que aumenta el nivel intracelular de especies reactivas de oxigeno.

Los terminos "estres inducido por salinidad", "estres salino" o un termino similar se refieren a cualquier estres que esta asociado con o es inducido por concentraciones elevadas de sal y que da lugar a una perturbacion en el potencial osmotico del medio ambiente intracelular o extracelular de un celula.

Las plantas transgenicas obtenidas de acuerdo con el metodo de la presente invencion, en presencia del acido polinucleico y/o la secuencia reguladora introducida en dicha planta, alcanzan una resistencia, tolerancia o tolerancia

o resistencia mejoradas contra el estres ambiental con respecto a la correspondiente planta de tipo.

Los terminos "tolerancia" y "resistencia" cubren el rango de proteccion desde un retraso hasta una inhibicion completa de la alteracion en el metabolismo celular, crecimiento celular reducido y/o muerte celular causados por las condiciones de estres ambiental definas aqui anteriormente. Preferiblemente, la planta transgenica obtenida de acuerdo con el metodo descrito aqui es tolerante o resistente a las condiciones de estres ambiental en el sentido de que dicha planta es capaz de crecer sustancialmente en forma normal bajo condiciones ambientales, donde la correspondiente planta de tipo silvestre muestra una reduccion en el crecimiento, metabolismo, viabilidad, productividad y/o esterilidad de tipo masculino o femenino. Como se usa en la presente memoria, "tolerancia al estres" se refiere a la capacidad de crecer y producir biomasa durante el estres, la capacidad de reiniciar el crecimiento y la produccion de biomasa despues del estres, y la capacidad de sobrevivir al estres. El termino "tolerancia al estres" tambien abarca la capacidad de la planta para experimentar su programa de desarrollo durante el estres de manera similar a bajo condiciones sin estres, por ejemplo, para cambiar de estado de latencia a la germinacion y de fase vegetativa a reproductiva bajo condiciones de estres de manera similar que bajo condiciones no estresadas. Las metodologias para determinar el crecimiento de la planta o la respuesta al estres incluyen, pero no se limitan a las mediciones de altura, area foliar, relaciones planta -agua, capacidad de florecer, capacidad de generar progenie y rendimiento o cualquier otra metodologia conocida por aquellos capacitados en la tecnica.

"Crecimiento" se refiere a la capacidad de la planta o de partes de la planta para crecer y el aumento de la biomasa mientras que "rendimiento" se refiere a la biomasa cosechable de plantas o partes de plantas, en particular las partes de valor comercial. "El crecimiento y/o rendimiento bajo condiciones estresadas y no estresadas" se refiere al hecho de que las plantas cultivadas en el campo casi siempre experimentaran alguna forma de estres, aunque leve. Se prefiere por lo tanto no distinguir entre condiciones no estresadas estresadas en forma leve. Como se espera que ocurran ciertos efectos beneficiosos de la invencion sobre el crecimiento y el rendimiento tanto bajo condiciones severas de estres como leves, se describen por lo tanto como un aumento del crecimiento y/o del rendimiento bajo condiciones estresadas y no estresadas.

Los medios para introducir ADN recombinante en el tejido o celulas de la planta incluyen, pero no se limitan a, transformacion utilizando CaCl2 y variaciones del mismo, en particular el metodo descrito anteriormente (Hanahan 1983), absorcion directa de ADN en los protoplastos (Krens et al. 1982; Paszkowski et al. 1984), captacion mediada por PEG a los protoplastos (Armstrong et al. 1990) bombardeo de microparticulas, electroporacion (Fromm et al. 1985), microinyeccion de ADN (Crossway et al. 1986; Fromm et al. 1985), bombardeo de microparticulas de explantes de tejido o de celulas (Christou et al 1988), infiltracion al vacio de tejido con acido nucleico, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por ADN-T por la transferencia de Agrobacterium al tejido de la planta como se describe esencialmente en (An et al. 1985; Dodds, 1985; Herrera-Estrella et al. 1983a; Herrera-Estrella et al. 1983b).

Los metodos para la transformacion de plantas monocotiledoneas son bien conocidos en la tecnica e incluyen transformacion mediada por Agrobacterium (Cheng et al. 1997 - W09748814; Hansen 1998 - W09854961, Hiei et al. 1994 -W09400977; Hiei et al. 1998 -W09817813; Rikiishi et al. 1999 -W09904618; Saito et al. 1995 -W09506722), bombardeo con microproyectiles (Adams et al. 1999 -US5969213; Bowen et al. 1998 -US5736369; Chang et al. 1994 -W09413822; Lundquist et al. 1999 -US5874265/US5990390; Vasil y Vasil 1995 -US5405765; Walker et al. 1999 -US5955362), captacion de ADN (Eyal et al. 1993 - W09318168), microinyeccion de celulas de Agrobacterium (von Holt 1994 - DE4309203) y sonicacion (Finer et al. 1997 - US5693512).

Para el bombardeo de celulas con microparticulas, se propulsa una microparticula dentro de una celula para producir una celula transformada. Cualquier metodologia adecuada de transformacion balistica de la celula y los aparatos se puede utilizar en la realizacion de la presente invencion. Un ejemplo de un aparato y de los procedimientos es descrito por Stomp et al. (Patente de los Estados Unidos No. 5.122.466) y Sanford y Wolf (Patente de los Estados Unidos No. 4.945.050). Cuando se utilizan procedimientos balisticos de transformacion, la construccion genica puede incorporar un plasmido capaz de replicarse en la celula que va a ser transformada. Los ejemplos de microparticulas adecuadas para uso en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 !m. La construccion de ADN puede ser depositada sobre la microparticula por medio de cualquier tecnica adecuada, tal como por medio de precipitacion.

Una planta entera puede ser regenerada a partir de la celula transformada o transfectada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica. El tejido vegetal capaz de propagacion clonal posterior, ya sea por organogenesis o por embriogenesis, puede ser transformado con una construccion genica de la presente invencion y una planta entera regenerada a partir de la misma. El tejido particular escogido variara dependiendo de los sistemas de propagacion clonal disponibles para, y mas adecuados para, las especies particulares que van a ser transformadas. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristematico existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares, y meristemos de la raiz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledon y meristemo del hipocotilo).

El termino "organogenesis", como se usa aqui, significa un proceso mediante el cual brotes y raices se desarrollan secuencialmente a partir de centros meristematicos.

El termino "embriogenesis", como se usa aqui, significa un proceso mediante el cual brotes y raices se desarrollan juntos de una forma concertada (no secuencial), ya sea a partir de celulas somaticas o de gametos.

Preferiblemente, la planta se produce de acuerdo con el metodo descrito aqui, es transfectada o transformada con una secuencia genetica, o es susceptible a la introduccion de una proteina, por medio de cualquier medio reconocido en el arte, tal como bombardeo de microproyectiles, microinyeccion, transformacion mediada por Agrobacterium (incluido el metodo de transformacion de 'inmersion de la flor'; (Bechtold & Pelletier 1998; Trieu et al. 2000)), fusion de protoplastos, o electroporacion, entre otros. Mas preferiblemente dicha planta es producida por transformacion mediada por Agrobacterium.

La "plantula" es la planta juvenil que surge del embrion maduro despues de la germinacion de la semilla.

Por "diferenciacion de una celula" se entiende que la celula desarrolla caracteristicas unicas que se relacionan con una funcion especifica. Generalmente la diferenciacion es irreversible.

La transformacion mediada por Agrobacterium o la transformacion agrolistica de plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de parte de las secuencias del vector de transformacion, llamadas ADN-T, al nucleo y en la integracion de dicho ADN-T en el genoma de dicha eucariota.

Por "Agrobacterium" se entiende un miembro de la Agrobacteriaceae, mas preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y mas preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.

Por "ADN-T", o ADN transferido, se entiende que parte del vector de transformacion flanqueado por los bordes del ADN-T que es, despues de la activacion de los genes vir de Agrobacterium, amellado en los bordes del ADN-T y transferido como un ADN monocatenario al nucleo de una celula eucariota.

Cuando se usa en este documento, con "bordes ADN-T", "region fronteriza del ADN-T", o "region fronteriza" se entiende ya sea el borde derecho del ADN-T (RB) o del borde izquierdo del ADN-T (LB). Tal borde comprende una secuencia central flanqueada por un borde de la region interior como parte del ADN-T que flanquea el borde y/o una region externa del borde como parte de la columna vertebral del vector que flanquea el borde. Las secuencias centrales comprenden 22 pb en el caso de los vectores tipo octopina y 25 pb en el caso de vectores tipo nopalina. Las secuencias centrales de la region del borde derecho y de la region del borde izquierdo forman repeticiones imperfectas. Secuencias centrales del borde son indispensables para el reconocimiento y el procesamiento por parte del complejo de amallado de Agrobacterium que consiste de al menos VirD1 y VirD2. Las secuencias centrales que flanquean un ADN-T son suficientes para promover la transferencia de dicho ADN-T. Sin embargo, la eficiencia de la transformacion usando vectores de transformacion que trasportan dicho ADN-T unicamente flanqueado por dichas secuencias centrales es baja. Se sabe que las regiones fronterizas interior y exterior modulan la eficiencia de la transferencia del ADN-T (Wang et al. 1987). Un elemento que mejora la transferencia del ADN-T ha sido caracterizado y reside en la region del borde exterior derecho y es llamado de sobrecarga (Peralta et al. 1986; van Haaren et al. 1987).

Por "vector de transformacion de ADN-T" o "vector de ADN-T" se entiende cualquier vector que abarca una secuencia de ADN-T flanqueada por un borde derecho e izquierdo del ADN-T que consiste de al menos las secuencias centrales del borde derecho e izquierdo, respectivamente, y utilizado para la transformacion de cualquier celula eucariota.

Por "secuencia de la columna vertebral del vector de ADN-T" o "secuencias de la columna vertebral del vector de ADN-T" se entiende todo ADN de un vector que contiene ADN-T que se encuentra fuera de los bordes del ADN-T y, mas especificamente, fuera de los sitios de amellamiento de las repeticiones imperfectas centrales del borde.

La presente invencion incluye vectores optimizados del ADN-T de tal manera que la integracion de la columna vertebral del vector en el genoma de una celula eucariota se reduce al minimo o esta ausente. Por "vector optimizado de ADN-T" se entiende un vector de ADN-T diserados ya sea para disminuir o para abolir la transferencia de secuencias de la columna vertebral del vector al genoma de una celula eucariota. Tales vectores de ADN-T son conocidos por alguien familiarizado con la tecnica e incluyen aquellos descritos previamente (Hanson et al. 1999), Stuiver et al. (1999 -W09901563).

La presente invencion considera claramente la inclusion de una secuencia de ADN de la presente invencion que codifica un factor DBF1 de enlazamiento de DRE o un fragmento del mismo como se definio anteriormente, en cualquier vector de ADN-T que comprende vectores de transformacion binarios, vectores de transformacion superbinarios, vectores de transformacion cointegrados, vectores de transformacion derivados de Ri, asi como en vectores que trasportan ADN-T utilizados en transformacion agrolistica.

Por "vector de transformacion binario" se entiende un vector de transformacion de ADN-T que comprende: una region de ADN-T que contiene por lo menos un gen de interes y/o al menos un marcador seleccionable activo en la celula eucariota que va a ser transformada, y una region de la columna vertebral del vector que comprende al menos origenes de replicacion activos en E. coli y en Agrobacterium y marcadores para seleccion en E. coli y en Agrobacterium. Alternativamente, la replicacion del vector de transformacion binario en Agrobacterium depende de la presencia de un plasmido auxiliar separado. El vector binario pGreen y el plasmido auxiliar pSoup forman un ejemplo de tal sistema como se describe, por ejemplo en (Hellens et al. 2000) o como se encuentra disponible en el sitio web http://www.pgreen.ac.uk.

Los bordes del ADN-T de un vector de transformacion binario se pueden derivar de plasmidos Ti de tipo octopina o de tipo nopalina o de ambos. El ADN-T de un vector binario solo se transfiere a una celula eucariota junto con un plasmido auxiliar. Tambien se conocen en la tecnica multiples cepas de Agrobacterium del vector binario para la eficiente cotransformacion de plantas (Bidney y Scelonge 2000 -W00018939).

Por "plasmido auxiliar" se entiende un plasmido que se mantiene de manera estable en Agrobacterium y porta al menos el conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del ADN-T. Dicho conjunto de genes vir puede derivarse de cualquiera de los plasmidos Ti de tipo octopina o de tipo nopalina o de ambos.

Por "vector de transformacion superbinario" se entiende un vector de transformacion binario que porta adicionalmente en la region de la columna vertebral del vector una region vir del plasmido Ti, pTiBo542, de la cepa super virulenta A281 de A. tumefaciens (Hiei et al. 1994 -EP0604662, Hiei et al. 1995 -EP0687730). Los vectores de transformacion superbinarios se utilizan junto con un plasmido auxiliar.

Por " vector de transformacion cointegrado" se entiende un vector ADN-T que comprende por lo menos: una region de ADN-T que contiene al menos un gen de interes y/o al menos un marcador seleccionable activo en plantas; y una region de la columna vertebral del vector que comprende al menos origenes de replicacion activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para la seleccion en E. coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del ADN-T.

Los bordes del ADN-T y dicho conjunto de genes vir de dicho vector de ADN-T se pueden derivar de cualquiera de los plasmidos Ti de tipo octopina o de tipo nopalina o de ambos.

Por "vector de transformacion de una planta derivado de Ri" se entiende un vector de transformacion binario en el que los bordes del ADN-T se derivan de un plasmido Ti y dicho vector de transformacion binario se utiliza junto con un plasmido 'auxiliar' Ri que porta el conjunto necesario de genes vir.

Tal como se utiliza aqui, el termino "gen marcador seleccionable" o "marcador seleccionable" o "marcador de seleccion" incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una celula en la cual se expresa para facilitar la identificacion y/o seleccion de celulas que se transfectan o transforman con una construccion genica de la invencion

o un derivado de la misma. Los genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aqui incluyen al gen de resistencia a la ampicilina (Amp'), al gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr), al gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (Kanr), al gen de resistencia a la fosfinotricina, al gen de la neomicina fosfotransferasa (nptll), al gen de resistencia a la higromicina, al gen de la �-glucuronidasa (GUS), al gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), al gen de la proteina fluorescente verde (gfp) (Haseloff et al. 1997), y al gen de la luciferasa, entre otros.

Por "agrolisticos", "transformacion agrolistica" o "transferencia agrolistica" se entiende aqui un metodo de transformacion que combina las caracteristicas de la transformacion mediada por Agrobacterium y de suministro de ADN biolistico. Como tal, un plasmido objetivo que contiene ADN-T se suministra conjuntamente con ADN / ARN permitiendo la produccion in planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996; Hansen et al. 1997), (Hansen y Chilton 1997 -W09712046). La presente invencion describe ademas una aproximacion para remover de las celulas transformadas una secuencia de ADN foraneo integrada de manera estable por medio de recombinacion que implica una recombinasa y lugares de recombinacion.

Por "ADN foraneo" se entiende cualquier secuencia de ADN que se introduce en el genoma del huesped por medio de tecnicas recombinantes. Dicho ADN foraneo incluye por ejemplo una secuencia de ADN-T o una parte de la misma tal como la secuencia de ADN-T que comprende el marcador seleccionable en un formato expresable. El ADN foraneo incluye, ademas, la intervencion de secuencias de ADN como se define mas arriba. Por "evento de recombinacion" se entiende tanto un evento de recombinacion especifico del sitio como un evento de recombinacion efectuado por medio del 'salto' de un transposon. Por "recombinasa" se entiende tanto una recombinasa especifica del sitio como una transposasa.

Por "sitio de recombinacion" se entiende ya sea sitios de recombinacion especificos del sitio o secuencias del borde del transposon.

Por "evento de recombinacion especifico del sitio" se entiende un evento catalizado por un sistema que consiste generalmente de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias o los sitios de recombinacion especificos del sitio) y una enzima especifica (la recombinasa especifica de sitio). La recombinasa especifica del sitio cataliza una reaccion de recombinacion unicamente entre dos secuencias de recombinacion especificas de sitio que dependen de la orientacion de las secuencias de recombinacion especificas de sitio. Las secuencias que intervienen entre dos sitios de recombinacion especificos del sitio se invertiran en presencia de la recombinasa especifica del sitio cuando las secuencias de recombinacion especificas del sitio estan orientadas en direcciones opuestas una con respecto a la otra (es decir, repeticiones invertidas). Si las secuencias de recombinacion especificas de sitio estan orientadas en la misma direccion una con respecto a la otra (es decir, repeticiones directas), entonces cualquiera de las secuencias que intervienen sera eliminada tras la interaccion con la recombinasa especifica del sitio. Por lo tanto, si las secuencias de recombinacion especificas del sitio estan presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una secuencia de ADN foraneo integrado en un genoma eucariotico, tal integracion de dichas secuencias se puede revertir posteriormente mediante la interaccion de las secuencias de recombinacion especificas del sitio con la correspondiente recombinasa especifica del sitio. Se pueden utilizar una cantidad de sistemas diferentes de recombinasa especifica del sitio, incluyendo pero sin limitarse al sistema Cre/lox del bacteriofago P1, al sistema FLP/FRT de levadura, a la recombinasa Gin del fago Mu, a la recombinasa Pin de E. coli, a la PinB , PinD y PinF de Shigella, y al sistema R/RS de Zygosaccharomyces rouxii. Recombinasas generalmente son integrasas, resolvasas o flipasas. Tambien pueden ser utilizadas recombinasas especificas duales conjuntamente con repeticiones directas o indirectas de dos sitios diferentes de recombinacion especificos del sitio correspondientes a la recombinasa especifica dual (Baszczynski et al. 1999 -W09925840). Los sistemas preferidos de recombinasa especificos del sitio son los sistemas Cre/lox del bacteriofago P1, el FLP / FRT de levadura y el R / RS de Z. rouxii. En estos sistemas una recombinasa (Cre, FLP o R) interactua especificamente con su respectiva secuencia de recombinacion especifica del sitio (lox, FRT, o RS, respectivamente) para invertir o eliminar las secuencias que intervienen. Las secuencias de recombinacion especificas del sitio para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 pb para lox y 47 pb para FRT). Algunos de estos sistemas ya han sido utilizados con gran eficiencia en plantas tales como tabaco (Dale & Ow 1990; Onouchi et al. 1991; Sugita et al. 2000) y Arabidopsis (Onouchi et al. 1995; Osborne et al. 1995). Los sistemas de recombinacion especificos del sitio tienen muchas aplicaciones en biologia molecular de plantas, incluyendo metodos para el control de la recombinacion homologa (por ejemplo, Hodges et al. 1996 - US5527695), para insercion dirigida, apilamiento de genes, etc. (Baszczynski et al. 1999 -W09925821) y para la resolucion de patrones de integracion complejos de ADN-T o para la escision de un marcador seleccionable (Ow et al. 1999 - W09923202).

Aunque las secuencias de recombinacion especificas del sitio deben estar enlazadas a los extremos del ADN para ser cortadas o para ser invertidas, el gen que codifica la recombinasa especifica del sitio puede estar situado en otro lugar. Por ejemplo, el gen de la recombinasa podria estar presente ya en el ADN de eucariota o podria ser suministrado por un fragmento de ADN introducido mas tarde, ya sea introducido directamente en las celulas, a traves de cruzamiento o a traves de polinizacion cruzada. Alternativamente, una proteina recombinasa sustancialmente purificada podria ser introducida directamente en la celula eucariota, por ejemplo, mediante microinyeccion o bombardeo de particulas. Tipicamente, la region de codificacion de la recombinasa especifica del sitio estara operativamente enlazada a secuencias reguladoras que permitan la expresion de la recombinasa especifica de sitio en la celula eucariota.

Por "evento de recombinacion efectuado por salto de transposon" o "recombinacion mediada por transposasa" se entiende un evento de recombinacion catalizado por un sistema que consta de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias del borde del transposon) y una enzima especifica (la transposasa). La transposasa cataliza una reaccion de recombinacion solamente entre dos secuencias del borde del transposon que estan dispuestas como repeticiones invertidas. Se pueden utilizar una cantidad de sistemas diferentes transposon / transposasa, incluyendo pero sin limitarse al sistema Ds / Ac, al sistema Spm y al sistema Mu. Estos sistemas se originan a partir del maiz, pero se ha demostrado que al menos el sistema Ds / Ac y el sistema Spm tambien funcionan en otras plantas (Fedoroff & Smith 1993; Schlappi et al. 1993; Van Sluys et al. 1987). Se prefieren los transposones del tipo Ds y SPM que son delineados por secuencias de borde de 11 pb y 13 pb, respectivamente.

Aunque las secuencias del borde del transposon deben estar enlazadas a los extremos del ADN que va a ser cortado, el gen que codifica la transposasa puede estar localizado en otra parte. Por ejemplo, el gen de la recombinasa podria ya estar presente en el ADN del eucariota o podria ser suministrado por un fragmento de ADN introducido mas tarde ya sea introducido directamente en las celulas, a traves de cruzamiento o a traves de polinizacion cruzada. Alternativamente, una proteina transposasa sustancialmente purificada podria ser introducida directamente en las celulas, por ejemplo, por medio de microinyeccion o por bombardeo de particulas.

Como parte de la presente invencion, las secuencias del borde del transposon se incluyen en una secuencia de ADN foraneo de tal manera que se encuentran fuera de dicha secuencia de ADN y transformen dicho ADN en una entidad tipo transposon que pueda moverse por la accion de una transposasa.

Como los transposones a menudo se reintegran en otro locus del genoma del huesped, puede ser necesario la segregacion de la progenie de los huespedes en los cuales se permitio actuar a la transposasa para separar los huespedes transformados que contienen por ejemplo solo la huella del transposon y los huespedes transformados que aun contienen el ADN foraneo.

En la realizacion de la presente invencion, se induce preferiblemente el elemento genetico para movilizacion, tal como, por ejemplo, mediante la expresion de una proteina recombinasa en la celula que contacta el sitio de integracion del elemento genetico y facilita alli un evento de recombinacion, escindiendo completamente el elemento genetico, o alternativamente, dejando una "huella", generalmente de aproximadamente 20 nucleotidos de longitud o mayor, en el sitio de integracion original. Aquellos huespedes y partes de los huespedes que han sido producidos de acuerdo con el metodo de la invencion se pueden identificar por medio de tecnicas estandar de hibridacion de acido nucleico y/o de amplificacion para detectar la presencia del elemento genetico que puede ser movilizado o una construccion genica que contiene al mismo. Alternativamente, en el caso de las celulas huesped transformadas, tejidos, y huespedes en donde el elemento genetico que puede ser movilizado ha sido escindido, es posible detectar una huella en el genoma del huesped que ha sido dejada despues del evento de escision, utilizando tales tecnicas. Tal como se utiliza aqui, el termino "huella" se entendera que se refiere a cualquier derivado de un elemento genetico que puede ser movilizado o construccion genica que lo contiene como se describe aqui que es producido mediante la escision, supresion u otro tipo de remocion del elemento genetico que puede ser movilizado del genoma de una celula previamente transformada con dicha construccion genica. Una huella generalmente comprende al menos una sola copia de los loci de recombinacion o del transposon utilizado para promover la escision. Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales derivadas de la construccion genica, por ejemplo secuencias de nucleotidos derivadas de la secuencia de borde izquierdo, de la secuencia del borde derecho, del origen de replicacion, de la secuencia que codifica la recombinasa o que codifica la transposasa, si se utiliza, u otras secuencias de nucleotidos derivadas del vector. En consecuencia, una huella puede ser identificada de acuerdo con la secuencia de nucleotidos del locus de recombinacion o del transposon o de la construccion genetica utilizada, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a un sitio lox, a un sitio frt o a un sitio RS.

Por "patogeno" se entiende aquellos organismos que tienen un efecto negativo sobre el estado fisiologico de la planta o una parte de la misma. Algunos patogenos son por ejemplo virus, bacterias, hongos, y plantas parasitas. Por "plagas" de las plantas se entiende el grupo de nematodos asi como de insectos, que son capaces de ejercer un efecto negativo sobre el estado fisiologico de la planta o de una parte de la misma.

"Celula vegetal" comprende cualquier celula derivada de cualquier planta y que existe en cultivo como una unica celula, un grupo de celulas o un callo. Una celula vegetal puede ser tambien cualquier celula en una planta en desarrollo o madura en cultivo o que crece en la naturaleza.

"Plantas" comprende todas las plantas, incluyendo plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas. "Cereal" comprende plantas de cultivo de grano comestible por ejemplo plantas que pertenecen a la familia de las gramineas que se cultiva por sus granos nutritivos tales como avena, cebada, centeno, trigo, arroz y maiz, etc.

Por "ensayo de doble hibrido en levadura" se entiende un ensayo que se basa en la observacion de que muchos factores de transcripcion eucariotas contienen dos dominios, un dominio de enlazamiento de ADN (DB) y un dominio de activacion (AD) que, cuando estan fisicamente separados (es decir, ruptura del enlace covalente) no efectuan la expresion del gen objetivo. Dos proteinas capaces de interactuar fisicamente con una de dichas proteinas fusionadas a DB y la otra de dichas proteinas fusionadas a AD volveran a reunir a los dominios DB y AD del factor de transcripcion resultando en la expresion del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo de doble hibridos en levadura es usualmente un gen reportero tal como el gen de la -galactosidasa. La interaccion entre proteinas socias en el ensayo de doble hibrido en levadura puede por lo tanto ser cuantificada midiendo la actividad del producto del gen reportero (Bartel & Fields, 1997). Alternativamente, se puede utilizar un sistema de doble hibrido en mamifero, que incluye por ejemplo un gen reportero que codifica una proteina fluorescente verde quimerica (Shioda et al. 2000). Incluso otra alternativa consiste en un sistema de doble hibrido en bacterias utilizando por ejemplo HIS como gen reportero (Joung et al. 2000).

El termino "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la secuencia original en referencia. La secuencia truncada (secuencia de acido nucleico o de proteina) puede variar ampliamente en longitud; el tamaro minimo es el de una secuencia de tamaro suficiente para proporcionar una secuencia con al menos una funcion y/o actividad comparables o la secuencia original de referencia, en tanto que el tamaro maximo no es critico. En algunas aplicaciones, el tamaro maximo por lo general no es sustancialmente mayor que el requerido para proporcionar la actividad y/o la funcion(es) deseada(s) de la secuencia original. Tipicamente, la secuencia truncada de nucleotidos o de aminoacidos variara en el rango aproximadamente de 5 hasta aproximadamente 60 aminoacidos de longitud. Mas tipicamente, sin embargo, la secuencia sera al menos aproximadamente de 50 aminoacidos de longitud, preferiblemente un maximo de (o al menos) aproximadamente 60, 80, 100, 120, 150, 200 o 220 aminoacidos. Normalmente es deseable seleccionar secuencias de al menos aproximadamente 10, 12 o 15 aminoacidos, hasta un maximo de aproximadamente 20 o 25 aminoacidos.

"Parte de una secuencia de acido nucleico" se refiere a una secuencia que tiene al menos aproximadamente 20 nucleotidos en longitud, preferiblemente un maximo de (o al menos) aproximadamente 25, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000 nucleotidos.

Ademas, se pueden llevar a cabo simulaciones de plegamiento y redisero por ordenador de motivos estructurales de la proteina de la invencion utilizando programas informaticos apropiados (Hoffman et al. 1995; Oiszewski et al. 1996). El modelamiento por ordenador del plegamiento de proteinas puede utilizarse para el analisis conformacional y energetico del peptido detallado y de modelos de proteinas (Monge et al. 1995; Renouf & Hounsell 1995). En particular, se pueden utilizar programas apropiados para la identificacion de sitios interactivos de la proteina de enlazamiento de DRE (DBF1) de la presente invencion por medio de busquedas asistidas por ordenador para secuencias complementarias de peptidos (Fassina & Melli 1994). En el estado del arte se describen otros sistemas informaticos apropiados para el disero de proteinas y de peptidos por ejemplo en (Berry & Brenner, 1994; Pabo & Suchanek 1986; Wodak 1987). Los resultados obtenidos a partir del analisis por ordenador anteriormente descrito pueden ser utilizados, por ejemplo, para la preparacion de peptidomimeticos. Tales analogos pseudopeptidicos de la secuencia natural de aminoacidos de la proteina pueden imitar muy eficientemente la proteina original (Benkirane et al. 1996). Por ejemplo, la incorporacion de residuos de aminoacidos � aquirales facilmente disponibles en una proteina o un fragmento de la misma da como resultado la sustitucion de enlaces amino por unidades de polimetileno de cadena alifatica, proporcionando asi una estrategia conveniente para la construccion de un peptidomimetico (Banerjee et al. 1996). Los analogos peptidomimeticos superactivos de hormonas peptidicas pequeras en otros sistemas estan descritos en el estado de la tecnica (Zhang et al. 1996). Los peptidomimeticos apropiados tambien pueden ser identificados por medio de la sintesis de bibliotecas combinatorias de peptidomimeticos mediante la alquilacion sucesiva de amina y analizando los compuestos resultantes, por ejemplo, por sus propiedades de enlazamiento, inhibidoras de quinasa y/o inmunologicas. Los metodos para la generacion y uso de bibliotecas de combinacion peptidomimeticas estan descritas en el estado de arte por ejemplo (Dorner et al. 1996; Ostresh et al. 1996).

Ademas, se pueden utilizar una estructura tridimensional y/o cristalografica de una proteina para el disero de inhibidores peptidomimeticos de la actividad biologica de una proteina (Rose et al. 1996; Rutenber et al 1996).

Los compuestos que van a ser obtenidos o identificados pueden ser compuestos que son capaces de enlazarse a cualquiera de los acidos nucleicos, peptidos o proteinas descritos aqui. Otros compuestos de interes para ser identificados son los compuestos que modulan la expresion de los genes o las proteinas de tal manera que, o bien se mejora la expresion de dicho gen o proteina o disminuye por la accion de dicho compuesto. Alternativamente, el compuesto puede ejercer su accion mejorando directa o indirectamente o disminuyendo la actividad de cualquiera de las proteinas de la invencion.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos pueden estar comprendidos, por ejemplo, en muestras, por ejemplo, extractos celulares, por ejemplo, de plantas, animales o microorganismos. Ademas, dicho(s) compuesto(s) puede(n) ser conocido(s) en la tecnica pero hasta ahora no conocido(s) por ser capaz(ces) de suprimir o activar proteinas que interactuan en el ciclo celular. La mezcla de reaccion puede ser un extracto libre de celulas que puede comprender una cultivo de celulas o de tejidos. Las configuraciones adecuadas para el metodo de la invencion son conocidas por la persona capacitada en la tecnica y han sido, por ejemplo, generalmente descritas previamente (Alberts et al. 1994), en particular el Capitulo 17. La pluralidad de compuestos puede ser, por ejemplo, aradida a la mezcla de reaccion, medio de cultivo o inyectados dentro de la celula.

Si una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos es identificada en el metodo de la invencion, entonces es posible o bien aislar el compuesto de la muestra original identificada por que contiene el compuesto capaz de actuar como un agonista, o se puede subdividir aun mas la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de compuestos diferentes, con el fin de reducir el numero de sustancias diferentes por muestra y repetir el metodo con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente se puede realizar varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el metodo de la invencion solo contenga un numero limitado de solo una sustancia(s). Preferiblemente dicha muestra contiene sustancias o propiedades quimicas y/o fisicas similares, y lo mas preferible, dichas sustancias son identicas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el metodo descrito anteriormente o su derivado es formulada ademas en una forma adecuada para la aplicacion en fitomejoramiento vegetal o cultivo de celulas y tejidos de plantas.

El factor de transcripcion que contiene el dominio AP2/EREBP es la denominacion ampliamente aceptada de una familia de proteinas de enlazamiento de ADN que contienen un dominio de enlazamiento de ADN de aproximadamente 60 aminoacidos que esta bastante bien conservado en la secuencia entre los diferentes miembros de la familia. Los ejemplos de tales secuencias son descritos en Ohme-Takagi y Shinshi (Plant Cell 1995; 7: 173 182), Weigel (Plant Cell 1995; 7: 388 -389), y Mushegian y Koonin (Genetica 1996, 144: 817 - 828). Este dominio se denomina generalmente como dominio apetala, AP2, EREBP o AP2/EREBP. Aquellos capacitados en la tecnica pueden identificar facilmente la presencia de un dominio AP2/EREBP en secuencias de polipeptidos y de proteinas, por ejemplo a traves de sitios en Internet publicamente accesibles. Por ejemplo, el programa Pfam 5.5 de la Universidad de Washington en San Louis permite detectar dominios AP2/EREBP en secuencias dadas de polipeptidos o de proteinas (http://pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc�name=AP2-domain).

La expresion del "elemento DRE" como se utiliza aqui se refiere a un "elemento sensible a la sequia". Este es un elemento que actua sobre cis conocido en la tecnica, con la secuencia general de consenso DRE: TACCGACAT (Busk et al., The Plant Journal (1997) 11 (6), 1285 -1295). Elementos DRE son frecuentemente encontrados en los promotores de genes que estan involucrados en la tolerancia al estres. Los terminos DRE1 y DRE2 como se usan aqui, se refieren a los elementos DRE que se encuentran en el promotor rab17 de maiz que tienen las secuencias de "ACCGA" y "ACCGAC", respectivamente (vease tambien Busk et al., 1997).

Tambien han sido reportados motivos relacionados con DRE en las regiones promotoras de los genes inducibles por frio y sequia, tales como lin1, cor6.6, rd17 (revisado en Liu et al., The Plant Cell (1998) 10,1391 -1406). Un motivo similar tambien fue reportado (repeticion C; "TGGCCGAC" en las regiones promotoras de la cor 15 a inducible por frio. La secuencia central "CCGAC" fue encontrada en las regiones promotoras del gen BN115 de colza inducible por frio designado como el elemento sensible a la baja temperatura.

La expresion "elementos DRE" como se utiliza aqui se refiere a las secuencias de elemento particular DRE como se menciono anteriormente, asi como a aquellos elementos en el contexto de un promotor natural, por ejemplo, en el contexto de al menos una parte del promotor rab17 de maiz. Tambien, cuando se utiliza la expresion "elemento DRE" en este documento nos referimos a un elemento DRE en el contexto de un promotor sintetico o un promotor quimerico, a una copia del elemento DRE o a multiples copias del elemento DRE (tal como en la SEQ ID NO 1).

La presente invencion es descrita adicionalmente por referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1:

A. Representacion en forma de arbol de las similitudes de secuencia entre diferentes miembros de la superfamilia que contiene el dominio AP2 de factores de transcripcion putativos. Tenga en cuenta que no todas las secuencias con dominios AP2 fueron incorporadas. Las alineaciones se realizaron con el programa CLUSTALW (serie Blosum 32, penalizacion por abertura de brecha 10,00 y por extension de la brecha 0,05). Los nombres en el lado derecho del arbol se refieren a las proteinas del dominio AP2 de funcion conocida que son representativas para cada clase de proteinas del dominio AP2.

B. Alineacion parcial de aminoacidos de DBF1 y de las secuencias mas estrechamente relacionadas, que muestra la conservacion de la secuencia fuera del dominio AP2. Las secuencias DREB1A y CBF1 se presentan para ilustrar la especificidad de la conservacion de la secuencia de DBF1 y de las secuencias estrechamente relacionadas. Una secuencia de consenso tentativa se presenta en negrita. Los numeros en la parte superior de la figura se refieren a la posicion del aminoacido en la secuencia de DBF1.

Figura 2:

Analisis tipo Northern que muestra la induccion de la expresion de DBF1 por estres por deshidratacion y tratamiento con ABA. Se utilizaron los ADN de rab17 y de la subunidad a de tubulina como control positivo y constitutivo, respectivamente. Los ADNc totales se utilizaron como sondas para todas las hibridaciones. Los extractos de ARN total se obtuvieron de plantas de 5 dias de edad, y se indican como sigue. C: control, plantas de 5 dias de edad sin tratamiento adicional. D: plantas estresadas por agua. S: plantas estresadas en un medio liquido de NaCl 250 mM.

A: plantas tratadas con 100 !M de ABA. 4: plantas estresadas con frio (4° C). 37: plantas estresadas con calor (37° C).

Figura 3:

Estudio de las cineticas de induccion de DBF1 en tejidos vegetativos durante el tratamiento de estres por agua de plantulas de maiz. Se utilizaron como control los ADNc de rab17 y de la subunidad a de tubulina. El ARN total se obtuvo en diferentes momentos indica como sigue. Los numeros por encima de cada carril indican el tiempo en minutos de tratamiento de estres por agua que se aplico a las plantas.

Figura 4:

Analisis de transferencias tipo Western utilizando anticuerpos de proteina total anti-DBF1 y de proteina parcial anti-DBF1 con extractos de proteina de diferentes partes de plantulas de maiz de 5 dias de edad tratadas con diversos tipos de estres, y en embriones de maiz. C: control, plantas de 5 dias de edad sin tratamiento adicional. D: plantas estresadas por agua. S: plantas estresadas en un medio liquido de NaCl 250 mM. A: plantas tratadas con ABA 100 !M. 4: plantas estresadas con frio (4° C). 37: plantas estresadas con calor (37� C). I: proteina total de DBF1 sobreexpresada en E. coli. Los numeros 14, 20, 40 y 60 indican los dias despues de la polinizacion.

Figura 5:

Valores e histograma de la expresion relativa de GUS / LUC, que muestran la induccion de la actividad del promotor Rab17 en celulas de callo de maiz por expresion transitoria de DBF1. El gen GUS esta bajo el control del promotor rab 17 de tipo silvestre de 350 pb (r17 +) o de una forma mutante que trasporta un elemento que actua sobre cis modificado DRE2 (r17 m). La mutacion en DRE2 es la misma que en la sonda de oligonucleotido usada para EMSA (ver materiales y metodos). El plasmido efector consiste del ADNc de DBF1 bajo el control de un promotor 35S doble del CaMV (DBF1) DBF1. Un vector vacio se utiliza como control (vector). Barras blancas: sin ABA 100 !M. Barras a rayas: con ABA 100 !M.

Figura 6:

Ensayo de cambio de movilidad electroforetica (EMSA) de DBF1 total y parcial.

a) EMSA de la proteina total DBF1 utilizando oligonucleotidos que contienen el elemento que actua sobre cis de DRE2 de tipo silvestre (carriles 1 - 4) y mutante (carril 5) como sondas. Carril 1: sonda libre solamente. Carriles 2 - 5:

+ 200 ng de proteina total DBF1. Carril 3: 1 competencia 100x con el elemento que actua sobre cis en peso de DRE2. 4: competencia 1000x con el elemento que actua sobre cis en peso de DRE2. b) Igual que a), pero utilizando la proteina parcial de DBF1 que carece del dominio AP2, para todas las reacciones. c) EMSA de la proteina total de DBF1 con sondas de oligonucleotidos diferentes. Carril 1: sonda libre que contiene solamente el elemento que actua sobre cis en peso de DRE2. Carriles 2 -5: + 200 ng de proteina total de DBF1. 2 y 7: sonda que contiene el elemento que actua sobre cis en peso de DRE2. 3: sonda que contiene el elemento que actua sobre cis en peso de DRE1. 4: sonda que contiene el elemento que actua sobre cis en peso de GRA. 5: sonda que contiene el elemento que actua sobre cis en peso de DRE1/ABRE1. 6: sonda que contiene el elemento que actua sobre cis de ABRE A del promotor del gen rab28.

Figura 7:

A. Representacion en forma de arbol de las similitudes de secuencias entre distintos miembros de la familia que contiene al dominio AP-2 de arroz en comparacion con otras proteinas AP2 de diversas especies de plantas tal como Tabaco y Arabidopsis. Las alineaciones se realizaron con el programa CLUSTALW (serie Blosum 32, penalizacion por abertura de brecha 10,00 y por extension de la brecha 0,05). Se incluyen las proteinas de enlazamiento de DRE anteriormente descritas, tales como CBF1 o DREB2A de Arabidopsis, asi como otras proteinas AP2 funcionalmente diferentes tales como ABI4, EREBP o aintegumenta.

B. Comparacion por pares de ZmDBF1 con proteina CAC39058 de Oryza sativa (OsDBF1, SEQ ID NO 16). La alineacion por pares se realizo con el programa CLUSTALW como se describe en A.

Figura 8: Listado de secuencias y de las correspondientes SEQ ID NOs.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Aislamiento de los ADNc que codifican las proteinas de enlazamiento de DRE2 utilizando la deteccion de un hibrido en levadura.

Se utilizo el sistema de seleccion de un hibrido en levadura (Clontech®) con el fin de aislar clones de ADNc que codifican proteinas de enlazamiento de ADN que interactuan con el elemento que actua en cis DRE2 del promotor rab17. Para este fin, se genero una cepa de levadura reportera dual. Se clono un oligonucleotido sintetico que contiene tres repeticiones en tandem del elemento que actua en cis DRE2 a partir del promotor rab17 (Busk et al., Plant J. 11: 1285 -1295, 1997) con sitios de restriccion EcoRI y XbaI o EcoRI y Sall en sus extremos 3' y 5' en los sitios de las enzimas de restriccion correspondientes en los multienlazadores de los plasmidos pHISi-1 y pLacZi respectivamente. La cepa de levadura reportera doble se obtuvo mediante la transformacion de la cepa de levadura YM4271 con las construcciones de los plasmidos placZi y pHISi-1 anteriores en forma secuencial. Los transformantes de levadura se sometieron a pruebas de control de -galactosidasa y 3-AT para la determinacion de la actividad de la expresion de fondo. Los transformantes de levadura que no mostraron actividad de lacZ y no fueron capaces de crecer en presencia de 3-aminotriazol (3-AT) 40 mM fueron seleccionados para su uso posterior en la seleccion de la biblioteca de ADNc con el sistema de un solo hibrido.

Se construyo una biblioteca de fusion de ADNc de expresion a partir de hojas de plantulas de maiz de cinco dias de edad que fueron previamente sometidas a estres hidrico durante tres horas. Se extrajo el ARN total como se describio previamente (Vilardell et al., Plant Mol Biol 17: 985 -993, 1991). Se obtuvo ARNm con una cola de poli (A)+ mediante el uso del kit de ARNm polyATtract® (Promega). Se preparo el ADNc usando el kit de sintesis de ADNc de Stratagene y se clono posteriormente con el vector fagemido HybriZap (Stratagene). La biblioteca de ADNc fue transformada en la cepa de levadura reportera dual y se seleccionaron aproximadamente 1,4 x 106 transformantes de levadura en presencia de 3-AT 40 mM. Se selecciono una gran cantidad de clones resistentes a 3-AT y posteriormente fueron analizados por la actividad de lacZ pero utilizando un ensayo de filtro X-gal. Catorce de los clones indujeron actividad de lacZ y formaron colonias azules. Los ADNc correspondientes se analizaron adicionalmente mediante digestion con enzimas de restriccion y secuenciacion del ADN, resultando en dos grupos que consistian de seis y ocho clones con insertos de ADNc de 1 y 1,2 kb respectivamente.

Ejemplo 2: Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de una proteina de enlazamiento de DRE2 de acuerdo con la invencion

DBF1 es un ejemplo de ADNc que codifica una proteina que se enlaza con el elemento que actua en cis DRE2. La secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de DBF1 se presentan como la SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, respectivamente. El ADNc de DBF1 contiene un marco de lectura abierto de 222 aminoacidos y codifica una proteina putativa con una masa molecular teorica de 24 kD.

Ejemplo 3: Analisis por BLAST de la base de datos con la secuencia de aminoacidos de DBF1

La secuencia de aminoacidos de DBF1 fue sometida a BLAST contra las bases de datos nr (Todas las traducciones de la CDS no redundante del GenBank + PDB + SwissProt + PIR) (utilizando el programa BLASTP) y GPT�DNA (Rijksunoversiteit Gent -Vlaams Interuniverisair Instituut voor Biotechnologie, K. L. Ledegenkstraat 35, B-9000 Gent; (http://aivwww.rug.ac.be/Onderzoeksbeleid/techno2002/EN/WE/WE09V13.htm) (utilizando el programa TBLASTN). Los resultados de ambas busquedas por BLAST mostraron esencialmente la misma imagen, a saber:

1.

DBF1 muestra la mayor similitud con una clase de proteinas que contienen el dominio AP2 de funcion desconocida. Los valores E de DBF1 con esta clase de proteinas estan en el rango entre e-39 y e-46. Ejemplos son las proteinas codificadas por las secuencias con numeros de acceso AC009243, AC024228, AC021666, AC006228, AC012680, AL161595, AC007168 y AB013395.

2.

DBF1 muestra una alta similitud con una clase de proteinas que contienen el dominio AP2 de funcion desconocida. Los valores E de DBF1 con esta clase de proteinas estan en el rango entre e-27 y e-29. Ejemplos son las proteinas con numeros de acceso AC066689, AL161537, y AC006234.

3.

DBF1 muestra menos homologia con las proteinas que contienen al dominio AP2 de funcion conocida tales como AB14, CBF1, DREB1A, las proteinas de la familia EREB, aintegumenta, y AP2. Los valores E de DBF1 con estas proteinas que contienen AP2 de funcion conocida son en todos los casos mayores que e-20.

Se concluye por lo tanto que DBF1 representa una clase separada de proteinas que contienen el dominio AP2, cuya funcion era desconocida hasta ahora.

Los mejores exitos con el programa TBLASTN contra la base de datos GPT-DNA se muestran a continuacion:

Secuencias que producen alineaciones significativas: Puntuacion (bits) Valor E

AC009243�gen25cadena+ L =1 005 UTR = 30 pb (108054..109058) 179 2e-45 AC024228�gen3cadena- L = 786 UTR = 30 pb (7956..8741) 176 2e-44 AC021666�gen4cadena+ L = 945 UTR = 30 pb (19304..20248) 174 9e-44

AC006998�gen4cadena- L = 945 UTR = 30 pb (15461..16405) 174 9e-44 AC012680�gen1cadena+ CDS incompleta L= 547 UTR = 30 pb (12.... 165 4e-41 AL161595�gen48cadena- L = 819 UTR = 30 pb (178386..179204) 163 2e-40 AC007168�gen13cadena+ L = 786 UTR = 30 pb (48835..49620) 161 5e-40 AB013395�gen5cadena+ L = 834 UTR = 30 pb (15366..16199) 161 5e-40 AC066689�gen10cadena+ L = 1008 UTR = 30 pb (56636..57643) 127 1 e-29 AL161537�gen5cadena+ L = 1032 UTR = 30 pb (24381..25412) 120 1 e-27 AC006234�gen16cadena- L = 1011 UTR = 30 pb (44635..45645) 118 5e-27 AL161572�gen26cadena- L = 879 UTR = 30 pb (90388..91266) 107 1 e-23 AL049803�gen2cadena-L = 879 UTR = 30 pb (1668...2546) 107 1 e-23 AB025637�gen7cadena+ L = 966 UTR = 30 pb (28869..29097,29900.... 103 2e-22 AB013388�gen9cadena- L = 1065 UTR = 30 pb (32150..33214) 98 1 e-20 AB018117�gen7cadena- L = 732 UTR = 30 pb (20365..21096) 98 1 e-20 AL163912�gen4cadena+ L = 792 UTR = 30 pb (20853..21105,21291.... 97 2e-20 AF085279�gen10cadena- L = 987 UTR = 30 pb (41637..42623) 96 2e-20 AB022212�gen1cadena- L = 2266 UTR = 30 pb (915..1325,1685..19... 95 6e-20 AC016163�gen16cadena- L = 552 UTR = 30 pb (48434..48985) 94 9e-20 AC016162�gen8cadena- L = 552 UTR = 30 pb (15218..15769) 94 9e-20 U78721�gen3cadena- L = 660 UTR = 30 pb (12017..12091,12359..1... 94 1 e-19

(continuacion)

Secuencias que producen alineaciones significativas: Puntuacion (bits) Valor E

AB026650�gen8cadena+ L = 1170 UTR = 30 pb (23043..23094,24382... 94 1 e-19 AB022217�gen21cadena+ L = 747 UTR = 30 pb (71834..71993,72232... 94 2e-19 AC005405�gen4cadena- L = 657 UTR = 30 pb (19886..20542) 94 2e-19 AC004260�gen8cadena- L = 657 UTR = 30 pb (32878..32944,33023.... 93 3e-19 AL161560�gen6cadena+ L = 1032 UTR = 30 pb (36135..37166) 93 3e-19 AL163491�gen13cadena+ L = 2430 UTR = 30 pb (65703..65986,6607... 92 4e-19 AC025813�gen6cadena+ L = 558 UTR = 30 pb (22457..23014) 92 4e-19 AB022220�gen1 cadena- L = 1125 UTR = 30 pb (1520..1570,1768..2... 92 6e-19 AC007591�gen29cadena+ L = 1176 UTR = 30 pb (99139..99218,9951... 92 6e-19

AL163815�gen18cadena- L = 711 UTR = 30 pb (89595..90305) 91 8e-19

AL163814�gen1cadena-L = 711 UTR = 30 pb (6771..7481) 91 8e-19

Este hallazgo fue confirmado cuando se hizo una alineacion de secuencias con el programa CLUSTALW (serie

5 Blosum 32, penalizacion por apertura de brecha 10,00 y por extension de la brecha 0,05). Una representacion en forma de arbol de esta alineacion se muestra en la Figura 1A. Esta representacion en forma de arbol ilustra nuevamente muy bien que DBF1 representa una nueva clase de factores de transcripcion del dominio AP2, que es diferente de la clase DREB / CBF de secuencias, la clase EREBP de secuencias, la clase TINY de secuencias y las secuencias de tipo apetala2 e integumenta.

10 Ademas, la alineacion de secuencias muestra una alta conservacion de secuencias entre DBF1 y sus familiares mas cercanos, secuencia abajo del dominio AP2 (vease la Figura 1B). Esta secuencia se conserva entre DBF1, T05015, AAF76898, y AAF87854, pero no con PZ02�LUPPO, lo que puede indicar que este ultimo ya pertenece a una clase diferente de proteinas del dominio AP2 (vease tambien la Figura 1A).

15 Se obtienen resultados similares con similitud de secuencia total calculada con el programa GAP. El programa GAP alinea dos secuencias en forma global (matriz de sustitucion de aminoacidos BLOSUM62, Peso de la Brecha: 8, Peso por Longitud: 2, Referencia: Henikoff, S. y Henikoff, JG (1992). Matrices de sustitucion de aminoacidos de los bloques de proteina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 -10919). Esto se ilustra en la Tabla 4, donde tambien

20 estan incluidos los homologos mas cercanos de DBF 1. La secuencia AB013395 (proteina correspondiente BAB11649) se muestra como un ejemplo de una clase de secuencias con un valor E de 5e-4 o menos, mientras que la secuencia AC006234 (proteina correspondiente AAD20907) fue tomada como ejemplo de una clase de secuencia con valor E de aproximadamente e-27. CBF1 se toma como ejemplo de una secuencia con valor E de aproximadamente e-20 o mas. Como se menciono anteriormente, todas las proteinas AP2/EREBP de funcion

25 conocida muestran valores E de aproximadamente e-20 o mas. Tambien se aislo un homologo de DBF1 recientemente identificado de Oryza sativa (vease el ejemplo 8) y se alineo con ZmDBF1.

Tabla 4: % de identidad de secuencia de aminoacidos y similitud entre DBF1 y otras proteinas AP2/EREBP

% de Identidad con ZmDBF1

% de similitud con ZmDBF1

BAB11649 (AB013395)

49,8 58,2

AAD20907 (AC006234)

40,3 48,9

CBF1

33,5 38,5

PZ02 LUPPO

37,9 44,4

T05015

52,4 58,4

AAF76898,

45,8 51,8

AAF87854

50 55,8

OsDBF1

35,3 38,4

30 A partir de este analisis de similitud, se puede deducir que las secuencias con 35%, 37%, 40%, y preferentemente 50% de identidad de secuencia de aminoacidos estan estrechamente relacionadas con DBF1, mientras que las secuencias con 33,5% de identidad acido amino o menos son pertenecientes a diferentes clases de proteinas AP2/EREBP. La cantidad minima de identidad de secuencia que es discriminatoria para secuencias relacionadas

35 con DBF1 esta por lo tanto entre 33,5% y 35%. De acuerdo con esto, la proteina OsDBF1 y la proteina PZ02 LUPPO, que estan en la misma clase que DBF1 en una representacion tipo arbol (vease la Figura 1A y la Figura 7A), pero situadas en una rama distante, muestran 35,3% y 37,9% de identidad de aminoacidos con DBF1 respectivamente.

40 Ejemplo 4: ARNm de DBF1 y la expresion de proteina es inducible por ABA y estres por deshidratacion

Se realizaron hibridaciones de transferencias tipo Northern para estudiar el patron de expresion de ARNm de la DBF1 en tejidos vegetativos de plantulas de maiz de cinco dias de edad sometidos a ABA y diversos tratamientos de estres abiotico, asi como durante la embriogenesis del maiz. El ARN total se preparo como se describio previamente

45 (Vilardell et al., Plant Mol Biol 17: 985 -993, 1991). Los ADNc totales se utilizaron como sondas para todas las hibridaciones de transferencia tipo Northern. Las hibridaciones para este experimento en particular se realizaron a 42° C con lavados a 65° C como se describio previamente (Amasino et al., Anal Biochem 152: 304 -307, 1986).

El gen para DBF1 fue fuertemente inducido despues del estres por deshidratacion en todas las partes vegetativas y tambien fue inducido por la sal y ABA, que muestra un nivel excepcionalmente alto de expresion en las raices (Figura 2). Los tratamientos de choque por frio y por calor parecieron tener un efecto muy bajo o ningun efecto sobre la abundancia de ARNm del gen para DBF1 mientras que se detecto un nivel basal de transcripcion en plantas de control no tratadas en todos los casos.

Las cineticas de acumulacion de ARNm de DBF1 y Rab17 fueron seguidas durante las primeras horas de estres por deshidratacion (Figura 3). Ya existe un aumento en los niveles del ARNm para DBF1 durante la primera hora de tratamiento del estres por agua seguido por un incremento adicional posterior.

En embriones de maiz, se detecto ARNm para DBF1 en todas las etapas de la embriogenesis y fue inducida adicionalmente por tratamiento con ABA en embriones jovenes. No se observo ARNm de rab17 en embriones jovenes; sin embargo, se acumulo hasta niveles altos en los embriones en etapas posteriores de la embriogenesis, asi como en embriones jovenes despues del tratamiento con ABA. Estos resultados indican que el gen para DBF1 es altamente transcrito en todos los tejidos vegetativos despues del estres con agua, sal o tratamiento con ABA, asi como en embriones de maiz durante todas las etapas de la embriogenesis y despues de la aplicacion de ABA.

Se elevaron los anticuerpos policlonales contra las proteinas totales y parciales de la DBF1 que fueron expresados y purificados a partir de E. coli. El ADNc total, asi como un fragmento parcial del ADNc para DBF1 excluyendo el fragmento que contenia el dominio AP2, fueron clonados como fragmentos EcoRI, XhoI en los vectores pET28a y pET28b del sistema de sobreexpresion pET (Promega). La sobreexpresion y purificacion de las proteinas correspondientes se realizo de acuerdo a lo descrito por los fabricantes. La inmunizacion de conejos se llevo a cabo mediante tres inyecciones sucesivas de 100 !g de proteina purificada en 500 !l de solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) emulsionados en un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund, como ha sido descrito (Goday et al., Electrophoresis 9: 738 -741, 1988) .

Estos anticuerpos fueron utilizados para la deteccion de DBF1 por medio de analisis de transferencias tipo Western de una planta de maiz y de extractos de proteina de embriones. Los extractos de proteina se obtuvieron a partir de plantulas de cinco dias de edad que fueron tratadas previamente de manera similar a la descrita para el analisis tipo Northern, y de embriones de maiz en diferentes etapas de la embriogenesis. Las proteinas se extrajeron mediante trituracion de las muestras en nitrogeno liquido y resuspension del polvo en un amortiguador de Tris-HCI 100 mM pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM (PMSF). La concentracion para cada extracto se determino usando el ensayo de Bradford. Volumenes relevantes que contenian 7 !g de proteina se mezclaron con amortiguador de carga 2x (Tris-HCl 100 mM pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glicerol, 0,003% de azul de bromofenol, 10% de mercaptoetanol) y se cargo en un gel de acrilamida-bis acrilamida al 15%. Se hicieron hibridaciones de transferencias tipo Western como se describe (Niogret et al., Plant J 9: 549 - 557, 1996). Se incubaron dos grupos de transferencias tipo Western por separado con el anti-DBF1 obtenido contra la proteina total (anti-DBF1) o el anti-DBF1 obtenido contra los anticuerpos de proteina parcial (anti-DBF1). La Figura 4 muestra que el anticuerpo anti-DBF1 detecto una banda con un peso molecular aproximado de 35 kD en todos los tejidos de plantas estresadas por agua. Ademas se detectaron dos bandas de la misma masa molecular en extractos de raiz de las plantas tratadas con sal y ABA. Las mismas bandas, pero con una intensidad mucho menor, fueron detectadas en extractos de proteina de hojas y tallo de las plantas tratadas con sal y ABA. La masa molecular de las bandas se correlaciona con la masa molecular predicha de la proteina de DBF1 y es ligeramente mas baja que la proteina expresada en E. coli debido a la etiqueta adicional de 31 aminoacidos fusionada a el. Otra banda con una masa molecular estimada de 70 - 75 kD fue detectada como constitutiva en extractos de proteina de todos los tejidos vegetativos. Sin embargo, esta proteina tiene una masa molecular mucho mas alta que la proteina DBF1. El anticuerpo contra el DBF1 parcial exhibio una mayor especificidad, ya que no reconoce estas proteinas de mayor peso molecular.

En los embriones, la proteina se detecta durante las ultimas etapas de la embriogenesis y con una menor intensidad en las primeras etapas de la formacion del embrion y en embriones jovenes tratados con ABA. Nuestros resultados tambien mostraron la expresion de la DBF1 en todos los tejidos vegetativos despues del tratamiento de desecacion, con sal o con ABA.

Ejemplo 5: La expresion transitoria de DBF1 en callo de maiz mejora la actividad basica e inducible por ABA del promotor Rab17

Para determinar la funcion de la interaccion DRE -DBF1 en la induccion in vivo de los promotores regulados por ABA, tales como rab17, se monitoreo la actividad del promotor rab17 en las celulas de callo de maiz a traves de la expresion transitoria de una proteina reportera, beta-glucuronidasa (GUS), bajo control del promotor rab17. El callo fue elaborado a partir de la linea de maiz Black Mexican Sweet y fue mantenido como se describe (Vilardell et al., Plant Mol Biol 14: 423 -432, 1990) con 3 mg / ml de acido 2,4-diclorofenoxiacetico en el medio. Aproximadamente 1 g de callo fue esparcido sobre papel de filtro un dia antes de bombardeo e incubado durante la noche a 26° C en la oscuridad. Cuatro horas antes del bombardeo, se traslado el callo a un medio con manitol 200 mM. El callo fue transformado por medio de bombardeo de particulas con 2 !g del plasmido rab17prom-GUS, 1,5 !g de pRT-ex/sint/s-LUC como estandar interno y 1 !g ya sea de pJIT-2x 35S-DBF1-nosT o la misma construccion sin inserto como se describe (Klein et al., Nature 327: 70 -73, 1987). Cada muestra se dividio en dos despues de la transformacion y se incubaron en medio con o sin ABA 100 !M durante 22 horas en la oscuridad a 26° C antes de la congelacion en nitrogeno liquido. Los ensayos de luciferasa y GUS se hicieron como se describio previamente (Busk et al., Plant J.

11: 1285 -1295, 1997). La actividad relativa de GUS es la lectura del ensayo de GUS dividida por la lectura del ensayo de la luciferasa. Las construcciones utilizadas consistieron ya sea del gen reportero de GUS bajo el control del promotor rab17 de tipo silvestre (fragmento del promotor -350/+30 en relacion con el inicio de la transcripcion) o de un promotor con el elemento DRE2 mutado. Estas construcciones reporteras fueron cotransformadas con un plasmido efector, que consiste del ADNc de DBF1 bajo el control del promotor 35S doble. Cada combinacion de plasmido efector con el plasmido reportero mutante o de tipo silvestre fue transformado a traves de bombardeo de microproyectiles en celulas de callo de maiz. Despues del bombardeo se incubaron la mitad de las muestras con ABA y la otra mitad se mantuvo en medio MS.

Como se observa en la figura 5, la proteina DBF1 fue capaz de inducir la expresion del promotor rab 17, resultando en un aumento de dos veces de la actividad de GUS. El tratamiento con ABA tuvo un efecto adicional sobre la expresion de GUS ya que resulto en un aumento de casi tres veces de la actividad relativa de GUS. La mutacion sobre el elemento de cis en DRE2 redujo significativamente la capacidad del promotor rab 17 para inducir la expresion en las condiciones de control, asi como despues del tratamiento con ABA.

Ejemplo 6: DBF1 interactua con DRE2, pero no con elementos que actuan sobre cis en DRE1 y ABRE

DBF1 se expreso en E. coli usando el sistema de sobreexpresion pET con el fin de estudiar sus propiedades de enlazamiento de ADN. La proteina purificada DBF1 fue utilizada en ensayos de cambio de movilidad electroforetica con el fin de determinar su capacidad para enlazarse con diferentes sondas de oligonucleotidos. Se utilizaron los siguientes oligonucleotidos de ADN en ensayos de cambio de movilidad electroforetica: DRE2 (SEQ ID NOs 4 y 5), DRE2m (SEQ ID NOs 6 y 7), DRE1 (SEQ ID NOs 8 y 9), DRE1/ABRE1 (SEQ ID NOs 10 y 11), ABRE A (SEQ ID NOs 12 y 13 ). Los oligonucleotidos de longitud completa fueron purificados por medio de PAGE desnaturalizante. Los oligonucleotidos complementarios se hibridaron y purificaron en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Los oligonucleotidos bicatenarios fueron marcados con a32P-dATP (3000 Ci/mmol, Amersham), rellenando con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (Sambrook et al., 1989) y se purifico en una columna NAP5 (Pharmacia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN competidor no marcado se relleno con nucleotidos no radiactivos. La sonda radiactiva se incubo con 400 ng de proteina en 20 !l de amortiguador de enlazamiento 1x (HEPES 25 mM, pH 7,8, KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 0,5 mM, DTT 0,2 mM y glicerol al 10%) y 700 ng de poli (dl-dC) durante 20 min sobre hielo antes de cargar sobre Tris-borato-EDTA 1x, (30:0,8 de bis-acrilamida) gel de poliacrilamida al 5%. La electroforesis se realizo a 10 V/cm a 4° C. En los ensayos de competicion se incubo la proteina con oligonucleotidos no radiactivos en amortiguador de enlazamiento 1x, en hielo durante 10 min antes de la adicion de la sonda radiactiva y continuando con la incubacion durante 20 min mas.

DBF1 se enlazo exitosamente con el oligonucleotido que contenia el elemento que actua sobre cis en DRE2 de tipo silvestre pero no con el oligonucleotido que alberga la version mutante de DRE2 (figura 6). La especificidad del enlazamiento DBF1 -DRE2 se confirmo mediante ensayos de competicion, asi como con el uso de diferentes sondas de oligonucleotidos. En el promotor del gen rab17 el elemento que actua sobre cis en DRE1 y ABRE1 son objetivos putativos para los factores de transcripcion. La DRE1 se superpone parcialmente con la ABRE1 y contiene un motivo de secuencia que difiere solo en un nucleotido en comparacion con la secuencia de DRE2. Como se muestra en la figura 6, DBF1 fue incapaz de enlazarse con cualquiera de estos elementos o con su combinacion. Ademas, no se detecto cambio de movilidad cuando se utilizo una proteina parcial DBF1 que carece del dominio de enlazamiento de ADN ya sea con oligonucleotidos DRE2 de tipo silvestre o mutados. Estos resultados indican que DBF1 se enlaza especificamente con el elemento que actua sobre cis en DRE2.

Ejemplo 7: Plantas transgenicas que expresan DBF1 bajo el control de un promotor constitutivo o regulable que muestra mayor tolerancia al estres por deshidratacion

El ADNc para DBF1 de maiz se clona en un vector de transformacion de la planta, una vez bajo el control del promotor constitutivo GOS2 y una vez bajo el control del promotor rab 17, que es inducido en las hojas y las semillas por ABA y el estres por deshidratacion. Los vectores vacios (es decir, sin DBF1) se utilizan como controles. Todos los cuatro constructos se introducen en el arroz mediante transformacion mediada por Agrobacterium (Hiei et al., Plant J: 6 271 -282, 1994). Las lineas transgenicas se seleccionan en un medio de cultivo de tejidos suplementado con el antibiotico apropiado. Las lineas seleccionadas se transfieren a macetas en el invernadero y la presencia de la construccion de ADN-T en estas lineas se confirmo mediante amplificacion por PCR sobre el ADN genomico de un fragmento de la construccion de ADN-T. La expresion del transgen DBF1 se analiza en hojas y semillas bajo condiciones sin estres asi como despues de tratamiento por sequia y ABA, tanto a nivel del ARNm (analisis tipo Northern y RT-PCR) y a nivel de la proteina (analisis tipo Western usando anticuerpos anti-DBF1). Las lineas transgenicas con diferentes niveles de expresion de DBF1 se seleccionan por autopolinizacion y la produccion de semillas. La expresion del transgen DBF1 se analiza de nuevo en la progenie. Ademas, se analiza la funcionalidad del transgen DBF1: se compara la expresion de rab 17 y de otro elemento DRE2 que contiene genes en las plantas con y sin el transgen DBF1 por medio del analisis tipo Northern, tanto en plantas tratadas por sequia como no estresadas. Las plantas con transgenes funcionales DBF1 son posteriormente comparadas por la tolerancia al estres por sequia y por sal contra las plantas que no contienen al transgen DBF1 transgen. Los parametros para la tolerancia al estres son el crecimiento y el rendimiento de semilla durante un estres suave, regeneracion y rendimiento de semilla despues de la liberacion del estres leve, el crecimiento y rendimiento de semillas y la supervivencia durante el estres severo, la regeneracion y el rendimiento de semilla despues de la liberacion del estres severo. Las plantas que expresan DBF1 transgenico son mas tolerantes al estres por deshidratacion que las plantas sin un transgen DBF1.

Ejemplo 8 de referencia: Identificacion del homologo de arroz ZmDBF1

Los inventores seleccionaron la base de datos TIGR (http://www.tigr.org/), la base de datos del GenBank y las secuencias del genoma del Arroz Indico publicados por El Instituto de Genomica de Beijing, un brazo operativo de la Academia China de Ciencias. Una prediccion de los ORF putativos correspondientes a las secuencias de ADN en esta base de datos estaba disponible para los inventores. Esta seleccion de las 3 bases de datos se realizo con la secuencia de la proteina de ZmDBF1 utilizando el programa TBLASTN. Los inventores identificaron un gen del arroz que fue anotado en la base de datos del GenBank como un factor de transcripcion putativo relacionado con AP2 (numero de acceso del Genbank CAC39058), pero los inventores demostraron por primera vez que esta proteina se agrupa perfectamente en el grupo de la proteina DBF1, al hacer una alineacion con el programa ClustalW (serie Blosum 32, penalizacion por abertura de brecha de 10,00 y por extension de la brecha de 0,05, vease la figura 7A). Esta secuencia de ADN de arroz se identifica en la presente memoria como SEQ ID NO 15 y el aminoacido correspondiente como SEQ ID NO 16. Esta secuencia de arroz no incluye la SEQ ID NO 14 (PZ02�LUPPO no contiene tampoco la SEQ ID NO: 14), pero este es el homologo mas cercano de ZmDBF1 en el genoma del arroz Nipponbare de Oryza sativa. Otros genes del arroz que se recuperan en esta busqueda por TBLASTN se agrupan en un grupo separado que diverge de DBF1 antes que el otro homologo de la SEQ ID NO 15. La relacion con la proteina DBF1 se ilustra adicionalmente en la figura 7. La figura muestra que solo una de las secuencias de arroz (correspondiente a la proteina CAC39058) se agrupa con DBF1 y con otras secuencias relacionadas de Arabidopsis (AAF87854) y Atriplex (AAF76898).

En la figura 7B se muestra una alineacion por pares entre la proteina ZmDBF1 y la proteina OsDBF1. El porcentaje de similitud entre las dos secuencias se calculo con el programa GAP y se determino que era 38,4% y el porcentaje de identidad: 35,3% (vease tambien la Tabla 4). El programa GAP alinea dos secuencias en forma global (matriz de sustitucion de aminoacidos BLOSUM62, Peso de la Brecha: 8, Peso por Longitud: 2, Referencia: Henikoff, S. y Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 10919).

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Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un acido nucleico que codifica una proteina DBF1 de una planta o un fragmento de la misma capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo de:

   (a)

   acido nucleico que contiene la secuencia de ADN como la presentada en la SEQ ID NO 2,

   (b)

   acido nucleico que codifica una proteina que comprende una secuencia de aminoacidos como la presentada en la SEQ ID NO 3,

   (c)

   un fragmento del acido nucleico de (a), que codifica una proteina de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE, y

   (d)

   un fragmento del acido nucleico de (b) que codifica una proteina de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE.

2. 2. El acido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que es ADNc, ADN, ADN genomico o ADN sintetico,

   o ARN en donde T es reemplazado por U.

3. 3.

   El acido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se deriva de una planta monocotiledonea.

4. 4.

   Un polipeptido codificado por un acido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Un vector que comprende una secuencia de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a

6. 3.

7. 6.

   El vector de la reivindicacion 5, que es un vector de expresion, en donde dicha secuencia de acido nucleico esta operativamente enlazada a una o mas secuencias de control que permite la expresion en celulas huesped procariotas y/o eucariotas.

8. 7.

   Una celula huesped que contiene un transgen DBF1 que contiene una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

9. 8.

   Una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 7 seleccionada del grupo que consiste de una celula bacteriana, de insecto, de hongo, de una planta o animal.

10. 9.

    Una celula de una planta transgenica que comprende un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

11. 10.

    La celula de una planta transgenica de la reivindicacion 9 en donde dicha secuencia de acido nucleico o dicho vector se integra en forma estable en el genoma de la celula de la planta.

12. 11.

    Una planta transgenica, un tejido de una planta o una parte de una planta que comprende una celula de una planta de la reivindicacion 9 o 10.

13. 12.

    Un metodo para la produccion de una planta transgenica, celula de una planta, parte de una planta o tejido de una planta que comprende la introduccion de un acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6 en una planta, celula de una planta, parte de una planta o tejido de una panta.

14. 13.

    El metodo de la reivindicacion 12 comprende ademas la regeneracion de una planta a partir de dicha celula de la planta, parte de la planta o tejido de la planta.

15. 14.

    Un metodo para incrementar el crecimiento y/o el rendimiento de una planta bajo condiciones estresadas y/o no estresadas, dicho metodo comprendiendo la introduccion de un acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6 en una celula de una planta, parte de una planta o tejido de una planta.

16. 15.

    La planta, tejido de la planta o parte de la planta transgenica de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicha planta es una planta monocotiledonea o una planta dicotiledonea.

17. 16.

    Una parte cosechable o propagulo derivados de una planta o tejido de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 11 o 15, dicha parte cosechable o propagulo comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

18. 17.

    La parte cosechable de acuerdo con la reivindicacion 16, que se selecciona del grupo que consiste de semillas,

    hojas, raices, flores, frutos, tallos, rizomas, tuberculos y bulbos, dicha parte cosechable comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o
19. 6.

20. 18.

    La progenie derivada de cualquiera de las plantas, tejidos de las plantas o partes de las plantas de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o las reivindicaciones 15 a 17, dicha progenie comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

21. 19.

    Un metodo para identificar polipeptidos que interactuan con un polipeptido de la reivindicacion 4, que comprende un ensayo de seleccion de doble hibrido en donde al menos un polipeptido de la reivindicacion 4 se usa como cebo y en donde una biblioteca de ADNc de una planta o parte de una planta se usa como presa.

    SEQ ID NO 1 Contiene tres repeticiones en tandem del elemento DRE2 (subrayado) usado como cebo en la seleccion de un hibrido (Ejemplo 1; Busk et al. 1997)

    SEQ ID NO 2 Secuencia de nucleotidos de DBF1 1043 nucleotidos Secuencia de ADN Zea mays

    FIGURA 8

    SEQ ID NO 3 SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE DBF1 222 AMINOACIDOS SECUENCIA DE PROTEINA Zea mays

    SECUENCIA CONSERVADA DE PEPTIDOS ENTRE DBF1 Y PROTEINAS RELACIONADAS

    (X = CUALQUIER AMINOACIDO NATURAL) FIGURA 8 (continuacion)

    FIGURA 8 (continuacion)