ES2387292B1 - COMBINATION OF SNPS TO DETERMINE THE RISK OF SUFFERING A NEUROVASCULAR DISEASE - Google Patents

COMBINATION OF SNPS TO DETERMINE THE RISK OF SUFFERING A NEUROVASCULAR DISEASE Download PDF

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ES2387292B1 ES201031004A ES201031004A ES2387292B1 ES 2387292 B1 ES2387292 B1 ES 2387292B1 ES 201031004 A ES201031004 A ES 201031004A ES 201031004 A ES201031004 A ES 201031004A ES 2387292 B1 ES2387292 B1 ES 2387292B1
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Abstract

Combinación de SNPs para determinar el riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular.#La presente invención se refiere a la detección de una predisposición a enfermedades neurovasculares en un individuo, y en particular al ictus. La presente invención se refiere a un método y un kit para la detección del riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus, en un individuo, que comprende la detección de una combinación de al menos dos polimorfismos de nucleótido único (SNPs), seleccionados del grupo que consiste en los SNPs rs7956957, rs310585, rs2276109, rs10275136, rs5742912 y rs10947803, así como a la propia combinación, los polinucleótidos que comprenden estos SNPs y sus usos.Combination of SNPs to determine the risk of suffering a neurovascular disease. # The present invention relates to the detection of a predisposition to neurovascular diseases in an individual, and in particular stroke. The present invention relates to a method and kit for the detection of the risk of suffering a neurovascular disease, in particular strokes, in an individual, comprising the detection of a combination of at least two selected single nucleotide polymorphisms (SNPs) from the group consisting of SNPs rs7956957, rs310585, rs2276109, rs10275136, rs5742912 and rs10947803, as well as the combination itself, the polynucleotides that comprise these SNPs and their uses.

Description

COMBINACIÓN DE SNPS PARA DETERMINAR EL RIESGO DE SUFRIR COMBINATION OF SNPS TO DETERMINE THE RISK OF SUFFERING

UNA ENFERMEDAD NEUROVASCULAR A NEUROVASCULAR DISEASE

Campo de la invención Field of the Invention

5 5
La presente invención se refiere a la detección de una The present invention relates to the detection of a

predisposición a enfermedades neurovasculares en un predisposition to neurovascular diseases in a

individuo, y en particular al ictus. La presente invención individual, and in particular stroke. The present invention

se refiere a un método y un kit para la detección del refers to a method and kit for the detection of

riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en risk of neurovascular disease, in

10 10
particular ictus, en un individuo, que comprende la particular stroke, in an individual, comprising the

detección de una combinación de al menos dos polimorfismos detection of a combination of at least two polymorphisms

de nucleótido único (SNPs), seleccionados del grupo que single nucleotide (SNPs), selected from the group that

consiste en los SNPs rs7956957, rs310585, It consists of the SNPs rs7956957, rs310585,

rs2276109, rs10275136, rs5742912 y rs10947803, así como a rs2276109, rs10275136, rs5742912 and rs10947803, as well as a

15 fifteen
la propia combinación, los polinucleótidos que comprenden the combination itself, the polynucleotides that comprise

estos SNPs y sus usos. these SNPs and their uses.

Antecedentes de la invención Background of the Invention

Las enfermedades neurovasculares suponen una carga enorme Neurovascular diseases are a huge burden

para el sistema de salud pública en todo el mundo. La for the public health system worldwide. The

20 twenty
patología neurovascular, en particular ictus, es la neurovascular pathology, in particular stroke, is the

tercera causa de muerte y primera causa de discapacidad, third cause of death and first cause of disability,

ejerciendo un impacto negativo no sólo en la calidad de exerting a negative impact not only on the quality of

vida del paciente afectado, sino también en su familia, life of the affected patient, but also in his family,

con un gran número de pacientes que sufren dependencia with a large number of patients suffering from dependency

25 25
funcional más de un año después del evento [1]. Por otra functional more than one year after the event [1]. For other

parte, el coste para los sistemas de salud es grave porque On the other hand, the cost for health systems is serious because

incluye costes directos (hospitalización, rehabilitación, includes direct costs (hospitalization, rehabilitation,

transporte, vigilancia médica, consumo de fármacos, etc.), transportation, medical surveillance, drug use, etc.),

y costes indirectos (pérdida de productividad de los and indirect costs (loss of productivity of the

3 O 3 O
pacientes y cuidadores, pérdida de actividad, mortalidad patients and caregivers, loss of activity, mortality

prematura, etc.). En general, el coste estimado del ictus premature, etc.). In general, the estimated cost of stroke

en España es de 13.826 € el primer año, 8.945 € el segundo in Spain it is € 13,826 the first year, € 8,945 the second

año y 7. 739 € el tercer año por paciente [2]. Por lo year and € 7,739 the third year per patient [2]. For the

tanto, existe una necesidad de detectar y prevenir estos Therefore, there is a need to detect and prevent these

35 35
accidentes cerebrovasculares. strokes.

Los presentes inventores han decidido estudiar la prevención de enfermedades neurovasculares desde el punto de vista genético. De hecho, existe una importante implicación genética en las enfermedades neurovasculares, The present inventors have decided to study the prevention of neurovascular diseases from a genetic point of view. In fact, there is an important genetic implication in neurovascular diseases,

5 descubierta en los años noventa en estudios con gemelos y estudios de agregación familiar, pero los genes responsables de esta herencia siguen siendo en gran parte sin ser determinados [3]. Por ejemplo, los estudios de análisis de ligamiento clásico o de asociación de genes 5 discovered in the 1990s in twin studies and family aggregation studies, but the genes responsible for this inheritance remain largely undetermined [3]. For example, classical linkage analysis or gene association studies

10 candidatos han demostrado la asociación de los genes PDE4D, ALOX5AP, ApoE, IL6, TNFa o MTHFR con los ictus isquémicos, pero la replicación de estos resultactos ha sido muy inconsistente [ 4] . Por otra parte, los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han revelado la 10 candidates have demonstrated the association of the PDE4D, ALOX5AP, ApoE, IL6, TNFa or MTHFR genes with ischemic strokes, but the replication of these results has been highly inconsistent [4]. Furthermore, complete genome association studies (GWAS) have revealed the

15 asociación de dos SNPs con ictus en el cromosoma 12p13 en población caucásica, sugiriendo un papel del gen NINJ2 [5], una asociación que ha sido contradicha posteriormente 15 Association of two SNPs with stroke on chromosome 12p13 in the Caucasian population, suggesting a role for the NINJ2 gene [5], an association that has been subsequently contradicted

[6] Además, un meta-análisis de GWAS en ictus isquémico en poblaciones caucásicas identificó una asociación del 20 gen ZFHX3 en el cromosoma 16q22 con ictus [7]. Los genes PRKCH y CELSR1 se han asociado también con ictus isquémico en la población japonesa [8-9], pero estos marcadores deben ser validados en nuevos estudios. En cualquier caso, todos los estudios revelaron asociaciones con un pequeño 2 5 efecto sobre la predicción global de la enfermedad. Del mismo modo, los factores de riesgo genético para el ictus hemorrágico aún no están definidos [3]. Sin embargo, la base genética de todas las enfermedades neurovasculares es probablemente idéntica ya que todos los genes candidatos 30 identificados hasta la fecha están involucrados en los procesos fisiopatológicos comunes a todas las enfermedades neurovasculares, como la inflamación, angiogénesis, fibrinólisis, coagulación, hipertensión, enfermedad coronaria, angiogénesis, el metabolismo lipídico o la [6] Additionally, a meta-analysis of GWAS in ischemic stroke in Caucasian populations identified an association of the 20 gene ZFHX3 on chromosome 16q22 with stroke [7]. The PRKCH and CELSR1 genes have also been associated with ischemic stroke in the Japanese population [8-9], but these markers must be validated in new studies. In any case, all studies revealed associations with a small 2 5 effect on the overall prediction of the disease. Similarly, the genetic risk factors for hemorrhagic stroke are not yet defined [3]. However, the genetic basis of all neurovascular diseases is probably identical since all 30 candidate genes identified to date are involved in the pathophysiological processes common to all neurovascular diseases, such as inflammation, angiogenesis, fibrinolysis, coagulation, hypertension, coronary heart disease, angiogenesis, lipid metabolism, or

35 diabetes [3]. Además, las enfermedades neurovasculares 35 diabetes [3]. In addition, neurovascular diseases

comparten los mismos factores de riesgo demográficos y they share the same demographic risk factors and

clínicos clinical
como la presencia de ataques isquémicos how the presence of attacks ischemic

transitorios, transients,
hipertensión, dislipidemia, diabetes, hypertension, dyslipidemia, diabetes,

fibrilación fibrillation
auricular, enfermedad cardiaca, angiopatía handset, disease cardiac, angiopathy

amiloide, amyloid,
obesidad, consumo o abuso de drogas, estilo de obesity, consumption or abuse of drugs, style of

vida sedentaria, tabaquismo, medicación, consumo de alcohol y/o antecedentes familiares [3]. Basado en el hecho que las enfermedades neurovasculares son enfermedades complejas causadas por múltiples factores genéticos y ambientales, los inventores pensaron que la combinación de varios marcadores genéticos y variables clínicas tal vez podría revelar relaciones más sólidas con la enfermedad. Los inventores han divulgado en algunas conferencias (por ejemplo, "Predecir el riesgo genético de accidente cerebrovascular isquémico: Estudio de 250 polimorfismos en 1080 casos y controles", Conferencia de Genética Humana Europea, Viena el 23/5/2009) la posibilidad de que 5 SNPs localizados en los genes NOS3, LRP, SCNN1A y MMP12 podrían estar asociados con un mayor riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular isquémico en población española, aunque nunca se reveló la identidad de los SNPs implicados en dichos genes, ni se menciona ni sugiere utilizar estos SNPs en combinación como una herramienta de detección de riesgo de enfermedad cerebrovascular. Del mismo modo, el uso de una combinación de marcadores genéticos con factores de riesgo de enfermedad cerebrovascular con el fin de detectar personas con un elevado riesgo de ictus isquémico no se mencionó ni sugirió. Además, los inventores publicaron el artículo "KCNK17 genetic variants in ischemic stroke", en la revista Atherosclerosis ( 2 O O 9) [ 1 O] , donde se reveló que el alelo A del SNP rs10947803 en el gen KCNK17 podría ser un marcador de riesgo para el accidente cerebrovascular isquémico, con un OR de 1, 48, pero no se revelo ni se sugirió usar este SNP en asociación con otros SNPs para sedentary life, smoking, medication, alcohol consumption and / or family history [3]. Based on the fact that neurovascular diseases are complex diseases caused by multiple genetic and environmental factors, the inventors thought that the combination of various genetic markers and clinical variables could perhaps reveal stronger relationships with the disease. The inventors have disclosed at some conferences (eg "Predicting the genetic risk of ischemic stroke: A study of 250 polymorphisms in 1080 cases and controls", European Human Genetics Conference, Vienna on 5/23/2009) the possibility that 5 SNPs located in the NOS3, LRP, SCNN1A and MMP12 genes could be associated with an increased risk of suffering ischemic stroke in the Spanish population, although the identity of the SNPs involved in these genes was never revealed, nor is it mentioned or suggested to use these SNPs in combination as a screening tool for stroke risk. Similarly, the use of a combination of genetic markers with risk factors for cerebrovascular disease to detect people at high risk of ischemic stroke was not mentioned or suggested. Furthermore, the inventors published the article "KCNK17 genetic variants in ischemic stroke", in the journal Atherosclerosis (2 OO 9) [1 O], where it was revealed that the A allele of the SNP rs10947803 in the KCNK17 gene could be a risk marker for ischemic stroke, with an OR of 1.48, but it was not disclosed or suggested to use this SNP in association with other SNPs to

predecir el riesgo de accidente cerebrovascular. El SNP rs5742912 del gen SCNN1A fue descrito en el artículo 11 Impact of eNaC Polymorphisms on the Risk of Ischemic Cerebrovascular Events: A Multicenter Case-Control Study", en la revista Clinical Chemistry (2005) [11], como marcador de riesgo para el accidente cerebrovascular isquémico, con un OR de 3,26 en mujeres jóvenes homocigóticas para esta mutación. Sin embargo, no se realizó ninguna mención del uso de este SNP en asociación con otros marcadores para el diagnóstico de ictus isquémico, y ninguna mención del uso de este SNP como herramienta predictiva en asociación con otros marcadores para mejorar la detección de ictus. Varios artículos han sido publicados sobre accidentes cerebrovasculares en la población española (por ejemplo, 11 Human Vitamin K-Dependent GA86: Gene Structure, Allelic Variation and Association with Stroke", Human Mutation (2004) [12], o 11Alpha (1)-antichymotrypsin polymorphism: a risk factor for hemorrhagic stroke in normotensive subjects", Stroke (2001) [13]). Sin embargo, no hay ninguna divulgación en estos artículos de los polimorfismos descritos en la presente invención, ni de la posibilidad de combinar varios marcadores y factores de riesgo para crear un modelo predictivo de infarto. Por último, el artículo 11Association of three-gene interaction among MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke: a multicenter case-control study", Human Genetics ( 2 O O 9) [14], describe un estudio genético de accidentes cerebrovasculars isquémicos en la población China, y sugiere que tres SNPs en los genes MTHFR, ALOX5AP y NOTCH3 podrían combinarse para mejorar el pronóstico de un accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, este artículo sólo llega a predecir con una OR de 3,16 y no menciona los SNPs o genes descritos en la presente invención. En vista de los conocimientos en el estado de la técnica, es necesario dar predict the risk of stroke. The SNP rs5742912 of the SCNN1A gene was described in article 11 Impact of eNaC Polymorphisms on the Risk of Ischemic Cerebrovascular Events: A Multicenter Case-Control Study ", in the journal Clinical Chemistry (2005) [11], as a risk marker for the ischemic stroke, with an OR of 3.26 in young women homozygous for this mutation, however, no mention was made of the use of this SNP in association with other markers for the diagnosis of ischemic stroke, and no mention of the use of this SNP as a predictive tool in association with other markers to improve stroke detection Several articles have been published on strokes in the Spanish population (for example, 11 Human Vitamin K-Dependent GA86: Gene Structure, Allelic Variation and Association with Stroke ", Human Mutation (2004) [12], or 11Alpha (1) -antichymotrypsin polymorphism: a risk factor for hemorrhagic stroke in normotensive subjects", Stroke (2001) [13 ]). However, there is no disclosure in these articles of the polymorphisms described in the present invention, nor of the possibility of combining various markers and risk factors to create a predictive model of heart attack. Finally, the article 11Association of three-gene interaction among MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke: a multicenter case-control study ", Human Genetics (2 OO 9) [14], describes a genetic study of ischemic strokes in the Chinese population, and suggests that three SNPs in the MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 genes could be combined to improve the prognosis of an ischemic stroke.However, this article only predicts with an OR of 3.16 and does not mention the SNPs or genes described in the present invention In view of the knowledge in the state of the art, it is necessary to give

a conocer una nueva herramienta para determinar el riesgo de sufrir enfermedades neurovasculares, en particular ictus. Un primer objetivo de la presente invención es dar a conocer nuevos marcadores genéticos para la prevención de las enfermedades neurovasculares, en particular ictus. Un segundo objetivo de la presente invención es dar a conocer un nuevo método y un nuevo kit para determinar la probabilidad de sufrir un accidente neurovascular, en particular ictus. En respuesta a estos objetivos, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que una combinación de los SNPs descritos en la presente invención es útil para determinar el riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus, y por lo tanto se puede desarrollar un método y un kit de uso de dicha combinación. to know a new tool to determine the risk of suffering neurovascular diseases, in particular strokes. A first objective of the present invention is to disclose new genetic markers for the prevention of neurovascular diseases, in particular strokes. A second objective of the present invention is to disclose a new method and a new kit to determine the probability of suffering a neurovascular accident, in particular strokes. In response to these objectives, the present inventors have surprisingly found that a combination of the SNPs described in the present invention is useful for determining the risk of suffering a neurovascular disease, in particular stroke, and therefore a method and a method can be developed. kit for using this combination.

Descripción resumida de la invención Summary description of the invention

La presente invención se refiere a una combinación de al menos dos polimorfismos de nucleótido único (SNPs), seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo para sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus. La presente invención se refiere también a un método para la determinación de una predisposición genética de enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo, que comprende la detección de los alelos de al menos dos SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de acido nucleico aislado de un individuo. La presente invención se refiere además a un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus. La presente invención se refiere también al uso de la combinación mencionada anteriormente. The present invention relates to a combination of at least two single nucleotide polymorphisms (SNPs), selected from SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803, and rs5742912, indicative of an individual's risk of suffering from neurovascular disease, in particular ictus. The present invention also relates to a method for the determination of a genetic predisposition of neurovascular diseases, in particular strokes, in an individual, comprising the detection of alleles of at least two SNPs selected from the group consisting of rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and rs10947803 in a nucleic acid sample isolated from an individual. The present invention further relates to a kit for determining an individual's risk of suffering a neurovascular disease, in particular stroke. The present invention also relates to the use of the aforementioned combination.

Breve descripción de las figuras Figura l. Curvas ROC del modelo con los factores de riesgo clásicos de accidente cerebrovascular (edad, sexo masculino, hipertensión, tabaquismo y diabetes) con y sin adicción de las 6 variantes genéticas. Figura 2. Porcentaje de controles y casos de accidentes cerebrovasculares en función del número de variantes genéticas. Figura 3. Porcentaje de controles y casos de accidentes cerebrovasculares en función del número total de factores de riesgo. Figura 4. Distribución de controles y casos de ictus por cada puntuación. Figura 5. Porcentaje de controles y casos de accidente cerebrovascular en cada categoría propuesta por el modelo de riesgo de ictus. Brief description of the figures Figure l. Model ROC curves with the classic risk factors for stroke (age, male sex, hypertension, smoking, and diabetes) with and without addiction of the 6 genetic variants. Figure 2. Percentage of controls and stroke cases according to the number of genetic variants. Figure 3. Percentage of controls and stroke cases based on the total number of risk factors. Figure 4. Distribution of controls and stroke cases by each score. Figure 5. Percentage of controls and stroke cases in each category proposed by the stroke risk model.

Descripción detallada de la invención 1.-Definiciones y terminología Detailed description of the invention 1.-Definitions and terminology

Las siguientes abreviaturas y siglas se utilizan en la presente invención: ACM: arteria cerebral media ADN: ácido desoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero CADASIL: arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) CeGen: centro de genotipado nacional The following abbreviations and acronyms are used in the present invention: ACM: middle cerebral artery DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid CADASIL: autosomal dominant cerebral artery disease with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts Leukoencephalopathy) CeGen: national genotyping center

CI: intervalo de confianza TCD: Doppler transcraneal ECG: electrocardiograma EDTA: acido etilendiaminotetraacético GWAS: genome-wide association studies o estudio de asociación de genoma entero CI: confidence interval TCD: transcranial Doppler ECG: electrocardiogram EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid GWAS: genome-wide association studies or whole genome association study

eNaC: canal de sodio epitelial eNaC: epithelial sodium channel

FDR: tasa de falsos positivos (False Discovery Rate) FDR: False Discovery Rate

HI: infarto hemorrágico HI: hemorrhagic infarction

HT: transformación hemorrágica HT: hemorrhagic transformation

HWE: equilibrio de Hardy-Weinberg HWE: Hardy-Weinberg equilibrium

IPA: Ingenuity Pathways Analysis IPA: Ingenuity Pathways Analysis

MAF: frecuencia de alelo minoritario MAF: frequency of minority allele

MELAS: Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis MELAS: Mitochondrial myopathy, encephalopathy, acidosis

láctica e ictus lactic and stroke

MRI: imágenes de resonancia magnética MRI: magnetic resonance imaging

mRS: escala de Rankin modificada mRS: modified Rankin scale

MMP: metaloproteinasa de matriz MMP: matrix metalloproteinase

NIHSS: National Institute of Health Stroke Scale NIHSS: National Institute of Health Stroke Scale

OCSP: Oxfordshire Community Stroke Project OCSP: Oxfordshire Community Stroke Project

OR: odds ratio OR: odds ratio

ROC: Característica operativa del receptor ROC: Operational characteristic of the receiver

PCR: reacción en cadena de la polimerasa PCR: polymerase chain reaction

PH: hematoma parenquimatoso PH: parenchymal hematoma

RMA: Robust Multiarray Averaging RMA: Robust Multiarray Averaging

SNP: single nucleotide polymorphism o polimorfismo de SNP: single nucleotide polymorphism or polymorphism of

nucleótido único single nucleotide

SPSS: paquete estadístico para las ciencias sociales SPSS: Statistical Package for the Social Sciences

TC: tomografia craneal CT: cranial tomography

TOAST: Prueba de ORG 10172 en el tratamiento del accidente TOAST: ORG 10172 test in accident treatment

cerebrovascular agudo acute cerebrovascular

t-PA: activador tisular del plasminógeno t-PA: tissue plasminogen activator

Nombres Names
de genes: of genes:

p38-MAPK: p38-MAPK:
proteína quinasa activada por mitógeno p38 protein kinase activated by p38 mitogen

ALOX5AP: ALOX5AP:
Proteína activadora de Araquidonato 5- Protein activator of Arachidonate 5-

lipoxigenasa lipoxygenase

ALOX12: ALOX12:
araquidonato 12-lipoxigenasa 12-lipoxygenase arachidonate

APOE: APOE:
apolipoproteína E apolipoprotein E

C4a: C4a:
componente de complemento 4A component of complement 4A

C4b: C4b:
componente de complemento 4B component of complement 4B

eDKNlA: inhibidor quinasa dependiente de ciclina lA (cyclin-dependent kinase inhibitor lA) eDKNlA: cyclin-dependent kinase inhibitor lA (kinase-dependent kinase)

eELSRl: cadherin EGF lag seven-pass G-type receptor 1 eELSRl: cadherin EGF lag seven-pass G-type receptor 1

eLEe4e: e-type lectin domain family 4, member e eLEe4e: e-type lectin domain family 4, member e

GOS2: GO/Gl switch 2 IL6: interleucina 6 ITGB3: integrina beta 3 GOS2: GO / Gl switch 2 IL6: interleukin 6 ITGB3: beta 3 integrin

KeNK17: canal de potasio, subfamilia K, miembro 17 KeNK17: potassium channel, subfamily K, member 17

LRP: proteína relacionada con el receptor de lipoproteína LRP: lipoprotein receptor related protein

de baja densidad low density

MMP: metaloproteinasa de matriz MMP: matrix metalloproteinase

MMP12: metaloproteinasa de matriz 12 MMP12: matrix metalloproteinase 12

MPL. Oncogén del virus de la leucemia mieloproliferativa MPL. Myeloproliferative leukemia virus oncogene

MTHFR: 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa MTHFR: 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase

NEKl: NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 1 NEKl: NIMA (never in mitosis gene a) -related kinase 1

NFkB: factor nuclear kappa-E NFkB: nuclear factor kappa-E

NINJ2: proteína inducida por lesión nerviosa 2 NINJ2: nerve injury-induced protein 2

NOS3: óxido nítrico sintasa 3 NOS3: nitric oxide synthase 3

PDE4D: fosfodiesterasa 4D PDE4D: phosphodiesterase 4D

PITX2: paired-like homeodomain transcription factor 2 PITX2: paired-like homeodomain transcription factor 2

PPIA: ciclofilina A PPIA: cyclophilin A

PRKeH: proteína quinasa e, eta PRKeH: protein kinase e, eta

seNNlA: canal de sodio, no neuronal (nonvoltage-gated) 1, signal: sodium channel, non-neuronal (nonvoltage-gated) 1,

subunidad alfa alpha subunit

TNFa: factor de necrosis tumoral alfa ZFHX3: dedos de zinc homeobox 3 TNFa: tumor necrosis factor alpha ZFHX3: zinc fingers homeobox 3

T: timina T: thymine

e: citosina e: cytosine

A: adenina A: adenine

G: guanina El término ualelo", como se utiliza aquí, se refiere a una variante en la secuencia del gen. G: guanine The term ualelo ", as used here, refers to a variant in the gene sequence.

Los términos "polimórficos" y "polimorfismo", como se usan aquí, se refieren a la condición en la cual dos o más variantes de una secuencia genómica específica, o la secuencia de aminoácidos codificados, se encuentran en una población. Los términos hacen referencia a la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos codificados, el uso se desprende del contexto. La región polimórfica o el sitio polimórfico se refieren a una región del ácido nucleico, donde se produce la diferencia de nucleótidos que distingue a las variantes, o, para las secuencias de aminoácidos, una región de la secuencia de aminoácidos donde se produce la diferencia de aminoácidos que distingue a las variantes de la proteína. Como se utiliza aquí, un 11polimorfismo de nucleótido único" o "SNP", se refiere a un sitio polimórfico que consiste en una posición de un solo nucleótido. The terms "polymorphic" and "polymorphism", as used herein, refer to the condition in which two or more variants of a specific genomic sequence, or the encoded amino acid sequence, are found in a population. The terms refer to the nucleic acid sequence or the encoded amino acid sequence, the use is clear from the context. The polymorphic region or polymorphic site refers to a region of the nucleic acid, where the nucleotide difference that distinguishes variants occurs, or, for amino acid sequences, a region of the amino acid sequence where the difference of amino acids that distinguishes variants of the protein. As used herein, a "single nucleotide polymorphism" or "SNP" refers to a polymorphic site consisting of a single nucleotide position.

El término "genotipo" se refiere a la descripción de los alelos de un gen o genes contenidos en un individuo o una muestra. Como se u t i 1 i z a aquí , no se hace distinción entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una muestra procedente de este mismo individuo. Aunque normalmente se determina un genotipo a partir de muestras de células diploides, un genotipo puede determinarse a partir de una muestra de células haploides, como por ejemplo una célula espermatozoica. The term "genotype" refers to the description of the alleles of a gene or genes contained in an individual or a sample. As used here, no distinction is made between the genotype of an individual and the genotype of a sample from the same individual. Although a genotype is normally determined from diploid cell samples, a genotype can be determined from a sample of haploid cells, such as a sperm cell.

El término "odds ratio" o "OR" se refiere a la proporción entre la probabilidad de sufrir la enfermedad en personas con el marcador o polimorfismo en relación a la probabilidad de sufrir la enfermedad en individuos sin el marcador o polimorfismo. The term "odds ratio" or "OR" refers to the ratio of the probability of suffering the disease in people with the marker or polymorphism in relation to the probability of suffering the disease in individuals without the marker or polymorphism.

El término "ácido polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado", como se usa aquí, se refiere a un polinucleótido que está separado y/o recuperado de un ácido nucleico de secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean la molécula de ácido nucleico y/o ha sido completamente o parcialmente purificado a partir de otro material biológico (por ejemplo, proteínas) que normalmente se asocian con el ácido nucleico. Asimismo, The term "isolated polynucleotide acid" or "isolated nucleic acid", as used herein, refers to a polynucleotide that is separated and / or recovered from a nucleic acid from nucleotide sequences that normally flank the nucleic acid molecule and / or it has been completely or partially purified from other biological material (eg, proteins) that are normally associated with nucleic acid. Likewise,

dicho "ácido polinucleótido aislado" comprende variantes de polinucleótido donde han llevado a cabo una o más inserciones, delecciones y/o sustituciones. said "isolated polynucleotide acid" comprises polynucleotide variants where one or more insertions, deletions and / or substitutions have been carried out.

Por "oligonucleótido" se entiende un polimero de 5 nucleótidos de cadena simple compuesta por más de 2 subunidades de nucleótidos unidas covalentemente. By "oligonucleotide" is meant a single chain 5 nucleotide polymer composed of more than 2 covalently linked nucleotide subunits.

El término "gen", como se utiliza aqui, se refiere no sólo a la parte estrictamente de codificación, sino también a las partes no codificantes. The term "gene", as used herein, refers not only to the strictly coding part, but also to the non-coding parts.

1 O El termino "combinación", a menos que se indique lo contrario, se refiere aqui a la combinación o asociación de al menos dos SNPs seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y 1 O The term "combination", unless otherwise indicated, refers here to the combination or association of at least two SNPs selected from among the SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and

rs5742912, rs5742912,
indicativos de riesgo de enfermedad indicative of risk of disease

15 fifteen
neurovascular, en particular ictus, de un individuo, en neurovascular, in particular ictus, of a individual, in

donde where
dichos SNPs están incluidos en una secuencia de sayings SNPs is it so included in a sequence of

polinucleótidos aislados como se define en este documento. isolated polynucleotides as defined in this document.

Cuando se hace referencia a los SNPs de esta invención y a los polinucleótidos que los comprenden, el 20 termino "una combinación de al menos dos" y en consecuencia el nómero exacto de "tres", "cuatro", "cinco" When referring to the SNPs of this invention and the polynucleotides that comprise them, the term "a combination of at least two" and consequently the exact number of "three", "four", "five"

o "seis", no se pretende significar un grupo cerrado de un máximo de 6 SNPs o polinucleótidos correspondientes, sino también pueden incluir combinaciones con más SNPs o 25 polinucleótidos correspondientes. En estas combinaciones, uno o más SNPs o polinucleótidos correspondientes pueden estar localizados o no en genes asociados a enfermedades neurovasculares, en particular accidentes cerebrovasculares, siempre y cuando dicho "al menos dos", or "six", is not intended to mean a closed group of a maximum of 6 SNPs or corresponding polynucleotides, but may also include combinations with more SNPs or 25 corresponding polynucleotides. In these combinations, one or more SNPs or corresponding polynucleotides may or may not be located in genes associated with neurovascular diseases, in particular strokes, as long as said "at least two",

30 "tres", "cuatro", "cinco" o "seis" corresponda a los SNPs y polinucleótidos correspondientes divulgados en la presente invención. 30 "three", "four", "five" or "six" correspond to the corresponding SNPs and polynucleotides disclosed in the present invention.

Por uvariable clinica" se entiende la utilización de los datos demográficos indicativos de enfermedad 35 neurovascular, en particular ictus, como la raza o el Clinical uvariable "means the use of demographic data indicative of neurovascular disease, particularly stroke, such as race or

origen étnico, edad, sexo y antecedentes familiares de enfermedad neurovascular, en particular ictus, así como el ethnic origin, age, sex and family history of neurovascular disease, in particular strokes, as well as the

uso use
de la información clínica, tal como la presencia de of the information clinic, such how the presence of

ataques attacks
isquémicos transitorios, ischemic transients,

hipertensión, hypertension,
dislipidemia, diabetes, fibrilación dyslipidemia, diabetes, fibrillation

auricular, enfermedad cardíaca, angiopatía amiloide, obesidad, consumo o abuso de drogas, estilo de vida sedentaria, tabaquismo, medicamentos, consumo de alcohol y antecedentes de enfermedad neurovascular, en particular ictus,. atrial, heart disease, amyloid angiopathy, obesity, drug use or abuse, sedentary lifestyle, smoking, medications, alcohol use, and a history of neurovascular disease, particularly stroke ,.

Por 11genes asociados a enfermedad neurovascular" se entiende los genes que se ha descrito que están asociados a cualquiera de las enfermedades neurovasculares definidas más adelante en la presente invención. By "genes associated with neurovascular disease" is meant the genes that have been described as being associated with any of the neurovascular diseases defined later in the present invention.

Por " genes asociados a ictus" o 11genes asociados a accidentes cerebrovasculares" se entiende los genes que se ha descrito que están asociados a la patología de ictus y/o a procesos relacionados funcionalmente con accidentes cerebrovasculares, tales como inflamación, fibrinólisis, coagulación, hipertensión, enfermedades del corazón, angiogénesis, metabolismo lipídico y diabetes. By "stroke-associated genes" or 11 strokes-associated genes "is understood the genes that have been described as being associated with the pathology of strokes and / or processes functionally related to strokes, such as inflammation, fibrinolysis, coagulation, hypertension, heart disease, angiogenesis, lipid metabolism and diabetes.

El término "enfermedades neurovasculares" se refiere a enfermedades complejas del cerebro, de la médula espinal y1o de los vasos sanguíneos y a los factores de riesgo asociados a enfermedades complejas del cerebro, de la médula espinal y1o de los vasos sanguíneos, tales como pueden ser: ictus (también denominado de forma equivalente en la presente invención como 11accidente(s) cerebrovascular(es)"), derrame cerebral, malformaciones arteriovenosas, trombosis, CADASIL, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma, disección, hiper/hipotensión, encefalopatías, síndromes lacunares, Fabry, homocistinuria/homocisteinemia, hiper/hipoglucemia, hiper/hypolipidemia, diabetes, MELAS, acidemia metilmalónica, displasia fibromuscular, síndrome de Foix- The term "neurovascular diseases" refers to complex diseases of the brain, spinal cord, and blood vessels, and risk factors associated with complex diseases of the brain, spinal cord, and blood vessels, such as: stroke (also equivalently named in the present invention as cerebrovascular accident (s) "), stroke, arteriovenous malformations, thrombosis, CADASIL, cerebral amyloid angiopathy, aneurysm, dissection, hyper / hypotension, encephalopathies, lacunar syndromes, Fabry, homocystinuria / homocysteinemia, hyper / hypoglycemia, hyper / hypolipidemia, diabetes, MELAS, methylmalonic acidemia, fibromuscular dysplasia, Foix syndrome-

Alajouanine, lesión por reperfusión, accidente cerebrovascular hemorrágico, accidente cerebrovascular isquémico, cardioembolismo, aterotrombismo, malformaciones vasculares, amnesia global transitoria, ataques isquémicos Alajouanine, reperfusion injury, hemorrhagic stroke, ischemic stroke, cardioembolism, atherothrombism, vascular malformations, transient global amnesia, ischemic attacks

transitorios, transients,
traumatismos, infecciones neurológicas, trauma, infections neurological,

convulsiones, seizures,
trastornos degenerativos, epilepsia, disorders degenerative, epilepsy,

cardiopatía, heart disease,
dolor de cabeza y migrañas, tumores, pain of head and migraines tumors,

inflamación, inflammation,
desmielinización, alteraciones de la demyelination, alterations of the

circulación, circulation,
neurodegeneración, demencia, Alzheimer, neurodegeneration, dementia, Alzheimer's

Parkinson, síndrome de Down, afasia, apraxia, trastornos psiquiátricos, trastornos de abuso de sustancias y drogas, trastornos cognitivos, esquizofrenia, trastornos del sueño. Parkinson's, Down syndrome, aphasia, apraxia, psychiatric disorders, substance and drug abuse disorders, cognitive disorders, schizophrenia, sleep disorders.

Por "población mediterránea" se entiende las personas originarias o residentes de cualquier de los siguientes estados o territorios: España, Francia, Italia, Portugal, Mónaco, Malta, Eslovenia, Croacia, Bosnia y Herzegovina, Montenegro, Albania, Grecia, Turquía, Chipre, Siria, Líbano, Israel, Palestina, Egipto, Libia, Túnez, Argelia, Marruecos, Creta, Eubea, las Islas Pelagia, Gibraltar, Rodas, Lesbos, Ceuta, Melilla, Quíos, Cefalonia, Corfú, Naxos, Andros, Cerdeña, Córcega, Cres, Krk, Brac , Hvar, Pag, Korcula, Akrotiri y Dhekelia, Andorra, Jordania, San Marino, Ciudad del Vaticano, Macedonia y Serbia. "Mediterranean population" means persons originating from or residing in any of the following states or territories: Spain, France, Italy, Portugal, Monaco, Malta, Slovenia, Croatia, Bosnia and Herzegovina, Montenegro, Albania, Greece, Turkey, Cyprus , Syria, Lebanon, Israel, Palestine, Egypt, Libya, Tunisia, Algeria, Morocco, Crete, Euboea, Pelagia Islands, Gibraltar, Rhodes, Lesbos, Ceuta, Melilla, Chios, Kefalonia, Corfu, Naxos, Andros, Sardinia, Corsica , Cres, Krk, Brac, Hvar, Pag, Korcula, Akrotiri and Dhekelia, Andorra, Jordan, San Marino, Vatican City, Macedonia and Serbia.

2.-Descripción 2.-Description

La presente invención se refiere a una combinación de al menos dos SNPs seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus. The present invention relates to a combination of at least two SNPs selected from among the SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of an individual's risk of suffering a neurovascular disease, in particular stroke.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en tres SNPs. En una realización más preferida, dicha combinación consiste en cuatro SNPs. In a preferred embodiment, said combination consists of three SNPs. In a more preferred embodiment, said combination consists of four SNPs.

En una realización más preferida, dicha combinación consiste en cinco SNPs. En una realización la más preferida, dicha combinación consiste en seis SNPs. In a more preferred embodiment, said combination consists of five SNPs. In a most preferred embodiment, said combination consists of six SNPs.

En una realización particular, dichos al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con uno o más de los SNPs rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733. In a particular embodiment, said at least two, three, four, five or six SNPs are combined with one or more of the SNPs rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 and rs2200733.

En otra realización, dichos polimorfismos de nucleótido único de acuerdo a las realizaciones anteriores se combinan con una o más variables clínicas asociadas a enfermedades neurovasculares. Preferiblemente, dicha variable clínica se selecciona entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia. In another embodiment, said single nucleotide polymorphisms according to the previous embodiments are combined with one or more clinical variables associated with neurovascular diseases. Preferably, said clinical variable is selected among age, sex, smoking, hypertension, diabetes and dyslipidemia.

Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular en las realizaciones anteriores es el ictus. Preferably, said neurovascular disease in the above embodiments is stroke.

Como dichos SNPs están por naturaleza comprendidos en un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico aislado, la presente invención se refiere también a la Since such SNPs are by nature comprised of an isolated polynucleotide or nucleic acid molecule, the present invention also relates to the

combinación combination
de al menos dos polinucleótidos aislados of to the less two polynucleotides isolated

incluidos included
en genes asociados a enfermedades in genes associates to diseases

neurovasculares, neurovascular,
comprendiendo cada uno de dichos understanding every one of sayings

polinucleótidos polynucleotides
un SNP seleccionado entre los SNPs a SNP selected between the SNPs

rs2276109, rs10275136 , rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a la SEC ID N o 1 a rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of an individual's risk of suffering a neurovascular disease, said isolated polynucleotides corresponding to SEQ ID No. 1 to

6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. 6. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

SEC ID N o 1 indica la posición del polimorfismo rs2276109 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido A o G, siendo G el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs2276109 se encuentra en el contig humano NT 033899.7 en la posición cromosómica 102251001 del SEQ ID No. 1 indicates the position of the rs2276109 polymorphism and its adjacent sequence, where nucleotide N is the SNP at position 21 and may be nucleotide A or G, with G being the allele associated with neurovascular disease. rs2276109 is found on human contig NT 033899.7 at chromosomal position 102251001 of

cromosoma 11. chromosome 11.

SEe ID N o 2 indica la posición del polimorfismo rs10275136 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido T o e, siendo el alelo e el asociado con la enfermedad neurovascular. rs10275136 se encuentra en el contig humano NT 007914.14 en la posición cromosómica 150514825 del cromosoma 7. SEe ID No. 2 indicates the position of the rs10275136 polymorphism and its adjacent sequence, where nucleotide N is the SNP at position 21 and may be a nucleotide T or e, the allele being associated with neurovascular disease. rs10275136 is found on the human contig NT 007914.14 at chromosome position 150514825 on chromosome 7.

SEe ID N o 3 indica la posición del polimorfismo rs310585 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido G o A, siendo A el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs310585 se encuentra en el contig humano NT 007914.14 en la posición cromosómica 150526188 del cromosoma 7. SEe ID No. 3 indicates the position of the rs310585 polymorphism and its adjacent sequence, where nucleotide N is the SNP at position 21 and may be nucleotide G or A, where A is the allele associated with neurovascular disease. rs310585 is found on the human contig NT 007914.14 at chromosome position 150526188 on chromosome 7.

SEe ID N o 4 indica la posición del polimorfismo rs7956957 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o G, siendo G el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs7956957 se encuentra en el contig humano NT 029419.11 en la posición cromosómica 55889082 del cromosoma 12. SEe ID No. 4 indicates the position of the rs7956957 polymorphism and its adjacent sequence, where nucleotide N is the SNP at position 21 and may be nucleotide e or G, with G being the allele associated with neurovascular disease. rs7956957 is found on the human contig NT 029419.11 at chromosome position 55889082 on chromosome 12.

oor

SEe ID N 5 indica la posición del polimorfismo rs10947803, también llamado rs9471058, y su secuencia SEe ID N 5 indicates the position of the rs10947803 polymorphism, also called rs9471058, and its sequence

adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o A, siendo A el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs1094 7803 se encuentra en el contig humano NT_007592.14 en la posición cromosómica 39378588 del cromosoma 6. adjacent, where nucleotide N is the SNP at position 21 and can be nucleotide e or A, where A is the allele associated with neurovascular disease. rs1094 7803 is found on the human contig NT_007592.14 at chromosome position 39378588 on chromosome 6.

SEe ID N o 6 se indica la posición del polimorfismo rs5742912 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o T, siendo el alelo T el asociado con la enfermedad neurovascular. rs5742912 se encuentra en el contig humano NT_009759 .15, en la posición cromosómica 6328611 del SEe ID No. 6 indicates the position of the rs5742912 polymorphism and its adjacent sequence, where nucleotide N is the SNP at position 21 and may be an e or T nucleotide, with the T allele being associated with neurovascular disease. rs5742912 is found on the human contig NT_009759 .15, at chromosomal position 6328611 of the

cromosoma 12. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular en las SEC ID N o 1-6 es el ictus. chromosome 12. Preferably, said neurovascular disease in SEQ ID NOS: 1-6 is stroke.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en tres polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. In a preferred embodiment, said combination consists of three isolated polynucleotides included in genes associated with neurovascular diseases, each of said polynucleotides comprising a SNP selected from SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of the risk of an individual suffering from neurovascular disease, said isolated polynucleotides corresponding to SEQ ID NOS: 1 to 6. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en cuatro polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. In a preferred embodiment, said combination consists of four isolated polynucleotides included in genes associated with neurovascular diseases, each of said polynucleotides comprising a SNP selected among the SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of the risk of an individual suffering from neurovascular disease, said isolated polynucleotides corresponding to SEQ ID NOS: 1 to 6. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en cinco polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. In a preferred embodiment, said combination consists of five isolated polynucleotides included in genes associated with neurovascular diseases, each of said polynucleotides comprising a SNP selected from SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of the risk of an individual suffering from neurovascular disease, said isolated polynucleotides corresponding to SEQ ID NOS: 1 to 6. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en seis polinucleótidos aislados incluidos en In a preferred embodiment, said combination consists of six isolated polynucleotides included in

genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. genes associated with neurovascular diseases, each of said polynucleotides comprising a SNP selected among the SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative of an individual's risk of suffering a neurovascular disease, said isolated polynucleotides corresponding to SEQ IDs No. 1 to 6. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

En otra realización particular, los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas de otros marcadores o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y 1o LRP. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. In another particular embodiment, the alleles of said SNPs are deduced by genetic tests of other markers or by measuring the levels of activity or concentration of the proteins, or the corresponding levels of RNA expression of NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 and 1st LRP. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

En una realización particular, dicha combinación de SNPs o los correspondientes polinucleótidos aislados se encuentran en un individuo perteneciente a la población mediterránea. En una realización más particular, dicho individuo pertenece a la población española. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus. In a particular embodiment, said combination of SNPs or the corresponding isolated polynucleotides are found in an individual belonging to the Mediterranean population. In a more particular embodiment, said individual belongs to the Spanish population. Preferably, said neurovascular disease is stroke.

Como se demostrará más adelante en la sección de métodos y resultados, dicha combinación de SNPs o los correspondientes polinucleótidos aislados, se puede aplicar a un nuevo modelo o método para determinar el As will be demonstrated later in the Methods and Results section, such a combination of SNPs or the corresponding isolated polynucleotides can be applied to a new model or method to determine the

riesgo risk
genético de que un individuo pueda sufrir una genetic of than a individual can suffer a

enfermedad disease
neurovascular, preferiblemente un ictus, y un neurovascular, preferably a ictus, and a

kit para kit for
la aplicación de dicho método. the application of said method.
2.1.-Métodos 2.1.-Methods

El objetivo de este estudio fue crear un modelo genético predictivo para el accidente cerebrovascular o ictus, aunque perfectamente ampliable a una enfermedad neurovascular tal como se define en este documento, The objective of this study was to create a predictive genetic model for stroke or stroke, although perfectly expandable to neurovascular disease as defined in this document,

mediante through
el hallazgo de nuevos marcadores genéticos a the finding of new markers genetic to

través through
de uno de los estudios más grandes de asociación de of one of the more studies big of Association of

genes genes
candidatos realizado hasta ahora en el accidente candidates accomplished until now in the accident

cerebrovascular, cerebrovascular,
incluyendo una réplica y un análisis including a replica and a analysis

funcional functional
de los resultados obtenidos. of the results obtained.

2.1.1.-Población de estudio 2.1.1.-Study population

El diseño de estudio fue de un estudio caso-control, donde se utilizaron casos y controles de ictus recogidos como se describe a continuación. El tamaño de la muestra se calculó con el programa Ene 2.0 para obtener una potencia de 0,80 con un nivel de significancia de 0,05 y una diferencia del 6% entre las frecuencias de los alelos de casos y controles. The study design was a case-control study, where stroke cases and controls collected as described below were used. The sample size was calculated with the Jan 2.0 program to obtain a power of 0.80 with a significance level of 0.05 and a difference of 6% between the frequencies of the alleles of cases and controls.

531 pacientes consecutivos con ictus isquémico en el territorio vascular de las arterias cerebrales basilar 531 consecutive patients with ischemic stroke in the vascular territory of the basilar cerebral arteries

o media (ACM) y admitido en el servicio de urgencias de un hospital universitario en las primeras 3 horas después de la aparición de síntomas fueron reclutados. El inicio del accidente cerebrovascular se define como la última vez que se determina que el paciente estuvo sin ningún tipo de déficit neurológico. Todos los pacientes fueron sometidos a examinaciones urgentes por ecografía carotídea y Doppler transcraneal (TCD). Recibieron t-PA por vía intravenosa en una dosis estándar de 0.9-mg/kg (bolo 10%, 90% en infusión continua durante 1 hora) . Los pacientes con una enfermedad clínicamente conocida inflamatoria o maligna fueron excluidos del análisis. Para identificar el mecanismo potencial de infarto cerebral, un conjunto de pruebas de diagnóstico se realizó que incluyeron electrocardiograma o mean (ACM) and admitted to the emergency department of a university hospital in the first 3 hours after the onset of symptoms were recruited. Onset of stroke is defined as the last time the patient was determined to be without any neurological deficit. All patients underwent urgent examinations by carotid ultrasound and transcranial Doppler (TCD). They received intravenous t-PA in a standard dose of 0.9-mg / kg (10% bolus, 90% in continuous infusion for 1 hour). Patients with a clinically known inflammatory or malignant disease were excluded from the analysis. To identify the potential mechanism of stroke, a set of diagnostic tests was performed that included an electrocardiogram.

(ECG) , radiografía de tórax, hemograma completo y diferencial de leucocitos, bioquímica de sangre, ecografía carotídea, contraste y tomografía craneal (TC) en todos los pacientes. Cuando esté indicado, algunos pacientes también se sometieron a pruebas especiales de coagulación, (ECG), chest radiography, complete and differential white blood cell count, blood biochemistry, carotid ultrasound, contrast and cranial tomography (CT) in all patients. When indicated, some patients also underwent special coagulation tests,

imágenes de resonancia magnética (MRI), ecocardiografía transtorácica y monitorización por Holter ECG. Teniendo en cuenta esta información, subgrupos etiológicos previamente definidos se determinaron según los criterios TOAST [1] y también por criterios de la Comunidad Oxfordshire (OCSP), basados en los síntomas clínicos, localización y extensión del infarto cerebral [ 2] . El examen clínico se realizó al ingreso y a las 12, 2 4 y 4 8 horas después del inicio de los síntomas y todos los días hasta el alta. Se evaluó la gravedad del accidente neurovascular mediante el uso de la escala de NIHSS [3]. De definieron la mejoría neurológica como una disminución en la puntuación ~ 4 puntos y el deterioro neurológico como la muerte o un aumento en la puntuación de > 4 puntos a las 48 horas [4]. El resultado funcional fue definido por la escala de Rankin modificada (mRS) >2, 3 meses después del ictus. Los exámenes TCD se realizaron en el servicio de urgencias antes de la administración de t-PA (<3 horas). La presión arterial sistólica, diastólica y la frecuencia cardíaca se midieron en el momento de cada examinación de TCD. El examen TCD se realizó con el dispositivo Multi-Dop X4 TCD (DWL Elektronische Systeme GmbH), por un transductor de mano y un modo de onda pulsada con una frecuencia de 2 MHz. La oclusión proximal de ACM fue definida como la ausencia de flujo o la presencia de una señal de flujo mínimo en todo la ACM a una profundidad de insonación entre 45 y 65 mm [5]. La oclusión distal ACM se definió como una velocidad media en la zona afectada ACM > 21% en comparación con la ACM no afectada [ 6] . A sus ingresos, todos los pacientes se sometieron a una tomografía computarizada en las primeras 3 horas después del inicio del ictus. Ningún paciente con una hipodensidad > 33% en el territorio de la ACM recibió t-PA en este estudio. El TC se repitió posteriormente, de 24 a 48 horas más tarde (o antes, cuando se produjo un deterioro neurológico rápido) para magnetic resonance imaging (MRI), transthoracic echocardiography and Holter ECG monitoring. Taking this information into account, previously defined etiological subgroups were determined according to the TOAST criteria [1] and also by criteria of the Oxfordshire Community (OCSP), based on the clinical symptoms, location and extent of cerebral infarction [2]. The clinical examination was performed at admission and at 12, 2, 4 and 4 8 hours after the onset of symptoms and every day until discharge. The severity of stroke was assessed using the NIHSS scale [3]. Neurological improvement was defined as a decrease in score ~ 4 points and neurological deterioration as death or an increase in score of> 4 points at 48 hours [4]. The functional result was defined by the modified Rankin scale (mRS)> 2.3 months after the stroke. TCD examinations were performed in the emergency department before administration of t-PA (<3 hours). Systolic, diastolic blood pressure and heart rate were measured at the time of each TCD examination. The TCD examination was performed with the Multi-Dop X4 TCD device (DWL Elektronische Systeme GmbH), by a hand-held transducer and a pulsed wave mode with a frequency of 2 MHz. The proximal occlusion of ACM was defined as the absence of flow or the presence of a minimum flow signal throughout the MCA at an insonation depth between 45 and 65 mm [5]. Distal ACM occlusion was defined as a mean velocity in the affected area ACM> 21% compared to unaffected ACM [6]. Upon admission, all patients underwent computed tomography in the first 3 hours after the onset of the stroke. No patient with hypodensity> 33% in the MCA territory received t-PA in this study. The CT was repeated later, 24 to 48 hours later (or earlier, when rapid neurological deterioration occurred) to

evaluar la presencia de transformación hemorrágica assess the presence of hemorrhagic transformation

(TH). Las TC fueron revisadas por un neurorradiólogo con amplia experiencia en el ictus agudo. Presencia y tipo de HT se definieron de acuerdo a criterios previamente publicados [7-8] . El infarto hemorrágico (HI) se definió como infartos petequiales sin efecto masa y hematoma parenquimatoso (PH) se definió como hemorragias con efecto masa. (TH). CT scans were reviewed by a neuroradiologist with extensive experience in acute stroke. Presence and type of HT were defined according to previously published criteria [7-8]. Hemorrhagic infarction (HI) was defined as petechial infarcts without mass effect and parenchymal hematoma (PH) was defined as hemorrhages with mass effect.

54 7 controles fueron reclutados en la unidad de ictus y en el laboratorio del hospital Vall d' Hebron de Barcelona entre 2 O O 7 y 2 O O 8. Todos los controles fueron mayores de 65 años de edad y se declararon sanos de demencia, enfermedad neurovascular y/o cardiovascular, evaluados mediante por entrevista antes de la extracción de sangre. Los pacientes con historia familiar de primer o segundo grado de enfermedad neurovascular fueron excluidos del estudio. 54 7 controls were recruited in the stroke unit and in the laboratory of the Vall d 'Hebron hospital in Barcelona between 2 OO 7 and 2 OO 8. All controls were over 65 years of age and declared healthy with dementia, neurovascular disease. and / or cardiovascular, evaluated through an interview before blood collection. Patients with a first or second degree family history of neurovascular disease were excluded from the study.

Una historia detallada de los factores de riesgo vascular se ha obtenido de cada participante. El tabaquismo se definió como fumar o haber fumado en alguna ocasión. La hipertensión se definió como una presión arterial sistólica ~ 140 mmHg y presión arterial diastólica ~ 85 mmHg, historia de hipertensión auto-reportada y/o tratamiento para la hipertensión. La diabetes mellitus se definió por historia de diabetes auto-reportada y/o tratamiento de diabetes tipo 2. La dislipidemia fue definida por niveles lipídicos elevados A detailed history of vascular risk factors has been obtained from each participant. Smoking was defined as smoking or having smoked on occasion. Hypertension was defined as systolic blood pressure ~ 140mmHg and diastolic blood pressure ~ 85mmHg, history of self-reported hypertension and / or treatment for hypertension. Diabetes mellitus was defined by history of self-reported diabetes and / or treatment of type 2 diabetes. Dyslipidemia was defined by elevated lipid levels

(colesterol> 200 mg/dL o triglicemia> 200 mg/dL), historia reportada y/o cualquier tratamiento. El consentimiento informado se obtuvo de cada participante del estudio y todos los sujetos presentaban ascendencia europea. El comité ético del hospital aprobó el estudio. (cholesterol> 200 mg / dL or triglycemia> 200 mg / dL), reported history and / or any treatment. Informed consent was obtained from each study participant and all subjects were of European descent. The hospital's ethics committee approved the study.

2.1.2.-Genotipado y asociaciones de SNPs 221 SNPs en 135 genes candidatos elegidos en la 2.1.2.-Genotyping and SNP associations 221 SNPs in 135 candidate genes chosen in the

literatura por sus funciones putativas en enfermedades literature for its putative functions in diseases

neurovasculares y en procesos relacionados funcionalmente neurovascular and functionally related processes

con estas enfermedades, como inflamación, fibrinólisis, with these diseases like inflammation, fibrinolysis,

coagulación, hipertensión, enfermedad coronaria, coagulation, hypertension, coronary heart disease,

5 5
angiogénesis, metabolismo lipídico o diabetes fueron angiogenesis, lipid metabolism or diabetes were

analizados de la siguiente manera. El ADN genómico se analyzed as follows. Genomic DNA is

extrajo de cada muestra de 1 mL de sangre periférica extracted 1 mL of peripheral blood from each sample

anticoagulada con EDTA mediante métodos estándar. Los SNPs anticoagulated with EDTA by standard methods. SNPs

se genotiparon por SNPlexrn (Applied Biosystems, Inc., were genotyped by SNPlexrn (Applied Biosystems, Inc.,

1 O 1 O
Foster City, EE.UU.) en el centro de genotipado nacional Foster City, USA) at the National Genotyping Center

español (CeGen) , con tasa de éxito de más de 9O%. Cinco Spanish (CeGen), with a success rate of more than 9O%. Five

genes fueron analizados en su totalidad por Tag-SNPs, genes were analyzed entirely by Tag-SNPs,

definidos por los datos del HapMap utilizando pairwise defined by HapMap data using pairwise

tagger r2 ~ O, 8 y una frecuencia del alelo menor >0, 1: tagger r2 ~ O, 8 and a minor allele frequency> 0, 1:

15 fifteen
MMP9, NOS3, VEGF, LRP y IL6. Desviación del equilibrio de MMP9, NOS3, VEGF, LRP and IL6. Deviation from the equilibrium of

Hardy-Weinberg (HWE) se evaluó mediante una prueba X2 con Hardy-Weinberg (HWE) was evaluated using an X2 test with

1 grado de libertad. Una prueba X2 o de Fisher, en su 1 degree of freedom. An X2 or Fisher test, in your

caso, se utilizó para comparar variables categóricas entre case, it was used to compare categorical variables between

grupos. La corrección de Bonferroni se utilizó para dar groups. The Bonferroni correction was used to give

20 twenty
cuenta de las pruebas múltiples. Los tests de Student o multiple testing account. Student's tests or

Krustal-Wallis se usaron para comparar variables Krustal-Wallis were used to compare variables

continuas, según correspondiera. Las odds ratio ( ORs) con continuous, as appropriate. Odds ratios (ORs) with

intervalos de confianza (IC) de 95% para el efecto sobre 95% confidence intervals (CI) for the effect on

el riesgo de ictus isquémico fueron estimadas por the risk of ischemic stroke were estimated by

25 25
regresión logística. Todos los análisis estadísticos se Logistic regression. All statistical analyzes are

realizaron con el programa SPSS 15.0 ©. made with the SPSS 15.0 © program.

La asociación cumulada de los SNP individuales The cumulative association of individual SNPs

asociados positivamente se calculó en función del número positively associated was calculated based on the number

de alelos de riesgo llevados (de O a 6) y de la of carried risk alleles (from 0 to 6) and the

30 30
combinación de alelos de los 6 SNPs llevada (de los 26 = allele combination of the 6 SNPs carried (of the 26 =

64 combinaciones posibles). El análisis se realizó bajo 64 possible combinations). The analysis was performed under

un modelo aditivo, teniendo en cuenta la etapa 1, etapa 2 an additive model, taking into account stage 1, stage 2

y la base de datos global. A continuación se realizó una and the global database. Then a

regresión logística, incluyendo cada variable y las logistic regression, including each variable and the

35 35
probabilidades predictivas fueron registradas. Se predictive probabilities were recorded. I know

realizaron 2 curvas ROC, una con los factores de riesgo y performed 2 ROC curves, one with the risk factors and

otra con los factores de riesgo y variantes genéticas, another with risk factors and genetic variants,

para explorar la relación entre la sensibilidad y to explore the relationship between sensitivity and

especificidad de una prueba clínica para el riesgo de Specificity of a clinical test for the risk of

5 5
accidente cerebrovascular. También se calculó la stroke. The

diferencia entre las áreas bajo las curvas con el difference between the areas under the curves with the

programa MedCalc. Por último, la combinación de variantes MedCalc program. Finally, the combination of variants

genéticas y clínicas realizadas por cada individuo se genetic and clinical performed by each individual is

utilizó para desarrollar un modelo predictivo de riesgo used to develop a predictive risk model

1 O 1 O
de accidente cerebrovascular y para determinar las of stroke and to determine the

categorías de riesgo para ictus. risk categories for strokes.

2.1.3.-Análisis funcional 2.1.3.-Functional analysis

Se extrajo ARN de controles sanos y se midió la RNA was extracted from healthy controls and the

15 fifteen
expresión mediante PCR cuantitativa en tiempo real de los expression by real-time quantitative PCR of the

genes KCNK17, LRP, SCNN1A y MMP12. La fracción de glóbulos KCNK17, LRP, SCNN1A and MMP12 genes. Blood cell fraction

blancos se obtuvo tras la centrifugación de sangre total blanks were obtained after centrifugation of whole blood

conservada en EDTA durante 15 minutos a 35O O rpm, y se preserved in EDTA for 15 minutes at 35O O rpm, and

conservó en RNAlater ® a -80 °C. El ARN total fue aislado preserved in RNAlater ® at -80 ° C. Total RNA was isolated

2 O 2 O
por RiboPure-Blood™ Kit (Ambion ®, Foster City, by RiboPure-Blood ™ Kit (Ambion ®, Foster City,

EE.UU.). La síntesis del cDNA se realizó utilizando el kit USA.). CDNA synthesis was performed using the kit

High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems Inc., High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems Inc.,

Foster City, EE.UU.). Los niveles de ARNm se determinaron Foster City, USA). MRNA levels were determined

mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un by quantitative real-time PCR, using a

25 25
protocolo estándar de kit TaqMan® PCR y sondas TaqMan standard protocol for TaqMan® PCR kit and TaqMan probes

fluorogénicas (LRP: Hs00233856_m1, SCNN1A: Hs00168906_m1, fluorogenic (LRP: Hs00233856_m1, SCNN1A: Hs00168906_m1,

MMP12: Hs001591 78_m1) mediante tecnología 7500 Real Time MMP12: Hs001591 78_m1) using 7500 Real Time technology

PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City , PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City,

EE.UU.) . El gen Cyclophilin A (PPIA) se usó para USA). The Cyclophilin A (PPIA) gene was used to

30 30
normalizar los resultados (Hs99999904_m1). Todas las normalize the results (Hs99999904_m1). All

reacciones se realizaron por triplicado en placas de 96 Reactions were performed in triplicate on 96 plates

pocillos y se analizaron con el Applied Biosystems SDS wells and analyzed with the Applied Biosystems SDS

7500 system software (Applied Biosystems Inc., Foster 7500 system software (Applied Biosystems Inc., Foster

City, EE.UU.) Los resultados se expresan en porcentaje en City, USA) Results are expressed as a percentage in

35 35
comparación a una muestra calibrador que se utiliza en Comparison to a sample calibrator used in

todos los experimentos. all experiments.

Los niveles de proteína MMP12 se midieron a partir de MMP12 protein levels were measured from

suero de controles mediante Fuorokine® MMP12 Analyte controls serum using Fuorokine® MMP12 Analyte

Profiling en placas de 96 pocillos. Cada muestra se Profiling in 96-well plates. Each sample is

5 5
concentró de 500pL a 100uL con Microcon® (MilliporeTM, concentrated from 500pL to 100uL with Microcon® (MilliporeTM,

Billerica, EE.UU.) y se analizaron dos veces según las Billerica, USA) and were analyzed twice according to the

instrucciones del fabricante, las muestras se midieron en manufacturer's instructions, samples were measured in

un analizador Luminex (Human MMP Base Kit, Fluorokine® a Luminex analyzer (Human MMP Base Kit, Fluorokine®

MAP, R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.). La actividad de MAP, R & D Systems, Minneapolis, USA). The activity of

10 10
la proteína NOS3 fue analizada a partir de plasma de NOS3 protein was analyzed from plasma of

controles por Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit en Controls by Nitrate / Nitrite Colorimetric Assay Kit on

placas de 96 pocillos. Cada muestra se concentró desde 96-well plates. Each sample was concentrated from

5O OpL hasta 1 O OuL con Microcon® (MilliporeTM, Billerica, 5O OpL to 1 O OuL with Microcon® (MilliporeTM, Billerica,

EE.UU.) y se analizo dos veces según las instrucciones del USA) and was analyzed twice according to the instructions of the

15 fifteen
fabricante (Catalog n°780001, Cayman™, Ann Arbor, USA). manufacturer (Catalog No. 780001, Cayman ™, Ann Arbor, USA).

2.1.4.-Microarrays y análisis por Ingenuity Pathways 2.1.4.-Microarrays and analysis by Ingenuity Pathways

Se extrajo ARN de 12 sujetos. Tubos con EDTA se RNA was extracted from 12 subjects. Tubes with EDTA se

centrifugaron a 3500RPM durante 15 minutos para obtener la centrifuged at 3500RPM for 15 minutes to obtain the

2 O 2 O
fracción de glóbulos blancos. El kit RiboPure™ -Blood de white blood cell fraction. The RiboPure ™ -Blood kit from

Ambion (Ambion, Woodward st. Austin, EE.UU.) fue el Ambion (Ambion, Woodward st. Austin, USA) was the

empleado para extraer el ARN total siguiendo las used to extract the total RNA following the

instrucciones del fabricante. El ARN de la globina de los manufacturer's instructions. Globin RNA from

eritrocitos de muestras de sangre que provoca erythrocytes from blood samples causing

25 25
interferencias en los estudios con microarrays fue interference in the microarray studies was

eliminado utilizando el kit de Globin-Clear (Ambion, removed using Globin-Clear kit (Ambion,

Woodward st. Austin, EE.UU.). Las imágenes fueron Woodward st. Austin, USA). The images were

procesadas con el Microarray Analysis Suite 5.0 processed with Microarray Analysis Suite 5.0

(Affymetrix) Todas las muestras mostraron (Affymetrix) All samples showed

30 30
características de alta calidad y se sometieron a análisis high quality features and underwent analysis

posteriores. Los valores de expresión crudos obtenidos later. The raw expression values obtained

directamente de archivos CEL fueron pre-procesados por el directly from CEL files were pre-processed by the

método de RMA, un proceso de tres pasos que integra RMA method, a three-step process that integrates

corrección de valores de fondo, normalización y resumen de correction of background values, normalization and summary of

35 35
valores de las sondas. Estos valores normalizados fueron probe values. These normalized values were

la base para todos los siguiente análisis. La selección de genes expresados diferencialmente se basó en un análisis con el modelo de Bayes. Los valores de p se usaron para the basis for all the following analyzes. The selection of differentially expressed genes was based on an analysis with the Bayes model. P values were used to

clasificar sort out
los genes con mayor o menor cambios de the genes with higher or less changes of

expresión. expression.
Los valores de p se ajustaron utilizando la The values of p I know adjusted using the

corrección correction
por falso positivo (FDR) y el método de by false positive (FDR) and the method of

Benjamini Benjamini
Hochberg. Los genes asociados de forma más Hochberg. The genes associates of shape plus

significativa se destacaron gráficamente utilizando gráficas de tipo volcanes con, en horizontal, la amplitud del cambio de expresión y, en vertical, los valores de p were highlighted graphically using volcano-type graphs with, in horizontal, the amplitude of the change of expression and, in vertical, the values of

obtenidos. La importancia biológica de los cambios observados se estimó comprobando si los genes que obtained. The biological significance of the observed changes was estimated by checking whether the genes that

resultaron ser expresados diferencialmente parecían estar concentrados o particularmente ausentes de algunas categorías del Ontology. Finalmente, con el software Ingenuity Pathways (IPA) se evaluaron las relaciones entre los genes asociados significativamente con los genotipos del LRP. Los resultactos se registraron en el IPA, y las asociaciones entre las moléculas significativas con otras moléculas, sus funciones y su participación en redes moleculares y en enfermedades se registro. El protocolo usado para el estudio fue el siguiente: They turned out to be differentially expressed. They seemed to be concentrated or particularly absent from some categories of Ontology. Finally, the Ingenuity Pathways (IPA) software evaluated the relationships between genes significantly associated with LRP genotypes. The results were recorded in the IPA, and the associations between significant molecules with other molecules, their functions and their participation in molecular networks and in diseases were recorded. The protocol used for the study was as follows:

Esquema 1 Scheme 1

Recogida de datos (cuestionarios) y muestras (ADN, ARN, suero, plasma, etc) Collection of data (questionnaires) and samples (DNA, RNA, serum, plasma, etc.)

+ +

Extraccion de ADN o ARN DNA or RNA extraction

+ +

Genotipado (PCR y secuenciación, PCR en tiempo real, etc) Genotyping (PCR and sequencing, real-time PCR, etc.)

+ +

Analisis estadi~ de los datos Statistical analysis of the data

~ ~ Estudios funcionales: ~ ~ Functional studies:

Replicacion de los . ,Replication of the. ,

resultados en una n1veles de protema por ELISA nueva populacion actividad de proteína por ensayo calorimétrico niveles de mARN por PCR en tiempo real Microarrays Results in a Protein Level by New ELISA Population Activity of Protein by Calorimetric Assay mRNA Levels by Real-time PCR Microarrays

2.2.-Resultados 2.2.-Results

2.2.1.-Análisis genético El análisis estadístico y el genotipado de las 2.2.1.-Genetic analysis Statistical analysis and genotyping of

5 muestras se realizaron en dos etapas distintas. En total, los casos de ictus isquémico se dividieron dependiendo de la etiologías en cardioembolicos (50%), aterotromboticos ( 23%) e indeterminados ( 2 7%) . No había diferencias significativas entre los casos y controles de la etapa 1 5 samples were made in two different stages. In total, the cases of ischemic stroke were divided depending on the etiologies into cardioembolic (50%), atherothrombotic (23%) and indeterminate (2 7%). There were no significant differences between stage 1 cases and controls.

10 contra los casos y controles del etapa 2. Los factores de riesgo establecidos como por ejemplo el género masculino, la edad, diabetes, hipertensión y el tabaquismo se observaron con una frecuencia mas elevada en el grupo de ictus (Tabla 1) 10 against stage 2 cases and controls. Established risk factors such as male gender, age, diabetes, hypertension, and smoking were observed with a higher frequency in the stroke group (Table 1)

15 22 SNPs se excluyeron del análisis debido a la frecuencia del alelo menor (MAF) inferior a 1% y 33 SNPs se excluyeron por fallo de genotipado en cualquier fase del análisis, por lo que el análisis estadístico final incluyó 166 SNPs. Teniendo en cuenta un modelo aditivo, un 15 22 SNPs were excluded from the analysis due to the minor allele frequency (MAF) less than 1% and 33 SNPs were excluded due to genotyping failure at any stage of the analysis, so the final statistical analysis included 166 SNPs. Taking into account an additive model, a

20 total de 25 SNPs se asociaron a ictus en al menos una etapa del análisis. Seis SNPs situados cerca o dentro de los genes KCNK17 (rs10947803), LRPl (rs7956957), MMP12 20 total of 25 SNPs were associated with strokes in at least one stage of the analysis. Six SNPs located near or within the genes KCNK17 (rs10947803), LRPl (rs7956957), MMP12

(rs2276109), NOS3 (rs10275136 y rs310585) y SCNNlA (rsS 7 42 912) se asociaron con ictus isquémico, en las dos 25 etapas del análisis (Tabla 2). Tabla l. Características de la población de estudio (rs2276109), NOS3 (rs10275136 and rs310585) and SCNNlA (rsS 7 42 912) were associated with ischemic stroke, in the two 25 stages of the analysis (Table 2). Table l. Characteristics of the study population.

Total (n=l062) Controles Cases (n=535) (n=527) valor de p Total (n = 1062) Controls Cases (n = 535) (n = 527) p-value

Edad, años ± DE 71.6 ± 7.1 70.7 ± 12.0 <0.05 Hombres, n (%) 230 (42.5) 287 (54. 5) <0.001 Fumadores, n (%) 68 (12.6) 130 (25.9) <0.001 Age, years ± SD 71.6 ± 7.1 70.7 ± 12.0 <0.05 Men, n (%) 230 (42.5) 287 (54. 5) <0.001 Smokers, n (%) 68 (12.6) 130 (25.9) <0.001

Hipertensión, n (%) 239 (44.2) 308 (59. 2) <0.001 Diabetes mellitus, n (%) 44 (8. 2) 120 (22.9) <0.001 Hypertension, n (%) 239 (44.2) 308 (59. 2) <0.001 Diabetes mellitus, n (%) 44 (8. 2) 120 (22.9) <0.001

Dislipidemia, n (%) 155 (28. 7) 173 (33 .1) <0.05 Dyslipidemia, n (%) 155 (28. 7) 173 (33 .1) <0.05

Tabla 2. SNPs asociados significativamente a ictus en las Table 2. SNPs significantly associated with strokes in the

2 2
etapas del análisis stages of analysis

Etapa Stage
1 one

Valor de Value of

SNP SNP
Riesgo Controles Casos p OR (95% IC) Risk Controls Cases p OR (95% IC)

rsl0947803 rsl0947803
A 17.8 25.3 0.003 1.57 (1.16-2.11) TO 17.8 25.3 0.003 1.57 (1.16-2.11)

rs7956957 rs7956957
G 63.0 70.0 0.0261 1.37 (1.04-1.80) G 63.0 70.0 0.0261 1.37 (1.04-1.80)

rs2276109 rs2276109
G 9.7 17.7 0.0003 2.00 (1.37-2.91) G 9.7 17.7 0.0003 2.00 (1.37-2.91)

rsl0275136 rsl0275136
e 93.5 9 7. 2 0.0137 2.35 (1.17-4. 73) and 93.5 9 7. 2 0.0137 2.35 (1.17-4. 73)

rs310585 rs310585
A 46.4 58.1 0.0005 1.60 (1.23-2.09) TO 46.4 58.1 0.0005 1.60 (1.23-2.09)

rs5742912 rs5742912
T 86.8 96.5 3.1E-07 4.19 (2.33-7.54) T 86.8 96.5 3.1E-07 4.19 (2.33-7.54)

Etapa 2 Stage 2

Valor de Value of

SNP SNP
Riesgo Controles Casos p OR (95% IC) Risk Controls Cases p OR (95% IC)

rsl0947803 rsl0947803
A 17.8 23.5 0.012 1.42 (1.08-2.12) TO 17.8 23.5 0.012 1.42 (1.08-2.12)

rs7956957 rs7956957
G 64.4 70.7 0.0415 1.33 (1.01-1. 76) G 64.4 70.7 0.0415 1.33 (1.01-1. 76)

rs2276109 rs2276109
G 9.7 14.0 0.0405 1.51 (1.02-2.25) G 9.7 14.0 0.0405 1.51 (1.02-2.25)

rsl0275136 rsl0275136
e 93.5 9 7. 6 0.0046 2.89 (1.34-6.20) and 93.5 9 7. 6 0.0046 2.89 (1.34-6.20)

rs310585 rs310585
A 44.9 55.4 0.0038 1.52 (1.14-2.03) TO 44.9 55.4 0.0038 1.52 (1.14-2.03)

rs5742912 rs5742912
T 93.8 9 7. 2 0.0127 2.31 (1.18-4.55) T 93.8 9 7. 2 0.0127 2.31 (1.18-4.55)

Total Total

Valor de Value of

SNP SNP
Riesgo Controles Casos p OR (95% IC) Risk Controls Cases p OR (95% IC)

rsl0947803 rsl0947803
A 17.8 24.2 0.003 1.48 (1.14-1.91) TO 17.8 24.2 0.003 1.48 (1.14-1.91)

rs7956957 rs7956957
G 63.7 70.3 0.0027 1.35 (1.11-1.64) G 63.7 70.3 0.0027 1.35 (1.11-1.64)

rs2276109 rs2276109
G 9.7 15.9 4.3E-05 1.76 (1.34-2.31) G 9.7 15.9 4.3E-05 1.76 (1.34-2.31)

rsl0275136 rsl0275136
e 93.5 97.4 0.0002 2.59 (1.55-4.34) and 93.5 97.4 0.0002 2.59 (1.55-4.34)

rs310585 rs310585
A 45.7 56.7 7.9E-06 1.56 (1.28-1.89) TO 45.7 56.7 7.9E-06 1.56 (1.28-1.89)

rs5742912 rs5742912
T 91.0 96.8 2.5E-07 3.05 (1.96-4.75) T 91.0 96.8 2.5E-07 3.05 (1.96-4.75)

Curiosamente, la combinación de seis SNPs mostró una 5 clara contribución al riesgo de ictus en comparación con el riesgo acumulado obtenido por los factores de riesgo Interestingly, the combination of six SNPs showed a clear 5 contribution to stroke risk compared to the cumulative risk obtained by risk factors.

clínicos convencionales, incluyendo edad, sexo, tabaquismo, hipertensión y diabetes, con áreas bajo la curva ROC de 0,687 (95% IC: 0,589-0,669) contra 0,629 (IC 95%: O, 649 a O. 725) (Figura 1). Además, el riesgo aumenta con el número de variantes genéticas que presenta el paciente (Figura 2), y el riesgo aumenta con la cantidad de marcadores genéticos y/o variable de riesgo clínicos presentes, aunque nadie en nuestra población presentaba más de 9 factores de riesgo (Figura 3) . Por último, se diseñó un modelo predictivo de riesgo para crear categorías de bajo a alto riesgo de ictus. Las seis variables clínicas y seis variantes genéticas replicadas se introdujeron en el modelo. Todas las variables son independientes unas de la otras. El test de Hosmer y Lemeshow mostró que nuestro modelo se adapta muy bien a los datos. Una puntuación de riesgo se asignó a cada variable y una escala de riesgo de 1 a 45 (Figura 4) se utilizó para clasificar a los sujetos en tres categorías. El riesgo de ictus fue definido como bajo (puntuación :<::; 18), moderado (19 <puntuación :<::; 26) o alto (26 <puntuación) (Figura 5). 2.2.2.-Análisis funcionales Conventional clinical trials, including age, sex, smoking, hypertension, and diabetes, with areas under the ROC curve of 0.687 (95% CI: 0.589-0.669) versus 0.629 (95% CI: O, 649 to O. 725) (Figure 1) . Furthermore, the risk increases with the number of genetic variants presented by the patient (Figure 2), and the risk increases with the number of genetic markers and / or clinical risk variable present, although no one in our population had more than 9 factors of risk (Figure 3). Finally, a predictive risk model was designed to create categories of low to high risk of stroke. The six clinical variables and six replicated genetic variants were entered into the model. All variables are independent of each other. The Hosmer and Lemeshow test showed that our model fits the data very well. A risk score was assigned to each variable and a risk scale of 1 to 45 (Figure 4) was used to classify the subjects into three categories. Stroke risk was defined as low (score: <::; 18), moderate (19 <score: <::; 26) or high (26 <score) (Figure 5). 2.2.2.-Functional analysis

La expresión génica de SCNN1A, medida en 26 controles sanos, reveló que los portadores de TT tenían niveles de ARNm significativamente superiores a los TC y ce (TT: 109 ± 40%, CT: 60 ± 28%, ce: 58 ± 25%, p o, 005) Sin embargo, la expresión génica de LRP1 se determinó en 18 controles sanos, pero ninguna asociación se observó entre el SNP rs7956957 y los niveles de ARNm (GG: 114 ± 73%, CG: 105 ± 60%, CC: 96 ± 47%, p = 0.578). Además, los niveles de ARNm del gen KCNK1 7 dependían de los alelos del SNP rs10947803 (p 0,021). Los portadores del alelo A presentan niveles más altos que los C (114 ± 35%, n = 5 vs 77 ± 38%, n 8). Por otra parte, la actividad de la proteína NOS3 determinada en 80 controles sanos reveló que los dos alelos de riesgo para ictus, los SNPs rs310585 y rs10275136, se asociaban a niveles menores de actividad de la proteína (A: 6,8 ± 2,0 mM, G: 8,0 ± 3,4 mM, p = 0,005 y SCNN1A gene expression, measured in 26 healthy controls, revealed that TT carriers had significantly higher mRNA levels than TC and ce (TT: 109 ± 40%, CT: 60 ± 28%, ce: 58 ± 25% , po, 005) However, LRP1 gene expression was determined in 18 healthy controls, but no association was observed between rs7956957 SNP and mRNA levels (GG: 114 ± 73%, CG: 105 ± 60%, CC : 96 ± 47%, p = 0.578). Furthermore, the KCNK1 7 gene mRNA levels were dependent on the rs10947803 SNP alleles (p 0.021). Carriers of the A allele show higher levels than C (114 ± 35%, n = 5 vs. 77 ± 38%, n 8). On the other hand, the activity of the NOS3 protein determined in 80 healthy controls revealed that the two alleles of risk for strokes, the SNPs rs310585 and rs10275136, were associated with lower levels of protein activity (A: 6.8 ± 2, 0mM, G: 8.0 ± 3.4mM, p = 0.005 and

C: 7,2 ± 2,7 mM, T: 8,8 ± 3,6 mM, p = 0,027). Por otro lado, la expresión génica del MMP12 no se pudo detectar en 12 controles sanos. Sin embargo, los niveles de proteína MMP12 se determinaron en 14 controles sanos por Luminex y solo pudimos detectar unos niveles muy bajos de MMP12 en 6 muestras, pero ninguna asociación con los genotipos del SNP rs2276109 (AA: 22,4 ± 13,3 años, AG: 18,1 ± 12, 8, AP: 11,6 pg 1 mg de proteína total, p = 0,704). Por último, el análisis por microarrays en 12 sujetos revelaron que los genotipos del SNP rs7956957 del gen LRP se asocian con la expresión de varios genes después de corrección por la tasa de descubrimiento falso (FDR) y el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) identificó varias redes asociadas a los genotipos del LRP. Notablemente, el alelo de riesgo del SNP rs7956957 (alelo G) se asoció con una menor expresión de genes implicados en procesos inflamatorios, C: 7.2 ± 2.7 mM, T: 8.8 ± 3.6 mM, p = 0.027). On the other hand, MMP12 gene expression could not be detected in 12 healthy controls. However, MMP12 protein levels were determined in 14 healthy controls by Luminex and we were only able to detect very low levels of MMP12 in 6 samples, but no association with rs2276109 SNP genotypes (AA: 22.4 ± 13.3 years , AG: 18.1 ± 12, 8, AP: 11.6 pg 1 mg total protein, p = 0.704). Finally, microarray analysis in 12 subjects revealed that LRP gene rs7956957 SNP genotypes are associated with the expression of several genes after correction for false discovery rate (FDR) and the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) program identified various networks associated with LRP genotypes. Notably, the SNP risk allele rs7956957 (allele G) was associated with a lower expression of genes involved in inflammatory processes,

tales such
como CLEC4C o los complementos 4A y 4B (C4A y C4B), how CLEC4C or the accessories 4A and 4B (C4A and C4B),

mientras While
que se asoció con un incremento de la expresión than I know associated with a increase of the expression

de of
genes implicados en apoptosis como ITGB3, ALOX12, NEK1 genes involved in apoptosis how ITGB3, ALOX12, NEK1

o GOS2. or GOS2.

2.3.-Discusión 2.3.-Discussion

En este estudio caso-control, los inventores analizaron la asociación de 221 SNPs funcionalmente relacionados con las enfermedades neurovasculares en una población mediterránea. Tras el análisis multivariante, ajustado por factores de riesgo convencionales, los inventores podrían replicar una asociación estadísticamente significativa entre seis SNPs In this case-control study, the inventors analyzed the association of 221 SNPs functionally related to neurovascular diseases in a Mediterranean population. After multivariate analysis, adjusted for conventional risk factors, the inventors could replicate a statistically significant association between six SNPs.

(rs10947803, rs7956957, rs2276109, rs10275136, rs310585 y rs5 7 42 912) y el riesgo de accidentes neurovasculares, o ictus. (rs10947803, rs7956957, rs2276109, rs10275136, rs310585 and rs5 7 42 912) and the risk of neurovascular accidents, or strokes.

El SNP rs5742912 del gen SCNNlA es un cambio de aminoácido importante al nivel estructural de la proteína se trata de un cambio triptófano por arginina The SNP rs5742912 of the SCNNlA gene is an important amino acid change at the structural level of the protein, it is a tryptophan change by arginine

(Trp493~Arg), cambiando un aminoácido cíclico no polar por un aminoácido de carga positiva. El gen codifica una subunidad de la proteína ENaC, un canal de sodio que está (Trp493 ~ Arg), exchanging a non-polar cyclic amino acid for a positively charged amino acid. The gene encodes a subunit of the ENaC protein, a sodium channel that is

presente Present
en las células epiteliales, junto con otras dos in the cells epithelial, together with others two

subunidades, subunits,
SCNN1B y SCNN1G [15] El papel de esta SCNN1B and SCNN1G [fifteen] The paper of this

proteína protein
en la homeostasis del sodio, osmolaridad in the homeostasis of the sodium, osmolarity

plasmática y la regulación de la presión arterial lo ha convertido en un candidato ideal para estudiar el desarrollo de enfermedades complejas como el ictus, el infarto de miocardio o la insuficiencia renal [16] . De hecho, el eNaC es importante por el paso limitante en la velocidad de reabsorción de sodio y es sensible al amiloride, un diurético que puede bloquear el canal de sodio e inhibe su asimilación, utilizado en el tratamiento de la hipertensión e insuficiencia cardíaca congestiva [17]. A nivel genético, el SNP rs5742912 de SCNN1A se ha asociado con el ictus isquémico [11]. En nuestro estudio, la asociación resistió corrección de Bonferroni y alcanzó un valor de p de 2. SE-O 7 y un OR de 3, 59, valores muy bajos para un estudio de genes candidatos. Los inventores también demuestran aquí por primera vez que este SNP está asociado a niveles de ARNm del gen SCNN1A, y los portadores del alelo de riesgo T mostraron niveles significativamente más elevados que los portadores del alelo C. Al ser un SNP no sinónimo, esperamos que pudiera afectar a la actividad de la proteína además del ARNm, sobre todo porque el SNP se encuentra en el dominio extracelular, donde se unen diferentes ligandos y el amiloride. Estos resultados son consistentes con otros estudios que muestran que otras variantes de la subunidad a se asocian con aumentos de actividad de esta proteína en células epiteliales humanas [18]. Los inventores Plasma and blood pressure regulation has made it an ideal candidate to study the development of complex diseases such as stroke, myocardial infarction, or renal failure [16]. In fact, eNaC is important for the limiting step in the rate of sodium reabsorption and is sensitive to amiloride, a diuretic that can block the sodium channel and inhibit its assimilation, used in the treatment of hypertension and congestive heart failure [ 17]. At the genetic level, the SNP rs5742912 from SCNN1A has been associated with ischemic stroke [11]. In our study, the association resisted Bonferroni correction and reached a p-value of 2. SE-O 7 and an OR of 3.59, very low values for a study of candidate genes. The inventors also demonstrate here for the first time that this SNP is associated with SCNN1A gene mRNA levels, and carriers of the risk T allele showed significantly higher levels than carriers of the C allele. Being a non-synonymous SNP, we expect that it could affect the activity of the protein in addition to the mRNA, especially since the SNP is in the extracellular domain, where different ligands and amiloride bind. These results are consistent with other studies showing that other variants of the a subunit are associated with increases in activity of this protein in human epithelial cells [18]. Inventors

observaron niveles mayores de ARNm asociados con el alelo de riesgo T, que es también el alelo más común. El gen SCNN1A se encuentra en el cromosoma 12p13, donde un GWAS mostró recientemente una asociación robusta con el locus genético del gen NINJ2 y el ictus, lo que indica que esta región podría ser de hecho una región importante de susceptibilidad para sufrir un accidente cerebrovascular observed higher levels of mRNA associated with the risk T allele, which is also the most common allele. The SCNN1A gene is found on chromosome 12p13, where a GWAS recently showed a robust association with the genetic locus of the NINJ2 gene and stroke, indicating that this region could indeed be a major region of susceptibility to stroke.

[5]. [5].

Otro SNP localizado en el cromosoma 12 se asoció con ictus isquémico en nuestro estudio. De hecho, el alelo G del rs7956957 del gen LRP1 en el locus 12q13 fue identificado como factor de riesgo en todas las etapas de nuestro estudio y en todas las etiologías de ictus, aunque no se asoció a los niveles de ARNm. El SNP está en ligamiento con muchos otros SNPs del gen, aunque el único SNP funcional descrito (C766T o rs1799986) se encuentra en otra región diferente del gen, compuesto de 8 9 exones, y no está en desequilibrio de ligamiento con el SNP rs7956957. Nada se sabe sobre este SNP (rs7956957), se trata de un SNP intrónico que se seleccionó en este estudio como un Taq-SNP para LRP1. El efecto del rs7956957 en ictus se examinó también mediante microarrays e Another SNP located on chromosome 12 was associated with ischemic stroke in our study. In fact, the G allele of rs7956957 of the LRP1 gene at the 12q13 locus was identified as a risk factor in all the stages of our study and in all the etiologies of stroke, although it was not associated with mRNA levels. The SNP is in linkage with many other SNPs in the gene, although the only functional SNP described (C766T or rs1799986) is located in a different region of the gene, composed of 8 9 exons, and is not in linkage disequilibrium with the SNP rs7956957. Nothing is known about this SNP (rs7956957), it is an intronic SNP that was selected in this study as a Taq-SNP for LRP1. The effect of rs7956957 on stroke was also examined using microarrays and

identificamos we identify
varios genes interesantes asociados a los various genes interesting associates to the

genotipos genotypes
del rs7956957 como ALOX12, ITGB3, MPL, C4a y of the rs7956957 how ALOX12, ITGB3, MPL, C4a and

C4b. C4b.
Una representación combinada de las dos redes A representation combined of the two nets

principales identificadas por el software IPA reveló que los genes implicados podrían tener un papel importante en los procesos biológicos de apoptosis, señalización celular, muerte celular e inflamación. La fusión de estas redes indica también que algunos genes como el LDL, NFKB, CDKN1A, y p38-MAPK podrían ser reguladores importantes de estas redes. El mecanismo del efecto del rs7956957 en el ictus isquémico todavía no está claro pero podría ser debido a una modulación de la actividad de la proteína ya que no afecta a la expresión de ARNm del LRP1, aunque los Major identified by the IPA software revealed that the genes involved could play an important role in the biological processes of apoptosis, cell signaling, cell death and inflammation. The fusion of these networks also indicates that some genes such as LDL, NFKB, CDKN1A, and p38-MAPK could be important regulators of these networks. The mechanism of the effect of rs7956957 in ischemic stroke is still unclear but it could be due to a modulation of the activity of the protein since it does not affect the expression of LRP1 mRNA, although the

resultactos indicaron que los casos de ictus presentaban niveles significativamente más bajos de ARNm que los controles sanos. The results indicated that the stroke cases had significantly lower levels of mRNA than the healthy controls.

Otros dos genes que han sido identificados en nuestro estudio, MMP12 y NOS3, están involucrados en procesos de inflamación. La proteína MMP12 se ha relacionado con accidente cerebrovascular isquémico, gracias a su papel en la estabilidad de la placa aterosclerótica, mientras que el gen MMP12, localizado en el cromosoma 11q22 se ha relacionado con la enfermedad coronaria y el ictus hemorrágico [21-22]. El SNP rs2276109 se asoció con accidente cerebrovascular isquémico en nuestra cohorte. Es una sustitución de A por G en la región promotora del gen, y se ha demostrado ser funcional, al influir en la capacidad de unión del factor de transcripción AP -1 en ensayos de electromobilidad [23]. El alelo A se asocia con una mayor actividad del promotor de MMP12 in vitro en los estudios de transfección transitoria, y se asocia con un menor riesgo de ictus isquémico en nuestro estudio. Por tanto, parece que una disminución de actividad del promotor de MMP12, a través del alelo G del SNP rs2276109, podría estar asociada con un mayor riesgo de ictus. La expresión génica y los niveles de proteína de MMP12 se midieron en controles sanos, con el fin de entender mejor la contribución de la variante rs2276109, pero los niveles de ARNm y proteínas eran apenas perceptibles e insuficientes para sacar conclusiones. Se utilizaron muestras de sangre, mientras que la MMP12 se manifiesta, principalmente, en macrófagos activados y células del estroma, lo que podría explicar por qué no se detectó. Two other genes that have been identified in our study, MMP12 and NOS3, are involved in inflammation processes. The MMP12 protein has been linked to ischemic stroke, thanks to its role in the stability of atherosclerotic plaque, while the MMP12 gene, located on chromosome 11q22, has been linked to coronary heart disease and hemorrhagic stroke [21-22] . SNP rs2276109 was associated with ischemic stroke in our cohort. It is a substitution of A for G in the promoter region of the gene, and has been shown to be functional, influencing the binding capacity of transcription factor AP -1 in electromobility assays [23]. The A allele is associated with increased MMP12 promoter activity in vitro in transient transfection studies, and is associated with a lower risk of ischemic stroke in our study. Therefore, it seems that a decrease in MMP12 promoter activity, through the G allele of the SNP rs2276109, could be associated with an increased risk of stroke. Gene expression and MMP12 protein levels were measured in healthy controls, in order to better understand the contribution of the rs2276109 variant, but mRNA and protein levels were barely noticeable and insufficient to draw conclusions. Blood samples were used, while MMP12 manifests itself mainly in activated macrophages and stromal cells, which could explain why it was not detected.

El NOS3, en el cromosoma 7q36, también se asoció con ictus en este estudio. De hecho, se observó una asociación de dos SNPs en este gen, rs10275136 y rs310585, este último llegando a valores de p de 7. 9E-06. Ambas asociaciones resistieron la corrección de Bonferroni. NOS3, on chromosome 7q36, was also associated with stroke in this study. In fact, an association of two SNPs was observed in this gene, rs10275136 and rs310585, the latter reaching p values of 7. 9E-06. Both associations resisted the Bonferroni correction.

Estos 2 SNPs no están en desequilibrio de ligamiento y, These 2 SNPs are not in linkage disequilibrium and,

por tanto son independientes entre ellos y se ubican en la therefore they are independent of each other and are located in the

región 5 'del NOS3. Se seleccionaron para este estudio 5 'region of NOS3. They were selected for this study

como Tag SNPs y su función es desconocida. La proteína like Tag SNPs and their function is unknown. The protein

5 5
NOS3, también conocida como eNOS o cNOS participa en NOS3, also known as eNOS or cNOS participates in

muchos procesos biológicos, incluyendo la hipertensión y many biological processes, including hypertension and

los espasmos coronarios [ 2 4 J . Cataliza la generación de coronary spasms [2 4 J. It catalyzes the generation of

óxido nítrico en los vasos sanguíneos a partir de L-nitric oxide in blood vessels from L-

arginina, y es particularmente importante en la arginine, and is particularly important in

10 10
señalización celular y la regulación de la función cell signaling and regulation of function

vascular [25]. A nivel genético, algunos polimorfismos en vascular [25]. At the genetic level, some polymorphisms in

este gen se han asociado con ictus, infarto de miocardio, this gene has been associated with stroke, myocardial infarction,

hipertensión y cardiopatía coronaria [26] . Curiosamente, hypertension and coronary heart disease [26]. Curiously,

mientras que los 3 otros SNP se asociaron con todos los while the 3 other SNPs were associated with all

15 fifteen
subtipos de ictus isquémico, estas dos variantes son ischemic stroke subtypes, these two variants are

específicas de la etiología cardioembólica, lo que indica specific to cardioembolic etiology, indicating

que podrían estar asociados con otros trastornos which could be associated with other disorders

cardiovasculares. Por otra parte, los dos alelos de riesgo cardiovascular. Furthermore, the two risk alleles

se asociaron con una menor actividad de la proteína NOS3 y were associated with decreased activity of the NOS3 protein and

2O 2O
los casos de ictus presentaron niveles más bajos que los Stroke cases had lower levels than those

controles sanos, lo que indica que niveles bajos de NOS3 healthy controls, indicating that low NOS3 levels

podrían ser factores de riesgo para ictus. De hecho, esta They could be risk factors for strokes. In fact, this

hipótesis esta en concordancia con estudios anteriores que hypothesis is in agreement with previous studies that

muestran que NOS3 es un regulador importante del f 1 uj o show that NOS3 is an important regulator of f 1 uj o

25 25
sanguíneo cerebral, especialmente durante la isquemia cerebral blood, especially during ischemia

cerebral, donde se ha demostrado que presenta efectos brain, where it has been shown to have effects

neuroprotectores a través de una perfusión mejor y un neuroprotective through better perfusion and

tamaño de ictus menor [27-28]. smaller stroke size [27-28].

El alelo A del SNP rs10947803 del gen KCNK17 se The A allele of SNP rs10947803 of the KCNK17 gene is

30 30
asoció independientemente con ictus isquémico en este independently associated with ischemic stroke in this

estudio con una OR de 1,47 (p = 0,010) Poco se sabe sobre study with an OR of 1.47 (p = 0.010) Little is known about

el gen KCNK17, pero se expresa ampliamente, sobre todo en the KCNK17 gene, but it is widely expressed, especially in

hígado, pulmón, placenta, páncreas, intestino y aorta liver, lung, placenta, pancreas, intestine, and aorta

[ 2 9] . Niveles altos de mRNA del gen KCNK1 7 se asociaron [2 9]. High levels of KCNK1 7 gene mRNA were associated

35 35
con un mayor riesgo de ictus isquémico. El mecanismo de with an increased risk of ischemic stroke. The mechanism of

esta asociación se desconoce y el SNP es intrónico y por lo tanto no pertenece a la región promotora del gen. La proteína codificada por el gen KCNK17 es un miembro de la superfamilia de canales de K+ [29-30]. Estos canales 5 regulan los flujos celulares de iones y en consecuencia el volumen celular, así como la acidosis metabólica y la hipotensión provocada por la secreción de HC0-3 [31-34] y teniendo en cuenta su función y su localización en muchos tejidos, podría desempeñar un papel importante en el this association is unknown and the SNP is intronic and therefore does not belong to the promoter region of the gene. The protein encoded by the KCNK17 gene is a member of the K + channel superfamily [29-30]. These channels 5 regulate cellular ion fluxes and consequently cell volume, as well as metabolic acidosis and hypotension caused by HC0-3 secretion [31-34] and taking into account their function and location in many tissues, could play an important role in

10 ictus, siendo un disparador principal común a todos los subtipos de ictus. En resumen, se observó que seis SNPs fueron factores de riesgo independientes de ictus en la población española. Cuatro de estos SNPs, en los genes KCNK17, 10 strokes, being a main trigger common to all stroke subtypes. In summary, it was observed that six SNPs were independent risk factors for stroke in the Spanish population. Four of these SNPs, in the KCNK17 genes,

15 SCNN1A y NOS3, mostraron una clara influencia sobre la función del gen o la proteína correspondiente, y un SNP en el gen MMP12 tenía también un efecto claro como se describe en otro estudio [23]. A continuación se evaluó la asociación acumulada de 15 SCNN1A and NOS3 showed a clear influence on the function of the corresponding gene or protein, and a SNP in the MMP12 gene also had a clear effect as described in another study [23]. The cumulative association of

20 twenty
estas variantes. El principal objetivo era establecer si these variants. The principal objective was establish yes

la the
combinación de al menos dos de estos SNP, combination of to the less two of these SNP,

preferiblemente preferably
tres SNP, mejor cuatro SNPs, todavía mejor three SNP, best four SNPs, even better

cinco five
SNP, y el óptimo seis SNPs, podría predecir el SNP, and the optimum six SNPs, could predict the

riesgo risk
de accidente cerebrovascular mejor que cada SNP de of accident cerebrovascular best than every SNP of

25 25
forma individual, y si los inventores podrían mejorar la shape individual, and yes the inventors could to get better the

discriminación discrimination
entre los sujetos de riesgo, en combinación between the subjects of risk, in combination

con with
factores de riesgo clásicos, en contraste con los factors of risk classics, in contrast  with the

factores factors
de riesgo clásicos solos. Los resultados de este of risk classics alone. The results of this

análisis analysis
mostraron que el riesgo aumentó gradualmente con they showed than the risk increase gradually with

3O 3O
el número de alelos del riesgo portados. De hecho, la the number of alleles of the risk carriers. Of done, the

asociación association
acumulada de los seis SNPs tenía un valor de accumulated of the six SNPs had a value of

predicción positiva positive prediction
superior a la adición del OR de cada higher to the addition of the OR of every

SNP SNP
de forma individual. Los portadores de todos los of shape individual. The carriers of everybody the

alelos alleles
de susceptibilidad presentaban un riesgo de ictus of susceptibility presented a risk of ictus

35 35
de casi el 100% comparándolo con controles sanos. Por otra of almost the 100% comparing it with controls healthy. By other

parte, la contribución de la información genética con factores de riesgo clásicos era significante, como se indica en la gráfica de las curvas ROC con los factores clínicos o clínicos y genéticos, así que los inventores asignaron una puntuación a cada SNP y cada factor de riesgo convencional, en función de su efecto sobre el ictus. El modelo predictivo obtenido finalmente permito la In addition, the contribution of genetic information with classic risk factors was significant, as indicated in the graph of the ROC curves with clinical or clinical and genetic factors, so the inventors assigned a score to each SNP and each risk factor. conventional, depending on its effect on stroke. The predictive model finally obtained allows the

distinción distinction
de varias categorías de riesgo ictus, para of several categories of risk ictus, for

clasificar sort out
a los sujetos en categorías de riesgo bajo, to the subjects in categories of risk low,

moderado moderate
o alto. Los inventores creen que este modelo or high. The inventors believe than this model

podría could
ser un instrumento importante en medicina to be a instrument important in medicine

preventiva, ya que el ictus supone una carga enorme para el sistema de salud y sobre todo para los pacientes. Ellos podrían beneficiarse de una prevención primaria individualizada y específica. De hecho, la combinación de SNPs presentada aquí podría aportar información clínica nueva e importante por lo menos al mismo nivel que factores de riesgo clásicos como la hipertensión, el tabaquismo o la diabetes. Los resultados obtenidos en este estudio permitirán clasificar mejor los individuos que presentan un riesgo moderado basado en factores clínicos, y que podrían realmente pertenecer al grupo de alto riesgo según este modelo de combinación genética y clínica. preventive, since strokes place a huge burden on the health system and especially on patients. They could benefit from specific and individualized primary prevention. In fact, the combination of SNPs presented here could provide important new clinical information at least at the same level as classic risk factors such as hypertension, smoking or diabetes. The results obtained in this study will allow a better classification of individuals who present a moderate risk based on clinical factors, and who could really belong to the high risk group according to this model of genetic and clinical combination.

En este estudio, los inventores encontraron sorprendentemente que a partir de una combinación de al menos dos de los SNPs descritos anteriormente, la predicción del riesgo medido era mejor que cualquier herramienta de predicción descrita en la literatura, y los inventores fueron capaces de prever que el riesgo de sufrir un ictus aumentaba con el número de SNPs portados, como se muestra en la tabla adyacente. En otras palabras, la combinación de dos de los SNPs mencionados indicaba un riesgo individual de accidente cerebrovascular de al menos 3,417 veces más alto que una persona que, en las mismas condiciones ambientales, no presenta ninguno de In this study, the inventors surprisingly found that from a combination of at least two of the SNPs described above, predicting the measured risk was better than any prediction tool described in the literature, and the inventors were able to predict that the Risk of having a stroke increased with the number of SNPs carried, as shown in the adjacent table. In other words, the combination of two of the mentioned SNPs indicated an individual risk of stroke of at least 3,417 times higher than a person who, under the same environmental conditions, does not present any of

estos SNPs. Como se muestra en la tabla, esta relación aumenta de manera dramática a medida que aumenta el número de SNPs, no sólo a través de un efecto sumatorio, sino a través de un efecto multiplicador, el modelo es óptimo 5 cuando el número de SNPs es de seis. La combinación de al menos dos SNPs es entonces un buen modelo para predecir el riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular, pero la combinaciones de tres, cuatro o cinco SNPs es cada vez mejor hasta seis SNPs que es la combinación óptima these SNPs. As shown in the table, this relationship increases dramatically as the number of SNPs increases, not only through a summation effect, but through a multiplier effect, the model is optimal 5 when the number of SNPs is six. The combination of at least two SNPs is therefore a good model to predict the risk of having a stroke, but the combination of three, four or five SNPs is getting better up to six SNPs which is the optimal combination

10 de predecir el riesgo de accidente cerebrovascular. 10 to predict the risk of stroke.

Tabla 3. Combinaciones de SNPs significativamente asociados a ictus Table 3. Combinations of SNPs Significantly Associated with Strokes.

Numero de SNPs Number of SNPs
OR 95% IC OR 95% CI

1 one
1 one
- -

2 2
3.417 0.670-17.426 3,417 0.670-17.426

3 3
6.159 1.261-30.089 6,159 1,261-30,089

4 4
10.26 2.095-50.326 10.26 2,095-50,326

5+ 5+
26.056 4.672-145.308 26,056 4,672-145,308

15 fifteen

Métodos Methods
y kits para su aplicación and kits for its application

La The
presente invención se refiere también a un método Present invention I know refers too to a method

para for
la determinación de la predisposición genética a the determination of the predisposition genetics to

2 O 2 O
enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un diseases neurovascular, in particular ictus, in a

individuo, individual,
que comprende la detección de los alelos de al than understands the detection of the alleles of to the

menos less
dos SNPs seleccionados del grupo que consiste en two SNPs selected of the group than consists in

rs2276109, rs2276109,
rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and

rs10947803 rs10947803
en un una muestra de ácido nucleico aislado de in a a shows of acid nucleic isolated of

25 25
un individuo. a individual.

En In
una realización preferida, dicho método se utiliza a preferred embodiment, saying method I know uses

para for
determinar la predisposición genética a enfermedades decide the genetic predisposition to diseases

neurovasculares, neurovascular,
en particular ictus, en un individuo y in particular ictus, in a individual and

comprende la detección de los alelos de tres SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo. it comprises the detection of the alleles of three SNPs selected from the group consisting of rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and rs10947803 in a nucleic acid sample isolated from an individual.

En una realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo y comprende la detección de los alelos de cuatro SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo. In a more preferred embodiment, said method is used to determine the genetic predisposition to neurovascular diseases, in particular strokes, in an individual and comprises the detection of the alleles of four SNPs selected from the group consisting of rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and rs10947803 in a nucleic acid sample isolated from an individual.

En una realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo y comprende la detección de los alelos de cinco SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo. In a more preferred embodiment, said method is used to determine the genetic predisposition to neurovascular diseases, in particular strokes, in an individual and comprises the detection of the alleles of five SNPs selected from the group consisting of rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and rs10947803 in a nucleic acid sample isolated from an individual.

En la realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo que comprende la detección de los alelos de los seis SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs1094 7803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo. In the most preferred embodiment, said method is used to determine the genetic predisposition to neurovascular diseases, in particular strokes, in an individual that comprises the detection of the alleles of the six SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 and rs1094 7803 in a nucleic acid sample isolated from an individual.

En una realización particular, los alelos detectados In a particular embodiment, the detected alleles

de of
acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores agreement with anyone  of the realizations previous

serían would
un alelo G de rs7956957, A de rs310585, G de a allele G of rs7956957, TO of rs310585, G of

r s 2 2 7 61 O 9, r s 2 2 7 61 O 9,
e de r s 1 O 2 7 513 6, T de r s 57 4 2 912 y A de and of r s 1 O 2 7 513 6, T of r s 57 4 2 912 and TO of

rs1094 7803. rs1094 7803.

La muestra de ácido nucleico aislado del individuo utilizada en cualquiuera de las realizaciones del método de la presente invención puede comprender ADN o ARN. Por otra parte, dicha muestra de ácido nucleico puede ser amplificada, generalmente por una reacción en cadena de la The nucleic acid sample isolated from the individual used in any of the embodiments of the method of the present invention may comprise DNA or RNA. On the other hand, said nucleic acid sample can be amplified, generally by a chain reaction of the

polimerasa (PCR), de la forma establecida en la técnica. polymerase (PCR), in the manner established in the art.

La detección de los SNP puede realizarse mediante SNP detection can be done by

cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por any of the methods known in the art, for

ejemplo sin limitarse a éstos, mediante hibridación de una example without limiting them, by hybridizing a

5 5
sonda de ácido nucleico o de oligonucleótidos, o mediante nucleic acid or oligonucleotide probe, or by

marcadores radiactivos, enzimáticos, luminosos o radioactive, enzymatic, luminous or

fluorescentes [35: pagina 4183 y 36: páginas 246-247]. fluorescent [35: page 4183 and 36: pages 246-247].

Dicha sonda o secuencia de oligonucleótido comprende Said oligonucleotide probe or sequence comprises

una secuencia que es totalmente complementaria a una a sequence that is completely complementary to a

1O 1O
secuencia de ácido nucleico que comprende los SNPs nucleic acid sequence comprising the SNPs

divulgada en la presente invención (SEC ID N o 1 a SEC ID disclosed in the present invention (SEQ ID No. 1 to SEQ ID

N ° 6). No. 6).

En una realización preferida, la presente invención In a preferred embodiment, the present invention

se refiere al método según cualquiera de las refers to the method according to any of the

15 fifteen
realizaciones descritas anteriormente en el que por lo embodiments described above in which

menos dos, tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con minus two, three, four, five or six SNPs are combined with

una o más variables clínicas asociadas con una enfermedad one or more clinical variables associated with a disease

neurovascular, en particular ictus. neurovascular, in particular stroke.

Preferentemente, dichas variables clínicas se Preferably, said clinical variables are

20 twenty
seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, they select between age, sex, smoking, hypertension,

diabetes y dislipidemia. diabetes and dyslipidemia.

En una realización particular, la presente invención In a particular embodiment, the present invention

se refiere al método según cualquiera de las realizaciones refers to the method according to any of the embodiments

descritas anteriormente en el que los alelos de dichos described above in which the alleles of said

25 25
SNPs se deducen mediante pruebas genéticas. SNPs are deduced using genetic tests.

En otra realización, la presente invención se refiere In another embodiment, the present invention relates

al método según cualquiera de las realizaciones descritas to the method according to any of the described embodiments

anteriormente en el que los alelos de dichos SNPs se above in which the alleles of said SNPs were

deducen de los niveles de actividad o concentración de las infer from activity levels or concentration of

30 30
proteínas, o de los correspondientes niveles de expresión proteins, or the corresponding levels of expression

de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK1 7, MMP12 y/o LRP, que son of RNA from NOS3, SCNN1A, KCNK1 7, MMP12 and / or LRP, which are

modulados por la presencia de los marcadores genéticos, modulated by the presence of genetic markers,

tal como se muestra en la sección de resultados. as shown in the results section.

En una realización particular, la presente invención In a particular embodiment, the present invention

35 35
se refiere al método según cualquiera de las realizaciones refers to the method according to any of the embodiments

descritas anteriormente en el que dichos al menos dos, described above in which said at least two,

tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con los SNPs three, four, five or six SNPs are combined with the SNPs

rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343,

rs6007897, rs4044210 y rs2200733. rs6007897, rs4044210 and rs2200733.

5 5
En una realización particular, la presente invención In a particular embodiment, the present invention

se refiere al método según cualquiera de las realizaciones refers to the method according to any of the embodiments

descritas anteriormente, que comprende además la described above, which further comprises the

comparación de la combinación de alelos obtenida para un comparison of the combination of alleles obtained for a

individuo con la combinación de alelos obtenida para otro individual with the combination of alleles obtained for another

1 O 1 O
individuo afectado por una enfermedad neurovascular, en individual affected by neurovascular disease, in

particular ictus, y la detección de la predisposición particular stroke, and the detection of predisposition

genética a una enfermedad neurovascular, en particular genetics to neurovascular disease, in particular

ictus, si el individuo a ser analizado presenta la misma stroke, if the individual to be analyzed presents the same

carga genética que el individuo afectado. En una genetic load than the affected individual. In a

15 fifteen
realización más preferida, dicho otro individuo tiene una more preferred embodiment, said other individual has a

relación familiar con el individuo a analizar. family relationship with the individual to be analyzed.

Preferentemente, en todas las realizaciones del Preferably, in all the embodiments of the

método anteriores dicha enfermedad neurovascular es el previous method said neurovascular disease is the

ictus. ictus.

20 twenty
En una realización particular, el método según In a particular embodiment, the method according

cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente any of the embodiments described above

para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una to determine an individual's risk of suffering a

enfermedad neurovascular, preferentemente ictus, se aplica neurovascular disease, preferably stroke, is applied

a un individuo perteneciente a la población mediterránea. to an individual belonging to the Mediterranean population.

25 25
En una realización más particular, dicho individuo In a more particular embodiment, said individual

pertenece a la población española. It belongs to the Spanish population.

La presente invención se refiere además un kit para The present invention further relates to a kit for

determinar el riesgo de un individuo de sufrir una determine an individual's risk of suffering a

30 30
enfermedad neurovascular, en particular ictus, que neurovascular disease, in particular stroke, which

comprende: understands:

(A) Dos o más sondas que permiten detectar los alelos de (A) Two or more probes that allow the alleles of

los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957,

rs10947803 y rs5742912. rs10947803 and rs5742912.

35 35
(B) Instrucciones para usar el kit y determinar el riesgo (B) Instructions for using the kit and determining the risk

de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en of an individual suffering from neurovascular disease, in

particular ictus, teniendo en cuenta la combinación de particular stroke, taking into account the combination of

SNPs presentada. SNPs filed.

En una realización preferida, se detectan dos SNPs In a preferred embodiment, two SNPs are detected

5 5
asociados a una enfermedad neurovascular, en particular associated with neurovascular disease, in particular

ictus. ictus.

En una realización preferida, se detectan tres SNPs In a preferred embodiment, three SNPs are detected

asociados a una enfermedad neurovascular, en particular associated with neurovascular disease, in particular

ictus. ictus.

10 10
En una realización más preferida, se detectan cuatro In a more preferred embodiment, four are detected

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en SNPs associated with neurovascular disease, in

particular ictus. particular stroke.

En una realización más preferida, se detectan cinco In a more preferred embodiment, five are detected

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en SNPs associated with neurovascular disease, in

15 fifteen
particular ictus. particular stroke.

En la realización más preferidq se detectan los seis In the most preferred embodiment all six are detected

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en SNPs associated with neurovascular disease, in

particular ictus. particular stroke.

Dichas dos o más sondas del kit pueden marcarse. De These two or more probes in the kit can be marked. Of

2 O 2 O
manera opcional, el kit puede comprender reactivos tales optionally, the kit may comprise such reagents

como soluciones de dilución, tampones de reacción, enzimas such as dilution solutions, reaction buffers, enzymes

de polimerización y/o oligonucleótidos (cebadores). Al polymerization and / or oligonucleotides (primers). To the

utilizar sondas marcadas radioactivamente, la hibridación use radioactively labeled probes, hybridization

puede ser detectada por autorradiografía, centelleo, can be detected by autoradiography, scintillation,

25 25
contador o contador gamma. counter or gamma counter.

En ciertas realizaciones del kit, éste puede In certain kit embodiments, the kit may

comprender además oligonucleótidos (cebadores) para la further comprise oligonucleotides (primers) for

amplificación o secuenciación y estos pueden ser amplification or sequencing and these can be

específicos de las secuencias SEC ID N o 1 a 6. specific for sequences SEQ ID NOS 1 to 6.

30 30
El kit también puede comprender también reactivos The kit may also comprise reagents

para el marcaje de uno o más de los oligonucleótidos for the labeling of one or more of the oligonucleotides

específicos de secuencia, o puede comprender sequence specific, or you can understand

oligonucleótidos marcados específicos de secuencia. Los sequence specific labeled oligonucleotides. The

marcadores útiles incluyen radioisótopos, así como grupos Useful markers include radioisotopes as well as groups

35 35
no radioactivos. Los marcadores isotópicos incluyen 3 H, non-radioactive. Isotopic markers include 3H,

35 s, 32p, 125 I, 57Co y 14C. Los marcadores isotópicos pueden 35 s, 32p, 125 I, 57Co and 14C. Isotopic markers can

ser introducidos en el oligonucleótido mediante técnicas be introduced into the oligonucleotide by techniques

descritas en la literatura. Los marcadores no isotópicos described in the literature. Non-isotopic markers

pueden ser fluorescentes, de quimioluminiscencia, enzimas, they can be fluorescent, chemiluminescent, enzymes,

5 5
cofactores, sustratos de la enzima, haptenos u otros cofactors, enzyme substrates, haptens or others

ligandos. ligands.

En una realización preferida, la presente invención In a preferred embodiment, the present invention

se refiere al kit según cualquiera de las realizaciones refers to the kit according to any of the embodiments

descritas anteriormente en el que dichos por lo menos dos, described above in which said at least two,

10 10
tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con una o más three, four, five or six SNPs are combined with one or more

variables clínicas asociadas con una enfermedad clinical variables associated with a disease

neurovascular, en particular ictus. Preferentemente, neurovascular, in particular stroke. Preferably,

dichas variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo, These clinical variables are selected between age, sex,

tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia. smoking, hypertension, diabetes and dyslipidemia.

15 fifteen
En una realización particular, en el kit de acuerdo In a particular embodiment, in the kit according

con las realizaciones anteriores, los alelos de dichos with the previous embodiments, the alleles of said

SNPs se deducen mediante pruebas genéticas de otros SNPs are deduced by genetic testing of others

marcadores o midiendo los niveles de actividad o markers or measuring activity levels or

concentración de las proteínas, o los correspondientes protein concentration, or the corresponding

20 twenty
niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNNlA, KCNK17, MMP12 expression levels of NOS3, SCNNlA, KCNK17, MMP12 RNA

y/o LRP. and / or LRP.

Preferentemente, en todas las realizaciones Preferably, in all embodiments

anteriores del kit, la enfermedad neurovascular es el earlier in the kit, neurovascular disease is the

ictus. ictus.

25 25
En una realización particular, dicho kit para In a particular embodiment, said kit for

determinar el riesgo individual de un individuo de sufrir determine an individual's individual risk of suffering

una enfermedad neurovascular, preferiblemente ictus, se a neurovascular disease, preferably stroke, is

aplica a un individuo perteneciente a la población applies to an individual belonging to the population

mediterránea. Mediterranean.

3O 3O
En una realización más particular, dicho individuo In a more particular embodiment, said individual

pertenece a la población española. It belongs to the Spanish population.

La presente invención se refiere además a la The present invention further relates to the

utilización de la combinación de al menos dos SNPs use of the combination of at least two SNPs

seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, selected from SNPs rs2276109, rs10275136,

35 35
rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912 y todas las rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912 and all

realizaciones de la combinación descritas en la presente combination embodiments described herein

invención en un kit para determinar el riesgo de un invention in a kit to determine the risk of a

individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, individual suffering from neurovascular disease,

preferiblemente el ictus. preferably the stroke.

5 5
En una realización particular, dicho uso se aplica a In a particular embodiment, said use is applied to

un individuo perteneciente a la población mediterránea. an individual belonging to the Mediterranean population.

En una realización más particular, dicho individuo In a more particular embodiment, said individual

pertenece a la población española. It belongs to the Spanish population.

La presente invención se refiere además a la The present invention further relates to the

10 10
utilización de la combinación de al menos dos SNPs use of the combination of at least two SNPs

seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, selected from SNPs rs2276109, rs10275136,

rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos rs310585, rs7956957, rs10947803 and rs5742912, indicative

del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad of an individual's risk of disease

neurovascular, preferiblemente el ictus, y todas las neurovascular, preferably stroke, and all

15 fifteen
realizaciones de la combinación descritas en la presente combination embodiments described herein

invención como una herramienta de prueba genética para una invention as a genetic testing tool for a

enfermedad neurovascular, preferiblemente el ictus. neurovascular disease, preferably stroke.

En una realización particular, dicho uso se aplica a In a particular embodiment, said use is applied to

un individuo perteneciente a la población mediterránea. an individual belonging to the Mediterranean population.

2 O 2 O
En una realización más particular, dicho individuo In a more particular embodiment, said individual

pertenece a la población española. It belongs to the Spanish population.
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Hofman A, DeCarli C, Heckbert SR, Koudstaal PJ, Yang Q, Hofman A, DeCarli C, Heckbert SR, Koudstaal PJ, Yang Q,

Smith NL, Kase CS, Rice K, Hari tunians T, Roks G, de Smith NL, Kase CS, Rice K, Hari tunians T, Roks G, de

Kort PL, Taylor KD, de Lau LM, Oostra BA, Uitterlinden Kort PL, Taylor KD, de Lau LM, Oostra BA, Uitterlinden

AG, Rotter JI, Boerwinkle E, Psaty BM, Mosley TH, van AG, Rotter JI, Boerwinkle E, Psaty BM, Mosley TH, van

Dui j n CM, Breteler MM, Longstreth WT, Jr., Wolf PA. Dui j n CM, Breteler MM, Longstreth WT, Jr., Wolf PA.

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Benjamin EJ, Rice KM, Arking DE, Pfeufer A, van Noord C, Smith AV, Schnabel RB, Bis JC, Boerwinkle E, Sinner MF, Dehghan A, Lubitz SA, D'Agostino RB, Sr., Lumley T, Ehret GB, Heeringa J, Aspelund T, Newton-Cheh C, Larson MG, Marciante KD, Soliman EZ, Rivadeneira F, Wang TJ, Eiriksdottir G, Levy D, Psaty BM, Li M, Chamberlain AM, Hofman A, Vasan RS, Harris TB, Rotter JI, Kao WH, Agarwal SK, Stricker BH, Wang K, Launer LJ, Smith NL, Chakravarti A, Uitterlinden AG, Wolf PA, Sotoodehnia N, Kottgen A, van Duijn CM, Meitinger T, Mueller M, Perz S, Steinbeck G, Wichmann HE, Lunetta KL, Heckbert SR, Gudnason V, Alonso A, Kaab S, Ellinor PT, Witteman JC. Variants in ZFHX3 are associated with atrial fibrillation in individuals of European ancestry. Nat Genet. 2009; 41:879-881. Benjamin EJ, Rice KM, Arking DE, Pfeufer A, van Noord C, Smith AV, Schnabel RB, Bis JC, Boerwinkle E, Sinner MF, Dehghan A, Lubitz SA, D'Agostino RB, Sr., Lumley T, Ehret GB , Heeringa J, Aspelund T, Newton-Cheh C, Larson MG, Marciante KD, Soliman EZ, Rivadeneira F, Wang TJ, Eiriksdottir G, Levy D, Psaty BM, Li M, Chamberlain AM, Hofman A, Vasan RS, Harris TB , Rotter JI, Kao WH, Agarwal SK, Stricker BH, Wang K, Launer LJ, Smith NL, Chakravarti A, Uitterlinden AG, Wolf PA, Sotoodehnia N, Kottgen A, van Duijn CM, Meitinger T, Mueller M, Perz S, Steinbeck G, Wichmann HE, Lunetta KL, Heckbert SR, Gudnason V, Alonso A, Kaab S, Ellinor PT, Witteman JC. Variants in ZFHX3 are associated with atrial fibrillation in individuals of European ancestry. Nat Genet. 2009; 41: 879-881.

8. 8.
Kubo M, Hata J, Ninomiya T, Matsuda K, Yonemoto K, Nakano T, Matsushita T, Yamazaki K, Ohnishi Y, Saito S, Kitazono T, Ibayashi S, Sueishi K, I ida M, Nakamura Y, Kiyohara Y. A nonsynonymous SNP in PRKCH (protein kinase C eta) increases the risk of cerebral infarction. Nat Genet. 2007; 39:212-217. Kubo M, Hata J, Ninomiya T, Matsuda K, Yonemoto K, Nakano T, Matsushita T, Yamazaki K, Ohnishi Y, Saito S, Kitazono T, Ibayashi S, Sueishi K, I ida M, Nakamura Y, Kiyohara Y. A nonsynonymous SNP in PRKCH (protein kinase C eta) increases the risk of cerebral infarction. Nat Genet. 2007; 39: 212-217.

9. 9.
Yamada Y, Fuku N, Tanaka M, Aoyagi Y, Sawabe M, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Kato K, Watanabe S, Nozawa Y, Hasegawa A, Kojima T. Identification of CELSR1 as a Yamada Y, Fuku N, Tanaka M, Aoyagi Y, Sawabe M, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Kato K, Watanabe S, Nozawa Y, Hasegawa A, Kojima T. Identification of CELSR1 as a

susceptibility gene for ischemic stroke in Japanese susceptibility gene for ischemic stroke in Japanese

individuals by a genome-wide association study. individuals by a genome-wide association study.

Atherosclerosis. 2009; 207:144-9. Atherosclerosis. 2009; 207: 144-9.

10. 10.
Domingues-Montanari S, Fernández-Cadenas I, Del Río-Espinola A, Mendioroz M, Fernandez-Morales J, Corbeto N, Delgado P, Ribó M, Rubiera M, Obach V, Martí-Fabregas J, Freijo M, Serena J, Montaner J. KCNK17 genetic variants in ischemic stroke. Atherosclerosis. 2010; 208(1):203-9. Domingues-Montanari S, Fernández-Cadenas I, Del Río-Espinola A, Mendioroz M, Fernandez-Morales J, Corbeto N, Delgado P, Ribó M, Rubiera M, Obach V, Martí-Fabregas J, Freijo M, Serena J, Montaner J. KCNK17 genetic variants in ischemic stroke. Atherosclerosis. 2010; 208 (1): 203-9.

11. eleven.
Hsieh K, Lalouschek W, Schillinger M, Endler G, Reisinger M, Janisiw M, Lang W, Cheng S, Wagner O, Mannhalter C. Impact of alphaENaC polymorphisms on the risk of ischemic cerebrovascular events: a multicenter case-control study. Clin Chem. 2005; 51(6) :952-6. Hsieh K, Lalouschek W, Schillinger M, Endler G, Reisinger M, Janisiw M, Lang W, Cheng S, Wagner O, Mannhalter C. Impact of alphaENaC polymorphisms on the risk of ischemic cerebrovascular events: a multicenter case-control study. Clin Chem. 2005; 51 (6): 952-6.

12. 12.
Muñoz X, Sumoy L, Ramírez-Lorca R, Vi llar J, de Frutos PG, Sala N. Human vitamin K-dependent GAS6: gene structure, allelic variation, and association with stroke. Hum Mutat. 2004; 23(5) :506-12. Muñoz X, Sumoy L, Ramírez-Lorca R, Vi llar J, de Frutos PG, Sala N. Human vitamin K-dependent GAS6: gene structure, allelic variation, and association with stroke. Hum Mutat. 2004; 23 (5): 506-12.

13. 13.
Obach V, Revilla M, Vila N, Cervera A A, Chamorro A A. alpha(1)-antichymotrypsin polymorphism: a risk factor for hemorrhagic stroke in normotensive subjects. Stroke. 2001; 32 (11) :2588-91. Obach V, Revilla M, Vila N, Cervera A A, Chamorro A A. alpha (1) -antichymotrypsin polymorphism: a risk factor for hemorrhagic stroke in normotensive subjects. Stroke. 2001; 32 (11): 2588-91.

14. 14.
Liu J, Sun K, Bai Y, Zhang W, Wang X, Wang Y, Wang H, Chen J, Song X, Xin Y, Liu Z, Hui R. Association of three-gene interaction among MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke: a multicenter case-control study. Hum Genet. 2009; 125(5-6) :649-56. Liu J, Sun K, Bai Y, Zhang W, Wang X, Wang Y, Wang H, Chen J, Song X, Xin Y, Liu Z, Hui R. Association of three-gene interaction among MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke: a multicenter case-control study. Hum Genet. 2009; 125 (5-6): 649-56.

15. fifteen.
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21. twenty-one.
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23. 2. 3.
Jormsjo S, Ye S, Moritz J, Walter DH, Dimmeler S, Zeiher AM, Henney A, Hamsten A, Eriksson P. Allele-specific regulation of matrix metalloproteinase-12 gene activity is associated with coronary artery luminal dimensions in diabetic patients with manifest coronary artery disease. Circ Res. 2000; 86:998-1003. Jormsjo S, Ye S, Moritz J, Walter DH, Dimmeler S, Zeiher AM, Henney A, Hamsten A, Eriksson P. Allele-specific regulation of matrix metalloproteinase-12 gene activity is associated with coronary artery luminal dimensions in diabetic patients with manifest coronary artery disease. Circ Res. 2000; 86: 998-1003.

24. 24.
Marsden PA, Schappert KT, Chen HS, Flowers M, Sundell CL, Wilcox JN, Lamas S, Michel T. Molecular cloning and Marsden PA, Schappert KT, Chen HS, Flowers M, Sundell CL, Wilcox JN, Lamas S, Michel T. Molecular cloning and

characterization of human endothelial nitric oxide synthase. FEBS Lett. 1992; 307:287-293. characterization of human endothelial nitric oxide synthase. FEBS Lett. 1992; 307: 287-293.

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27. 27.
Sironi L, Cimino M, Guerrini U, Calvio AM, Lodetti B, Asdente M, Balduini W, Paoletti R, Tremoli E. Treatment with statins after induction of focal ischemia in rats reduces the extent of brain damage. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23:322-327. Sironi L, Cimino M, Guerrini U, Calvio AM, Lodetti B, Asdente M, Balduini W, Paoletti R, Tremoli E. Treatment with statins after induction of focal ischemia in rats reduces the extent of brain damage. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23: 322-327.

28. 28.
Huang Z, Huang PL, Ma J, Meng W, Ayata C, Fishman MC, Moskowitz MA. Enlarged infarcts in endothelial nitric oxide synthase knockout mice are attenuated by nitro-L-arginine. J Cereb Blood Flow Metab. 1996; 16:981-987. Huang Z, Huang PL, Ma J, Meng W, Ayata C, Fishman MC, Moskowitz MA. Enlarged infarcts in endothelial nitric oxide synthase knockout mice are attenuated by nitro-L-arginine. J Cereb Blood Flow Metab. nineteen ninety six; 16: 981-987.

29. 29.
Decher N, Maier M, Dittrich W, Gassenhuber J, Brüggemann A, Busch AE, Steinmeyer K. Characterization of TASK-4, a novel member of the pH-sensitive, two-pore domainpotassium channel family. FEBS Lett 2001; 492:84-Decher N, Maier M, Dittrich W, Gassenhuber J, Brüggemann A, Busch AE, Steinmeyer K. Characterization of TASK-4, a novel member of the pH-sensitive, two-pore domainpotassium channel family. FEBS Lett 2001; 492: 84-

9 . 9.

30. Girard C, Duprat F, Terrenoire C, Tinel N, Fosset M, Romey G, Lazdunski M, Lesage F. Genomic and functional characteristics of novel human pancreatic 2P domain K(+)channels. Biochem Biophys Res Commun 2001; 282:249-30. Girard C, Duprat F, Terrenoire C, Tinel N, Fosset M, Romey G, Lazdunski M, Lesage F. Genomic and functional characteristics of novel human pancreatic 2P domain K (+) channels. Biochem Biophys Res Commun 2001; 282: 249-

56. 56.

31. 31.
Niemeyer MI, Cid LP, Barros LF, Sepúlveda FV. Modulation of the two-pore domain acid-sensitive K+ channel TASK-2 (KCNK5) by changes in cell volume. J Biol Chem 2001; 276:43166-74. Niemeyer MI, Cid LP, Barros LF, Sepúlveda FV. Modulation of the two-pore domain acid-sensitive K + channel TASK-2 (KCNK5) by changes in cell volume. J Biol Chem 2001; 276: 43166-74.

32. 32.
Barriere H, Belfodil R, Rubera I, Tauc M, Lesage F, Poujeol e, Guy N, BarhaninJ, Poujeol P. Role of TASK2 Barriere H, Belfodil R, Rubera I, Tauc M, Lesage F, Poujeol e, Guy N, BarhaninJ, Poujeol P. Role of TASK2

potassium channels regarding volume regulation in primary cultures of mouse proximal tubules. J Gen Physiol 2003; 122:177-90. potassium channels regarding volume regulation in primary cultures of mouse proximal tubules. J Gen Physiol 2003; 122: 177-90.

33. Duprat F, Girard C, Jarretou G, Lazdunski M. 33. Duprat F, Girard C, Jarretou G, Lazdunski M.

5 Pancreatic two P domain K+ channels TALK-1 and TALK-2 are activated by nitric oxide and reactive oxygen species. J Physiol 2005; 562:235-44. 5 Pancreatic two P domain K + channels TALK-1 and TALK-2 are activated by nitric oxide and reactive oxygen species. J Physiol 2005; 562: 235-44.

34. Niemeyer MI, González-Nilo FD, Zúñiga L, González W, Cid LP, Sepúlveda FV. Neutralization of a single 34. Niemeyer MI, González-Nilo FD, Zúñiga L, González W, Cid LP, Sepúlveda FV. Neutralization of a single

10 arginine residue gates open a two-pore domain, alkali-activated K+ channel. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:666-71. 10 arginine residue gates open a two-pore domain, alkali-activated K + channel. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 666-71.

35. LaFramboise T. Single nucleotide polymorphism arrays: 35. LaFramboise T. Single nucleotide polymorphism arrays:

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36. Ding C, Jin S. High-throughput methods for SNP genotyping. Methods Mol Biol. 2009; 578:245-54. 36. Ding C, Jin S. High-throughput methods for SNP genotyping. Methods Mol Biol. 2009; 578: 245-54.

Claims (38)

REIVINDICACIONES 1.-Combinación de polimorfismos de nucleótido único 1.-Combination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912, indicativa del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular. (SNPs) comprising rs2276109, rs10275136, rs310585, and rs5742912, indicative of an individual's risk of neurovascular disease. 2.-La combinación según la reivindicación 1, donde dicha combinación de SNPs se combina con uno o más de los SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733. 2. The combination according to claim 1, wherein said combination of SNPs is combined with one or more of the SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 and rs2200733. 3.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha combinación de polimorfismos de nucleótido único se combina con una o más variables clínicas asociadas con una enfermedad neurovascular. 3. The combination according to any of claims 1 or 2, wherein said combination of single nucleotide polymorphisms is combined with one or more clinical variables associated with neurovascular disease. 4.-La combinación según la reivindicación 3, donde dicha variable clínica se selecciona entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia. 4. The combination according to claim 3, wherein said clinical variable is selected from age, sex, smoking, hypertension, diabetes and dyslipidemia. 5.-Combinación de polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares que comprenden cada uno de dichos polinucleótidos un SNP de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912, indicativa del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N 1, 2, 3 y 6, respectivamente.5.-Combination of isolated polynucleotides included in genes associated with neurovascular diseases that each of said polynucleotides comprise a SNP of the combination of SNPs that includes rs2276109, rs10275136, rs310585, and rs5742912, indicative of an individual's risk of suffering a neurovascular disease , said isolated polynucleotides corresponding to SEQ ID N 1, 2, 3 and 6, respectively. o or 6.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 o LRP. The combination according to any of claims 1 to 4, in which the alleles of said SNPs are deduced by genetic tests or by measuring the levels of activity or concentration of proteins, or the corresponding levels of expression of NOS3, SCNN1A RNA. , KCNK17, MMP12 or LRP. 7.-La combinación según la reivindicación S en la que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 The combination according to claim S, in which the alleles of said SNPs are deduced by genetic tests or by measuring the levels of activity or concentration of the proteins, or the corresponding levels of RNA expression of NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12. o LRP. or LRP. 8.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6, donde la enfermedad neurovascular es el ictus. 8. The combination according to any of claims 1-4 or 6, where the neurovascular disease is stroke. 9.-La combinación según la reivindicación 5 ó 7, donde la enfermedad neurovascular es el ictus. 9. The combination according to claim 5 or 7, where the neurovascular disease is stroke. 10.-Un método para la determinación de una predisposición genética a las enfermedades neurovasculares de un individuo, que comprende la detección de los alelos de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo. 10.- A method for the determination of a genetic predisposition to an individual's neurovascular diseases, which comprises the detection of alleles of the combination of SNPs comprising rs2276109, rs10275136, rs310585, and rs5742912 in a nucleic acid sample isolated from An individual. 11.-El método según la reivindicación 10, donde se detectan un alelo A para rs310585, un alelo G para rs2276109, un alelo C para rs10275136, o un alelo T para The method according to claim 10, wherein an A allele is detected for rs310585, a G allele for rs2276109, a C allele for rs10275136, or a T allele for
rs5742912. rs5742912.
12.-12.-
El método según cualquiera de las The method according anyone of the
reivindicaciones claims
10 u 11, donde la muestra de ácido 10 or eleven, where the shows of acid
nucleico comprende ADN. Nucleic comprises DNA.
13.-13.-
El método según cualquiera de las The method according anyone of the
reivindicaciones 10-12, donde la muestra de ácido nucleico comprende ARN. Claims 10-12, where the nucleic acid sample comprises RNA.
14.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dichos SNPs se detectan por hibridación de una sonda de ácido nucleico o secuencia de oligonucleótido, o mediante marcadores radiactivos, enzimáticos, luminosos o fluorescentes. 14. The method according to any of claims 10-13, wherein said SNPs are detected by hybridization of a nucleic acid probe or oligonucleotide sequence, or by radioactive, enzymatic, light or fluorescent labels. 15.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, donde dicha combinación de SNPs se combina con una o más variables clínicas asociadas con enfermedades neurovasculares. 15. The method according to any of claims 10-14, wherein said combination of SNPs is combined with one or more clinical variables associated with neurovascular diseases. 16.-El método según la reivindicación 15, donde dichas variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia. 16.- The method according to claim 15, wherein said clinical variables are selected among age, sex, smoking, hypertension, diabetes and dyslipidemia. 17. -El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, donde dicha combinación de SNPs 17. -The method according to any of claims 10 to 16, wherein said combination of SNPs
se I know
combina con uno o más de los SNPs rs7956957, combines with one or plus of the SNPs rs7956957,
rs10947803, rs10947803,
rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778,
rs7193343, rs7193343,
rs6007897, rs4044210 y rs2200733. rs6007897, rs4044210 and rs2200733.
18.-18.-
El método según cualquiera de las The method according anyone of the
reivindicaciones 10 a 17, en el que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y/o LRP. Claims 10 to 17, in which the alleles of said SNPs are deduced by genetic tests or by measuring the levels of activity or concentration of the proteins, or the corresponding levels of RNA expression of NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 and / or LRP .
19.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, que comprende además la 19.- The method according to any of claims 10 to 18, further comprising the comparación de la combinación de alelos obtenida para un individuo con la combinación de alelos obtenida para otro individuo afectado por una enfermedad neurovascular y la detección de la predisposición genética a una enfermedad neurovascular si el individuo a ser analizado presenta la misma carga genética que el individuo afectado comparison of the combination of alleles obtained for one individual with the combination of alleles obtained for another individual affected by neurovascular disease and detection of genetic predisposition to neurovascular disease if the individual to be analyzed has the same genetic load as the affected individual 20.-El método según la reivindicación 19, donde el otro individuo tiene una relación familiar con el 20.-The method according to claim 19, where the other individual has a family relationship with the
individuo individual
a analizar. to analyze.
21.-twenty-one.-
El método según cualquiera de las The method according anyone of the
reivindicaciones claims
10 a 20, donde dicha enfermedad 10 to twenty, where bliss disease
neurovascular neurovascular
es el ictus. is the ictus.
22.-Un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir dicha enfermedad neurovascular que comprende, 22.-A kit to determine the risk of an individual to suffer said neurovascular disease that comprises,
(a) (to)
Sondas que permiten detectar los alelos de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912. Probes that allow detecting alleles of the combination of SNPs comprising rs2276109, rs10275136, rs310585, and rs5742912.
(b) (b)
Instrucciones para usar el kit y determinar el riesgo del individuo de sufrir una enfermedad neurovascular teniendo en cuenta la combinación de SNPs presentada. Instructions for using the kit and determining the individual's risk of suffering a neurovascular disease taking into account the presented combination of SNPs.
23.-El kit según la reivindicación 22, donde una o más sondas están marcadas. 23. The kit according to claim 22, where one or more probes are marked. 24.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, que incluye un reactivo para detectar el marcador. 24. The kit according to any of claims 22 or 23, which includes a reagent to detect the marker. 25.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde dicha combinación de SNPs se combina con variables clínicas asociadas con una enfermedad neurovascular. 25. The kit according to any of claims 22 to 24, wherein said combination of SNPs is combined with clinical variables associated with neurovascular disease. 26.-El kit según la reivindicación 25, donde las variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia. 26.-The kit according to claim 25, wherein the clinical variables are selected between age, sex, smoking, hypertension, diabetes and dyslipidemia. 27.-El kit según las reivindicaciones 22 a 26, donde dicha combinación de SNPs se combina con uno o más de los SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733. 27.-The kit according to claims 22 to 26, wherein said combination of SNPs is combined with one or more of the SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 and rs2200733. 28.-El kit según las reivindicaciones 22 a 27, donde los alelas de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y/o LRP. 28.-The kit according to claims 22 to 27, where the alleles of said SNPs are deduced by means of genetic tests or by measuring the levels of activity or concentration of the proteins, or the corresponding levels of RNA expression of NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 and / or LRP. 29.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, donde dicha enfermedad neurovascular es el ictus. 29.-The kit according to any of claims 22 to 28, wherein said neurovascular disease is stroke. 30.-El uso de la combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular. 30.-The use of the combination according to any of claims 1 to 9 in a kit to determine the risk of an individual suffering from neurovascular disease. 31.-El uso de la combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como herramienta de prueba genética para enfermedades neurovasculares. 31.-The use of the combination according to any of claims 1 to 9, as a genetic testing tool for neurovascular diseases. 32.-El uso según las reivindicaciones 30 ó 31, donde dicha enfermedad neurovascular es el ictus. 32.-The use according to claims 30 or 31, wherein said neurovascular disease is stroke. 33.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea. 33.-The combination according to any of claims 1 to 9, wherein said individual belongs to the Mediterranean population. 34.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho individuo pertenece a 34.-The combination according to any of claims 1 to 9, wherein said individual belongs to la población española. the Spanish population. 35.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea. 35.-The method according to any of claims 10 to 21, wherein said individual belongs to the Mediterranean population. 5 36.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, donde dicho individuo pertenece a la población española. 36.-The method according to any of claims 10 to 21, wherein said individual belongs to the Spanish population. 37.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, donde dicho individuo pertenece a la población 10 mediterránea. 37.-The kit according to any of claims 22 to 29, wherein said individual belongs to the Mediterranean population. 38-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, donde dicho individuo pertenece a la población española. 38-The kit according to any of claims 22 to 29, wherein said individual belongs to the Spanish population. 39.-El uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 30 a 32, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea. 39.-The use according to any of claims 15 30 to 32, where said individual belongs to the Mediterranean population. 40.-El uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, donde dicho individuo pertenece a la población española. 40.-The use according to any of claims 30 to 32, where said individual belongs to the Spanish population.
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