ES2384604T3 - Método de extracción selectiva de proteínas de membrana con calixarenos - Google Patents

Abstract

Método para extraer selectivamente proteínas de membrana, es decir, proteínas asociadas a membranas biológicas, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una solución acuosa que comprende una o varias proteínas de membrana de la proteína de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno, caracterizado porque el calixareno es un calixareno de fórmula (I): en donde: - n es un número entero igual a 1, 3, 5 o 6; - R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno; un grupo alquilo (C1-12) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios heteroátomos seleccionados entre el grupo de átomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C1-12) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo -COOR en donde R es un grupo alquilo (C1-4) lineal o ramificado; un grupo arilo que comprende de 6 a 20 átomos de carbono; - X1, X2 y X3 independientemente uno de otro representan un grupo -(CH2)m-COOR' en donde - m es un número entero de 0 a 10, - R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-4) lineal o ramificado; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Metodo de extracci6n selectiva de proteinas de membrana con calixarenos

Campo tecnico

La presente invenci6n se refiere a un metodo para extraer selectivamente proteinas de membrana con al menos un 5 calixareno.

El uso de calixarenos en el metodo de acuerdo con la invenci6n permite la solubilizaci6n selectiva de las proteinas de membrana, a la vez que se conserva su estructura tridimensional que es esencial para su actividad enzimatica.

En la descripci6n que sigue, las referencias que figuran entre corchetes [ ] se refieren a la lista de referencias que fi

gura al final del texto.

10 Estado de la tecnica

La extracci6n de las proteinas de membrana es una etapa requerida previamente para su estudio en soluci6n, en particular su caracterizaci6n estructural por cristalografia de rayos X, que implica mantenerlas en soluci6n en un estado topol6gico identico al que adoptan en las membranas.

En general, esta etapa se efectua con ayuda de detergentes o tensioactivos que, por un lado, hacen posible la ex

15 tracci6n de estas proteinas de su medio membranal, desestructurando la bicapa de la membrana compitiendo con las cadenas alifaticas de los lipidos que la constituyen y, por otro lado, mantienen la proteina de la membrana en soluci6n debido a su componente hidr6filo. Sin embargo, estos detergentes no muestran las mismas caracteristicas fisicoquimicas que los lipidos y, por lo tanto, tienden a desestabilizar la estructura de los dominios de la membrana, lo que es una fuente de heterogeneidad estructural.

20 A pesar de que son los mas eficaces para solubilizar las proteinas de membrana, los detergentes o los tensioactivos ani6nicos, como por ejemplo, dodecil sulfato s6dico (SOS) o desoxicolato de sodio, son generalmente desestructurantes. Ademas, la eficacia de la fase de desestructuraci6n de la bicapa lipidica es una funci6n de la longitud de la cadena alifatica del detergente o del agente tensioactivo, un parametro que varia en funci6n del origen de las membranas y de las proteinas que se insertan en ella.

25 Ademas, se conocen diversos estudios sobre las interacciones de diversos calixarenos con proteinas, pero no permiten la extracci6n de las proteinas de membrana de su medio membranal, y en particular, sin una desnaturalizaci6n de las mismas.

El documento de Oshima F. y col. (LANGMUIR, vol. 21, paginas 7280782, 2005) describe el uso de un calix[6]areno especifico para la extracci6n selectiva del citocromo c.

30 El documento de patente WO 89/08092 describe que ciertos calix[48]arenos son aptos para extraer hidrocarburos.

En el contexto de la presente invenci6n, los terminos "agente tensioactivo", "tensioactivo" y "detergente" se utilizan indistintamente para designar moleculas que tienen propiedades particulares debido a su estructura anfifilica. Una molecula se dice que es anfifilica cuando posee simultaneamente un grupo polar e hidr6filo y un grupo apolar e hidr6fobo.

35 La expresi6n "extracci6n selectiva" en la presente invenci6n, significa un metodo que permite extraer las proteinas de membrana, selectivamente unas respecto a las otras, desde un medio de membrana mediante solubilizaci6n de las membranas lipidicas en las que estas proteinas estan insertadas, sean naturales o artificiales, y la disoluci6n de dichas proteinas.

En el sentido de la presente invenci6n, la "solubilizaci6n" o "puesta en soluci6n" de proteinas de la membrana, signi

40 fica el paso de la proteina de membrana desde el medio membranal, es decir, desde un medio esencialmente lipidico, a un medio acuoso. En el medio acuoso, las proteinas "solubilizadas" pueden estar en suspensi6n, en dispersi6n

o en forma de moleculas que no estan libres en la soluci6n acuosa. Oichas proteinas se pueden asociar o ligar eventualmente con tensioactivos o detergentes.

En la actualidad, existen muy pocos detergentes poliani6nicos no desnaturalizantes para las proteinas de membrana 45 que permitan su extracci6n selectiva.

Por lo tanto, existe una necesidad real de un metodo de extracci6n que mitigue los defectos, las limitaciones y las desventajas y obstaculos de la tecnica anterior, en particular de un metodo que emplee moleculas ani6nicas que tengan propiedades detergentes que permitan extraer selectivamente las proteinas de la membrana sin desnaturalizarlas, es decir, sin desestructurar o sin modificar su conformaci6n tridimensional normal que les permite cumplir su

50 funci6n.

Descripcion de la invencion

El objeto de la presente invenci6n es precisamente responder a esta necesidad, proporcionando un metodo para extraer selectivamente las proteinas de membrana, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una soluci6n acuosa de la proteina de membrana que se va a extraer, con al menos un calixareno de f6rmula (I):

5 en donde:

•

n es un numero entero igual a 1, 3, 5 o 6;

�

R1, R2, R3 y R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno, un grupo alquilo (C112) (por ejemplo alquilo (C312), por ejemplo alquilo (C912)), lineal o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios

10 heteroatomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C112) (por ejemplo alquilo (C312), por ejemplo alquilo (C912)), lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo COOR en donde R es un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado; o un grupo arilo que comprende de 6 a 20 atomos de carbono;

� X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2)mCOOR' en donde

m es un numero entero de 0 a 10, 15 R' representa un atomo de hidr6geno o un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado;

o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

Oe acuerdo con una realizaci6n particular de la invenci6n, el metodo para la extracci6n selectiva de la proteina de membrana se puede llevar a cabo utilizando al menos un calixareno de f6rmula (I) en la que:

• n es un numero entero igual a 1;

20 � R1, R2, R3 y R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal o ramificado;

� X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2)mCOOR' en el que

m es un numero entero de 0 a 10,

R' representa un atomo de hidr6geno;

25 o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

En el sentido de la presente invenci6n, "alquilo" significa un radical que contiene carbono, lineal, ramificado o ciclico, saturado o insaturado, eventualmente sustituido, que comprende de 1 a 12 atomos de carbono. A titulo indicativo, se pueden citar los radicales metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecanilo y sus is6meros ramificados. El grupo alquilo puede estar eventualmente sustituido con uno o varios heteroa

30 tomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N, P.

El termino "arilo" designa de manera general un sustituyente aromatico ciclico que contiene de 6 a 20 atomos de carbono. En el contexto de la invenci6n, el grupo arilo puede ser mono o policiclico y estar eventualmente sustituido. Como tales, se pueden citar el bencilo y el fenilo.

En el contexto de la presente invenci6n, la expresi6n "sales farmaceuticamente aceptables" abarca las sales prepa

radas con acidos o bases no t6xicas, dependiendo de los sustituyentes presentes en los compuestos. Cuando los compuestos de la invenci6n contienen funciones acidas, las sales correspondientes pueden obtenerse mediante la adici6n de una base organica o inorganica en el compuesto en forma neutralizada, eventualmente en presencia de un disolvente preferentemente inerte. Ejemplos de sales de adici6n de una base pueden ser las sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino (organico) o magnesio. Cuando los compuestos de la invenci6n contienen funciones basicas, las sales correspondientes se pueden obtener por adici6n de un acido organico o inorganico, eventualmente en un disolvente preferentemente inerte. Ejemplos de sales de adici6n de acido inorganico, pueden ser clorohidrato, bromohidrato, nitrato, carbonato, monohidrogenocarbonato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, sulfato, sulfato, monohidrogenosulfato, yodohidrato. Ejemplos de sales de adici6n de acido organico pueden ser acetato, propionato, isobutirato, maleato, malonato, benzoato, succinato, suberato, fumarato, lactato, mandelato, ftalato, bencenosulfonato, ptolilsulfonato, citrato, tartrato, metanosulfonato.

En el sentido de la presente invenci6n, "proteina de membrana" significa una proteina asociada a las membranas biol6gicas, es decir, anclada o integrada, y que no esta libre para la difusi6n en medios acuosos y es inestable en esos medios. Entre las proteinas de membrana, se pueden citar por ejemplo, las proteinas de las membranas plasmaticas y las proteinas de las membranas intracelulares (como por ejemplo, las proteinas de las membranas mitocondriales, nucleares, lisosomales, etc.).

Las proteinas de membrana se clasifican frecuentemente basandose en las estructuras que les permiten interaccionar con las membranas y segun la manera en que estas estructuras encajan entre si. Las proteinas de membrana pueden ser proteinas polit6picas o proteinas monot6picas, por ejemplo, proteinas polit6picas.

"Proteinas polit6picas" significa proteinas que atraviesan la membrana una o varias veces.

"Proteinas monot6picas" significa proteinas que interaccionan solo con un lado de la membrana.

Las proteinas de membrana tambien se pueden clasificar en funci6n de la dificultad para extraerlas de las membranas. Pueden ser integrales o perifericas, por ejemplo, integrales.

"Proteinas integrales" significa proteinas monot6picas o polit6picas que interaccionan fuertemente con la membrana, en particular con interacciones hidr6fobas. Estas proteinas se llaman tambien "proteinas intrinsecas".

"Proteinas perifericas" significa proteinas monot6picas que interaccionan debilmente con la membrana, es decir, ya sea por enlaces electrostaticos, o por la implicaci6n de otras proteinas de membrana. Estas proteinas se llaman tambien "proteinas extrinsecas".

En el sentido de la presente invenci6n, una "soluci6n acuosa de la proteina de membrana" significa una soluci6n acuosa que comprende una o varias proteinas de membrana. Se puede tratar, por ejemplo, de una suspensi6n o una dispersi6n, en donde las proteinas pueden estar en forma no disuelta o no difusa o se pueden combinar, por ejemplo, con una fracci6n de membrana biol6gica.

Los calixarenos de f6rmula (I) son moleculas ani6nicas que tienen propiedades detergentes. Poseen una cara hidr6fila compuesta de varias funciones carboxilicas y una cara hidr6foba formada por grupos alquilo. La multiplicidad de cargas negativas favorece por un lado la interacci6n i6nica de la molecula detergente con la superficie hidr6fila de la proteina y por otro lado impide su penetraci6n (desestructurante) en el nucleo (hidr6fobo) de las proteinas.

Concretamente, en raz6n de su f6rmula quimica, los calixarenos de f6rmula (I) tienen una geometria molecular en forma de cono o cono truncado, en el que la regi6n acampanada es hidr6fila, mientras que la cola es hidr6foba (figura 1). Esta forma particular de las calixarenos de f6rmula (I) permite la formaci6n de micelas, que por un lado favorecen el paso de las proteinas desde un medio de membrana hacia un medio acuoso, y por otro lado permiten la conservaci6n de su estructura tridimensional y, por lo tanto, de su actividad.

Asi, el uso de los calixarenos de f6rmula (I) en el metodo de acuerdo con la invenci6n, permite extraer selectivamente las proteinas de membrana, mediante la solubilizaci6n selectiva de las mismas (es decir, permitiendo su paso desde el medio de membrana al medio acuoso), conservando su estructura tridimensional que es esencial para su actividad, por ejemplo, enzimatica. Asi, despues de su reconstituci6n en lipidos naturales o sinteticos, las proteinas de membrana recuperan su actividad.

Ademas, el metodo de la invenci6n permite la extracci6n de una proteina dada, de manera selectiva en relaci6n con otras proteinas de membrana, en particular modulando la longitud de la cola hidr6foba del calixareno. El metodo de la invenci6n permite asi la extracci6n y la separaci6n de fracciones de proteinas de membrana (fracciones solubilizadas y fracciones no solubilizadas). Oe hecho, dependiendo de los sustituyentes presentes, en particular de la longitud de los grupos alquilo en R1, R2, R3 y/o R4, los calixarenos de f6rmula (I) se pueden ajustar a los tipos de membranas y proteinas, y se puede realizar una extracci6n y una solubilizaci6n selectivas y eficaces.

Oe acuerdo con una realizaci6n particular de la invenci6n, el metodo de la invenci6n puede comprender dos o varias etapas sucesivas de puesta en contacto con diferentes calixarenos de f6rmula (I), lo que permite la extracci6n y el aislamiento de proteinas de membrana entre si.

Ademas, a causa de su estructura, en particular, la naturaleza de los sustituyentes X1, X2 y/o X3, los calixarenos de acuerdo con la invenci6n pueden formar micelas cuya existencia es modulable dependiendo del pH. Esta caracteristica es particularmente util para favorecer o, al contrario, evitar la formaci6n de micelas y mantener de este modo una proteina de membrana en soluci6n con detergentes, con diferentes grados de organizaci6n. Oe hecho, la ausencia de micelas favorece el establecimiento de contactos proteinaproteina que facilitan la formaci6n de cristales en soluci6n.

El metodo de la invenci6n permite extraer cualquier proteina de membrana, y ventajosamente cualquier proteina de membrana presente en una fracci6n de membrana biol6gica obtenida a partir de un organismo procariota o eucariota, sano o alterado. Por ejemplo, en el metodo de acuerdo con la invenci6n, la proteina de membrana que se va a extraer puede estar en una fracci6n de membrana plasmatica obtenida a partir de un organismo procariota o eucariota, sano o alterado. Por ejemplo, el metodo de la invenci6n permite extraer cualquier proteina de membrana polit6pica. Por ejemplo, el metodo de la invenci6n permite extraer cualquier proteina integral de la membrana.

Oe acuerdo con un modo de realizaci6n de la invenci6n, la proteina de membrana se puede seleccionar entre el grupo que comprende las proteinas de transporte. En el sentido de la presente invenci6n, "proteina de transporte" significa una proteina de membrana cuya funci6n es el transporte de diversas sustancias (iones, esteroles, macromoleculas, etc.) desde ambos lados de la membrana. Por ejemplo, se pueden citar los transportadores ABC ("ATPbinding cassette" en ingles, o proteina con dominio de uni6n a ATP), los receptores, los intercambiadores, los canales, etc.

Oe acuerdo con un modo de realizaci6n particular de la invenci6n, la proteina de transporte puede ser un transportador ABC seleccionado entre el grupo que comprende la glicoproteina P (Pgp/ABCB1) [1], MRP1/ABCC1 (proteina de resistencia a multiples farmacos, transportador ABC humano, polit6pico e integral) [2], BCRP/ABCG2 (proteina de resistencia al cancer de mama, transportador ABC humano, polit6pico e integral) [3], BmrA (ATP bacteriano de resistencia a multiples farmacos, transportador ABC procari6tico, polit6pico e integral) [4].

Preferiblemente, la proteina de membrana es una proteina seleccionada entre el grupo que comprende, como proteinas de transporte, la glicoproteina P (Pgp/ABCB1), MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2, y todas las proteinas de esta clase. Mas particularmente, la proteina de transporte puede ser un transportador ABC seleccionada entre el grupo que comprende BmrA.

La etapa de puesta en contacto una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer, con al menos un calixareno de f6rmula (I), se puede efectuar a un pH que varia de 5,5 a 10, preferiblemente de 6 a

9.

El metodo de extracci6n puede efectuarse a una temperatura que varia de 0 a 100°C, preferiblemente de 4 a 25°C.

El metodo de extracci6n utiliza una concentraci6n de calixareno de f6rmula (I) que varia desde 106 a 102 M.

El metodo de extracci6n de acuerdo con la invenci6n puede efectuarse con calixarenos en soluci6n o con calixarenos en agregados coloidales debido a su propiedad de tensioactivo.

En el sentido de la presente invenci6n, por agregado coloidal se entienden grupos que tienen desde unas pocas hasta algunos cientos de moleculas de calixareno que se organizan en funci6n de las fuerzas de repulsi6n hacia el disolvente. Oada su naturaleza, los calixarenos de f6rmula (I) son capaces de formar agregados en un medio apropiado tal como, por ejemplo, en agua, en una soluci6n acuosa, en un medio isot6nico o en un medio biol6gico.

El agregado se puede seleccionar entre el grupo que comprende micelas, liposomas y nanoparticulas lipidicas. Preferiblemente, los calixarenos estan en forma de micelas.

El termino micela designa un agregado esferoidal de moleculas de calixareno de f6rmula (I) que se organiza en funci6n del disolvente utilizado. Por ejemplo, en agua o en un disolvente acuoso, los extremos lip6filos estan dirigidos hacia el interior de la micela, mientras que los extremos hidr6filos formar la interfaz de la micela con el disolvente. En un disolvente organico, por ejemplo aceite, la disposici6n se invierte.

El termino liposoma designa pequefas vesiculas preparadas artificialmente, constituidas en particular por laminas delgadas de fosfolipidos, separadas entre si por compartimentos acuosos. Pueden tener una estructura muy parecida a la de las membranas celulares.

En el contexto de la presente invenci6n, el termino nanoparticula significa un conjunto desde unos pocos cientos a varios miles de moleculas de calixareno de f6rmula (I), que dan como resultado un objeto en el que al menos una de sus dimensiones es de tamafo nanometrico, por ejemplo, entre 1 y 300 nm. En el metodo de la invenci6n, la etapa de puesta en contacto de una suspensi6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con el calixareno de f6rmula (I), se puede realizar eventualmente en presencia de al menos un cosoluto seleccionado entre el grupo que comprende,

i) sales organicas e inorganicas seleccionadas entre el grupo que comprende sales farmaceuticamente

aceptables;

ii) pequefas moleculas bioactivas seleccionadas entre el grupo de los aminoacidos, vitaminas, lipidos, esteroides, carbohidratos o metabolitos;

iii) moleculas bioactivas olig6meras seleccionadas entre el grupo de los peptidos, oligonucle6tidos u oligosacaridos;

iv) moleculas biol6gicas polimeras seleccionadas entre el grupo de las proteinas, polinucle6tidos y polisacaridos.

Oe acuerdo con un modo de realizaci6n de la invenci6n, la etapa de puesta en contacto puede estar precedida por una etapa en la cual:

la proteina de membrana que se va a extraer o la fracci6n de membrana que la contiene se disuelve en una soluci6n tamp6n, y

el calixareno de f6rmula (I) se afade de acuerdo con las condiciones de temperatura, pH y concentraci6n previamente descritas.

Oe acuerdo con un modo de realizaci6n de la invenci6n, la etapa de puesta en contacto puede estar seguida por una etapa de centrifugaci6n, lo que hace posible separar las proteinas de membrana que forman complejos con los calixarenos de f6rmula (I), de las proteinas de membrana que no forman complejos.

Las proteinas de membrana que forman complejo con los calixarenos de f6rmula (I) y las proteinas de membrana que no forman complejos, se pueden separar por centrifugaci6n, por ejemplo durante 1 h, a 4°C y a una velocidad de

100.000 x g. Las condiciones de centrifugaci6n dependeran de la naturaleza de la proteina. El experto en la tecnica sabra seleccionar las condiciones 6ptimas de centrifugaci6n, por ejemplo las descritas en [6].

Otras ventajas se pondran de manifiesto para el experto en la tecnica con la lectura de los siguientes ejemplos, ilustrados por las figuras adjuntas, que se ofrecen a titulo ilustrativo.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 representa la geometria en forma de cono de los calixarenos utilizados en el metodo de la invenci6n. El grupo polar en la parte superior se muestra oscuro y la cadena alifatica hidr6foba esta situada en la parte inferior de la figura. Esta geometria especial hace posible la formaci6n de micelas. En la figura 1, la regi6n A corresponde a la regi6n cargada hidr6fila, la regi6n B corresponde a la plataforma del calix[4]areno y la regi6n C corresponde a una cola alifatica en CnH2n+1.

La figura 2 representa las propiedades tensioactivas de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n =112. El efecto de los derivados del calix[4]areno que contiene cadenas de alquilo con 1 a 12 atomos de carbono, sobre la tensi6n superficial del agua se estudi6 como una funci6n de la concentraci6n de dichos derivados (en molar M o mol/l) a pH 6,0 (no expuesto) y 8,0 (expuesto). Las propiedades tensioactivas de OOM (�Ododecil maltopiran6sido) tambien se muestran en esta figura. Cada punto se corresponde a la media de tres valores.

La figura 3 representa el potencial tensioactivo de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) en funci6n de la longitud de las cadenas de alquilo (n = numero de atomos de carbono = 112) y el pH. El efecto de las moleculas que contienen una cadena de alquilo que tiene de 1 a 12 grupos metileno (n, eje X en la figura 3) sobre la tensi6n superficial del agua, se midi6 a una concentraci6n de 102 M, a pH 6,0 (triangulos) y a pH 8,0 (cuadrados). Cada punto se corresponde a la media de tres valores.

La figura 4 representa la concentraci6n micelar critica (CMC) de la serie p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 112, en funci6n del pH y de la longitud de las cadenas de alquilo. El efecto de las moleculas que tienen una cadena de alquilo con 1 a 12 grupos metileno (n, eje X en la figura) sobre la CMC, se mide a una concentraci6n de 102 M, a pH 6,0 (circulos negros) y 8,0 (circulos blancos). Cada punto se corresponde a la media de tres valores, estimados a partir de los datos de la figura 2.

La figura 5 representa la modulaci6n del potencial tensioactivo del compuesto p(COOH)3Ar4o(C7H15) con los aminoacidos (aa). El compuesto p(COOH)3Ar4o(C7H15) esta presente con una concentraci6n de 102 M, mientras que la de los aminoacidos varia como se indica. La tensi6n superficial se mide a pH 8,0. Los aminoacidos se indican con su c6digo de tres letras: Glu = acido glutamico, Trp = tript6fano, Asn = asparagina, Gly = glicina, Ala = alanina, Ser = serina, Phe = fenilalanina, Leu = leucina, Pro = prolina, Lys = lisina, His = histidina, Arg = arginina. Cada punto se corresponde a la media de tres valores.

La figura 6 representa el esquema topol6gico de BmrA expresada en una bacteria e insertada en su membrana plasmatica. BmrA es una proteina homodimera, estando constituido cada mon6mero por un dominio transmembrana (TMO) unido a un dominio de uni6n a nucle6tido (en ingles, "nucleotidebinding domain" (NBO)) [4, 5].

La figura 7 representa los ensayos de solubilizaci6n de membranas enriquecidas en BmrA con las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) y otros detergentes conocidos. Las fracciones de membrana se preparan tal y como se indica en el ejemplo 11 y se analizan despues de la incubaci6n, ya sea con moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 1 a 12 tal y como se indica en la figura 7, o con detergentes conocidos (FC12, Foscolina 12: ndodecilfosfocolina, detergente zwitteri6nico; SOS: dodecilsulfato de sodio, detergente ani6nico fuerte; OOM: ndodecilOmaltopiran6sido, detergente sin carga), o con un tamp6n (No Oet). Oespues de la separaci6n de la proteina solubilizada (S, material sobrenadante) y no solubilizada (P, sedimento o coagulo) por centrifugaci6n a 100.000 x g, 1 h, 4°C, el contenido proteico se analiza por SOSPAGE. Las lineas de puntos grises y negras y la linea negra sirven como una escala de la eficacia de las moleculas que se van a solubilizar. Las lineas "no det" significan "sin detergente".

La figura 8 representa el efecto de la concentraci6n de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) sobre la solubilizaci6n de BmrA. Las condiciones experimentales son las de la figura 7, con la excepci6n de las concentraciones de las moleculas butilo, heptilo y dodecilo que son tal y como se indican en la figura, para las que la correspondencia g/L <> M se indica en la tabla 2. Las lineas "no det" significan "sin detergente".

La figura 9 representa el efecto de la solubilizaci6n con series de p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) sobre la actividad ATPasa de BmrA. Los ensayos de solubilizaci6n tener lugar como en la figura 8 y los ensayos de la actividad ATPasa se describen en el ejemplo 11. Las lineas de puntos verticales representan la CMC de cada compuesto. Los rombos negros corresponden a una prueba en la que BmrA se solubiliza con p(COOH)3Ar4o(C7H15) y luego se reconstituye en lipidos despues de la eliminaci6n del detergente con BioBeads (BioRad), de acuerdo con el procedimiento descrito en Lenoir y col. [6]. El eje de ordenadas representa la actividad especifica en %, 100% de actividad se corresponde a 0,25 Imol de Pi producido/mg de proteina/min.

La figura 10 representa la extracci6n de la proteina BCRP (a definir) a partir de: i) celulas de insecto Sf9 (en la parte superior de la figura) e ii) celulas humanas HEK293 (en la parte inferior de la figura). Esta muestra la capacidad de los calixarenos utilizados para extraer las proteinas de membrana de lineas celulares diferentes.

La figura 11 representa la actividad de la proteina BmrA despues de la extracci6n con diferentes detergentes, incluyendo Ododecilmaltopiran6sido (OOM), Foscolina 12 (FC12) y calix[4]arenOheptiloxi (C4C7). El porcentaje de actividad ATPasa especifica sensible al vanadato (% de SA o % de actividad ATPasa especifica sensible a VO4) se evalua para los diferentes casos siguientes:

BmrA Mb: actividad de BmrA en las membranas naturales,

OOM sup./OOM: actividad de BmrA en el extracto de OOM,

OOM sup./Lip.: Actividad de BmrA del extracto de OOM y reconstituida en liposomas,

FC12 sup./FC12: Actividad de BmrA en el extracto de Foscolina 12,

FC12 sup./Lip.: Actividad de BmrA del extracto Foscolina 12 y reconstituida en liposomas,

C4C7 sup./FC12: Actividad de BmrA en el extracto de calixareno C4C7 (es decir, calix[4]arenOheptiloxi),

C4C7 sup./Lip.: Actividad de BmrA del extracto de calixareno C4C7 y reconstituida en liposomas.

La figura 12 resume los resultados de una extracci6n utilizando sucesivamente los calixarenos C4C3, despues C4C7 (figura 12A), seguida de una purificaci6n por cromatografia de filtraci6n en gel (figuras 12BE). La figura 12A muestra el SOSPAGE (electroforesis en gel de SOSpoliacrilamida) de las fracciones solubilizadas (S, material sobrenadante) y las fracciones no solubilizadas (P, sedimento) despues de extracciones sucesivas con calixarenos C4C3 y luego C4C7, representando M la parte delantera de la migraci6n. La figura 12C muestra la cromatografia de afinidad a niquel despues de la extracci6n con el calixareno C4C7, en funci6n del volumen de eluci6n Veen mililitros. La figura 12O muestra la cromatografia de filtraci6n en gel en presencia de FC12 despues de la extracci6n con calixareno C4C7, en funci6n del volumen de eluci6n Ve en mililitros. La figura 12E muestra la actividad ATPasa especifica (sensible a vanadato) para la fracci6n a ("S200 pool FC12" o fracci6n de BmrA sometida a cromatografia de filtraci6n en gel en presencia de foscolina 12) y la fracci6n b ("S200 pool Lip.", la misma fracci6n de BmrA sometida a filtraci6n en gel, reconstituida posteriormente en presencia de liposomas).

La figura 13 representa diferentes calix[4]arenos (Figura 13A) y ejemplos de organizaci6n supramolecular de estas moleculas en micelas o agrupaciones supramoleculares (Figura 13B).

En la figura 13A, los calix[4]arenos representados estan formados por una corona de 4 fenoles (anillo, definido por el numero "1" en la figura) que son portadores en una cara de los grupos carboxilato (gui6n pequefo en un circulo, definido por el numero "2") y en la otra cara una cadena alifatica CnH2n+1, con n = 1, 3, 7, 10 y 12 (pequefas varillas, que se definen por el numero "3").

En la figura 13B, las micelas (representada por la zona "a") formadas por estos calixarenos, exponen las funciones cargadas (gui6n pequefo en un circulo) en la superficie con una cohesi6n mantenida por los grupos hidr6fobos (pequefas varillas) agrupados en el interior de la agrupaci6n.

Ejemplos

Metodos generales

Disolventes y reactivos

El diclorometano (CH2Cl2) y el tolueno se destilan bajo una atm6sfera de nitr6geno sobre CaH2, y el tetrahidrofurano (THF) se destila bajo una atm6sfera de nitr6geno sobre sodio y benzofenona. El eter dietilico se destila bajo una atm6sfera de nitr6geno sobre CaH2 y se almacena a 04°C bajo una atm6sfera de nitr6geno sobre un tamiz molecular de4A. Los otros disolventes usados se obtienen del proveedor CarloErba.

Resonancia Magnetica Nuclear (RMN)

Los espectros de 1H y 13C se realizan en un aparato Bruker AV500. Los desplazamientos quimicos (0) de los espectros de RMN 1H se calibran de acuerdo con la referencia de tetrametilsilano (TMS) que tiene un valor 0 de 0,00 ppm. Los 0 de los espectros de RMN 13C se calibran de acuerdo con el valor de referencia del disolvente. Las mediciones se realizan a 25°C en tubos de 5 mm de diametro. Los espectros se realizan en disolventes deuterados obtenidos del proveedor Aldrich o SOS.

Cromatografia

Las cromatografias en capa fina (TLC) se realizan sobre placas de aluminio de Merck "TLC Silica gel 60F254". Los compuestos se revelan con una lampara UV (ultravioleta) y/o se sumergen en el liquido revelador que contiene acido fosfomolibdico en acido sulfurico y etanol, seguido por calentamiento con un decapador termico.

Las columnas cromatograficas se realizan con un gel de silice de Merck (gel de silice 60 (40 a 63 Im)).

Espectrometria de masas

Masa ESI: las muestras se analizan en un espectr6metro Perkin Elmer Sciex API 300, en disolventes de calidad "para Analisis".

Medici6n de la tensi6n superficial

Las propiedades tensioactivas de los calixarenos de f6rmula (I) se evaluan por difusi6n de vapor por gota pesada (en ingles, "sitting drop") de 1 ml con ayuda de un aparato Kibron con microdepresi6n y empleando una jeringa de acero inoxidable y una balanza de Wilhelmy. Las curvas obtenidas se procesan con el programa v11 de SigmaPlot.

Ejemplo 1: Sintesis de 25-butiloxicalix[4]areno

A una suspensi6n de calix[4]areno (20 g, 0,47 mol) en OMF anhidro (943 ml) se afaden soluciones de CsF (8,49 g, 1,2 equivalentes) y yodobutano (35,47 ml, 10 equivalentes). La mezcla de reacci6n se agita a 40°C durante 96 horas. El progreso de la reacci6n se sigue por CCF o TLC (Cromatografia en Capa Fina o "Thin Layer Chromatography). Una vez terminada la reacci6n, se detiene por adici6n de acido clorhidrico 1 M (250 ml). El medio de reacci6n se extrae con CH2Cl2 (2 x 200 ml). Las fases organicas se combinan, se lavan con agua (2 x 250 ml) y se secan sobreMgSO 4. Oespues de la evaporaci6n del disolvente, el producto bruto restante se recoge con una mezcla CH2Cl2/MeOH (1:1). La soluci6n se filtra a continuaci6n para eliminar el calix[4]areno que no ha reaccionado y se purifica por cromatografia en columna (CH2Cl2/hexano 1:1).

Se obtiene un s6lido blanco con un rendimiento del 68% por el procedimiento. P.f. = 239°C;

1H RMN (COCl3) 0 1,14 (t, 3H, 2JHH = 7,1 Hz, ArOCH2CH2CH2CH3), 1,74 (m, 2H, ArO(CH2)2CH2CH3), 2,18 (m, 2H, ArOCH2CH2CH2CH3), 3,48 (d, 4H, 2JHH = 13,3 Hz, ArCH2Ar), 4,17 (t, 2H, 2JHH = 7,0 Hz, ArOCH2(CH2)2CH3), 4,30 (d, 2H, 2JHH = 13,6 Hz, ArCH2Ar), 4,37 (d, 2H, 2JHH = 12,9 Hz, ArCH2Ar), 6,697,07 (m, 12H, ArH), 9,46 (s, 2H, ArOH), 9,77 (s, 1H, ArOH).

13C RMN (COCl3) 014,2 (ArO(CH2)3CH3), 19,2 (ArO(CH2)2CH2CH3), 19,7 (ArOCH2CH2CH2CH3), 31,4 y 32,3 (ArCH2Ar), 77,1 (ArOCH2(CH2)2CH3), 120,8; 121,8; 121,7; 126,1; 128,3; 128,7; 129,3 (Ar), 149,1 y 150,6 (ArCOH), 151,5 (ArCO(CH2)3CH3).

Espectro de masas ES (CHCl3) m/z: 481,2 [M+H]+, 503,3 [M+Na]+, 519,2 [M+K]+.

Ejemplo 2: Sintesis de 25-dodeciloxicalix[4]areno

A una suspensi6n de calix[4]areno (20 g, 0,47 mol) en OMF anhidro (943 ml) se afaden soluciones de CsF (8,49 g, 1,2 equivalentes) y yodododecano (35,47 ml, 10 equivalentes). La mezcla de reacci6n se agita a 40°C durante 96 horas. El progreso de la reacci6n se sigue por TLC. Una vez terminada la reacci6n, se detiene por adici6n de acido clorhidrico 1 M (250 ml). El medio de reacci6n se extrae con CH2Cl2 (2 x 200 ml). Las fases organicas se combinan, se lavan con agua (2 x 250 ml) y se secan sobre MgSO4. Oespues de la evaporaci6n del disolvente, el producto bruto restante se recoge en una mezcla CH2Cl2/MeOH (1:1). A continuaci6n, la soluci6n se filtra para eliminar el ca

lix[4]areno que no ha reaccionado y se purifica por cromatografia en columna (CH2Cl2/hexano 1:1).

Se obtiene un s6lido blanco con un rendimiento del 48%, p.f. = 235°C; 1H RMN (COCl3) 0 1,01 (t, 3H, 3JHH = 7,0 Hz, ArO(CH2)11CH3), 1,42 (m, 4H, ArO(CH2)8CH2CH2CH3), 1,49 (m, 4H, ArO(CH2)7CH2CH2(CH2)2CH3), 1,53 (m, 4H, ArO(CH2)5CH2CH2(CH2)4CH3), 1,62 (m, 4H, ArO(CH2)3CH2CH2(CH2)6CH3), 1,80 (m, 2H, ArO(CH2)2CH2(CH2)8CH3), 2,29 (m, 2H, ArOCH2CH2(CH2)9CH3), 3,57 (d, 4H, 2JHH = 13,3 Hz, ArCH2Ar), 4,26 (t, 2H, 2JHH = 6,8 Hz, ArOCH2(CH2)10CH3), 4,39 (d, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 4,48 (d, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 6,777,18 (m, 12H, ArH), 9,57 (s, 2H, ArOH), 9,88 (s, 1H, ArOH).

13C RMN (COCl 3) 0 14,3 (ArO(CH2)11CH3), 22,9 (ArO(CH2)10CH2CH3), 26,1 (ArO(CH2)9CH2CH2CH3), 29,6 (ArO(CH2)8CH2(CH2)2CH3), 29,7 (ArO(CH2)7CH2(CH2)3CH3), 29,8 (ArO(CH2)7CH2(CH2)4CH3), 29,8 (ArO(CH2)5CH2(CH2)5CH3), 29,9 (ArO(CH2)4CH2(CH2)6CH3), 30,1 (ArO(CH2)3CH2(CH2)7CH3), 31,6 (ArO(CH2)2CH2(CH2)8CH3), 31,8 (ArOCH2CH2(CH2)8CH3), 32,1 y 32,2 (ArCH2Ar), 77,7 (ArOCH2(CH2)10CH3) 121,1; 122,1; 122,4; 126,2; 128,4; 128,6; 128,9; 129,1; 129,5; 134,4 (Ar), 149,4 y 151,0 (ArCOH), 151,6 (ArCO(CH2)11CH3).

ES espectro de masas (CHCl3) m/z: 593,2 [M+H]+, 615,2 [M+Na]+, 631,3 [M+K]+.

Ejemplo 3: Sintesis de 5,11,17 tris-[(carboxilato)metil]25-mono-metiloxi 26,27,28 tris-hidroxicalix[4]areno compuesto 5a

Se colocan en un matraz 5 g de tris[(ciano)metil] monometiloxi 26,27,28 trishidroxicalix[4]areno en 50 ml de EtOH. Se afaden 50 ml de KOH 3 M. La mezcla de reacci6n se calienta a reflujo durante 72 horas. La soluci6n se enfria, se trata con 500 ml de agua helada, y se acidifica con una soluci6n de HCl 12 N. El producto amarillo se recupera por filtraci6n y a continuaci6n se lleva a reflujo durante 72 horas en 50 ml de MeOH y 4,5 g de NaOH en 50 ml de agua. La soluci6n se enfria a continuaci6n, se trata con 250 ml de agua helada, se acidifica con HCl, se filtra, se lava con agua para dar el 5,11,17 tris[(carboxi)metil]25monometiloxicalix[4]areno en forma de un polvo de color blanquecino a amarillo con un rendimiento del 72%. P.f. = 221°C.

1H RMN (OMSO) 0 3,24 (s, 2H, ArCH2COOH), 3,31 (s, 4H, ArCH2COOH), 3,39 (d, 2H, 2JHH = Hz, ArCH2Ar), 3,48 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 4,01 (s, 3H, ArOCH3), 4,18 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 4,25 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 6,897,16 (m, 9H, ArH), 8,79 (s, 2H, ArOH), 9,50 (s, 1H, ArOH), 12,07 (s, 3H, ArCH2COOH).

13C RMN (OMSO) 0 21,1 (ArCH2COOH), 29,1 y 30,9 (ArCH2Ar), 66,1 (ArOCH3), 142,7; 143,1; 147,4; 148,4 (Ar), 150,3 y 153,5 (ArCOH), 154,1 (ArCOCH3), 168,4 y 169,3 (ArCH2COOH).

ES espectro de masas (OMSO) m/z: 613,1 [M+H]+, 635,1 [M+Na]+, 611,3 [MH].

Ejemplo 4: Sintesis de 5,11,17 tris-[(carboxilato)metil]25-mono-butiloxi 26,27,28 tris-hidroxicalix[4]areno compuesto 5b

Se colocan en un matraz 5 g de tris[(ciano)metil]monobutiloxi 26,27,28 trishidroxicalix[4]areno en 50 ml de EtOH. Se afaden 50 ml de KOH 3 M. La mezcla de reacci6n se calienta a reflujo durante 72 horas. La soluci6n se enfria, se trata con 500 ml de agua helada, y se acidifica con una soluci6n de HCl 12 N. El producto amarillo se recupera por filtraci6n, a continuaci6n se lleva a reflujo durante 72 horas en 50 ml de MeOH y 4,5 g de NaOH en 50 ml de agua. La soluci6n se enfria, se trata con 250 ml de agua helada, se acidifica con HCl, se filtra y se lava con agua para proporcionar el 5,11,17 tris[(carboxi)metil]25monobutiloxicalix[4]areno en forma de un polvo de color blanquecino a amarillo con un rendimiento del 75%. P.f. = 223°C.

1H RMN (OMSO) 0 1,07 (t, 3H, 2JHH = 6,9 Hz, ArO(CH2)3CH3), 1,69 (m, 2H, ArO(CH2)2CH2CH3), 2,01 (m, 2H, ArOCH2CH2CH2CH3), 3,17 (s, 2H, ArCH2COOH), 3,31 (s, 4H, ArCH2COOH), 3,38 (d, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 3,48 (d, 2H, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 3,57 (t, 2H, 2JHH = Hz, ArOCH2(CH2)2CH3), 4,11 (d, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 4,20 (d, 2H, 2JHH = 13,1 Hz, ArCH2Ar), 6,827,12 (m, 9H, ArH), 8,87 (s, 2H, ArOH), 9,56 (s, 1H, ArOH),

13C RMN (OMSO) 0 13,8 (ArO(CH2)3CH3), 18,6 (ArO(CH2)2CH2CH3), 22,1 (ArCH2COOH), 30,3 (ArOCH2CH2CH2CH3), 30,6 y 31,4 (ArCH2Ar), 76,6 (ArOCH2(CH2)2CH3), 125,7; 127,6; 128,7, 130,1, 134,0 (Ar), 147,8 y 150,0 (ArCOH), 151,9 (ArCO(CH2)3CH3), 172,9 (ArCH2COOH).

ES espectro de masas (OMSO) m/z: 677,1 [M+Na]+, 653,3 [MH].

Ejemplo 5: Sintesis de 5,11,17 tris-[carboxilato)metil] 25-mono-hexiloxi 26,27,28 tris-hidroxicalix[4]areno compuesto 5c

En un matraz se colocan 5 g de tris[(ciano)metil]monohexiloxi 26,27,28 trishidroxicalix[4]areno en 50 ml de EtOH. Se afaden 50 ml de KOH 3 M. La mezcla de reacci6n se calienta a reflujo durante 72 horas. La soluci6n se enfria, se trata con 500 ml de agua helada y se acidifica con una soluci6n de HCl 12 M.

El producto amarillo se recupera por filtraci6n, a continuaci6n se lleva a reflujo durante 72 horas en 50 ml de MeOH y 4,5 g de NaOH en 50 ml de agua. La soluci6n se enfria, se trata con 250 ml de agua helada, se acidifica con HCl, se filtra y se lava con agua para dar el 5,11,17 tris[(carboxi)metil]25monohexiloxicalix[4]areno en forma de un s6lido de color amarillo con un rendimiento del 69%. P.f. = 222°C

1H RMN (OMSO) 0 0,95 (t, 3H, 2JHH = 7,1 Hz, ArO(CH2)5CH3), 1,42 (m, 4H, ArO(CH2)3CH2CH2CH3), 1,67 (m, 2H, ArO(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 2,02 (m, 2H, ArCH2CH2(CH2)3CH3), 3,16 (s, 2H, ArCH2COOH), 3,31 (s, 4H, ArCH2COOH), 3,38 (d, 2H, 2JHH = 12,9 Hz, ArCH2Ar), 3,50 (d, 2H, 2JHH = 12,9 Hz, ArCH2Ar), 4,04 (t, 2H, 2JHH = 7,2 Hz, ArOCH2(CH2)4CH3), 4,15 (d, 2H, 2JHH = 12,9 Hz, ArCH2Ar), 4,20 (d, 2H, 2JHH = 12,9 Hz, ArCH2Ar), 6,857,18 (m, 9H, ArH), 8,89 (s, 2H, ArOH), 9,53 (s, 1H, ArOH),

13C RMN (OMSO) 0 14,0 (ArO(CH2)5CH3), 22,3 (ArCH2COOH), 24,8 (ArO(CH2)4CH2CH3), 29,3 (ArO(CH2)3CH2CH2CH3), 29,7 (ArO(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 30,3 (ArOCH2CH2(CH2)3CH3), 30,6 y 31,7 (ArCH2Ar), 77,2 (ArOCH2(CH2)4CH3), 123,2; 124,2; 125,4; 126,9; 127,9; 129,6; 134,0 (Ar), 147,8 y 150,0 (ArCOH), 151,9 (ArCO(CH2)5CH3).

ES espectro de masas m/z: 683,1 [M+H]+, 681,5 [MH].

Ejemplo 6: Sintesis de 5,11,17 tris-[(carboxilato)metil]25-monododecil 26,27,28 tris-hidroxicalix[4]areno compuesto 5d

En un matraz se colocan 5 g de tris[(ciano)metil] monododeciloxi 26,27,28 trishidroxicalix[4]areno en 50 ml de EtOH. Se afaden 50 ml de KOH 3 M. La mezcla de reacci6n se calienta a reflujo durante 72 horas. La soluci6n se enfria, se trata con 500 ml de agua helada y se acidifica con una soluci6n de HCl 12 M.

El producto amarillo se recupera por filtraci6n, a continuaci6n se lleva a reflujo durante 72 horas en 50 ml de MeOH y 4,5 g de NaOH en 50 ml de agua. La soluci6n se enfria, se trata con 250 ml de agua helada, se acidifica con HCl, se filtra y se lava con agua para dar el 5,11,17 tris[(carboxi)metil]25monododeciloxicalix[4]areno en forma de un s6lido de color amarillo con un rendimiento del 71%. P.f. = 210°C

1H RMN (OMSO) 0 0,81 (t, 3H, 2JHH = 7,0 Hz, ArO(CH2)11CH3), 1,01 (m, 4H, ArO(CH2)9CH2CH2CH3), 1,03 (m, 4H, ArO(CH2)7CH2CH2(CH2)2CH3), 1,10 (m, 4H, ArO(CH2)5CH2CH2(CH2)4CH3), 1,25 (m, 2H, ArO(CH2)4CH2(CH2)5CH3), 1,44 (m, 2H, ArO(CH2)3CH2(CH2)6CH3), 1,67 (m, 2H, ArO(CH2)2CH2(CH2)7CH3), 2,01 (m, 2H, ArOCH2CH2(CH2)8CH3), 3,18 (s, 2H, ArCH2COOH), 3,30 (s, 4H, ArCH2COOH), 3,35 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 3,47 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 4,01 (t, 2H, 2JHH =7,1 Hz, ArOCH2(CH2)10CH3),4,13 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 4,17 (d, 2H, 2JHH = 13,2 Hz, ArCH2Ar), 6,837,12 (m, 9H, ArH), 8,91 (s, 2H, ArOH), 9,53 (s, 1H, ArOH),

13C RMN (OMSO) 0 13,8 (ArO(CH2)11CH3), 21,2 (ArCH2COOH), 24,6 (ArO(CH2)10CH2CH3), 24,8 (ArO(CH2)9CH2CH2CH3), 28,7 (ArO(CH2)8CH2(CH2)2CH3), 28,8 (ArO(CH2)7CH2(CH2)3CH3), 29,1 (ArO(CH2)6CH2(CH2)4CH3), 29,4 (ArO(CH2)5CH2(CH2)5CH3), 29,6 (ArO(CH2)4CH2(CH2)6CH3), 29,8 (ArO(CH2)3CH2(CH2)7CH3), 29,9 (ArO(CH2)2CH2(CH2)8CH3), 30,2 (ArOCH2CH2(CH2)9CH3), 30,5 y 31,6 (ArCH2Ar), 77,8 (ArOCH2(CH2)10CH3), 123,1; 124,3; 124,6; 127,2; 128,4; 129,7; 134,1 (Ar), 147,1 y 150,3 (ArCOH), 151,4 (ArCO(CH2)11CH3), 170,3 (ArCH2COOH).

ES espectro de masas m/z: 767,2 [M+H] +, 765,1 [MH].

Ejemplo 7: Propiedades de tensioactivo -1

La figura 2 muestra el efecto tensioactivo de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 112 atomos de carbono. Como se muestra, la capacidad de disminuir la tensi6n superficial del agua, un efecto tipico de un tensioactivo, aumenta con el numero de atomos de carbono en la cadena alifatica. Las moleculas de calixareno que tienen una cadena alifatica mas corta modifican poco la tensi6n superficial del agua, lo que significa que sus propiedades detergentes son limitadas. Por otro lado, las moleculas que contienen una cadena de alquilo mas larga (n = 3 a 12) se comportan como detergentes.

Como se esperaba, el potencial del tensioactivo aumenta con la longitud de la cadena de alquilo, y la molecula p(COOH)3Ar4o(C12H25) muestra propiedades tensioactivas cercanas a las de OOM (�Ododecil maltopiran6sido), un detergente no i6nico, utilizado tipicamente para disolver la membrana de las proteinas.

Este ejemplo ilustra la primera propiedad de los compuestos calixarenos de la invenci6n, a saber, que las moleculas de calixarenos p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 312 se comportan como tensioactivos.

Como se muestra en la figura 3, el pH modula el potencial de las moleculas sobre la tensi6n superficial. A pH 6 y 8, la tensi6n superficial aumenta regularmente con la longitud de las cadenas de alquilo que alcanzan una meseta que corresponde a la mitad de la tensi6n superficial inicial (n = 12 a pH 8,0).

Estos efectos ilustran una propiedad de la invenci6n, que es que simplemente cambiando el pH se puede modular la tensi6n superficial del medio, en presencia de los calixarenos de la invenci6n. Este efecto se puede reducir o ampliar

en funci6n de la longitud de la cadena de alquilo de los calixarenos de la invenci6n.

Ejemplo 8: Propiedades de tensioactivo -2

Como se muestra en la figura 4, los calixarenos p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 112 se comportan como detergentes con una concentraci6n micelar critica (CMC) que puede variar desde 0,15 hasta 1,5 mM. Por concentraci6n micelar critica (CMC), se entiende la concentraci6n mas alla de la cual, la concentraci6n de las moleculas detergentes no aumenta mas, ya que dichas moleculas estan implicadas en las micelas (figura 13). Las moleculas que contienen una cadena de alquilo con un numero de grupos metileno menor que 8, muestran una CMC del orden mM que no depende del pH. A la inversa, cuando las cadenas de alquilo incluyen mas de 8 grupos metileno, la CMC resultante disminuye apreciablemente a 0,15 mM cuando el pH aumenta de 6 a 8.

Este ejemplo ilustra una propiedad importante de los calixarenos de la serie p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n = 112 cuya sensibilidad al pH depende de la longitud de la cadena de alquilo. Esta propiedad es particularmente importante para los calixarenos p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), n =912 que se pueden utilizar ya sea con un pH acido o con un pH basico, para favorecer o evitar la formaci6n de micelas. Esta propiedad es tipicamente para facilitar la eliminaci6n del detergente sin aumentar la concentraci6n durante la etapa de concentraci6n de la membrana de la proteina solubilizada.

Ejemplo 9: Interaccion de p(COOH)3-Ar4-0(CnH2n+1) con aminoacidos

La figura 5 ilustra la propiedad unica de los calixarenos de la serie p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), ejemplificada con n = 7, de formar complejos con aminoacidos, modulando la tensi6n superficial del medio. No se observa ningun efecto con aminoacidos tales como el acido glutamico o su derivado aminado, la asparagina. Un efecto moderado se observa con la glicina. Este efecto se amplifica con la hidrofobicidad (alanina, fenilalanina, leucina) y se vuelve muy pronunciado con los aminoacidos cargados positivamente, tales como histidina, lisina y arginina.

Este ejemplo ilustra una propiedad importante de la molecula de p(COOH)3Ar4o(C7H15) (y otras), en donde se puede aumentar facilmente el potencial tensioactivo mediante la adici6n de aminoacidos cargados positivamente. Los complejos resultantes son pr6ximos a los compuestos zwitteri6nicos.

Ejemplo 10: Tamano de los agregados

La Tabla 1 muestra el estado de agregaci6n de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1).

Tabla 1. Estado de agregacion de las moleculas p(COOH)3-Ar4-0(CnH2n+1) Diametro aparente (nm)

Compuesto pH 2 pH 4 pH 6 pH 8 22 5a 950 340 270 260 550 270 5b 500 145 90 25 210 5c 850 210 400 6 890 730 5d 880 100 190 8 40

Tal y como se ilustra en la tabla 1, todos los sistemas observado forman agregados de tipo micelar.

Efectos biologicos de las moleculas p(COOH)3-Ar4-0(CnH2n+1)

Las series p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) se someten a ensayos para la solubilizaci6n de BmrA, una proteina de membrana que pertenece a los transportadores ABC y que protege las celulas contra el flujo de salida y la fuga de xenobi6ticos hacia el exterior de la celula [Chami 2002 JMB 315 1075; Orelle 2003 JBC 27847 47002].

Como se muestra esquematicamente en la figura 6, BmrA es una proteina homodimera insertada en la membrana plasmatica de la bacteria. Esta proteina expulsa xenobi6ticos a traves de la hidr6lisis de ATP, una actividad enzimatica que depende del plegamiento correcto del transportador y que requiere lipidos [7]. Tal actividad se utiliza para verificar la integridad funcional de la proteina en el curso del procedimiento de solubilizaci6n.

Ejemplo 11: Capacidad de solubili�ar las membranas biologicas de los calixarenos de la invencion

Las bacterias competentes C41 BL21 (OE3) de E� coli (Esc�eric�ia coli) se transforman con el plasmido pET15bBMRA que es portador del gen que codifica BmrA y se colocan bajo el control de un promotor inducible y un gen que codifica la proteina que confiere resistencia a la ampicilina. Un clon positivo se cultiva en un medio liquido a 37°C y 200 rpm en presencia de ampicilina, hasta una fase de crecimiento semiexponencial. La expresi6n de BmrA se induce mediante la adici6n de isopropil tiogalact6sido 1 mM y continua a 25°C durante 4 horas. Las bacterias se recogen por centrifugaci6n, se rompen en una prensa francesa ("French press"), y la fracci6n de membrana se aisla por una serie de etapas de centrifugaci6n a velocidades bajas y altas. El contenido en proteina se evalua por colorimetria [8] y se fija en 20 mg/ml (TrisCl 20 mM, pH 8,0, 200 ml de NaCl, sacarosa 300 mM) antes de la congelaci6n y el almacenamiento en nitr6geno liquido. Antes del uso, la fracci6n de membrana se descongela a continuaci6n rapidamente en agua y se mantiene a 4°C en hielo.

La solubilizaci6n se efectua a 4°C (o a temperatura ambiente 23°C, cuando se indica, mediante la diluci6n de la fracci6n de membrana en el mismo tamp6n hasta una concentraci6n final de 2 mg/ml de proteinas, a continuaci6n, se afaden los detergentes y las moleculas sometidas a ensayo hasta 10 mg/ml (1%) o menos cuando se indica, seguido por una incubaci6n de 2 horas a 4°C. Las fracciones de proteinas solubilizadas o no solubilizadas se separan por una etapa de centrifugaci6n a 200.000 x g durante 1 hora a 10°C. Cada sedimento de la centrifugaci6n se suspende en el volumen inicial y se carga, junto con el material sobrenadante en una electroforesis de tipo Laemmli en gel de poliacrilamida (SOSPAGE) [9], y como se describe, por ejemplo en [7], para analizar su contenido en proteinas. Bajo tales condiciones, BmrA migra a aproximadamente 70.000 Oalton.

La actividad ATPasa se mide evaluando el contenido en fosfato inorganico (Pi) despues de 5 minutos de incubaci6n a 37°C. La fracci6n de Pi producida por otras actividades ATPasa se deduce midiendo la misma actividad en presencia de orto vanadato 1 mM que inhibe la actividad ATPasa de BmrA (por ejemplo, tal y como se describe en [10]).

Tal y como se muestra en la figura 7, BmrA se encuentra cada vez mas en el material sobrenadante, en funci6n de la longitud de la cadena de alquilo de las moleculas p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1). No se lleva a cabo ninguna solubilizaci6n con las moleculas mas cortas (n = 1 o 2), dando un esquema comparable al obtenido sin detergente (lineas "no det"). La solubilizaci6n aumenta progresivamente con n = 3 o 4, y es mas pronunciada con n = 5 y 6 que conduce al mismo esquema que el obtenido con OOM. La solubilizaci6n parece completa para n � 7, tal y como se obtiene con FC12 o SOS. En consecuencia, estas moleculas solubilizan eficientemente las proteinas de la membrana.

Esto se confirma con los datos de la figura 8, que muestran que la solubilizaci6n se lleva a cabo a una concentraci6n de moleculas � CMC, aproximadamente 1,5 mM para el compuesto heptilo (1 g/L = 1,6 mg/ml), mientras que este no es el caso para el compuesto dodecilo, dado que con una CMC de 0,15 mM (correspondiente a 0,1 g/l), no se lleva a cabo ninguna solubilizaci6n, probablemente debido a una relaci6n detergente/proteina demasiado baja.

La tabla 2 indica la correspondencia g/l en M para las moleculas sometidas a ensayo.

p(COOH)3-Ar4

[compuestos], M

PM

CMC, M 10 g�� 1 g�� 0,1 g�� 0,01 g�� 0,001 g��

0(C1H3)

612 >1,5E03 1,6E02 1,6E03 1,6E04 1,6E05 1,6E06

0(C3H7)

640 �1,5E03 1,6E02 1,6E03 1,6E04 1,6E05 1,6E06

0(C7H15)

696 �1,5E03 1,4E02 1,4E03 1,4E04 1,4E05 1,4E06

0(C12H25)

766 �1,5E04 1,3E02 1,3E03 1,3E04 1,3E05 1,3E06

Ejemplo 12: Efecto de la solubili�acion con la serie p(COOH)3-Ar4-0(CnH2n+1) sobre la actividad ATPasa de BmrA

El efecto de la solubilizaci6n con la serie p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1) sobre la actividad ATPasa de BmrA se analiz6 bajo las mismas condiciones que en la figura 8.

La figura 9 muestra el efecto de los detergentes utilizados (calixarenos que contienen una cadena alifatica metilo, butilo, heptilo o dodecilo) y detergentes testigos (FC12 y C12E8, un detergente sin carga) sobre la actividad ATPasa, antes, durante y despues de la solubilizaci6n de BmrA. Como se observa tipicamente, la actividad ATPasa disminuye con la solubilizaci6n tal y como se observa para FC12 y C12E8.

Cabe destacar que la comparaci6n entre las figuras 8 y 9 muestra que la molecula heptilo, a 1 mg/ml, solubiliza BmrA mas eficazmente, mientras que esta concentraci6n, ligeramente inferior a la CMC, no conduce a la inactivaci6n. Esto es igualmente cierto para el compuesto dodecilo, a la misma concentraci6n, 1 mg/ml, 1/10 de CMC.

Los experimentos de reconstituci6n de BmrA en bicapas lipidicas despues de la eliminaci6n del detergente, muestran una actividad ATPasa totalmente recuperada (rombo negro en la figura 9) lo que indica que las moleculas de la invenci6n conservan la topologia de BmrA en un estado funcional.

Ejemplo 13: Extraccion de la proteina BCRP de origen humano de acuerdo con el metodo de la invencion

La proteina BCRP, derivada de un gen humano, se expres6 en celulas HEK293 humanas o en celulas Sf9 de insecto en las que se habia transfectado el gen correspondiente. Esta proteina se ha solubilizado igualmente de forma eficaz con los derivados de calixarenos de f6rmula (I) que contienen cadenas de heptilo o mas largas, tal y como se muestra en la figura 10.

Estos experimentos muestran que el metodo de acuerdo con la invenci6n que emplea calix[4]arenos triani6nicos es un metodo eficaz para la extracci6n de una proteina de membrana dada, dependiendo de la elecci6n de calixareno de la serie hom6loga que, o bien enriquece el material sobrenadante, o deja la proteina en el sedimento. Esta extracci6n puede estar seguida eventualmente por una etapa de purificaci6n.

Ejemplo 14: Efecto de la solubili�acion con los calixarenos de acuerdo con la invencion, sobre la actividad en�imatica de los transportadores ABC

Las proteinas de la familia de transportadores ABC son muy sensibles a la solubilizaci6n, alterando esta etapa frecuentemente su actividad ATPasa, al menos de forma reversible. Esta alteraci6n da como resultado la falta de acoplamiento entre los dominios NBOs (dominio de uni6n al nucle6tido o "nucleotidebinding domain") y TMOs (dominio transmembrana).

Los efectos de la solubilizaci6n sobre la actividad de la proteina BmrA se han evaluado con diversos calixarenos C4Cn, es decir, los calixarenos p(COOH)3Ar4o(CnH2n+1), y tambien con los detergentes testigos, tales como Foscolina 12 (FC12) y Ododecil maltopiran6sido (OOM), a continuaci6n, los extractos obtenidos (fracciones de sobrenadante) se dializan en presencia de liposomas con el fin de restaurar un medio de membrana, lo que permite la recuperaci6n de la actividad de la proteina.

Los resultados representados en la figura 11, muestran que una vez solubilizada en presencia de OOM o FC12, la proteina BmrA ha perdido respectivamente 95 y 99% de su actividad ATPasa (columnas "OOM Sup./ OOM" y "FC12 Sup./ FC12", respectivamente), en relaci6n con la actividad BmrA que se puede medir en las membranas naturales ("BmrA Mb"). Sin embargo, esta actividad ATPasa se recupera despues de la eliminaci6n de los detergentes y la reconstituci6n en los liposomas (fig. 11, columnas "OOM Sup./ Lip" y "FC12 Sup./ Lip").

Cuando los derivados calixarenos C4C3 y C4C7 se utilizan sucesivamente (ver ejemplo 15), se conserva aproximadamente el 50% de la actividad ATPasa, lo que demuestra que estos detergentes calixarenos permiten mantener la proteina de membrana en soluci6n de una manera mas rigida, a diferencia de los detergentes OOM y FC12. Oe hecho, la estructura rigida de cono de los calixarenos de f6rmula (I) permite la formaci6n de micelas rigidas que para las proteinas constituyen un medio comparable al medio de la membrana, lo que permite una mejor conservaci6n de su estructura tridimensional y, por lo tanto, de su actividad.

Ejemplo 15: Extraccion � purificacion de proteinas de la familia de transportadores ABC, con calixarenos de formula (I)

La ventaja de la extracci6n diferencial de la proteina BmrA utilizando sucesivamente los calixarenos C4C3 y luego C4C7, ha permitido enriquecer la fracci6n del material sobrenadante (tal y como se muestra en la fig. 12A), antes de una purificaci6n posterior mediante cromatografia (figuras 12BE).

El material sobrenadante de C4C7 (muestra "C4C7 S" en la figura 12A) se ha sometido a una cromatografia de afinidad a niquel (figuras 12B y 12C), siendo portadora la proteina BmrA de un marcador de hexahistidina en su extremo Nterminal. La proteina se asocia de este modo a la resina y se eluye con imidazol en presencia de NaCl 0,3 M, por lo que es posible evitar la quelaci6n del niquel a traves del calixareno triani6nico.

El mismo material sobrenadante tambien se ha sometido a una cromatografia de filtraci6n en gel, en presencia de Foscolina 12 (figura 12O), con el fin de verificar el estado de oligomerizaci6n del transportador. BmrA se eluye con un volumen de 12 ml, que corresponde a un peso molecular aparente de 200.000 Oa, que es un valor compatible con una forma dimerica de BmrA (2 x 65000 Oa) y una micela de FC12 (70.000 Oa). Ourante esta etapa, el calixareno C4C7 se ha intercambiado con FC12 y se ha eluido entre 15 y 25 ml, de acuerdo con la detecci6n con UV (OO a 280 nm en miliunidades de absorci6n mAU) y con SOSPAGE (recuadro en la figura 12O). La fracci6n de BmrA (representada por una estrella en la figura 12O) esta activa (fracci6n a de la figura 12E), a pesar de la presencia de FC12, lo que sugiere que una estructura funcional de BmrA se conserva despues de solubilizaci6n con C4C7, y/o trazas de C4C7 permanecen unidas a la proteina. Una actividad ATPasa elevada se recupera despues de la reconstituci6n de BmrA en los liposomas (fracci6n b en la figura 12E). Estos resultados muestran claramente que una proteina de membrana se puede purificar mediante el uso de una pareja de calixarenos de f6rmula (I) y las etapas de cromatografia, conservando en cada una de estas etapas la integridad funcional de la proteina.

�istado de Referencias

[1]. Juliano, R. L. y Ling, V. (1976) A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants, Biochim Biophys Acta 455, 152162.

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[3]. Litman, T., Brangi, M., Hudson, E., Fetsch, P., Abati, A., Ross, O. O., Miyake, K., Resau, J. H. y B�tes, S. E. (2000) The multidrugresistant phenotype associated with overexpression of the new ABC halftransporter, MXR (ABCG2), J Cell Sci 113 ( Pt 11), 20112021.

10 [4]. Chami, M., Steinfels, E., Orelle, C, Jault, J. M., Oi Pietro, A., Rigaud, J. L. y Marco, S. (2002) Threedimensional structure by cryoelectron microscopy of �vcC, an homodimeric ATPbinding cassette transporter from Bacillus subtilis, J Mol Biol 315, 10751085.

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15 Chem. 278, 4700247008.

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20 Characterization of �vcC (BmrA), a multidrug ABC transporter constitutively expressed in Bacillus subtilis, Biochemistry 43, 74917502.

[8]. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. O., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Oison, B. J. y Klenk, O. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal. Biochem. 150, 7685.

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[10]. Oecottignies, A., Grant, A. M., Nichols, J. W., de Wet, H., Mclntosh, O. B. y Goffeau, A. (1998) ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein �or1 p, J. Biol. Chem. 273, 1261212622.

Claims (14)

1. REIvINDICACIONES

   1. Metodo para extraer selectivamente proteinas de membrana, es decir, proteinas asociadas a membranas biol6gicas, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una soluci6n acuosa que comprende una o varias proteinas de membrana de la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno, caracterizado porque el calixareno es un calixareno de f6rmula (I):

   en donde:

   •

   n es un numero entero igual a 1, 3, 5 o 6;

   �

   R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal

   10 o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios heteroatomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C112) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo COOR en donde R es un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado; un grupo arilo que comprende de 6 a 20 atomos de carbono;

   � X1, X2 y X3 independientemente uno de otro representan un grupo (CH2)mCOOR' en donde

   m es un numero entero de 0 a 10, 15 R' representa un atomo de hidr6geno o un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado;

   o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
2. 2. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde la extracci6n selectiva de la proteina de membrana se lleva a cabo utilizando al menos un calixareno de f6rmula (I) en la que:

   • n es un numero entero igual a 1; 20 � R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal

   o ramificado;

   � X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2)mCOOR' en donde m es un numero entero de 0 a 10, R' representa un atomo de hidr6geno;

   25 o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
3. 3. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proteina de membrana que se va a extraer esta presente en una fracci6n de membrana biol6gica derivada de un organismo procariota o eucariota, sano

   o alterado.
4. 4. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteina de membrana es 30 una proteina seleccionada entre el grupo que comprende las proteinas de transporte.

5. 5.

   Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en donde la proteina de transporte es un transportador ABC, seleccionado entre el grupo que comprende las glicoproteinas P (Pgp/ABCB1), MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2 y BmrA.

6. 6.

   Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa de puesta en con

   tacto de una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de f6rmula (I) se efectua a un pH que varia de 5,5 hasta 10.

7. 7.

   Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa de puesta en con

   tacto de una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixa5 reno de f6rmula (I) se efectua a una temperatura que varia de 0 a 100°C.

8. 8.

   Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa de puesta en contacto de una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de f6rmula (I) se efectua a una concentraci6n de calixareno que oscila entre 106 a 102 M.

9. 9.

   Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa de puesta en con

   10 tacto de una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de f6rmula (I) se efectua con calixarenos en soluci6n o con calixarenos en agregados coloidales.

10. 10.

    Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en donde el agregado coloidal se selecciona entre el grupo que comprende micelas, liposomas y nanoparticulas lipidicas.

11. 11.

    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la etapa de puesta en con

    15 tacto de una soluci6n acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de f6rmula (I) se efectua eventualmente en presencia de al menos un cosoluto seleccionado entre el grupo que comprende:

    i) sales organicas e inorganicas seleccionadas entre el grupo que comprende sales farmaceuticamente aceptables;

    20 ii) pequefas moleculas bioactivas seleccionadas entre el grupo de los aminoacidos, vitaminas, lipidos, esteroides, carbohidratos o metabolitos;

    iii) moleculas bioactivas olig6meras seleccionadas entre el grupo de los peptidos, oligonucle6tidos, oligosacaridos;

    iv) moleculas biol6gicas polimeras seleccionadas entre el grupo de las proteinas, polinucle6tidos y polisaca25 ridos.
12. 12. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la etapa de puesta en contacto esta precedida por una etapa en la cual:

    la proteina de membrana que se va a extraer o la fracci6n de membrana que la contiene se disuelve en una soluci6n tamp6n, y

    30 el calixareno de f6rmula (I) se afade de acuerdo con las condiciones descritas en las reivindicaciones 6 a
13. 11.
14. 13. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las proteinas que forman un complejo con los calixarenos de f6rmula (I) y las proteinas que no forman un complejo se separan por centrifugaci6n.

    35 14. Proteina de membrana que forma un complejo con al menos un calixareno de f6rmula (I) tal y como se define en la reivindicaci6n 1, obteniendose dicha proteina de membrana que forma un complejo por un metodo de extracci6n de acuerdo con la reivindicaci6n 13.

    �igura 1