ES2374370A1 - Método para la detección de daño renal. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección de daño renal.La invención se refiere a un método para determinar la presencia de daño renal en un individuo así como un método para predecir la progresión de dicho daño renal por medio de la detección de Reg3B así como adicionalmente, por medio de la detección de una o varias proteínas que se seleccionan de la lista que comprende, fetuina B, Ras-related GTP-binding proteín A, inhibidor de la proteína serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por ejemplo la gentamicina.
Description
Método para la detección de daño renal.
La invención se refiere a un método para
determinar la presencia de daño renal en un individuo así como un
método para predecir la progresión de dicho daño renal por medio de
la detección de una o varias proteínas que se seleccionan de la
lista que comprende Reg3B, fetuina B, Ras-related
GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína
serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa,
gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A,
alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa,
ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal
puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser
causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el
agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por
ejemplo la gentamicina.
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Los antibióticos aminoglucósidos se usan
ampliamente contra infecciones bacterianas. Concretamente, la
gentamicina se usa contra las infecciones Gram negativas. Su
eficacia y uso terapéutico están gravemente obstaculizados por su
toxicidad, que se produce principalmente a nivel renal y auditivo
(Martínez-Salgado C, López-Hernández
FJ y López-Novoa JM. 2007, Toxicol Appl
Pharmacol., 223: 86-98). La nefrotoxicidad
inducida por gentamicina aparece en el 10-25% de los
tratamientos (Leehey DJ et al., 1993, J. Am. Soc.
Nephrol., 4: 81-90). Se caracteriza
principalmente por daño tubular (Nakakuki M et al., 1996,
Can J Physiol Pharmacol., 74: 104-111), pero
también podrían aparecer alteraciones glomerulares
(Martínez-Salgado C, López-Hernández
FJ y López-Novoa JM. 2007, Toxicol Appl
Pharmacol., 223: 86-98) y vasculares (Goto T
et al., 2004, Virchows Arch., 444:
362-74; Segilmi§ MA, et al., 2005, Nephron
Physiol., 100: 13-20) de forma dependiente de la
dosis (Hishida A et al., 1994, Ren Fail., 16:
109-116). El daño tubular afecta principalmente al
túbulo proximal en el que, dependiendo de la intensidad de la
agresión, la lesión puede oscilar desde un descamado epitelial leve
hasta una necrosis tubular más grave (Nakakuki et al., 1996.
Can J Physiol Pharmacol., 74: 104-111). Las
lesiones tubulares dan como resultado un desequilibrio en la
capacidad de resorción que activa la retroalimentación
tubuloglomerular, que reduce drásticamente la tasa de filtración
glomerular (TFG) para evitar una pérdida masiva de fluido.
Finalmente, la gentamicina reduce el flujo sanguíneo renal (FSR) por
contracción tanto de las arterias preglomerulares, como de las
arteriolas aferentes y eferentes (Klotman et al., 1983.
Kidney Int., 24: 638-643). Como consecuencia
de una FSR menor, la TFG se deteriora. Un menor FSR también
contribuye
a la necrosis tisular, especialmente en el interior de la zona cortical (Cheung et al, 2008. Drugs Aging, 25: 455-476).
a la necrosis tisular, especialmente en el interior de la zona cortical (Cheung et al, 2008. Drugs Aging, 25: 455-476).
Dependiendo de la edad, sexo, función renal
anterior, duración del tratamiento, pauta terapéutica, nivel de
hidratación y otros estados concomitantes (por ejemplo., embarazo o
hipotiroidismo), la nefrotoxicidad asociada con gentamicina puede a
veces llegar al fallo renal agudo.
El fallo real agudo es un tipo de daño renal en
el que se manifiesta una pérdida de la función excretora del riñón,
suficiente para impedir la limpieza de la sangre de productos de
deshecho y agua así como de mantener el balance electrolítico
(Bellomo R, Kellum JA y Ronco C, 2007. Intensive Care Med.,
33: 409-413). El fallo renal agudo puede estar
inducido por una amplia variedad de agresiones entre las que se
incluyen fármacos, tóxicos químicos, hipoxia, obstrucción de las
vías urinarias, infecciones y otros (Binswanger U, 1997. Kidney
Blood Press Res., 20: 163). Este tipo de daño renal representa
una enorme sobrecarga humana y socioeconómica derivada de su elevada
incidencia y tasa de mortalidad. Se estima que casi el 1% de
ingresos hospitalarios están asociados con el fallo renal agudo, y
aproximadamente el 2-7% de los pacientes
hospitalizados eventualmente lo desarrollan. Más importante, la
mortalidad entre los pacientes de un fallo renal agudo se mantiene
remarcablemente elevada en aproximadamente un 50% de los casos.
En la práctica clínica, un fallo renal agudo se
diagnostica cuando la disfunción renal produce síntomas que se
pueden medir. Estos típicamente se basan en la determinación de los
niveles de creatinina y urea Lo más habitual es que sus
concentraciones en suero aumenten a medida que la TFG disminuye. Sin
embargo, en ese estado en el que ya se observa aumento de los
niveles séricos de urea y creatinina, el fallo renal agudo resulta
difícil de tratar. Así, las tendencias actuales en el diagnóstico
buscan detectar eventos fisiopatológicos incipientes producidos en
etapas tempranas, cuando el daño está menos extendido (Vaidya VS,
Ferguson MA y Bonventre JV, 2008. Rev Pharmacol Toxicol.,
48:463-493). Entre estos, la medida de ciertas
enzimas celulares presentes en la orina como consecuencia de la
rotura de células tubulares es actualmente el procedimiento más
refinado para una detección temprana del fallo renal agudo, que
cursa con daño tubular. Estas enzimas incluyen
N-acetil-D-glucosaminidasa
(NAG), pero también otras como lactato deshidrogenasa (DHL),
fosfatasa alcalina (ALP) o gammaglutamil transpeptidasa (GGT). La
mayor parte de estas enzimas tienen un valor moderado como
marcadores urinarios tempranos y sensibles del fallo renal agudo,
debido principalmente a problemas de estabilidad e inhibición por
otros componentes de la orina (Vaidya VS, Ferguson MA y Bonventre
JV, 2008. Rev Pharmacol Toxicol., 48:
463-493). Marcadores tempranos de última generación
incluyen, entre otros, la medida en la orina de la molécula de daño
renal 1 (KIM-1), o de la lipocalina asociada a la
gelatinasa neutrófila (NGAL) (Vaidya y cols., 2008).
Sin embargo, existen todavía aspectos
susceptibles de mejora en el diagnostico del daño renal agudo. Uno
de esos aspectos es el diagnóstico etiológico del daño, es decir, no
solamente la detección precoz del daño, sino también de su causa.
Este aspecto cobra especial importancia en situaciones clínicas en
las que convergen diversos agentes potencialmente neurotóxicos en el
mismo individuo al mismo tiempo, como por ejemplo diferentes
fármacos potencialmente nocivos para los riñones. En estas
circunstancias, cuando aparecen los primeros síntomas de
nefrotoxicidad, es imposible saber con la tecnología diagnostica
actual cual de los fármacos es el causante del daño, lo que impide
sustituir solamente ese o cambiar sólo su régimen terapéutico sin
alterar el de los otros fármacos. Entre los fármacos de este tipo se
pueden destacar los antibióticos aminoglucósidos. De esta manera se
conseguiría proporcionar La identificación de marcadores o
colecciones de marcadores específicos de cada agente potencialmente
neurotóxico permitiría realizar un tratamiento más racional,
individualizado y específico de situaciones clínicas cotidianas como
los tratamientos simultáneos que contienen dos o más fármacos
potencialmente nefrotóxicos. Esto permitiría redirigir correctamente
el tratamiento sustituyendo únicamente el fármaco dañino o volviendo
a conformar su pauta terapéutica.
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La invención se refiere a un método para
determinar un daño renal en un individuo así como un método para
predecir la progresión de dicho daño renal por medio de la detección
de una o varias proteínas que se seleccionan de la lista que
comprende Reg3B, fetuina B, Ras-related
GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína
serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa,
gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A,
alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa,
ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal
puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser
causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el
agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por
ejemplo la gentamicina.
La presente invención proporciona evidencias de
que el daño renal o un fallo renal agudo inducido por ejemplo, pero
sin limitarse, por gentamicina, está relacionado con un incremento
en la excreción de cualquier proteína seleccionada de la lista
mencionada en el párrafo anterior, o de cualquiera de sus
combinaciones.
Por tanto, la presente invención proporciona
herramientas para la detección de un daño renal o de un fallo renal
agudo. Estas herramientas permiten la predicción de la progresión de
un daño renal o de un fallo renal agudo, es decir, la supervisión de
la progresión de dicha patología cuando la persona sea tratada con,
por ejemplo, pero sin limitarse, sustancias terapéuticas, o cuando
la persona está expuesta a cualquier condición o a cualquier agente
nefrotóxico o no nefrotóxico.
Además, la presente invención presenta una
ventaja importante: La detección de una proteína, o de cualquiera de
sus fragmentos, que se selecciona de la lista que comprende Reg3B,
fetuina B, Ras-related
GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína
serina A3L (serpina A3L), subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la
ATP sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1 A,
alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa,
ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K (serpina A3K),
en muestras de orina, supone una ventaja adicional para el paciente
ya que la evacuación de este fluido biológico es hecho fisiológico
necesario que ocurre normalmente. Esto supone un muestreo no
agresivo en el individuo.
A continuación se lleva a cabo una breve
descripción de las proteínas detectadas y/o cuantificadas en el
método de la presente invención.
Reg3B (conocida también, entre otros sinónimos,
como Regenerating islet-derived protein 3 beta,
pancreatic stone protein 2, Pap, Pap1, HIP, INGAP,
pancreatitis-associated protein,
Pancreatitis-associated protein 1,
REG-III o RegIII [beta], Reg
III-beta). Esta proteína se ha relacionado con la
lectina. Reg3B está presente en pequeñas cantidades en un páncreas
normal pero está sobreexpresada durante la fase aguda de la
pancreatitis. Puede estar involucrada en la respuesta para el
control de la proliferación bacteriana durante la pancreatitis
aguda. Se ha conseguido clonar.
La fetuina B (conocida también, entre otros,
como 16G2, Fetuin-B precursor, Gugu, IRL685).
La fetuina es una proteína que se sintetiza en el hígado y es
secretada al torrente sanguíneo. Pertenece a un grupo numeroso de
proteínas que posibilitan el transporte y la disponibilidad de una
amplia variedad de sustancias en el torrente sanguíneo. Esta
proteína es más abundante en la sangre fetal que en la del individuo
adulto, de ahí el nombre de "fetuin".
Ras-related
GTP-binding protein A (conocida también, entre
otros, como Rag A, FIP1, FIP-1, RagA, RAGA, RRAGA,
Rag A, Ras-related GTP-binding
protein A o Adenovirus E3 14.7
kDa-interacting protein 1). Esta proteína puede
estar en forma de homodímero. Participa en la ruta
RCC1/Ran-GTPasa y puede desempeñar una función
directa en la señalización mediada por TNF-alfa, que
produce la inducción de la muerte celular. Se expresa de forma
ubicua en músculo esquelético, corazón y cerebro.
La proteína serpina A3L (algunos sinónimos para
referirse a esta proteína son serine protease inhibitor A3L,
serine protease inhibitor 1 o
contratripsin-like protease inhibitor 3),
pertenece a un grupo de proteínas capaces de inhibir otras enzimas
del grupo de las proteasas. El nombre serpina deriva de la
combinación de Serpin (Serine protease inhibitor) en virtud
de sus propiedades funcionales. La serpina A3L se induce por
hormonas de crecimiento y se ha descrito una reducción de los
niveles de expresión de la misma en ratas durante inflamación aguda.
El producto de la expresión del gen se ha localizado en hígado de
Rattus norvegicus (rata). La proteína serpina A3K (algunos
otros sinónimos para referirse a esta proteína son
contratripsin-like protease inhibitor 1,
Kallikrein-binding protein, serine protease
inhibitor 2 o growth hormone-regulated
proteinase inhibitor) es una proteína serpina extracelular que
ha mostrado niveles bajos en retinas de ratas que padecen diabetes,
lo que puede contribuir a una retinopatía.
El signalosoma COP9 es un complejo proteico
conservado en células eucariotas compuesto por ocho subunidades
(CSN1 a CSN8). COP9 es un regulador de la ubiquitinación. La
ubiquitinación consiste en el proceso de mareaje de proteínas por
medio de la proteína ubiquitina para su proteolisis. La ubiquitina
se ancla a la proteína que se ha de eliminar y de esta forma, la
proteína marcada se mueve hacia el proteasoma, una estructura donde
se lleva a cabo el proceso de la proteolisis.
La subunidad gamma del complejo de la ATP
sintasa (también conocida como subunidad gamma de la ATPasa tipo F)
forma el eje central que conecta el dominio F0 de rotación al
dominio catalizador F1 del complejo. La proteína ATP sintasa produce
ATP utilizando ADP en presencia de un gradiente de protones entre el
exterior y el interior de la célula. Las ATPasas tipo F tienen dos
componentes, el componente F1, con función catalizadora y el
componente F0, que es el canal de protones embebido en la membrana.
F1 tiene cinco subunidades: alfa, beta, gamma, delta y epsilon. F0
tiene tres subunidades principales: a, b y c. La subunidad gamma es
importante en la regulación de la actividad del complejo y en el
flujo de protones.
La gelsolina es una proteína globular de 82 KDa
con seis subdominios, llamados S1-S6. Esta proteína
está implicada en el ensamblaje de los filamentos de actina.
La ribonucleasa (RNasa), es una enzima
(nucleasa) que cataliza la hidrólisis de ARN en componentes más
pequeños. La ribonucleasa UK114 es responsable de la inhibición de
la traducción, hidrolizando el ARNm. La ribonucleasa 4 (RNasa 4) es
una proteína de unos 16 kDa que tiene preferencia por la hidrólisis
de polímeros de ácido ribonucleico.
La enzima aminoacilasa 1 (Acy 1) se clocaliza en
el citosol, es homodimérica, dependiente de su unión a zinc y
cataliza la hidrólisis de L aminoácidos acilados.
La enzima alfa-enolasa, una
conocida enzima glucolítica, ha sido identificada como un
autoantígeno de la encefalopatía Hashimoto, así como se ha
relacionado con asma severo. La disminución en la expresión de la
enzima ha sido encontrada en córneas de personas que padecen
queratocono.
La queratina 5 es una citoqueratina
frecuentemente relacionada con la queratina 14. Las citoqueratinas
tipo II consisten en proteínas básicas o neutrales que están
organizadas en pares de cadenas distintas de queratina coexpresadas
durante la diferenciación de tejidos epiteliales simples y
estratificados. Mutaciones en estos genes se han asociado con
enfermedades llamadas epidermolisis simples.
La proteína parvalbúmina es una albúmina de bajo
peso molecular (normalmente 9-11 kDa) que necesita
unirse a calcio para ejercer su función. Está estructuralmente
relacionada con calmodulina y troponina C. La parvalbúmina está
localizada en los músculos de rápida contracción así como en el
cerebro y algunos tejidos endocrinos.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un método de obtención de datos útiles para determinar un
daño renal, que comprende:
- a.
- obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
- b.
- detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en (a) al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
- -
- una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
- -
- una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
- -
- una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
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El término "daño renal" tal como se
entiende en la presente invención se refiere a cualquier daño en el
sistema renal de un individuo que puede ocasionar o no una condición
en el individuo que permita o no permita asignar dicha condición a
una enfermedad renal. El origen de dicho daño renal puede ser, por
ejemplo, pero sin limitarse, genético, inmune, isquémico o un
tratamiento con cualquier fármaco. El daño renal o enfermedad antes
mencionados puede ser también producido por un procedimiento
quirúrgico, por ejemplo, pero sin limitarse, de riñón, de próstata,
de vejiga, de uréter o de uretra.
A continuación se describe la correspondencia de
las secuencias citadas con las proteínas descritas así como los
números de acceso (entre paréntesis) de cada una de ellas y el
organismo del que proceden:
- -
- SEQ ID NO: 1; Reg3A (AAX29964 o NP_002571.1), correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 2; fetuina B (NP_055190.2, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 3; inhibidor de la proteína serina A3K (P05545.3, correspondiente a Rattus norvegicus),
- -
- SEQ ID NO: 4; subunidad gamma de la ATP sintasa (NP_001001973.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 5; gelsolina (NP_000168.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 6; ribonucleasa UK114 (P52758.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 7; aminoacilasa 1A (NP_000657.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 8; alfa-enolasa (AAB88178.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 9; queratina 5 (NP_000415.2, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 10; parvalbúmina alfa (P20472.2, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 11; ribonucleasa 4 (AAA96750.1, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 12; inhibidor de la proteína serina A3L (P05544.3, correspondiente a Rattus norvegicus)
- -
- SEQ ID NO: 13; subunidad 1 de COP9 (Q13098.4, correspondiente a Homo sapiens),
- -
- SEQ ID NO: 14; Ras-related GTP-binding protein A (NP_006561.1, correspondiente a Homo sapiens).
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de identidad se ha establecido en
base a la determinación del % de identidad de la secuencia
aminoacídica de la proteína correspondiente a Homo sapiens
con respecto a la secuencia aminoacídica de la proteína
correspondiente a Rattus norvegicus (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "% de identidad" entre dos
secuencias de aminoácidos, tal como se entiende en la presente
invención, se refiere al número de posiciones aminoacídicas sobre la
longitud total de la secuencia que se compara, donde todos los
aminoácidos en esa posición son idénticos.
Más preferiblemente, en el apartado (b) del
método se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera
de sus combinaciones, con:
- -
- al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
- -
- al menos un 80, 85, 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
- -
- al menos un 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
\vskip1.000000\baselineskip
En adelante, cuando se haga referencia a
cualquiera de las proteínas de la presente invención se tendrá en
cuenta que también puede detectarse cualquier proteína con el
porcentaje de identidad que se ha mencionado en párrafos
precedentes, según la proteína de la que se trate. Por tanto, en
adelante, se podrá hacer referencia a cualquiera de las proteínas de
la presente invención como "proteína de la invención" o
"proteína de la presente invención".
Para detectar y/o cuantificar la proteína de la
presente invención es suficiente con detectar uno o más fragmentos
de dicha proteína ya que dicho fragmento es un constituyente de la
secuencia aminoacídica y de la estructura de la proteína.
El apartado (b) del método de la presente
invención se refiere a la detección y la cuantificación de la
proteína, o de cualquiera de sus fragmentos, o se refiere también a
su detección o a su cuantificación. Dicha detección y/o
cuantificación se puede llevar a cabo por medio de cualquier técnica
conocida en el estado de la técnica.
Por otra parte, tal como se ha mencionado, el
método de la presente invención se puede llevar a cabo mediante la
detección y/o cuantificación de la combinación de cualquiera de las
proteínas de la lista citada anteriormente o de la combinación de
cualquiera de los fragmentos de dichas proteínas. Además, el término
"cualquiera de sus combinaciones" también se refiere a que una
o más proteínas de la invención (o cualquiera de sus fragmentos),
pueden ser detectadas en combinación con la detección de cualquier
otra proteína diferente de cualquiera de las proteínas de la
presente invención.
Cualquiera de las proteínas de la presente
invención es el producto de la expresión de una secuencia
nucleotídica. Esta secuencia nucleotídica puede ser, por ejemplo
pero sin limitarse, cualquier ARN como por ejemplo, pero sin
limitarse, ARN mensajero (ARNm), o cualquiera de sus fragmentos. La
secuencia nucleotídica puede ser también ADN complementario (ADNc) o
cualquier de sus fragmentos. El ADNc es un ADN complementario a un
ARMm o es también la secuencia nucleotídica que comprende los exones
de la secuencia nucleotídica genómica pero no los intrones, es
decir, el ADNc es la secuencia codificante. La transcripción de la
secuencia nucleotídica genómica del gen que codifica para la
proteína y su ADNc codifican para el mismo ARNm y, por tanto, para
la misma proteína. En la presente invención también es posible
detectar cualquier ARN o cualquier ADN, o cualquiera de sus
fragmentos, en lugar de la detección de la proteína, o
simultáneamente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Una realización preferida se refiere al método
de obtención de datos útiles para determinar un daño renal, donde se
detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus
combinaciones, seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 1
a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere a un
método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal,
donde se detecta y/o cuantifica una proteína con al menos un 60% de
identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos
un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus
fragmentos. Según una realización más preferida, se detecta y/o
cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera
de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere a un
método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal,
donde además comprende la comparación de los datos obtenidos en el
apartado (b) con datos obtenidos de muestras control para buscar
alguna desviación significativa.
El término "muestras control" tal como se
entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin
limitarse, a una muestra obtenida de un individuo que no desarrolla
un daño renal (individuo sano). Este tipo de muestra control, es un
muestra control negativa o control negativo para un daño renal.
El término "desviación significativa" tal
como se entiende en la presente invención se refiere, a la presencia
de la proteína en la muestra aislada, o una mayor concentración de
la proteína de la invención en la muestra aislada respecto de una
muestra aislada procedente de un individuo sano. La selección del
individuo sano se lleva a cabo por medio de la medida del nivel de
uno o más marcadores comunes de un daño renal. El marcador común se
selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse,
creatinina, blood urea nitrogen (BUN) o proteinuria.
La muestra biológica aislada de un organismo,
como por ejemplo, pero sin limitarse, un humano u otro animal, puede
ser un fluido biológico o cualquier tejido celular de dichos
organismos.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere a un método para la determinación de un daño
renal que comprende los apartados de los métodos de obtención de
datos descritos en párrafos anteriores y además comprende la
atribución de la desviación significativa al desarrollo de dicho
daño renal, en el individuo. En consecuencia, esta realización
preferida es un método para diagnosticar un daño renal.
Otra realización preferida se refiere al método
de obtención de datos útiles para determinar un daño renal donde el
daño renal es un fallo renal agudo. El término "fallo renal
agudo", tal como se entiende en la presente invención, se refiere
a una insuficiencia renal aguda en cualquier etapa (o gravedad) de
una disfunción renal. El origen de fallo renal agudo puede ser, por
ejemplo, pero sin limitarse, genético, inmune, isquémico o un
tratamiento con cualquier droga. El fallo renal agudo puede ser
producido también por un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, pero
sin limitarse, de riñón, de próstata, de vejiga, de uréter o de
uretra.
En otra realización preferida del método de
obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un fallo
renal agudo, la muestra biológica del apartado (a) es un fluido
biológico. El fluido biológico puede incluir fluidos que son
excretados o secretados por el cuerpo animal así como fluidos que no
son excretados o secretados. El fluido biológico se selecciona de la
lista que comprende, pero sin limitarse, fluido amniótico rodeando
al feto, humor acuoso, sangre, plasma, fluido intersticial, linfa,
leche, mucus (incluyendo secreción nasal y flema), saliva, sebo
(aceite de la piel), suero, sudor, lágrimas u orina. La proteína de
la presente invención puede ubicarse en cualquier compartimento
biológico presente en el mencionado fluido biológico como por
ejemplo, pero sin limitarse, en una célula o en una vesícula. En una
realización más preferida, el fluido biológico es orina.
Otra realización preferida se refiere al método
de obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un
fallo renal agudo, donde la proteína, o cualquier fragmento de la
misma, es detectada y/o cuantificada por medio de electroforesis,
immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray.
La detección y/o cuantificación de la proteína
de la presente invención puede llevarse a cabo por medio de
cualquiera de las técnicas mencionadas o por cualquier combinación
de las mismas. La proteína puede ser detectada evaluando su
presencia o ausencia. La detección puede llevarse a cabo por medio
del reconocimiento específico de cualquier fragmento de la proteína
por medio de cualquier sonda y/o cualquier anticuerpo. La proteína
de la presente invención, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser
cuantificada, sirviendo estos datos como referencia para compararlos
con los datos obtenidos en la muestra control y buscar alguna
desviación significativa. Esta desviación significativa puede ser
asignada al diagnóstico de un daño renal en el individuo del que
procede la muestra problema. En una realización preferida, la
proteína de la invención, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser
detectada y/o cuantificada por medio de electroforesis y/o
inmunoensayo.
La electroforesis es una técnica analítica de
separación basado en el movimiento o la migración de
macro-moléculas disueltas en un medio (buffer
de electroforesis), mediante una matriz o un sólido apoyo como
resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de
la molécula depende de su movilidad electroforética y esta movilidad
depende de la carga, tamaño y forma. Existen numerosas variaciones
de esta técnica basadas en el equipamiento usado, soportes y
condiciones para llevar a cabo la separación de las proteínas. La
electroforesis se selecciona de la lista que comprende, pero sin
limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel,
electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de
poliacrilamida, isoelectroenfoque o electroforesis
bidimensional.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que
mide la concentración de una sustancia en un líquido biológico
usando la reacción de un anticuerpo o anticuerpos con alguno de sus
antígenos. El ensayo aprovecha la especificidad de un anticuerpo con
su antígeno. La cantidad de anticuerpo o antígeno puede detectarse
por medio de métodos conocidos en el estado de la técnica. Uno de
los métodos más comunes es el que se basa en el mareaje del antígeno
o de los anticuerpos. El mareaje puede llevarse a cabo, pero sin
limitarse, una enzima, radioisótopos (radioinmunoensayo), etiquetas
magnéticas (inmunoensayo magnético) o fluorescencia, y también otras
técnicas incluidas aglutinación, nefelometría, turbidimetría o
Western Blot. Los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos
o no competitivos. El inmunoensayo puede ser competitivo: la
respuesta será inversamente proporcional a la concentración de
antígeno en la muestra, o puede ser no competitivo (conocido también
como "sandwich assay"): los resultados son directamente
proporcionales a la concentración del antígeno. Una técnica de
inmunoensayo que puede ser utilizada en la presente invención es el
ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay).
Por medio de las técnicas cromatográficas, las
moléculas pueden ser separadas, pero sin limitarse, por su carga,
tamaño, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su
potencial redox. La técnica de cromatografía se selecciona, pero sin
limitarse, cromatografía de líquidos (cromatografía de partición,
cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión o
cromatografía de intercambio iónico), cromatografía de gases o
cromatografía de fluidos supercríticos.
La tecnología de microarray de la presente
invención está basada, por ejemplo, sobre la fijación en un soporte
sólido de una molécula que reconoce la proteína de la presente
invención. El microarray basado en anticuerpos es el microarray de
proteínas más común. En este caso, los anticuerpos se fijan en el
soporte sólido (también se puede emplear el término chip para
referirse a microarray). Estos anticuerpos son utilizados para
capturar moléculas que permiten la detección de proteínas
procedentes, pero sin limitarse, de muestras biológicas, de lisados
celulares, de suero o de orina. El término "soporte sólido" tal
como se emplea en la presente invención se refiere a una gran
variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, intercambio
de iones o resina adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel,
ésteres de celulosa, esferas paramagnéticas o la combinación de
algunos de ellos.
Según otra realización preferida del método de
obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un fallo
renal agudo de la presente invención, el daño renal o el fallo renal
agudo es producido por la administración o por la exposición del
individuo a, al menos, un agente nefrotóxico. Una realización más
preferida se refiere al método donde el agente nefrotóxico es un
antibiótico aminoglucósido.
Este agente nefrotóxico puede causar una o más
patologías renales debido al nivel de la administración o de
exposición. Dicha administración o exposición puede tener lugar
durante un periodo de tiempo o puede estar limitado a un
acontecimiento único, así como también puede deberse a uno o varios
compuestos. Las circunstancias de la exposición pueden ser
involuntarias, accidentales, intencionadas, como consecuencia de una
sobredosis o como consecuencia de una necesidad terapéutica
(administración). El riñón es el órgano principal de la excreción
porque mantiene la homeostasis de moléculas solubles en agua, y
puede concentrar determinadas sustancias activamente. En general, el
túbulo proximal, distal o urinario pueden ser reparados, pero los
glomérulos y la médula pueden tener una reparación
significativamente menor.
El agente nefrotóxico, cuando es administrado,
puede ser una composición farmacéutica (sustancia terapéutica) o,
pero sin limitarse, anestésicos halogenados o un compuesto que está
incluido en un alimento funcional, o en un complemento vitamínico, o
en un complemento nutricional. El agente nefrotóxico, cuando el
individuo está expuesto, puede ser además, un químico como por
ejemplo, pero sin limitarse, metal pesado, plaguicida o
antimicrobiano. El plaguicida puede ser, pero sin limitarse, un
fungicida, un herbicida, un insecticida, un algicida, un
molusquicida, un acaricida o un raticida. El insecticida puede ser,
pero sin limitarse, un bactericida, un antibiótico, un
antibacteriano, un antiviral, un antifúngico, un antiprotozoario o
un agente antiparasitario.
El antibiótico aminoglucósido (aminoglucósido)
ejerce su acción uniéndose a las subunidades ribosomales 30S y 50S
bacterianas, inhibiendo la translocación de la
peptidil-tRNA y también causando lectura errónea de
ARNm, dejando a la bacteria incapaz de sintetizar proteínas vitales
para su crecimiento. La antibiótico aminoglucósido puede ser por
ejemplo, pero sin limitarse, amikacina, arbekacina, gentamicina,
kanamicina, neomicina netilmicina, paromomicina, rodostreptomicina,
estreptomicina, tobramicina, apramicina, espectinomicina,
higromicina B, verdamicina, astromicina o puromicina. Según una
realización aún más preferida, el antibiótico aminoglucósido es
gentamicina.
La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido
de amplio espectro comúnmente empleado para tratar las infecciones
de bacterias aeróbicas Gram negativas. Los aminoglucósidos son
absorbidos mal cuando son administrados oralmente, pero se eliminan
rápidamente por los riñones. Por otra parte, los aminoglucósidos
difunden en las células bacterianas a través de canales localizados
en la membrana exterior y son transportados hasta el citoplasma.
Como resultado, la gentamicina actúa interfiriendo con la síntesis
de proteínas bacterianas pero puede causar daño renal en el túbulo
proximal, particularmente en el segmento S1 o S2, que puede dar
lugar al desarrollo de un fallo renal agudo. El fallo renal agudo
puede ser debido, además, a la administración simultánea o
secuencial de un segundo agente nefrotóxico. Este segundo compuesto
puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, nitrato de uranilo o
cisplatino. El nitrato de uranilo es un agente nefrotóxico que
ocasiona insuficiencia renal grave y necrosis tubular aguda. Otros
órganos diana incluyen el hígado, pulmones o el cerebro. El
cisplatino es un agente antitumoral de amplio espectro comúnmente
utilizado para tratar tumores de los testículos, ovarios, vejiga,
piel, cuello o pulmones. El cisplatino difunde en las células y
funciona por intercalarse dentro y entre las cadenas de ADN,
provocando la muerte de la célula.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para predecir la progresión de un daño renal debido a la
administración de, al menos, un agente nefrotóxico, que comprende,
en primer lugar, (a) determinar una primera concentración de una
proteína, o cualquier fragmento de la misma, seleccionada de la
lista que comprende:
- -
- una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
- -
- una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
- -
- una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos,
en un fluido biológico aislado de un individuo
expuesto o no expuesto a un agente nefrotóxico. En segundo lugar se
determina una segunda concentración de la proteína cuya
concentración se ha determinado en (a), en un fluido biológico del
individuo, después de determinar la primera concentración de dicha
proteína en el individuo expuesto, o después de la iniciación de la
administración o exposición al agente nefrotóxico en el individuo no
expuesto, y (c) comparar la segunda concentración obtenida en el
apartado (b) con la primera concentración contenida en apartado (a)
para buscar alguna desviación significativa. Es decir, si la
determinación de la primera concentración se lleva a cabo en una
muestra de un individuo expuesto al agente nefrotóxico, la medida de
la segunda concentración se lleva a cabo tras la determinación de la
primera concentración, y si la determinación de la primera
concentración se lleva a cabo en una muestra de un individuo sin
exposición al agente nefrotóxico, la medida de la segunda
concentración se lleva a cabo después del comienzo de la
administración o la exposición al agente nefrotóxico del individuo.
La segunda concentración es comparada con la primera concentración
buscando cualquier desviación significativa. La desviación
significativa puede ser en el sentido de mayores o menores valores
cuando la segunda concentración es comparada con la primera
concentración, o cuando cualquier desviación significativa es
comparada con una determinación anterior de la concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
En la presente invención, el término "predecir
la progresión" se refiere a una conclusión de la monitorización o
supervisión de la progresión del daño renal, esto es, la
manifestación sobre la progresión de un daño renal debida a la
administración de, al menos, un agente nefrotóxico.
Una realización preferida se refiere al método
para predecir la progresión de un daño renal debido a la
administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde en el
apartado (a) y (b) se detecta y/o cuantifica al menos una proteína,
o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que
comprende: SEQ ID NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al método
para predecir la progresión de un daño renal debido a la
administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde se
determina la concentración de una proteína con al menos un 60% de
identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos
un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus
fragmentos.
Según una realización más preferida, se detecta
y/o cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o
cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al método
para predecir la progresión de un daño renal debido a la
administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde el daño
renal es un fallo renal agudo.
Según otra realización preferida del método para
predecir la progresión de un daño renal o de un fallo renal agudo,
el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido. Una
realización más preferida se refiere al método donde el antibiótico
aminoglucósido es gentamicina.
Otra realización preferida se refiere al método
para predecir la progresión de un daño renal o de un fallo renal
agudo, donde el fluido biológico es orina.
Para referirse a cualquiera de los métodos de la
presente invención para la obtención de datos útiles para la
determinación de un daño renal o de un fallo renal agudo, o de
cualquiera de los métodos para predecir la progresión de dicho daño
renal o de dicho fallo renal agudo, puede emplearse el término
"método/s de la presente invención" o "método/s de la
invención".
Según una realización preferida del método de la
presente invención, el individuo es un humano. El individuo del
método de la invención puede ser un animal ya que el citado método
es útil para usos veterinarios.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones,
seleccionada de la lista que comprende:
- -
- una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
- -
- una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos,
como biomarcador para determinar un daño renal o
para predecir la progresión de un daño renal.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida se refiere al uso
donde se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera
de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID
NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al uso,
donde se determina la concentración de una proteína con al menos un
60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al
menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera
de sus fragmentos. Según una realización más preferida, se detecta
y/o cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o
cualquiera de sus fragmentos.
Este biomarcador indica un cambio en la
expresión o estado de una proteína relacionada con un daño renal o
con la progresión de un daño renal. Una vez que el bioindicador ha
sido validado, puede ser utilizado para diagnosticar un daño renal,
la progresión de un daño renal o para adecuar tratamientos a un
individuo para dicho daño renal, por ejemplo, tratamiento con
diversas drogas o regímenes de administración.
Si un tratamiento altera la presencia o la
concentración de biomarcador detectado que tiene una relación
directa con el riesgo de sufrir un daño renal, el bioindicador sirve
como un informador para modificar cualquier tratamiento o
exposición a cualquier agente nefrotóxico.
Una realización preferida del uso de una
proteína o cualquier fragmento de la misma es el uso donde el daño
renal o la progresión del daño renal es debido a la administración
de, al menos, un agente nefrotóxico. Según una realización más
preferida del uso de una proteína o cualquier fragmento de la misma,
el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido. Otra
realización aún más preferida es el uso donde el antibiótico
aminoglucósido es gentamicina.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit para determinar un daño renal, para obtener datos útiles
para la determinación de un daño renal o para predecir la progresión
de un daño renal, en una muestra aislada de un individuo, que
comprende, al menos, una o más sondas capaces de reconocer al menos
una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la
lista que comprende
- -
- una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
- -
- una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
- -
- una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida se refiere al kit,
donde la/s sonda/s reconoce/n al menos una proteína, o cualquiera de
sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO:
1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al kit,
donde la/s sonda/s reconoce/n una proteína con al menos un 60% de
identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos
un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus
fragmentos. Según una realización más preferida, la/s sonda/s
reconoce/n la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera
de sus fragmentos.
Una sonda es una sustancia que normalmente está
marcada (pero no necesariamente) y que se utiliza para detectar,
identificar y/o cuantificar cualquier proteína de la presente
invención o cualquier fragmento de la misma. La sonda puede ser,
pero sin limitarse, una sonda que reacciona con grupos thiol,
biotina, avidina, estreptavidina o peptina. El soporte sólido es
preferiblemente un gel, por ejemplo, pero sin limitarse, un gel de
agarosa o un gel de poliacrilamida.
Otra realización preferida se refiere a un kit
donde las sondas son anticuerpos capaces de reconocer la proteína o
cualquiera de sus fragmentos. Dichos anticuerpos pueden ser
policlonales o monoclonales.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Muestra la tasa de supervivencia y la
aparición de marcadores renales de daño correspondientes a ratas
tratadas con gentamicina.
A. Tasa de supervivencia representada como
porcentaje de animales supervivientes en cada grupo durante 7 días
de tratamiento, B. Imágenes representativas de análisis mediante
inmunotransferencia (Western blot) de niveles de expresión de
la molécula de daño renal 1 (KIM-1) y proteína
morfogenética ósea 7 (BMP-7) en homogenados de riñón
procedentes de 3 ratas control aleatoriamente seleccionadas y 3
ratas tratadas con gentamicina tras 7 días de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Muestra imágenes representativas del
córtex y papilla de secciones de tejido renal de ratas tratadas con
gentamicina.
Imágenes representativas del córtex
(A-D) y papilla (E-H) de secciones
de tejido renal teñidas con hematoxilina y eosina, procedentes de
ratas control (n=3) y ratas tratadas con gentamicina (n=3),
aleatoriamente elegidas. Las imágenes A, B, E y F se tomaron con un
aumento de 400x, mientras que las imágenes C, D, G y H con un
aumento de 1000x.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3. Muestra la separación mediante
SDS-PAGE de proteínas urinarias procedentes de ratas
control y ratas tratadas con gentamicina.
Las proteínas se separaron mediante
SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 6% (A) y 15%
(B), y teñidas posteriormente con azul brillante de Coomassie. Las
proteínas presentes en las bandas (1-24) se
determinaron mediante
LC-ESI-Q-TOF y
relacionadas en la tabla 3.
Hilera 1: patrones de peso molecular. Hilera 2:
Orina de control. Hilera 3: orina del grupo de la gentamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Muestra imágenes de electroforesis de
2 dimensiones (2D) de proteínas diferencialmente expresadas.
El análisis cuantitativo de intensidad usando el
programa informático Image Master 2D Platinum (GE
Healthcare) reveló 129 proteínas diferencialmente expresadas
entre las muestras de orina normal y de gentamicina. Las manchas se
marcaron con números correspondientes a los de la tabla 4 y se
identificaron mediante
LC-ESI-Q-TOF y
MALDI-TOF. Cada uno de los geles mostrados en esta
figura es representativo de 8 geles obtenidos con orina procedente
de animales aleatoriamente seleccionados de cada grupo, cada uno de
ellos analizado por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratas Wistar hembra con un peso de
200-250 g. Los animales se alojaron en condiciones
ambientales controladas en jaulas metabólicas individuales, de las
que se recogieron individualmente muestras de orina de 24 h. Se
administraron ad libitum pienso normal y agua. Las ratas se
dividieron aleatoriamente en dos grupos: (i) grupo de control (C),
recibiendo diariamente placebo i.p. durante 6 días, y (ii) grupo de
gentamicina (G), recibiendo diariamente una dosis i.p. de
gentamicina (150 mg/kg de peso corporal) durante 6 días. En el día
7, los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico y los
riñones se perfundieron desde la aorta con solución salina (0,9% de
NaCl) para eliminar la sangre. Inmediatamente, los riñones se
diseccionaron. Uno de estos se congeló en nitrógeno líquido y se
mantuvo posteriormente a -80ºC para estudios de inmunotransferencia,
y el otro se sumergió en p-formaldehído al 3,7% para
estudios histológicos. También se obtuvieron muestras de sangre en
capilares heparinizados en diferentes puntos temporales a partir de
una pequeña incisión en la punta de la cola. La sangre se centrifugó
y el suero se guardó a -80ºC hasta su uso. La orina se clarificó por
centrifugación a 10.000 g y 4ºC durante 10 minutos, y se almacenó a
-80ºC hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Los riñones se mantuvieron en
p-formaldehído durante toda la noche a 4ºC. A
continuación, se fabricaron bloques de parafina y se cortaron
secciones de tejido de 5-\mum y se tiñeron con
hematoxilina y eosina. Se tomaron fotografías bajo un microscopio
Olympus BX51 conectado a una cámara digital Olympus DP70 color.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron la concentración de creatinina en
suero y nitrógeno ureico mediante tiras reactivas comerciales
(Roche Diagnostics) y el analizador automático Reflotron®
(Roche Diagnostics). La medida de concentración de creatinina
tenía un límite de detección inferior de 0,5 mg/dL. La concentración
de proteína ureica se midió mediante el método de Bradford
(Bradford, 1976. Anal Biochem, 72: 248-254). El
contenido en NAG de la orina se determina indirectamente por el
grado de actividad NAG. La actividad enzimática NAG se determinó
mediante un procedimiento colorimétrico basado en la conversión de
la
3-cresolsulfonftaleinil-N-acetil-D-glucosaminida
en el
3-cresol-cresolsulfonftaleinilo
púrpura, que se midió a 580 nm con un fotómetro de placa (Thermo).
Para la medida de la actividad NAG se usó un kit comercial (Roche
Diagnostics) que se usó según las instrucciones del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron inmunotransferencias con extractos
tisulares (50 g de proteína total por muestra) preparados
homogeneizando los riñones con un mezclador de tejido
Ultra-Turrax T8, IKA®-Werwe) a 4ºC en tampón de
homogenización (NaCl 140 mM, Tris-HCl 20 mM pH=7,5,
ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M EDTA, glicerol al 10%, Igepal
CA-630 al 1%, 1 g/mL de aprotinina, 1 g/ml de
leupeptina, 1 g/mL de pepstatina A, fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PMSF 1 mM). Los homogenados tisulares se centrifugaron a 22.000 g
durante 15 minutos a 4ºC. Se recogieron los sobrenadantes. La
concentración de proteína se midió con un kit comercial (BioRad)
basado en el método de Lowry. Las muestras se separaron por
electroforesis en geles de acrilamida al 10-15%
(sistema Mini Protean II, BioRad). Inmediatamente, las proteínas se
transfirieron eléctricamente a una membrana
Immobilon-P (Millipore). Tras bloquear la membrana
para evitar la unión no específica, las membranas se sondearon con
anticuerpos contra KIM-1 (R&D Systems) y
proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7, bone
morphogenetic protein 7, Santa Cruz Biotechnology).
\vskip1.000000\baselineskip
La orina se concentró y desaló mediante
filtración forzada por centrifugación a través de columnas Amicon
Ultra con corte de 5 K (Millipore). Se determinó la concentración de
proteínas por el método de Bradford. Para la separación
electroforética 1 D se hicieron correr 100 mg de proteína total por
muestra en geles de acrilamida al 6 y 15% (sistema Mini Protean II,
BioRad, Madrid, España) y se tiñeron con azul brillante de Coomassie
G-250. Para la electroforesis 2D, las proteínas
ureicas se precipitaron con el kit Clean-Up (GE
Healthcare) según las instrucciones de los fabricantes. Se
rehidrataron 100 mg de proteína de cada muestra en urea 7 M, tiourea
2 M, Chaps al 4% (p/v), anfolitos al 0,5% pH 4-7 ó
4,5-5,5), ditiotreitol (DTT) 50 mM y azul de
bromofenol, y se centraron isoeléctricamente
(500-8.000 V) a través de tiras inmovilizadas de 18
cm de longitud con gradiente de pH (IPG), pH 4-7 ó
4,5-5,5 (GE Healthcare, Madrid, España),
usando un equipo IPGphor (GE Healthcare). Las tiras IPG se
preequilibraron durante 15 minutos en tampón de equilibrado
[Tris-HCl 50 mM pH=8,8, urea 6 M, glicerol al 30%
(v/v), dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% (p/v), azul de bromofenol
al 0,01% (p/v)] conteniendo DTT al 1% (p/v), y otros 15 minutos en
tampón de equilibrado que contenía yodoacetamida al 2,5% (p/v) A
continuación, las tiras IPG se transfirieron a geles de acrilamida
de 18 cm de longitud al 12% y se separaron por electroforesis con un
equipo SE 600 Ruby (GE Healthcare). Los geles se fijaron durante
toda la noche en etanol al 30%, ácido acético al 10% y se tiñeron
con plata con un kit comercial (GE Healthcare). A no ser que
se indique otra cosa, todos los reactivos procedían de Sigma. Para
visualización y análisis, los geles teñidos se escanearon (Image
Sanner, GE Healthcare, Madrid, España), y procesaron y se
analizaron estadísticamente con el programa informático Image Master
2D Platinum 6.0 (GE Healthcare, Madrid, España). La
discriminación de manchas se realizó con los siguientes parámetros:
(i) factor de alisado: 2; (ii) área mínima: 5 píxeles; (iii)
"saliency" 100. El análisis se corrigió visualmente para
eliminar artefactos. Para cada mancha individual, se restó el fondo
y se normalizó la intensidad del volumen individual según la
intensidad del volumen total (intensidad de todas las manchas). Para
comparación de la misma mancha entre geles, se estableció una
diferencia mínima de dos veces la intensidad para tener en cuenta
una expresión diferencial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un sistema ProteomeLab PF2D (Beckman
Coulter). Se diluyeron las orinas concentradas y desaladas en un
tampón optimizado (urea 7,5 M, tiourea 2,5 M, glicerol al 12,5%,
Tris-HCl 62,5 mM pH = 7,8-8,2,
n-octilglucósido al 2,5% (p/v), clorhidrato de
triscarboxietil fosfina 6,25 mM) durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Este tampón se sustituyó a continuación, por start
buffer (pH 8,5\pm0,1, Beckman Coulter) usando una
columna PD-10 (GE Healthcare). La primera fracción
de 3,5 ml se recogió y se cuantificó la concentración de proteínas.
A continuación, 1 mg de cada muestra se introdujo en la columna de
intercambio iónico cromatofocalizante y se eluyó en fracciones de
0,3 pH según el punto isoeléctrico mediante un gradiente lineal
descendente de pH (8,5 hasta 4). Cada fracción de pH se separó a
continuación a 50ºC según la hidrofobia proteica usando una
cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa con una
columna C18 no porosa (RP-HPLC) implementada con un
gradiente lineal 5-100% de TFA al 0,08% en
acetonitrilo a 0,75 mL/min en la que A es TFA al 0,1% en agua. Las
fracciones de fase inversa de 0,6 min se recogieron y almacenaron a
-80ºC. Se midió la absorbancia a 214 nm en la segunda dimensión, y
los datos se analizaron mediante los programas informáticos 32 Karat
y Delta View (Beckman Coulter).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recortaron de los geles las bandas y manchas
de interés procedentes de las separaciones 1D y 2D
(respectivamente). Cada recorte de gel se deshidrató en acetonitrilo
y éste se evaporó con una bomba de vacío y se volvió a suspender en
NH_{4}HCO_{3}. Las fracciones 2D-CF se
evaporaron también a vacío y los residuos se volvieron a suspender
en NH_{4}HCO_{3}. De esta manera, las muestras procedentes de
1D, 2D y 2D-CF se trataron de forma idéntica. Se
redujeron con DTT 10 mM en NH_{4}HCO_{3} 50 mM a 56ºC, y se
alquilaron con yodoacetamida en NH_{4}HCO_{3} 50 mM. A
continuación, las proteínas se digirieron en el gel a péptidos con
tripsina porcina (Promega) durante 30 minutos a 4ºC. Posteriormente,
los péptidos se extrajeron con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5%
(v/v). La disolución se evaporó a vacío y los péptidos se
disolvieron en ácido fórmico al 0,1% (v/v) bajo sonicación. Las
disoluciones que contenían péptidos se inyectaron en un
espectrofotómetro de masas LC9
ESI-QUAD-TOF QSTAR XL (Applied
Biosystems) con un micro HPLC 1100 (Agilent). Se usó una columna
Supelco de poro ancho A de 150 x 0,32 mm (5 m) (Discovery BIO) con
un caudal de 7 L/min. Se obtuvieron espectros MS/MS. La
identificación de proteínas se realizó con el programa informático
MASCOT (www.matrixscience.com) frente a bases de datos de secuencias
proteínicas no redundantes (Swiss Prot y NCBI). Se ajustó la
tolerancia másica a 50 ppm, la tolerancia MS/MS fue 0,5 Da, y el
estado taxonómico fue Rattus. Solo se consideraron hitos
significativos identificados mediante el análisis de probabilidad
MASCOT, y se ajustó como umbral de aceptación al menos un
emparejamiento de péptido con puntuación de ión superior a 20. En
algunos casos en los que el procedimiento
LC-ESIQUAD-TOF no produjo una
identificación proteínica no ambigua, o en manchas seleccionadas
aleatoriamente (para su confirmación, las proteínas se identificaron
con un espectrómetro de masas Ultraflex I MALDI-TOF
(Bruker Daltonics) en el Proteomic Service del Centro de
Investigación del Cáncer de la Universidad de
Salamanca-CSIC (Salamanca, España).
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos se representaron como promedio \pm
error estándar o promedio \pm desviación estándar de n
experimentos realizados, según se indica en cada caso. Excepto para
el estudio de los resultados proteómicos (según se indica
anteriormente), las comparaciones estadísticas se evaluaron mediante
análisis ANOVA de una vía. Se evaluó la distribución de la
normalidad (pasando al menos tres de los siguientes tests:
normalidad de los residuos por asimetría, normalidad de los residuos
por curtosis, normalidad de los residuos por ómnibus e igualdad de
varianza por Levene modificada. Se usó el test de Scheffe para
determinar la significancia estadística. Se consideró significativo
un valor de p<0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras 7 días de tratamiento, la gentamicina
produjo un daño renal (fallo renal agudo o insuficiencia renal
aguda) marcada con una mortalidad asociada de aproximadamente un 50%
(Fig. 1 y tabla 2). Los animales supervivientes cursaron con una
pérdida de peso pequeña pero significativa y poliuria. El fallo
renal agudo se caracterizó adicionalmente por un importante aumento
de la creatinina en suero y concentración BUN, indicando una
reducción de la TFG. La excreción de NAG también aumento en una gran
extensión, indicando daño tubular extensivo. La proteinuria fue
también evidente en la orina de los animales tratados con
gentamicina (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las secciones renales teñidas con
hematoxilina-eosina (Fig. 2) revelaron una clara
necrosis tubular en las ratas tratadas con gentamicina, en las que
se puede observar una masiva destrucción epitelial. No es evidente
una modificación importante de los glomérulos. A nivel papilar, la
obstrucción de los túbulos colectores con material hialino es
habitual en los animales tratados con gentamicina. Estos estudios
proporcionan el respaldo morfológico al menos para parte de la
extensa disfunción renal observada.
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Se han usado en este estudio tres enfoques
proteómicos diferentes (1D-SDS-PAGE,
2D y 2D-CF) y dos técnicas de espectrometría de
masas para la identificación de proteínas
(LC-ESI-QUAD-TOF y
MALDI-TOF). Esta combinación se ha demostrado como
parcialmente solapante y parcialmente no redundante. Los resultados
representativos de 1D se muestran en las figuras. La Fig. 3
representa un perfil típico SDS-PAGE de la orina
procedente de las ratas control y de las tratadas con gentamicina,
del que se extrajeron y analizaron 24 bandas diferencialmente
abundantes, conteniendo cada una varias proteínas. Las bandas de la
13 a la 16 fueron más abundantes en el grupo de control, mientras
que las bandas de 1 a 12 y de 17 a 24 fueron más abundantes en el
grupo de la gentamicina. Las proteínas identificadas mediante este
enfoque se recogen en la tabla 5.
En estudios piloto, se determinó el perfil de
distribución de proteínas en las orinas de control y de gentamicina
según su punto isoeléctrico. La mayor parte de proteínas se
incluyeron en el intervalo de pH de 4 a 7. En estudios piloto, los
autores usaron tiras IPG cubriendo un amplio intervalo de pH)
(2-10). Debido a que había un defecto en el alcance
más allá de pH 7, y también porque se perdían comparativamente pocas
proteínas en el intervalo de pH 7-10, los autores
decidieron realizar los experimentos en el intervalo de pH de 4 a 7
para la primera dimensión de la separación 2D. Se muestra en los
paneles superiores de la figura 4 una imagen representativa de un
gel 2D (intervalo de pH 4-7) de muestras de orina
procedentes de ratas control tratadas con gentamicina. Se observa
una gran similitud entre las muestras procedentes de animales del
mismo grupo, y se obtuvo una elevada reproducibilidad cuando se
repitió la separación 2D con la misma muestra. Muchas proteínas se
concentraron en el intervalo de pH 4,5-5,5. Por esta
razón, se realizaron también las separaciones 2D de las mismas
muestras de orina en este intervalo de pH. Una imagen significativa
de esto último se muestra en los paneles inferiores de la Fig. 4. En
ambos casos, se reconocieron y numeraron para identificación química
manchas diferencialmente presentes estadísticamente significativas
entre los grupos de control y de la gentamicina. (En la Fig. 4, los
números asociados con las manchas se indican para el grupo en el que
la proteína específica aparece de forma más abundante).
El proteoma de la orina de ambos grupos fue
sustancialmente distinto. En primer lugar, se identificaron
significativamente más manchas en la orina de las ratas tratadas con
gentamicina que en las ratas control. En el intervalo de pH de
4-7, se identificaron 606 manchas procedentes del
grupo de control y 933 del grupo de la gentamicina. En el intervalo
de pH 4,5-5,5, los números fueron 358 y 724,
respectivamente. De estas, se encontraron 129 manchas
diferencialmente expresadas entre los grupos (37 sobreexpresadas en
el grupo de la gentamicina, y 92 en el grupo de control). De estas
129 manchas, los datos de espectrometría de masas identificaron 98
de ellas en bases de datos de proteínas, correspondientes a
isoformas o variantes modificadas
post-trascripcionalmente de 34 proteínas (23
incrementadas en el grupo de la gentamicina y 11 en el grupo de
control; véase la tabla 4).
Un estudio complementario del proteoma
diferencial de la orina de dos animales control y dos tratados con
gentamicina se realizó mediante el procedimiento
2D-CF. La similitud entre las muestras del mismo
grupo fue buena y la reproducibilidad de los resultados de
diferentes experimentos con la misma muestra fue también muy alta.
La Fig. 5 muestra el mapa comparativo de la expresión de proteínas
generado mediante análisis 2D-CF de ambos grupos.
Cada mancha roja (tal como se ve en los experimentos. En la presente
invención se presenta en escala de grises) representa una fracción
aumentada (proteína) en el grupo de la gentamicina, mientras que
cada mancha verde representa una fracción aumentada en el grupo de
control (es decir, una disminución en el grupo de la gentamicina).
El análisis por MS de las fracciones diferencialmente abundantes
identificó 22 proteínas (véase la tabla 5). Muchas de estas
proteínas coincidieron con algunas de las encontradas según el
procedimiento 2D como
2-HS-glicoproteína, hemopexina,
albúmina en suero, quininógeno T 1, transtiretina, proteína de unión
con la vitamina D, y las proteínas urinarias 1, 2 y 3. Muchas de
estas proteínas se identificaron también en varias reacciones,
confirmando la existencia de variantes o isoformas. De manera
interesante, este procedimiento identificó varias proteínas no
detectadas mediante 1D y 2D. Es el caso de por ejemplo, la
2-microglobulina y la cistatina C. Hay que mencionar
que, como resultado del fraccionamiento líquido, se obtuvo una mejor
cobertura de las secuencias para la mayor parte de las proteínas
también identificadas según el procedimiento 2D.
Los procedimientos de separación de proteínas
usados, concretamente 1D, 2D y 2D-CF, demostraron
ser parcialmente solapantes pero también parcialmente no
redundantes, evidenciando su valor complementario.
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En la presente invención se ha seleccionado la
orina como la muestra corporal más adecuada para análisis rutinarios
a escala de población. En el caso de enfermedades renales, esto no
sólo es conveniente por su accesibilidad sencilla y no traumática,
sino también por su contacto directo con los tejidos en los que se
producen los eventos patológicos, de los que es fácil recoger un
importante material diagnóstico.
El muestreo de orina puede realizarse al cabo de
24 horas desde que se inicia el tratamiento o administración con
antibióticos aminoglucósidos, frente a muestras puntuales de orina.
El muestreo de 24 horas permite una normalización más fina y precisa
a través del cálculo de la excreción diaria de cualquiera de las
proteínas de la invención (marcadores). Sin embargo, su uso en el
ámbito clínico está limitado a un subconjunto de pacientes. Las
muestras puntuales de orina, por el contrario, sirven mejor para el
análisis de la población en general. Sin embargo, el nivel de
presencia de los marcadores potenciales puede depender fuertemente
de la concentración de orina, que puede alterar resultados y
conclusiones. Los intentos de normalizar la concentración de orina
(es decir, por la concentración de creatinina urinaria) pueden
llevar también a resultados sesgados, ya que los parámetros de
normalización están frecuentemente alterados en condiciones
patológicas.
Un intento de resolver estos inconvenientes
sería actuar a través de la creación de perfiles urinarios de
cualquiera de las proteínas de la invención cuya presencia en la
orina esté alterada (tanto aumentada como disminuida) en términos
relativos, como una fracción de todas las proteínas excretadas como
consecuencia de una agresión (por ejemplo, un fármaco). Para
aplicación en la práctica clínica, la magnitud de una proteína
marcador en un modelo diagnóstico determinado sería el resultado de
su normalización respecto de la cantidad total de proteínas en la
muestra de orina analizada. Así, con este objetivo, en el presente
estudio los autores han normalizado muestras de orina según el
contenido proteico usando la misma cantidad de proteínas por
muestra, y a continuación, estudiado la presencia relativa de
cualquiera de las proteínas de la invención, que se habían
identificado mediante técnicas de proteómica
diferencial.
diferencial.
Desde un punto de vista teórico, un aumento o
disminución en la presencia absoluta o relativa de cualquiera de las
proteínas de la invención en la orina, puede ser el resultado de
numerosos factores: (i) alteraciones en la filtración glomerular y
en la secreción tubular de proteínas procedentes de la sangre o el
espacio extracelular renal; (ii) los marcadores pueden proceder de
tejidos renales dañados o en reparación; (iii) la presencia alterada
puede también ser la consecuencia de una capacidad de resorción
impedida en general o de forma específica a nivel tubular; (iv)
finalmente, y muy importante, los marcadores pueden proceder de
síntesis, rutas de señalización, transporte transmembrana o
exocitosis alterados en tejidos renales existentes o no alterados o
de compartimentos específicos.
En la presente invención se han encontrado un
número de proteínas marcadoras de daño renal que aparecen
incrementados en la orina de ratas nefrointoxicadas por gentamicina
con respecto a ratas sanas (control) mediante la aplicación de
técnicas proteómicas (Tabla 6). Hay que tener en cuenta que la
excreción de estas proteínas marcadoras está infraestimada porque 14
ratas del grupo de la gentamicina mostraron una evidente
proteinuria. Esto significa que la excreción diaria de las proteínas
marcadoras identificadas como aumentadas en la orina de estos
animales es varias veces mayor que su presencia relativa en la orina
(la excreción de proteínas en el grupo de la gentamicina es más de 5
veces superior que en el grupo de control, Tabla 2). El análisis de
los perfiles electroforéticos 1D y 2D (Figs 3 y 4) de proteínas en
orina procedentes de ambos grupos revela claramente que la
abundancia relativa de proteínas de peso molecular bajo (<35 KDa)
es mayor en las ratas control. Por el contrario, las proteínas de
peso molecular intermedio (PMM) (35-65 KDa) son
relativamente más abundantes en las ratas tratadas con gentamicina.
En las últimas, es especialmente evidente de los experimentos 1D que
las proteínas de peso molecular elevado (PME) (65 KDa), ausentes en
el grupo de ratas control, aparecen como consecuencia del
tratamiento con gentamicina. Se pueden encontrar estas proteínas
grandes con hasta casi 200 KDa (Fig. 3, bandas
17-22). La presencia de proteínas PME en la orina se
considera normalmente como un síntoma de lesión en la barrera de
filtración glomerular (BFG) aumentando su permisividad para las
proteínas más grandes, normalmente excluidas del ultrafiltrado. Sin
embargo, las proteínas de peso molecular grande pueden aparecer
también en la orina como resultado del desprendimiento de las
estructuras renales en contacto directo con la orina, como las que
forman la barrera de filtración, los diferentes segmentos tubulares,
los uréteres o la vejiga. Una proteinuria tipo nefrítica derivada de
una clara lesión en la barrera de filtración glomerular, se espera
que produzca la aparición de proteínas con un intervalo no
específico de pesos moleculares en la orina. Sin embargo, también se
puede postular un daño más específico y sutil que produciría solo la
aparición de algunas proteínas de peso molecular elevado en la
orina. Es de notar que, en el caso de los animales tratados con
gentamicina de la presente invención, la mayor parte de proteínas
parecían concentrarse alrededor o por debajo del límite superior del
tamaño de las proteínas normalmente filtradas (por ejemplo,
aproximadamente el tamaño de la albúmina), con relativamente pocas
por encima de dicho umbral.
Sin embargo, junto con estas proteínas PME, la
excreción de numerosas proteínas de peso molecular bajo (PMB)
también aumenta tras el tratamiento con gentamicina (véase la Tabla
6).
Estos datos, en su conjunto, aparentemente
indican que esta pauta de gentamicina fuertemente nefrotóxica y
dañina para el riñón sólo alteró moderadamente las propiedades de
tamizado de la barrera de filtración glomerular, a pesar de producir
una marcada insuficiencia renal que se correlaciona con una tasa de
fallecimientos de un 50% (Figs 1 y 2).
\newpage
La influencia de la reabsorción tubular y de los
procesos de secreción sobre la composición final de la orina, no es
sólo la consecuencia de los efectos de la gentamicina a nivel
tubular. También, la composición del ultrafiltrado altera
específicamente la reabsorción de proteínas, supuestamente por
procesos de competición. Así, un contenido en proteína
específicamente alterado en el ultrafiltrado como resultado de este
efecto también modifica específicamente su propio procesado tubular,
contribuyendo adicionalmente a un marcador urinario específico de la
agresión.
Los resultados mostrados en las Figs 1 y 2
apuntan a una evidente lesión tubular producida por la gentamicina,
disminuyendo gravemente la recuperación de proteínas filtradas a
nivel tubular (Tabla 2).
En la Tabla 6 se recogen principalmente
proteínas PMM y PMB. Como en otras muchas enfermedades renales, la
mayor parte de estas proteínas proceden de la sangre, y su excreción
urinaria aparece aumentada tras tratamiento con gentamicina,
evidenciando un modelo general de reabsorción tubular
disminuida.
Las proteínas detectadas de forma diferencial
(Tabla 6), comunes a otras enfermedades renales son catepsina B,
algunas proteinasas
(alfa-1-antitripsina, cistatina C,
inhibidor inter-alfa-tripsina,
serpina A3L, y varias proteínas de fase aguda y respuesta inmune
(alfa-1-microglobulinas,
alfa-2-HS-glicoproteína,
ceruloplasmina, complemento C3 y C9, haptoglobina, hemopexina,
inmunoglobulinas, lisozima C, quininógenos T). El aumento de su
excreción podría explicarse por un aumento de la presencia en el
ultrafiltrado (no como consecuencia de una hiperfiltración, sino en
su lugar debido a sus mayores niveles en sangre) combinado con una
reabsorción tubular desequilibrada.
De todas las proteínas detectadas
diferencialmente (Tabla 6), el incremento en los valores urinarios
de las siguientes proteínas tiene un valor biomarcador con valor
diagnóstico de daño renal: proteína Reg3B, fetuina B,
Ras-related GTP-binding protein
A, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP
sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A,
alfa-enolasa, queratina-5,
parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3K. Estas proteínas no
se han relacionado con anterioridad con la obtención de datos útiles
en el diagnóstico de enfermedades renales o en el diagnóstico
propiamente dicho. Excepto la gelsolina y serpina A3K, estas
proteínas están normalmente ausentes de la sangre. El aumento de
cualquiera de dichas proteínas en la orina es el resultado de los
eventos que tienen lugar en el riñón por acción de la gentamicina.
Además, hay serios candidatos para los que explorar adicionalmente
su utilidad en el pronóstico del daño renal y/o en el fallo renal
agudo ocasionado por antibióticos aminoglucósidos como por ejemplo
la gentamicina.
Además, un análisis proteómico diferencial del
córtex del riñón reveló que la gentamicina causa la sobrerregulación
de proteínas principalmente relacionadas con (i) gluconeogénesis y
glicolisis (por ejemplo, fructosa 1,6-bisfosfatasa y
alfa-enolasa); (ii) transporte y metabolismo de
ácidos grasos (por ejemplo, proteína de transporte de ácidos grasos,
acetil-CoA carbolilasa,
metilacil-CoA racemasa); (iii) el ciclo del ácido
cítrico (por ejemplo, sucinil CoA sintetasa ATP específica, malato
deshidrogenasa); y (iv) respuesta al estrés (por ejemplo, moesina,
SPI 1, chaperona molecular tipo adnK). Una excepción es la
alfa-enolasa, que también está aumentada en la orina
de las ratas del ensayo tratadas con gentamicina (Tablas 4 y 6).
Esta divergencia en la modificación del modelo proteico entre el
tejido renal y la orina probablemente refleja que la mayor parte de
las proteínas biomarcadoras de la presente invención, derivadas del
riñón, no son el resultado de un aumento de producción, sino
supuestamente de (i) una secreción alterada procedente de células
renales, o (ii) tejidos desprendidos o dañados y residuos celulares
excretados a la orina.
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<110> Universidad de Salamanca
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<120> Método para la detección de daño
renal
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1367.34BIS
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
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<210> 1
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<211> 175
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 382
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 413
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 298
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 782
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 137
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 408
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 336
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 590
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 119
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 413
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<211> 491
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
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<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Método para determinar un daño renal, que
comprende:
- a.
- obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
- b.
- detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en el paso (a) la proteína Reg3B.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, donde se
detecta y/o cuantifica la proteína Reg3B de Homo sapiens.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde además comprende detectar y/o
cuantificar en la muestra al menos una proteína, o cualquiera de sus
combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
- -
- fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según la reivindicación 3, donde se
detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus
combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 2,
3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde además comprende la comparación de los
datos obtenidos en el apartado (b) con datos obtenidos de al menos
una muestra control para buscar alguna desviación significativa,
siendo dicha desviación significativa la presencia de la proteína en
la muestra aislada, o una mayor concentración de la proteína en la
muestra respecto de una muestra control aislada.
6. Método para la determinación de un daño renal
según la reivindicación 5, donde además comprende la atribución de
la desviación significativa al desarrollo de dicho daño renal, en el
individuo.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el daño renal es un fallo renal
agudo.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde la muestra biológica del apartado (a)
es un fluido biológico.
9. Método según la reivindicación 8, donde el
fluido biológico es orina.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde la proteína,es detectada y/o
cuantificada por medio de electroforesis, immunoensayo,
cromatografía y/o tecnología de microarray.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde el daño renal es producido por la
administración o por la exposición del individuo a, al menos, un
agente nefrotóxico.
12. Método según la reivindicación 11, donde el
agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
13. Método según la reivindicación 12, donde el
antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde el individuo es un humano.
15. Método para determinar la progresión de un
daño renal debido a la administración de, al menos, un agente
nefrotóxico, que comprende:
- a.
- determinar una primera concentración de la proteína Reg3B, en un fluido biológico aislado de un individuo expuesto o no expuesto a un agente nefrotóxico,
- b.
- determinar una segunda concentración de la proteína, o cualquiera de sus combinaciones, cuya concentración se ha determinado en el apartado (a) en un fluido biológico del individuo después de determinar la primera concentración en el fluido biológico del individuo expuesto, o después de la iniciación de la administración o exposición al agente nefrotóxico en el individuo no expuesto, y
- c.
- comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para buscar alguna desviación significativa, siendo dicha desviación significativa la presencia de la proteína en la muestra aislada, o una mayor concentración de la proteína en la muestra respecto de una muestra control aislada.
\newpage
16. Método según la reivindicación 15, donde en
el apartado (a) y (b) se detecta y/o cuantifica la proteína Reg3B de
Homo sapiens.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, donde además comprende detectar y/o
cuantificar en la muestra al menos una proteína, o cualquiera de sus
combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
- -
- fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Método según la reivindicación 17, donde se
detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus
combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 2,
3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18, donde el daño renal es un fallo renal
agudo.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, donde el agente nefrotóxico es un
antibiótico aminoglucósido.
21. Método según la reivindicación 20, donde el
antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 21, donde el fluido biológico es orina.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 22, donde el individuo es un humano.
24. Uso de la proteína Reg3B como biomarcador
para determinar un daño renal o para predecir la progresión de un
daño renal.
25. Uso según la reivindicación 24, donde la
proteína Reg3B es de Homo sapiens.
26. Uso de:
- a.
- la proteína Reg3B y
- b.
- de al menos una proteína o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
- -
- fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
como biomarcadores para determinar un daño renal
o para predecir la progresión de un daño renal.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Uso según la reivindicación 26, donde se
selecciona al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones,
de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13 ó 14.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
24 a 27, donde el daño renal es un fallo renal agudo.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
24 a 28, donde el daño renal o la progresión del daño renal es
debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico.
30. Uso según la reivindicación 29, donde el
agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
31. Kit para determinar un daño renal o para
determinar la progresión de un daño renal, en una muestra aislada de
un individuo, que comprende, al menos, una o más sondas para la
proteína Reg3B.
32. Kit según la reivindicación 31, donde la
proteína Reg3B es de Homo sapiens.
33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
31 ó 32, donde además comprende el uso de una o más sondas para al
menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada
de la lista que comprende:
- -
- fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Kit según la reivindicación 41, donde se
selecciona al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones,
de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13 ó 14.
35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
31 a 34, donde las sondas son fijadas a un soporte sólido.
36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
31 a 35, donde las sondas son anticuerpos.
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|---|---|---|---|
| ES201031407A ES2374370B1 (es) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Método para la detección de daño renal. |
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| ES201031407A ES2374370B1 (es) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Método para la detección de daño renal. |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9388215B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-07-12 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
| CN116904586A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-10-20 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 一种检测血浆来源的外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用 |
-
2010
- 2010-08-04 ES ES201031407A patent/ES2374370B1/es active Active
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| US9738695B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-08-22 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
| US10899815B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-01-26 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
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| CN116904586B (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-22 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 一种检测血浆来源的外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2374370B1 (es) | 2013-01-08 |
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