ES2371843A1 - Procedimiento para el cultivo de microalgas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el cultivo de microalgas que comprende la plantación de una cepa de algas en un entorno acuoso y el procedimiento de crecimiento, bajo irradiación solar, mediante la alimentación continua de una corriente gaseosa constituida esencialmente por dióxido de carbono y una corriente de nutrientes a base de nitrógeno, constituida por agua residual de plantas industriales, procedente de procedimientos de tratamiento secundarios.
Description
Procedimiento para el cultivo de microalgas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para el cultivo de microalgas.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un procedimiento para el cultivo de microalgas apropiado
para su utilización en la producción de biomasas.
Todavía más específicamente, la presente
invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de
microalgas alimentado con agua industrial procedente de plantas
petrolíferas, por ejemplo refinerías.
Son conocidos los estudios para el cultivo de
algas y microalgas, ver, por ejemplo, W.J. Oswald, "Journal of
Applied Phycology", 15, 99-106, 2003. Los
cultivos de microalgas utilizan generalmente agua dulce o salada con
la adición de nutrientes y sales minerales y, cuando resulta
necesario, vitaminas, y son realizados en estanques abiertos que
presentan unas amplias dimensiones, por ejemplo de 10 a 100 m de
longitud y de 3 a 30 m de anchura, con una profundidad de 0,2 a 0,5
m, bajo irradiación solar. Además del agua, los estanques son
alimentados con dióxido de carbono, almacenado, en forma gaseosa o
líquida, en tanques específicos, u obtenido a partir de gases de
escape del tratamiento industrial, por ejemplo, a partir de
centrales eléctricas, posiblemente diluido con aire. La fase gaseosa
se hace burbujear a través de la masa líquida, a través de conductos
perforados sumergidos en el estanque de crecimiento, con el fin de
presentar la máxima disponibilidad de CO_{2} para las
microalgas.
El cultivo de microalgas requiere pocos
componentes esenciales que consisten en sales y sustancias a base de
nitrógeno y fósforo, además de luz y CO_{2} como se ha mencionado
anteriormente. Las exigencias de nutrición mínimas pueden ser
establecidas sobre la base de la fórmula empírica siguiente de la
biomasa de las algas:
CO_{0,48}H_{1,83}N_{0,11}P_{0,01}
Los cultivos de algas requieren por lo tanto P y
N en cantidades óptimas para crecer al ritmo necesario con el fin de
mantener unas concentraciones de biomasa elevadas. Este principio
puede ser aprovechado para la extracción de los compuestos
fosforados o nitrogenados del agua residual industrial, siempre que
los otros compuestos presentes en el agua no originen niveles de
toxicidad que dificulten el crecimiento o la funcionalidad de la
célula de algas.
El solicitante ha descubierto, como se describe
con mayor detalle en las reivindicaciones adjuntas, que la
utilización del agua industrial de las plantas petrolíferas, en
particular refinerías, representa una fuente válida por lo menos de
estos nutrientes nitrogenados. Se ha descubierto de hecho que el
cultivo de microalgas en los sistemas de laboratorio se realiza con
una productividad sustancialmente inalterada con respecto a las
producciones tradicionales que adoptan las soluciones acuosas
específicas de los nutrientes nitrogenados, utilizando, con este
fin, el agua residual de las refinerías, por ejemplo.
Como es conocido, el agua residual civil e
industrial experimenta un primer procedimiento de cribado que
permite la separación del material contaminante de grandes
dimensiones, tal como madera, plástico, papel, seguido por un
tratamiento (primario) que comprende la sedimentación de los sólidos
suspendidos gruesos y otros sólidos, seguido por un procedimiento de
tratamiento (secundario) en el que se produce la oxidación biológica
de los compuestos orgánicos que puede ser cuantificada generalmente
mediante DBO (Demanda Biológica de Oxígeno) y DOO (Demanda Química
de Oxígeno). En el flujo de estos dos tipos de tratamiento, el agua
pasa a la fase de eliminación de nutrientes (compuestos fosforados y
nitrogenados, tratamiento terciario). Finalmente, antes de la
ejecución, el procedimiento puede comprender un tratamiento de
acabado (desinfección, etc.), en relación a la utilización final
del
agua.
agua.
Se ha descubierto que algo de agua industrial
parcialmente purificada procedente del procedimiento de tratamiento
secundario contiene una cantidad determinada de derivados de
nitrógeno, generalmente a concentraciones comprendidas entre 0,1 y
0,5 mg/l, óptimas para utilizar este agua como fuente de nutriente
nitrogenado para el cultivo de microalgas y para permitir su
proliferación en este tipo de agua. Este resultado puede ser
considerado sorprendente, puesto que este agua residual contiene,
además de los nutrientes nitrogenados, otros contaminantes, tales
como cloruros, sulfatos, metales pesados, hidrocarburos, fenoles,
etc., no siempre apropiados, e incluso tóxicos con respecto a muchas
especies vivas.
Los nutrientes nitrogenados están generalmente
presentes como NH_{3} y derivados de amoniaco, por ejemplo como
sales de amonio inorgánicas u orgánicas.
En la mayoría de casos, para el crecimiento del
alga, resulta necesaria la integración del agua residual industrial
con nutriente fosforoso, si no está presente en el agua residual
industrial. En general, son introducidas soluciones de sales
fosforosas solubles en agua, tales como fosfatos de metal
alcalinotérreo o alcalino, por ejemplo fosfatos de magnesio, sodio,
potasio, calcio o fosfatos de amonio.
\newpage
Al término del crecimiento, con la asimilación y
extracción consecuentes de los nutrientes (nitrógeno y fósforo), el
agua residual es separada y puede ser vertida en los estanques de
agua superficiales o sometida a acabado, permitiendo su
reutilización de reciclado.
Se proporcionan a continuación dos ejemplos
ilustrativos y no limitativos de la presente invención, demostrando
el crecimiento de las dos especies de algas, una agua dulce
(Scenedesmus sp.) y una de agua salada (Tetraselmis
sk.) sobre un efluente industrial.
Los experimentos siguientes se refieren a la
caracterización de las cepas de microalgas en medios de cultivo no
convencionales. Más específicamente, el medio de cultivo utilizado
fue agua residual de una planta de tratamiento de residuos
industriales.
El agua procedente de la unidad de tratamiento
de residuos presenta las características siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Las pruebas se realizaron en el laboratorio para
comprobar la proliferación de algas en este medio de cultivo,
utilizando los sistemas apropiados para el crecimiento (botellas de
Roux) que consisten en recipientes de vidrio de tres litros cada
uno. La agitación del cultivo fue garantizada mediante el gas
(mezcla de CO_{2} en aire al 2%) que fluye en el interior de las
botellas. Estaban asimismo provistos de un sistema de refrigeración
para impedir que la temperatura del cultivo excediera los 30ºC. Cada
unidad presentaba sensores para la medición de la temperatura y del
pH.
La fuente de carbono para el crecimiento de las
algas fue proporcionada directamente por el CO_{2} que se
introdujo en el medio de cultivo bajo el control del pH.
La energía radiante para permitir la fijación
del carbono al cultivo mediante la reacción fotosintética fue
proporcionada por un sistema de luz artificial (lámpara de halógeno
con marca registrada JB, 100 vatios, dispuesto 50 cm con respecto a
la botella de Roux), encendido durante 24 horas un día, con una
intensidad lumínica de 17.000 lux.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa de colección Scenedesmus
sp. El inóculo que se debe introducir en los sistemas de cultivo
se preparó como se expone a continuación:
- se descongeló una muestra de cultivo
monoalgal, mantenida previamente a -85ºC en una solución de
glicerina al 10%, dejándola a temperatura ambiente, y se sometió a
continuación a centrifugación para eliminar el sobrenadante.
- la pasta celular así obtenida se inoculó en
tres matraces de 250 ml que contenían 50 ml de la solución que
contiene los nutrientes.
- el cultivo se desarrolló en una cámara
climática iluminada a una temperatura constante de 30ºC, en la
presencia de 0,5% de CO_{2} en el aire.
- tras aproximadamente una semana, el matraz
alcanzó una concentración de 0,3 g/l, este cultivo se utilizó como
inóculo para los tres matraces de 1 litro, que contenían 500 ml de
la solución que contiene los nutrientes y se dispuso en una cámara
climática.
- tras 2 días el cultivo presentó una
concentración de 0,5 g/l, formando este cultivo el inóculo de las
tres botellas de Roux de litro utilizadas en la experimentación.
\vskip1.000000\baselineskip
El inóculo, preparado como se ha descrito
anteriormente, se utiliza normalmente en las condiciones de la
literatura (1) mencionadas a continuación:
Inóculo: 10% por volumen en el medio M4N
descrito a continuación:
Medio de cultivo tipo M4N:
KNO_{3}, 5,0 g/l;
KH_{2}PO_{4}, 1,25 g/l;
CaCl_{2}, 0,01 g/l;
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,003 g/l;
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 2,5 g/l;
Microelementos: 1 ml/l de la solución siguiente:
2,86 g de H_{3}BO_{3}, 1,81 g de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 80
mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 220 mg de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 210 mg de Na_{2}MoO_{4}, 25 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 33,5 g de EDTA y 1 gota de
H_{2}SO_{4} concentrado por litro.
Agua: potable
pH de funcionamiento: 7,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que estas condiciones pueden ser
mejoradas en cuanto a pH de funcionamiento y medio de cultivo como
se representa en los ejemplos siguientes. Las variaciones para las
condiciones de crecimiento optimizadas son las siguientes:
Reducción en el contenido de KNO_{3} de 5,0 a
1,5 g/l;
adición de 0,1 g/l de K_{2}HPO_{4};
reducción en el contenido de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O de 2,5 a 1,5 g/l;
reducción en el pH de funcionamiento: de 7,8 a
7,0.
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los tres sistemas de cultivo para
la presente experimentación con las condiciones de crecimiento
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba 1 (condición estándar,
control)
Inóculo: 10% por volumen preparado según
se ha descrito anteriormente.
Medio de cultivo optimizado M4N:
KNO_{3}, 1,5 g/l;
KH_{2}PO_{4}, 1,25 g/l;
KH_{2}PO_{4}, 0,1 g/l;
CaCl_{2}, 0,01 g/l;
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,003 g/l;
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,5 g/l;
Microelementos: 1 ml/l de la solución siguiente:
2,86 g de H_{3}BO_{3}, 1,81 g de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 80
mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 220 mg de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 210 mg de Na_{2}MoO_{4}, 25 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 33,5 de EDTA y 1 gota de H_{2}SO_{4}
concentrado por litro.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: potable
pH de funcionamiento: 7,0
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba 2 (prueba con agua
residual +
nutrientes)
Inóculo: 10% por volumen preparado como
se ha descrito anteriormente.
Medio de cultivo: el agua procedente de
la planta de tratamiento de agua industrial, aguas abajo del
tratamiento secundario, con la composición indicada en la Tabla
1;
pH de funcionamiento: 7,0
Medio de cultivo optimizado M4N:
KNO_{3}, 1,5 g/l;
KH_{2}PO_{4}, 1,25 g/l;
K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/l;
CaCl_{2}, 0,01 g/l;
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,003 g/l;
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,5 g/l;
Microelementos: 1 ml/l de la solución siguiente:
2,86 g de H_{3}BO_{3}, 1,81 g de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 80
mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 220 mg de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 210 mg de Na_{2}MoO_{4}, 25 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 33,5 de EDTA y 1 gota de H_{2}SO_{4}
concentrado por litro.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: industrial (ver Tabla 1).
pH de funcionamiento: 7,0
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba 3 (prueba con agua
residual, sin
nutrientes)
Inóculo: 10% en volumen preparado como se
ha descrito anteriormente.
Medio de cultivo: no obtenido del
exterior
pH de funcionamiento: 7,0.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: industrial (ver Tabla 1).
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de cultivo de las tres pruebas se
recogieron y se sometieron a mediciones de densidad óptica mediante
un espectrofotómetro Varian C 900 con el fin de poder seguir la
tendencia del crecimiento de las algas.
Además de estas mediciones, se realizaron
asimismo mediciones de peso seco para determinar la concentración
efectiva alcanzada por los cultivos. La tabla 2 resume los
resultados obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas mediciones, puede apreciarse
claramente que la tasa de crecimiento y la concentración final del
cultivo en el medio constituido por agua residual industrial son
comparables con el crecimiento y la concentración final del cultivo
de control. Esto demuestra por lo tanto que la cepa utilizada según
la presente invención, en las condiciones de procedimiento
mencionadas, puede asimismo ser cultivada en agua residual
industrial con rendimientos en cuanto a la productividad comparables
con los obtenidos utilizando las condiciones de cultivo de
laboratorio típicas.
Debería destacarse que cuando se utiliza el agua
residual sin nutrientes (Roux 3), la cinética de crecimiento es
inferior con respecto a los otros dos casos examinados (Roux 1 y
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa de colección Tetraselmis
su. Se preparó el inóculo que se debía introducir en los
sistemas de cultivo como se expone a continuación:
- una muestra de cultivo monoalgal, mantenido
previamente a -85ºC en una solución al 10% de glicerina, se
descongeló dejándola a temperatura ambiente y a continuación se
sometió a centrifugación para extraer el sobrenadante.
- la pasta celular así obtenida se inoculó en
los tres matraces de 250 ml que contenían 50 ml de la solución que
contiene los nutrientes.
- el cultivo se desarrolló en una cámara
climática iluminada a una temperatura constante de 30ºC, en
presencia de 0,5% de CO_{2} en el aire.
- tras aproximadamente una semana, el matraz
alcanzó una concentración de 0,3 g/l, este cultivo se utilizó como
inóculo para tres matraces de 1 litro, que contenían 500 ml de la
solución que contenía los nutrientes y se dispuso en una cámara
climática.
- tras 2 días el cultivo presentó una
concentración de 0,5 g/l, formando este cultivo el inóculo de los
sistemas de crecimiento de 3 litros utilizados en la
experimentación.
\vskip1.000000\baselineskip
El inóculo, preparado como se ha descrito
anteriormente, se utiliza normalmente en las condiciones de la
literatura (2) mencionadas a continuación:
Inóculo: 10% por volumen en el medio F/2
descrito a continuación:
Medio de cultivo F/2:
NaNO_{3}, 600 mg/l;
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 26,5 mg/l;
FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 6,3 mg/l (Fe de 1,3
mg);
Na_{2}EDTA, 8,72 mg/l;
Vitaminas 0,5 ml de la solución siguiente:
Tiamina-HCl 0,2 g/l;
Biotina 1,0 mg/l;
B12 1,0 mg/l;
Microelementos: 0,5 ml/l de la solución
siguiente:
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O 19,6 mg/l (0,005 mg/l
Cu);
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 44 mg/l (0,01 mg/l
Zn);
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 20 mg/l (0,005 mg/l
Co);
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 360 mg/l (0,1 mg/l
Mn);
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O 12,6 mg/l
(0,005 mg/l Mo);
Sales marinas para agua de mar (sintéticas) 33
g/l;
pH de funcionamiento: 7,8
Agua para la preparación del medio de
cultivo: potable.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tres sistemas de cultivo se prepararon para
la presente experimentación, con las condiciones de crecimiento
siguientes:
Prueba 1 (condición estándar,
control)
Inóculo: 10% por volumen en el medio F/2
descrito anteriormente.
Medio de cultivo F/2.
pH de funcionamiento: 7,8.
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: potable.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba 2 (prueba con agua
residual + nutrientes. Roux
2)
Inóculo: 10% por volumen en el medio F/2
descrito anteriormente.
Medio de cultivo F/2.
pH de funcionamiento: 7,8
Flujo de mezcla gaseoso 16
litros/hora.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: industrial (ver tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba 3 (prueba con agua
residual, sin
nutrientes)
Inóculo: 10% por volumen en el medio F/2
descrito anteriormente.
Medio de cultivo: no obtenido del
exterior
pH de funcionamiento: 7,8;
Flujo de mezcla gaseoso: 16
litros/hora.
Agua para la preparación del medio de
cultivo: industrial (ver tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de cultivo de las tres pruebas se
recogieron y sometieron a las mediciones de densidad óptica mediante
un espectrofotómetro Varian C 900 con el fin de poder seguir la
tendencia del crecimiento de las algas.
Además de estas mediciones, se realizaron
asimismo mediciones de peso seco para determinar la concentración
efectiva alcanzada por los cultivos. La tabla 3 resume los
resultados obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden asimismo extraer las mismas
conclusiones para la cepa marina que para la cepa de agua dulce. La
cepa presenta la misma cinética de proliferación en el agua de mar y
en el medio constituido por el agua residual industrial que contiene
el medio de crecimiento F/2. Debería apreciarse que, en el caso del
medio que esta constituido por agua residual sola (prueba 3), la
cinética de crecimiento es inferior con respecto a los otros dos
casos.
Claims (8)
1. Procedimiento para el cultivo de microalgas
que comprende la plantación de una cepa de algas en un entorno
acuoso y el procedimiento de crecimiento, bajo irradiación solar,
mediante la alimentación continua de una corriente gaseosa,
constituida esencialmente por dióxido de carbono y una corriente de
nutrientes a base de nitrógeno, constituida por agua residual de
plantas industriales, que los contienen, procedente de
procedimientos de tratamiento secundarios.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los procedimientos industriales son plantas petrolíferas o
refinerías.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que las algas son seleccionadas de entre las algas
clorófitas.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las algas son clorófitas de
las cepas de colección seleccionadas de entre Tetraselmis
suecica, Scenedesmus sp, Phaeodactylum tricornutum, Chlorella
vulgaris, o de las cepas autóctonas identificadas en la
proximidad de la planta industrial.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el entorno acuoso está
constituido por agua residual industrial con una salinidad de 1 g/l
a 28 g/l.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende alimentar además una
segunda corriente acuosa de nutrientes que contiene sales de fósforo
en solución en una concentración comprendida entre 0,01 y 0,05
g/l.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el flujo gaseoso contiene de
6 a 100% por volumen de CO_{2}.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el agua residual es agua de
refinería.
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