ES2370359B1 - Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal mri-oi-spect. - Google Patents

Abstract

Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.#Nanoestructuras multifuncionales que consisten en una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie de la ferritina. La invención también se refiere a un método para obtener dichas nanoestructuras, así como a su uso como medicamento y más preferiblemente para la diagnosis de cáncer o como agente de contraste.

Description

Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.

La presente invención se refiere a una nanoestructura multifuncional, concretamente a una ferritina, además de su aplicación como agente de contraste en OI, MRI o SPECT. Por tanto, la invención se podría encuadrar dentro del campo de la biomedicina.

Estado de la técnica

La integración de la Nanotecnología en la biotecnología ha hecho florecer una nueva disciplina: la nanomedicina. En este campo, se diseñan y preparan nanopartículas metálicas para obtener bioimágenes mediante el uso simultáneo de varias técnicas, distribución efectiva de fármacos o técnicas de terapias tan prometedoras como la hipertermia originada localmente por nanopartículas magnéticas. Es un área de tremendo potencial sujeta al desarrollo de nuevas nanoestructuras para su avance.

Las nanopartículas magnéticas han atraído atención principalmente por su uso potencial como agentes de contraste en Imagen por Resonancia Magnética (MRI). Esta técnica se basa en la resonancia magnética de los protones de tejidos del cuerpo (agua, membranas, lípidos, proteínas, etc) y es actualmente el método más potente de diagnosis.

El contraste en MRI, puede mejorarse con sustancias paramagnéticas. La capacidad de un compuesto para incrementar la velocidad de relajación de los espines de protón de las moléculas de agua del entorno se llama relajación y se define como R1∼1/T1 o R2∼1/T2. Las nanopartículas superparamagnéticas son candidatos para actuar como agentes de contraste en MRI. Al igual que las sustancias paramagnéticas, pierden su magnetización cuando se elimina el campo magnético externo, pero a diferencia de éstas, su magnetización es sensiblemente mayor. Por lo tanto, la relajación que producen es mucho más alta que las de los clásicos complejos paramagnéticos de Gd(III). El efecto de las nanopartículas superparamagnéticas se puede describir en base a la heterogeneidad del intenso campo magnético que afecta a los protones de alrededor, induciendo un desfase del momento magnético y dando lugar a un acortamiento del tiempo de relajación T2. De este modo, las nanopartículas superparamagnéticas son unos buenos candidatos para el desarrollo de nuevos agentes de contraste, permitiendo una detección temprana de patologías severas y de gran impacto social.

Por otro lado, los denominados quantum dots (QDs), han sido usados con éxito como nuevos marcadores fluorescentes en el campo biomédico y son considerados como una herramienta prometedora en Imagen óptica de fluorescencia (OI) para diagnóstico clínico. Los QDs son nanopartículas inorgánicas, generalmente compuestas de elementos de los grupos II-VI y III-V, los cuales, debido a su confinamiento cuántico de cargas en un diminuto espacio muestran unas propiedades fluorescentes únicas: espectros de emisión estrechos, rendimiento cuántico alto, espectros de absorción anchos, buena estabilidad química y alta fotoestabilidad y longitud de onda de emisión dependiente del tamaño, ampliando su rango de emisión hasta la región NIR (infrarrojo cercano) o IR (infrarrojo) y ofreciendo una mayor penetración en tejido para una mejor imagen. Sin embargo, a pesar de las excepcionales propiedades fluorescentes que presentan, estas nanopartículas necesitan ser funcionalizadas con algún tipo de polímero o proteína que las haga biocompatibles y por tanto aptas para su utilización in vivo.

Un enfoque dentro de la nanomedicina es el uso de nanopartículas que puedan combinar diferentes técnicas de bioimagen. Cada modalidad de bioimagen tiene sus propios méritos pero también ciertas desventajas y por lo tanto los métodos de imagen multimodales presentan mayor capacidad para obtener una imagen integral y más detallada. La combinación MRI-OI es un buen ejemplo de un método biomodal y una ruta para su consecución es el uso de nanoestructuras que contengan dos componentes metálicos, uno magnético y otro fluorescente: nanopartículas bifuncionales magneto-fluorescente. El nanocomponente magnético puede incorporar un radiomarcador, como 99mTcO4 − , añadiendo a la nanoestructura multifuncional una nueva modalidad de imagen médica mediante la detección de la radiación gamma que dicho radionúclido genera mediante gammagrafía (SPECT).

Un punto clave para la aplicación biomédica de las nanopartículas metálicas es que no pueden ser tóxicas y deben permanecer en circulación el tiempo suficiente para alcanzar el blanco biológico. El sistema fagocítico mononuclear (MPS) reconoce y elimina, a través de los macrófagos, las partículas de la circulación, con su simultánea concentración en órganos con alta actividad fagocítica (principalmente el hígado). Por lo tanto, una estrategia sensata es el uso de nanopartículas que sean capaces de evadir el ataque por parte del MPS y no sean fagocitadas por los macrófagos, aumentando consecuentemente el tiempo de vida media en plasma y permitiendo alcanzar un órgano o tejido específico.

Este tipo de agentes de diagnosis ideales para su aplicación clínica deberían poseer una alta y específica acumulación en las células adecuadas, lo que tendría como consecuencia la posibilidad de diagnosticar de forma cada vez más precoz una enfermedad aún tratable.

Numerosos métodos físicos y químicos han sido utilizados para preparar nanopartículas magnéticas. Puesto que las propiedades magnéticas son muy dependientes del tamaño, es crucial que el método a desarrollar permita la obtención de nanopartículas con tamaños uniformes. Una posible ruta para obtener nanopartículas metálicas sin agregación y con tamaño controlado es el uso de una plataforma molecular preorganizada, con una cavidad que pueda actuar como nanoreactor para el control químico y espacial en la formación de las nanopartículas. Un ejemplo típico de este tipo de moléculas es la proteína ferritina. La apoferritina consiste en una proteína esférica formada por 24 subunidades rodeando una cavidad acuosa con un diámetro de aproximadamente 8 nm.

La organización de las multisubunidades para formar la apoferritina genera la presencia de canales. Ocho canales hidrofílicos de aproximadamente 4 A permiten la entrada de iones metálicos y moléculas suficientemente pequeñas al interior de la cavidad de la proteína. Esto ha permitido la introducción de magnetita en el interior de la apoferritina produciendo magnetoferritina, la cual ha sido usada como método de diagnostico monomodal (MRI) (Journal of Magnetic Resonance Imaging. 4(3):497-505, 1994 May-Jun.).

Descripción detallada de la invención

En vista del estado de la técnica un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente de contraste OI, el cual puede además ser usado como agente bimodal, OI-MRI, e incluso trimodal, OI-MRI-SPECT, basado en una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot (QD) y al menos una molécula de un polímero biocompatible unidos ambos covalentemente a la superficie de la ferritina (Figura 1). Estas partículas han demostrado que se biodistribuye en diferentes tejidos, como el hígado, pulmón y cerebro, por lo que son útiles como agentes de contraste para enfermedades en dichos tejidos.

La ferritina de la invención es biocompatible y la bioconjugación con un quantum dot, mejora significativamente la biodistribución de ambas partículas por separado. La nanoestructura formada por la conjugación de la ferritina y del quantum dot puede ser usada como agente de contraste en OI y muestra tiempos de vida medios suficientemente extensos para distribuirse por el sistema circulatorio sin ser fagocitados en un tiempo menor de 3 h, pero a la vez suficientemente cortos para evitar su acumulación en el cuerpo.

En el contexto de la presente invención se entiende por ferritina cualquier apo-ferritina, independiente del material que se encuentre encapsulado en su cavidad interna, incluidas las apo-ferritinas en las cuales la cavidad interna está vacía.

Los componentes fluorescentes, como por ejemplo los QD525, QD655 y QD800, que podría enlazar covalentemente a la capa externa de la ferritina mediante formación de un enlace covalente amida por reacción entre los grupos -NH2 libres de los restos de lisinas de la capa externa de la ferritina y los grupos carboxílicos del QD.

Los denominados quantum dots QDs, han sido usados con éxito como nuevos marcadores fluorescentes en el campo biomédico y son considerados como una herramienta prometedora en Optical Imaging para diagnóstico clínico in vivo [Choi, H. S. Liu, W. Misra, W., Tanaka, E, Zimmer, J. P., Ipe, B. I., Bawendi, M. G, Frangioni, J. V, Nat. Biotechnol. 2007, 25, 1165-1170 y Qi, L., Gao, X. Expert. Opin. Drug Delivery 2008, 5, 263-267.]. Los QDs son nanopartículas inorgánicas, generalmente compuestas de elementos de los grupos II-VI y III-V, los cuales, debido a su confinamiento cuántico de cargas en un diminuto espacio muestran unas propiedades fluorescentes únicas: espectros de emisión estrechos, rendimiento cuántico alto, espectros de absorción anchos, buena estabilidad química y alta fotoestabilidad y longitud de onda de emisión dependiente del tamaño, ampliando su rango de emisión y ofreciendo una mayor penetración en tejido para una mejor imagen. Una de las limitaciones de los QD para poder tener aplicaciones in vivo es su bajo tiempo de residencia en sangre. No obstante, esta limitación puede ser superada mediante funcionalización con polímeros hidrofóbicos como el polietilén glicol (PEG) [Daou, T. Jean; Li, Liang; Reiss, Peter; Josserand, Veronique; Texier, Isabelle . Langmuir (2009), 25(5), 3040-3044 y referencias]. Una vez convenientemente funcionalizados, pueden ser administrados in vivo y su localización detectada por la emisión fluorescente correspondiente.

Los quantum dots se pueden seleccionar por ejemplo entre los que se listan en el catálogo Invitrogen Molecular Probes 2009 y preferiblemente se seleccionan entre Qdot® 625 ITKTM carboxyl quantum dots (A10200), Qdot® 605 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21301MP), Qdot® 585 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21311MP), Qdot® 655 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21321MP), Qdot® 565 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21331MP), Qdot® 525 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21341MP), Qdot® 705 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21361MP), Qdot® 800 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21371MP), Qdot® 545 ITKTM carboxyl quantum dots 8 μM solution (Q21391MP). Qdot® 605 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21501MP), Qdot® 585 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21511MP), Qdot® 655 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21521MP), Qdot® 565 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21531MP), Qdot® 525 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21541MP), Qdot® 705 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21561MP), Qdot® 800 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21571MP), Qdot® 545 ITKTM amino (PEG) quantum dots 8 μM solution (Q21591MP) y cualquiera de sus combinaciones. Los quantum dots preferidos son los que emiten entre 750 y 850 nm.

Aunque hay diferentes maneras de anclar el quantum dot a la superficie de la ferritina, preferiblemente estos están anclados a través de enlaces covalentes tipo amida, aprovechando los grupos amino que están libres en la superficie de la ferritina.

Normalmente entre 1 y 2 unidades de quantum dots anclados a la superficie son suficientes para el uso de la ferritina como agente de contraste.

El número de quantum dots anclados a la magnetoferritina se puede calcular según la fórmula: N=2π (RFe +RQD)2/(3)1/2 (RQD)2, donde RFe es el radio de la nanopartícula y RQD es el radio del quantum dot (QD). Esta expresión, estimativa, proviene de dividir el área de la ferritina cubierta por los quantum dots y dividirla por el área de ferritina cubierta por un solo quantum dot. El cálculo asume un empaquetamiento compacto de QDs sobre la superficie de la ferritina y tiene en consideración los huecos entre los QDs. Por ejemplo para una partícula magnética de 10 nm el número máximo de QDs aumenta desde 45 hasta 133 cuando el diámetro del QD disminuye de 4 a 2 nm

(D. Wang, J. He, N. Rosenzweig, Z. Rosenzweig, Nano Lett. 2004, 4, 409-413).

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención la ferritina tiene cadenas de un polímero biocompatible covalentemente unidas a la superficie de la ferritina. La presencia de este polímero mejora las propiedades de la ferritina de la invención para ser usada como agente de contraste puesto que aumenta su estabilidad general obteniendo tiempos medios de vida en sangre adecuados para su uso. El polímero biocompatible preferido es polietilenglicol (PEG), entre otras razones por su disponibilidad industrial, su facilidad de incorporación a la superficie de la ferritina y su alta biocompatibilidad. El proceso de unir covalentemente el polímero de PEG a otras moléculas, normalmente fármacos o proteínas terapéuticas es conocido como PEGylación (Kohler, N.; Fryxell, G. E.; Zhang, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7206. Paul, K. G.; Frigo, T. B.; Groman, J. Y.; Groman, E. V. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 394.). En nuestro caso, el PEG va unido covalentemente a la ferritina. Este proceso se puede llevar a cabo de forma sencilla, incubando un derivado del PEG reactivo con las nanopartículas. La unión covalente de PEG las enmascara del sistema inmune, aumenta la talla hidrodinámica (talla en solución) lo que aumenta el tiempo de vida media en sangre y reduce su eliminación por el sistema inmune. Este proceso además aumenta la solubilidad en agua de dichas nanopartículas y le confiere de forma general una estabilidad adicional. Se puede además controlar el número de moléculas de PEG que se unen a la superficie de la nanopartícula. Los derivados del PEG de tipo succinimidil éster permiten la formación de un enlace covalente de tipo amida por reacción con los grupos amino en la superficie externa de las nanopartículas. En resumen, para conseguir la unión de las cadenas de PEG y la ferritina, el PEG debe de estar derivatizado con grupos funcionales capaces de unirse por sí solos o con la ayuda de un reactivo a la superficie de la ferritina. El PEG se une preferiblemente mediante enlaces amida, siendo por lo tanto los derivados de PEG preferidos, como ya se ha comentado antes, los que contienen el grupo funcional succinimidil éster, que permite una funcionalización directa de las ferritinas, ya que este grupo éster activado reacciona con los grupos aminos que rodean las nanopartículas, formando el enlace covalente tipo amida. Uno de los PEG preferidos es PEG1163 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ωácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 2,000 Dalton. Los PEG funcionalizados como éster succinimidil son comerciales y su acoplamiento covalente a la partícula superparamagnética se puede llevar a cabo después de la introducción del 99mTc.

El número de cadenas de PEG introducidas se pueden controlar dependiendo de la estequiometría y del PEG empleados. Por ejemplo, cuando se utilizan derivados de éster activados, dada la alta reactivad de dichos ésteres y de las aminas de la nanopartícula, la reacción es completa, de tal forma que el número de PEG enlazados covalentemente a la superficie de la nanopartícula coincide con el número de moléculas del derivado de PEG/nanopartículas que se utiliza en la reacción. Además el número de cadenas introducidas se comprobó a través del uso de un patrón electroforético, analizando las diferentes ferritinas derivatizadas con PEG y viendo su correspondencia con un aumento escalonado y gradual del peso molecular y por ende de una mayor retención. El PEG puede ser mono-o bifuncionalizado con ésteres activados y se pueden unir PEG con diferente densidad y cristalinidad. La estabilidad de la ferritina de la invención se ve aumentada por la introducción del polímero biocompatible, y en especial cuando este es PEG, pero este mayor aumento de la estabilidad no es proporcional al número de cadenas introducidas. Por lo tanto, aunque se puede introducir entre 1 y 72 cadenas, se pueden dejar grupos amino libre por sí se desea realizar subsiguientes derivatizaciones o simplemente para reducir los coste de fabricación. Preferiblemente se incorporan de media entre 3 y 10 cadenas de PEG por ferritina y más preferiblemente entre4y6.

A continuación se detallan algunos de los derivados de PEG útiles para la presente invención:

i) MeO-PEG-COOH: PEG1156 MeO-PEG(11)-COOH α-Metoxi-ω-ácido propanoico unde(etilenglicol) PEG-WM 588,7 g/mol, PEG1161 MeO-PEG-COOH α-Metoxi-ω-ácido carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 750 D, PEG1158 MeO-PEG-COOH α-Metoxi-ω-ácido carboxílico poli(etilen glicol) PEG-WM 2.000 D, PEG1160 MeO-PEG-COOH α-Metoxi-ω-ácido carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 5.000 D, PEG1157 MeO-PEG-COOH α-Metoxi-ω-ácido carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000 D, PEG1159 MeO-PEG-COOH α-Metoxi-ω-carboxílico ácido poli(etilenglicol) PEG-WM 20.000 D, PEG1166 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 750 D, PEG1163 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-carboxílico ácido succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 2.000 D, PEG1165 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 5.000 D, PEG1162 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000 D, PEG1164 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 20.000 D,

ii) HOOC-PEG-COOH:PEG1091 HOOC-PEG(12)-COOH α,ω-Bis(propionico ácido) duodeca(etilen glicol) PEG-WM 2.000 690,8 g/mol, PEG1083 HOOC-PEG-COOH α,ω-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 2.000 D, PEG1085 HOOC-PEG-COOH α,ω-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 3.000 DPEG1086 HOOC-PEG-COOH α,ω-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 6.000 D, PEG1082 HOOC-PEG-COOH α,ω-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000 D PEG1084 HOOC-PEG-COOH α,ω-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 20.000 D,

iii) NHS-PEG-NHS:PEG1184 Su-OOC-PEG-COO-Su α,ω-Di-succinimidil éster poli(etilen glicol) PEG-WM

2.000 D, PEG1186 Su-OOC-PEG-COO-Su α,ω-Di-succinimidil éster poli(etilen glicol) PEG-WM 3.000 D, PEG1187 Su-OOC-PEG-COO-Su α,ω-Di-succinimidil éster poli(etilen glicol) PEG-WM 6.000 D, PEG1183 Su-OOC-PEGCOO-Su α,ω-Di-succinimidil éster poli(etilen glicol) PEG-WM 10.000 D, PEG1185 Su-OOC-PEG-COO-Su α,ω-Disuccinimidil éster poli(etilen glicol) PEG-WM 20.000 D,

iv) H2N-PEG-COOH:PEG1096 H2N-PEG-COOH*HCl α-Amino-ω-carboxi poli(etilen glicol) clorohidrato PEG-WM 3.000 D, PEG1097 H2N-PEG-COOH*HCl α-Amino-ω-carboxi poli(etilenglicol) clorohidrato PEG-WM 5.000 Dalton PEG1095 H2N-PEG-COOH*HCl α-Amino-ω-carboxi poli(etilenglicol) clorohidrato PEG-WM 10.000 Dalton.

Se eligió preferiblemente el PEG1163 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-carboxílico ácido succinimidil éster poli (etilen glicol) PEG-WM 2.000 Dalton. El derivado de PEG que contiene el grupo funcional succinimidil éster, permite una funcionalización directa de las ferritinas ya que este grupo éster activado reacciona con los grupos aminos que rodean las nanopartículas, formando un enlace covalente tipo amida.

Los datos experimentales han demostrado que después de 3 h de inyección, las partículas se acumulan de forma significativa en pulmón. Por otra parte, puesto que se puede controlar la cantidad de Tc/partícula (en un rango 020, con un 100% prácticamente de incorporación de Tc) permite que se pueda alcanzar de sobra el rango óptimo de concentraciones de Tc (10−9 M) y el de MRI (del orden de 10−5 M).

Se puede utilizar la cavidad interior de la ferritina para introducir magnetita, obteniendo una nanopartícula superparamagnética llamada magnetoferritina, a partir de ahora la magnetoferritina de la invención. Esta nanopartícula superparamagnética está constituida por una nanopartícula de magnetita encapsulada en la ferritina que presenta propiedades para comportarse como agente de contraste en MRI.

La magnetoferritina de la invención es biocompatible y presenta una biodistribución en distintos órganos, mejorando significativamente las propiedades de otros agentes de contraste como son la magnetita sola. Esta puede ser usada como agente de contraste bimodal en MRI.

Otras ventajas de la magnetoferritina de la presente invención es que en la preparación de estas nanopartículas se puede ocluir 99mTc. Preferiblemente este se introduce en forma de 99mTcO4 −. La introducción de 99mTcO4 se puede llevar a cabo a temperatura ambiente en un tiempo óptimo para su inyección en el cuerpo. Además no requiere reducción del Tc(VII) y su incorporación a la nanopartícula es prácticamente total, lo que permite una acumulación óptima del radionúclido. El hecho de que el pertecnectato vaya ocluido en la red del mineral de Fe, hace que pueda controlarse la cantidad de 99mTcO4 − por partícula y por lo tanto, puedan prepararse fármacos de diferentes dosis de radionúclido, en función de las necesidades. Al introducirse el 99mTc hace que las magnetoferritina de la invención se pueden usar como agente de contraste trimodal, OI-MRI-SPECT.

La especie de Tc preferida para su inclusión en la magnetoferritina de la invención es 99mTcO4 −. La concentración de 99mTc se puede ajustar en función de la necesidad, por ejemplo diagnosis o terapia pero preferiblemente está comprendida entre 10−9-10−5M.

Los presentes inventores han logrado obtener partículas de magnetita de alto contenido en Fe en la cavidad de ferritina. El contenido en Fe puede ser modulado hasta 3800 átomos de Fe por unidad de ferritina. Preferiblemente se modula la cantidad de Fe de 3000 a 3800 átomos de Fe por unidad de ferritina, lo cual permite mejorar sus propiedades como agente de contraste en MRI.

Durante la preparación de la nanopartícula de magnetita (i), el Tc queda ocluido dentro de la magnetita, lo que es un ventaja frente a los complejos de coordinación de Tc puesto que la concentración de Tc por partícula es mucho mayor (hasta 20 veces mayor) y permite acumular una mayor densidad de átomos de Tc. Esta mayor acumulación redunda en un incremento de la radiación gamma y en una mayor resolución. Asimismo, la acumulación optimiza la concentración del radiomarcador, lo que permite el uso de menores dosis.

Los datos experimentales han demostrado que después de 3 h de inyección, las partículas se acumulan de forma significativa en pulmón (Figura 2). Por otra parte, puesto qué controlar la cantidad de Tc/ferritina (en un rango 020, con un 100% prácticamente de incorporación de Tc) permite que se pueda alcanzar de sobra el rango óptimo de concentraciones de Tc (10−9 M) y el de MRI (del orden de 10−5 M).

Otro de los aspectos es proporcionar un método para la síntesis de las ferritinas y las magnetoferritinas de la presente invención. Este método comprende:

a) anclar al menos un quantum dot a la superficie de la ferritina

b) y después anclar las cadenas de PEG a la superficie de la ferritina.

En una realización preferida la etapa (a) comprende: adicionar una disolución que comprende un quantum dot derivatizado con grupos carboxílicos en la superficie y un agente de acoplamiento, como una carboimida; a otra disolución de la ferritina y posteriormente hacer reaccionar la disolución que comprende el PEG.

La introducción de las cadenas de polímero biocompatible se deben de realizar después de la introducción del QD. La introducción del polímero biocompatible se realiza preferentemente mediante el uso de derivados del polímero biocompatible que comprenden ácidos carboxílicos, y así se forman enlaces tipo amida, por lo que se puede usar un agente de acoplamiento para la catálisis de la reacción. El biopolímero puede estar activado/funcionalizado, es decir los ácidos carboxílicos pueden estar derivatizados, incluyendo ya el agente de acoplamiento.

Los agentes de acoplamiento preferidos de la presente invención se seleccionan entre N,N-diciclohexilcarbodiimida, 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y cualquiera de sus combinaciones.

Respecto la síntesis de la magnetoferritina, esta se realiza antes de la introducción del QD y del polímero biocompatible. Aunque la introducción de la magnetita se puede hacer mediante el proceso descrito por Douglas (Masaki Uchida, Masahiro Terashima, Charles H. Cunningham, Yoriyasu Suzuki, Deborah A. Willits, Ann F. Willis, Philip C. Yang, Philip S. Tsao, Michael V. McConnell, Mark J. Young and Trevor Douglas, Magnetic Resonance in Medicine 60:1073-1081 (2008)), los presentes inventores han desarrollado una variación, que proporciona algunas ventajas. El método de la invención comprende al menos las etapas de:

i) preparar una disolución de apoferritina, preferiblemente de concentración entre 0,1 y 100 mg/mL, y más preferiblemente entre5y20 mg/mL,

ii) Preparar una disolución que comprenda Fe(II) y Fe(III) en estequiometría aproximada de 1:2, es decir entre 1:1,8 a 1,8:1,

iii) preparar una disolución de pertecnectato (99mTc),

iv) adicionar de forma intercalada la disolución preparada en el paso (ii) y la disolución preparada en la etapa (iii) sobre la preparada en el paso (i).

v) Preferiblemente, se aísla la magnetoferritina superparamagnética dopada con 99mTc.

La estequiometría inicial de Fe(II) y Fe(III) es determinante para la preparación apropiada de magnetoferritina y por ende de sus propiedades magnéticas. A diferencia del método reportado por Douglas y colaboradores, donde todo el Fe de partida está en su estado de oxidación Fe(II) y se ha comprobado que con un riguroso control de la extensión de la oxidación, en nuestro método, el balance estequiométrico de partida confiere las condiciones óptimas y no requiere un control exhaustivo de la entrada de aire en el sistema.

Las sales de hierro (II) y (III) útiles para la preparación de la magnetoferritina son conocidas por los expertos en la materia. En una realización preferida la etapa (ii) se prepara mezclando una disolución que comprende sulfato de hierro (II) amoniaco hexahidratado con otra que comprende Fe (NO3)3 en HCl.

La inclusión de 99mTcO4 − se lleva a cabo mediante pequeñas adiciones de 99mTcO4 − al mismo tiempo que se hace la red de magnetita. Se puede dializar la disolución resultante en bolsas de diálisis con tamaño de poro adecuado y separar las partículas de todo el material restante. En la disolución que no contiene las partículas se puede medir la concentración de Tc y de esta forma se conoce el porcentaje de Tc incorporado. En algunos casos se ha estudiado el comportamiento del MoO42−, porque tiene una química muy similar a del 99mTcO4 −, pero no es radioactivo. Se ha observado que para pequeños contenidos de Mo (0-20 átomos de Mo/magnetoferritina), la incorporación es prácticamente del 100%.

Con objeto de llevar una caracterización más pormenorizada que permita conocer la distribución de Tc en la nanopartícula superparamagnética, se llevó a cabo un estudio mediante Microscopía Electrónica de Transmisión de muestras similares en las que en vez de usar el radiomarcador pertecnectato, se usaron otros aniones del tipo molibdato, vanadato, arseniato y fosfato. La química de estos aniones es similar a la del pertecnectato, especialmente si no hay cambios del estado de oxidación del metal.

El estudio de Microscopía Electrónica de Transmisión es de especial utilidad en el caso de las nanopartículas dopadas con vanadato; esta técnica nos proporciona tanto información sobre la distribución del tamaño de las nanopartículas como sobre la composición química y distribución espacial de los estados de oxidación en nanopartículas individuales. Las imágenes de campo oscuro a alto ángulo son sensibles al número atómico del material, es decir, aquellas zonas en la que estén presentes los elementos más pesados se mostrarán en la imagen como puntos de mayor intensidad. En nuestro caso de estudio, las nanopartículas, al contener elementos de alto número atómico, aparecerán en la imagen con alto contraste, siendo visualizadas directamente y de forma individual. En estas condiciones de registro de la imagen se pueden realizar medidas directas del tamaño de las nanopartículas presentes en la muestra, a partir de las cuales se puede establecer una distribución de tamaños de partícula. Adicionalmente se puede determinar la distribución espacial, con resolución sub-nanométrica, de los elementos químicos presentes en las partículas individuales, utilizando la técnica de pérdida de energía de los electrones (EELS). Esta técnica nos permite estudiar directamente las transiciones electrónicas que ocurren en el átomo cuando este es sometido a un haz de electrones de alta energía, 200 kV. En particular esta técnica mide la energía que el electrón incidente pierde cuando interacciona con un átomo. Por ejemplo en el caso de los átomos de Vanadio, se estudian directamente las transiciones L2,3 donde los electrones 2p del átomo son transferidos a estados no ocupados sobre el nivel de Fermi. La energía requerida para esta transición es un valor característico para cada átomo y es igual a la energía pérdida por el electrón incidente. Así, midiendo la pérdida de energía de los electrones incidentes uno puede identificar los distintos elementos presentes en las nanopartículas, (V 513 eV, O 532 eV, Fe 708 eV). Adicionalmente la estructura fina del espectro EELS de los metales de transición se caracteriza por la presencia de dos picos intensos (líneas blancas) cuya intensidad y posición en energía varía en función del estado de oxidación del material (Leapman et al Phys. Rev. Lett. 45, 397 (1980), Turquat et al. International Journal of Inorganic Materials 3 (2001) 1025-1032). El estudio detallado de la estructura fina del pico de absorción refleja información sobre el estado electrónico del material pudiendo estudiar las posibles variaciones del estado de oxidación del hierro o vanadio a través de las nanopartículas.

El estudio de la composición química y los estados de oxidación en nanopartículas individuales fue llevado a cabo combinando las propiedades de las imágenes en campo oscuro a alto ángulo con la espectroscopia de pérdida de energía de los electrones, utilizando el método de adquisición conocido como espectro-imagen (Tence, M. Quartuccio and C. Colliex, Ultramicroscopy 58 (1995) 42, Maigne et al Journal of Electron Microscopy 58(3): 99-109 (2009)). Este modo consiste en adquirir simultáneamente la señal de campo oscuro a alto ángulo y los espectros EELS mientras la sonda barre una zona predeterminada, imagen (1D) o espectro línea. En particular utilizando un tiempo de adquisición de 2 segundos se adquirió un espectro EELS, con energía de dispersión de 0,5eV, cada 0,6 nm a lo largo de una línea de 36,7nm que pasa a través de las nanopartículas. El análisis de cada uno de los espectros adquiridos (cuantificación y estudio del estado de oxidación) a lo largo de la nanopartícula nos proporciona la composición y estado de oxidación del metal caracterizado a la escala subnanométrica.

Preferiblemente en el método la disolución de la etapa (a) está tamponada con AMPSO a un pH entre pH 7,5 y 9,5, preferiblemente entre 8,0 y 9,0.

En una realización particular, las cadenas del polímero biocompatible, preferiblemente PEG, se hacen reaccionar con la magnetoferritina después de la inclusión de la magnetita/Tc.

Otro aspecto se refiere a una composición farmacéutica que comprende la magnetoferritina de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, así como el uso de dicha composición farmacéutica para la preparación de un medicamento.

Las ferritinas de la presente invención, y especialmente la magnetoferritina, así como la composición farmacéutica que las incluye son útiles para la preparación de medicamento para la diagnosis de diferentes enfermedades, según la utilización de moléculas que lo confieran especificidad por un tejido u órgano en cuestión, pero en especial cáncer, incluyendo cáncer cervical, de cabeza y cuello, renal y de uréter, de colon, recto y ano, de endometrio, de esófago, de estómago, de hígado, de laringe, de ovario, de páncreas, de piel, de próstata, de pulmón, de cerebro, de testículo, leucemia, melanoma, y linfoma.

Además de para detectar enfermedades también son útiles tanto la ferritina de la presente invención, y especialmente magnetoferritina, así como la composición farmacéutica que las comprende como agentes de contraste en general y como agente de contraste en MRI, OI o SPECT.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una de las realizaciones particulares de la nanoestructura de la invención. Esta consta de ferritina (i), con un núcleo de magnetita dopado con 99mTc (iv), un quantum dot anclado a la superficie (ii), y polímero biocompatible de PEG (iii). La nanoestructura es capaz de actuar como agente de contraste en MRI (i), OI(ii), gammagrafía (iv) y muestra tiempos de vida medio en sangre suficientemente extensos para distribuirse por el sistema circulatorio sin ser fagocitados en un tiempo menor de 3 h.

La figura 2. TEM-STEM de la nanoestructura mostrando la formación preferencial de dímeros ferritina-QD.

La figura 3. EELS en línea de un dímero ferritina-QD, demostrando la presencia de FeyOenel bloque de ferritina ydeCdeneldeQD.

La figura 4. Imagen de ratones atímicos a los que se les inyectó la nanoestructura objeto de la presente patente. Tras 3 h, se observa la fluorescencia de la nanoestructura, centrada preferencialmente en pulmones, con una concentración prácticamente despreciable en el hígado.

Ejemplos

Acoplamiento ferritina con Quantum Dots

Como ejemplo de una de nuestras realizaciones particulares, la ferritina se acopló con 3 tipos diferentes de quantum dots: un primer tipo de quantum dots emitiendo en el verde (QD525), un segundo tipo emitiendo en el rojo (QD655) y un tercero que emite en el cercano infrarrojo (QD800). Para ello se llevó a cabo una incubación directa de ambos tipos de nanopartículas (magnetoferritina y Qdot) en presencia del catalizador EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida), y se obtuvo una nanoestructura que contenía ambos tipos de nanoprecursores (magnetoferritina+Qdot).

El estudio por Optical Imaging de la biodistribución de la magnetoferritina acoplada al QD800 mostró lo siguiente: en un tiempo de entre 15 minutos y 1 hora después de la administración intravenosa la nanoestructura se concentra en hígado, pulmón y cerebro, en orden decreciente. Después de 3 horas, se localiza preferentemente en pulmones, siendo la concentración en hígado muy poco significativa (Figura 4). Tras 24 horas no se detectaron nanopartículas.

Síntesis de magnetoferritina-99mTc

Disolución 1. Se preparan 10 ml una disolución de apoferritina (Sigma-Aldrich Ref. A341-1G, lot. 048K7004) de concentración 10 mg/ml en tampón AMPSO pH 8,6 (Sigma A6659). La disolución se desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante 10 min.

Disolución 2. Se preparan dos disoluciones: 5 ml de Sal de Mohr (Amonium Iron (II) sulfate hexahydrate, Aldrich Chem. 20,350-5) 0,05 M en HCl 0,01My5mldeFe(NO3)3 0,1 M en HCl 0,01 M, se mezclan y se desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante 10 min.

Disolución 3. Una disolución de NaOH 0,1 M se desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante 10 min.

Disolución 4. Una disolución de pertenectato (99mTc) obtenida a partir de kit comercial se desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante 2 min.

Suspensión 5. Se lleva a cabo la adición lenta de la disolución 2 sobre la disolución 1. Se llevan a cabo adiciones de 0,25 ml cada 2 min hasta completar 1 ml. Antes de la 5 adición de la disolución 2, se adicionan 56 μl de la disolución de 99mTc (disolución 4).

Disolución 6. A la suspensión 5 se le adiciona lentamente 1 ml de una disolución de citrato sódico 0,1 M para eliminar todo los compuestos metálicos que no hayan quedado encapsulados en la apoferritina. La disolución resultante se cromatografía (10 min) en columna de exclusión por tamaño (Sephadex G-25, lot.360710, GE Healthcare, PD-10 Desalting Columns, 17-0851-01), obteniendo la disolución final 6 que contiene magnetita dopada con 99mTc encapsulada en la cavidad de la apoferritina.

Adición del radioisótopo de Tc a la magnetoferritina

Disolución 4. Se usa un generador de 99Mo/99mTc de 12 GBq de actividad calibrada. La elución realizada es analizada en términos de actividad de 99mTc. Conocida la relación específica mCi/μgde 99mTc, es posible controlar la cantidad de Tc utilizada y por ende su actividad radioquímica.

Suspensión 5. Se lleva a cabo la adición lenta de la disolución 2 sobre la disolución 1. Se llevan a cabo adiciones de 0,25 ml cada 2 min hasta completar 1 ml. Antes de la 5 adición de la disolución 2, se adicionan 0,5 ml de la disolución de 99mTc (disolución 4).

Para la realización del control de calidad usamos tiras de papel Whatman 3 MM de 10 cm de longitud y 0,5 cm de ancho, en las que depositamos una alícuota (150 μl) del radiofármaco marcado, y para su desarrollo las introducimos en tanques cromatográficos con acetona hasta unos 0,5 mm de la base. Cuando la cromatografía se ha desarrollado la medimos en el Radio Cromatógrafo Minigita Raytest. En el origen de la tira cromatográfica se quedarán los coloides (Rf=0), en este caso la magnetoferritina dopada con Tc, y en el frente el pertecnetato libre (Rf=1).

Acoplamiento de la magnetoferritina-99mTc (disolución 6) con Quantum Dots

Los quantum dots QD525, QD655 y QD800 se adquirieron en Invitrogen (Q21341MP, Q21321MP, Q21371MP, respectivamente). Los quantum dots están recubiertos por un polímero funcionalizado con grupos carboxílicos para reaccionar con los grupos amino de la ferritina. Los residuos carboxílicos de los QDs deben activarse con EDC (1etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida, Fluka 03450-25G).

Disolución 7. 20 μl de la solución stock del QD comercial (8 mM) se incuban con 10 μl de una disolución stock de EDC (10 mg/ml en agua bidestilada) durante 30 min para su activación. Esta preparación se lleva a cabo mientras se desgasifican las disoluciones requeridas en el paso anterior de la síntesis de magnetoferritina.

Disolución 8. 0,2 ml de la disolución 6 (magnetoferritina-99mTc) se diluyen hasta 2 ml en tampón PBS (Fosfato potásico monobásico, Acros Organics 424205000 y fosfático sódico dibásico, Acros Organics 424375000) y se le añade la disolución 7 (quantum dot activado. La mezcla se incuba durante 1 h en agitación suave y a 4ºC. Posteriormente la muestra se purifica en una columna de cromatografía (15 min) por exclusión de tamaño (Sephacryl 5,5 cm x 1,5 cm de lecho, Sigma) con el fin de eliminar el exceso de producto que no hubiese reaccionado.

Acoplamiento de PEG

El derivado de polietilenglicol MeO-PEG-NHS α-Metoxi-ω-carboxílico ácido succinimidil éster poli(etilenglicol) (PEG-MW 2.000 Dalton)/ M.W. 2000 g/mol) se adquirió en Iris Biotech GmbH (PEG1164, lot. 125447).

Disolución 9. 1000 moles de PEG (0.0058 g en 0.5 ml de agua bidestilada) fueron añadidos a la disolución 8 y se dejó 30 min en agitación suave y a temperatura ambiente. Se cromatografió (10 min) en una columna de exclusión por tamaño (Sephadex G-25, lot.360710, GE Healthcare, PD-10 Desalting Columns, 17-0851-01) hasta obtener una disolución pura de nanopartículas de magnetita dopadas con 99mTc, acopladas covalentemente con un QD y PEG.

Cuantificación de los quantum dot anclados

Solamente cuando la preparación se lleva a cabo en un fuerte exceso de QD, se logra observar nanopartículas del tipo QD-magnetoferritina-QD. El recuento del número de QD enlazados convalentemente a la magnetoferritina en la nanoestructura objeto de la presente invención se llevó a cabo mediante TEM (Microscopía Electrónica de Transmisión) (figura 2) y mediante Microscopía Electrónica de Barrido-Transmisión en modo Campo Oscuro Anular de AltoÁngulo (HAADF-STEM) (figura 2). En esta última técnica, la intensidad de la señal con la que se construye la imagen depende del número atómico (Z), de tal forma que en las zonas de la imagen en las que están presentes elementos químicos con mayor valor de Z, el brillo es mayor. La relación entre la intensidad en la imagen y el valor del número atómico es aproximadamente del tipo Z2 (S.J. Pennycook, D.E. Jesson, Ultramicroscopy, 1991, 37, 14). Como puede observarse en la figura, la imagen STEM-HAADF muestra claramente la presencia de dos partículas de dimensiones nanométricas próximas entre sí. Puede apreciarse, igualmente, que hay una clara diferencia de brillo entre las dos partículas que forman la nanoestructura, tal como cabría esperar, puesto que una contiene un óxido de Fe (ZFe=26, ZO=8) y la otra, una capa de CdSe (ZCd= 48, ZSe=34). De acuerdo con lo comentado anteriormente, la partícula que muestra menor intensidad sería la que contiene elementos más ligeros (Fe, O) y la más brillante aquella que contiene a los elementos más pesados (Cd, Se). Para confirmar la interpretación anterior y obtener una evidencia directa sobre la naturaleza química de cada una de las dos partículas que se integraban en las nanoestructuras detectadas mediante Microscopía Electrónica, se llevó a cabo un estudio complementario mediante la técnica denominada EELS (Espectroscopía de pérdida de energía de los electrones). Esta técnica, que se lleva a cabo en los microscopios electrónicos de transmisión, se registra la energía cinética que pierde el haz de electrones incidente al atravesar la muestra. Esta pérdida de energía corresponde a las interacciones inelásticas electrón-muestra. Parte de estas interacciones corresponden a excitaciones de electrones de los nivele s internos de los átomos presentes en la muestra a niveles por encima del nivel de Fermi. Como las energías de estas transiciones son específicas de cada átomo, el registro del espectro de pérdida de energías constituye una huella dactilar de los elementos presentes en la muestra, permitiendo en definitiva realizar un análisis químico cualitativo y cuantitativo de la zona iluminada por el haz de electrones. Como el diámetro de las sondas de electrones que se pueden obtener en microscopios de transmisión como el empleado para obtener la figura, dotado con cañón de emisión de campo o FEG, puede ser del orden de tan solo unos pocos Angstroms, esta técnica permite realizar lo que viene a llamarse como nanoanálisis, es decir un análisis químico cualitativo y cuantitativo con una resolución espacial mejor que un nanómetro. Es más, si formamos una de estas sondas de dimensiones nanométricas, controlamos su movimiento sobre la muestra y en paralelo realizamos un registro simultáneo de la señal STEM-HAADF y de los espectros EELS podemos trabajar en un modo denominado de espectro-imagen (en el caso en el que la muestra se barra a lo largo de dos direcciones, sobre un área) o de espectro-línea (cuando la sonda de electrones se barre siguiendo una trayectoria lineal desde un punto a otro de la muestra). Trabajando en estos modos obtenemos información no sólo de qué elementos están presentes y en qué cantidad sino, además, sobre la distribución espacial de los elementos presentes en la muestra, con resolución subnanométrica. Esta aproximación experimental de espectrolínea es la que se ha aplicado al estudio de la composición química de las nanoestructuras reivindicadas. En nuestro caso se ha realizado análisis EELS a lo largo de trayectorias lineales que, partiendo del extremo de una de las partículas y cruzándola, llegaban y cruzaban la segunda de las partículas, adquiriendo un espectro, con una sonda menor que 5 ˚A. Como puede observarse (Figura 3), los espectros correspondientes a la zona de la imagen corres-

A, tras cada 5 ˚pondiente a la partícula más brillante muestran señales correspondientes al Cd, mientras que los espectros registrados en la zona de la imagen correspondiente a la partícula menos brillante, contienen señales de Fe y O, confirmando que la nanoestructura consiste en dímeros de magnetoferritina y QD.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie de la ferritina.

2. 2. La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque el quantum dot emite entre 750 y 850 nm.

3. 3.

   La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el quantum dot está funcionalizado con grupos carboxílicos.

4. 4.

   La ferritina según cualquiera las tres reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el quantum dot está unido covalentemente a la superficie de la ferritina mediante enlaces amida.

5. 5.

   La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende entre 1 y 2 unidades de quantum dots anclados a la superficie de la ferritina.

6. 6.

   La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polímero biocompatible es polietilén glicol.

7. 7.

   La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque es obtenible por la unión de PEG1163 MeOPEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 2,000 Dalton a la superficie de la ferritina.

8. 8.

   La ferritina según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polietilén glicol está unido mediante enlaces covalentes de tipo amida.

9. 9.

   La ferritina según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizada porque tiene entre 3 y 10 cadenas de polietilén glicol unidas covalentemente a la superficie de la ferritina.

10. 10.

    La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracteriza porque el núcleo tiene magnetita ocluyendo 99mTc.

11. 11. La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque la especie de 99mTc es 99mTcO4 − .

12. 12.

    La ferritina según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración de la especie 99mTc está comprendida entre 10−9-10−5M.

13. 13.

    Un método para la síntesis de cualquiera de las ferritinas como se definen en las reivindicaciones anteriores que comprende:

    a) anclar al menos un quantum dot a la superficie de la ferritina b) y después anclar las cadenas de polietilén glicol a la superficie de la ferritina.

14. 14.

    El método según la reivindicación anterior, donde la etapa (a) comprende: adicionar una disolución que comprende un quantum dot derivatizado con grupos carboxílicos en la superficie y una carboimida a otra disolución de la ferritina y posteriormente hacer reaccionar la disolución que comprende el polietilén glicol.

15. 15.

    El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la etapa (b) comprende un agente de acoplamiento.

16. 16.

    El método según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente de acoplamiento se selecciona entre N,N-diciclohexilcarbodiimida, 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y cualquiera de sus combinaciones.

17. 17.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para la síntesis de cualquiera de las ferritinas como se definen en las reivindicaciones 10 a 12 que comprende antes de la incorporación del quantum dot al menos las siguientes etapas:

    i) preparar una disolución de apoferritina, preferiblemente de concentración entre 0,1 y 100 mg/mL, y más preferiblemente entre5y20 mg/mL,

    ii) preparar una disolución que comprenda Fe (II) y Fe(III) en estequiometría aproximada de 1:2.

    iii) preparar una disolución de pertenectato (99mTc),

    iv) adicionar de forma intercalada la disolución preparada en el paso (ii) y la disolución preparada en la etapa (iii) sobre la preparada en el paso (i).

    v) aislar la magnetoferritina superparamagnética dopada con 99mTc.

18. 18.

    El método según la reivindicación anterior en la que la disolución de la etapa (ii) se prepara mezclando una disolución que comprende sulfato de hierro (II) amoniaco hexahidratado con otra que comprende Fe (NO3)3 en HCl.

19. 19.

    El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la disolución de la etapa (i) esta tamponada con AMPSO a un pH entre pH 7,5 y 9,5, preferiblemente entre 8,0 y 9,0.

20. 20.

    Una composición farmacéutica que comprende la ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

21. 21. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento.

22. 22.

    El uso de la composición según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para la diagnosis de cáncer.

23. 23.

    El uso de la ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento como agente de contraste.

24. 24.

    El uso ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento para su uso como agente de contraste en MRI, OI o SPECT.

    OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. Ver Hoja Adicional

    21 N.o solicitud: 200931146 22 Fecha de presentaci6n de la solicitud: 11.12.2009 32 Fecha de prioridad:

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoria

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    Y Y A A A FERNANDEZ B. et al. Quantum dots decorated with magnetic bionanoparticles. Advanced Functional Materials. 2008, Vol. 18, paginas 3931-3935, todo el documento. WO 2005102396 A2 (EMORY UNIVERSITY) 03.11.2005, todo el documento. DAOU T. J. et al. Effect of poly(ethylene glycol) length on the in vivo behavior of coated quantum dots. Langmuir. 27.01.2009, Vol. 25, paginas 3040-3044, todo el documento. SARAVANAKUMAR G. e t al. Current st atus of nanoparticle-based i maging agents for ear ly diagnosis of cancer and atherosclerosis. Journal of Biomedical Nanotechnology. 02.2009, Vol. 5, No 1, paginas 20-35, todo el documento. WO 2008115854 A2 (GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA & UNIVERSITY OF OXFORD) 25.09.2008, todo el documento. 1-9,13-16,20-24 1-9,13-16,20-24 1-24 1-24 1-24

    Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgaci6n no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci6n de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentaci6n de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado � para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones no:

    Fecha de realizaci6n del informe 22.11.2011 Examinador M. Cumbreno Galindo Pagina 1/5

    INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

    No de solicitud: 200931146

    CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUD

    A61K49114 (2006.01) A61K51108 (2006.01) B82Y5100 (2011.01) A61K103110 (2006.01)

    Documentaci6n minima buscada (sistema de clasificaci6n seguido de los simbolos de clasificaci6n)

    A61K, B82Y

    Bases de datos electr6nicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de busqueda utilizados)

    INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, NPL, EMBASE

    Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/5

    OPINION ESCRITA

    No de solicitud: 200931146

    Fecha de Realizaci6n de la Opini6n Escrita: 22.11.2011

    Declaraci6n

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones 1-24 SI

    Reivindicaciones

    NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones 10-12, 17-19 SI

    Reivindicaciones 1-9, 13-16, 20-24

    NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaci6n industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opini6n.-

    La presente opini6n se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/5

    OPINION ESCRITA

    No de solicitud: 200931146

    1. Documentos considerados.-

    A continuaci6n se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideraci6n para la realizaci6n de esta opini6n.

    Documento

    Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n

    D01

    FERNANDEZ B. et al. Advanced Functional Materials. Vol. 18, paginas 3931-3935. 2008

    D02

    WO 2005/102396 A2 03.11.2005

    D03

    DAOU T. J. et al. Langmuir. Vol. 25, paginas 3040-3044. 27.01.2009

    D04

    SARAVANAKUMAR G. et al. Journal of Biomedical Nanotechnology. Vol. 5, No 1, paginas 20-35. 02.2009

    D05

    WO 2008115854 A2 (GOVERNMENT OF THE UNITED) 25.09.2008

25. 2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6n

    La presente invenci6n tiene por objeto una ferritina que comprende al menos un quantum dot y al menos una molecula de un polimero biocompatible siendo dicho polimero polietilenglicol (reivindicaciones de la 1 a la 9). Ademas, el nucleo de la ferritina presenta magnetita ocluyendo 99mTc (reivindicaciones de la 10 a la 12). Tambien tiene por objeto un metodo para la sintesis de laferritina mencionada (reivindicaciones de la 13 a la 19), una composici6n que comprende dicha ferritina (reivindicaci6n 20) yel uso de la misma para preparar un medicamento como agente de contraste enMRI, OI o SPECT y para la diagnosis del cancer (reivindicaciones de la 21 a la 24).

    D01 menciona que las ferritinas nativas estan principalmente compuestas de ferrihidrita ymagnetita, proporcionando una plataforma para la funcionalizaci6n quimica y genetica, y describe una magnetoferritina bioconjugada, una nueva clase de quantum dots (QDs) magneticos, solubles en agua y fluorescentes.

    D02 anticipa nanoestructuras multimodales que incluyen diferentes componentes, como quantum dots y particulas metalicas

    o magneticas, que pueden estar recubiertas por un polimero, las cuales permiten su detecci6n utilizando diferentes tecnicas de imagen como MRI o SPECT.

    D03 expone el recubrimiento de quantum dots con polietilenglicol, que presenta grupos funcionales metoxi y cadenas de diferente longitud, y estudia la imagen de fluorescencia que se origina tras su administraci6n in vivo. El recubrimiento de los quantum dots con las cadenas de polietilenglicol reduce la absorci6n de las nanoparticulas en los 6rganos del sistema reticulo endotelial.

    D04 revisa diferentes agentes que se utilizan en el diagn6stico por imagen los cuales se componen de nanoparticulas multimodales, asi como su uso en el diagn6stico de la aterosclerosis y el cancer. Entre ellos, se emplean las nanoparticulas superparamagneticas a base de 6xido de hierro que habitualmente se recubren con polimeros naturales o sinteticos para favorecer su biocompatibilidad y prolongar su retenci6n intravascular. Tambien se utilizan los quantum dots recubiertos, en ocasiones, de polimeros como el polietilenglicol (PEG) o los quantum dots paramagneticos polietilenglicados.

    D05 anticipa una nanoparticulamultifuncional compuesta por un nucleo metalico, una capa externa biocompatible, que comprende un agente de co ntraste 6ptico, y una biomolecula conjugada con un ligando que se une a u n agente para diagn6stico por imagen, asi como su uso en el diagn6stico del cancer. El nucleo es un 6xido de hierro superparamagnetico, la capa e xterna b iocompatible es si lica, el agente de c ontraste 6ptico es un co mpuesto f luorescente, l a biomolecula conjugada es un anticuerpo y el agente para diagn6stico por imagen es un radiois6topo.

    1. NOVEDAD

    Ninguno de los documentos considerados anticipa una ferritina que comprenda al menos un quantum dot y al menos una molecula de un polimero biocompatible, siendo dicho polimero polietilenglicol, en la que el nucleo de ferritina presente magnetita ocluyendo 99mTc. Por lo tanto, las reivindicaciones de la 1 a la 24 se consideran nuevas.

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    OPINION ESCRITA

    No de solicitud: 200931146
26. 2. ACTIVIDAD INVENTIVA

    REIVINDICACIONES 1-9, 13-16 Y 20-24

    D01 menciona que las ferritinas nativas estan principalmente compuestas de ferrihidrita y magnetita, proporcionando una plataforma para la funcionalizaci6n quimica y genetica, y describe una magnetoferritina bioconjugada, una nueva clase de quantum dots (QDs) magneticos, solubles en agua y fluorescentes. Se trata de nanoparticulas doblemente funcionales, magneticas y fluorescentes, disenadas para di agn6stico por i magen empleando t ecnicas como M RI. C onsiderando e l potencial de la magnetoferritina y de los QDs, se utilizan los residuos de lisina situados en la capa externa de la ferritina para conjugar covalentemente 3 tipos de carboxil quantum dots (QD525, QD655 y QD800) a la magnetoferritina de modo que se obtienen 3 nanoestructuras magneticas con emisi6n de fluorescencia variable. La conjugaci6n se lleva a cabo utilizando 1etil-3-�3-dimetilaminopropil� carbodiimida hidrocloruro lo cual origina la formaci6n de uniones amida. Asi, estas nanoparticulas presentan una parte correspondiente a la magnetoferritina superparamagnetica que puede servir como agente de contraste en MRI y otra parte correspondiente a los QDs que emiten fluorescencia y, por todo ello, tienen aplicaci6n en el campo nanobiomedico.

    La diferencia entre D01, que es el documento mas pr6ximo del estado de la tecnica, y la presente invenci6n es que en dicho documento la magnetoferritina no comprende un polimero biocompatible, en concreto polietilenglicol, unido a la superficie de la misma.

    D02 anticipa nanoestructuras multimodales que incluyen diferentes componentes, como quantum dots y particulas metalicas

    o magneticas, que pueden estar recubiertas por un polimero, las cuales permiten su detecci6n utilizando diferentes tecnicas de imagen como MRI o SPECT. En concreto, la nanoestructura comprende una nanoespecie con una primera funcionalidad detectable �6ptica, magnetica, radioactiva- y una segunda molecula con una segunda funcionalidad detectable, estando la nanoespecie unida a un compuesto biocompatible como polietilenglicol y pudiendo formar parte tambien de la nanoestructura una tercera molecula con una tercera funcionalidad detectable siendo, en cualquier caso, las tres diferentes. La nanoespecie puede ser un quantum dot o una nanoparticula magnetica y la segunda molecula tecnecio, o bien la nanoespecie puede ser una nanoparticula magnetica de 6xido de hierro, la segunda molecula un quantum dot y la tercera molecula 99mTc.

    Para un experto en la materia seria evidente utilizar polimeros biocompatibles como el polietilenglicol (D02) unido a ferritina en una nanoparticula en la que la ferritina tambien esta unida a un quantum dot (D01) siendo, ademas, conocido en el estado de la tecnica el uso del polietilenglicol en la elaboraci6n de nanoestructuras para aumentar el tiempo de vida media en sangre y reducir su eliminaci6n por parte de las celulas del sistema inmune. Por consiguiente, las reivindicaciones 1-9, 13-16 y 20-24 no presentan actividad inventiva.

    REIVINDICACIONES 10-12 Y 17-19

    En lo que se refiere al Tecnecio, si bien el documento D02 menciona que es incorporado a la nanoparticula, no especifica que este ocluido en el interior de la misma, hecho que se considera relevante por tratarse de un emisor gamma pr6ximo a un campo magnetico. Por lo tanto, las reivindicaciones 10-12 y 17-19 presentan actividad inventiva.

    Informe del Estado de la Tecnica Pagina 5/5