ES2368556T3

ES2368556T3 - PROTEIN INVOLVED IN THE RESTORATION OF FERTILITY FROM CITOPLASMA MALE STERILITY AND GEN THAT CODIFIES IT.

Info

Publication number: ES2368556T3
Application number: ES02720587T
Authority: ES
Inventors: Jun Imamura; Hideya Fujimoto; Ritsuko Yanagidate; Nobuya Koizuka; Takako Sakai; Takahiko Hayakawa
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2011-11-18
Anticipated expiration: 2022-04-24

Abstract

ADN aislado que codifica una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en una planta que presenta esterilidad masculina citoplasmática, seleccionado de entre el grupo constituido por: (1) un ADN aislado que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; (2) un ADN aislado que presenta una homología 90% o superior con respecto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; (3) un ADN aislado que presenta una homología de 90% con la secuencia de ADN de SEC ID nº:2.Isolated DNA encoding a protein involved in fertility restoration in a plant that exhibits cytoplasmic male sterility, selected from the group consisting of: (1) an isolated DNA encoding a protein that has the amino acid sequence of SEQ ID NO. : 3; (2) an isolated DNA having a 90% or higher homology with respect to a DNA sequence encoding a protein that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (3) an isolated DNA having a homology of 90% with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2.

Description

Proteína implicada en la restauración de la fertilidad a partir de la esterilidad masculina citoplasmática y gen que la codifica. Protein involved in the restoration of fertility from male cytoplasmic sterility and the gene that encodes it.

Technical field

La presente invención se refiere a un gen implicado en la restauración de la fertilidad en caso de esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, la presente invención se refiere al gen implicado en la reversión de la característica de esterilidad masculina citoplasmática (en adelante, abreviada a veces como emc), que se utiliza para el desarrollo de una variedad de cultivo de un híbrido de primera generación filial (en adelante, abreviado como F1), así como a un vector y a un transformante que contienen dicho gen. The present invention relates to a gene involved in the restoration of fertility in case of cytoplasmic male sterility. More specifically, the present invention relates to the gene involved in the reversal of the cytoplasmic male sterility characteristic (hereinafter, sometimes abbreviated as emc), which is used for the development of a crop variety of a subsidiary first generation hybrid (hereinafter, abbreviated as F1), as well as a vector and a transformant containing said gene.

Prior art

En cuanto a cultivos tales como cultivos de cereales y hortalizas, las variedades F1 se están desarrollando activamente con características tales como: 1) un carácter genético agrícola excelentemente mejorado por heterosis, 2) una calidad homogénea de las cosechas, y 3) protección del derecho de obtentor sobre la base de la segregación de caracteres genéticos en la siguiente generación. De hecho, las variedades F1 de muchos de los principales cultivos se han pasado a utilizar en la práctica. Regarding crops such as cereal and vegetable crops, F1 varieties are actively developing with characteristics such as: 1) an agricultural genetic character greatly improved by heterosis, 2) a homogeneous quality of crops, and 3) protection of the right of breeder based on the segregation of genetic characters in the next generation. In fact, the F1 varieties of many of the main crops have been used in practice.

Un procedimiento para la producción de semillas de una variedad F1 resulta ejemplificado por un sistema de producción de semillas emc/Rf que comprende una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática (emc) y una línea restauradora de la fertilidad (en adelante, abreviada a veces como Rf) en una variedad que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Por ejemplo, el procedimiento ha sido desarrollado para cereales tales como arroz, sorgo y maíz, y para una oleaginosa tal como el girasol. Estos métodos han sido desarrollados utilizando una técnica de reproducción o fusión celular. A process for the production of seeds of a variety F1 is exemplified by an emc / Rf seed production system comprising a line that presents cytoplasmic male sterility (emc) and a fertility restorative line (hereinafter, sometimes abbreviated as Rf) in a variety that presents cytoplasmic male sterility. For example, the procedure has been developed for cereals such as rice, sorghum and corn, and for an oilseed such as sunflower. These methods have been developed using a cell reproduction or fusion technique.

Para las brasicáceas, está muy extendido el sistema de producción de semillas F1 mediante la aplicación de autoincompatibilidad. Sin embargo, para la colza que muestra una autoincompatibilidad inestable, el sistema para la producción de semillas F1 requiere la utilización de la línea emc y la línea Rf. For brasicáceas, the F1 seed production system is widely used through the application of self-incompatibility. However, for rapeseed that shows unstable self-incompatibility, the F1 seed production system requires the use of the emc line and the Rf line.

Por el contrario, en los últimos años se ha llevado a cabo un estudio para la utilización de una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática derivada de rábano Kosena (Kosena emc) y una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática derivada de rábano Ogura (Ogura emc) para la colza. Ambos genes emc están codificados en un genoma de la mitocondria, que es un orgánulo citoplasmático, y sus secuencias de nucleótidos son conocidas. Sin embargo, no se ha llevado a cabo ningún estudio de biología molecular utilizando rábano y, por lo tanto, apenas se conocen los marcadores necesarios para el aislamiento de los genes. En consecuencia, el aislamiento del gen a partir de un núcleo resulta complicado. Por lo tanto, la introducción del gen Rf sólo se ha logrado para la colza mediante la aplicación de cruces intergenéricos o enfoques de fusión celular a una línea de rábano, en la cual se ha restaurado la fertilidad. On the contrary, in recent years a study has been carried out for the use of a cytoplasmic male sterility line derived from Kosena radish (Kosena emc) and a line presenting cytoplasmic male sterility derived from Ogura radish (Ogura emc) for the rapeseed. Both emc genes are encoded in a genome of the mitochondria, which is a cytoplasmic organelle, and their nucleotide sequences are known. However, no molecular biology study using radish has been carried out and, therefore, the markers necessary for gene isolation are hardly known. Consequently, the isolation of the gene from a nucleus is complicated. Therefore, the introduction of the Rf gene has only been achieved for rapeseed through the application of intergeneric crossings or cell fusion approaches to a radish line, in which fertility has been restored.

Además, para el gen Rf, 1 o más genes restauradores están presentes de acuerdo con cada línea emc de diferentes especies de plantas. Para el rábano, la presencia del gen Rf1 y del gen Rf2 es necesaria para la restauración de la fertilidad. Además, es conocido que el gen Rf1 reduce notablemente la acumulación de proteína ORF125 (M. Iwabuchi et al, Plant Mol. Biol., 39: 183-188, 1999) en la mitocondria, conocida como proteína asociada a la emc del rábano (Jpn. J. Breeding 47 (volumen independiente 1): p. 186. 1997 y Jpn. J. Breeding 48 (volumen independiente 1): p. 197. 1998.) In addition, for the Rf gene, 1 or more restorative genes are present according to each emc line of different plant species. For radish, the presence of the Rf1 gene and the Rf2 gene is necessary for the restoration of fertility. Furthermore, it is known that the Rf1 gene significantly reduces the accumulation of ORF125 protein (M. Iwabuchi et al, Plant Mol. Biol., 39: 183-188, 1999) in the mitochondria, known as radish emc-associated protein ( Jpn. J. Breeding 47 (independent volume 1): p. 186. 1997 and Jpn. J. Breeding 48 (independent volume 1): p. 197. 1998.)

En la colza, también se ha puesto de manifiesto por análisis genético que el gen Rf1 de rábano introducido por cruces intergenéricos o fusión celular reduce la acumulación de las proteínas ORF125 u ORF138 (M. Grelon y otros, Mol. Gen. Genet. 243: 540-547), conocidas como proteínas asociadas a la emc, y que la reducción de la acumulación de dichas proteínas ORF125 u ORF138 coincide perfectamente con el fenómeno de la restauración de la fertilidad (N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet. 100: 949-955. 2000). La restauración de la fertilidad de la línea masculina estéril de colza requiere la reducción de la acumulación de las proteínas ORF125 u ORF138. Para ello, el gen Rf1 es un gen importante. In rapeseed, it has also been shown by genetic analysis that the radish Rf1 gene introduced by intergeneric crossings or cell fusion reduces the accumulation of ORF125 or ORF138 proteins (M. Grelon et al., Mol. Gen. Genet. 243: 540-547), known as emc-associated proteins, and that the reduction in the accumulation of said ORF125 or ORF138 proteins coincides perfectly with the phenomenon of fertility restoration (N. Koizuka et al., Theor. Appl. Genet. 100: 949-955. 2000). The restoration of fertility of the male sterile rapeseed line requires the reduction of the accumulation of ORF125 or ORF138 proteins. For this, the Rf1 gene is an important gene.

Sin embargo, en relación con una secuencia de nucleótidos de los genes Rf, sólo se ha identificado y aislado el gen Rf2, que es un gen restaurador de un citoplasma T del maíz emc. Pero no se ha dado a conocer ninguna secuencia de nucleótidos de genes Rf de otras especies vegetales. However, in relation to a nucleotide sequence of the Rf genes, only the Rf2 gene, which is a restorative gene of a T cytoplasm of emc corn, has been identified and isolated. But no nucleotide sequence of Rf genes from other plant species has been disclosed.

Description of the invention

Se ha puesto de manifiesto que la línea restauradora de la colza en la que se ha introducido un gen Rf1 derivado de rábano Ogura por hibridación intergenérica o fusión celular, y la variedad F1 creada mediante la utilización de la línea como línea parental con polen, muestra un contenido más elevado de glucosinolatos (en adelante abreviados como GSL) con respecto al valor habitual, lo que supone un problema práctico. Esto puede ser debido a que el gen derivado de rábano que participa en la biosíntesis de los GSL está presente alrededor del gen Rf1, estableciéndose un estrecho enlace genético y, en consecuencia, el contenido de GSL de la línea restauradora de la colza (línea Rf) aumenta. Es conocido que los GSL están presentes en los desechos de colza y que, cuando se administran a un animal como alimento, afectan a la glándula tiroides. En consecuencia, el contenido de GSL de una semilla de colza en una etapa de reproducción está limitado a 18 µmol/g o menor en Norteamérica y a 20 µmol/g o menor en Europa. It has been shown that the rapeseed restorative line into which an Rf1 gene derived from Ogura radish has been introduced by intergeneral hybridization or cell fusion, and the F1 variety created by using the line as a parental line with pollen, shows a higher content of glucosinolates (hereinafter abbreviated as GSL) with respect to the usual value, which is a practical problem. This may be due to the fact that the radish-derived gene that participates in the biosynthesis of the GSL is present around the Rf1 gene, establishing a narrow genetic link and, consequently, the GSL content of the rapeseed restorative line (Rf line ) increases. It is known that GSLs are present in rapeseed wastes and that, when administered to an animal as food, they affect the thyroid gland. Consequently, the GSL content of a rapeseed seed in a breeding stage is limited to 18 µmol / g or less in North America and 20 µmol / g or less in Europe.

Por otra parte, en los últimos años se ha desarrollado activamente una planta a la que se ha añadido una función tal como tolerancia a herbicidas mediante recombinación génica. Para la creación eficiente de estas plantas, la presencia únicamente de la línea restauradora de la colza producida por reproducción o fusión celular es insuficiente, de manera que se desea el aislamiento del gen Rf, particularmente del gen Rf1 derivado de rábano. On the other hand, in recent years a plant has been actively developed to which a function such as herbicide tolerance by gene recombination has been added. For the efficient creation of these plants, the presence of only the rapeseed restorative line produced by reproduction or cell fusion is insufficient, so that isolation of the Rf gene, particularly of the Rf1 gene derived from radish, is desired.

Por lo tanto, uno de los problemas que pretende resolver la presente invención consiste en aislar genes Rf, particularmente el gen Rf1 derivado de rábano, y determinar su estructura. Otro problema que pretende resolver la presente invención consiste en proporcionar unos medios para establecer la línea restauradora de la colza utilizando el gen Rf aislado. Therefore, one of the problems that the present invention intends to solve is to isolate Rf genes, particularly the Rf1 gene derived from radish, and determine its structure. Another problem that the present invention intends to solve is to provide means for establishing the rapeseed restorative line using the isolated Rf gene.

Como resultado del estudio exhaustivo llevado a cabo a fin de solucionar los problemas anteriores, se ha conseguido la clonación de genes Rf1 derivados de la colza y el rábano, solucionando de este modo dichos problemas. As a result of the exhaustive study carried out in order to solve the above problems, the cloning of Rf1 genes derived from rapeseed and radish has been achieved, thus solving these problems.

Así, la presente invención da a conocer una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC ID nº: 3. Además, se describe una proteína que tiene 14 o más motivos de repetición de pentatricopéptidos (en adelante, abreviado a veces como PPR), en la que un grupo de dichos motivos se divide en 3 o más bloques, presentando cada uno de los bloques individuales, como mínimo, 2 o más motivos PPR, y presentando el bloque del extremo carboxilo (C-terminal) 4 motivos PPR. Thus, the present invention discloses a protein involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility, which has the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3. In addition, a protein having 14 is described. or more repetition motifs of pentatric peptides (hereinafter, sometimes abbreviated as PPR), in which a group of said motifs is divided into 3 or more blocks, each of the individual blocks presenting at least 2 or more PPR motifs. , and presenting the carboxyl end block (C-terminal) 4 PPR motifs.

También se describe: It is also described:

la proteína en la que el número de motivos PPR está comprendido entre 14 y 16; the protein in which the number of PPR motifs is between 14 and 16;

la proteína en la que el grupo de motivos PPR se divide en 3 bloques y cada bloque tiene 5, 7 y 4 motivos PPR empezando desde el extremo amino (N-terminal); the protein in which the group of PPR motifs is divided into 3 blocks and each block has 5, 7 and 4 PPR motifs starting from the amino (N-terminal) end;

la proteína en la que el cuarto aminoácido situado en un segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal) es un aminoácido distinto de serina, treonina y cisteína; the protein in which the fourth amino acid located in a second PPR motif from the amino (N-terminal) end is an amino acid other than serine, threonine and cysteine;

la proteína en la que el cuarto aminoácido situado en un segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal) es cualquiera de entre asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico o histidina; y the protein in which the fourth amino acid located in a second PPR motif from the amino (N-terminal) end is any of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid or histidine; Y

la proteína que tiene además una secuencia de péptido señal para translocar a una mitocondria en el extremo terminal o tiene una secuencia de -LysAspGluLeu-en el extremo carboxilo. the protein that also has a signal peptide sequence to translocate to a mitochondrion at the terminal end or has a sequence of -LysAspGluLeu-at the carboxyl end.

Además, se describe una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, lo que provoca un cambio en la movilidad electroforética de un producto de transcripción después de ponerse en contacto con el producto de transcripción de un gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática. In addition, a protein involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility is described, which causes a change in the electrophoretic mobility of a transcription product after contacting the transcription product of a responsible gene of cytoplasmic male sterility.

Además, se describe una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 26; In addition, a protein involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility is described, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 27; a protein involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 28, y a protein involved in fertility restoration in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 29. a protein involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

Se describe también cualquiera de las siguientes proteínas: Any of the following proteins are also described:

(1) (one): una proteína que presenta una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 17, o una secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de a protein that has a sequence corresponding to amino acids 80 ° to 687 ° of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, a sequence corresponding to amino acids 80 ° to 687 ° of the amino acid sequence SEQ ID NO: 17, or a sequence corresponding to amino acids 82º to 690º of the sequence of

aminoácidos SEC ID nº: 19; o amino acids SEQ ID NO: 19; or

(2) (2): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, la secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 17, o la secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 19, y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. a protein that has an amino acid sequence in which 1 or several amino acids have been removed, added and / or substituted in the sequence corresponding to amino acids 80 ° to 687 ° of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, the sequence corresponding to the amino acids 80º to 687º of the amino acid sequence SEQ ID NO: 17, or the sequence corresponding to amino acids 82º to 690º of the amino acid sequence SEQ ID NO: 19, and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility.

(1) (one): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 17 o SEC ID nº: 19; o a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19; or

(2) (2): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 17, o SEC ID nº: 19, y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. a protein that has an amino acid sequence in which 1 or several amino acids have been removed, added and / or substituted in the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19, and is involved in the restoration of fertility in an individual who presents cytoplasmic male sterility.

Preferentemente, en la presente invención, el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene un gen de esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura o un homólogo de los mismos. Preferably, in the present invention, the individual presenting cytoplasmic male sterility has a cytoplasmic male sterility gene of Kosena radish and / or Ogura radish or a homologue thereof.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un ADN que codifica la proteína según la presente invención, descrita anteriormente. Another aspect of the present invention discloses a DNA encoding the protein according to the present invention, described above.

También se describe: It is also described:

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 22; a DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 22;

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 23; a DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 23;

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 24; y a DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 24; Y

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 25. a DNA that has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 25.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer: Another aspect of the present invention discloses:

(1) (one): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2. También se describe un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18; o a DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 2. A DNA is also described having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18; or

(2) (2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o a DNA having a nucleotide sequence in which 1 or several nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, and is involved in the restoration of fertility in an individual who presents cytoplasmic male sterility; or

(3) (3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, y SEC ID nº: 18 en condiciones estrictas y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. a DNA that hybridizes with a DNA that has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 under strict conditions and is involved in the restoration of fertility in an individual exhibiting sterility cytoplasmic male.

Se describe también cualquiera de los siguientes ADN: Any of the following DNA is also described:

(1) (one): un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o a DNA having a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence corresponding to nucleotides 812 ° to 3002 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15; or

(2) (2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o a DNA having a nucleotide sequence in which 1 or more nucleotides have been removed, added and / or substituted in the sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or a sequence corresponding to nucleotides 812º to 3002º of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15, and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility; or

(3) (3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. a DNA that hybridizes with a DNA that has a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence corresponding to nucleotides 812 ° to 3002 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15 in strict conditions, and is involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility.

(1) (one): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1. También se describe un ADN que presenta a DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. A DNA is also described that has

una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o a nucleotide sequence SEQ ID NO: 15; or

(2) (2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o a DNA that has a nucleotide sequence in which 1 or several nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 15, and is involved in the restoration of the fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility; or

(3) (3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. a DNA that hybridizes with a DNA that has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 15 under strict conditions, and is involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer: Preferentemente, en la presente invención, el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene un gen de esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura o un homólogo de los mismos. Another aspect of the present invention discloses: Preferably, in the present invention, the individual presenting cytoplasmic male sterility has a Kosena radish and / or Ogura radish male sterility gene or a homologue thereof.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un vector que contiene ADN según la presente invención. Another aspect of the present invention discloses a vector containing DNA according to the present invention.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un transformante que presenta ADN según la presente invención o un vector según la presente invención. Preferentemente, dicho transformante es una planta transformada. Another aspect of the present invention discloses a transformant presenting DNA according to the present invention or a vector according to the present invention. Preferably, said transformant is a transformed plant.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un procedimiento para la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática en el que se utiliza ADN según la presente invención. Another aspect of the present invention discloses a method for the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility in which DNA according to the present invention is used.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un transformante con un gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática, en el que se introduce una longitud parcial o total de ADN según la presente invención con un promotor de tipo inducción a una célula que presenta ADN según la presente invención, de tal modo que el transformante puede regular la expresión del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática. Another aspect of the present invention discloses a transformant with a gene responsible for cytoplasmic male sterility, in which a partial or total length of DNA according to the present invention is introduced with a promoter of induction type to a cell that presents DNA according to the present invention, such that the transformant can regulate the expression of the gene responsible for cytoplasmic male sterility.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un procedimiento para mantener la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática utilizando el transformante descrito anteriormente. Another aspect of the present invention discloses a method for maintaining the cytoplasmic male sterility line using the transformant described above.

Además, se describe un procedimiento para la detección de un gen involucrado en la reversión de la esterilidad masculina citoplásmica, en el que se utiliza un cebador oligonucleótido con entre 15 y 50 unidades libremente diseñado a partir del ADN según la presente invención o una sonda con por lo menos 15 oligonucleótidos que consiste en la totalidad o una parte del ADN anterior según la presente invención, y en el que se confirma que la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada por el cebador o la cantidad de la secuencia de nucleótidos detectada por la sonda en el organismo de muestra de interés es de 1 gen o más en 1 genoma. In addition, a method for the detection of a gene involved in the reversal of cytoplasmic male sterility is described, in which an oligonucleotide primer with between 15 and 50 units freely designed from the DNA according to the present invention or a probe with at least 15 oligonucleotides consisting of all or part of the above DNA according to the present invention, and in which it is confirmed that the amount of the nucleotide sequence amplified by the primer or the amount of the nucleotide sequence detected by the probe in the organism of interest sample is 1 gene or more in 1 genome.

Se describe además un ADN promotor que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 5091º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 1º a 811º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15. A promoter DNA is also described which has a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 5091 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence corresponding to nucleotides 1 ° to 811 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15.

Brief description of the drawings

La figura 1 representa un mapa genético del marcador Rf. Figure 1 represents a genetic map of the Rf marker.

La figura 2 representa una vista esquemática de la estructura de un clon lambda CHI portador de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1. Figure 2 represents a schematic view of the structure of a lambda CHI clone carrying the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.

La figura 3 representa un resultado de la detección de un ADN introducido en un transformante mediante el método PCR: Figure 3 represents a result of the detection of a DNA introduced into a transformant by the PCR method:

Carril 1: vector de control; Carril 2: colza transformada; Carril 3: colza con esterilidad masculina citoplasmática, Lane 1: control vector; Lane 2: transformed rapeseed; Lane 3: Rape with cytoplasmic male sterility,

a: 3186 pb a 3753 pb, longitud: 568 pb, a: 3186 bp to 3753 bp, length: 568 bp,

b: 4869 pb a 5112 pb, longitud: 244 pb, b: 4869 bp to 5112 bp, length: 244 bp,

c: 7766 pb a 8250 pb, longitud: 485 pb. c: 7766 bp to 8250 bp, length: 485 bp.

La figura 4 representa el resultado del análisis transferencia Western de la reducción de la acumulación de ORF125, que es una proteína emc, en el transformante: Figure 4 represents the result of the Western blot analysis of the reduction of the accumulation of ORF125, which is an emc protein, in the transformant:

Carril 1: colza con esterilidad masculina citoplasmática -1-15 µg; Lane 1: rape with cytoplasmic male sterility -1-15 µg;

Carril 2: colza con fertilidad restaurada 15 µg; Lane 2: rapeseed with restored fertility 15 µg;

Carril 3: colza con esterilidad masculina citoplasmática -2-15 µg; Carriles 4 a 7: colza con esterilidad masculina citoplasmática -2 -, Serie de dilución: 15/2 µg, 15/4 µg, 15/8 µgy 15/16 µg; Lane 3: rape with cytoplasmic male sterility -2-15 µg; Lanes 4 to 7: rape with cytoplasmic male sterility -2 -, Dilution series: 15/2 µg, 15/4 µg, 15/8 µg and 15/16 µg;

Carril 8: colza transformada 15 µg. Lane 8: transformed rape 15 µg.

La figura 5 representa el resultado de la observación microscópica de granos de polen extraídos de una planta florecida de colza transformada. Figure 5 represents the result of microscopic observation of pollen grains extracted from a flowering plant of transformed rapeseed.

La figura 6 representa la secuencia de nucleótidos de pSTV125-5’ #LA6 y pSTV125-5’ #LA12. Figure 6 depicts the nucleotide sequence of pSTV125-5 ’# LA6 and pSTV125-5’ # LA12.

Best way to practice the invention

Las formas de realización de la presente invención se describen con mayor detalle a continuación. The embodiments of the present invention are described in more detail below.

(1) Formas de realización de la proteína según la presente invención (1) Embodiments of the protein according to the present invention

La proteína según la presente invención se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3. The protein according to the present invention refers to a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

En la presente memoria, el motivo PPR es el motivo “repetición de pentatricopéptidos”. Dicho motivo PPR es una estructura de una nueva proteína descubierta en el transcurso de un proyecto de genoma de Arabidopsis. El motivo básico de la misma consiste en que una secuencia de 35 aminoácidos degenerados se repite en tándem en una estructura primaria de la proteína. El motivo PPR tiene la secuencia representada por: terminal amino (terminal N)”VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV”-terminal carboxilo (terminal C) como secuencia consenso de aminoácidos. Este motivo es el propuesto por Small y Peeters (referencia: Trends Biochem. Sci. 2000, 25 46-47). En el año de publicación de la referencia, se registraron aproximadamente 200 genes que pueden presentar este motivo en el genoma de Arabidopsis en un banco de genes tal como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html). En la actualidad, la posibilidad de la presencia de esta estructura en una determinada proteína se puede determinar fácilmente mediante un programa alojado en la base de datos Protein Families Database of Alignments and HMNs (en adelante abreviada como Pfam; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml), ubicada en el Sanger Institute del Reino Unido. Here, the PPR motif is the motif "pentatric peptide repeat". Said PPR motif is a structure of a new protein discovered in the course of an Arabidopsis genome project. The basic reason for this is that a sequence of 35 degenerated amino acids is repeated in tandem in a primary structure of the protein. The PPR motif has the sequence represented by: amino terminal (terminal N) "VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV" -terminal carboxyl (terminal C) as the amino acid consensus sequence. This reason is proposed by Small and Peeters (reference: Trends Biochem. Sci. 2000, 25 46-47). In the year of publication of the reference, approximately 200 genes that can present this motif in the Arabidopsis genome were registered in a gene bank such as GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index .html). At present, the possibility of the presence of this structure in a given protein can be easily determined by a program hosted in the Protein Families Database of Alignments and HMNs (hereinafter abbreviated as Pfam; http: //www.sanger .ac.uk / Software / Pfam / search.shtml), located at the Sanger Institute in the United Kingdom.

Hasta ahora, existen los ejemplos siguientes de proteínas con el motivo PPR cuya función se conoce: 1) PET309 de levadura y CYA-5 de Neurospora crassa, que son proteínas que se translocan a la mitocondria, interactúan con el ARNm coxI, que es un gen mitocondrial que regula la expresión de coxI en un estadio de procesamiento posttranscripcional o traducción (Manthey y McEwen, EMBO. J. 1995, 14, 4031, Coffin y otros, Curr Genet 1997, 32, 273-280); y 2) CRP1 de maíz, que es una proteína con motivo PPR que se transloca a la mitocondria y es esencial para la traducción de los genes petA y petD, dos genes de cloroplasto esenciales para una etapa de procesamiento de ARNm de petD (Fisk y otros, EMBO. J., 1999, 18, 2621-2630). En consecuencia, las proteínas que presentan el motivo del PPR pueden contribuir muy probablemente de algún modo a la regulación de la traducción. So far, there are the following examples of proteins with the PPR motive whose function is known: 1) PET309 of yeast and CYA-5 of Neurospora crassa, which are proteins that are translocated to the mitochondria, interact with the coxI mRNA, which is a mitochondrial gene that regulates coxI expression in a posttranscriptional processing or translation stage (Manthey and McEwen, EMBO. J. 1995, 14, 4031, Coffin et al., Curr Genet 1997, 32, 273-280); and 2) corn CRP1, which is a protein with PPR motif that translocates to the mitochondria and is essential for the translation of the petA and petD genes, two chloroplast genes essential for a processing stage of petD mRNA (Fisk and others, EMBO J., 1999, 18, 2621-2630). Consequently, the proteins that present the reason for PPR may most likely contribute in some way to the regulation of translation.

En el contexto de la presente invención, se ha aislado un gen involucrado en la restauración de la fertilidad de un individuo de rábano Kosena que presenta esterilidad masculina citoplasmática y han descubierto que la proteína codificada por el mismo tiene 14 o más motivos de repeticiones de pentatricopéptidos (en adelante, abreviados como PPR), el grupo de motivos PPR se divide en 3 o más bloques, presentando cada uno de los bloques individuales, como mínimo, 2 o más motivos PPR, y presentando el bloque situado en la posición más cercana al extremo carboxilo (C-terminal) 4 motivos PPR. In the context of the present invention, a gene involved in the restoration of the fertility of an individual of Kosena radish that has cytoplasmic male sterility has been isolated and they have discovered that the protein encoded by it has 14 or more motifs of pentatric peptide repeats. (hereinafter, abbreviated as PPR), the group of PPR motifs is divided into 3 or more blocks, each of the individual blocks presenting at least 2 or more PPR motifs, and presenting the block located in the position closest to the carboxyl end (C-terminal) 4 PPR motifs.

La proteína mencionada anteriormente involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática es preferentemente una en la que el número de motivos PPR esta comprendido entre 14 y 16, y más preferentemente en la que el grupo de motivos PPR se divide en 3 bloques y cada bloque tiene 5, 7 y 4 motivos PPR empezando desde un extremo amino (N-terminal). The aforementioned protein involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility is preferably one in which the number of PPR motifs is between 14 and 16, and more preferably in which the PPR motif group is divided in 3 blocks and each block has 5, 7 and 4 PPR motifs starting from an amino (N-terminal) end.

Específicamente, la proteína comprende: Specifically, the protein comprises:

(1) (one): Complejo PPR nº 1: complejo PPR en el que los motivos PPR primero a quinto desde el extremo N-terminal comprenden 175 residuos consecutivos; PPR complex No. 1: PPR complex in which the first to fifth PPR motifs from the N-terminal end comprise 175 consecutive residues;

(2) (2): Complejo PPR nº 2: complejo PPR en el que los motivos PPR sexto a 12º del extremo N-terminal comprenden 245 residuos consecutivos; PPR complex No. 2: PPR complex in which the sixth to 12th PPR motifs of the N-terminal end comprise 245 consecutive residues;

(3) (3): Complejo PPR nº 3: complejo PPR en el que los motivos PPR 13º a 16º del extremo N-terminal comprenden 140 residuos consecutivos; PPR complex No. 3: PPR complex in which the 13th to 16th PPR motifs of the N-terminal end comprise 140 consecutive residues;

Más preferentemente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR del extremo amino (Nterminal), es un aminoácido distinto de serina, treonina o cisteína. Más preferentemente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal), es cualquiera de entre asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico o histidina. De forma particularmente preferente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal), es asparagina. More preferably, the fourth amino acid, which is present in the second PPR motif of the amino (Nterminal) terminus, is an amino acid other than serine, threonine or cysteine. More preferably, the fourth amino acid, which is present in the second PPR motif from the amino (N-terminal) end, is any of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid or histidine. Particularly preferably, the fourth amino acid, which is present in the second PPR motif from the amino (N-terminal) end, is asparagine.

Es conocido que, normalmente, el gen restaurador de la fertilidad está presente en un genoma nuclear y el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática está presente en la mitocondria. En consecuencia, la proteína anterior involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene además una secuencia de péptido señal para la translocación a la mitocondria en el extremo amino o tiene una secuencia Lys-Asp-Glu-Leu en el extremo carboxilo. It is known that, normally, the fertility restorative gene is present in a nuclear genome and the gene responsible for cytoplasmic male sterility is present in the mitochondria. Consequently, the above protein involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility also has a signal peptide sequence for translocation to the mitochondrion at the amino terminus or has a Lys-Asp-Glu-Leu sequence in the carboxyl end

Entre los ejemplos de secuencia de péptido señal en el extremo N para la translocación a la mitocondria se encuentran las confirmadas por un programa de predicción “TargetP” (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) o el programa de predicción “Psort” (http://psort.nibb.ac.jp/) basado en un algoritmo de O. Emanuelsson (J. Mol. Biol. 300, 1005-1016, 2000). Entre los ejemplos del péptido señal se encuentra el péptido señal (MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProArgGluSerAspHisGluArgAs p) del gen AtOXA1 de Arabidopsis thaliana (W. Sakamoto y otros, Plant Cell Physiol., 41: 1157-1163.) Entre estos péptidos, un ejemplo de secuencia de aminoácidos preferente es la secuencia representada por los aminoácidos 1º a 79º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, y de forma particularmente preferente la secuencia correspondiente a los aminoácidos 1º a 34º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3. Examples of signal peptide sequence at the N-terminus for translocation to the mitochondria are those confirmed by a prediction program "TargetP" (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) or the “Psort” prediction program (http://psort.nibb.ac.jp/) based on an O. Emanuelsson algorithm (J. Mol. Biol. 300, 1005-1016, 2000). Examples of the signal peptide include the signal peptide (MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProlergGluSerAspHisGluArgAs p) of the gene AtOXA1, 11 amino acid. Preferred is the sequence represented by amino acids 1 to 79 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, and particularly preferably the sequence corresponding to amino acids 1 to 34 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.

La proteína según la presente invención, que está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, está enlazada al producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática con el fin de provocar una inhibición de la traducción de dicho gen, alcanzándose la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. The protein according to the present invention, which is involved in the restoration of fertility in an individual exhibiting cytoplasmic male sterility, is linked to the transcription product of the gene responsible for cytoplasmic male sterility in order to cause an inhibition of the translation of said gene, achieving the restoration of fertility in the individual who presents cytoplasmic male sterility.

Entre los ejemplos del producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática se encuentra el producto de transcripción (ARNm) de cada gen de orf125, que es una proteína que causa esterilidad masculina citoplasmática en rábano Kosena, u orf138, que es la proteína que causa esterilidad masculina citoplasmática en rábano Ogura. Entre los ejemplos preferidos se encuentra la región 5’-UTR (Bonhomme y otros; Mol. Gen. Genet., 235: 340-348, 1992) del gen. Examples of the transcription product of the gene responsible for cytoplasmic male sterility are the transcription product (mRNA) of each orf125 gene, which is a protein that causes cytoplasmic male sterility in Kosena radish, or orf138, which is the protein which causes cytoplasmic male sterility in Ogura radish. Among the preferred examples is the 5’-UTR region (Bonhomme et al .; Mol. Gen. Genet., 235: 340-348, 1992) of the gene.

Entre los ejemplos de los procedimientos empleados para confirmar el enlazamiento con el producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática se encuentra un procedimiento en el que se añade la proteína según la presente invención al ARNm de ORF125 u ORF138, que se transcribió artificialmente in vitro, seguido de electroforesis en el llamado método de cambio en la movilidad electroforética. En la práctica, la operación se puede llevar a cabo en las condiciones aplicadas comúnmente en el método de cambio en la movilidad electroforética. Among the examples of the procedures used to confirm the binding with the transcription product of the gene responsible for cytoplasmic male sterility is a procedure in which the protein according to the present invention is added to the mRNA of ORF125 or ORF138, which was artificially transcribed in vitro, followed by electrophoresis in the so-called method of change in electrophoretic mobility. In practice, the operation can be carried out under the conditions commonly applied in the method of change in electrophoretic mobility.

Otro método consiste en que un gen fusionado de ORF125 u ORF138 y un gen reportero detectable, tal como ßgalactosidasa o luciferasa, se expresan en Escherichia coli o similar, se añade la proteína según la presente invención y se observa la presencia o ausencia de inhibición de la expresión. Another method is that a fused ORF125 or ORF138 gene and a detectable reporter gene, such as ßgalactosidase or luciferase, are expressed in Escherichia coli or the like, protein is added according to the present invention and the presence or absence of inhibition of The expression.

Específicamente, el gen restaurador de la fertilidad que presenta la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº: 2 se integra en un vector para la expresión en una Escherichia coli, y un vector en el que la región 5’-UTR y una región de codificación de 25 aminoácidos de orf125 están fusionados al gen lacZ se integran en la Escherichia coli. Estos vectores se someten a expresión de inducción, la expresión del gen lacZ se suprime sólo cuando el vector de expresión en el que se ha integrado el gen restaurador de la fertilidad integrada está presente, y como consecuencia las colonias azules de Escherichia coli se vuelven blancas en presencia de X-Gal. Tal como se ha descrito anteriormente, se puede confirmar que, mediante la utilización de un gen que codifica la proteína según la presente solicitud y llevando a cabo la confirmación mencionada anteriormente, la proteína según la presente invención tiene una función de restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, provocando la inhibición de la traducción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática. Specifically, the fertility-restoring gene presenting the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is integrated into a vector for expression in an Escherichia coli, and a vector in which the 5'-UTR region and a coding region of 25 amino acids of orf125 are fused to the lacZ gene are integrated into the Escherichia coli. These vectors undergo induction expression, lacZ gene expression is suppressed only when the expression vector in which the integrated fertility restorative gene has been integrated is present, and as a consequence the blue colonies of Escherichia coli turn white in the presence of X-Gal. As described above, it can be confirmed that, by using a gene encoding the protein according to the present application and carrying out the confirmation mentioned above, the protein according to the present invention has a fertility restoration function in the individual presenting cytoplasmic male sterility, causing the inhibition of the translation of the gene responsible for cytoplasmic male sterility.

También se describe el hecho de que los ejemplos de las proteínas implicadas en la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática incluyen proteínas con una secuencia de aminoácidos que presenta una homología del 70% o superior, preferentemente del 80% o superior, más preferentemente del 90% The fact that examples of the proteins involved in the restoration of fertility in the individual presenting cytoplasmic male sterility are also described include proteins with an amino acid sequence having a homology of 70% or higher, preferably 80% or higher. , more preferably 90%

: o superior, y todavía más preferentemente 92% o superior, todavía más preferentemente 95% o superior, particularmente del 97% o superior, con respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 26 a 29, que es la secuencia de consenso. La secuencia de consenso se ejemplifica con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 26, preferentemente con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 27 o 28, y de forma particularmente preferente con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 29. or higher, and still more preferably 92% or higher, still more preferably 95% or higher, particularly 97% or higher, with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 26 to 29, which is the consensus sequence. The consensus sequence is exemplified with the amino acid sequence SEQ ID NO: 26, preferably with the amino acid sequence SEQ ID NO: 27 or 28, and particularly preferably with the amino acid sequence SEQ ID NO: 29.

Otros ejemplos descritos de las proteínas mencionadas anteriormente incluyen: Other described examples of the proteins mentioned above include:

(1) (one): una proteína que presenta una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de a protein that has a sequence corresponding to amino acids 80 ° to 687 ° of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, a sequence corresponding to amino acids 80 ° to 687 ° of the sequence of

aminoácidos SEC ID nº: 17, o la secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 19; o amino acids SEQ ID NO: 17, or the sequence corresponding to amino acids 82 ° to 690 ° of the amino acid sequence SEQ ID NO: 19; or

Un ejemplo de la proteína que presenta una secuencia para la translocación a la mitocondria es: An example of the protein that has a sequence for mitochondrial translocation is:

(1) (one): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3. a protein that has an amino acid sequence SEQ ID NO: 3.

La proteína según la presente invención es la proteína que puede estar involucrada en la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, cuando la planta transformante (línea Rf) en la que se ha introducido el ADN que codifica la proteína según la presente invención se cruza con un individuo de la línea de esterilidad masculina citoplasmática (línea emc), se pueden obtener semillas F1 en las que se ha restaurado la fertilidad. Entre los ejemplos preferidos del anterior individuo de la línea emc se encuentra la planta en la que se ha introducido el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura. The protein according to the present invention is the protein that may be involved in the restoration of fertility in the individual presenting cytoplasmic male sterility. More specifically, when the transforming plant (Rf line) into which the DNA encoding the protein according to the present invention has been introduced is crossed with an individual of the cytoplasmic male sterility line (emc line), F1 seeds can be obtained in those that have restored fertility. Among the preferred examples of the previous individual of the emc line is the plant in which the gene responsible for the cytoplasmic male sterility of Kosena radish and / or Ogura radish has been introduced.

La proteína según la presente invención se puede aislar por cribado mediante el método de cambio en la movilidad electroforética tal como se ha descrito anteriormente, y se puede aislar o sintetizar utilizando ADN según la presente invención, que se describe más adelante. El procedimiento para la obtención de la proteína según la presente invención se describe a continuación. The protein according to the present invention can be isolated by screening by the method of change in electrophoretic mobility as described above, and can be isolated or synthesized using DNA according to the present invention, which is described below. The process for obtaining the protein according to the present invention is described below.

(2) (2): Formas de realización de ADN según la presente invención Embodiments of DNA according to the present invention

El ADN según la presente invención se refiere a ADN de: The DNA according to the present invention refers to DNA of:

(i) (i): ADN que codifica la proteína según la presente invención descrito anteriormente; o (v) (1) ADN que tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1. Se describe además un DNA encoding the protein according to the present invention described above; or (v) (1) DNA having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. A further described

(ii) (ii): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos cualquiera de entre SEC ID nº: 22 a SEC ID nº: 25; DNA having a nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 25;

(iii) ADN de entre cualquiera de los siguientes; (iii) DNA from any of the following;

(1) (one): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18; o DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18; or

(2) (2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o DNA presenting a nucleotide sequence in which 1 or more nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility; or

(iv) (iv): ADN de cualquiera de entre los siguientes: DNA from any of the following:

(1) (one): ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o DNA having a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence corresponding to nucleotides 812 ° to 3002 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15; or

(2) (2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o DNA having a nucleotide sequence in which 1 or several nucleotides have been removed, added and / or substituted in the sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or a sequence corresponding to nucleotides 812º to 3002º of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15, and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility; or

(3) (3): ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. DNA that hybridizes with a DNA that has a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 8553 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence corresponding to nucleotides 812 ° to 3002 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15 under conditions strict, and is involved in the restoration of fertility in an individual who presents cytoplasmic male sterility.

(v) (v): ADN de entre cualquiera de los siguientes; DNA from any of the following;

(1) (one): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o DNA presenting a nucleotide sequence SEQ ID NO: 15; or

(2) (2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o DNA that has a nucleotide sequence in which 1 or more nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 15, and is involved in fertility restoration in an individual who presents cytoplasmic male sterility; or

(3) (3): ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. DNA that hybridizes with a DNA that has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 15 under strict conditions, and is involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility.

En la presente memoria, el ADN según la presente invención también se puede designar gen según la presente invención. Here, the DNA according to the present invention can also be designated a gene according to the present invention.

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es una secuencia genómica de nucleótidos de ADN de 8553 nucleótidos, la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2 es una secuencia de codificación obtenida a partir de SEC ID nº: 1, y la secuencia SEC ID nº: 3 es una secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2. The nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 is a genomic sequence of DNA nucleotides of 8553 nucleotides, the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 is a coding sequence obtained from SEQ ID NO: 1, and the sequence SEQ ID #: 3 is an amino acid sequence that is encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 es una secuencia genómica de nucleótidos de ADN de 3306 bases, la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16 es una secuencia de codificación obtenida a partir de SEC ID nº: 15 y la secuencia SEC ID nº: 17 es una secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16. The nucleotide sequence SEQ ID NO: 15 is a genomic sequence of 3306 base DNA nucleotides, the nucleotide sequence SEQ ID NO: 16 is an encoding sequence obtained from SEQ ID NO: 15 and the sequence SEQ ID NO. : 17 is an amino acid sequence that is encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 16.

La expresión “la secuencia de nucleótidos en la que 1 o diversos nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido” en la presente memoria se refiere a la secuencia de nucleótidos en la que cierto número de nucleótidos, por ejemplo entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 15, más preferentemente entre 1 y 10, y aún más preferentemente entre 1 y 5, se han eliminado, añadido y/o sustituido. The expression "the nucleotide sequence in which 1 or several nucleotides have been removed, added and / or substituted" herein refers to the nucleotide sequence in which a certain number of nucleotides, for example between 1 and 20, preferably between 1 and 15, more preferably between 1 and 10, and even more preferably between 1 and 5, have been removed, added and / or substituted.

La expresión “la secuencia de aminoácidos en la que 1 o diversos aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido” en la presente memoria se refiere a la secuencia de aminoácidos en la que cierto número de aminoácidos, por ejemplo entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 15, más preferentemente entre 1 y 10, y aún más preferentemente entre 1 y 5, se han eliminado, añadido y/o sustituido. The expression "the amino acid sequence in which 1 or several amino acids have been removed, added and / or substituted" herein refers to the amino acid sequence in which a certain number of amino acids, for example between 1 and 20, preferably between 1 and 15, more preferably between 1 and 10, and even more preferably between 1 and 5, have been removed, added and / or substituted.

La expresión “ADN que se hibrida en condiciones estrictas” se refiere a la secuencia de nucleótidos de ADN que se obtiene utilizando el ADN como una sonda por el método de hibridación de colonias, el método de hibridación de placa o el método de hibridación de transferencia Southern. Un ejemplo de un ADN de este tipo es aquel que se puede identificar mediante la utilización de un filtro preparado mediante la fijación de ADN o un fragmento de ADN derivados de una colonia o una placa y mediante la realización de una hibridación a 65ºC en presencia de NaCl 0,7 a 1,0 M, seguido por el lavado del filtro utilizando solución 0,1 a 2 x SSC (1 x SSC está compuesta por cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM) a 65ºC. The term "DNA that hybridizes under strict conditions" refers to the nucleotide sequence of DNA that is obtained using DNA as a probe by the colony hybridization method, the plate hybridization method or the transfer hybridization method. Southern An example of such a DNA is one that can be identified by the use of a filter prepared by fixing DNA or a DNA fragment derived from a colony or a plate and by performing a hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, followed by washing the filter using 0.1 to 2 x SSC solution (1 x SSC is composed of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) at 65 ° C.

La hibridación se puede llevar a cabo según el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en adelante abreviado como “Molecular Cloning 2ª ed”). Hybridization can be carried out according to the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd ed.").

Un ejemplo del ADN que se hibrida en condiciones estrictas es el ADN que tiene un cierto grado, o superior, de homología con la secuencia de nucleótidos del ADN utilizado como sonda. La expresión “un cierto grado, o superior, de homología” utilizada en el presente documento es, por ejemplo, el 70% o superior, preferentemente el 80% o superior, más preferentemente el 90% o superior, aún más preferentemente el 93% o superior, de forma particularmente preferentemente el 95% o superior y todavía más preferentemente 97% o superior. El ADN que tiene un cierto grado o superior de homología utilizado en el presente documento incluye un polinucleótido que muestra una homología tal como se ha descrito anteriormente y un polinucleótido con una hebra complementaria del mismo. An example of DNA that hybridizes under strict conditions is DNA that has a certain degree, or higher, of homology to the nucleotide sequence of the DNA used as a probe. The expression "a certain degree, or higher, of homology" used herein is, for example, 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, even more preferably 93% or higher, particularly preferably 95% or higher and still more preferably 97% or higher. DNA that has a certain degree or higher of homology used herein includes a polynucleotide that shows a homology as described above and a polynucleotide with a complementary strand thereof.

El ADN según la presente invención es ADN que puede participar en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, cuando la planta transformante (línea Rf) en la que se ha introducido el ADN según la presente invención se cruza con un individuo de la línea de esterilidad masculina citoplasmática (línea emc), se pueden obtener semillas F1 en las que se ha restaurado la fertilidad. Entre los ejemplos preferidos de la línea emc mencionada anteriormente se encuentran un individuo en el que se ha introducido el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o de rábano Ogura. The DNA according to the present invention is DNA that can participate in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility. More specifically, when the transforming plant (Rf line) into which the DNA according to the present invention has been introduced crosses an individual of the cytoplasmic male sterility line (emc line), F1 seeds can be obtained in which it has been Restored fertility. Among the preferred examples of the emc line mentioned above are an individual in which the gene responsible for the cytoplasmic male sterility of Kosena radish and / or Ogura radish has been introduced.

(3) Método de obtención de ADN según la presente invención (3) Method of obtaining DNA according to the present invention

El procedimiento para obtener ADN según la presente invención no está particularmente limitado. Sobre la base de la información de las secuencias de nucleótidos SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, dadas a conocer en la presente memoria, y de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 o el motivo PPR obtenido sobre la base de la información de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 y la secuencia de aminoácidos obtenida mediante la combinación de una secuencia de tránsito mitocondrial, se puede aislar o sintetizar ADN según la presente invención mediante la aplicación de una técnica común de reproducción y una técnica común de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia. The process for obtaining DNA according to the present invention is not particularly limited. Based on the information of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, disclosed herein, and the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 or the PPR motif obtained on the basis From the amino acid sequence information SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence obtained by combining a mitochondrial transit sequence, DNA according to the present invention can be isolated or synthesized by applying a common reproduction technique and a Common genetic engineering technique known to those skilled in the art.

Concretamente, se puede obtener ADN según la presente invención de un origen vegetal apropiado en el que se expresa el gen según la presente invención, en concreto una planta Raphanus que incluye una variedad y una especie relacionada de rábano, u otras plantas en las que se introduce el ADN genómico que contiene el gen restaurador a partir de estas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular, más concretamente, plantas Raphanus tales como rábano Kosena, rábano Ogura, rábano Yuanhong o variedades derivadas de los mismos y especies relacionadas con dichas variedades de rábano o plantas Brassica en las que se introduce el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática de estas especies de plantas y variedades a partir de estas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular. El gen según la presente invención se puede aislar y obtener, por ejemplo, aislando marcadores de ADN que se sitúan alrededor de un gen Rf, preparando un mapa genómico que indica la relación entre las distancias genéticas de estos marcadores de ADN y el gen Rf y aplicando el método de clonación posicional (también llamado rastreo cromosómico) de una región Rf a la vez que se empieza por el mapa genómico. Specifically, DNA according to the present invention can be obtained from an appropriate plant origin in which the gene according to the present invention is expressed, in particular a Raphanus plant that includes a variety and a related species of radish, or other plants in which introduces the genomic DNA that contains the restorative gene from these plants by means of cell crossing or fusion techniques, more specifically, Raphanus plants such as Kosena radish, Ogura radish, Yuanhong radish or varieties derived therefrom and species related to said varieties of Radish or Brassica plants in which the genomic DNA containing the restorative gene of cytoplasmic male sterility of these species of plants and varieties from these plants is introduced by cross-linking or cell fusion techniques. The gene according to the present invention can be isolated and obtained, for example, by isolating DNA markers that are located around an Rf gene, preparing a genomic map indicating the relationship between the genetic distances of these DNA markers and the Rf gene and applying the method of positional cloning (also called chromosomal tracing) of an Rf region while starting with the genomic map.

Esta técnica se inicia encontrando un marcador de ADN apropiado en un ADN genómico y preparando el mapa genómico mediante la medición de la distancia genética del gen Rf y los marcadores de ADN. Para los marcadores de ADN, que por lo general tienen unos 100 pb de longitud, el genoma derivado de un padre se deben distinguir del genoma derivado de una madre. El marcador de ADN debe localizar un cromosoma igual que el del gen y los marcadores cuyo modo de herencia es casi igual al del gen debido a una pequeña distancia con respecto al mismo, es decir, resulta más deseable un marcador con una relación genética muy estrecha. This technique begins by finding an appropriate DNA marker in a genomic DNA and preparing the genomic map by measuring the genetic distance of the Rf gene and the DNA markers. For DNA markers, which are usually about 100 bp in length, the genome derived from a father must be distinguished from the genome derived from a mother. The DNA marker must locate a chromosome just like that of the gene and the markers whose inheritance mode is almost equal to that of the gene due to a small distance from it, that is, a marker with a very close genetic relationship is more desirable. .

Como método para aislar el marcador de ADN, hasta el momento se ha utilizado frecuentemente el método RFLP. Sin embargo, recientemente se han utilizado métodos simples y ventajosos, tales como el método RAPD y el método AFLP (polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados), que utilizan PCR (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, nº 21: 4407-4414). Particularmente, el método AFLP es un medio eficaz para la obtención del marcador que presenta una relación genética estrecha. Como material para la medición de la distancia genética con respecto al marcador, habitualmente se utiliza una población F2 obtenida por autopolinización de una generación F1 producida por cruce de un individuo homocigótico recesivo que no presenta el gen Rf1 con un individuo homocigótico dominante que presenta genes Rf1 homocigóticos, y una población BC1 obtenida por cruce de la generación F1 con la planta homocigótica recesiva, que es la progenitora de la misma, que carece del gen de interés. As a method to isolate the DNA marker, so far the RFLP method has been used frequently. However, recently, simple and advantageous methods have been used, such as the RAPD method and the AFLP method (amplified fragment length polymorphism), which use PCR (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21: 4407- 4414). Particularly, the AFLP method is an effective means for obtaining the marker that has a close genetic relationship. As a material for measuring the genetic distance with respect to the marker, a population F2 obtained by self-pollination of an F1 generation produced by crossing a homozygous recessive individual that does not present the Rf1 gene with a dominant homozygous individual presenting Rf1 genes is usually used homozygous, and a BC1 population obtained by crossing the F1 generation with the homozygous recessive plant, which is the parent of it, which lacks the gene of interest.

Como individuo homocigótico recesivo descrito anteriormente, se pueden utilizar plantas de Raphanus que incluyen la variedad y la especie relacionada con el rábano de la línea de esterilidad masculina citoplasmática, más concretamente rábano Kosena y rábano Ogura de la línea de esterilidad masculina citoplasmática, o plantas Brassica en las que se ha introducido la esterilidad masculina citoplasmática derivada del rábano Kosena (Kosena emc) y la esterilidad masculina citoplasmática derivada del rábano Ogura (Ogura emc), y más concretamente se puede utilizar colza emc. As the homozygous recessive individual described above, Raphanus plants can be used that include the variety and species related to the radish of the cytoplasmic male sterility line, more specifically Kosena radish and Ogura radish of the cytoplasmic male sterility line, or Brassica plants in which the cytoplasmic male sterility derived from the Kosena radish (Kosena emc) and the cytoplasmic male sterility derived from the Ogura radish (Ogura emc) have been introduced, and more specifically can be used rape emc.

Como planta homocigótica dominante descrita anteriormente, se pueden utilizar plantas Raphanus que incluyen la variedad y la especie relacionada de rábano de la línea Rf, más concretamente plantas Brassica en las que se ha introducido mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática de las plantas Raphanus, incluidos el rábano Kosena, el rábano Ogura, el rábano Yuanhong o variedades y especies relacionadas de estas variedades de rábano, que son la línea de esterilidad masculina citoplasmática, y más específicamente se puede utilizar colza Rf. As the dominant homozygous plant described above, Raphanus plants that include the variety and related radish species of the Rf line can be used, more specifically Brassica plants in which genomic DNA containing the genomic DNA has been introduced by cross-linking or cell fusion techniques. cytoplasmic male fertility restorative gene of Raphanus plants, including Kosena radish, Ogura radish, Yuanhong radish or related varieties and species of these radish varieties, which are the cytoplasmic male sterility line, and more specifically can be used rape Rf.

Para el análisis de la población F2 obtenida por autopolinización de la generación F1 obtenida mediante el cruce de estos progenitores y la población BC1 obtenida mediante el cruce de la generación F1 con la planta homocigótica recesiva, habitualmente se utilizan deseablemente 100 individuos o más, y más preferentemente 1.000 individuos o más. El número de individuos utilizados es el mayor posible para aumentar la exactitud del mapa genómico y reducir la distancia física del marcador de ADN con respecto a un gen de interés. De modo parecido, en el gen Rf se puede obtener el marcador de ADN que tiene una distancia física más corta. For the analysis of the F2 population obtained by self-pollination of the F1 generation obtained by crossing these parents and the BC1 population obtained by crossing the F1 generation with the recessive homozygous plant, 100 or more individuals are usually desirably used, and more preferably 1,000 or more individuals. The number of individuals used is as large as possible to increase the accuracy of the genomic map and reduce the physical distance of the DNA marker from a gene of interest. Similarly, in the Rf gene, the DNA marker having a shorter physical distance can be obtained.

Como material para la medición de la distancia genética del marcador de ADN con respecto al gen Rf, por ejemplo, se puede utilizar una población F2 de unos miles de individuos que se obtiene mediante la autopolinización de la generación F1 de rábano producida mediante el cruce de rábano Kosena (Raphanus sativus cv. Kosena) de la línea emc con rábano Yuanhong (Raphanus sativus cv. Yuanhong) de la línea Rf según el método descrito en N. Koizuka y otros (Teor. Appl. Genet. 100: 949-955, 2000). El análisis de estas poblaciones permite el aislamiento de los marcadores de ADN con un enlace en una forma que intercala el gen Rf y situados en una posición con una distancia de alrededor de 0,2 cM desde ambos lados. Mediante este paso se puede preparar el mapa genómico, tal como se muestra en la figura 1, que muestra la distancia genética del marcador con respecto al gen Rf. As a material for measuring the genetic distance of the DNA marker with respect to the Rf gene, for example, an F2 population of a few thousand individuals can be used that is obtained by the self-pollination of the F1 generation of radish produced by crossing Kosena radish (Raphanus sativus cv. Kosena) of the emc line with Yuanhong radish (Raphanus sativus cv. Yuanhong) of the Rf line according to the method described in N. Koizuka and others (Teor. Appl. Genet. 100: 949-955, 2000). The analysis of these populations allows the isolation of DNA markers with a link in a way that intercalates the Rf gene and located in a position with a distance of about 0.2 cM from both sides. Through this step the genomic map can be prepared, as shown in Figure 1, which shows the genetic distance of the marker with respect to the Rf gene.

Después de la preparación del mapa genómico, el ADN genómico que corresponde a su posición se debe clonar para combinar entre los marcadores de ADN que intercalan el gen objetivo. Normalmente, la distancia física entre los marcadores de ADN y el gen objetivo es grande y, por lo tanto, la combinación de una serie de clones que presentan fragmentos de ADN genómico permite cubrir una región que abarca desde el marcador de ADN hasta el gen objetivo. Un paso para combinar estos marcadores de ADN mediante la utilización del clon que presenta fragmentos de ADN genómico es la preparación de un cóntigo. Para el gen Rf, el cóntigo se puede preparar de modo similar mediante la combinación de estos marcadores de ADN, que se encuentran en la posición más cercana al gen Rf, utilizando una serie de clones con fragmentos de ADN genómico, de tal modo que se cubre la región del gen Rf. After the preparation of the genomic map, the genomic DNA that corresponds to its position must be cloned to combine between the DNA markers that interleave the target gene. Normally, the physical distance between the DNA markers and the target gene is large and, therefore, the combination of a series of clones presenting genomic DNA fragments allows to cover a region that ranges from the DNA marker to the target gene . One step to combine these DNA markers through the use of the clone that presents genomic DNA fragments is the preparation of a partner. For the Rf gene, the partner can be similarly prepared by combining these DNA markers, which are located in the position closest to the Rf gene, using a series of clones with genomic DNA fragments, such that covers the region of the Rf gene.

Se puede obtener una colección de clones con fragmentos de ADN genómico mediante la preparación de una biblioteca genómica. Normalmente, se utilizan diferentes tipos de vectores según la longitud del ADN genómico que se puede clonar. Los ejemplos incluyen los construidos utilizando un vector fago lambda, que puede clonar un fragmento con una longitud de hasta 20 kb, un vector cósmido, que puede clonar un fragmento con una longitud relativamente grande (hasta 40 kb), un vector BAC (cromosoma artificial bacteriano), que puede clonar un fragmento con una longitud más grande (100 kb o más). A collection of clones with genomic DNA fragments can be obtained by preparing a genomic library. Normally, different types of vectors are used depending on the length of the genomic DNA that can be cloned. Examples include those constructed using a lambda phage vector, which can clone a fragment with a length of up to 20 kb, a cosmid vector, which can clone a fragment with a relatively large length (up to 40 kb), a BAC vector (artificial chromosome bacterial), which can clone a fragment with a larger length (100 kb or more).

En cualquier biblioteca, es importante que el valor obtenido multiplicando un número de poblaciones de la biblioteca por una longitud promedio del fragmento clonado dé un valor correspondiente a de 4 a 5 veces la longitud completa (tamaño genómico) del genoma suministrado a la biblioteca. El tamaño genómico del rábano puede ser de aproximadamente 500 Mbp y, por lo tanto, en caso de utilizar el vector fago lambda con una longitud promedio de 20 kb, el número de la población se vuelve entre 1,0 x 105 y 1,25 x 105 y, en caso de utilizar la biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb, el número de la población se vuelve entre 5,0 x 104 y 6,25 x 104. Se cree que el tamaño genómico de la colza es de aproximadamente 1.000 Mbp y, por lo tanto, en caso de utilizar el vector fago lambda con una longitud promedio de 20 kb, el número de la población se vuelve entre 2,0 x 105 y 2,5 x 105 y, en caso de utilizar la biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb, el número de la población se vuelve entre 1,0 x 105 y 1,25 x 105. In any library, it is important that the value obtained by multiplying a number of populations in the library by an average length of the cloned fragment gives a value corresponding to 4 to 5 times the full length (genomic size) of the genome supplied to the library. The horseradish genomic size can be approximately 500 Mbp and, therefore, in case of using the lambda phage vector with an average length of 20 kb, the population number becomes between 1.0 x 105 and 1.25 x 105 and, if using the cosmid library with an average length of 40 kb, the population number becomes between 5.0 x 104 and 6.25 x 104. It is believed that the rape's genomic size is of approximately 1,000 Mbp and, therefore, in case of using the lambda phage vector with an average length of 20 kb, the population number becomes between 2.0 x 105 and 2.5 x 105 and, in case of use the cosmid library with an average length of 40 kb, the population number becomes between 1.0 x 105 and 1.25 x 105.

Para el ADN genómico suministrado a la biblioteca, el ADN genómico se puede extraer de un organismo vivo que contiene el gen objetivo mediante un método convencional. Para el gen Rf, se puede utilizar la planta Raphanus, incluyendo la variedad y la especie relacionada con el rábano de la línea Rf, más concretamente plantas Brassica en las que se ha introducido por técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática de las plantas Raphanus, incluyendo rábano Kosena, rábano Ogura, rábano Yuanhong o variedades y especies relacionadas con estas variedades de rábano, que son la línea de esterilidad masculina citoplasmática, más específicamente, la colza Rf. En general, puede resultar más preferente extraer el ADN genómico de la misma planta de línea Rf que la planta progenitora utilizada para la preparación de la población F2 y la población BC1 a fin de preparar la biblioteca genómica. El ADN genómico se puede preparar de acuerdo con un método convencional, tal como el método CTAB (Murray, M. G. y Thompson, W.F. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4321). For genomic DNA supplied to the library, genomic DNA can be extracted from a living organism that contains the target gene by a conventional method. For the Rf gene, the Raphanus plant can be used, including the radish-related variety and species of the Rf line, more specifically Brassica plants in which genomic DNA containing the genomic DNA has been introduced by cross-linking or cell fusion techniques. Restorative gene of cytoplasmic male fertility of Raphanus plants, including Kosena radish, Ogura radish, Yuanhong radish or varieties and species related to these radish varieties, which are the cytoplasmic male sterility line, more specifically, Rf rape. In general, it may be more preferred to extract the genomic DNA from the same Rf line plant as the parent plant used for the preparation of the F2 population and the BC1 population in order to prepare the genomic library. Genomic DNA can be prepared according to a conventional method, such as the CTAB method (Murray, M. G. and Thompson, W.F. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4321).

Para la preparación del cóntigo, primero se aísla el clon que tiene el marcador de ADN situado a ambos lados del gen Rf. El aislamiento se lleva a cabo a partir de la biblioteca genómica por el procedimiento convencional que utiliza un método de hibridación en placa para una biblioteca de fagos lambda y un método de hibridación de colonias para una biblioteca de cósmidos y una biblioteca de BAC. A continuación, utilizando una región terminal del clon aislado como un índice, se prepara un cóntigo aislando el clon situado en una posición adyacente al clon. Después de la preparación, la secuencia de nucleótidos del cóntigo se determina mediante el método convencional. For the preparation of the contigo, the clone with the DNA marker located on both sides of the Rf gene is first isolated. Isolation is carried out from the genomic library by the conventional procedure that uses a plaque hybridization method for a lambda phage library and a colony hybridization method for a cosmid library and a BAC library. Next, using a terminal region of the isolated clone as an index, a partner is prepared by isolating the clone located in a position adjacent to the clone. After preparation, the nucleotide sequence of the partner is determined by the conventional method.

Desde el desarrollo del proyecto del genoma en los últimos años, se ha puesto a punto una técnica para prever la existencia de un gen funcional basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico. Un programa de identificación de genes llamado “Genscan” puede identificar el gen con una considerable probabilidad. Además, un programa de búsqueda de homologías llamado “BLAST” puede identificar la similitud con otros genes y proteínas. Mediante la utilización de estos programas analíticos se lleva a cabo la identificación y el aislamiento del gen objetivo. De modo similar, para el gen Rf se puede aislar e identificar la secuencia de ADN genómico del cóntigo utilizando un software analítico similar. Dicho análisis revela una región promotora en una secuencia de nucleótidos de ADN genómico, una región génica estructural que contiene un intrón y una región de terminación. Además, con respecto al gen estructural que contiene el intrón, se indican claramente el gen en una forma que se traduce en una proteína de la que se ha excluido el intrón y la secuencia de aminoácidos que corresponde al gen. De este modo, se puede identificar el gen Rf en el cóntigo con una probabilidad considerable. Since the development of the genome project in recent years, a technique has been developed to predict the existence of a functional gene based on the nucleotide sequence of genomic DNA. A gene identification program called "Genscan" can identify the gene with considerable probability. In addition, a homology search program called "BLAST" can identify similarity with other genes and proteins. Through the use of these analytical programs, the identification and isolation of the target gene is carried out. Similarly, for the Rf gene, the genomic DNA sequence of the partner can be isolated and identified using similar analytical software. Said analysis reveals a promoter region in a nucleotide sequence of genomic DNA, a structural gene region containing an intron and a termination region. In addition, with respect to the structural gene that contains the intron, the gene is clearly indicated in a form that translates into a protein from which the intron has been excluded and the amino acid sequence corresponding to the gene. In this way, the Rf gene can be identified in the partner with a considerable probability.

Además, sobre la base de la secuencia génica identificada mediante los programas analíticos descritos anteriormente, la forma concreta de expresión in vivo del genoma objetivo se puede confirmar mediante la purificación de un ARNm y el aislamiento del ADN complementario (ADNc) correspondiente. Se confirma convenientemente un sitio de inicio de la transcripción mediante un análisis que aplica el sencillo método de 5’-RACE, que utiliza PCR, y, de forma más fiable, el método de extensión del cebador y el método de mapeo de SI. In addition, based on the gene sequence identified by the analytical programs described above, the specific form of in vivo expression of the target genome can be confirmed by purification of an mRNA and isolation of the corresponding complementary DNA (cDNA). A transcription initiation site is conveniently confirmed by an analysis that applies the simple 5’-RACE method, which uses PCR, and, more reliably, the primer extension method and the SI mapping method.

Los métodos mencionados anteriormente se han descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y similares. The methods mentioned above have been described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 and the like.

Un ejemplo de los genes según la presente invención que se aislaron a partir de la secuencia de nucleótidos identificada por las técnicas descritas anteriormente es el ADN de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16 y SEC ID nº: 18. De este modo, sobre la base de la secuencia de ADN se puede aislar fácilmente el ADNc de otro origen vegetal mediante una técnica de ingeniería genética convencional. An example of the genes according to the present invention that were isolated from the nucleotide sequence identified by the techniques described above is the DNA of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18. Thus On the basis of the DNA sequence, cDNA from another plant origin can easily be isolated by a conventional genetic engineering technique.

En concreto, el ADNc correspondiente al gen según la presente invención se puede obtener a partir del origen vegetal apropiado en el que se expresa el gen según la presente invención, en concreto, la planta Raphanus que incluye la variedad y la especie relacionada con el rábano u otras plantas, en la que se ha introducido a partir de dichas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, y más concretamente las plantas Raphanus como rábano Kosena, rábano Ogura y rábano Yuanhong, o variedades y especies relacionadas de dichas variedades de rábano o plantas del género Brassica, en las que se ha introducido mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática, mediante la preparación de una biblioteca de ADNc según el método convencional y la selección de un clon adecuado de la biblioteca utilizando el fragmento adecuado de ADN específico para el gen según la presente invención como sonda, o utilizando un anticuerpo contra un producto de traducción del gen según la presente invención. In particular, the cDNA corresponding to the gene according to the present invention can be obtained from the appropriate plant origin in which the gene according to the present invention is expressed, in particular, the Raphanus plant that includes the variety and the species related to radish or other plants, in which genomic DNA containing the cytoplasmic male sterility restorative gene has been introduced from said plants by cell crossing or fusion techniques, and more specifically Raphanus plants such as Kosena radish, Ogura radish and radish Yuanhong, or related varieties and species of said varieties of radish or plants of the Brassica genus, in which genomic DNA containing the cytoplasmic male fertility restorative gene has been introduced by means of crossover or cell fusion, by preparing a cDNA library according to the conventional method and the selection of a suitable clone from the uti library using the appropriate DNA fragment specific for the gene according to the present invention as a probe, or using an antibody against a gene translation product according to the present invention.

En el procedimiento descrito anteriormente, algunos ejemplos del origen del ADNc son varias células y tejidos que expresan el gen según la presente invención y una célula cultivada derivada de los mismos. La separación del ARN total, la separación y purificación del ARNm y la obtención y clonación del ADNc a partir de estas células y tejidos se puede llevar a cabo según el método convencional. In the procedure described above, some examples of the origin of the cDNA are several cells and tissues that express the gene according to the present invention and a cultured cell derived therefrom. The separation of the total RNA, the separation and purification of the mRNA and the obtaining and cloning of the cDNA from these cells and tissues can be carried out according to the conventional method.

El método para la detección del gen según la presente invención a partir de la biblioteca de ADNc no está particularmente limitado y puede seguir el método convencional. The method for detecting the gene according to the present invention from the cDNA library is not particularly limited and can follow the conventional method.

Como sonda utilizada en la presente invención, se puede utilizar de forma general el ADN sintetizado químicamente a partir de la información sobre la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención, y se pueden utilizar preferentemente el gen según la presente invención y el fragmento del mismo ya obtenido. Además, también se pueden utilizar como sonda para detección un cebador sentido y un cebador antisentido diseñados a partir de la información de la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención. As a probe used in the present invention, chemically synthesized DNA from the information on the nucleotide sequence of the gene according to the present invention can be used in general, and the gene according to the present invention and the fragment of the gene can preferably be used same already obtained. In addition, a sense primer and an antisense primer designed from the nucleotide sequence information of the gene according to the present invention can also be used as a probe for detection.

Una secuencia de nucleótidos del cebador sentido y el cebador antisentido utilizados como sonda es una secuencia de nucleótidos parcial que corresponde al ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, que tiene, como mínimo, de 15 a 50 nucleótidos consecutivos y preferentemente de 20 a 30 nucleótidos consecutivos. Alternativamente, se puede utilizar como sonda un clon positivo que tiene la secuencia tal como se ha descrito anteriormente. A nucleotide sequence of the sense primer and the antisense primer used as a probe is a partial nucleotide sequence corresponding to the DNA encoding the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, which has at least 15 to 50 consecutive nucleotides and preferably 20 to 30 consecutive nucleotides. Alternatively, a positive clone having the sequence as described above can be used as a probe.

La obtención del gen según la presente invención se puede llevar a cabo combinando técnicas convencionales utilizadas para el aislamiento del gen, tales como la técnica de amplificación de ADN y ARN por el método PCR y el método RACE, representado por el método 5’-RACE. Obtaining the gene according to the present invention can be carried out by combining conventional techniques used for gene isolation, such as the DNA and RNA amplification technique by the PCR method and the RACE method, represented by the 5'-RACE method. .

El cebador utilizado para la aplicación del método PCR se puede diseñar adecuadamente basándose en la información de la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención dado a conocer por la presente invención, y se puede sintetizar por el método convencional. El aislamiento y la purificación de los fragmentos de ADN y ARN amplificados se pueden llevar a cabo por el método convencional, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede utilizar electroforesis en gel. The primer used for the application of the PCR method can be suitably designed based on the nucleotide sequence information of the gene according to the present invention disclosed by the present invention, and can be synthesized by the conventional method. Isolation and purification of the amplified DNA and RNA fragments can be carried out by the conventional method, as described above. For example, gel electrophoresis can be used.

En cuanto al gen o los diversos fragmentos de ADN según la presente invención obtenidos mediante los procedimientos descritos anteriormente, la secuencia de nucleótidos de los mismos se puede determinar según el método convencional. As for the gene or the various DNA fragments according to the present invention obtained by the procedures described above, the nucleotide sequence thereof can be determined according to the conventional method.

Utilizando una parte o toda la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención obtenido mediante dicho procedimiento, se puede detectar característicamente la presencia del gen según la presente invención y la aparición de expresión del mismo en un individuo o en diversos tejidos. Using a part or all of the nucleotide sequence of the gene according to the present invention obtained by said method, the presence of the gene according to the present invention and the appearance of expression thereof in an individual or in various tissues can be characteristically detected.

Tal como se ha descrito anteriormente, un ejemplo del gen según la presente invención es un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3, aunque no se limita al mismo. Los homólogos de dicho gen entran dentro del ámbito de la presente invención. As described above, an example of the gene according to the present invention is a DNA encoding an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, although it is not limited thereto. Homologs of said gene fall within the scope of the present invention.

La expresión “los homólogos del gen” se refiere a una serie de genes relacionados que presentan una homología de secuencia con el gen (o un producto génico del mismo) según la presente invención y se reconocen como una familia de genes basándose en la similitud de un rasgo estructural, tal como se ha descrito anteriormente, y de una función biológica del mismo, tal como se ha descrito anteriormente. Se incluye un alelo de dichos genes. The term "gene homologs" refers to a series of related genes that have sequence homology with the gene (or a gene product thereof) according to the present invention and are recognized as a family of genes based on the similarity of a structural feature, as described above, and of a biological function thereof, as described above. An allele of such genes is included.

Por ejemplo, el gen según la presente invención no se limita al gen que presenta la secuencia de nucleótidos específica de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, sino que puede presentar una secuencia de nucleótidos seleccionada combinando opcionalmente un codón correspondiente a un residuo aminoácido individual representado por SEC ID nº: 3. La selección del codón se puede llevar a cabo según el método convencional y, por ejemplo, se puede tener en cuenta la frecuencia de uso de un codón en un huésped. For example, the gene according to the present invention is not limited to the gene that has the specific nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but can present a selected nucleotide sequence by optionally combining a codon corresponding to a Individual amino acid residue represented by SEQ ID NO: 3. Codon selection can be carried out according to the conventional method and, for example, the frequency of use of a codon in a host can be taken into account.

Además, tal como se ha descrito anteriormente, el gen según la presente invención incluye ADN que se hibrida con el ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o con una parte del mismo en condiciones estrictas. Un ADN de este tipo es un ADN que tiene un cierto grado o superior de homología con ADN que tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte del mismo. In addition, as described above, the gene according to the present invention includes DNA that hybridizes with the DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or with a part thereof under strict conditions. Such a DNA is a DNA that has a certain degree or higher of homology with DNA that has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or a part thereof.

Los ADN descritos anteriormente con un cierto grado de homología o superior se refieren a polinucleótidos y polinucleótidos de cadena complementaria de los mismos que presentan, como mínimo, un 70% de grado de homología, preferentemente por lo menos 90% de grado de homología, más preferentemente, como mínimo, un 95% de grado de homología, y todavía más preferentemente por lo menos 97% de grado de homología, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte de los mismos, o la secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 3 o una parte de la misma. The DNAs described above with a certain degree of homology or higher refer to complementary chain polynucleotides and polynucleotides thereof which have at least 70% homology degree, preferably at least 90% homology degree, more preferably, at least 95% homology grade, and even more preferably at least 97% homology grade, with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or a portion thereof, or the nucleotide sequence encoding the amino acid sequences SEQ ID NO: 3 or a part thereof.

Más específicamente, se puede poner como ejemplo el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se hibrida con el ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte de la misma en condiciones estrictas de 0,2 x SSC que contiene un 0,1% de SDS a 50ºC o 1 x SSC que contiene un 0,1% de SDS a 60ºC. More specifically, the DNA having the nucleotide sequence that hybridizes to the DNA having a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or a part thereof under strict conditions of 0 can be set as an example. , 2 x SSC containing 0.1% SDS at 50 ° C or 1 x SSC containing 0.1% SDS at 60 ° C.

Entre los ADN según la presente invención, particularmente los siguientes se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia, tales como síntesis química, técnicas de ingeniería genética y mutagénesis: Among the DNAs according to the present invention, particularly the following can be prepared by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques and mutagenesis:

El ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; DNA that has a nucleotide sequence in which 1 or more nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15, and is involved in fertility restoration in an individual who presents cytoplasmic male sterility;

El ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; y DNA that has a nucleotide sequence in which 1 or more nucleotides have been removed, added and / or substituted in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18, and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility; Y

El ADN que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Por ejemplo, utilizando ADN con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o parte de las mismas se puede obtener un gen mutado, introduciéndose la mutación en dichos ADN. DNA encoding a protein that has an amino acid sequence in which 1 or several amino acids have been removed, added and / or substituted in the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 and is involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility. For example, using DNA with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or part thereof, a mutated gene can be obtained, the mutation being introduced into said DNA.

Como procedimiento para la obtención de un gen mutante, se pueden utilizar los procedimientos conocidos como de mutante aleatorio, mutante con diana, un método que utiliza un gen sintético (Sin Idensi Kougaku Handbook, Zikken Igaku Sppl., Youdosya, 1996). As a procedure for obtaining a mutant gene, methods known as random mutant, target mutant, a method that uses a synthetic gene can be used (Sin Idensi Kougaku Handbook, Zikken Igaku Sppl., Youdosya, 1996).

Específicamente, se pueden utilizar procedimientos que consisten en poner en contacto el ADN con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 ó 2, o parte de las mismas, con un fármaco mutágeno, un procedimiento para irradiar rayos ultravioleta en el ADN, una técnica de ingeniería genética, etc. El procedimiento de mutagénesis dirigida a un sitio, que es una técnica de ingeniería genética, es una técnica útil, ya que puede introducir una mutación específica en un sitio específico y se puede llevar a cabo según el método descrito en Molecular Cloning, 2ª edición. Specifically, methods consisting in contacting the DNA with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or 2, or part thereof, with a mutagenic drug, a method for irradiating ultraviolet rays in the DNA, a technique, can be used of genetic engineering, etc. The site-directed mutagenesis procedure, which is a genetic engineering technique, is a useful technique, since it can introduce a specific mutation at a specific site and can be carried out according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.

(4) Vector que contiene ADN según la presente invención (4) Vector containing DNA according to the present invention

El ADN según la presente invención se puede utilizar como vector recombinante mediante su introducción en un vector apropiado. El tipo de vector puede ser un vector de expresión o un vector de no expresión y se puede seleccionar de acuerdo con los fines. The DNA according to the present invention can be used as a recombinant vector by introduction into an appropriate vector. The type of vector can be an expression vector or a non-expression vector and can be selected according to the purposes.

Un vector de clonación preferido es el que puede presentar replicación autónoma en una cepa K12 de Escherichia coli y se puede utilizar un vector fago o un vector plasmídico. El vector para la expresión en Escherichia coli se puede utilizar como vector de clonación. Específicamente, algunos ejemplos son ZAP Express (Strata Gene, Strategies, 5, 58 (1992),) pBluescrlpt II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), Lambda ZAP II (Strata Gene), λ gt10, λ gt11 (ADN Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49 (1985)), λ TriplEx (Clonetec), λ ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 (Mo1. Gen. Biol., 3, 280 (1983)), pMW218 (Wako Pure Chemicals), pUC118 (Takara), pEG400 (J. Bac., 172, 2392 (1990)), y pQE-30 (QIAGEN). A preferred cloning vector is one that can have autonomous replication in a K12 strain of Escherichia coli and a phage vector or a plasmid vector can be used. The vector for expression in Escherichia coli can be used as a cloning vector. Specifically, some examples are ZAP Express (Strata Gene, Strategies, 5, 58 (1992),) pBluescrlpt II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), Lambda ZAP II (Strata Gene), λ gt10 , λ gt11 (DNA Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49 (1985)), λ TriplEx (Clonetec), λ ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 (Mo1. Gen. Biol., 3, 280 (1983) )), pMW218 (Wako Pure Chemicals), pUC118 (Takara), pEG400 (J. Bac., 172, 2392 (1990)), and pQE-30 (QIAGEN).

El vector de expresión se puede seleccionar teniendo en cuenta la combinación con el huésped, y preferentemente se utiliza un vector capaz de replicación autónoma en la célula huésped o de integración en un cromosoma y que contiene un promotor en una posición que permite la transcripción del gen según la presente invención. The expression vector can be selected taking into account the combination with the host, and preferably a vector capable of autonomous replication in the host cell or integration in a chromosome and containing a promoter in a position that allows gene transcription is used according to the present invention.

Cuando se utiliza una bacteria como célula huésped, resulta preferente que el vector de expresión para la expresión del ADN sea capaz de experimentar replicación autónoma en la célula bacteriana y también que sea un vector recombinante compuesto por el promotor, una secuencia de unión a los ribosomas, el ADN anterior y una secuencia de terminación de transcripción. También puede estar incluido un gen para regular el promotor. When a bacterium is used as the host cell, it is preferred that the expression vector for DNA expression is capable of undergoing autonomous replication in the bacterial cell and also that it is a recombinant vector composed of the promoter, a ribosome binding sequence , the previous DNA and a transcription termination sequence. A gene to regulate the promoter may also be included.

Algunos ejemplos de vectores de expresión para bacterias son pBTrP2, pBTac1, pBTac2 (todos ellos comercializados por Boeringer Manheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 58-110600), pKYP200 (Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), PLSA1 (Agrc. Biol. Chem., 53, 277 (1989) ), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)), pBluescriptII SK+, pBluescriptII SK(-) (Stratagene), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERMBP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US nº 4.686.191, US nº 4.939.094, US nº 5.160.735), pSupex, pUB110, pTP5; pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara), pSTV29 (Takara), pUC118 (Takara), pPA1 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 63-233798), pEG400 (J. Bacteriol., 172, 2392 (1990) ), y pQE-30 (QIAGEN). Algunos ejemplos de promotores para bacterias son promotores derivados de Escherichia coli y fagos, tales como el promotor trp (P trp), el promotor lac (P lac), el promotor PL, el promotor PR y el promotor PSE, así como el promotor SP01, el promotor SP02 y el promotor penP. Some examples of expression vectors for bacteria are pBTrP2, pBTac1, pBTac2 (all of them marketed by Boeringer Manheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (Japanese patent publication open for public inspection 58-110600), pKYP200 (Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), PLSA1 (Agrc. Biol. Chem., 53, 277 (1989 )), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)), pBluescriptII SK +, pBluescriptII SK (-) (Stratagene), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERMBP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US 4,686,191, US 4,939,094, US 5,160,735), pSupex, pUB110, pTP5; pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara), pSTV29 (Takara), pUC118 (Takara), pPA1 (Japanese patent publication open for inspection public 63-233798), pEG400 (J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)), and pQE-30 (QIAGEN). Some examples of promoters for bacteria are promoters derived from Escherichia coli and phages, such as the trp (P trp) promoter, the lac (P lac) promoter, the PL promoter, the PR promoter and the PSE promoter, as well as the SP01 promoter , the SP02 promoter and the penP promoter.

Algunos ejemplos de vector de expresión para levadura son YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19 y pHS15. Algunos ejemplos de promotor para levadura son el promotor PHO5, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, el promotor gal1, el promotor gal10, el promotor de las proteínas de choque térmico y promotores tales como el promotor MF-α1 y el promotor CUP1. Some examples of yeast expression vector are YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19 and pHS15. Some examples of yeast promoter are the PHO5 promoter, the PGK promoter, the GAP promoter, the ADH promoter, the gal1 promoter, the gal10 promoter, the heat shock protein promoter and promoters such as the MF-α1 promoter and the CUP1 promoter.

Algunos ejemplos de vector de expresión para una célula animal son pcDNAI, pcDM8 (comercializados por Funakoshi), pAGE107 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI/AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), y pAGE210. Algunos ejemplos de promotores para célula animal son el gen temprano inmediato (IE o “immediate early”) de citomegalovirus (CMV humano), un promotor temprano de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneínas, un promotor de choque térmico y un promotor SRα. Some examples of expression vector for an animal cell are pcDNAI, pcDM8 (marketed by Funakoshi), pAGE107 (Japanese patent publication open for public inspection 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (publication Japanese patent open for public inspection 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987) ), and pAGE210. Some examples of animal cell promoters are the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (human CMV), an SV40 early promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter and a SRα promoter.

Algunos ejemplos de vector de expresión para una célula vegetal son pIG121-Hm (Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)), pBI121 (EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)), pLAN411 y pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290). Cuando se introduce en una planta un fragmento largo de ADN, de 10 kb o superior, resulta deseable utilizar un vector mejorado a fin de permitir una fijación estable y la introducción de ADN de cadena larga. Por ejemplo, pBIBAC2 (Gene 200 (1997) 107-116), pYLTAC7 (PNAS 96 (1999) 6535-6540) y pBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39). Some examples of expression vector for a plant cell are pIG121-Hm (Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)), pBI121 (EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)), pLAN411 and pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290). When a long DNA fragment of 10 kb or greater is introduced into a plant, it is desirable to use an improved vector in order to allow stable fixation and introduction of long chain DNA. For example, pBIBAC2 (Gene 200 (1997) 107-116), pYLTAC7 (PNAS 96 (1999) 6535-6540) and pBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39).

Un ejemplo de promotor para célula vegetal es el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (Mol. Gen. Genet. (1990) 220, 389-392). A continuación se describe con mayor detalle la transformación de la planta. An example of a plant cell promoter is the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (Mol. Gen. Genet. (1990) 220, 389-392). The transformation of the plant is described in more detail below.

(5) Transformante que presenta ADN según la presente invención (5) Transformant presenting DNA according to the present invention

El transformante que presenta ADN según la presente invención se puede preparar mediante la introducción del vector recombinante mencionado anteriormente (preferentemente el vector de expresión) en un huésped. The DNA presenting transformant according to the present invention can be prepared by introducing the aforementioned recombinant vector (preferably the expression vector) into a host.

Son ejemplos específicos de la célula huésped de bacterias los microorganismos pertenecientes a Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmun, Streptomyces, Synnecoccus y Zymomonas. Un ejemplo del procedimiento para introducir el vector recombinante en el huésped bacteriano es un procedimiento que utiliza un ion de calcio y un método de protoplastos. Specific examples of the bacterial host cell are microorganisms belonging to Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium, Erbacterium, Rhodium, Rhodium , Rhodospirillum, Scenedesmun, Streptomyces, Synnecoccus and Zymomonas. An example of the procedure for introducing the recombinant vector into the bacterial host is a procedure that uses a calcium ion and a protoplast method.

Algunos ejemplos específicos de huésped de levadura son Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans y Schwanniomyces alluvius. Some specific examples of yeast hosts are Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans and Schwanniomyces alluvius.

El procedimiento para introducir el vector recombinante en el huésped de levadura puede ser cualquier método para introducir el ADN en la levadura, y algunos ejemplos son el método de electroporación, el método de esferoplastos y el método de acetato de litio. The method of introducing the recombinant vector into the yeast host can be any method of introducing the DNA into the yeast, and some examples are the electroporation method, the spheroplast method and the lithium acetate method.

Un ejemplo del huésped para la célula animal son las células Namalva, las células COS1, las células COS7 y las células CHO. An example of the host for the animal cell is Namalva cells, COS1 cells, COS7 cells and CHO cells.

Como método para introducir el vector recombinante en la célula animal, se puede utilizar cualquier método capaz de introducir ADN en células animales. Por ejemplo, se pueden utilizar el método de electroporación, el método del fosfato de calcio y el método de lipofección. As a method to introduce the recombinant vector into the animal cell, any method capable of introducing DNA into animal cells can be used. For example, the electroporation method, the calcium phosphate method and the lipofection method can be used.

El transformante que utiliza la célula vegetal se describe más adelante. The transformant used by the plant cell is described below.

(5) Método de obtención de la proteína según la presente invención (5) Method of obtaining the protein according to the present invention

El método para la obtención de la proteína según la presente invención no está particularmente limitado. Sobre la base de la información obtenida mediante la combinación de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, dada a conocer en la presente memoria, o la secuencia de tránsito a las mitocondrias obtenida sobre la base de la información de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, la proteína según la presente invención se puede aislar, expresar o sintetizar mediante la aplicación de la técnica general de ingeniería genética conocida por los expertos en la materia. The method for obtaining the protein according to the present invention is not particularly limited. Based on the information obtained by combining the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, disclosed herein, or the sequence of mitochondrial transit obtained based on the information of the amino acid sequence SEC ID No: 3, the protein according to the present invention can be isolated, expressed or synthesized by the application of the general genetic engineering technique known to those skilled in the art.

Por ejemplo, la proteína según la presente invención se puede expresar mediante el aislamiento o la síntesis de ADN que codifica una proteína según la presente invención e introduciéndola en la célula. For example, the protein according to the present invention can be expressed by isolation or synthesis of DNA encoding a protein according to the present invention and introducing it into the cell.

La proteína según la presente invención se puede obtener, por ejemplo, mediante el cultivo de un transformante que presenta un gen según la presente invención, la producción y acumulación de la proteína según la presente invención en dicho cultivo y la recolección de la proteína del mismo. The protein according to the present invention can be obtained, for example, by the cultivation of a transformant having a gene according to the present invention, the production and accumulation of the protein according to the present invention in said culture and the collection of the protein thereof. .

El método para el cultivo de un transformante que presenta un gen según la presente invención se puede llevar a cabo según un método convencional utilizado para el cultivo del huésped. The method for the cultivation of a transformant presenting a gene according to the present invention can be carried out according to a conventional method used for the cultivation of the host.

Cuando el transformante según la presente invención es un microorganismo procariota, tal como Escherichia coli,o eucariota, tal como una levadura, un medio de cultivo para el cultivo de estos microorganismos puede ser un medio natural o sintético, siempre que dichos medios de cultivo contengan una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas que puedan ser utilizadas por los microorganismos y siempre que se pueda llevar a cabo un cultivo eficiente del transformante. El cultivo se lleva a cabo preferentemente en condiciones aeróbicas, tal como un cultivo con agitación o un cultivo sumergido aireado y agitado; la temperatura de cultivo está comprendida normalmente entre 15 y 40ºC, y la duración del mismo está comprendida normalmente entre 16 horas y 7 días. Durante el cultivo, el pH se mantiene entre 3,0 y 9,0. El ajuste del pH se lleva a cabo utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amonio o similares. Además, si es necesario, durante el cultivo se puede añadir al medio un antibiótico como la ampicilina o la tetraciclina. When the transformant according to the present invention is a prokaryotic microorganism, such as Escherichia coli, or eukaryotic, such as a yeast, a culture medium for the cultivation of these microorganisms can be a natural or synthetic medium, provided that said culture media contain a source of carbon, a source of nitrogen, inorganic salts that can be used by microorganisms and provided that an efficient culture of the transformant can be carried out. The culture is preferably carried out under aerobic conditions, such as a culture with agitation or a submerged aerated and agitated culture; the culture temperature is normally between 15 and 40 ° C, and the duration thereof is usually between 16 hours and 7 days. During cultivation, the pH is maintained between 3.0 and 9.0. The pH adjustment is carried out using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonium or the like. In addition, if necessary, during the culture an antibiotic such as ampicillin or tetracycline can be added to the medium.

Como medio de cultivo para el cultivo del transformante obtenido utilizando la célula animal como célula huésped, se utiliza medio RPM11640, un medio de uso habitual (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), medio MEM de Eagle (Science, 122, 501 (1952)), medio DMEM (Virology, 8, 396 (1959)), medio 199 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) o el medio preparado mediante la adición de suero bovino fetal a cualquiera de estos medios. Habitualmente, el cultivo se lleva a cabo a un pH comprendido entre 6 y 8, una temperatura comprendida entre 30 y 40ºC y CO2 al 5% de 1 a 7 días. Además, si es necesario durante el cultivo, se puede añadir un antibiótico como la kanamicina o la penicilina al medio de cultivo. As the culture medium for the culture of the transformant obtained using the animal cell as the host cell, RPM11640 medium, a medium of usual use (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle MEM medium ( Science, 122, 501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), medium 199 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) or the medium prepared by the addition of fetal bovine serum to any of these media. Usually, the culture is carried out at a pH between 6 and 8, a temperature between 30 and 40 ° C and 5% CO2 for 1 to 7 days. In addition, if necessary during culture, an antibiotic such as kanamycin or penicillin can be added to the culture medium.

Como medio de cultivo para el transformante obtenido utilizando la célula vegetal como célula huésped, se utiliza cualquier medio tal como medio MS, medio R2P y otros, que son comúnmente utilizados junto con especies vegetales. El cultivo se lleva a cabo durante de 1 a 21 días a un pH comprendido entre 6 y 8 y una temperatura comprendida entre 15 y 35ºC. Si es necesario durante el cultivo, se puede añadir un antibiótico, como la kanamicina As a culture medium for the transformant obtained using the plant cell as the host cell, any medium such as MS medium, R2P medium and others, which are commonly used together with plant species, is used. The culture is carried out for 1 to 21 days at a pH between 6 and 8 and a temperature between 15 and 35 ° C. If necessary during culture, an antibiotic, such as kanamycin, can be added

o la higromicina, al medio de cultivo. or hygromycin, to the culture medium.

Con el fin de aislar y purificar la proteína según la presente invención, que está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática a partir de un producto de cultivo del transformante, se pueden utilizar métodos habituales de aislamiento y purificación. In order to isolate and purify the protein according to the present invention, which is involved in the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility from a culture product of the transformant, usual methods of isolation and purification can be used .

Por ejemplo, cuando la proteína según la presente invención se expresa intracelularmente en estado de disolución, tras la finalización del cultivo, las células se recogen por centrifugación, se suspenden en una solución tampón acuosa y, a continuación, se rompen mediante un equipo de ultrasonidos, un equipo de émbolo, un homogeneizador Manton Gaulin o un triturador Dyno Mill a fin de obtener una solución de extracto sin células. A partir del sobrenadante obtenido por centrifugación de la solución de extracto sin células, se puede obtener un producto de muestra purificado utilizando un método convencional de aislamiento y purificación de proteínas, tal como un método de extracción por disolvente, un método de precipitación por adición de sal utilizando sulfato de amonio y similares, un método de desalinización, un método de precipitación utilizando un disolvente orgánico, un método de cromatografía por intercambio aniónico utilizando una resina como dietilaminoetilo (DEAE) Sepharose o DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corp), un método de cromatografía por intercambio catiónico utilizando S-Sepharosa FF (Pharmacia), un método de cromatografía hidrofóbica utilizando una resina como Butyl Sepharose o Phenyl Sepharose, un método de filtración en gel con utilización de un tamiz molecular, un método de cromatografía de afinidad, un método de cromatofocalización y un método de electroforesis, tal como isoelectroenfoque, de forma independiente o en combinación. For example, when the protein according to the present invention is expressed intracellularly in a state of dissolution, after the end of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution and then broken down by ultrasound equipment. , a plunger equipment, a Manton Gaulin homogenizer or a Dyno Mill crusher in order to obtain an extract solution without cells. From the supernatant obtained by centrifuging the extract solution without cells, a purified sample product can be obtained using a conventional method of protein isolation and purification, such as a solvent extraction method, a precipitation method by the addition of salt using ammonium sulfate and the like, a desalination method, a precipitation method using an organic solvent, an anion exchange chromatography method using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose or DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corp), a cation exchange chromatography method using S-Sepharosa FF (Pharmacia), a hydrophobic chromatography method using a resin such as Butyl Sepharose or Phenyl Sepharose, a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity chromatography method, a chromato-focusing method and an electro method foresis, such as isoelectric focusing, independently or in combination.

Cuando la proteína se expresa intracelularmente formando una materia insoluble, la misma se recoge a partir de una fracción del precipitado que se obtiene mediante la recolección, destrucción y centrifugación de las células de manera similar por un método convencional. A continuación, la materia insoluble de la proteína se solubiliza mediante un agente de desnaturalización de proteínas. Una solución de la proteína disuelta se diluye o se dializa con una solución que carece del agente de desnaturalización de proteínas o lo contiene en una concentración tan baja que la desnaturalización de las proteínas no se produce, con el fin de construir una estructura normal estereoscópica de la proteína. A continuación, se puede obtener un producto de muestra purificado mediante los mismos métodos de aislamiento y purificación descritos anteriormente. When the protein is expressed intracellularly forming an insoluble matter, it is collected from a fraction of the precipitate that is obtained by collecting, destroying and centrifuging the cells in a similar manner by a conventional method. Next, the insoluble matter of the protein is solubilized by a protein denaturation agent. A solution of the dissolved protein is diluted or dialyzed with a solution that lacks the protein denaturation agent or contains it in such a low concentration that protein denaturation does not occur, in order to build a normal stereoscopic structure of the protein. Next, a purified sample product can be obtained by the same isolation and purification methods described above.

Cuando la proteína según la presente invención o un derivado de la misma, tal como la molécula modificada con azúcar, se secreta extracelularmente, la proteína o derivado, tal como la molécula con adición de una cadena de azúcar, se puede recoger en el sobrenadante del cultivo. La fracción solubilizada se obtiene por tratamiento del producto de cultivo por medio de técnicas tales como centrifugación, tal como se ha descrito anteriormente, y el producto de muestra purificado se puede obtener a partir de la fracción disuelta mediante los métodos de aislamiento y purificación descritos anteriormente. When the protein according to the present invention or a derivative thereof, such as the sugar modified molecule, is secreted extracellularly, the protein or derivative, such as the molecule with the addition of a sugar chain, can be collected in the supernatant of the culture. The solubilized fraction is obtained by treating the culture product by means of techniques such as centrifugation, as described above, and the purified sample product can be obtained from the dissolved fraction by the isolation and purification methods described above. .

La proteína según la presente invención también se puede preparar por un método de síntesis química, tal como el método Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) o el método t-Boc (t-butiloxicarbonilo). Además, la síntesis se puede realizar utilizando un sintetizador de péptidos disponible en el mercado a través de Souwa Boueki (Advanced Chem Tech, USA), Perkin Elmer Japan (Perkin Elmer, USA), Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech), Aroca (Protein Technology Instrument, USA), Kurabou (Synthecell-Vega, USA), Japan PerSeptive Ltd. (PerSeptive, USA) y Shimadzu Corporation. The protein according to the present invention can also be prepared by a chemical synthesis method, such as the Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) method or the t-Boc (t-butyloxycarbonyl) method. In addition, the synthesis can be performed using a commercially available peptide synthesizer through Souwa Boueki (Advanced Chem Tech, USA), Perkin Elmer Japan (Perkin Elmer, USA), Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech), Aroca ( Protein Technology Instrument, USA), Kurabou (Synthecell-Vega, USA), Japan PerSeptive Ltd. (PerSeptive, USA) and Shimadzu Corporation.

(7) Transformante de la planta que presenta ADN según la presente invención (7) Plant transformant presenting DNA according to the present invention

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es la secuencia de nucleótidos en una forma en la que la secuencia de nucleótidos del genoma original de la planta se ha extraído. Dicha secuencia de nucleótidos contiene un promotor y un terminador necesarios para la expresión de genes en una forma operativa. En cuanto al vector que se debe introducir, la clonación del gen se puede realizar en un vector de clonación convencional, tal como el cósmido pWE15 (STRATAGANE), mediante un método de introducción directa. Cuando se utiliza Agrobacterium, la clonación se puede realizar en un vector de transformación de plantas convencional, tal como el vector pB1121 (Clontech). The nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence in a form in which the nucleotide sequence of the original plant genome has been extracted. Said nucleotide sequence contains a promoter and terminator necessary for the expression of genes in an operative manner. As for the vector to be introduced, the cloning of the gene can be performed in a conventional cloning vector, such as the cosmid pWE15 (STRATAGANE), by a direct introduction method. When Agrobacterium is used, cloning can be performed in a conventional plant transformation vector, such as vector pB1121 (Clontech).

Se pueden introducir en la célula vegetal el ADN de la secuencia de nucleótidos de la que se han extraído parte de los intrones de esta secuencia (genómica), el ADN de la secuencia de nucleótidos de la que se han extraído casi todos los intrones, el ADN de la SEC ID nº: 2 o de los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma. The DNA of the nucleotide sequence from which part of the introns of this sequence (genomic), the DNA of the nucleotide sequence from which almost all introns have been extracted, can be introduced into the plant cell DNA of SEQ ID NO: 2 or of nucleotides 238 ° to 2064 ° thereof, or the DNA encoding a protein of SEQ ID NO: 3 or a region corresponding to residues 80 ° to 687 ° thereof.

El ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 5091º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es el promotor que tiene la capacidad de transcribir un ARNm en una antera y se utiliza preferentemente para la reversión de la esterilidad masculina. DNA that has a sequence corresponding to nucleotides 3754 ° to 5091 ° of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 is the promoter that has the ability to transcribe an mRNA into an anther and is preferably used for the reversal of male sterility.

Además, las regiones promotora y terminadora se pueden reemplazar por un promotor y un terminador que funcionen en una célula vegetal conocida. In addition, the promoter and terminator regions can be replaced by a promoter and terminator that function in a known plant cell.

Cuando se introduce en la célula vegetal el ADN anterior de SEC ID nº: 2 o los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma, el promotor y el terminador son necesarios además de dicho ADN. Un ejemplo de vector de expresión de uso común es el pB1121 (Clonetech). En dicho vector, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza como promotor y el terminador de la enzima nopalina sintasa, que está presente en el plásmido Ti de A. tumefaciens, se utiliza como terminador. Como promotor necesario para la expresión, no sólo se puede utilizar el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor descrito anteriormente, sino también el promotor rbcS ampliamente presente en las plantas. Más preferentemente, se utilizan un promotor tal como TA29, que se expresa en el período de desarrollo del polen, y más preferentemente promotores auténticos situados más arriba de los genes. Como terminador, no sólo se puede utilizar el terminador de la enzima nopalina sintasa descrito anteriormente, sino también el terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor. Más preferentemente, se utiliza un terminador auténtico situado más abajo del gen. When the previous DNA of SEQ ID NO: 2 or nucleotides 238 ° to 2064 ° thereof, or the DNA encoding a protein of SEQ ID NO: 3 or a region corresponding to residues 80 ° to 687 ° of is introduced into the plant cell it, the promoter and the terminator are necessary in addition to said DNA. An example of a commonly used expression vector is pB1121 (Clonetech). In said vector, the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus is used as a promoter and the terminator of the nopaline synthase enzyme, which is present in the Ti plasmid of A. tumefaciens, is used as a terminator. As a promoter necessary for expression, not only can the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus described above be used, but also the rbcS promoter widely present in plants. More preferably, a promoter such as TA29 is used, which is expressed in the pollen development period, and more preferably authentic promoters located above the genes. As the terminator, not only can the nopaline synthase enzyme terminator described above be used, but also the 35S terminator of the cauliflower mosaic virus. More preferably, an authentic terminator located below the gene is used.

Cuando el ADN anterior de SEC ID nº: 2 o los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma se utilizan a fin de restaurar la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, es necesaria además de estas secuencias una secuencia de tránsito mitocondrial. When the previous DNA of SEQ ID NO: 2 or nucleotides 238 ° to 2064 ° thereof, or the DNA encoding a protein of SEQ ID NO: 3 or a region corresponding to residues 80 ° to 687 ° thereof are used for of restoring fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility, a mitochondrial transit sequence is necessary in addition to these sequences.

Como secuencia de tránsito mitocondrial, se utiliza un ADN correspondiente a los nucleótidos 1º a 237º de la SEC ID nº: 2 o un ADN que codifica los aminoácidos 1º a 79º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3. As a mitochondrial transit sequence, a DNA corresponding to nucleotides 1 to 237 of SEQ ID NO: 2 or a DNA encoding amino acids 1 to 79 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 is used.

En los siguientes ejemplos, se han preparado los vectores para la transformación de plantas a fin de introducir el ADN (SEC ID nº: 1) del gen Rf que contiene intrones contenidos en regiones desde el promotor auténtico presente en el genoma hasta el terminador y la planta en una forma auténtica. Tras la escisión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 del clon que compone una parte del cóntigo por una enzima de restricción, la secuencia se subclonó en un vector de clonación apropiado. A continuación, el fragmento subclonado se introdujo en los vectores pKM424 y pBIGRZ2 para la transformación de la planta a fin de obtener el vector que puede introducir el fragmento en la planta. Este vector se introdujo en Agrobacterium para la transformación de la planta. Mediante la infección de la planta con Agrobacterium que contiene dicho vector, el fragmento de ADN se integra en el genoma de la planta. In the following examples, the vectors for plant transformation have been prepared to introduce the DNA (SEQ ID NO: 1) of the Rf gene containing introns contained in regions from the authentic promoter present in the genome to the terminator and Plant in an authentic way. After cleavage of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 of the clone that composes a part of the condom by a restriction enzyme, the sequence is subcloned into an appropriate cloning vector. Next, the subcloned fragment was introduced into vectors pKM424 and pBIGRZ2 for plant transformation in order to obtain the vector that can introduce the fragment into the plant. This vector was introduced in Agrobacterium for plant transformation. By infecting the plant with Agrobacterium containing said vector, the DNA fragment is integrated into the genome of the plant.

Algunos ejemplos de plantas a las que se puede aplicar el gen según la presente invención son oleaginosas tales como colza, girasol, soja y palma, cereales tales como arroz, maíz y trigo, plantas de floración tales como el tabaco y la petunia, y diversas hortalizas tales como tomate, brócoli, col, col china y zanahoria. Some examples of plants to which the gene according to the present invention can be applied are oilseeds such as rapeseed, sunflower, soy and palm, cereals such as rice, corn and wheat, flowering plants such as tobacco and petunia, and various Vegetables such as tomato, broccoli, cabbage, Chinese cabbage and carrot.

Entre las mismas, resultan preferentes las plantas Brassica, tales como la colza, la col, la col china y el brócoli, y el tomate. La colza, la col, la col china y el brócoli son particularmente preferentes, y la colza es la más preferente. Among them, Brassica plants, such as rapeseed, cabbage, Chinese cabbage and broccoli, and tomatoes are preferred. Rapeseed, cabbage, Chinese cabbage and broccoli are particularly preferred, and rapeseed is the most preferred.

En la presente memoria, algunos ejemplos de fuente de la planta para transformación son una semilla, un germen, un brote, un callo, una célula cultivada y un cuerpo de planta. Por ejemplo, el germen o un protoplasto en el caso de la colza; la plántula, el callo o la célula cultivada en el caso de la soja; la plántula en el caso del girasol; el callo o la célula cultivada en el caso de la palma; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso del arroz; la plántula, el brote, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso del maíz; la plántula, el callo o la célula cultivada en el caso del trigo; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso de la col y el brócoli; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso de la zanahoria. Las partes preferentes se seleccionan adecuadamente en función de la planta, tal como acostumbran a hacer los expertos en la materia. Here, some examples of plant source for transformation are a seed, a germ, a bud, a callus, a cultured cell and a plant body. For example, the germ or a protoplast in the case of rapeseed; the seedling, callus or cell grown in the case of soybeans; the seedling in the case of sunflower; the callus or the cultured cell in the case of the palm; the seedling, callus, cultured cell or protoplast in the case of rice; the seedling, the bud, the callus, the cultured cell or the protoplast in the case of corn; the seedling, callus or cell grown in the case of wheat; the seedling, the callus, the cultured cell or the protoplast in the case of cabbage and broccoli; the seedling, the callus, the cultured cell or the protoplast in the case of the carrot. Preferred parts are properly selected according to the plant, as those skilled in the art usually do.

La transformación de la planta se puede llevar a cabo por vías convencionales. Por ejemplo, existe el método en el que se introduce el vector en la planta mediante la infección de una célula de la misma con Agrobacterium después de introducir el vector en una célula de Agrobacterium; y el método en el que el vector se introduce directamente en la célula utilizando, por ejemplo, el método de electroporación, el método de DEAE-dextrano, el método del fosfato de calcio, el método del polietilenglicol y el método de la pistola de partículas. The transformation of the plant can be carried out by conventional means. For example, there is a method in which the vector is introduced into the plant by infecting a cell thereof with Agrobacterium after introducing the vector into an Agrobacterium cell; and the method in which the vector is introduced directly into the cell using, for example, the electroporation method, the DEAE-dextran method, the calcium phosphate method, the polyethylene glycol method and the particle gun method .

Por ejemplo, el método preferido para la introducción de un gen en la colza se ejemplifica con el método descrito a continuación. For example, the preferred method for introducing a gene into rapeseed is exemplified by the method described below.

Un hipocótilo de una forma de colza asépticamente germinada en el medio MS que contiene un azúcar, tal como sacarosa, como fuente de carbono, se precultiva en dicho medio MS que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético y sacarosa. La Agrobacterium cultivada en medio YEB se recoge por centrifugación y se suspende de nuevo en el medio MS que contiene sacarosa. El hipocótilo de colza descrito anteriormente se añade a esta suspensión seguido de agitación. A continuación, el hipocótilo extraído se devuelve al medio de precultivo original para el cocultivo durante 3 días, seguido de la transferencia a un medio de selección que contiene hormonas vegetales tales como zeatina y bencilaminopurina, y carbenicilina y kanamicina para la selección. Se obtiene un individuo regenerado mediante el cultivo de los brotes verdes regenerados obtenidos en un medio de cultivo de crecimiento que contiene opcionalmente una hormona vegetal, tal como bencilaminopurina, y a continuación en un medio de cultivo de enraizamiento que contiene opcionalmente hormonas vegetales, tal como ácido naftalenacético y bencilaminopurina. Mediante el cruce de este individuo con el individuo de la línea emc se pueden obtener híbridos F1 en los que se ha restaurado la fertilidad. A hypocotyl of an aseptically germinated rapeseed form in the MS medium containing a sugar, such as sucrose, as a carbon source, is precultured in said MS medium containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and sucrose. Agrobacterium grown in YEB medium is collected by centrifugation and suspended again in the MS medium containing sucrose. The rapeseed hypocotyl described above is added to this suspension followed by stirring. Then, the extracted hypocotyl is returned to the original preculture medium for co-culture for 3 days, followed by transfer to a selection medium containing plant hormones such as zeatin and benzylaminopurine, and carbenicillin and kanamycin for selection. A regenerated individual is obtained by growing the regenerated green shoots obtained in a growth culture medium that optionally contains a plant hormone, such as benzylaminopurine, and then in a rooting culture medium that optionally contains plant hormones, such as acid naphthalenacetic and benzylaminopurine. By crossing this individual with the individual of the emc line, F1 hybrids can be obtained in which fertility has been restored.

La introducción de ADN según la presente invención en la planta se puede permitir la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. The introduction of DNA according to the present invention into the plant can allow the restoration of fertility in an individual who exhibits cytoplasmic male sterility.

Para la planta regenerada descrita anteriormente, la expresión se puede confirmar mediante el cruce con colza de la línea emc y examinando la fertilidad de la descendencia. Cuando la transformación se lleva a cabo utilizando una planta de colza que presenta la característica de emc en forma de material, la fertilidad del polen se puede examinar transfiriendo el transformante (individuo regenerado), que ha producido una raíz de la manera descrita anteriormente, a un suelo que contiene un fertilizante convencional para floración. Este procedimiento resulta preferente teniendo en cuenta la facilidad de manejo y el aspecto temporal. For the regenerated plant described above, the expression can be confirmed by rape crossing the emc line and examining the fertility of the offspring. When the transformation is carried out using a rapeseed plant that has the characteristic of emc in the form of a material, the fertility of the pollen can be examined by transferring the transformant (regenerated individual), which has produced a root in the manner described above, to a soil that contains a conventional fertilizer for flowering. This procedure is preferred considering the ease of handling and the temporal aspect.

En el transformante anterior, cuando la transformación se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente utilizando la célula o el tejido, preferentemente el hipocótilo, un cotiledón, una hoja, el polen, la célula cultivada, el callo y el protoplasto de la planta de colza que presenta esterilidad masculina citoplasmática como fuente de células, la planta en la que se ha restaurado la fertilidad del polen se puede obtener mediante la transferencia de la planta (individuo regenerado) producida por el método anterior a una tierra que contiene el fertilizante convencional para floración. In the above transformant, when the transformation is carried out as described above using the cell or tissue, preferably the hypocotyl, a cotyledon, a leaf, the pollen, the cultured cell, the callus and the protoplast of the plant of rapeseed that has cytoplasmic male sterility as a source of cells, the plant in which pollen fertility has been restored can be obtained by transferring the plant (regenerated individual) produced by the previous method to a soil that contains the conventional fertilizer for flowering

El cuerpo de la planta en cuyo núcleo se ha integrado el ADN se puede obtener mediante la introducción del ADN según la presente invención en la célula emc por el método de introducción de genes descrito anteriormente utilizando la célula emc, seleccionando la célula en cuyo núcleo está integrado el ADN utilizando como índice un marcador de selección de tolerancia frente a un antibiótico, tal como kanamicina, o de tolerancia a un herbicida, y cultivando a continuación la célula en el medio de cultivo de crecimiento o el medio de cultivo de enraizamiento, tal como se ha descrito anteriormente. En este cuerpo de planta, la fertilidad se ha restaurado frente al carácter de esterilidad masculina. The plant body in whose nucleus the DNA has been integrated can be obtained by introducing the DNA according to the present invention into the emc cell by the gene introduction method described above using the emc cell, selecting the cell in whose nucleus it is integrated the DNA using as an index a marker of tolerance selection against an antibiotic, such as kanamycin, or herbicide tolerance, and then culturing the cell in the growth culture medium or the rooting culture medium, such as described above. In this plant body, fertility has been restored against the character of male sterility.

Para detectar el gen implicado en la restauración de la fertilidad, el método aplicable consiste en utilizar un cebador oligonucleótido con entre 15 y 50 unidades libremente diseñado a partir del ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sonda con al menos 15 unidades que consiste en la totalidad o una parte del ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y se confirma que la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada por el cebador o la cantidad de la secuencia de nucleótidos detectada por la sonda en el organismo de muestra de interés es de 1 gen o más en 1 genoma. To detect the gene involved in fertility restoration, the applicable method is to use an oligonucleotide primer with between 15 and 50 units freely designed from DNA according to any one of claims 1 to 4, or a probe with at least 15 units consisting of all or part of the DNA according to any one of claims 1 to 4, and confirming that the amount of the nucleotide sequence amplified by the primer or the amount of the nucleotide sequence detected by the probe in the organism of Sample of interest is 1 gene or more in 1 genome.

Un ejemplo de técnica específica para la confirmación es el método PCR y el método de hibridación de Southern, de entre los cuales resulta preferente el método PCR. Estas técnicas se pueden llevar a cabo de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en adelante abreviado Molecular Cloning 2ª ed.). An example of a specific technique for confirmation is the PCR method and the Southern hybridization method, among which the PCR method is preferred. These techniques can be carried out according to the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (hereinafter abbreviated Molecular Cloning 2nd ed.).

Para confirmar que se encuentra 1 gen o más en 1 genoma mediante el método PCR, es necesario que, como técnica simplificada, se puede observar un mismo grado de amplificación mediante el uso de un mismo número de copias del ADN como plantilla. Más exactamente, en la misma muestra biológica de una misma cantidad, la cantidad de dicho gen amplificado conocido se compara con la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada mediante el uso del cebador mediante la aplicación del método PCR cuantitativo utilizando un cebador opcional para amplificar un gen conocido como estándar interno en el que hay 1 gen en 1 genoma. En el método de hibridación de Southern, el ADN de la planta de la línea restauradora de la fertilidad en el que 1 gen está presente en 1 genoma se compara con el ADN de la planta de muestra objetivo en una cantidad idéntica y a continuación se comprueba que las cantidades de los ADN detectados son idénticas o superiores. To confirm that 1 gene or more is found in 1 genome by the PCR method, it is necessary that, as a simplified technique, the same degree of amplification can be observed by using the same number of copies of the DNA as a template. More precisely, in the same biological sample of the same amount, the amount of said known amplified gene is compared with the amount of the nucleotide sequence amplified by the use of the primer by applying the quantitative PCR method using an optional primer to amplify a gene known as internal standard in which there is 1 gene in 1 genome. In the Southern hybridization method, the plant DNA of the fertility restorative line in which 1 gene is present in 1 genome is compared with the DNA of the target sample plant in an identical amount and then it is verified that the amounts of the DNA detected are identical or higher.

Un ejemplo de cebador utilizado en el método PCR es el oligonucleótido de 15 a 50 unidades idéntico o complementario a la secuencia de ADN de SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 2. An example of a primer used in the PCR method is the oligonucleotide of 15 to 50 units identical or complementary to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 2.

Un ejemplo de la sonda utilizada en el método de hibridación de Southern es una región total de una doble hebra de ADN idéntica a la secuencia de ADN de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, o una parte de, como mínimo, 15 unidades o más de la misma, o la región total de un ADN de hebra sencilla o una hebra complementaria de la misma, o una parte de al menos 15 unidades o más de la misma. Además, se puede utilizar un ADN que tiene un cierto grado de homología o más con respecto a la secuencia de nucleótidos del ADN que se utiliza como sonda, tal como se ha mencionado anteriormente. El “cierto grado de homología o más” utilizado en el presente documento es, por ejemplo, el 70% o superior, preferentemente el 80% o superior, más preferentemente el 90% o superior, aún más preferentemente el 93% o superior, particularmente preferentemente 95% o superior y todavía más preferentemente 97% o superior. El ADN que tiene dicho cierto grado de homología o más incluye el polinucleótido que presenta homología descrito anteriormente y el polinucleótido de la hebra complementaria del mismo. An example of the probe used in the Southern hybridization method is a total region of a double strand of DNA identical to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a portion of at least 15 units or more thereof, or the total region of a single stranded DNA or a complementary strand thereof, or a portion of at least 15 units or more thereof. In addition, a DNA that has a certain degree of homology or more can be used with respect to the nucleotide sequence of the DNA that is used as a probe, as mentioned above. The "certain degree of homology or more" used herein is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or higher and still more preferably 97% or higher. DNA that has such a degree of homology or more includes the polynucleotide having homology described above and the polynucleotide of the complementary strand thereof.

El método para la detección del gen tal como se ha descrito anteriormente se puede aplicar como medio no sólo de confirmación de la integración del ADN en el transformante, sino también de la confirmación de la presencia del gen Rf en el individuo en el que se pretende llevar a cabo la introducción del gen Rf por cruce. Al utilizar este método, la presencia del gen Rf se puede confirmar antes de la floración cuando el gen Rf se introduce en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Cuando el gen Rf se introduce en la planta que presenta un citoplasma común, la fertilidad del individuo de la siguiente generación obtenida mediante el cruce del polen en una etapa de floración con el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática debe ser confirmada, pero la presencia del gen Rf se puede confirmar antes de esta etapa utilizando el presente método. Dicho método se conoce generalmente como uso de un ADN marcador o reproducción de ADN marcador. El gen Rf se puede utilizar como ADN marcador del gen Rf (marcador Rf). El marcador Rf, tal como se ha descrito anteriormente, es importante para la reproducción de una variedad de planta comercial utilizando un recombinante en el que se ha introducido el ADN y una planta no recombinante en la que se ha introducido el gen Rf por cruce como planta madre. The method for the detection of the gene as described above can be applied as a means not only of confirming the integration of DNA into the transformant, but also of confirming the presence of the Rf gene in the individual in which it is intended carry out the introduction of the Rf gene by crossing. By using this method, the presence of the Rf gene can be confirmed before flowering when the Rf gene is introduced into the individual who exhibits cytoplasmic male sterility. When the Rf gene is introduced into the plant that has a common cytoplasm, the fertility of the next generation individual obtained by crossing the pollen in a flowering stage with the individual presenting cytoplasmic male sterility must be confirmed, but the presence of the Rf gene can be confirmed before this stage using the present method. Said method is generally known as use of a marker DNA or reproduction of marker DNA. The Rf gene can be used as DNA marker of the Rf gene (Rf marker). The Rf marker, as described above, is important for the reproduction of a commercial plant variety using a recombinant in which the DNA has been introduced and a non-recombinant plant in which the Rf gene has been introduced by crossing as mother plant.

Se puede confirmar si el ADN introducido funciona como gen Rf mediante la confirmación de la restauración de la fertilidad del transformante tal como se ha mencionado anteriormente, y también por el método que se presenta a continuación. It can be confirmed if the introduced DNA functions as an Rf gene by confirming the restoration of the fertility of the transformant as mentioned above, and also by the method presented below.

Tal como se ha descrito anteriormente, el gen Rf restaura la fertilidad del cuerpo de la planta reduciendo la cantidad de proteína ORF125 u ORF138, que es la proteína asociada a emc, la cual se acumula en las mitocondrias. En consecuencia, al confirmar la reducción de la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en las mitocondrias del transformante, se puede confirmar que el gen introducido es el gen Rf. As described above, the Rf gene restores the fertility of the plant body by reducing the amount of ORF125 or ORF138 protein, which is the emc-associated protein, which accumulates in mitochondria. Consequently, by confirming the reduction in the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated in the transformant mitochondria, it can be confirmed that the gene introduced is the Rf gene.

El método para confirmar la reducción de la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en las mitocondrias es, por ejemplo, un método por el que se confirma que la cantidad de señal de hibridación de un anticuerpo contra la proteína derivada de un genoma mitocondrial utilizado como estándar interno, tal como anti-F1-F0-ATPasa (en adelante abreviado ATPA) descrito en N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet., 100: 949-955, 2000, es igual entre el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática y el transformante en el que se ha introducido el ADN en la planta con fertilidad restaurada o el individuo con esterilidad masculina citoplasmática, cuando la proteína ORF125 u ORF138 se detectan por el método transferencia Western según la condición descrita en la presente memoria, y que la cantidad acumulada en el transformante producido introduciendo el ADN en la planta con la fertilidad restaurada o el individuo con esterilidad masculina citoplasmática se ha reducido en más del 50%, preferentemente en el 60% o más, más preferentemente en el 80% o más, en comparación con la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en el individuo con esterilidad masculina citoplasmática. The method for confirming the reduction of the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated in the mitochondria is, for example, a method by which it is confirmed that the amount of hybridization signal of an antibody against the protein derived from a mitochondrial genome used as internal standard, such as anti-F1-F0-ATPase (hereinafter abbreviated ATPA) described in N. Koizuka et al., Theor. Appl. Genet., 100: 949-955, 2000, is the same between the individual presenting cytoplasmic male sterility and the transformant in which the DNA has been introduced into the plant with restored fertility or the individual with cytoplasmic male sterility, when the ORF125 protein or ORF138 are detected by the Western blotting method according to the condition described herein, and that the amount accumulated in the transformant produced by introducing the DNA into the plant with restored fertility or the individual with cytoplasmic male sterility has been reduced by more than 50%, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, compared to the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated in the individual with cytoplasmic male sterility.

En la práctica, en un capullo de la planta de rábano con esterilidad masculina citoplasmática que tiene ORF125, cuando se introduce el gen Rf restaurador de la fertilidad, la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce notablemente, lo que lleva a una detección prácticamente nula. En la colza, en un capullo de la planta con la fertilidad restaurada en la que se ha introducido el gen restaurador de la fertilidad en colza con esterilidad masculina citoplasmática que tiene la proteína ORF125 mediante cruce, se ha observado que la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce en un 80% o más. En el ejemplo, en el capullo de la colza transformante en la que se ha introducido el gen en el individuo con esterilidad masculina citoplasmática, se ha observado que la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce en un 80% o más. In practice, in a cocoon of the cytoplasmic male sterile radish plant that has ORF125, when the fertility-restoring Rf gene is introduced, the amount of accumulated ORF125 protein is markedly reduced, leading to a virtually zero detection. In rapeseed, in a cocoon of the plant with restored fertility in which the fertility restorative gene in rapeseed with cytoplasmic male sterility that has the ORF125 protein by crossing has been introduced, it has been observed that the amount of accumulated ORF125 protein It is reduced by 80% or more. In the example, in the cocoon of the transforming rape in which the gene has been introduced in the individual with cytoplasmic male sterility, it has been observed that the amount of accumulated ORF125 protein is reduced by 80% or more.

El anticuerpo contra la proteína ORF125 y ORF138 del método descrito anteriormente se puede obtener mediante la siguiente técnica convencional. Estas proteínas se inoculan en un animal como antígeno para obtener un antisuero, y el anticuerpo inmunoglobulina G se puede purificar utilizando una columna de afinidad que tiene fijada proteína A. El antígeno se puede obtener mediante la purificación de la proteína a partir del individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática y que la expresa, y de la célula cultivada por un método convencional. Además, el antígeno también se obtiene por combinación de los genes de ORF125 y ORF138 con el vector de expresión para expresarlo en Escherichia coli y levadura, seguido de purificación de un modo parecido. Además, el péptido obtenido por síntesis química de la longitud entera o una parte de la misma de la proteína ORF125 y ORF138 se puede utilizar como antígeno. El anticuerpo contra el ATPA también se puede obtener mediante una técnica similar. The antibody against the ORF125 and ORF138 protein of the method described above can be obtained by the following conventional technique. These proteins are inoculated into an animal as an antigen to obtain an antiserum, and the immunoglobulin G antibody can be purified using an affinity column that has fixed protein A. The antigen can be obtained by purifying the protein from the individual presenting cytoplasmic and expressing male sterility, and of the cultured cell by a conventional method. In addition, the antigen is also obtained by combining the ORF125 and ORF138 genes with the expression vector to express it in Escherichia coli and yeast, followed by purification in a similar manner. In addition, the peptide obtained by chemical synthesis of the entire length or a portion thereof of the ORF125 and ORF138 protein can be used as an antigen. The antibody against ATPA can also be obtained by a similar technique.

Además, mediante la introducción de una parte o la totalidad del gen según la presente invención en la célula que tiene un citoplasma con emc y/o el ADN según la presente invención junto con el promotor de inducción, la expresión de la emc se puede regular de forma específica y temporal y, de este modo, se puede alcanzar un nuevo sistema de producción de semillas híbridas que no necesitan una línea masculina que mantenga la esterilidad (mantenedora) y/o la línea restauradora (línea Rf) necesaria para la producción de semillas híbridas. Furthermore, by introducing part or all of the gene according to the present invention into the cell that has a cytoplasm with emc and / or the DNA according to the present invention together with the induction promoter, the expression of the emc can be regulated. specifically and temporarily and, in this way, a new hybrid seed production system that does not need a male line that maintains the sterility (maintainer) and / or restorative line (Rf line) necessary for the production of hybrid seeds

Es decir, normalmente la colza de la línea emc es estéril y, por lo tanto, la propagación y mantenimiento de la línea emc requiere la línea mantenedora en la que la emc y el Rf no están involucrados. Por lo tanto, hasta ahora, la producción de una semilla híbrida requería plantas de 3 líneas, concretamente, la línea Rf, la línea emc y la línea mantenedora. Sin embargo, debido a que el gen Rf ha sido aislado e identificado por la presente invención, aplicar el método para llevar a cabo la inducción del promotor mediante una sustancia química en la producción de híbridos con el fin de regular la expresión del gen restaurador permite la construcción de la línea emc con capacidad de propagación y mantenimiento incluso sin la línea mantenedora. That is, normally the rape of the emc line is sterile and, therefore, the propagation and maintenance of the emc line requires the maintenance line in which the emc and the Rf are not involved. Therefore, until now, the production of a hybrid seed required 3-line plants, namely, the Rf line, the emc line and the maintenance line. However, because the Rf gene has been isolated and identified by the present invention, applying the method to carry out the induction of the promoter by means of a chemical substance in the production of hybrids in order to regulate the expression of the restorative gene allows the construction of the emc line with propagation and maintenance capacity even without the maintenance line.

Específicamente, la longitud entera o una parte de la misma del gen según la presente invención se integra en un vector que presenta el promotor inducido desde el exterior, por ejemplo, el promotor sensible a fármacos, en una dirección antisentido o sentido, o es un vector construido para inducir el silenciamiento génico con el promotor inducible. A continuación, la célula que presenta el citoplasma emc y el ADN según la presente invención, o que tiene únicamente el citoplasma emc, se transforma utilizando el vector. Specifically, the entire length or a portion thereof of the gene according to the present invention is integrated into a vector presenting the promoter induced from the outside, for example, the drug-sensitive promoter, in an antisense or sense direction, or is a vector constructed to induce gene silencing with the inducible promoter. Next, the cell presenting the emc cytoplasm and the DNA according to the present invention, or having only the emc cytoplasm, is transformed using the vector.

La célula que presenta el citoplasma emc y/o el ADN según la presente invención puede ser no sólo la célula obtenida mediante la transformación de una célula que tiene el citoplasma emc con el ADN según la presente invención por el método descrito anteriormente, sino también la célula obtenida mediante el cruce de la línea emc con la línea Rf. The cell presenting the emc cytoplasm and / or the DNA according to the present invention can be not only the cell obtained by transforming a cell having the emc cytoplasm with the DNA according to the present invention by the method described above, but also the cell obtained by crossing the emc line with the Rf line.

El promotor inducible descrito anteriormente se conoce, por ejemplo, a partir de la publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 6-46697, y el método para la preparación del vector y la transformación tiene un ejemplo en las técnicas similares a las descritas anteriormente. The inducible promoter described above is known, for example, from the Japanese patent publication open for public inspection 6-46697, and the method for vector preparation and transformation has an example in techniques similar to those described above.

Normalmente, el promotor no se induce en el transformante, que es la célula obtenida por el método descrito anteriormente, tiene citoplasma emc y tiene o no ADN según la presente invención, y en el que una parte o la totalidad del ADN según la presente invención se integra junto con el promotor de inducción. Por lo tanto, la planta que lleva el vector diseñado para la regulación al alza del gen descrito anteriormente muestra fertilidad cuando se aplica la inducción, o la planta que lleva el vector diseñado para la regulación a la baja del gen muestra fertilidad causada por la inhibición de la expresión del gen Rf endógeno, y el mantenimiento de la línea se puede llevar a cabo por autopolinización. En la producción del híbrido, la sustancia química que tiene capacidad de inducir el promotor actúa sobre la planta que lleva un vector que puede regular a la baja el gen Rf endógeno y, por lo tanto, se inhibe la expresión del gen Rf. De este modo, la planta adquiere esterilidad masculina y, por lo tanto, se puede utilizar como línea emc en la producción de la semilla híbrida. Además, cuando la línea emc que tiene tanto el gen Rf endógeno y el constructo de regulación a la baja, la línea Rf necesaria hasta ahora para la producción de semillas híbridas pasa a ser innecesaria. En consecuencia, todas las variedades o líneas de colza sin el gen Rf se pueden utilizar como donantes de polen (padre). Así, además de ser innecesaria la línea mantenedora, la línea Rf se vuelve igualmente innecesaria y se pueden reducir considerablemente los costes de producción. Normally, the promoter is not induced in the transformant, which is the cell obtained by the method described above, has emc cytoplasm and has or not DNA according to the present invention, and in which a part or all of the DNA according to the present invention It is integrated together with the induction promoter. Therefore, the plant that carries the vector designed for upward regulation of the gene described above shows fertility when induction is applied, or the plant that carries the vector designed for downward regulation of the gene shows fertility caused by inhibition. of endogenous Rf gene expression, and line maintenance can be carried out by self-pollination. In the production of the hybrid, the chemical that has the capacity to induce the promoter acts on the plant that carries a vector that can regulate the endogenous Rf gene downwards and, therefore, the expression of the Rf gene is inhibited. In this way, the plant acquires male sterility and, therefore, can be used as an emc line in the production of the hybrid seed. In addition, when the emc line that has both the endogenous Rf gene and the downregulation construct, the Rf line necessary so far for the production of hybrid seeds becomes unnecessary. Consequently, all rapeseed varieties or lines without the Rf gene can be used as pollen donors (father). Thus, in addition to the maintenance line being unnecessary, the Rf line becomes equally unnecessary and production costs can be considerably reduced.

La aplicación de estos métodos permite la propagación y mantenimiento por autopolinización, incluso en la línea emc. En consecuencia, aunque hasta el momento son necesarias 3 líneas para la producción de la semilla híbrida, es posible que la línea mantenedora se vuelva innecesaria y se puedan reducir considerablemente los costes de producción. The application of these methods allows the propagation and maintenance by self-pollination, even in the emc line. Consequently, although so far 3 lines are necessary for the production of the hybrid seed, it is possible that the maintenance line becomes unnecessary and production costs can be considerably reduced.

A continuación se describen con mayor detalle los ejemplos de la presente invención no limitativos del alcance de la presente invención en ningún sentido. The examples of the present invention not limiting the scope of the present invention in any way are described in greater detail below.

Ejemplos Examples

Example 1: Isolation of a DNA marker related to the cytoplasmic male fertility restorative gene and genomic map preparation

Para el aislamiento del gen restaurador de la fertilidad (gen Rf), es necesario en primer lugar aislar el marcador de ADN situado alrededor del gen Rf y preparar el mapa genómico que muestra una relación entre las distancias genéticas de este marcador de ADN y el gen Rf. Como punto de partida, se llevó a cabo la clonación posicional de una región Rf. For the isolation of the fertility restorative gene (Rf gene), it is first necessary to isolate the DNA marker located around the Rf gene and prepare the genomic map showing a relationship between the genetic distances of this DNA marker and the gene Rf. As a starting point, positional cloning of an Rf region was carried out.

Como método para aislar el marcador de ADN, se llevó a cabo un método AFLP utilizando el AFLP Analysis System I AFLP Starter Kit de GIBCO BRL para el método AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados) (Nucleic Acids Research, 1995, vol. 23, nº 21: 4407-4414). Como material utilizado para medir la distancia genética desde el marcador, se utilizó una población F2 de aproximadamente 2.100 individuos obtenida por autopolinización de ocho individuos de la generación F1 de rábano producida mediante el cruce de un individuo ((KC2/KA1)-1) de Raphanus sativus cv. Kosena de la línea emc con un individuo (Yuan10-3) de Raphanus sativus cv. Yuanhong según el método descrito en N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet., 100: 949-955 2000. Como resultado, se aislaron, en una forma que intercalaba el gen Rf, 5 marcadores enlazados en una posición con una distancia genética comprendida entre 0,2 y 0,3 cM desde cada lado del gen. La figura 1 muestra el mapa genómico que pone de manifiesto la distancia genética de cada marcador de ADN y del gen Rf. As a method to isolate the DNA marker, an AFLP method was carried out using the AFLP Analysis System I AFLP Starter Kit of GIBCO BRL for the AFLP method (polymorphism in the length of amplified fragments) (Nucleic Acids Research, 1995, vol. 23, no. 21: 4407-4414). As a material used to measure the genetic distance from the marker, an F2 population of approximately 2,100 individuals obtained by self-pollination of eight individuals of the F1 radish generation produced by crossing an individual ((KC2 / KA1) -1) of Raphanus sativus cv. Kosena of the emc line with an individual (Yuan10-3) of Raphanus sativus cv. Yuanhong according to the method described in N. Koizuka et al., Theor. Appl. Genet., 100: 949-955 2000. As a result, 5 markers linked in a position with a genetic distance between 0.2 and 0.3 cM from each side of the gene were isolated in a way that intercalated the Rf gene. . Figure 1 shows the genomic map that shows the genetic distance of each DNA marker and the Rf gene.

Ejemplo 2: Preparación del cóntigo y análisis del gen Rf sobre la base del mapa genómico Example 2: Preparation of the contigo and analysis of the Rf gene based on the genomic map

Tras la elaboración del mapa genómico, es necesario que el ADN genómico correspondiente a la posición esté clonado y los marcadores de ADN que intercalan el gen Rf estén enlazados. Dado que los marcadores de ADN están lejos del gen Rf, mediante la combinación de una serie de clones con el fragmento de ADN genómico se preparó el cóntigo de la región del gen Rf que cubre los marcadores de ADN. After the elaboration of the genomic map, it is necessary that the genomic DNA corresponding to the position is cloned and the DNA markers that intercalate the Rf gene are linked. Since the DNA markers are far from the Rf gene, by combining a series of clones with the genomic DNA fragment, the region of the Rf gene region covering the DNA markers was prepared.

Un grupo de clones que presentan el fragmento de ADN genómico se denomina biblioteca genómica. Se prepararon dos tipos de biblioteca. Como dador de ADN, el ADN genómico se preparó a partir de rábano Yuanhong, que es el mismo que el progenitor de la línea restauradora para la preparación de la población F2 mediante el método CTAB (Murray, M. G. y Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321) según una técnica convencional. Para la biblioteca, se preparó una biblioteca de fagos lambda con una longitud promedio de 20 kb y una población de 1,5 x 105 individuos utilizando un vector λ DASH II (Stratagene) como vector lambda. Como vector cósmido, se preparó una biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb y una población de 5,5 x 104 individuos utilizando el vector PNEB::-TNC (EPICENTRE TECHNOLOGIES). A group of clones that present the genomic DNA fragment is called the genomic library. Two types of library were prepared. As a DNA donor, genomic DNA was prepared from Yuanhong radish, which is the same as the progenitor of the restorative line for the preparation of the F2 population using the CTAB method (Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321) according to a conventional technique. For the library, a lambda phage library with an average length of 20 kb and a population of 1.5 x 105 individuals was prepared using a λ DASH II vector (Stratagene) as a lambda vector. As a cosmid vector, a cosmid library with an average length of 40 kb and a population of 5.5 x 104 individuals was prepared using the PNEB :: - TNC vector (EPICENTRE TECHNOLOGIES).

En la preparación del cóntigo, en primer lugar se aisló un clon lambda de la biblioteca de fagos lambda preparada del modo descrito anteriormente utilizando el marcador de ADN situado a ambos lados del gen Rf como índice mediante la técnica de hibridación en placa. Se aisló un clon cósmido de la biblioteca de cósmidos utilizando la técnica de hibridación de colonias para completar el cóntigo que cubre los marcadores de ADN de ambos lados, tal como se muestra en la figura 1. Para los clones de cósmidos NIT7/2 y TO3-2, que forman una parte del cóntigo, la secuencia de nucleótidos se determinó por un método convencional. In the preparation of the condom, a lambda clone from the lambda phage library prepared in the manner described above was first isolated using the DNA marker located on both sides of the Rf gene as an index by plaque hybridization technique. A cosmid clone from the cosmid library was isolated using the colony hybridization technique to complete the condom that covers the DNA markers on both sides, as shown in Figure 1. For cosmid clones NIT7 / 2 and TO3 -2, which form a part of the partner, the nucleotide sequence was determined by a conventional method.

A continuación, la secuencia de nucleótidos de los clones de cósmidos NIT7/2 y TO3-2 que componen una parte del cóntigo se analizó mediante “Genscan” (Mitsubishi Space Software) considerando un parámetro para Arabidopsis thaliana, cuya secuencia de ADN genómico es parecida a la del rábano y cuya secuencia genómica total ha sido determinada recientemente. De resultas de ello, se descubrieron la región promotora que parecía expresar el gen Rf, la región génica estructural que contiene el intrón y la región de terminación. Además, se obtuvieron el gen que tiene una forma susceptible de ser traducida a la proteína de la que se han eliminado los intrones y la secuencia de aminoácidos del mismo. Next, the nucleotide sequence of the cosmid clones NIT7 / 2 and TO3-2 that make up a part of the partner was analyzed by "Genscan" (Mitsubishi Space Software) considering a parameter for Arabidopsis thaliana, whose genomic DNA sequence is similar to that of radish and whose total genomic sequence has been determined recently. As a result, the promoter region that appeared to express the Rf gene, the structural gene region containing the intron and the termination region were discovered. In addition, the gene that has a form capable of being translated into the protein from which introns and the amino acid sequence thereof have been removed was obtained.

Ejemplo 3: Subclonación de la región de ADN genómico Example 3: Subcloning the genomic DNA region

El fragmento HpaI-SwaI (8546 pb) del ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 1º a 8553º de SEC ID nº: 1, que contiene suficientes regiones desde el promotor hasta el terminador detectadas por “Genscan”, se separó del vector mediante electroforesis en gel utilizando agarosa (FMC) para la recolección de los fragmentos. El gel que contenía el fragmento de ADN se digirió con GELase (Epicentre Technologies) para recoger el ADN. A continuación, se obtuvieron fragmentos clonados mediante la división del fragmento obtenido utilizando una enzima de restricción, BamHI. Estos fragmentos de ADN se subclonaron en vector pGEM-T Easy (Promega) a fin de obtener cds6BT/pGEM-T Easy. Los detalles se facilitan a continuación. The HpaI-SwaI fragment (8546 bp) of the DNA having a sequence corresponding to nucleotides 1 to 8553 of SEQ ID NO: 1, containing sufficient regions from the promoter to the terminator detected by "Genscan", was separated from the vector by Gel electrophoresis using agarose (FMC) for fragment collection. The gel containing the DNA fragment was digested with GELase (Epicenter Technologies) to collect the DNA. Next, cloned fragments were obtained by dividing the fragment obtained using a restriction enzyme, BamHI. These DNA fragments were subcloned into pGEM-T Easy vector (Promega) in order to obtain cds6BT / pGEM-T Easy. Details are provided below.

Se añadieron 1 µg de ADN cósmido NIT7/2 y 10 unidades de enzima de restricción HpaI (Takara) a 100 µl de solución tampón 1xK con enzimas de restricción (Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, KCl 100 mM) y se incubó a 37ºC durante 1 hora. 1 µg of cosmid DNA NIT7 / 2 and 10 units of HpaI restriction enzyme (Takara) were added to 100 µl of 1xK buffer solution with restriction enzymes (20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl2, dithiothreitol 1 mM, 100 mM KCl) and incubated at 37 ° C for 1 hour.

Tras la incubación, se añadieron 10 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 250 µl de etanol y se agitó, seguido de enfriamiento a -80ºC durante 5 minutos, y a continuación la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a After incubation, 10 µl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 250 µl of ethanol were added and stirred, followed by cooling at -80 ° C for 5 minutes, and then the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed and 1 ml of 70% ethanol was carefully added, and the mixture was centrifuged at

15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó con un secador de centrifugación en vacío durante 5 minutos. Se añadieron 89 µl de agua esterilizada al precipitado de ADN recogido a fin de disolver el ADN. 15,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried with a vacuum centrifuge dryer for 5 minutes. 89 µl of sterilized water was added to the precipitate of collected DNA in order to dissolve the DNA.

A la solución de ADN disuelto se le añadieron 10 µl de solución tampón 10xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 500 mM (pH 7,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCl 1.000 mM), 1 µl de enzima de restricción SwaI 10 unidades/µl (Takara) y la mezcla se incubó a 25°C durante 1 hora. Se añadieron 11 µl de 10x solución tampón de carga (1% de SDS, 50% de glicetrol, 0,05% de azul de bromofenol). To the dissolved DNA solution was added 10 µl of 10xH buffer solution with restriction enzymes (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1,000 mM NaCl), 1 µl of SwaI restriction 10 units / µl (Takara) and the mixture was incubated at 25 ° C for 1 hour. 11 µl of 10x loading buffer solution (1% SDS, 50% glycetrol, 0.05% bromophenol blue) was added.

Se mezclaron 1,2 g de agarosa de punto de fusión bajo, agarosa SeaPlaque GTG (FMC) y 150 ml de solución tampón TAE 1x (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM), la mezcla se calentó a 100ºC para fundir la agarosa y se enfrió a 45ºC con agitación. Se colocó un peine de 30 mm de ancho x 1 mm de espesor en una bandeja de gel de 14 x 15 cm y el gel enfriado se vertió para la coagulación. El ADN al que se había añadido un colorante de carga se vertió en el peine de gel y se sometió a electroforesis en TAE 1x a un voltaje de 30 V/30 cm durante 18 horas. 1.2 g of low melting point agarose, SeaPlaque GTG agarose (FMC) and 150 ml of 1x TAE buffer solution (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) were mixed, the mixture was heated at 100 ° C to melt the agarose and cooled to 45 ° C with stirring. A 30 mm wide x 1 mm thick comb was placed in a 14 x 15 cm gel tray and the cooled gel was poured for coagulation. The DNA to which a loading dye had been added was poured into the gel comb and subjected to electrophoresis in 1x TAE at a voltage of 30 V / 30 cm for 18 hours.

El gel de electroforesis se transfirió a 0,5 µg/ml de bromuro de etidio/solución TAE 1x para la tinción durante 30 minutos. El gel se colocó en un transiluminador en el que se irradiaron rayos ultravioleta con una longitud de onda de 365 nm y un fragmento de interés de 8546 pb se cortó con un cuchillo esterilizado. A continuación, el gel se cortó a fin de obtener fragmentos cuadrados de aproximadamente 1 mm y se transfirió a microtubos de 2 ml previamente pesado, y se determinó el peso del gel. The electrophoresis gel was transferred to 0.5 µg / ml ethidium bromide / 1x TAE solution for staining for 30 minutes. The gel was placed in a transilluminator in which ultraviolet rays with a wavelength of 365 nm were irradiated and a fragment of interest of 8546 bp was cut with a sterilized knife. The gel was then cut in order to obtain square fragments of approximately 1 mm and transferred to previously weighed 2 ml microtubes, and the gel weight was determined.

Se añadió 1 µl de tampón 50x GELase (Bis-Tris 2M (pH 6,0), NaCl 2M) por 50 mg de peso de gel. El tubo que contenía el gel se incubó en un bloque calefactor seco a 68ºC, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 10 minutos para fundir completamente el gel. El tubo se pasó al bloque calefactor seco a 45ºC, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 5 minutos. Se añadió a este tubo 1 unidad de GELase (Epicentre Technologies) por 200 mg de peso del gel, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 30 minutos en el bloque calefactor seco a 45ºC. 1 µl of 50x GELase buffer (2M Bis-Tris (pH 6.0), 2M NaCl) was added per 50 mg gel weight. The tube containing the gel was incubated in a dry heating block at 68 ° C, the solution was stirred occasionally turning and incubated for 10 minutes to completely melt the gel. The tube was passed to the dry heating block at 45 ° C, the solution was stirred occasionally turning and incubated for 5 minutes. To this tube was added 1 unit of GELase (Epicenter Technologies) per 200 mg of gel weight, the solution was stirred occasionally turning and incubated for 30 minutes in the dry heating block at 45 ° C.

Se añadió 1/3 de volumen de acetato de amonio 10 M (pH 7,0) por 1 volumen del gel y la solución se agitó y se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de 2 ml y se añadieron 2 volúmenes de etanol. El tubo se agitó y centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la solución se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó en un secador de centrifugación en vacío durante 5 minutos. Se añadieron 20 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado y la solución se disolvió por completo para recoger el ADN. 1/3 volume of 10M ammonium acetate (pH 7.0) was added per 1 volume of the gel and the solution was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred to a new 2 ml microtube and 2 volumes of ethanol were added. The tube was stirred and centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. The supernatant was removed and 1 ml of 70% ethanol was carefully added, and the solution was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried in a vacuum centrifuge dryer for 5 minutes. 20 µl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to the precipitate and the solution was completely dissolved to collect the DNA.

A 20 µl de la solución de ADN recogida se le añadieron 10 µl de solución tampón 10xK con enzimas de restricción (Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, KCl 1.000 mM), 68 µl de dH20, 2 µl de enzima de restricción BamHI 10 unidades/µl (Takara), y la mezcla se incubó a 30ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron 10 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 250 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, y a continuación se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron de nuevo cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 20 µl de agua esterilizada al precipitado de ADN recogido a fin de disolverlo. Se añadieron y mezclaron 55 µl de agua esterilizada, 10 µl de 10x solución tampón de PCR (Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), KCl 500 mM), 6 µl de MgCl2 25 mM, 8 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de 5 unidades/µl de Taq ADN polimerasa (Takara), y a continuación la mezcla se incubó a 72ºC durante 30 minutos para añadir dATP en la posición 3’ terminal. To 20 µl of the collected DNA solution was added 10 µl of 10xK buffer solution with restriction enzymes (200 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1,000 mM KCl), 68 µl of dH20, 2 µl of BamHI restriction enzyme 10 units / µl (Takara), and the mixture was incubated at 30 ° C for 1 hour. After incubation, 10 µl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 250 µl of ethanol were added and the mixture was stirred and cooled at -80 ° C for 5 minutes, and then centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes . The supernatant was removed and 1 ml of 70% ethanol was carefully added again, and the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a vacuum centrifuge dryer. 20 µl of sterilized water was added to the precipitate of collected DNA in order to dissolve it. 55 µl of sterilized water, 10 µl of 10x PCR buffer solution (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl), 6 µl of 25 mM MgCl2, 8 µl of dNTP 2 mixture were added and mixed, 5 mM, 1 µl of 5 units / µl of Taq DNA polymerase (Takara), and then the mixture was incubated at 72 ° C for 30 minutes to add dATP in the 3 'terminal position.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos.Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se añadieron 20 µl de la solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM), se retiró la unidad de filtración y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo. La solución se centrifugó a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro. The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration unit with Microcon-50 membrane (Millipore) and centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. Water was discarded, 100 µl of sterilized water was added again and the mixture was centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. 20 µl of the TE buffer solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added, the filtration unit was removed and the direction was reversed to fix the new microtube. The solution was centrifuged at 3,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes to collect the DNA in the filter unit.

Se mezclaron 1 µl de vector pGEM-T Easy (Promega) 50 ng/µly6 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver.2 (Takara) con 5 µl del ADN purificado obtenido por el método anterior, y a continuación se incubó la mezcla a 16ºC durante 30 minutos. 1 µl of pGEM-T Easy vector (Promega) 50 ng / µly6 µl of solution I of the DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara) kit was mixed with 5 µl of the purified DNA obtained by the above method, and then the mixture was incubated at 16 ° C for 30 minutes.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y a continuación se centrifugó la solución a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo. The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration unit with Microcon-50 membrane (Millipore) together with 100 µl of sterilized water and then the solution was centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. Water was discarded, 100 µl of sterilized water was added again and the mixture was centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed and the direction was reversed to fix the new microtube.

El ADN de la unidad de filtro se recogió por centrifugación a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. The DNA of the filter unit was collected by centrifugation at 3,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes.

El ADN recogido en el tubo se enfrió poniéndolo en hielo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. Las células de Escherichia coli mezcladas con ADN se transfirieron a una cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina (Wako Pure Chemicals Ltd.), 20 µg/ml de X-Gal (Takara) y 1 mM de IPTG (Takara), y se cultivó durante 18 horas o más a 37ºC. The DNA collected in the tube was cooled by placing it on ice. 30 µl of Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) was introduced into the tube for electroporation and mixed gently. Escherichia coli cells mixed with DNA were transferred to a cuvette (USA Scientific Plastics) previously cooled in ice for electroporation (the distance between electrodes was 1 mm). Electroporation was carried out in an Electro Cell Manipulator 600 (BTX) device under conditions of 1.25 kv, 129 0 and 50 µF, and then 500 µl of heated SOC culture medium (Gibco BRL) was immediately added to the cuvette at 37 ° C. Escherichia coli was transferred to a 10 ml culture tube and subjected to culture with shaking at 37 ° C for 1 hour. The cultured Escherichia coli was spread on LB agar medium (1% bactotriptone, 0.5% bactolevadura extract, 1% NaCl, 1.5% bacto-agar) to which 100 µg / ml ampicillin was added ( Wako Pure Chemicals Ltd.), 20 µg / ml X-Gal (Takara) and 1 mM IPTG (Takara), and was grown for 18 hours or more at 37 ° C.

Una colonia blanca aparecida en un medio de cultivo de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina. El ADN plásmido se extrajo de células cultivadas de Escherichia coli por el método convencional. Se confirmó que un fragmento de interés se clonó en el ADN plásmido por escisión con enzima de restricción EcoRI (Takara), y así se obtuvo cds6BT/pGEM-T Easy. A white colony appearing in an agar culture medium was grown at 37 ° C for 18 hours or more in 2 ml of LB medium to which 100 µg / ml of ampicillin was added. Plasmid DNA was extracted from cultured Escherichia coli cells by the conventional method. It was confirmed that a fragment of interest was cloned into the plasmid DNA by cleavage with restriction enzyme EcoRI (Takara), and thus cds6BT / pGEM-T Easy was obtained.

Se cultivó Escherichia coli DH10B individual portadora del cds6BT/pGEM-T Easy obtenido por el método anterior a 37ºC durante 18 horas en 100 ml de medio de cultivo LB al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina. La purificación se llevó a cabo por el método alcalino con SDS utilizando el equipo Qiagen Midi Kit (QIAGEN). Individual Escherichia coli DH10B carrying the cds6BT / pGEM-T Easy obtained by the previous method was grown at 37 ° C for 18 hours in 100 ml of LB culture medium to which 100 µg / ml of ampicillin was added. Purification was carried out by the alkaline method with SDS using the Qiagen Midi Kit (QIAGEN).

Ejemplo 4-1: Preparación del vector para la transformación de plantas (1) Example 4-1: Preparation of the vector for the transformation of plants (1)

El cds6BT/pGEM-T Easy se dividió con la enzima de restricción EcoRI y se separó del vector mediante electroforesis en gel utilizando agarosa para la recolección de los fragmentos. El fragmento de ADN obtenido se clonó en el sitio EcoRI del vector para la transformación de plantas pKM424 (un vector en el que se añadieron un fragmento del promotor CaMV35S: gen GUS: un terminador NOS al pKM424, es el vector pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290)) a fin de preparar el vector para la transformación de plantas cds6BT/pKM424. Los detalles se facilitan a continuación. The cds6BT / pGEM-T Easy was divided with the restriction enzyme EcoRI and separated from the vector by gel electrophoresis using agarose to collect the fragments. The DNA fragment obtained was cloned into the EcoRI site of the plant transformation vector pKM424 (a vector in which a fragment of the CaMV35S promoter: GUS gene: an NOS terminator was added to pKM424, is the vector pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290)) in order to prepare the vector for plant transformation cds6BT / pKM424. Details are provided below.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM) se le añadió 1 µg de ADN cds6BT/pGEM-T Easy y 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. To 100 µl of 1xH buffer solution with restriction enzymes (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl) was added 1 µg of cds6BT / pGEM-T Easy DNA and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara), and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour.

Posteriormente, el fragmento EcoRI que contenía cds6BT se separó y se recogió de cds6BT/pGEM-T Easy por el mismo método que para recoger el fragmento HpaI-SwaI anterior. Subsequently, the EcoRI fragment containing cds6BT was separated and collected from cds6BT / pGEM-T Easy by the same method as for collecting the above HpaI-SwaI fragment.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM) se añadió 1 µg del vector para la transformación de plantas pKM424 y 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron 100 µl de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y 1 unidad de fosfatasa alcalina bacteriana (Takara) y se mezcló. A continuación, se llevó a cabo una desfosforilación mediante la incubación a 50ºC durante 1 hora. To 100 µl of 1xH buffer solution with restriction enzymes (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl) 1 µg of the vector for the transformation of pKM424 and 10 plants was added EcoRI restriction enzyme units (Takara), and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. After incubation, 100 µl of 1M Tris-HCl (pH 8.0) and 1 unit of bacterial alkaline phosphatase (Takara) were added and mixed. Then, dephosphorylation was carried out by incubation at 50 ° C for 1 hour.

Se añadieron 200 µl de fenol-cloroformo saturado de solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM) y la mezcla se agitó vigorosamente. Se llevó a cabo una centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos y a continuación se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Se repitió la misma operación para eliminar la proteína. Se añadieron 20 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 500 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, seguido de centrifugación a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 100 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado a fin de disolverlo completamente para obtener una concentración de 10 ng/µl. 200 µl of saturated phenol-chloroform of TE buffer solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA) were added and the mixture was vigorously stirred. Centrifugation was carried out at 15,000 rpm for 5 minutes and then the supernatant was transferred to a new tube. The same operation was repeated to remove the protein. 20 µl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 500 µl of ethanol were added and the mixture was stirred and cooled at -80 ° C for 5 minutes, followed by centrifugation at 15,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed and 1 ml of 70% ethanol was carefully added, and the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a vacuum centrifuge dryer. 100 µl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to the precipitate to completely dissolve it to obtain a concentration of 10 ng / µl.

Se mezclaron 10 µl de fragmento EcoRI purificado, 1 µl de vector pKM424 desfosforilado y 11 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver. 2 (Takara), y a continuación la mezcla se incubó a 16ºC durante 30 minutos. 10 µl of purified EcoRI fragment, 1 µl of dephosphorylated pKM424 vector and 11 µl of solution I of the DNA Ligation Kit Ver. 2 kit (Takara) were mixed, and then the mixture was incubated at 16 ° C for 30 minutes.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la solución se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se fijó a un nuevo microtubo en dirección invertida. The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration unit with Microcon-50 membrane (Millipore) together with 100 µl of sterilized water and centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. Water was discarded, 100 µl of sterilized water was added again and the solution was centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed and fixed to a new inverted microtube.

La centrifugación se llevó a cabo a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro. Centrifugation was carried out at 3,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes to collect the DNA in the filter unit.

El ADN recogido en el tubo se puso en hielo a fin de enfriarlo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. La Escherichia coli mezclada con ADN se transfirió a una cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina (Sigma) y se cultivó durante 18 horas o más a 37ºC. The DNA collected in the tube was placed on ice to cool it. 30 µl of Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) was introduced into the tube for electroporation and mixed gently. The Escherichia coli mixed with DNA was transferred to a cuvette (USA Scientific Plastics) previously cooled in ice for electroporation (the distance between electrodes was 1 mm). Electroporation was carried out in an Electro Cell Manipulator 600 (BTX) device under conditions of 1.25 kv, 129 0 and 50 µF, and then 500 µl of heated SOC culture medium (Gibco BRL) was immediately added to the cuvette at 37 ° C. Escherichia coli was transferred to a 10 ml culture tube and subjected to culture with shaking at 37 ° C for 1 hour. The cultured Escherichia coli was spread on LB agar medium (1% bactotriptone, 0.5% bactolevadura extract, 1% NaCl, 1.5% bacto-agar) to which 50 µg / ml spectinomycin was added ( Sigma) and was grown for 18 hours or more at 37 ° C.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina. El ADN plásmido se extrajo de la Escherichia coli cultivada por un método convencional. Se confirmó que la región situada desde el sitio BamHI al sitio HpaI se clonó en el ADN plásmido por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara). El plásmido se denominó cds6BT/pKM424. The colony that appeared in the agar medium was grown at 37 ° C for 18 hours or more in 2 ml of LB medium to which 50 µg / ml of spectinomycin was added. Plasmid DNA was extracted from Escherichia coli cultured by a conventional method. It was confirmed that the region located from the BamHI site to the HpaI site was cloned into the plasmid DNA by cleavage with restriction enzyme HindIII (Takara). The plasmid was named cds6BT / pKM424.

Se cultivó a 37ºC durante 18 horas Escherichia coli DH10B portadora de cds6BT/pKM424 en 250 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina. Se llevó a cabo una purificación por el método SDS alcalino utilizando el kit Qiagen Midi Kit (Qiagen Corp). Escherichia coli DH10B carrier of cds6BT / pKM424 was grown at 37 ° C in 250 ml of LB medium to which 50 µg / ml of spectinomycin was added. Purification was carried out by the alkaline SDS method using the Qiagen Midi Kit (Qiagen Corp).

Ejemplo 4-2: Preparación del vector para la transformación de plantas (2) Example 4-2: Preparation of the vector for plant transformation (2)

Se dividió el clon lambda CHI (véase la figura 2, fragmento clonado con una longitud de aproximadamente 17 kb) suficientemente portador de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 con una enzima de restricción NotI (Takara), que se encuentra en el sitio de clonación múltiple, y a continuación se separó del vector mediante electroforesis en gel de agarosa a fin de recoger el fragmento, que se clonó en el sitio NotI del vector pBIGRZ2 (Bioscience and Industry, 55 (1997), 37-39) para la transformación de plantas a fin de preparar el vector CHI/pBIGRZ2 para la transformación de plantas. Los detalles se facilitan a continuación. The lambda CHI clone (see Figure 2, cloned fragment with a length of approximately 17 kb) was divided sufficiently carrying the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 with a restriction enzyme NotI (Takara), which is located at the site of multiple cloning, and then separated from the vector by agarose gel electrophoresis to collect the fragment, which was cloned into the NotI site of the vector pBIGRZ2 (Bioscience and Industry, 55 (1997), 37-39) for transformation of plants in order to prepare the CHI / pBIGRZ2 vector for plant transformation. Details are provided below.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM, 0,01% de BSA y 0,01% de Triton X-100) se le añadieron 1 µg del ADN de clon lambda CHI y 10 unidades de enzima de restricción NotI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. El fragmento NotI del clon lambda CHI se separó y se recogió por el mismo método aplicado para la recolección del fragmento HpaI-SwaI, tal como se ha descrito anteriormente. At 100 µl of 1xH buffer solution with restriction enzymes (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 0.01% BSA and 0.01% Triton X -100) 1 µg of the lambda CHI clone DNA and 10 units of NotI restriction enzyme (Takara) were added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. The NotI fragment of the lambda CHI clone was separated and collected by the same method applied for the collection of the HpaI-SwaI fragment, as described above.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM, 0,01% de BSA y 0,01% de Triton X-1) se le añadieron 1 mg del vector pBIGRZ2 para la transformación de plantas y 10 unidades de enzima de restricción NotI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron y mezclaron 100 µl de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y 1 unidad de fosfatasa alcalina bacteriana (Takara), y la mezcla se incubó a 50ºC durante 1 hora para la desfosforilación. At 100 µl of 1xH buffer solution with restriction enzymes (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 0.01% BSA and 0.01% Triton X -1) 1 mg of the vector pBIGRZ2 for plant transformation and 10 units of NotI restriction enzyme (Takara) were added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. After incubation, 100 µl of 1M Tris-HCl (pH 8.0) and 1 unit of bacterial alkaline phosphatase (Takara) were added and mixed, and the mixture was incubated at 50 ° C for 1 hour for dephosphorylation.

Se añadieron 200 µl de fenol/cloroformo saturado con solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) y a continuación se agitó la mezcla vigorosamente. Tras una centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos, se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Se repitió la misma operación para eliminar la proteína. Se añadieron 20 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 500 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, seguido de centrifugación a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la solución se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 100 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado a fin de disolverlo completamente para obtener una concentración de 10 ng/µl. 200 µl of phenol / chloroform saturated with TE buffer solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added and then the mixture was vigorously stirred. After centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was transferred to a new tube. The same operation was repeated to remove the protein. 20 µl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 500 µl of ethanol were added and the mixture was stirred and cooled at -80 ° C for 5 minutes, followed by centrifugation at 15,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed and 1 ml of 70% ethanol was carefully added, and the solution was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a vacuum centrifuge dryer. 100 µl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to the precipitate to completely dissolve it to obtain a concentration of 10 ng / µl.

Se mezclaron 10 µl de fragmento NotI purificado, 1 µl de vector pBIGRZ2 desfosforilado y 11 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver.2 (Takara), y la mezcla se incubó a 16ºC durante 30 minutos. 10 µl of purified NotI fragment, 1 µl of dephosphorylated pBIGRZ2 vector and 11 µl of solution I of the DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara) kit were mixed, and the mixture was incubated at 16 ° C for 30 minutes.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo. La solución se centrifugó a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro. The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration unit with Microcon-50 membrane (Millipore) together with 100 µl of sterilized water and centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. Water was discarded, 100 µl of sterilized water was added again and the mixture was centrifuged at 5,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed and the direction was reversed to fix the new microtube. The solution was centrifuged at 3,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes to collect the DNA in the filter unit.

El ADN recogido en el tubo se puso en hielo a fin de enfriarlo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. La Escherichia coli mezclada con el ADN se transfirió a la cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más. The DNA collected in the tube was placed on ice to cool it. 30 µl of Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) was introduced into the tube for electroporation and mixed gently. Escherichia coli mixed with the DNA was transferred to the cuvette (USA Scientific Plastics) previously cooled in ice for electroporation (the distance between electrodes was 1 mm). Electroporation was carried out in an Electro Cell Manipulator 600 (BTX) device under conditions of 1.25 kv, 129 0 and 50 µF, and then 500 µl of heated SOC culture medium (Gibco BRL) was immediately added to the cuvette at 37 ° C. Escherichia coli was transferred to a 10 ml culture tube and subjected to culture with shaking at 37 ° C for 1 hour. The cultivated Escherichia coli was spread in LB agar medium (1% bactotriptone, 0.5% bactolevadura extract, 1% NaCl, 1.5% bacto-agar) to which 25 µg / ml kanamycin was added ( Wako Pure Chemicals) and was grown at 37 ° C for 18 hours or more.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina. El ADN plásmido se extrajo de la Escherichia coli cultivada por el método convencional. Se confirmó por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara) que un fragmento de interés se clonó en el ADN plásmido. El plásmido se denominó CHI/pBIGRZ2. The colony that appeared in the agar medium was grown at 37 ° C for 18 hours or more in 2 ml of LB medium to which 25 µg / ml of kanamycin was added. Plasmid DNA was extracted from Escherichia coli cultured by the conventional method. It was confirmed by cleavage with restriction enzyme HindIII (Takara) that a fragment of interest was cloned into the plasmid DNA. The plasmid was named CHI / pBIGRZ2.

Se cultivó a 37ºC durante 18 horas Escherichia coli DH10B portadora de CHI/pBIGRZ2 en 250 ml de medio LB al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina. Se llevó a cabo una purificación por el método SDS alcalino utilizando el kit Qiagen Midi Kit (Qiagen). Escherichia coli DH10B carrying CHI / pBIGRZ2 in 250 ml of LB medium was cultured at 37 ° C for which 25 µg / ml of kanamycin was added. Purification was carried out by the alkaline SDS method using the Qiagen Midi Kit (Qiagen).

Ejemplo 5: Transferencia del vector para la transformación de planta a Agrobacterium Example 5: Transfer of the vector for plant transformation to Agrobacterium

Se preparó una célula competente de Agrobacterium y se transfirieron respectivamente el vector cds6BT/pKM424 y el vector CHI/pBIGRZ2 obtenidos en los ejemplos 4-1 y 4-2 al Agrobacterium EHA101 para la transformación de plantas. Los detalles se indican a continuación. A competent Agrobacterium cell was prepared and the cds6BT / pKM424 vector and the CHI / pBIGRZ2 vector obtained in Examples 4-1 and 4-2 were respectively transferred to the Agrobacterium EHA101 for plant transformation. Details are indicated below.

La célula competente para la electroporación de Agrobacterium EHA101 se preparó por el método siguiente. Se diseminó Agrobacterium EHA101 en medio LB agar al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals) y 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), y se cultivaron a 28ºC durante 24 horas o más para obtener una única colonia. Se introdujeron 20 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina y 25 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de centrífuga de 50 ml, se inoculó la colonia de aproximadamente 1 mm de diámetro y se sometió a cultivo con agitación a 28ºC durante 40 horas. Después de 40 horas, se abrió y cerró una vez la tapa del tubo de centrífuga y el cultivo se prosiguió del mismo modo durante 4 horas. La solución de cultivo se centrifugó a 1.500 x g y 4ºC para recoger las células. Una vez descartado el sobrenadante, se añadieron al tubo 40 ml de glicerol al 10% enfriado con hielo y esterilizado, seguido de resuspensión de las células y centrifugación a The cell competent for electroporation of Agrobacterium EHA101 was prepared by the following method. Agrobacterium EHA101 was disseminated in LB agar medium to which 50 µg / ml of kanamycin (Wako Pure Chemicals) and 25 µg / ml of chloramphenicol (Wako Pure Chemicals) were added, and grown at 28 ° C for 24 hours or more to obtain a single Suburb. 20 ml of LB medium was added to which 50 µg / ml of kanamycin and 25 µg / ml of chloramphenicol were added in a 50 ml centrifuge tube, the colony of approximately 1 mm in diameter was inoculated and subjected to shaking culture at 28 ° C for 40 hours. After 40 hours, the lid of the centrifuge tube was opened and closed once and the culture was continued in the same manner for 4 hours. The culture solution was centrifuged at 1,500 x g and 4 ° C to collect the cells. After discarding the supernatant, 40 ml of 10% glycerol cooled with ice and sterilized were added to the tube, followed by resuspension of the cells and centrifugation at

1.500 x g a 4ºC para la recolección de las células. Esta operación se repitió dos veces. Se añadieron 500 µl de glicerol al 10% esterilizado y enfriado con hielo a las células obtenidas para la resuspensión. Se dispusieron 100 µl de las células en cada uno de los microtubos esterilizados y se congelaron con nitrógeno líquido, y a continuación se guardaron a -80ºC en un congelador. 1,500 x g at 4 ° C for cell collection. This operation was repeated twice. 500 µl of sterile 10% glycerol and ice-cooled were added to the cells obtained for resuspension. 100 µl of the cells were placed in each of the sterilized microtubes and frozen with liquid nitrogen, and then stored at -80 ° C in a freezer.

Se disolvieron en hielo células competentes de Agrobacterium EHA101 para la electroporación. Se introdujeron 40 µl de células electrocompetentes en tubos de 1,5 ml previamente enfriados y se añadieron 100 ng de ADN plásmido de cualquiera de los vectores cds6BT/pKM424 o CHI/pBIGRZ2, y se mezcló suavemente. Competent Agrobacterium EHA101 cells were dissolved in ice for electroporation. 40 µl of electrocompetent cells were introduced into 1.5 ml tubes previously cooled and 100 ng of plasmid DNA from any of the cds6BT / pKM424 or CHI / pBIGRZ2 vectors were added, and mixed gently.

La Agrobacterium mezclada con el ADN se transfirió a la cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,44 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 30ºC. La Agrobacterium se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 30ºC durante 1 hora. The Agrobacterium mixed with the DNA was transferred to the cuvette (USA Scientific Plastics) previously cooled in ice for electroporation (the distance between electrodes was 1 mm). Electroporation was carried out on Electro Cell Manipulator 600 (BTX) equipment under conditions of 1.44 kv, 129 0 and 50 µF, and then 500 µl of heated SOC (Gibco BRL) culture medium was immediately added to the cuvette at 30 ° C. The Agrobacterium was transferred to a 10 ml culture tube and subjected to culture with stirring at 30 ° C for 1 hour.

En cuanto a la Agrobacterium a la que se transfirió el vector cds6BT/pKM424, la Agrobacterium cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals), 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), 50 µg/ml de espectinomicina (Sigma) y 2,5 µg/ml de tetraciclina (Sigma), y se cultivó a 28ºC durante 24 horas o más. As for the Agrobacterium to which the cds6BT / pKM424 vector was transferred, the cultivated Agrobacterium was spread on LB agar medium (1% bactotriptone, 0.5% bactolevure extract, 1% NaCl, 1.5% bacto-agar) to which 50 µg / ml of kanamycin (Wako Pure Chemicals), 25 µg / ml of chloramphenicol (Wako Pure Chemicals), 50 µg / ml of spectinomycin (Sigma) and 2.5 µg / ml of tetracycline were added (Sigma), and was grown at 28 ° C for 24 hours or more.

En cuanto a la Agrobacterium a la que se transfirió el vector CHI/pBIGRZ2, la Agrobacterium cultivada se extendió en medio LB agar al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals), 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals) y 30 µg/ml de higromicina (Sigma), y se cultivó a 28ºC durante 24 horas o más. As for the Agrobacterium to which the CHI / pBIGRZ2 vector was transferred, the cultivated Agrobacterium was spread on LB agar medium to which 50 µg / ml of kanamycin (Wako Pure Chemicals), 25 µg / ml of chloramphenicol (Wako Pure) were added Chemicals) and 30 µg / ml hygromycin (Sigma), and grown at 28 ° C for 24 hours or more.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 30ºC durante 24 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron los antibióticos anteriores correspondientes a cada vector. El ADN plásmido se extrajo de la Agrobacterium cultivada por un método convencional. Se confirmó por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara) que el vector cds6BT/pKM424 o el vector CHI/pBIGRZ2 se transfirieron a la Agrobacterium. La solución de cultivo cultivada durante 24 horas que contenía el clon confirmado se mezcló con una cantidad idéntica de glicerol esterilizado al 80% y se guardó a -80ºC. Este clon se utilizó para la transformación de la planta de colza. The colony that appeared in the agar medium was grown at 30 ° C for 24 hours or more in 2 ml of LB medium to which the previous antibiotics corresponding to each vector were added. Plasmid DNA was extracted from the cultivated Agrobacterium by a conventional method. It was confirmed by cleavage with HindIII restriction enzyme (Takara) that the cds6BT / pKM424 vector or the CHI / pBIGRZ2 vector was transferred to the Agrobacterium. The 24-hour culture solution containing the confirmed clone was mixed with an identical amount of 80% sterilized glycerol and stored at -80 ° C. This clone was used for the transformation of the rapeseed plant.

Ejemplo 6: Preparación del transformante de colza Example 6: Preparation of rapeseed transformant

La transformación de la colza se llevó a cabo de la siguiente manera. Se sometieron semillas de colza emc (SW18) con el gen asociado a la emc orf125 derivado de rábano a un tratamiento de esterilización con una solución de hipoclorito al 10% para germinarlas en medio MS (T. Murashige y F. Skoog, Physiol. Plant. 15: 485, 1962), que no contiene ninguna hormona. Sólo se cortó un hipocótilo de una plántula de 7 a 14 días tras la germinación; se cortó y se dividió en una longitud de 3 a 5 mm y se precultivó en medio MS (Sigma; M5519) que contenía sacarosa (3%), 2,4-D (1 mg/l) y agarosa (0,4%) (Sigma; tipo I) a 23ºC durante un periodo de 12 a 16 horas. Entonces se llevó a cabo un cocultivo junto con una línea celular BY-2 derivada del tabaco para cultivo nodriza. The rapeseed transformation was carried out as follows. Seeds of rape emc (SW18) with the gene associated with emc orf125 derived from radish were subjected to a sterilization treatment with a 10% hypochlorite solution to germinate them in MS medium (T. Murashige and F. Skoog, Physiol. Plant 15: 485, 1962), which does not contain any hormones. Only one hypocotyl was cut from a seedling 7 to 14 days after germination; it was cut and divided into a length of 3 to 5 mm and precultured in MS medium (Sigma; M5519) containing sucrose (3%), 2,4-D (1 mg / l) and agarose (0.4% ) (Sigma; type I) at 23 ° C for a period of 12 to 16 hours. A co-culture was then carried out together with a BY-2 cell line derived from tobacco for nurse cultivation.

La Agrobacterium que contenía CHI/pBIGRZ2 se cultivó a 28ºC durante 8 a 48 horas hasta aproximadamente OD600 = 1,0. Las células de Agrobacterium se suspendieron en un medio MS líquido sin hormonas. El hipocótilo cortado se mezcló con esta solución de Agrobacterium y se sometió a cocultivo durante aproximadamente 20 minutos. Tras el cocultivo, el hipocótilo, del que se extrajo la Agrobacterium con un papel de filtro, se cultivó, por ejemplo, en medio MS básico que contenía vitamina B5 (Sigma; M0404), sacarosa (3%) y 2,4-D (1 mg/l) durante 2 días para la infección. Tras la infección, el cotiledón se transfirió al medio desprovisto de bacterias obtenido mediante la adición del antibiótico carbenicilina (Pfizer: zeopen o GIBCO-BRL: sales disódicas de carbenicilina) en una concentración de 500 mg/l en el medio MS básico que contenía vitamina B5, sacarosa (3%) y 2,4-D (1 mg/l), a fin de eliminar la Agrobacterium. Agrobacterium containing CHI / pBIGRZ2 was grown at 28 ° C for 8 to 48 hours until approximately OD600 = 1.0. Agrobacterium cells were suspended in a liquid MS medium without hormones. The cut hypocotyl was mixed with this Agrobacterium solution and co-cultivated for approximately 20 minutes. After coculturing, the hypocotyl, from which the Agrobacterium was extracted with a filter paper, was grown, for example, in basic MS medium containing vitamin B5 (Sigma; M0404), sucrose (3%) and 2,4-D (1 mg / l) for 2 days for infection. After infection, the cotyledon was transferred to the bacteria-free medium obtained by the addition of the antibiotic carbenicillin (Pfizer: zeopen or GIBCO-BRL: disodium salts of carbenicillin) at a concentration of 500 mg / l in the basic MS medium containing vitamin B5, sucrose (3%) and 2,4-D (1 mg / l), in order to eliminate Agrobacterium.

Transcurrido un período de 5 días a 1 semana en el medio desprovisto de bacterias, el hipocótilo se cultivó en medio MS básico que contenía vitamina B5, sacarosa (1%), bencilaminopurina (3 mg/l), carbenicilina (500 mg/l), así como nitrato de plata (5 mg/l) y kanamicina para la selección (de 5 a 30 mg/l) (Nakalai Tesque; sulfato de kanamicina) de 14 a 21 días. En este momento puede aparecer un callo verde, que se debe transferir inmediatamente mediante inoculación en el medio del siguiente paso. After a period of 5 days to 1 week in the medium devoid of bacteria, the hypocotyl was grown in basic MS medium containing vitamin B5, sucrose (1%), benzylaminopurine (3 mg / l), carbenicillin (500 mg / l) , as well as silver nitrate (5 mg / l) and kanamycin for selection (5 to 30 mg / l) (Nakalai Tesque; kanamycin sulfate) for 14 to 21 days. At this time a green callus may appear, which must be transferred immediately by inoculation in the middle of the next step.

Un ejemplo del medio del siguiente paso es el medio de selección, por ejemplo, medio MS básico (Sigma; M5519), sacarosa (1%), bencilaminopurina (3 mg/l), zeatina (1 mg/l), carbenicilina (500 mg/l) y kanamicina (de 5 a 30 mg/l). El hipocótilo que forma el callo desde un punto de corte se transfirió a este medio de cultivo y se cultivó a 23ºC durante 3 semanas. A continuación, dicha transferencia se repitió de 3 a 5 veces cada 3 semanas hasta la aparición del callo verde. An example of the medium of the next step is the selection medium, for example, basic MS medium (Sigma; M5519), sucrose (1%), benzylaminopurine (3 mg / l), zeatin (1 mg / l), carbenicillin (500 mg / l) and kanamycin (5 to 30 mg / l). The hypocotyl that forms the callus from a cut-off point was transferred to this culture medium and grown at 23 ° C for 3 weeks. This transfer was then repeated 3 to 5 times every 3 weeks until the appearance of the green callus.

El callo verde se cortó del hipocótilo en el momento en que hacía aparición y se transfirió al medio con la misma composición. A continuación, cuando sólo la parte verde se cortó y se subcultivó, se formó un brote adventicio con una probabilidad comprendida entre un 1 y un 30%. Posteriormente, dicho brote adventicio se transfirió al medio B5 básico (Sigma; G5893) al que se añadieron sacarosa (3%) y bencilaminopurina (1mg/l), y se sometió a subcultivo seguido de enraizamiento en el medio MS (Sigma; M5519) que contenía sacarosa (3%), ácido nafténico (0,1 mg/l) y bencilaminopurina (0,01 mg/l). The green callus was cut from the hypocotyl at the time it appeared and was transferred to the medium with the same composition. Then, when only the green part was cut and subcultured, an adventitious bud formed with a probability between 1 and 30%. Subsequently, said adventitious shoot was transferred to the basic B5 medium (Sigma; G5893) to which sucrose (3%) and benzylaminopurine (1mg / l) were added, and subcultured followed by rooting in the MS medium (Sigma; M5519) containing sucrose (3%), naphthenic acid (0.1 mg / l) and benzylaminopurine (0.01 mg / l).

Ejemplo 7: Análisis del transformante (detección del ADN transferido) Example 7: Transformant analysis (detection of transferred DNA)

Se extrajo una hoja de un individuo del transformante obtenido en el ejemplo 6 que formó un brote y se aisló el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN de Qiagen (DNAeasy Plant Mini). An individual leaf was extracted from the transformant obtained in Example 6 that formed an outbreak and the DNA was isolated using the Qiagen DNA Isolation Kit (DNAeasy Plant Mini).

En 3 sitios (sitios a, b y c) del ADN se detectó el fragmento transferido por el método PCR (el resultado se muestra en la figura 3). El sitio a es una secuencia de 568 pb correspondiente a los nucleótidos 3186º a 3753º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3’” (SEC ID nº: 4) y como cebador inverso se utilizó “5’-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3’” (SEC ID nº: 5). El sitio b es una secuencia de 244 pb correspondiente a los nucleótidos 4869º a 5112º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3’” (SEC ID nº: 6) y como cebador inverso se utilizó “5’-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3’” (SEC ID nº: 7). El sitio c es una secuencia de 485 pb correspondiente a los nucleótidos 7766º a 8250º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3’” (SEC ID nº: 8) y como cebador inverso se utilizó “5’-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3’” (SEC ID nº: 9). In 3 sites (sites a, b and c) of the DNA the fragment transferred by the PCR method was detected (the result is shown in Figure 3). Site a is a 568 bp sequence corresponding to nucleotides 3186 ° to 3753 ° of the sequence SEQ ID NO: 1, and "5'-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3 '" (SEQ ID NO: 4) was used as the direct primer. Inverse, “5'-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3 '” (SEQ ID NO: 5) was used. Site b is a 244 bp sequence corresponding to nucleotides 4869 ° to 5112 ° of the sequence SEQ ID NO: 1, and as a direct primer "5'-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3" (SEQ ID NO: 6) was used and as a primer Inverse, “5'-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3 '” was used (SEQ ID NO: 7). Site c is a 485 bp sequence corresponding to nucleotides 7766 ° to 8250 ° of the sequence SEQ ID NO: 1, and as a direct primer "5'-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3" (SEQ ID NO: 8) was used and as a primer Inverse, “5'-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3 '” (SEQ ID NO: 9) was used.

A 1 µl de la solución de ADN transformante (50 ng/µl) se añadieron 12,1 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón de PCR 10 x (Tris-HCl 100 mM (pH 8, 3), KCl 500 mM), 1,2 µl de MgCl2 25 mM, 1,6 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución de cebador directo 10 µM para cada sitio, 1 µl de solución de cebador inverso 10 µM para cada sitio, 0,1 µl de 5 unidades/µl de rTaq ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado. A continuación, el ADN se amplificó repitiendo 35 veces un ciclo de 94ºC durante 40 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Se utilizó UNOII (Biometra) como termociclador. Tras la compleción de la reacción, el producto amplificado se detectó por electroforesis en gel con NuSieve 3:1 agarosa (FMC) al 4%/solución tampón TBE 1 x (tris-borato 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM) (véase la figura 3). To 1 µl of the transforming DNA solution (50 ng / µl) 12.1 µl of sterilized water, 2 µl of 10 x PCR buffer solution (100 mM Tris-HCl (pH 8, 3), 500 mM KCl were added ), 1.2 µl of 25 mM MgCl2, 1.6 µl of 2.5 mM dNTP mixture, 1 µl of 10 µM direct primer solution for each site, 1 µl of 10 µM reverse primer solution for each site, 0 , 1 µl of 5 units / µl of rTaq DNA polymerase (Takara), followed by mixing. Next, the DNA was amplified by repeating a cycle of 94 ° C for 40 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute. UNOII (Biometra) was used as a thermal cycler. After completion of the reaction, the amplified product was detected by gel electrophoresis with 4% NuSieve 3: 1 agarose (FMC) / 1 x TBE buffer solution (89 mM tris-borate, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA) (see figure 3).

Como conclusión, se puso de manifiesto que el sitio a no se transfirió a esta colza transformada. Se puso de manifiesto que, en los otros dos sitios (sitios b y c), se observó un producto de amplificación con el mismo tamaño que el de un control positivo y, por lo tanto, el ADN se integró en la colza transformada. In conclusion, it was revealed that the site was not transferred to this transformed rapeseed. It was revealed that, at the other two sites (sites b and c), an amplification product with the same size as that of a positive control was observed and, therefore, the DNA was integrated into the transformed rapeseed.

Ejemplo 8: Análisis del transformante (detección de la acumulación reducida de la proteína ORF125 asociada a emc) Example 8: Transformant analysis (detection of reduced accumulation of the ORF125 protein associated with emc)

Se extrajo un capullo de la misma planta que la del ejemplo 7 y se analizó por transferencia Western la acumulación reducida de la proteína ORF125 asociada a emc. El resultado se muestra en la figura 4. A bud of the same plant as in example 7 was extracted and the reduced accumulation of the ORF125 protein associated with emc was analyzed by Western blotting. The result is shown in Figure 4.

(1) Extracción de la proteína de la planta transformada (1) Extraction of the protein from the transformed plant

Se llevaron a cabo la extracción de proteínas y el transferencia Western según el método de N. Koizuka y otros, (Theor. Appl. Genet. (2000) 100: 949-955). Protein extraction and Western blotting were carried out according to the method of N. Koizuka et al. (Theor. Appl. Genet. (2000) 100: 949-955).

En concreto, 1 capullo (1 mm de longitud) de la colza transformada obtenida y 100 µl de la solución tampón enfriada con hielo (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), SDS al 2% (p/v)) para la extracción de proteínas se introdujeron en un mortero enfriado con hielo y se trituraron con una mano de mortero. Esta solución se transfirió a un microtubo de centrifugación y se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Tras la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de centrifugación y se calentó a 100ºC durante 5 minutos. La centrifugación se llevó a cabo de nuevo a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de centrifugación a fin de preparar una solución de proteína solubilizada en SDS. La concentración de la solución de proteína solubilizada en SDS se midió por el método de Bradford utilizando un kit de cuantificación de proteínas (Biorad). Simultáneamente a esta operación, la solución de proteína solubilizada en SDS se extrajo de manera similar a partir de los capullos de colza de la línea con esterilidad masculina citoplasmática y colza de la línea restauradora de la esterilidad, y se midieron las concentraciones. Specifically, 1 cocoon (1 mm in length) of the processed rape obtained and 100 µl of the ice-cold buffer solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2% SDS (w / v)) for Protein extraction was introduced into an ice-cold mortar and crushed with a pestle. This solution was transferred to a centrifuge microtube and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new centrifuge microtube and heated at 100 ° C for 5 minutes. Centrifugation was carried out again at 15,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes and the supernatant was transferred to a new centrifuge microtube in order to prepare a protein solution solubilized in SDS. The concentration of the SDS solubilized protein solution was measured by the Bradford method using a protein quantification kit (Biorad). Simultaneously to this operation, the SDS solubilized protein solution was similarly extracted from the rapeseed buds of the cytoplasmic male sterility line and rapeseed of the sterility restorative line, and the concentrations were measured.

(2) (2): Separación de la proteína por SDS-PAGE y transferencia a una membrana de PVDF: transferencia Western Protein separation by SDS-PAGE and transfer to a PVDF membrane: Western blot

Con un gel de poliacrilamida-SDS al 10% de 7 x 10 cm, se colocaron 15 µg de la proteína solubilizada en SDS en 1 carril para la separación por electroforesis. Además, para la comparación de las acumulaciones de proteína ORF125 se colocaron series diluidas de colza de la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática en el gel y se separaron. Se llevó a cabo una electroforesis a 10 mA durante 1 hora y 15 mA durante 1 hora. Tras la electroforesis, la proteína contenida en el gel de poliacrilamida se transfirió a la membrana de PVDF (Millipore) utilizando un equipo de electrotransferencia en sistema semiseco (Nippon Electrophoresis) a 100 mA durante una hora. With a 7% 10 cm polyacrylamide-SDS gel, 15 µg of the SDS solubilized protein was placed in 1 lane for electrophoresis separation. In addition, for the comparison of ORF125 protein accumulations diluted series of rapeseed were placed from the line showing cytoplasmic male sterility in the gel and separated. A 10 mA electrophoresis was carried out for 1 hour and 15 mA for 1 hour. After electrophoresis, the protein contained in the polyacrylamide gel was transferred to the PVDF membrane (Millipore) using a semi-dry electrotransfer system (Nippon Electrophoresis) at 100 mA for one hour.

(3) (3): Detección de la proteína utilizando un anticuerpo: transferencia Western Protein detection using an antibody: Western blot

Las membranas de PVDF a las que se transfirió la proteína se cortaron en mitades y se transfirieron a 10 ml de una solución de bloqueo (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%, leche descremada al 5%) y se bloquearon mediante agitación durante una hora. Se detectó ATPA en la membrana superior de PVDF como control de una proteína mitocondrial y se detectó ORF125, que es la proteína implicada en la esterilidad masculina citoplasmática, en la membrana inferior de PVDF. La membrana de PVDF se transfirió a 10 ml de una solución de reacción de anticuerpo primario (se añadieron 100 µl de un anticuerpo monoclonal ATPA para la detección de ATPA a 10 ml de la solución de bloqueo y se añadieron 2 µl de antisuero de conejo anti-ORF125 para la detección de ORF125 (M. Iwabuchi y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), y se agitó durante 18 horas. La membrana de PVDF se transfirió a 100 ml de TTBS (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%) y se agitó durante 10 minutos. Esta operación se repitió 3 veces a fin de lavar la solución de anticuerpo primario en exceso. La membrana de PVDF se transfirió a 10 ml de una solución de reacción de anticuerpo secundario (a 10 ml de la solución de bloqueo se añadieron 10 µl de anti-IgG de ratón obtenido en cabra marcado con peroxidasa (Amersham) para la detección de ATPA y 10 µl de anti-IgG de conejo obtenido en cabra marcado con fosfatasa alcalina (Bio-rad) para la detección de ORF125, respectivamente (M. Iwabuchi y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), y ambas soluciones se agitaron durante una hora. La membrana de PVDF se transfirió a 100 ml de TTBS (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%) y se agitó durante 10 minutos. Esta operación se repitió tres veces a fin de lavar la solución de anticuerpo secundario en exceso. Se utilizó un sistema de quimioluminiscencia “ECL+” (Amersham) para la peroxidasa a fin de detectar ATPA, y la exposición se llevó a cabo durante 5 segundos para la detección. Para la detección de ORF125, se utilizó BCIP/NBT (MOSS Inc.), que es un sustrato colorante para fosfatasa alcalina, y la tinción y la detección se llevaron a cabo durante 5 minutos. The PVDF membranes to which the protein was transferred were cut in halves and transferred to 10 ml of a blocking solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20 , 5% skim milk) and were blocked by stirring for one hour. ATPA was detected in the upper PVDF membrane as a control of a mitochondrial protein and ORF125, which is the protein involved in cytoplasmic male sterility, was detected in the lower PVDF membrane. The PVDF membrane was transferred to 10 ml of a primary antibody reaction solution (100 µl of an ATPA monoclonal antibody was added for the detection of ATPA to 10 ml of the blocking solution and 2 µl of anti rabbit antiserum was added -ORF125 for the detection of ORF125 (M. Iwabuchi et al., Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), and stirred for 18 hours. The PVDF membrane was transferred to 100 ml of TTBS (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20) and stirred for 10 minutes. This operation was repeated 3 times in order to wash the excess primary antibody solution. The PVDF membrane was transferred to 10 ml of a secondary antibody reaction solution (to 10 ml of the blocking solution 10 µl of mouse anti-IgG obtained in peroxidase-labeled goat (Amersham) was added for the detection of ATPA and 10 µl of rabbit anti-IgG obtained in goat labeled with alkaline phosphatase (Bio-rad) for the detection of ORF125, respectively (M. Iwabuchi et al., Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), and Both solutions were stirred for one hour. The PVDF membrane was transferred to 100 ml of TTBS (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20) and stirred for 10 minutes. This operation was repeated three times in order to wash the secondary secondary antibody solution in excess. An "ECL +" chemiluminescence system (Amersham) was used for peroxidase to detect ATPA, and the exposure was carried out for 5 seconds for detection. For the detection of ORF125, BCIP / NBT (MOSS Inc.), which is a dye substrate for alkaline phosphatase, was used, and staining and detection were carried out for 5 minutes.

Como conclusión, se puso de manifiesto que las acumulaciones de ATPA, que es el control, prácticamente no cambian en el capullo de la colza con esterilidad masculina citoplasmática de 2 líneas, en la colza con fertilidad restaurada y en el capullo de la colza transformante obtenida introduciendo ADN en la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática, pero la acumulación de proteína ORF125 se redujo significativamente en la colza transformante. El alcance de esta reducción es idéntico al de la línea con fertilidad restaurada obtenida mediante la transferencia de un gen restaurador de la fertilidad a la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática mediante cruce (figura 4 e Iwabuchi M. y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188). Se puso de manifiesto que el grado de reducción de la acumulación de la proteína ORF125 fue de 1/8 a 1/16 en la colza con fertilidad restaurada y de aproximadamente 1/8 en la colza transformante por comparación con las series diluidas. Tal como se ha descrito anteriormente, la restauración de la fertilidad en la colza está fuertemente relacionada con la reducción de la acumulación de la proteína ORF125, y los dos hechos indican lo mismo. Por lo tanto, se demostró que la secuencia de ADN tiene la función de reducir la acumulación de proteína ORF125 en la mitocondria y es una secuencia de ADN genómico portadora del gen restaurador de la fertilidad. In conclusion, it was revealed that the accumulations of ATPA, which is the control, practically do not change in the canola of the rapeseed with 2-line cytoplasmic male sterility, in the rapeseed with restored fertility and in the cocoon of the transforming rape obtained introducing DNA into the line that presents cytoplasmic male sterility, but the accumulation of ORF125 protein was significantly reduced in the transforming rape. The extent of this reduction is identical to that of the restored fertility line obtained by transferring a fertility restorative gene to the line that presents cytoplasmic male sterility by crossing (Figure 4 and Iwabuchi M. et al., Plant Molecular Biology (1999 ) 39: 183-188). It was shown that the degree of reduction of the accumulation of the ORF125 protein was 1/8 to 1/16 in the rape with restored fertility and about 1/8 in the transforming rape by comparison with the diluted series. As described above, the restoration of fertility in rapeseed is strongly related to the reduction of the accumulation of the ORF125 protein, and the two facts indicate the same. Therefore, it was demonstrated that the DNA sequence has the function of reducing the accumulation of ORF125 protein in the mitochondrion and is a genomic DNA sequence carrying the fertility restorative gene.

Además, los granos de polen se extrajeron de la planta en floración y se observaron al microscopio. Como conclusión, se confirmó que se producía un polen normal (figura 5). In addition, pollen grains were extracted from the flowering plant and observed under a microscope. In conclusion, it was confirmed that a normal pollen was produced (Figure 5).

Ejemplo 9: Aislamiento de ADNc. Example 9: cDNA isolation.

El aislamiento del ADNc se llevó a cabo seleccionando la planta F2 que tiene genes Rf1 homocigóticos y muestra fertilidad del polen como donante de ARN de la población F2 utilizado para la elaboración del mapa genético, purificando el ARNm del capullo y utilizando a continuación el método 5’-RACE o 3’-RACE tras la síntesis del ADNc. The cDNA isolation was carried out by selecting the F2 plant that has homozygous Rf1 genes and shows pollen fertility as an RNA donor of the F2 population used for the elaboration of the genetic map, purifying the mRNA from the cocoon and then using method 5 '-RACE or 3'-RACE after cDNA synthesis.

(Purificación de ARNm) (MRNA purification)

Se extrajo el ARN total del capullo de la planta F2 que tiene genes Rf1 homocigóticos y muestra fertilidad del polen aplicando el método del tiocianato de guanidinio como método convencional mediante el uso del kit RNeasy (Qiagen). Se purificó el ARN poliA+ del ARN total utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm. Total RNA was extracted from the cocoon of the F2 plant that has homozygous Rf1 genes and shows pollen fertility by applying the guanidinium thiocyanate method as a conventional method by using the RNeasy kit (Qiagen). PolyA + RNA was purified from total RNA using the "mRNA purification kit" (Amersham Pharmacia) with an Origo cellulose column (dT) and used as mRNA.

(Aislamiento de ADNc por 5’-RACE y 3’-RACE) (CDNA isolation by 5’-RACE and 3’-RACE)

El ADNc se aisló con 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, basado en los métodos 5’-RACE y 3’-RACE. Como cebadores específicos de gen, se utilizó 5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’ (SEC ID nº: 10) para el 5’RACE y 5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’ (SEC ID nº: 11) para el 3’-RACE. Después de determinarse la secuencia de nucleótidos del clon obtenido, se obtuvo la secuencia del ADNc (SEC ID nº: 2). The cDNA was isolated with 1 µg of purified mRNA using the “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” kit, based on the 5’-RACE and 3’-RACE methods. As gene-specific primers, 5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 ’(SEQ ID No: 10) was used for 5’RACE and 5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’ (SEQ ID No: 11) for 3’-RACE. After determining the nucleotide sequence of the clone obtained, the cDNA sequence was obtained (SEQ ID NO: 2).

Ejemplo 10: Conversión de ADNc en secuencia de aminoácidos y análisis de la misma Example 10: Conversion of cDNA into amino acid sequence and analysis thereof

(1) (one): La conversión de ADNc en la secuencia de aminoácidos se realizó utilizando un código genético convencional y el software de análisis de genes “Genetyx-SV” (Software Development K.K.), lo que permite obtener la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3. El motivo PPR se analizó mediante un programa registrado en la base de datos Protein Families Database of Alignments and HMNs (en adelante abreviada Pfam; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml). Como resultado del análisis, se puso de manifiesto que el producto traducido del gen restaurador de la fertilidad de SEC ID nº: 1 fue la proteína que tenía 16 motivos PPR. El motivo PPR tenía 3 complejos PPR. Los 3 complejos eran: The conversion of cDNA into the amino acid sequence was performed using a conventional genetic code and the gene analysis software "Genetyx-SV" (Software Development KK), which allows obtaining the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The PPR reason was analyzed using a program registered in the Protein Families Database of Alignments and HMNs (hereinafter abbreviated Pfam; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml). As a result of the analysis, it was revealed that the translated product of the fertility restorative gene of SEQ ID NO: 1 was the protein that had 16 PPR motifs. The PPR motive had 3 PPR complexes. The 3 complexes were:

(1) (one): complejo PPR nº 1: complejo PPR comprendido por 175 residuos consecutivos de los motivos PPR primero a quinto desde el extremo N-terminal; PPR complex No. 1: PPR complex comprised of 175 consecutive residues of the first to fifth PPR motifs from the N-terminal end;

(2) (2): complejo PPR nº 2: complejo PPR compuesto por 245 residuos consecutivos de los motivos PPR sexto a 12º desde el extremo N-terminal; y PPR complex No. 2: PPR complex consisting of 245 consecutive residues of the sixth to 12th PPR motifs from the N-terminal end; Y

(3) (3): complejo PPR nº 3: complejo PPR compuesto por 140 residuos consecutivos de los motivos PPR 13º a 16º desde el extremo N-terminal; PPR complex No. 3: PPR complex consisting of 140 consecutive residues of the 13th to 16th PPR motifs from the N-terminal end;

Ejemplo 11: Análisis de la proteína según la presente invención Example 11: Analysis of the protein according to the present invention

Se investigó si la traducción se inhibía o no en Escherichia coli uniéndola al producto de transcripción (ARNm) del gen de la proteína ORF125, lo que provoca esterilidad masculina citoplasmática en Kosena. It was investigated whether or not the translation was inhibited in Escherichia coli by binding it to the transcription product (mRNA) of the ORF125 protein gene, which causes cytoplasmic male sterility in Kosena.

El gen restaurador de la fertilidad de SEC ID nº: 2 se introdujo en el sitio BamHI-SphI del vector de expresión pQE80L (Qiagen) de Escherichia coli para construir el vector de expresión que añade seis residuos de histidina (6 x His) al extremo N-terminal (pQEB1/cds6). El ADN se amplificó utilizando el cebador: CGGGATCCGCTCACAATT (SEC ID nº: 12) para introducir el sitio BamHI y el cebador M13 Primer RV (Takara) y utilizando el vector pSTV29 (Takara) como plantilla. Para la amplificación del ADN, se utilizó el kit Takara LA PCR Kit (Takara). El ADN amplificado se The fertility restorative gene of SEQ ID NO: 2 was introduced into the BamHI-SphI site of the expression vector pQE80L (Qiagen) of Escherichia coli to construct the expression vector that adds six histidine residues (6 x His) to the end N-terminal (pQEB1 / cds6). The DNA was amplified using the primer: CGGGATCCGCTCACAATT (SEQ ID NO: 12) to introduce the BamHI site and the M13 Primer RV primer (Takara) and using the vector pSTV29 (Takara) as a template. For DNA amplification, the Takara LA PCR Kit (Takara) was used. The amplified DNA is

dividió mediante las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (Takara), y a continuación se purificó utilizando Suprec02 (Takara). A fin de sintetizar un fragmento de ADN con los sitios BamHI y EcoRI en ambos extremos del sitio 5’-UTR del gen orf125 y 25 aminoácidos de orf125, se llevó a cabo un PCR según el método de Fujimoto (Plant PCR Experiment Protocol: Practice of ADN synthesis, pág. 84-87 (Syuuzyunsya)) utilizando 2 cebadores. Los 2 cebadores utilizados fueron: divided by restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara), and then purified using Suprec02 (Takara). In order to synthesize a DNA fragment with the BamHI and EcoRI sites at both ends of the 5'-UTR site of the orf125 gene and 25 amino acids of orf125, PCR was carried out according to Fujimoto's method (Plant PCR Experiment Protocol: Practice of ADN synthesis, page 84-87 (Syuuzyunsya)) using 2 primers. The 2 primers used were:

y Y

El ADN amplificado se dividió mediante las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (Takara) y se purificó utilizando Suprec-02 (Takara). El ADN purificado se ligó con el kit Takara Ligation Kit (Takara). Con ello se transformó la Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar, IPTG 0,1 mM, X-Gal 20 µg/ml) al que se añadieron 50 µg/ml de cloranfenicol (Sigma). Se extrajo un plásmido de una colonia de color azul pálido por un método convencional y se determinó la secuencia de nucleótidos. De este modo, se construyó un vector (pSTV125-5’#LA6) en el que 174 pb (nucleótidos 7º al 180º de la secuencia de nucleótidos de la figura 6) que contienen la región 5’-UTR del gen orf125 y 25 aminoácidos de orf125 se introdujeron entre el sitio EcoRI y un punto de inicio de transcripción del gen lacZ. Además, simultáneamente, se obtuvo el vector que tiene el fragmento (nucleótidos 7º al 193º de la secuencia de nucleótidos de la figura 6) en el que se producen varias mutaciones en la parte correspondiente a los 174 pb (pSTV125-5’#LA12). The amplified DNA was divided by restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara) and purified using Suprec-02 (Takara). The purified DNA was ligated with the Takara Ligation Kit (Takara). This transformed Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) and was grown at 37 ° C for 18 hours or more in LB agar medium (1% bactotriptone, 0.5% bactolevure extract, 1% NaCl, 1.5% of bacto-agar, 0.1 mM IPTG, 20 µg / ml X-Gal) to which 50 µg / ml chloramphenicol (Sigma) was added. A pale blue colony plasmid was extracted by a conventional method and the nucleotide sequence was determined. Thus, a vector (pSTV125-5 '# LA6) was constructed in which 174 bp (7 th to 180 th nucleotides of the nucleotide sequence of Figure 6) containing the 5'-UTR region of the orf125 gene and 25 amino acids of orf125 were introduced between the EcoRI site and a transcription start point of the lacZ gene. In addition, simultaneously, the vector having the fragment (nucleotides 7 to 193 of the nucleotide sequence of Figure 6) was obtained in which several mutations occur in the part corresponding to 174 bp (pSTV125-5 '# LA12) .

Los vectores pSTV125-5’#LA6 y #LA12 se transfirieron a Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) y las células se cultivaron en el medio de agar obtenido mediante la adición de 50 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), 200 µM de IPTG (Wako Pure Chemicals) y 40 µg/ml de X-Gal (Takara) a medio LB, a 37ºC durante una noche a fin de hacer crecer la colonia, lo que dio lugar a una colonia de color azul pálido. De este modo se confirmó que el gen LacZ transferido se expresaba en la Escherichia coli a la que se había transferido cada vector. Vectors pSTV125-5 '# LA6 and # LA12 were transferred to Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) and the cells were cultured in the agar medium obtained by adding 50 µg / ml chloramphenicol (Wako Pure Chemicals), 200 µM of IPTG (Wako Pure Chemicals) and 40 µg / ml of X-Gal (Takara) at LB medium, at 37 ° C overnight to grow the colony, which resulted in a pale blue colony. Thus it was confirmed that the transferred LacZ gene was expressed in the Escherichia coli to which each vector had been transferred.

Además, a fin de transferir el vector pSTV125-5’ anterior y el vector pQEB1/cds6 a la Escherichia coli, que es la misma que la descrita anteriormente, cuando las células se cultivaron con el medio al que se añadieron 50 µg/ml de ampicilina, en el caso del cocultivo con pSTV125-5’#LA6 la colonia se volvió blanca. Sin embargo, en caso de cocultivo con pSTV125-5’#LA12 con una mutación en un sitio de fragmento de transferencia, la colonia se volvió azul pálido y el grado de azulamiento fue el mismo que en el caso del #LA12 solo. Se examinó si a la Escherichia coli le faltaba alguno de estos vectores transferidos mediante la extracción de los vectores por un método convencional tras el cultivo de cada colonia. In addition, in order to transfer the above pSTV125-5 'vector and the pQEB1 / cds6 vector to Escherichia coli, which is the same as described above, when the cells were cultured with the medium to which 50 µg / ml of ampicillin, in the case of co-culture with pSTV125-5 '# LA6 the colony turned white. However, in the case of co-culture with pSTV125-5 ’# LA12 with a mutation at a transfer fragment site, the colony turned pale blue and the degree of bluing was the same as in the case of # LA12 alone. It was examined whether Escherichia coli was missing any of these transferred vectors by extracting the vectors by a conventional method after the culture of each colony.

A partir de los resultados anteriores, se entiende que la proteína expresada en Escherichia coli por el vector pQEB1/cds6 se convirtió en la colonia blanca a través de la supresión de la expresión del gen LacZ como resultado de la unión con el ARNm de pSTV125-5’#LA6. En el caso de cocultivo con pSTV125-5’#LA12, se entiende que la mutación se produce en el sitio de fragmento de transferencia y por lo tanto la proteína derivada de pQEB1/cds6 no se puede unir a ARNm y, en consecuencia, el gen LacZ se expresa y provoca el color azul. From the above results, it is understood that the protein expressed in Escherichia coli by the vector pQEB1 / cds6 became the white colony through suppression of LacZ gene expression as a result of binding with the mRNA of pSTV125- 5 '# LA6. In the case of co-culture with pSTV125-5 '# LA12, it is understood that the mutation occurs at the transfer fragment site and therefore the protein derived from pQEB1 / cds6 cannot bind to mRNA and, consequently, the LacZ gene is expressed and causes the color blue.

En consecuencia, se supone que la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 afecta al ARNm de orf125, más específicamente al producto de transcripción de una región código de como mínimo la región orf125-5’UTR y 25 residuos aminoácidos de ORF125 con el fin de suprimir la expresión de la proteína ORF125. Consequently, it is assumed that the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 affects the mRNA of orf125, more specifically the transcription product of a code region of at least the orf125-5'UTR region and 25 amino acid residues of ORF125 in order to suppress the expression of the ORF125 protein.

Se supone que el producto de traducción del gen según la presente invención, después de translocarse a la mitocondria, se une al gen de esterilidad masculina en la mitocondria e inhibe la traducción, lo que provoca la reducción de la acumulación de la proteína causante de la esterilidad masculina citoplasmática y, de este modo, se revierte dicha esterilidad masculina citoplasmática en fertilidad. It is assumed that the translation product of the gene according to the present invention, after translocating to the mitochondria, binds to the male sterility gene in the mitochondria and inhibits translation, which causes the reduction of the accumulation of the protein causing the cytoplasmic male sterility and, thus, said cytoplasmic male sterility is reversed in fertility.

Ejemplo 12: Aislamiento del gen restaurador de la fertilidad de colza Kosena Example 12: Isolation of the Kosena rapeseed fertility restorative gene

La secuencia genómica del gen restaurador de la fertilidad se obtuvo a partir de la línea de colza (en adelante, colza Kosena) obtenida mediante la transferencia del gen restaurador de la fertilidad de rábano Kosena por fusión celular aplicando el método PCR. El ADN se extrajo de 0,1 g de una hoja de colza Kosena utilizando un kit de aislamiento de ADN (DNeasy plant mini) de Qiagen. Para amplificar el ADN, el 5’-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3’ (SEC ID nº: 30), que es la secuencia de nucleótidos de 1027 pb a 1059 pb de SEC ID nº: 1, se diseñó como cebador directo, y el 5’-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3’ (SEC ID nº: 31), que es la secuencia de nucleótidos de 7675 pb a 7651 pb de SEC ID nº: 1, se diseñó como cebador inverso. The genomic sequence of the fertility restorative gene was obtained from the rapeseed line (hereinafter, Kosena rapeseed) obtained by transferring the fertility restorative gene from Kosena radish by cell fusion using the PCR method. The DNA was extracted from 0.1 g of a Kosena rape leaf using a DNA isolation kit (DNeasy plant mini) from Qiagen. To amplify the DNA, 5'-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3 '(SEQ ID NO: 30), which is the nucleotide sequence of 1027 bp to 1059 bp of SEQ ID NO: 1, was designed as a direct primer, and the 5' -AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3 '(SEQ ID NO: 31), which is the nucleotide sequence of 7675 bp to 7651 bp of SEQ ID NO: 1, was designed as a reverse primer.

A 10 µl de solución de ADN de colza Kosena (50 ng/µl) se le añadieron 49 µl de agua esterilizada, 10 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 10 µl de MgCl2 25 mM, 16 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2 µl de solución de cebador inverso 10 µMy1 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 15 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Tras completar la reacción, se purificaron aproximadamente 6 kb del producto amplificado con la unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-PCR (Millipore). La secuencia de nucleótidos de 3306 pb de los nucleótidos 4280º a 7585º de SEC ID nº: 1 se determinó por un método convencional utilizando el producto purificado como plantilla (SEC ID nº: 15). Mediante la comparación de la secuencia genómica de nucleótidos obtenida a partir de colza Kosena con la secuencia obtenida a partir de rábano Yuanhong, se encontraron sustituciones de nucleótidos en el ADN en 7 pb de entre 3306 pb, y se reveló que presentan un alto grado de homología. To 10 µl of Kosena rapeseed DNA solution (50 ng / µl) was added 49 µl of sterile water, 10 µl of 10 x PCR PCR solution (Takara), 10 µl of 25 mM MgCl2, 16 µl of dNTP mixture 2.5 mM, 2 µl of 10 µM direct primer solution, 2 µl of 10 µM inverse primer solution and 1 µl of 5 units / µl of Takara LA Taq (Takara), followed by mixing. The DNA was amplified by repeating a cycle of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 15 minutes. The thermal cycler used was UNOII (Biometra). After completing the reaction, approximately 6 kb of the amplified product was purified with the Microcon-PCR membrane ultrafiltration unit (Millipore). The 3306 bp nucleotide sequence of nucleotides 4280 ° to 7585 ° of SEQ ID NO: 1 was determined by a conventional method using the purified product as a template (SEQ ID NO: 15). By comparing the genomic nucleotide sequence obtained from Kosena rapeseed with the sequence obtained from Yuanhong radish, nucleotide substitutions in DNA were found in 7 bp of 3306 bp, and it was revealed that they have a high degree of homology

Además, la secuencia de ADNc del gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena en la parte 3’ se obtuvo por RT-PCR y se confirmó que los intrones estaban unidos del mismo modo que en el rábano Yuanhong. A partir del brote de colza Kosena, se extrajo el ARN total por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. A partir de 1 µg de ARN total, se sintetizó el ADNc utilizando RNAsaH-transcriptasa inversa SUPERSCRIPT II (Invitrogen). Se utilizó 5’-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC3’ (SEC ID nº: 32) como cebador directo específico de la parte 3’ del gen restaurador de la fertilidad y 5’-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3’ (SEC ID nº: 33) como cebador inverso específico de la parte 3’ del gen restaurador de la fertilidad. El ADN se amplificó mediante la adición y mezclado de 14,9 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón de PCR 10 x (Takara), 1,5 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1,5 µl de solución 10 µM de cebador directo, 1,5 µl de solución 10 µM de cebador inverso y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq (Takara) a 1 µl de solución de ADNc de colza Kosena y la repetición 35 veces de un ciclo de 94ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se confirmó que los intrones del ADNc de la colza Kosena estaban unidos del mismo modo que en el rábano Yuanhong. Así, se puso de manifiesto que las sustituciones de bases de 7 pb encontradas en la comparación de las secuencias genómicas estaban presentes en 5444 pb a 5814 pb de SEC ID nº: 1 y no afectaron al empalme. In addition, the cDNA sequence of the Kosena rape fertility restorative gene in part 3 'was obtained by RT-PCR and it was confirmed that the introns were bound in the same way as in the Yuanhong radish. From the Kosena rapeseed outbreak, total RNA was extracted by the AGPC (guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform) method (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 to 166 ), which is a conventional method. From 1 µg of total RNA, the cDNA was synthesized using SUPERSCRIPT II reverse RNAsaH-transcriptase (Invitrogen). 5'-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC3 '(SEQ ID NO: 32) was used as the specific direct primer of the 3' part of the fertility restorative gene and 5'-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3 '(SEQ ID NO: 33) as the specific reverse primer of the 3 'part of the fertility restorative gene. The DNA was amplified by the addition and mixing of 14.9 µl of sterilized water, 2.5 µl of 10 x PCR buffer solution (Takara), 1.5 µl of 25 mM MgCl2, 2 µl of 2.5 dNTP mixture mM, 1.5 µl of 10 µM direct primer solution, 1.5 µl of 10 µM reverse primer solution and 0.1 µl of 5 units / µl of Takara Taq (Takara) to 1 µl of rapeseed cDNA solution Kosena and the repetition 35 times of a cycle of 94 ° C for 40 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes. The thermal cycler used was UNOII (Biometra). To 3 µl of the amplified product 1 µl of pGEM-Teasy vector (Promega), 5 µl of 2 x ligation buffer solution (Promega) and 1 µl of T4 DNA ligase (Promega) were added, and the mixture was allowed to stand at temperature ambient for 1 hour in order to bind the vector. Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) was transformed with this vector in order to obtain a clone. The nucleotide sequence of the clone obtained was determined by a conventional method and it was confirmed that the introns of the Kosena rape cDNA were bound in the same way as in the Yuanhong radish. Thus, it was revealed that the 7 bp base substitutions found in the comparison of the genomic sequences were present at 5444 bp to 5814 bp of SEQ ID NO: 1 and did not affect the splicing.

A partir de los resultados anteriores, se puso de manifiesto que el gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena se expresa de modo parecido a como lo hace en el rábano Yuanhong. La secuencia de ADNc que codifica únicamente la región de traducción se muestra en la SEC ID nº: 16. La secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 17) se obtuvo a partir de esta secuencia de ADNc. From the previous results, it was revealed that the fertility restorative gene of the Kosena rapeseed is expressed in a similar way as it does in the Yuanhong radish. The cDNA sequence encoding only the translation region is shown in SEQ ID NO: 16. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) was obtained from this cDNA sequence.

Ejemplo 13: Aislamiento de la secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de un rábano silvestre, Raphanus raphanistrum (en adelante, R. raphanistrum) Example 13: Isolation of the partial sequence of the fertility restorative gene of a wild radish, Raphanus raphanistrum (hereinafter, R. raphanistrum)

Se aisló una secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de R. raphanistrum a partir de un ADNc. A partial sequence of the fertility restorative gene of R. raphanistrum was isolated from a cDNA.

(Purificación de ARNm) (MRNA purification)

Se extrajo el ARN total del capullo de R. raphanistrum por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenolcloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. Se purificó ARN poliA+ del ARN total utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm. Total RNA from the cocoon of R. raphanistrum was extracted by the AGPC (guanidinium thiocyanate acid-phenolchloroform) method (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 to 166) a conventional method PolyA + RNA was purified from total RNA using the "mRNA purification kit" (Amersham Pharmacia) with an Origo cellulose column (dT) and used as mRNA.

(Aislamiento de la secuencia parcial de ADNc) (Isolation of the partial cDNA sequence)

El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech). The cDNA was synthesized from 1 µg of purified mRNA using the “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” kit (Clontech).

Se utilizó 5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’ (SEC ID nº: 34) como cebador directo específico del gen restaurador de la fertilidad y 5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’ (SEC ID nº: 35) como cebador inverso específico del gen restaurador de la fertilidad. 5'-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 '(SEQ ID NO: 34) was used as a specific direct primer of the fertility restorative gene and 5'-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3' (SEQ ID NO: 35) as a specific reverse primer of the restorative gene fertility.

A 1 µl de solución de ADNc de R. raphanistrum se le añadieron 14,4 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón Pyrobest PCR 10 x (Takara), 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2,5 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2,5 µl de solución de cebador inverso 10 µM y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Pyrobest ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado, y el ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Se añadieron y mezclaron 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq (Takara) a la solución de ADN amplificado. A continuación, se añadió el nucleótido adenina al terminal 3’ del ADN mediante incubación a 72ºC durante 10 minutos. A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se obtuvo la secuencia parcial de ADNc (SEC ID nº: 20). Además, se obtuvo la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 21) a partir de la secuencia de ADNc. To 1 µl of R. raphanistrum cDNA solution was added 14.4 µl of sterile water, 2.5 µl of 10 x Pyrobest PCR buffer solution (Takara), 2 µl of 2.5 mM dNTP mixture, 2.5 µl of 10 µM direct primer solution, 2.5 µl of 10 µM reverse primer solution and 0.1 µl of 5 units / µl of Pyrobest DNA polymerase (Takara), followed by mixing, and the DNA was amplified by repeating 30 times a cycle of 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds. The thermal cycler used was UNOII (Biometra). 0.1 µl of 5 units / µl of Takara Taq (Takara) was added and mixed to the amplified DNA solution. Next, the adenine nucleotide was added to the 3 ′ terminal of the DNA by incubation at 72 ° C for 10 minutes. To 3 µl of the amplified product 1 µl of pGEM-Teasy vector (Promega), 5 µl of 2 x ligation buffer solution (Promega) and 1 µl of T4 DNA ligase (Promega) were added, and the mixture was allowed to stand at temperature ambient for one hour in order to bind the vector. Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) was transformed with this vector in order to obtain a clone. The nucleotide sequence of the clone obtained was determined by a conventional method and the partial cDNA sequence was obtained (SEQ ID NO: 20). In addition, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 21) was obtained from the cDNA sequence.

Ejemplo 14: Aislamiento del gen restaurador de la fertilidad de colza Ogura Example 14: Isolation of the Ogura rapeseed fertility restorative gene

La secuencia de ADNc del gen restaurador de la fertilidad se aisló a partir de la línea de colza obtenida mediante la transferencia del gen restaurador de la fertilidad de rábano Ogura por cruce (en adelante, colza Ogura) aplicando el método 5’RACE y el método 3’RACE. The cDNA sequence of the fertility restorative gene was isolated from the rapeseed line obtained by transferring the fertility restorative gene from Ogura radish by crossing (hereinafter, Ogura rapeseed) using the 5'RACE method and the method 3'RACE.

(Purificación de ARNm) (MRNA purification)

Se extrajo el ARN total de los capullos de colza Ogura por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenolcloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. Se purificó ARN poliA+ utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia Corp.) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm. Total RNA was extracted from Ogura rapeseed buds by the AGPC (guanidinium thiocyanate acid-phenolchloroform) method (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 to 166) a conventional method PolyA + RNA was purified using the "mRNA purification kit" (Amersham Pharmacia Corp.) with an Origo cellulose column (dT) and used as mRNA.

El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech). 5’-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3’ (SEC ID nº: 36) se utilizó como cebador directo específico del gen restaurador de la fertilidad y CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3’ (SEC ID nº: 37) como cebador inverso específico del gen restaurador de la fertilidad. The cDNA was synthesized from 1 µg of purified mRNA using the “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” kit (Clontech). 5’-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3 ’(SEQ ID NO: 36) was used as a specific direct primer for the fertility restorative gene and CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3’ (SEQ ID No: 37) as a specific reverse primer for the fertility restorative gene.

A 1 µl de solución de ADNc de colza Ogura se le añadieron 14,4 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón Pyrobest PCR 10 x (Takara), 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2,5 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2,5 µl de solución de primer inverso 10 µM y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Pyrobest ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Se añadieron y mezclaron 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq a la solución de ADN amplificado y a continuación se añadió el nucleótido adenina al terminal 3’ del ADN mediante incubación a 72ºC durante 10 minutos. A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se obtuvieron cuatro secuencias parciales de ADNc. Sobre la base de la información de las cuatro secuencias parciales obtenidas, se diseñaron cebadores en cuatro partes comunes para 5’RACE y 3’RACE, y se aisló cada ADNc. To 1 µl of Ogura rape cDNA solution was added 14.4 µl of sterilized water, 2.5 µl of 10 x Pyrobest PCR buffer solution (Takara), 2 µl of 2.5 mM dNTP mixture, 2.5 µl of 10 µM direct primer solution, 2.5 µl of 10 µM first inverse solution and 0.1 µl of 5 units / µl of Pyrobest DNA polymerase (Takara), followed by mixing. The DNA was amplified by repeating a cycle of 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds. The thermal cycler used was UNOII (Biometra). 0.1 µl of 5 units / µl of Takara Taq were added and mixed to the amplified DNA solution and then the adenine nucleotide was added to the 3'-terminal of the DNA by incubation at 72 ° C for 10 minutes. To 3 µl of the amplified product 1 µl of pGEM-Teasy vector (Promega), 5 µl of 2 x ligation buffer solution (Promega) and 1 µl of T4 DNA ligase (Promega) were added, and the mixture was allowed to stand at temperature ambient for 1 hour in order to bind the vector. Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) was transformed with this vector in order to obtain a clone. The nucleotide sequence of the clone obtained was determined by a conventional method and four partial cDNA sequences were obtained. Based on the information of the four partial sequences obtained, primers were designed in four common parts for 5’RACE and 3’RACE, and each cDNA was isolated.

(Aislamiento de ADNc por 5’RACE y 3’RACE) (CDNA isolation by 5’RACE and 3’RACE)

Se aisló ADNc del modo descrito anteriormente y llevando a cabo 5’RACE 3’RACE con el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech). Como cebadores específicos de gen, se utilizaron CDNA was isolated in the manner described above and performing 5’RACE 3’RACE with the “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” kit (Clontech). As gene specific primers, they were used

y Y

para 5’RACE, y para 3’-RACE. for 5’RACE, and for 3’-RACE.

En 5’RACE, el PCR se llevó a cabo dos veces para obtener ADN. A 2 µl de solución de ADNc de colza Ogura diluida 250 veces se le añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 9907F, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 70ºC durante 3 minutos, y 25 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 3 minutos. La solución de ADN obtenida se diluyó 100 veces y a 2 µl de la misma se añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 5’ ogu-1, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 70ºC durante 3 minutos, y 25 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 3 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). In 5’RACE, the PCR was carried out twice to obtain DNA. To 2 µl of Ogura rapeseed cDNA solution diluted 250 times was added 8.6 µl of sterilized water, 2 µl of 10 x PCR PCR solution (Takara), 2 µl of 25 mM MgCl2, 3.2 µl of mixture 2.5 mM dNTP, 1 µl of 10 µM primer solution of SEQ ID NO: 9907F, 1 µl of 10 µM solution of adapter primer (“Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE” kit, Clontech) and 0.2 µl of 5 units / µl of Takara LA Taq (Takara), followed by mixing. The DNA was amplified by repeating a 98 ° C cycle for 5 seconds and 72 ° C for 3 minutes, 5 times a 98 ° C cycle for 5 seconds and 70 ° C for 3 minutes, and 25 times a 98 ° C cycle for 5 seconds and 68 ° C for 3 minutes. . The DNA solution obtained was diluted 100 times and 2 µl of it was added 8.6 µl of sterilized water, 2 µl of 10 x LA PCR buffer solution (Takara), 2 µl of 25 mM MgCl2, 3.2 µl of 2.5 mM dNTP mixture, 1 µl of 10 µM primer solution of SEQ ID NO: 5 'ogu-1, 1 µl of 10 µM solution of adapter primer (“Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE” kit, Clontech ) and 0.2 µl of 5 units / µl of Takara LA Taq (Takara), followed by mixing. The DNA was amplified by repeating a 98 ° C cycle for 5 seconds and 72 ° C for 3 minutes, 5 times a 98 ° C cycle for 5 seconds and 70 ° C for 3 minutes, and 25 times a 98 ° C cycle for 5 seconds and 68 ° C for 3 minutes. . The thermal cycler used was UNOII (Biometra).

En 3’RACE, a 2 µl de solución de ADNc de colza Ogura diluida 50 veces se añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 3’ ogu-1, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 35 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 63ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. In 3'RACE, 8.6 µl of sterilized water rape cDNA was added to 2 µl of sterilized water 50 times, 2 µl of 10 x PCR PCR solution (Takara), 2 µl of 25 mM MgCl2, 3, 2 µl of 2.5 mM dNTP mixture, 1 µl of 10 µM primer solution of SEQ ID NO: 3 'ogu-1, 1 µl of 10 µM solution of primer adapter (kit “Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE ”, Clontech) and 0.2 µl of 5 units / µl of Takara LA Taq (Takara), followed by mixing. The DNA was amplified by repeating a cycle of 98 ° C for 5 seconds, 63 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes.

A 3 µl del producto amplificado se le añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. Se determinó la secuencia de nucleótidos del clon obtenido y a continuación se obtuvieron la secuencia 5’RACE y la secuencia 3’RACE correspondientes a las anteriores 4 secuencias parciales de ADNc. La secuencia de ADNc de longitud completa se obtuvo por combinación de cada secuencia. Entre estas, la secuencia que tiene la mayor homología con la secuencia de ADNc de rábano Yuanhong se identificó como el gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena (SEC ID nº: 18). Además, se obtuvo la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 19) a partir de la secuencia de ADNc. To 3 µl of the amplified product was added 1 µl of pGEM-Teasy vector (Promega), 5 µl of 2 x ligation buffer solution (Promega) and 1 µl of T4 DNA ligase (Promega), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour in order to bind the vector. Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) was transformed with this vector in order to obtain a clone. The nucleotide sequence of the clone obtained was determined and then the 5’RACE sequence and the 3’RACE sequence corresponding to the previous 4 partial cDNA sequences were obtained. The full length cDNA sequence was obtained by combining each sequence. Among these, the sequence that has the highest homology with the Yuanhong radish cDNA sequence was identified as the fertility restorative gene of the Kosena rape (SEQ ID NO: 18). In addition, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) was obtained from the cDNA sequence.

Ejemplo 15: Análisis del gen restaurador de la fertilidad Example 15: Analysis of the fertility restorative gene

Para los genes individuales restauradores de la fertilidad obtenidos por el método anterior, se llevaron a cabo análisis utilizando el software de análisis de genes “Mac Vector 6.5” (Oxford Molecular Ltd. ) para la homología de la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos, y utilizando la Protein Families Database of Alignments and HMNs disponible a través de Sanger Institute, Reino Unido, para el análisis de motivos. For individual fertility-restoration genes obtained by the above method, analyzes were carried out using the "Mac Vector 6.5" gene analysis software (Oxford Molecular Ltd.) for homology of the cDNA sequence and amino acid sequence , and using the Protein Families Database of Alignments and HMNs available through the Sanger Institute, United Kingdom, for motive analysis.

Todos los genes Rf derivados de rábano Yuanhong, colza Kosena y colza Ogura según la presente invención tienen 16 motivos PPR, y estos grupos de motivos PPR se dividen en 3 bloques de 5, 7 y 4 motivos desde el extremo amino, y el cuarto aminoácido situado en el segundo motivo PPR desde el extremo amino es asparagina. El fragmento parcial derivado de Raphanus raphanistrum también se analizó mediante su aplicación a la parte correspondiente (94º a 264º de la SEC ID nº: 26) de la secuencia anterior, y se puso de manifiesto que tenía una parte correspondiente a los motivos PPR primero a sexto desde el extremo amino, y los grupos de motivos PPR y el cuarto aminoácido situado en el segundo motivo PPR desde el extremo amino también mostró las características descritas anteriormente. All Rf genes derived from Yuanhong radish, Kosena rape and Ogura rape according to the present invention have 16 PPR motifs, and these groups of PPR motifs are divided into 3 blocks of 5, 7 and 4 motifs from the amino terminus, and the fourth amino acid located in the second PPR motif from the amino end is asparagine. The partial fragment derived from Raphanus raphanistrum was also analyzed by applying it to the corresponding part (94º to 264º of SEQ ID NO: 26) of the previous sequence, and it was revealed that it had a part corresponding to the PPR motifs first to sixth from the amino end, and the groups of PPR motifs and the fourth amino acid located in the second PPR motif from the amino terminus also showed the characteristics described above.

Además, entre los 3 genes restauradores de la fertilidad obtenidos a partir de rábano Yuanhong, colza Kosena y colza Ogura, y la proteína (SEC ID nº: 26) y el gen que la codifica (SEC ID nº: 27) según la presente invención, que se obtuvieron de resultas del análisis de la secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de R. raphanistrum, el rábano Yuanhong muestra una homología muy alta con la colza Kosena. Es decir, las secuencias de aminoácidos muestran un grado elevado de homología del 99,6% (sólo 3 aminoácidos son diferentes) y las secuencias de nucleótidos muestran un grado elevado de homología del 99,7%. En consecuencia, la proteína que presenta una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 29 y el gen (SEC ID nº: 25) que la codifica son particularmente preferentes. In addition, among the 3 fertility restorative genes obtained from Yuanhong radish, Kosena and Ogura rape, and the protein (SEQ ID NO: 26) and the gene that encodes it (SEQ ID NO: 27) according to the present invention , which were obtained as a result of the analysis of the partial sequence of the fertility-restoring gene of R. raphanistrum, the Yuanhong radish shows a very high homology with the Kosena rape. That is, the amino acid sequences show a high degree of homology of 99.6% (only 3 amino acids are different) and the nucleotide sequences show a high degree of homology of 99.7%. Consequently, the protein that has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and the gene (SEQ ID NO: 25) that encodes it are particularly preferred.

Por otro lado, la comparación de la colza Ogura con el rábano Yuanhong y de la colza Ogura con la colza Kosena puso de manifiesto un alto grado de homología. Cada homología en la secuencia de aminoácidos mostró un 92,0% en la comparación de la colza Ogura con el rábano Yuanhong y un 91,6% en la comparación de la colza Ogura con la colza Kosena. La comparación de la secuencia de nucleótidos puso de manifiesto aproximadamente un 95% en ambos casos. Estos valores son menores que los existentes entre el rábano Yuanhong y la colza Kosena. On the other hand, the comparison of the Ogura rape with the Yuanhong radish and the Ogura rape with the Kosena rape showed a high degree of homology. Each homology in the amino acid sequence showed 92.0% in the comparison of the Ogura rape with the Yuanhong radish and 91.6% in the comparison of the Ogura rape with the Kosena rape. The comparison of the nucleotide sequence revealed approximately 95% in both cases. These values are lower than those between the Yuanhong radish and the Kosena rapeseed.

Industrial applicability

Según la presente invención, se aisló el gen Rf, particularmente el gen Rf1 derivado de rábano, y se determinó la estructura del mismo. Según la presente invención, se da a conocer un medio para establecer una línea 5 restauradora de la fertilidad en la colza utilizando el gen Rf aislado. According to the present invention, the Rf gene, particularly the radish-derived Rf1 gene, was isolated, and its structure was determined. According to the present invention, a means for establishing a fertility restorative line in rapeseed using the isolated Rf gene is disclosed.

Sequence listing

<110> Mitsubishi Chemical Corporation 10 <110> Mitsubishi Chemical Corporation 10

<120> Proteína implicada en la restauración de la fertilidad en caso de esterilidad masculina citoplasmática y gen que la codifica <120> Protein involved in fertility restoration in case of male cytoplasmic sterility and gene that encodes it

<130> EP21009EP 15 <130> EP21009EP 15

<140> EP 02 720 587.1 <140> EP 02 720 587.1

<141> 2002-04-24 <141> 2002-04-24

<150> JP2001128008 20 <151> 2001-04-25 <150> JP2001128008 20 <151> 2001-04-25

<150> JP2001202082 <150> JP2001202082

<151> 2001-07-03 25 <150> JP2002020083 <151> 2001-07-03 25 <150> JP2002020083

<151> 2002-01-29 <151> 2002-01-29

<160> 39 30 <170> PatentIn Ver. 2.1 <160> 39 30 <170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 <210> 1

<211> 8553 <211> 8553

<212> ADN 35 <213> Raphanus sativus <212> DNA 35 <213> Raphanus sativus

<400> 1 <400> 1

<210> 2 <210> 2

<211> 2064 <211> 2064

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<400> 2 <400> 2

<210> 3 15 <211> 687 <210> 3 15 <211> 687

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<400> 3 20 <400> 3 20

<210> 4 <210> 4

<211> 25 <211> 25

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético <223> Description of the artificial sequence: synthetic DNA

<400> 4 <400> 4

gaagcaaaaa agaaaacgag cagag gaagcaaaaa agaaaacgag cagag

<210> 5 <210> 5

<211> 25 <211> 25

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<400> 5 <400> 5

ccaaaaatcc gaaatccgaa tagac ccaaaaatcc gaaatccgaa tagac: 25 25

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético <220> <223> Description of the artificial sequence: synthetic DNA

<400> 6 <400> 6

ctcggctctg ggtttagtga ctcggctctg ggtttagtga: 20 twenty

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 7 <400> 7

tccacaaacc ctagccaaca tccacaaacc ctagccaaca: 20 twenty

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 8 <400> 8

gcttatgctt ctctggttcg cctc gcttatgctt ctctggttcg cctc: 24 24

<210> 9 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 9 <400> 9

ctcagttttc gtcaccttac acaatgc ctcagttttc gtcaccttac acaatgc: 27 27

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 10 <400> 10

gattcctttc tcttgcattt cag gattcctttc tcttgcattt cag: 23 2. 3

<210> 11 <211> 23 <212 ADN <210> 11 <211> 23 <212 DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<400> 11 <400> 11

atctcgtcct ttaccttctg tgg atctcgtcct ttaccttctg tgg: 23 2. 3

<210> 12 <211> 18 <212 > ADN <213> Secuencia artificial <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 12 <400> 12

cgggatccgc tcacaatt cgggatccgc tcacaatt: 18 18

<210> 13 <211> 100 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 13 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 13 <400> 13

<210> 14 <210> 14

<211> 100 <211> 100

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<400> 14 <400> 14

<210> 15 <210> 15

<211> 3306 <211> 3306

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<400> 15 <400> 15

<210> 16 <210> 16

<211> 2064 <211> 2064

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<400> 16 <400> 16

<210> 17 <210> 17

<211> 688 <211> 688

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<400> 17 <400> 17

5 10 5 10: <210> 18 <211> 2073 <212> ADN <213> Raphanus sativus. <210> 18 <211> 2073 <212> DNA <213> Raphanus sativus.

41 41

<400> 18 <400> 18

5 5

<210> 19 <210> 19

<211> 691 <211> 691

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

10 10

<400> 19 <400> 19

<210> 20 <210> 20

<211> 516 <211> 516

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus raphanistrum <213> Raphanus raphanistrum

<400> 20 <400> 20

<210> 21 <210> 21

<211> 171 <211> 171

<212> <212>: PRT 15 <213> Raphanus raphanistrum PRT 15 <213> Raphanus raphanistrum

<400> 21 <400> 21

<210> 22 <210> 22

<211> 2073 <211> 2073

<212> <212>: ADN 25 <213> Raphanus DNA 25 <213> Raphanus

<400> 22 <400> 22

<210> 24 <210> 24

<211> 2064 <211> 2064

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus <213> Raphanus

<400> 24 <400> 24

<210> 25 <210> 25

<211> 2064 <211> 2064

<212> <212>: ADN 15 <213> Raphanus. DNA 15 <213> Raphanus.

5 5

<210> 23 <210> 23

<211> 2073 <211> 2073

<212> ADN <212> DNA

<213> Raphanus <213> Raphanus

10 10

<400> 23 <400> 23

<400> 25 <400> 25

<210> 26 <210> 26

<211> 690 <211> 690

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus <213> Raphanus

<220> <220>

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 16 <222> 16

<223> Glu o Val <223> Glu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 36 <222> 36

<223> Arg o ninguno <223> Arg or none

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 37 <222> 37

<223> Asp o ninguno <223> Asp or none

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 95 <222> 95

<223> Glu o Lys <223> Glu or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 99 <222> 99

<223> leu o Val <223> leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 104 <222> 104

<223> Tyr o His <223> Tyr or His

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 105 <222> 105

<223> Gln o Lys <223> Gln or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 109 <222> 109

<223> Arg o Met <223> Arg or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 110 <222> 110

<223> Lys o Arg <223> Lys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 111 <222> 111

<223> Gln o Arg <223> Gln or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 113 <222> 113

<223> Arg o Pro <223> Arg or Pro

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 116 <222> 116

<223> Ile, Ala o Val <223> Ile, Ala or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 142 <222> 142

<223> Leu o Ile <221> Xaa <223> Leu or Ile <221> Xaa

<222> 152 <222> 152

<223> Val o Ala <223> Val or Ala

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 155 <222> 155

<223> Thr o Asn <223> Thr or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 163 <222> 163

<223> Val, o Leu <223> Val, or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 164 <222> 164

<223> Glu o Asp <223> Glu or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 165 <222> 165

<223> Asp, Asn o Lys <223> Asp, Asn or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 167 <222> 167

<223> Val o Gly <223> Val or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 172 <222> 172

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 173 <222> 173

<223> Leu o Phe <223> Leu or Phe

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 186 <222> 186

<223> Val o Ile <223> Val or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 187 <222> 187

<223> Val o Ile <223> Val or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 198 <222> 198

<223> Arg o Tyr <223> Arg or Tyr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 202 <222> 202

<223> Ile o Val <223> Ile or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 213 <222> 213

<223> Met o Leu <223> Met or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 220 <222> 220

<223> Thr o Asp <223> Thr or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 234 <222> 234

<223> Lys o Met <223> Lys or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 250 <222> 250

<223> Val o Leu <223> Val or Leu

<221> Xaa <222> 254 <221> Xaa <222> 254

<223> Ile o Lys <223> Ile or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 276 <222> 276

<223> Ala o Ser <223> Wing or Being

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 297 <222> 297

<223> Ser o Cys <223> Ser or Cys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 300 <222> 300

<223> Val o Asn <223> Val or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 309 <222> 309

<223> Ser o Ile <223> Be or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 389 <222> 389

<223> Ala o Pro <223> Ala or Pro

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 396 <222> 396

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 397 <222> 397

<223> Leu o Val <223> Leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 398 <222> 398

<223> Ile o Phe <223> Ile or Phe

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 408 <222> 408

<223> Cys o Arg <223> Cys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 426 <222> 426

<223> Thr o Ala <223> Thr or Ala

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 431 <222> 431

<223> Asp o Asn <223> Asp or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 433 <222> 433

<223> Thr o Val <223> Thr or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 443 <222> 443

<223> Tyr o Cys <223> Tyr or Cys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 444 <222> 444

<223> Leu o Gln <223> Leu or Gln

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 449 <222> 449

<223> Asn o Thr <223> Asn or Thr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 456 <222> 456

<223> Gln o His <223> Gln or His

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 463 <222> 463

<223> Leu o Val <223> Leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 466 <222> 466

<223> Asp o Asn <223> Asp or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 467 <222> 467

<223> Ile o Val <223> Ile or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 471 <222> 471

<223> Asp o Ser <223> Asp or Ser

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 487 <222> 487

<223> Leu o Trp <223> Leu or Trp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 489 <222> 489

<223> Met o Leu <223> Met or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 498 <222> 498

<223> Lys o Met <223> Lys or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 537 <222> 537

<223> Glu o Lys <223> Glu or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 591 <222> 591

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 618 <222> 618

<223> Ala o Thr <223> Ala or Thr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 626 <222> 626

<223> Cys o Arg <223> Cys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 630 <222> 630

<223> Lys o Asn <223> Lys or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 652 <222> 652

<223> Asp o Gly <223> Asp or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 653 <222> 653

<223> Thr o Ile <223> Thr or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 658 <222> 658

<223> Asn o Ser <223> Asn or Ser

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 672 <222> 672

<223> Ala o Thr <223> Ala or Thr

<221> Xaa <222> 678 <221> Xaa <222> 678

<223> Lys o Glu <223> Lys or Glu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 683 <222> 683

<223> Met o Val <223> Met or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 684 <222> 684

<223> Asp o Gly <223> Asp or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 685 <222> 685

<223> Leu o Tyr <223> Leu or Tyr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 686 <222> 686

<223> Ser o Gln <223> Ser or Gln

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 687 <222> 687

<223> Phe o Leu <223> Phe or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 688 <222> 688

<223> Gly o Glu <223> Gly or Glu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 689 <222> 689

<223> Gly o Asp <223> Gly or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 690 <222> 690

<223> Glu o ninguno <223> Glu or none

<400> 26 <400> 26

<210> 27 <210> 27

<211> 690 <211> 690

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus <213> Raphanus

<220> <220>

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 16 <222> 16

<223> Glu o Val <223> Glu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 36 <222> 36

<223> Arg o ninguno <223> Arg or none

<221> Xaa <221> Xaa

<223> <223>: 37 37

<223> <223>: Asp o ninguno Asp or none

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 95 <222> 95

<223> Glu o Lys, <223> Glu or Lys,

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 99 <222> 99

<223> Leu o Val <223> Leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 104 <222> 104

<223> Tyr o His <223> Tyr or His

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 105 <222> 105

<223> Gln o Lys <223> Gln or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 109 <222> 109

<223> Arg o Met <223> Arg or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 110 <222> 110

<223> Lys o Arg <223> Lys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 111 <222> 111

<223> Gln o Arg <223> Gln or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 113 <222> 113

<223> Arg o Pro <221> Xaa <223> Arg or Pro <221> Xaa

<222> 116 <222> 116

<223> Ile o Ala <223> Ile or Ala

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 142 <222> 142

<223> Leu o Ile <223> Leu or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 165 <222> 165

<223> Asp o Asn <223> Asp or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 167 <222> 167

<223> Val o Gly <223> Val or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 172 <222> 172

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 173 <222> 173

<223> Leu o Phe <223> Leu or Phe

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 276 <222> 276

<223> Ala o Ser <223> Wing or Being

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 297 <222> 297

<223> Ser o Cys <223> Ser or Cys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 300 <222> 300

<223> Val o Asn <223> Val or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 309 <222> 309

<223> Ser o Ile <223> Be or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 389 <222> 389

<223> Ala o Pro <223> Ala or Pro

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 396 <222> 396

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 397 <222> 397

<223> Leu o Val <223> Leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 398 <222> 398

<223> Ile o Phe <223> Ile or Phe

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 408 <222> 408

<223> Cys o Arg <223> Cys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 426 <222> 426

<223> Thr o Ala <223> Thr or Ala

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 431 <222> 431

<223> Asp o Asn <223> Asp or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 433 <222> 433

<223> Thr o Val <223> Thr or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 443 <222> 443

<223> Tyr o Cys <223> Tyr or Cys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 444 <222> 444

<223> Leu o Gln <223> Leu or Gln

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 449 <222> 449

<223> Asn o Thr <223> Asn or Thr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 456 <222> 456

<223> Gln o His <223> Gln or His

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 463 <222> 463

<223> Leu o Val <223> Leu or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 466 <222> 466

<223> Asp o Asn <223> Asp or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 467 <222> 467

<223> Ile o Val <223> Ile or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 471 <222> 471

<223> Asp o Ser <223> Asp or Ser

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 487 <222> 487

<223> Leu o Trp <223> Leu or Trp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 489 <222> 489

<223> Met o Leu <223> Met or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 498 <222> 498

<223> Lys o Met <223> Lys or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 537 <222> 537

<223> Glu o Lys <223> Glu or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 591 <222> 591

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 618 <222> 618

<223> Ala o Thr <223> Ala or Thr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 626 <222> 626

<223> Cys o Arg <223> Cys or Arg

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 630 <222> 630

<223> Lys o Asn <223> Lys or Asn

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 652 <222> 652

<223> Asp o Gly <223> Asp or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 653 <222> 653

<223> Thr o Ile <223> Thr or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 658 <222> 658

<223> Asn o Ser <223> Asn or Ser

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 672 <222> 672

<223> Ala o Thr <223> Ala or Thr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 678 <222> 678

<223> Lys o Glu <223> Lys or Glu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 683 <222> 683

<223> Met o Val <223> Met or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 684 <222> 684

<223> Asp o Gly <223> Asp or Gly

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 685 <222> 685

<223> Leu o Tyr <223> Leu or Tyr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 686 <222> 686

<223> Ser o Gln <223> Ser or Gln

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 687 <222> 687

<223> Phe o Leu <223> Phe or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 688 <222> 688

<223> Gly o Glu <223> Gly or Glu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 689 <222> 689

<223> Gly o Asp <223> Gly or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 690 <222> 690

<223> Glu o ninguno <223> Glu or none

<400> 27 <400> 27

<210> 28 <210> 28

<211> 687 <211> 687

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<210> 28 <210> 28

<211> 687 <211> 687

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus <213> Raphanus

<220> <220>

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 111 <222> 111

<223> Arg o Pro <223> Arg or Pro

<221> Xaa <221> Xaa

<222> <222>: 114 114

<222> <222>: Ile o Val Ile or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 140 <222> 140

<223> Leu o Ile <223> Leu or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 150 <222> 150

<223> Val o Ala <223> Val or Ala

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 153 <222> 153

<223> Thr o Asn <223> Thr or Asn

<221> Xaa <222> 161 <221> Xaa <222> 161

<223> Val o Leu <223> Val or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 162 <222> 162

<223> Glu o Asp <223> Glu or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 163 <222> 163

<223> Asp o Lys <223> Asp or Lys

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 170 <222> 170

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 171 <222> 171

<223> Leu o Phe <223> Leu or Phe

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 184 <222> 184

<223> Val o Ile <223> Val or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 185 <222> 185

<223> Val o Ile <223> Val or Ile

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 196 <222> 196

<223> Arg o Tyr <223> Arg or Tyr

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 200 <222> 200

<223> Ile o Val <223> Ile or Val

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 211 <222> 211

<223> Met o Leu <223> Met or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 218 <222> 218

<223> Thr o Asp <223> Thr or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 232 <222> 232

<223> Lys o Met <223> Lys or Met

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 248 <222> 248

<223> Val o Leu <223> Val or Leu

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 252 <222> 252

<223> Ile o Lys <223> Ile or Lys

<400> 28 <400> 28

<212> PRT <212> PRT

<213> Raphanus sativus <213> Raphanus sativus

<220> 10 <221> Xaa <220> 10 <221> Xaa

<222> 140 <222> 140

<223> Leu o Ile <223> Leu or Ile

<221> Xaa 15 <222> 170 <221> Xaa 15 <222> 170

<223> Asn o Asp <223> Asn or Asp

<221> Xaa <221> Xaa

<222> 171 20 <223> Leu o Phe <222> 171 20 <223> Leu or Phe

<400> 29 <400> 29

<210> 30 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 30 <400> 30

acataaaaat cactagatac ttgacatgga ggc acataaaaat cactagatac ttgacatgga ggc: 33 33

<210> 31 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 31 <400> 31

aagaggagga agatggcatc acagc aagaggagga agatggcatc acagc: 25 25

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 32 <400> 32

tggagtaaag aggaactaaa aagggc tggagtaaag aggaactaaa aagggc: 26 26

<210> 33 <210> 33

<211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 33 <400> 33

cagacaatag acgcataaaa ggc cagacaatag acgcataaaa ggc: 23 2. 3

<210> 34 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 34 <400> 34

gattcctttc tcttgcattt cag gattcctttc tcttgcattt cag: 23 2. 3

<210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 35 <400> 35

atctcgtcct ttaccttctg tgg atctcgtcct ttaccttctg tgg: 23 2. 3

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 36 <400> 36

gatccatgca tttgtcaagg gatccatgca tttgtcaagg: 20 twenty

<210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 37 <400> 37

catttgtgta gcctcatcta gg catttgtgta gcctcatcta gg: 22 22

<210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 38 <400> 38

5 10 5 10: gtccggagag cagcccttgg tag <210> 39 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético 23 gtccggagag cagcccttgg tag <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthetic DNA 2. 3

15 fifteen: <400> 39 tcatcgtata attcttcagc ctc 23 <400> 39 tcatcgtata attcttcagc ctc 2. 3

Claims

1. Isolated DNA encoding a protein involved in the restoration of fertility in a plant that presents cytoplasmic male sterility, selected from the group consisting of:

(1) (one): un ADN aislado que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; an isolated DNA encoding a protein that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

(2) (2): un ADN aislado que presenta una homología 90% o superior con respecto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; an isolated DNA having a 90% or higher homology with respect to a DNA sequence encoding a protein that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

(3) (3): un ADN aislado que presenta una homología de 90% con la secuencia de ADN de SEC ID nº: 2. an isolated DNA having a homology of 90% with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2.

2. 2.: ADN aislado según la reivindicación 1 que presenta una homología de 95% con la secuencia de ADN de SEC ID nº: 2. Isolated DNA according to claim 1 having a 95% homology with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2.

3. 3.: ADN aislado según la reivindicación 2, que es SEC ID nº: 2. Isolated DNA according to claim 2, which is SEQ ID NO: 2.

4. Four.: ADN aislado de SEC ID nº: 1. DNA isolated from SEQ ID NO: 1.

5. 5.: Proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, que está codificada por un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 3. Protein involved in the restoration of fertility in an individual presenting cytoplasmic male sterility, which is encoded by a DNA according to one of claims 1 to 3.

6. 6.: Proteína según la reivindicación 4, que presenta la SEC ID nº: 3. Protein according to claim 4, which has SEQ ID NO: 3.

7. 7.: Vector que contiene el ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4. Vector containing the isolated DNA according to one of claims 1 to 4.

8. 8.: Planta transformante o células de la misma transformada con el ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector según la reivindicación 7. Transforming plant or cells thereof transformed with the isolated DNA according to one of claims 1 to 4 or a vector according to claim 7.

9. 9.: Planta transformante o células de la misma según la reivindicación 8, que es una planta Brassica. Transforming plant or cells thereof according to claim 8, which is a Brassica plant.

10. 10.: Utilización de un ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la restauración de la fertilidad en la planta que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Use of an isolated DNA according to one of claims 1 to 4 for the restoration of fertility in the plant presenting cytoplasmic male sterility.