JP4102099B2

JP4102099B2 - Proteins involved in recovery from cytoplasmic male sterility to feasibility and genes encoding the same

Info

Publication number: JP4102099B2
Application number: JP2002121715A
Authority: JP
Inventors: 順今村; 英也藤本; りつ子今井; 信也肥塚; 隆子酒井; 孝彦早川
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2022-04-24
Also published as: JP2003289879A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞質雄性不稔から可稔への回復に関与する遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、一代雑種（以下、Ｆ1と略す）品種開発のために利用される細胞質雄性不稔形質（以下、ｃｍｓと略すことがある）の回復に関与する遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター及び形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
禾穀類、野菜などの農作物では、１）雑種強勢による優れた農業形質、２）収穫物の均一性、３）次世代で遺伝形質が分離するため品種育成者の利益が保護される、などの特徴のもと、Ｆ1品種の開発が盛んであり、多くの主要作物で実用化されている。
【０００３】
Ｆ1品種の種子を生産するための方法の一つとしては、細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）系統とその雄性不稔を回復する（以下、Ｒｆと略すことがある）系統からなるｃｍｓ／Ｒｆ採種システムがあり、例えばイネ、ソルガム、トウモロコシ等の禾穀類や例えばひまわりなどの油量作物で開発されているが、これらはいずれも、交配あるいは細胞融合の手法を用いて開発されたものである。
【０００４】
一方、アブラナ科では、自家不和合性を用いたＦ1採種システムが広く利用されているが、ナタネに関しては、安定な自家不和合性のないため、ｃｍｓ系統とＲｆ系統を利用したＦ1採種システムが求められている。
【０００５】
これに対して、近年、コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔（コセナｃｍｓ）やオグラダイコン由来の細胞質雄性不稔（オグラｃｍｓ）をナタネで利用する研究がなされている。両ｃｍｓ遺伝子に関しては細胞質小器官であるミトコンドリアのゲノムにコードされており、塩基配列についても知られているが、ダイコンは、分子生物学的な研究が進んでおらず、遺伝子単離に必要なマーカーもほとんど知られていない状態であるため、核からの遺伝子の単離が困難であり、Ｒｆに関しては、ダイコンの稔性回復系統から交配あるいは細胞融合の手法を使いナタネに導入されているのみである。
【０００６】
さらに、Ｒｆ遺伝子に関しては、植物の各ｃｍｓ系統により、１つ又は複数の回復遺伝子が存在する。ダイコンにおいては、Ｒｆ１遺伝子及びＲｆ２遺伝子が同時に存在することが稔性回復に必要であり、加えて、Ｒｆ１遺伝子が、ダイコンのｃｍｓ原因タンパク質として知られている、ミトコンドリア内のＯＲＦ１２５タンパク質（M. Iwabuchi et al. Plant Mol. Biol. 39:183-188, 1999）の蓄積量を大幅に減少させることが知られている。（育種学雑誌４７（別１）Ｐ１８６，１９９７、育種学雑誌４８（別１）Ｐ１９７、１９９８）。
【０００７】
またナタネにおいては、遺伝解析実験により、交配または細胞融合によって導入されたダイコンのＲｆ１遺伝子が、ｃｍｓ原因タンパク質として知られているＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質(M. Grelon et al. Mol. Gen. Genet. 243:540-547)の蓄積量を減少させること、これらＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量の減少と稔性が回復する現象は完全に一致していることが知られている（N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000）。つまり、ナタネ雄性不稔系統で稔性が回復するには、ＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量の減少が必須であり、そのために、Ｒｆ１遺伝子は重要な遺伝子である。
しかしながら、一方でＲｆ遺伝子の塩基配列については、トウモロコシのｃｍｓの一つであるＴ―サイトプラズムに対する回復遺伝子の一つであるＲｆ２遺伝子のみについては同定、単離されているが、他の植物でＲｆ遺伝子の塩基配列については、全く知られていない。
【０００８】
【発明が解決するための課題】
交配あるいは細胞融合によりオグラダイコン由来のＲｆ１遺伝子を導入したナタネ回復系統とその系統を父親として作出されたＦ1品種は、グルコシノレート（以下ＧＳＬと略す）含量が、規制値より高くなることがわかり、実用上問題となっている。これは、ＧＳＬの生合成に関与するダイコン由来の遺伝子がＲｆ１遺伝子の近傍に存在し、遺伝的に強連鎖しているため、ナタネの回復系統（Ｒｆ系統）のＧＳＬの含量が上昇するものと考えられている。ＧＳＬはナタネの搾油かすに含まれ、それを飼料として動物に与えたとき、甲状腺肥大をもたらすことが知られているため、ナタネ種子のＧＳＬ含量は、育種段階において、北米では18μmole/g ヨーロッパでは20μmole/g以下にすることが求められている。
【０００９】
さらに、近年では、除草剤耐性等の機能を遺伝子組換えにより付加した植物の開発も活発であり、これらの植物を効率的に創出するためには、交配あるいは細胞融合により得られたナタネ回復系の存在のみでは不十分であり、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子の単離が望まれていた。
【００１０】
即ち、本発明は、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子を単離してその構造を同定することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、単離したＲｆ遺伝子を利用してナタネ回復系統を確立する手段を提供することを解決すべき課題とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ダイコン及びナタネからＲｆ１遺伝子をクローニングすることに成功し、本課題を解決するに至った。
すなわち、本発明によれば、Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、該ＰＰＲモチーフ群は３つ以上のブロックに分割されており、該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側のブロックは４つのＰＰＲモチーフを有することを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が提供される。
【００１２】
上記タンパク質の好ましい態様によれば、
ＰＰＲモチーフの数が１４〜１６個であるタンパク質；
ＰＰＲモチーフ群が３つのブロックに分割されており、アミノ末端（N末端）側から順に各ブロックが５個、７個及び４個のＰＰＲモチーフを有するタンパク質；
アミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がセリン、スレオニン又はシステイン以外であるタンパク質；
アミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンのいずれかであるタンパク質；並びに
さらに、アミノ末端にミトコンドリアに移行するためのシグナルペプチド配列を有するか又はカルボキシ末端に−LysAspGluLeu−からなる配列を有するタンパク質；
が提供される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲルシフトを起こさせることを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；並びに、
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質：
が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのタンパク質が提供される。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのタンパク質が提供される。
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
本発明において好ましくは、細胞質雄性不稔個体は、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、
配列番号２２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
配列番号２３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
配列番号２４に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；並びに、
配列番号２５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ：
が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
本発明において好ましくは、細胞質雄性不稔個体は、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを含有するベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡ又は本発明のベクターを有する形質転換体が提供される。形質転換体は、好ましくは形質転換植物である。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを用いることを特徴とする、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、細胞質雄性不稔遺伝子を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞に、さらに本発明のＤＮＡの一部又は全部を誘導型プロモーターと共に導入することにより、雄性不稔回復遺伝子の発現を制御することが可能となった形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した形質転換体を利用することによる細胞質雄性不稔系統の維持方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡから任意に設定した１５〜５０merのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、上記した本発明のＤＮＡの全部又は１部からなる少なくとも１５mer以上のプローブを使用し、目的の生物試料中に、該プライマーにより増幅される塩基配列の量、又は、プローブにより検出される塩基配列の量が、１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認することで、細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜５０９１番目の塩基配列、又は配列番号１５に記載の塩基配列の１番目〜８１１番目の塩基配列を有する、プロモーターＤＮＡが提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質の態様
本発明のタンパク質は下記（ｉ）から（ｖ）のいずれかのタンパク質に関する。
（ｉ） Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、該ＰＰＲモチーフ群は３つ以上のブロックに分割されており、該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側のブロックは４つのＰＰＲモチーフを有することを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
（ｉｉ）細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲルシフトを起こさせることを特徴とするタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２６〜２９の何れかに記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
（ｉｖ）下記の何れかのタンパク質。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；並びに、
（ｖ）下記の何れかのタンパク質。
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【００２１】
本明細書において、PPRモチーフとは「Pentatricopeptide Repeat」モチーフのことを称す。このPPRモチーフは、アラビドピシスのゲノムプロジェクトの進行によって見出された新しいタンパク質のモチーフ構造である。その基本モチーフは35個の縮重した（degenarate）したアミノ酸配列が、そのタンパク質の一次構造上でタンデムに繰り返されたものである。PPRモチーフは、コンセンサスアミノ酸配列として、アミノ末端（Ｎ末端）-「VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV」-カルボキシ末端（Ｃ末端）に代表される配列を有する。このモチーフは、Small and Peeters（文献 Trends Biochem Sci 2000, 25 46-47）によって提唱されたもので、アラビドピシスのゲノム中には、このモチーフを取りうる遺伝子が、この文献が出版された当時で200ほどGenBank (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) などの遺伝子バンクに報告されている。現在、ある任意のタンパク質が、このモチーフ構造を持ち得るか否か判断は、英国のサンガー研究所内にあるProtein families database of alignments and HMNs (以下Pfamと略、 http//:www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)にあるプログラムで容易に判断することができる。
【００２２】
現在までのところでPPRモチーフを有するタンパク質の機能が明らかになっている例としては、１）ミトコンドリアに移行するタンパク質である酵母のPET309やアカパンカビのCYA-5が、ミトコンドリア遺伝子であるcox1 mRNAと相互作用をしてcox1の発現を転写後のプロセシングもしくは翻訳のレベルで制御している例（Manthey and McEwen EMBO J 1995 14 4031-4043, Coffin et.al. Curr Genet 1997 32 273-280）や２）葉緑体に移行するPPRモチーフタンパク質であるトウモロコシのCRP1が、葉緑体遺伝子であるpetAおよびpetD遺伝子の翻訳に必須であり、加えてpetDmRNAのプロセシングのステップにも必須である例（Fisk et.at. EMBO J 1999 18 2621-2630）等が挙げられ、従って、ＰＰＲモチーフを有するタンパク質は、何らかの形で翻訳制御に関わっている可能性が高いと推察される。
【００２３】
今回、本発明者らがコセナダイコン細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する遺伝子を単離したところ、それによりコードされているタンパク質は、Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、加えて該ＰＰＲモチーフ群が３つ以上のブロックに分割されており、さらに該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、最もカルボキシ末端（Ｃ末端）側に存在するブロックは４つのＰＰＲモチーフを有するものであることを見出した。
【００２４】
上述の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質として好ましくは、ＰＰＲモチーフの数が１４〜１６個のものであり、より好ましくはＰＰＲモチーフ群が３つのブロックに分割されており、アミノ末端（N末端）側から順に各ブロックが５個、７個及び４個のＰＰＲモチーフを有するものである。
具体的には、
（１）PPRクラスター＃１：N末端から1番目のPPRモチーフから5番目のPPRモチーフが連続した１７５残基からなるPPRクラスター、
（２）PPRクラスター＃２：N末端から６番目のPPRモチーフから12番目のPPRモチーフが連続した２４５残基からなるPPRクラスター、
（３）PPRクラスター＃３：N末端から13番目のPPRモチーフから16番目のPPRモチーフが連続した１４０残基、
からなるものである。
【００２５】
更に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がセリン、スレオニン又はシステイン以外であるものであり、更に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンのいずれかであるものであり、特に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギンであるものである。
【００２６】
通常、稔性回復遺伝子は、核ゲノムに存在し、細胞質雄性不稔遺伝子はミトコンドリアに存在する事が知られているため、上記細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質は、さらに、アミノ末端にミトコンドリアに移行するためのシグナルペプチド配列を有するか又はカルボキシ末端に「LysAspGluLeu」からなる配列を有することが好ましい。
【００２７】
該ミトコンドリアに移行するためのＮ末端のシグナルペプチドとしては、O. Emanuelsson ら(J. Mol. Biol. 300,1005-1016(2000)のアルゴリズムを基にした予測プログラム「TargetP」(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)又は予測プログラム「Psort」( HYPERLINK http://psort.nibb.ac.jp) http://psort.nibb.ac.jp/)から確認されるものが挙げられ、また、該シグナルペプチドの具体例としては、シロイヌナズナAtOXA1遺伝子のシグナルペプチド(W. Sakamoto et al:Plant Cell Physiol, 41:1157-1163)（MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProArgGluSerAspHisGluArgAsp）といった配列が挙げられる。このうち、好ましくは配列番号３に記載のアミノ酸配列における１〜７９のアミノ酸配列が挙げられ、特に好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列における１〜３４のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質は、細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合することにより、その細胞質雄性不稔遺伝子の翻訳阻害を起こさせ、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させるものである。
【００２９】
細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物としては、コセナ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質であるＯＲＦ１２５又はオグラ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質であるＯＲＦ１３８のそれぞれの遺伝子の転写産物(mRNA)が挙げられ、好ましくは該遺伝子の５’−ＵＴＲ（Bonhomme et al; Mol Gen Genet, 235:340-348(1992)領域が挙げられる。
細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合するか否かを確認する方法としては、in vitroで人工的に転写させたorf125又はorf１３８のmRNAに本発明のタンパク質を加え、電気泳動させる方法、いわゆるゲルシフト法が挙げられ、具体的操作方法としては、ゲルシフト法として、通常行われているような条件で行えばよい。
【００３０】
また、ＯＲＦ１２５又はＯＲＦ１３８の遺伝子と、例えばβ-ガラクトシダーゼやルシフェラーゼのような検出可能なレポーター遺伝子との融合遺伝子を大腸菌などに発現させたものに、さらに本願タンパク質を加えることで発現が抑制されるか否かを確認する方法も挙げられる。
具体的には、配列番号２の塩基配列で示される稔性回復遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込んだものと、orf125の5'-UTR領域と25アミノ酸のコーディング部分をLacZ遺伝子に融合したベクターを大腸菌に組み込みんだものを作成し、誘導発現させると、稔性回復遺伝子を組み込んだ発現ベクターを同居させた場合にのみ、LacZ遺伝子の発現が抑制されて、X-Galの存在下で青い大腸菌コロニーが白くなる。このように本願タンパク質をコードする遺伝子を利用し、上記のような確認を行うことによっても、細胞質雄性不稔遺伝子の翻訳阻害を起こさせることにより、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させる機能を有することが確認できる。
【００３１】
本発明の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質の中で最も好ましいものとしては、コンセンサス配列である配列番号２６〜２９に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。コンセンサス配列としては配列番号２６に記載のアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは配列番号２７又は２８に記載のアミノ酸配列が挙げられ、特に好ましくは配列番号２９に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
また、上記したタンパク質の好ましい具体例としては、
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が挙げられる。
また、該配列にミトコンドリアへの移行配列を有するものとしては、
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質は、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与することができるタンパク質である。より具体的には、本発明のタンパク質をコードするDNAが導入されている形質転換植物（Ｒｆ系統）を細胞質雄性不稔系統（ｃｍｓ系統）の個体と交配させた場合に、稔性の回復されたＦ1種子を得ることができる。上記ｃｍｓ系統の個体として好ましくは、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子が導入された個体が挙げられる。本発明のタンパク質は、上述のようなゲルシフト法を利用してスクリーニングをし、単離したり、下記で説明する本発明のＤＮＡを利用し、単離又は合成することができる。本発明のタンパク質の取得方法については後記する。
【００３３】
（２）本発明のＤＮＡの態様
本発明のＤＮＡは、下記の（ｉ）から（ｉｖ）の何れかのＤＮＡに関する。
（ｉ）上記した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｉ）配列番号２２〜配列番号２５の何れかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｉｉｉ）下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
（ｉｖ）下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
（ｖ）下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００３４】
本明細書では、本発明のＤＮＡを、本発明の遺伝子と称する場合もある。
配列番号１で示される塩基配列は、８５５３個の塩基から成るゲノムＤＮＡ塩基配列であり、配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１より得られたコード配列である。配列番号３は、配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列である。
配列番号１５で示される塩基配列は３３０６個の塩基から成るゲノムＤＮＡ塩基配列であり、配列番号１６で示される塩基配列は、配列番号１５より得られたコード配列である。配列番号１７は、配列番号１６で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列である。
【００３５】
本明細書において「１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列のことを言う。
本明細書において、「１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列のことを言う。
【００３６】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後"モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上である。なお。ここで言う一定以上の相同性を有するＤＮＡとしては、上記した相同性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【００３９】
本発明のＤＮＡは、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与することができるＤＮＡである。より具体的には、本発明のＤＮＡを導入した形質転換植物（Ｒｆ系統）を細胞質雄性不稔系統（ｃｍｓ系統）の個体と交配させることにより、稔性の回復されたＦ1種子を得ることができる。上記ｃｍｓ系統の個体として好ましくは、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子が導入された個体が挙げられる。
【００４０】
（３）本発明のＤＮＡの取得方法
本発明のＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中に開示した配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、並びに配列番号３に記載したアミノ酸配列または配列番号３に記載したアミノ酸配列の情報に基づいて得られたPPRモチーフやミトコンドリア移行配列を組み合わせて得られるアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者に公知の一般的育種手法及び一般的遺伝子工学的手法を利用することにより、本発明のＤＮＡを単離又は合成することができる。
【００４１】
具体的には、本発明の遺伝子が発現される適当な植物起源、具体的にはダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたその他の植物、より具体的にはコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等のＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたブラシカ属の植物から得ることができ、例えば、Ｒｆ遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーを単離し、このＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離の関係を示したゲノムの地図を作製し、ゲノムの地図を出発点としてＲｆ領域のポジショナルクローニング法（クロモゾームウオーキングとも言う）によって、本発明の遺伝子を単離、取得できる。
【００４２】
この手法はゲノムＤＮＡ上に適当なＤＮＡマーカーを見いだし、Ｒｆ遺伝子とＤＮＡマーカーの遺伝距離を測ることでゲノムの地図を作製することから始める。ＤＮＡマーカーは父親由来のゲノムと母親由来のゲノムとを識別する必要があり、一般的には数１００ｂｐの長さからなる。またＤＮＡマーカーは遺伝子と同一染色体上に座乗している必要があり、遺伝子との距離が近いために遺伝様式がほぼ同様となるようなもの、つまり遺伝的に強く連鎖しているマーカーほど望ましい。
【００４３】
ＤＮＡマーカー単離法には、以前よりＲＦＬＰ法が使われていたが、近年はＰＣＲを用いた簡便な方法であるＲＡＰＤ法やＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法（Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21, 4407-4414）が利用されている。特に、ＡＦＬＰ法は遺伝的に強く連鎖するマーカーを得る手段として有効である。マーカーとの遺伝距離を測る材料として、通常、Ｒｆ１遺伝子を持たない劣性ホモ個体とＲｆ１遺伝子をホモに有する優性ホモ個体を交配したＦ1世代を自家受粉して得られるＦ２集団やＦ1世代とこの親である目的の遺伝子を持たない劣性ホモ個体を交配して得られるＢＣ１集団を用いることができる。
【００４４】
上記劣性ホモ個体としては、細胞質雄性不稔系統のダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物、より具体的には細胞質雄性不稔系統のコセナダイコンやオグラダイコン、又は、コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔（コセナｃｍｓ）やオグラダイコン由来の細胞質雄性不稔（オグラｃｍｓ）が移入されたブラシカ属植物、より具体的にはｃｍｓナタネを使用することができる。
【００４５】
上記優性ホモ個体としては、Ｒｆ系統であるダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物、より具体的には細胞質雄性不稔回復系統のコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン、又は、これらのダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシカ属の植物、より具体的にはＲｆナタネを使用することができる。
【００４６】
これらの両親を交配して得られたＦ1世代を自家受粉して得られるＦ２集団や、Ｆ1世代と劣性ホモ個体を交配して得られるＢＣ１集団は、通常は１００個体以上、より好ましくは１０００個体以上解析することが望ましく、個体数が増すほどゲノムの地図の精度が上がり、ＤＮＡマーカーから目的の遺伝子までの物理的距離が短くなる。Ｒｆ遺伝子の場合も同様に、より物理的距離が短いＤＮＡマーカーを得ることが可能になる。
【００４７】
ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離を測る材料としては、例えば、ｃｍｓ系統コセナダイコン(Raphanus sativus cv. Kosena)とＲｆ系統である園紅ダイコン(Raphanus sativus cv. Yuanhong)とをN. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000に記載の方法に準じ、交配したダイコンＦ1世代を自家受粉して得られる数千個のＦ２集団を用いることができる。これらを解析することにより、Ｒｆ遺伝子を挟むような形で、両側にそれぞれ0.2cM程度の遺伝距離で離れた位置に連鎖するＤＮＡマーカーを単離することができ、これにより図１に示すようなマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離を示したゲノムの地図を作成することができる。
【００４８】
ゲノムの地図作成に続いては、その位置に対応するゲノムＤＮＡをクローン化し、目的の遺伝子を挟むＤＮＡマーカー間を繋ぐことが必要になる。通常はＤＮＡマーカーと目的遺伝子との物理距離が離れているため、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋げることによって、ＤＮＡマーカーから目的遺伝子領域をカバーすることになる。このＤＮＡマーカー間を、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンで繋ぐ行程がコンティグの作製である。Ｒｆ遺伝子の場合も同様に、よりＲｆ遺伝子に近い位置に存在するＤＮＡマーカー間を、Ｒｆ遺伝子領域をカバーするように、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋ぐことによってコンティグを作製することができる。
【００４９】
ゲノムＤＮＡ断片をもつクローンの集合体はゲノミックライブラリーを作製することで得られる。通常は、クローニングできるゲノムＤＮＡの長さによって、いくつかの種類のベクターが使用され、例えば、約２０ｋｂまでの断片をクローニングできるラムダファージベクター、比較的長い断片（〜４０ｋｂ）がクローニングできるコスミドベクター、より長い１００ｋｂ以上の断片をクローニングできるＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）ベクター等を利用したライブラリーが挙げられる。
【００５０】
いずれのライブラリーも、クローニングされた断片の平均長にライブラリーの集団数を乗じた値が、ライブラリーに供与されたゲノムの全長（ゲノムサイズ）に対して４から５倍程度の値に成ることが重要である。ダイコンのゲノムサイズは約５００Ｍｂｐと考えられているので、ラムダファージベクターで平均長２０ｋｂの場合、集団数は１．０×１０⁵個から１．２５×１０⁵個となり、コスミドライブラリーで平均長が４０ｋｂの場合は、集団数は５．０×１０⁴個から６．２５×１０⁴個となる。ナタネのゲノムサイズは約１０００Ｍｂｐと考えられているので、ラムダファージベクターで平均長２０ｋｂの場合、集団数は２．０×１０⁵個から２．５×１０⁵個となり、コスミドライブラリーで平均長が４０ｋｂの場合は、集団数は１．０×１０⁵個から１．２５×１０⁵個となる。
【００５１】
ライブラリーに供与するゲノムＤＮＡは、目的の遺伝子を含む生物からゲノムＤＮＡを常法により抽出すればよい。Ｒｆ遺伝子の場合、Ｒｆ系統であるダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物、より具体的には細胞質雄性不稔回復系統のコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン、又は、これらのダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシカ属の植物、より具体的にはＲｆナタネが利用できる。一般的には、Ｆ２集団やＢＣ１集団を作製した時に利用した親と同じＲｆ系統の植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製することが最も望ましいと考えられる。ゲノムＤＮＡはＣＴＡＢ法（Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321）のような常法に従い、調製することができる。
【００５２】
コンティグの作製は最初に、Ｒｆ遺伝子の両側に位置するＤＮＡマーカーを保持するクローンを単離する。ゲノミックライブラリーから、常法により、ラムダファージライブラリーの場合は、プラークハイブリダイエーション法を用いて、コスミドライブラリーとＢＡＣライブラリーの場合はコロニーハイブリダイゼーション法を用いて単離する。次にその単離したクローンの末端領域を指標にして、そのクローンに隣接するクローンを単離する事によってコンティグを作製する。作成後、コンティグの塩基配列を、常法により決定する。
【００５３】
近年のゲノムプロジェクトの進展から、ゲノムＤＮＡの塩基配列から機能する遺伝子を推定する技術が発達してきた。「Genscan」に代表される遺伝子発見プログラムは、かなりの確度で遺伝子を推定することができる。また「BLAST」に代表されるホモロジー検索プログラムは、他の遺伝子やタンパク質の類似性を推定することができる。この様な解析ソフトウエアーを利用して、目的の遺伝子を推定し、単離することが行われている。Ｒｆ遺伝子の場合も、同様にコンティグのゲノムＤＮＡ配列を同様の解析ソフトウエアーを利用して、単離、同定することが可能である。また解析すると、ゲノムＤＮＡ塩基配列上のプロモーター部分、イントロンを含んだ構造遺伝子部分、ターミネーター部分が明示される。また同時に、イントロンを含んだ構造遺伝子に対して、イントロンが除かれたタンパク質に翻訳される形の遺伝子とその遺伝子に対するアミノ酸配列が明示される。この様にしてコンティグ上のＲｆ遺伝子をかなりの確度で推定することが可能である。
【００５４】
また、上記解析ソフトを利用し推定された遺伝子配列を元にして、生体内で目的のゲノムが実際にはどのような形で発現しているかどうかを確認するために、mRNAを精製し、これに対する相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)を単離することで証明できる。また、どこから転写が開始しているかについては簡便法としては5'-RACE法と呼ばれるＰＣＲを応用した方法やより確実にはプライマーイクステンション法やS1マッピング法をもちいて解析することで証明することが可能である。
以上の方法は、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.等に記載されている。
【００５５】
上述の手法で推定される塩基配列を元にして、単離された本発明の遺伝子としては、具体的には、配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８で示されるＤＮＡが挙げられ、これにより、該ＤＮＡ配列をもとに、一般的な遺伝子工学的手法によって、他の植物起源等からｃＤＮＡを容易に単離することも可能となった。
【００５６】
具体的には、本発明の遺伝子が発現される適当な植物起源、具体的にはダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたその他の植物、より具体的にはコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等のＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたブラシカ属の植物から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なＤＮＡ断片をプローブとして、又は本発明の遺伝子の翻訳産物に対する抗体を用いて所望のクローンを選抜することにより、本発明の遺伝子に相当するｃＤＮＡを単離することができる。
【００５７】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞が例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００５８】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、すでに取得された本発明の遺伝子やその断片も良好に使用できる。また、本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００５９】
前記プローブとして用いられるセンスプライマーとアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個〜５０の連続した塩基、好ましくは２０〜３０個の連続した塩基を有するものが挙げられる。あるいは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることもできる。
【００６０】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ/ＲＮＡ増幅法や５’−ＲＡＣＥ法等に代表されるＲＡＣＥ法等、遺伝子の単離に通常用いられる手法を組み合わせて行えばよい。
【００６１】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適時設定でき、これは常法に従って合成できる。なお、増幅させたＤＮＡ/ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などで行うことができる。
【００６２】
また、上記で得られる本発明の遺伝子あるいは各種ＤＮＡ断片は、常法に従って、その塩基配列を決定することができる。
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の存在と発現の有無を特徴的に検出することができる。
【００６３】
前述した通り、本発明の遺伝子としては、例えば配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該遺伝子の相同物も包含される。
ここで遺伝子の相同物とは、本発明遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴、および上記したようなその生物学的機能の類似性により一つの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、該遺伝子の対立遺伝子も当然含まれる。
【００６４】
例えば、本発明の遺伝子は、配列番号１もしくは配列番号２で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号３で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能である。同様に、配列番号１５もしくは配列番号１６で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号１７で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能であり、配列番号１８で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号１９で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる。
【００６５】
また、前記の通り、本発明の遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又はそれらの一部に示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも包含する。このようなＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又はそれらの一部に示される塩基配列を有するＤＮＡと一定以上の相同性を有するＤＮＡである。
【００６６】
上記した一定以上の相同性を有するＤＮＡとは、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８で示される塩基配列又はそれらの一部あるいは配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列又はその一部をコードする塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、さらにもっとも好ましくは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
【００６７】
より具体的には、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１８に示される塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを例示することができる。
【００６８】
また、本発明のＤＮＡのうち、特に、
配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列又はその一部において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；
配列番号２、配列番号１６又は配列番号１８に記載の塩基配列又はその一部において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；及び
配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列又はその一部において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質をコードするＤＮＡ：
については、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列番号１、２、１５、１６、又は１８に記載の塩基配列またはそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異遺伝子を取得することができる。
【００６９】
変異遺伝子を得るための方法として、例えばランダム突然変異体、標的のある突然変異体、合成遺伝子を用いた方法など（新遺伝子工学ハンドブック、実験医学別冊、羊土社、1996参照）等の公知の方法を用いることができる。
具体的には、配列番号１又は２の塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００７０】
（４）本発明のＤＮＡを含有するベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に応じて選ぶことができる。
クローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できるものが好ましく、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescrlpt II SK(+)〔Nuclelc Acids Research, 17, 9494(1989)〕、Lambda ZAP II(ストラタジーン社製)、λgt10、λgt11〔ＤＮＡ Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49(1985)〕、λTriplEx(クローンテック社製)、λExCell(ファルマシア社製)、pT7T318U(ファルマシア社製)、pcD2〔Mo1. Cen. Bio1., 3, 280 (1983)〕、pMW218(和光純薬社製)、pUC118(宝酒造社製)、pEG400〔J.Bac., 172, 2392 (1990)〕、pQE-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。
【００７１】
発現ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、好ましくは宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明の遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００７２】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescrlptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400〔J. Bacterio1., 172, 2392(1990)〕、pQE-30(QIAGEN社製)等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００７３】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００７４】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcＤＮＡI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcＤＮＡI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００７５】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕、pLAN411やpLAN421（Plant Cell Reports 10(1991) 286-290）を例示することができる。また、特に10kb以上の長いＤＮＡ断片を植物に導入するときは、長鎖ＤＮＡを安定的に保持・導入できるように改良されたベクターの使用が望ましい。例えば、pBIBAC2(Gene 200(1997)107-116)、pYLTAC7（PNAS 96(1999)6535-6540）やpBIGRZ2（バイオサイエンスとインダストリー55(1997)37-39）があげられる。
植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕等が挙げられる。なお、植物の形質転換についての詳細は別途後述する。
【００７６】
（５）本発明のＤＮＡを有する形質転換体
本発明のＤＮＡを有する形質転換体は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospiri11um属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属等に属する微生物をあげることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００７７】
酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。
酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００７８】
動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等を挙げることができる。
動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
植物細胞を用いた形質転換体については後述する。
【００７９】
（６）本発明のタンパク質の取得方法
本発明のタンパク質の取得方法は特に限定されない。本明細書中に開示した配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載したアミノ酸配列又は配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載したアミノ酸配列の情報に基づいて得られるPPRモチーフやミトコンドリア移行配列を、組み合わせて得られるアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者に一般的遺伝子工学的手法を利用することにより、本発明のタンパク質を単離、発現、又は合成することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを単離または合成して、細胞に導入することにより発現させることができる。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物より該タンパク質を採取することにより取得することができる。
【００８０】
本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８２】
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＭＳ培地、Ｒ２Ｐ培地等、その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、１５〜３５℃等の条件下で１〜２１日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８３】
形質転換体の培養物から、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００８４】
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００８５】
本発明のタンパク質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該タンパク質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００８６】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製〉、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００８７】
（７）本発明のＤＮＡを有する植物の形質転換体
配列番号１及び配列番号１５に記載された塩基配列は、植物ゲノム本来の塩基配列を抜き出した形の塩基配列である。この塩基配列は、遺伝子の発現に必要なプロモーターとターミネーターを作動可能な形で含んでいる。導入するベクターは、直接導入法の場合は一般的なクローニングベクター、たとえばコスミドpWE15（STRATAGENE社製）などに当該遺伝子をクローニングすることができる。アグロバクテリウムを利用する場合は、一般的な植物形質転換用ベクター、たとえばpBI121（Clontec社製）などにクローニングすることができる。
【００８８】
また、この配列（ゲノム配列）から一部のイントロンを抜き出した塩基配列のＤＮＡや、ほとんどすべてのイントロンを抜き出した塩基配列のＤＮＡ、配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入してもよい。
【００８９】
ここで、配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜５０９１番目の塩基配列、又は配列番号１５に記載の塩基配列の１番目〜８１１番目の塩基配列を有するＤＮＡは、葯でｍＲＮＡを転写する能力を有するプロモーターであり、雄性不稔性を回復させるのに好ましく用いられる。
さらに、プロモーターとターミネーター部分を既知の植物細胞中で機能するプロモーターやターミネーターと置換してもよい。
尚、上記した配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入する場合には、このＤＮＡの他にプロモーターとターミネーターが必要である。通常よく使用される一般的な発現ベクターとしては、pBI121(clonetec社製)が挙げられるが、このベクターはプロモーターにカリフラワーモザイクウイルスの３５Sプロモーター、ターミネーターにA. tumefacienceのTiプラスミドに存在するノパリン合成酵素のターミネーターが使用されている。また発現に必要なプロモーターとしては、上記カリフラワーモザイクウイルスの３５Sプロモーターに限らずに、植物に広く存在するｒｂｃSプロモーター等を用いてもよく、より好ましくは花粉の生育期に発現する種類のプロモーター例えばTA29プロモーターが、さらに好ましくは当該遺伝子の上流に配位された本来のプロモーターが用いられる。ターミネーターについても、上記ノパリン合成酵素のターミネーターに限らず、カリフラワーモザイクウイルスの３５Sターミネーター等を用いることができ、より好ましくは当該遺伝子の下流に配位された本来のターミネーターが用いられる。加えて、上記した配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを用いて、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させる目的に使用する場合、この配列に加え、ミトコンドリアへの移行配列が必要となる。
該ミトコンドリアへの移行配列としては、上記配列番号２の１〜２３７番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号３の１〜７９番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、上記配列番号１６の１〜２３７番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号１７の１〜７９番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは上記配列番号１８の１〜２４３番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号１９の１〜８１番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、その他上述の公知の移行配列等が利用できる。
【００９０】
本発明者らは以下の実施例において、配列番号１に示された、ゲノムに存在する本来のプロモーターからターミネーターまでに含まれるイントロンを含んだＲｆ遺伝子のＤＮＡを、本来の形で植物に導入するために、植物形質転換用ベクターを作製した。コンティグの一部をなすクローンから配列番号１に示された塩基配列を制限酵素によって切り出した後、適当なクローニングベクターにサブクローンした後、植物形質転換用ベクターpKM424,pBIGRZ2にサブクローニングした断片を導入し、当該断片を植物に導入可能なベクターを得た。このベクターを植物形質転換用アグロバクテリウムに導入した。このベクターを保持したアグロバクテリウムを植物に感染させることによって当該ＤＮＡ断片が植物ゲノム中に組み込まれる。
【００９１】
本発明の遺伝子が適用される植物は、例えばナタネ、ヒマワリ、ダイズ、パーム椰子等の油量作物、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ等の禾穀類、例えば、タバコ、ペチュニア等の花卉類、例えばトマト、ブロッコリー、キャベツ、白菜、人参等の各種の野菜類などが例示される。
このうち、ナタネ、キャベツ、白菜、ブロッコリー等のブラシカ属の植物やトマトなどが好ましく、特に好ましくは、ナタネ、キャベツ、白菜、ブロッコリーが挙げられ、最も好ましくは、ナタネである。
【００９２】
本明細書において、形質転換植物源としては、種子、芽生え、苗、カルス、培養細胞、植物体などが挙げられ、例えば、ナタネの場合には芽生えまたはプロトプラスト；ダイズの場合には芽生え、カルスまたは培養細胞；ヒマワリの場合には芽生え；パーム椰子の場合にはカルスまたは培養細胞；イネの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；トウモロコシには、芽生え、苗、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；コムギの場合には、芽生え、カルスまたは培養細胞；キャベツ、ブロッコリーの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；ニンジンの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト等と言ったように、当業者が通常行うように、対象植物によって適宜好ましい部位を選択して行えばよい。
【００９３】
植物への形質転換法は常法に従って行うことができ、例えば、ベクターを一度アグロバクテリウムに導入した後に、アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで、ベクターを植物に導入する方法や、エレクトロポーレイション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などを用いてベクターを細胞へ直接導入する方法等を挙げることができる。
【００９４】
例えば、ナタネの場合に好ましい遺伝子導入法としては、下記に記載された方法が挙げられる。
スクロース等の糖類を炭素源として含んだ MS培地で無菌発芽させたナタネ品種の下胚軸を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、及びスクロースを含むMS培地上で前培養する。YEB培地で増殖させたアグロバクテリウムを遠心により集菌し、スクロースを含んだMS培地に再懸濁を行う。この懸濁液に、先のナタネ下胚軸を加え振とうさせた後、取り出した下胚軸を元の前培養培地に戻し３日間共存培養した後、ゼアチン、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモン、カルベニシリン、及びカナマイシンを含む選択培地に移して選抜を行う。これにより、得られた緑色の再生芽を、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモンを任意に含んだ伸長培地、引き続いてナフタレン酢酸、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモンを任意に含んだ発根培地で培養することで再生個体を得ることができ、この個体をｃｍｓ系統の個体と交配することにより、稔性が回復されたＦ１雑種を得ることができる。
【００９５】
このように植物に本発明のＤＮＡを導入することにより、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することが可能になる。
尚、上記再生個体は、ｃｍｓ系統のナタネと交配し、その子孫の稔性を調査することで、発現の確認ができるが、ｃｍｓ細胞質を持つナタネを材料として形質転換を行った場合には、上記のように根を形成した形質転換体（再生個体）を通常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、花粉稔性を調査でき、時間的にも操作的にも簡便で好ましい。
【００９６】
また、上記形質転換において、用いる細胞としてｃｍｓ細胞質を有するナタネの細胞又は組織、好ましくは胚軸、子葉、葉、花粉、培養細胞、カルス、プロトプラストを利用して上述のように形質転換を行った場合には、上記の方法で得られる植物体（再生個体）を通常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、花粉稔性が回復された植物個体を得ることができる。
すなわち、ｃｍｓ細胞を用い、該ｃｍｓ細胞に上述の遺伝子導入法で本発明のＤＮＡを導入し、該ＤＮＡが核に組み込まれている細胞をカナマイシン等の抗生物質耐性あるいは除草剤耐性選抜マーカーを指標にして選抜した後、前述のような伸長培地及び発根培地で培養することにより該ＤＮＡが核に組み込まれた植物体を得ることができる。この植物体は、雄性不稔形質が回復され可稔となる。
【００９７】
細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法としては、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡから任意に設定した15〜50merのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡの全部又は１部からなる少なくとも１５mer以上のプローブを使用し、目的の生物試料中に、該プライマーにより増幅される塩基配列の量、又は、プローブにより検出される塩基配列の量が、１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認することにより行うことができる。
【００９８】
具体的な確認手法としては、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法などがあげられ、このうち、ＰＣＲ法が好ましい。これらの手法は、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００９９】
１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認するためには、ＰＣＲ法では簡易法として同じコピー数のＤＮＡを鋳型にして、同程度の増幅が認められることが必要であり、より正確には定量ＰＣＲ法を用いて、内部標準として１ゲノム中に１遺伝子存在することがわかっている既知の遺伝子を増幅させる任意のプライマーを用い、同量の生物試料中に、この既知の遺伝子の増幅量と該プライマーにより増幅される塩基配列の量を比較することで確認できる。サザンハイブリダイゼーション法では、当該ＤＮＡが１ゲノム中に１遺伝子あることがわかっている稔性回復系統植物個体のＤＮＡと目的の植物試料のＤＮＡを等量ずつ比較して、検出されるＤＮＡの量が同じ又はそれ以上であることを確認する。
【０１００】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、たとえば配列番号１もしくは配列番号２に記載のＤＮＡ配列と同一の、または相補性を有する15〜50merのオリゴヌクレオチドがあげられる。
サザンハイブリダイゼーション法に用いるプローブは、配列番号１もしくは配列番号２に記載のＤＮＡ配列と同一の２本鎖ＤＮＡの全域もしくは少なくとも１５mer以上のその一部分、または１本鎖ＤＮＡまたはその相補鎖の全域もしくは少なくとも１５mer以上のその一部分があげられる。また、先に述べたようにプローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上である。なお。ここで言う一定以上の相同性を有するＤＮＡとしては、上記した相同性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【０１０１】
以上に述べた遺伝子を検出する方法は、形質転換体において当該ＤＮＡが組み込まれているかどうかを確認することだけでなく、交配によりＲｆ遺伝子の導入を試みた個体においても、Ｒｆ遺伝子の有無を確認する手段として用いることができる。この方法を用いれば、細胞質雄性不稔個体にＲｆ遺伝子を導入した場合、開花する前にＲｆ遺伝子の有無を確認することが可能である。また、通常の細胞質を持つ個体にＲｆ遺伝子を導入した場合は、開花時の花粉を細胞質雄性不稔個体に交配して得られた次世代の個体の稔性を確認しなければならないが、この方法を用いることでこれ以前にＲｆ遺伝子の有無を確認できる。このような利用方法は、一般的にマーカーＤＮＡの利用またはマーカーＤＮＡ育種と呼ばれている。Ｒｆ遺伝子の場合は、Ｒｆ遺伝子のマーカーＤＮＡ（Ｒｆマーカー）としての利用が考えられる。Ｒｆマーカーは、先に述べたように、当該ＤＮＡを導入した組み換え個体や非組み換え体である交配によりＲｆ遺伝子を導入した植物を母本として用い、実用品種を育種していく上で、重要である。
【０１０２】
尚、導入ＤＮＡがＲｆ遺伝子として機能するかどうかを確認するには、上述のように形質転換体の稔性回復を確認することによっても可能であるが、その他にも、下記に示すような方法でも行うことができる。
先に述べたように、Ｒｆ遺伝子は、ｃｍｓ原因タンパク質であるＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質のミトコンドリア内の蓄積量を減少させることにより、植物体の稔性を回復させる。従って形質転換個体のミトコンドリアにおいて、ＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質蓄積量の減少を確認することにより、導入遺伝子がＲｆ遺伝子であることが確認できる。
【０１０３】
ミトコンドリアにおけるＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質蓄積量の減少を確認する方法としては、本明細書に記述した条件に従ってウエスタンブロッティング法によりＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質を検出した時に、内部標準として用いるミトコンドリアゲノム由来のタンパク質に対する抗体、例えば、N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000に記載されている、抗Ｆ₁-F₀ATPase（以下ATPAと省略）のシグナル量が、細胞質雄性不稔個体と、稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該ＤＮＡを導入した形質転換個体とで等量であって、かつ、細胞質雄性不稔個体のＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量と比べて、稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該ＤＮＡを導入した形質転換個体での蓄積量が５０％より多く減少、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上減少していることを確認する方法である。
【０１０４】
実際には、ＯＲＦ１２５を有する細胞質雄性不稔ダイコンのつぼみでは、稔性回復遺伝子Ｒｆが導入されると、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量は激減し、ほとんど検出されない。またナタネでは、細胞質ＯＲＦ１２５を有する細胞質雄性不稔ナタネに、交配により稔性回復遺伝子が導入された稔性回復ナタネのつぼみでは、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が80%以上減少していることが観察されている。また、実施例においても、細胞質雄性不稔個体に当該ＤＮＡを導入した形質転換ナタネのつぼみでは、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が80%以上減少していることが観察されている。
尚、上述の方法における、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８タンパク質に対する抗体は、下記のような一般的な手法を用いることにより得ることができる。すなわち、抗原としてこれらのタンパク質を動物に免疫することで抗血清が得られ、さらにproteinAを結合したアフィニティーカラムを用いることでイムノグロブリンＧ抗体を精製することが出来る。用いる抗原としては、発現している細胞質雄性不稔植物やこの培養細胞から、定法によりタンパク質を精製する事で得られる。また、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８遺伝子を発現ベクターに繋いで、大腸菌や酵母において発現させ、同様に精製することで得られる。さらには、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８の全長もしくは一部分を化学合成したペプチドも抗原としてもちいる事ができる。ATPAに対する抗体も同様の手法で得ることができる。
【０１０５】
さらに、ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞に、さらに誘導型プロモーターと共に本発明の遺伝子の一部又は全部を導入することで、本発明のＤＮＡの発現を特異的にしかも一時的に制御することで、ハイブリッド種子生産に必要な雄性不稔性維持系統（維持系統）を必要としない新しいハイブリッド種子生産システムを作ることができる。
【０１０６】
すなわち、通常、ｃｍｓ系統のナタネは不稔であるため、ｃｍｓ系統を増殖、維持するためには、別途、ｃｍｓ及びＲｆが関与していない維持系統というものが必要であり、従来、ハイブリッド種子の生産のためにはＲｆ系統、ｃｍｓ系統、維持系統という３つの系統の植物を必要としたが、本発明により、Ｒｆ遺伝子が単離・同定されたため、ハイブリッド生産の際に、化学物質によるプロモーターの誘導を行い、回復遺伝子の発現を制御する方法を用いることにより、維持系統が無くとも増殖、維持が可能となるｃｍｓ系統が構築できる。
【０１０７】
具体的には、外部から誘導するプロモーター、例えば、薬剤感受性のあるプロモーターを有するベクターに、本発明の遺伝子の一部または全長をアンチセンスあるいはセンスの向きで組み込み、該ベクターを用いて、ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞を形質転換する。
ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞としては、上述の方法に従い、ｃｍｓ細胞質を有する細胞を本発明のＤＮＡで形質転換したものだけでなく、ｃｍｓ系統とＲｆ系等を交配して得られたものでもよい。
上述の誘導可能なプロモーターとしては、例えば、特開平６−４６６９７号公報で知られており、ベクターの作成及び形質転換の方法としては上述と同様の手法が挙げられる。
【０１０８】
上記方法により得られるｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞であって、さらに誘導型プロモーターと共に本発明のＤＮＡの一部又は全部が組み込まれた形質転換体は、通常、プロモーターが誘導されていないため、元々存在するＲｆ遺伝子により植物は可稔性を示し、該系統の維持も自家受粉により行うことができるが、ハイブリッド生産の際には、この植物にプロモーターを誘導させる能力を有する化学物質を作用させ、プロモーターが誘導されることによりＲｆ遺伝子の発現が阻害される。これにより、その植物は雄性不稔となるため、ハイブリッド種子生産時にｃｍｓ系統として使用することができる。
従って、この方法を用いることで、ｃｍｓ系統であっても増殖、維持が自家受粉で行えることになるので、従来はハイブリッド種子の生産のために３つの系統が必要であったものが、維持系統は必要なくなり、生産コストを大幅に減少させることが可能になる。
以下、実施例について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【０１０９】
【実施例】
実施例１：細胞質雄性不稔回復遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーの単離とゲノム地図の作製
稔性回復遺伝子（Ｒｆ遺伝子）を単離するために、まず、Ｒｆ遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーを単離し、このＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離の関係を示したゲノムの地図を作製する必要がある。それの出発点としてＲｆ領域のポジショナルクローニングを行った。
【０１１０】
ＤＮＡマーカー単離法には、ＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法(Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21 4407-4414)に準じた、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社のＡＦＬＰＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍＩＡＦＬＰＳｔａｒｔｅｒＰｒｉｍｅｒＫｉｔに従ってＡＦＬＰを行った。マーカーとの遺伝距離を測定する材料として、ｃｍｓ系統コセナダイコン(Raphanus sativus cv. Kosena)の１個体（（ＫＣ２/ＫＡ１）-1）とＲｆ系統である園紅ダイコン(Raphanus sativus cv. Yuanhong)の１個体（Ｙｕａｎ１０−３）とをN. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955 2000に記載の方法に準じ、交配したダイコンＦ1世代８個体を自家受粉して得られた約２１００個体のＦ２集団を用いた。その結果、Ｒｆ遺伝子を挟むような形で、両側にそれぞれ0.2〜0.3cMの遺伝距離で離れた位置に連鎖するマーカーを５つ単離した。各ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝的距離を示したゲノムの地図を図１に示す。
【０１１１】
実施例２：ゲノム地図を基にしたコンティグの作製とＲｆ遺伝子の解析
ゲノム地図作成に続いてはその位置に対応するゲノムＤＮＡをクローン化し、Ｒｆ遺伝子を挟むＤＮＡマーカー間を繋ぐ事が必要になる。ここで、ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子との距離が離れているため、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋げる事によって、ＤＮＡマーカー間をカバーするＲｆ遺伝子領域のコンティグを作製した。
【０１１２】
ゲノムＤＮＡ断片をもつクローンの集合体をゲノミックライブラリーといい、我々は２種類のライブラリーを作製した。ＤＮＡ供与体として、Ｆ₂集団を作製した時に利用した回復系統の親と同じ園紅ダイコンより、常法に従い、CTAB法（Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321）によりゲノムＤＮＡを調製した。ライブラリーは、ラムダベクターとしてλDASHIIベクター（STRATAGENE社製）を用いて、平均長20kb、集団数1.5×10⁵個のラムダファージライブラリーを作製した。また、コスミドベクターとしてpWEB::TNCベクター(EPICENTRE TECHNOLOGIES社製)を用いて、平均長40kb、集団数5.5×10⁴個のコスミドライブラリーを作製した。
【０１１３】
コンティグの作製は最初に、Ｒｆ遺伝子の両側に位置するＤＮＡマーカーを指標に、上記で作製したラムダファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーション法を用いて、ラムダクローンを単離した。またコスミドライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法を用いてコスミドクローンを単離し、図１に示すような両端のＤＮＡマーカー間をカーバーするコンティグを完成した。コンティグの一部を成すコスミドクローンNIT7/2とTO3-2は常法により、塩基配列を決定した。
【０１１４】
続いて、上記コンティグの一部を成すコスミドクローンNIT7/2とTO3-2の塩基配列を、「Genscan」（三菱スペースソフトウエア社製）を用いて、ダイコンとゲノムＤＮＡ配列が似通っており、最近全ゲノム配列が決定されたシロイヌナズナに対するパラメーターを加味して解析した。その結果、Ｒｆ遺伝子を発現すると思われるプロモーター部分とイントロンを含んだ構造遺伝子部分とターミネーター部分を発見した。さらに、イントロンが除かれたタンパク質に翻訳される形の遺伝子とその遺伝子に対するアミノ酸配列を得た。
【０１１５】
実施例３：ゲノミックＤＮＡ領域のサブクローニング
「Genscan」で推定されたプロモーターからターミネーターを十分に含む、配列番号１に記載された1〜8553の塩基配列からなるＤＮＡのHpaI-SwaI断片(8546bp)を、フラグメント回収用アガロース(FMC社製)を用いたゲル電気泳動によりベクターと分離した。ＤＮＡ断片を含むゲルをゲル分解酵素(Epicentre Technologies社製)により消化してＤＮＡを回収した。さらに、得られた断片を制限酵素BamHIにより切断したクローニング断片を得た。これらＤＮＡ断片を、pGEM-T easyベクター(Promega社製)にサブクローニングして、cds6BT/pGEM-T easyを得た。以下、詳細に記述する。
【０１１６】
100μlの1×K制限酵素緩衝液(20mM Tris-HCl(pH8.5), 10mM MgCl₂, 1mM Dithiothreitol, 100mM KCl)中に、1μgの NIT7/2コスミドＤＮＡと10 unitの制限酵素HpaI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。
【０１１７】
加温後、10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と250μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心する。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心する。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させる。回収したＤＮＡ沈殿に、滅菌水89μlを加えて溶かす。
【０１１８】
溶かしたＤＮＡ溶液に、10μlの10×H制限酵素緩衝液(500mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM MgCl₂, 10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl)、1μlの10unit/μl制限酵素SwaI（宝酒造社製）を加え、25℃にて1時間加温した。11μlの10×loading緩衝液(1% SDS, 50% Glycetrol, 0.05% Bromophenol Blue)を加えた。
【０１１９】
1.2gの低融点アガロースSeaPlaqueGTG agarose（FMC社製）と、150ml の1×TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 緩衝液を混和後、100℃に加熱してアガロースを溶かし、45℃まで攪拌しながら冷却した。14×15cｍのゲルトレイに30mm幅×1mm厚のコームを設置し、冷却したゲルを流し込み固めた。ゲルコームにloading Dyeを加えたＤＮＡを流し込み、1×TAE、30V/30cmの電圧で18時間電気泳動した。
【０１２０】
電気泳動したゲルを、0.5μg/ml エチジウムブロミド／1×TAE溶液に移し、30分染色した。ゲルを365nmの長波紫外線を放射したトランスイルミネーターの上に乗せ、目的の8546bpの断片を、滅菌したメスを用いて切り出した。さらにゲルを約1mm角の断片になるように刻み、あらかじめ秤量した2mlのマイクロチューブに移し、ゲルの重さを秤量した。
【０１２１】
ゲルの重さ50mgに対して1μl の50×GELase Buffer(2M Bis-Tris(pH6.0), 2M NaCl）を加えた。ゲルの入ったチューブを68℃に加温したドライヒートブロックに入れ、時々チューブを上下にしながら攪拌し、10分間加温して、ゲルを完全に溶かした。このチューブを45℃のドライヒートブロックに移し、時々チューブを上下にしながら攪拌し、5分間加温した。このチューブに、ゲルの重さ200mgに対して1unitのGELase (Epicentre Technologies社製)を加えて45℃のドライヒートブロックで、時々チューブを上下にしながら攪拌し、30分間加温した。
【０１２２】
ゲル容積に対して、1/3容量の10M 酢酸アンモニウム(pH7.0)を加え攪拌し、15000rpm, 5分間遠心した。上清を新しい2mlのマイクロチューブに移し、上に対して2容量のエタノールを加えた。チューブを攪拌後、15000rpm、4℃で２０分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に20μl のTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、DNA断片を回収した。
【０１２３】
回収した20μlのＤＮＡ溶液に、10μlの10×K制限酵素緩衝液(200mM Tris-HCl (pH8.5), 100mM MgCl₂, 10mM Dithiothreitol, 1000mM KCl)、68μl のｄH₂0、2μl の10 unit/μlの制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加え、30℃にて1時間加温した。加温後、10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と250μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心する。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心する。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させる。回収したＤＮＡ沈殿に、滅菌水20μlを加えて溶かす。55μlの滅菌水、10μlの10x ＰＣＲ緩衝液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl) 、6μlの25mM MgCl₂、8μlの2.5mM dNTP mix、1μlの5 unit/μl のrTaq ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、72℃で30分間加温して、3'末端にdATPを付加した。
【０１２４】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。20μｌのTE緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）を加え、フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡを回収した。
【０１２５】
上述の方法で得られた5μlの精製されたDNAに、1μlの50ng/μl pGEM-T easyベクター（Promega社製）、6μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)のI溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
【０１２６】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡを回収した。
【０１２７】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡと混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。100μg/mlのAmpiciline(和光純薬社製)、20μg/mlのX-Gal(宝酒造社製)、1mMのIPTG(宝酒造社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１２８】
寒天培地上に現れた白いコロニーを、100μg/mlのAmpiciIlinを加えた2ml のLB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡに目的の断片がクローニングされていることを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で切断して確認して、cds6BT/pGEM-T easyを得た。
【０１２９】
上述の方法で得たcds6BT/pGEM-T easyを保持したそれぞれの大腸菌DH10Bを、100μg/mlのAmpiciIlinを加えた100mlのLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社製）を用いて精製した。
【０１３０】
実施例４−１：植物形質転換用ベクターの作製(1)
cds6BT/pGEM-Teasyを制限酵素EcoRIで切断後、フラグメント回収用アガロースを用いたゲル電気泳動によりベクターと分離し、回収されたＤＮＡ断片を植物形質転換用ベクターpKM424 （pKM424にCaMV35Sプロモーター：GUS gene：NOSターミネーターの断片を加えたベクターがpLAN421（Plant Cell Reports 10(1991) 286-290ベクター）のEcoRI部位にクローニングして、植物形質転換用ベクターcds6BT/pKM424とした。以下に詳細を示す。
【０１３１】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl)中に、1μg のcds6BT/pGEM-T easy ＤＮＡと10 unitの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。
以下、上記のHpaI-SwaI断片を取り出した同様の方法で、cds6BT/pGEM-T easyからcds6BTを含むEcoRI断片を分離回収した。
【０１３２】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl)中に、1μgの植物形質転換用ベクターpKM424と10 unitの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。加温後、100μl の1M Tris-HCl(pH8.0)と、1 unitのBacterial Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)を加えて混和後、50℃で1時間加温して脱リン酸化した。
【０１３３】
200μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で飽和したフェノール・クロロホルムを加え、激しく攪拌した。15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチューブに移す。同様の操作をもう一度繰り返し、タンパク質を取り除いた。20μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と500μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に100μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、10ng/μlの濃度とした。
【０１３４】
10μlの精製されたEcoRI断片、1μlの脱リン酸化されたpKM424ベクター、11μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)I溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
【０１３５】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡを回収した。
【０１３６】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡと混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。50μg/mlのSpectinomycin(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１３７】
寒天培地上に現れたコロニーを、50μg/mlのSpectinomycinを加えた2mlの LB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡにBamHI部位からHpaI部位がクローニングされていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認し、cds6BT/pKM424とした。
cds6BT/pKM424を保持した大腸菌DH10Bを、50μg/mlのSpectinomycinを加えた250ml のLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１３８】
実施例４−２：植物形質転換用ベクターの作製(２)
配列番号１に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローンCHI（図２参照、クローニング断片長約17kb）をマルチプルクローニング部位に存在する制限酵素NotI（宝酒造社製）で切断後、フラグメント回収用アガロースを用いたゲル電気泳動によりベクターと分離し、回収されたＤＮＡ断片を植物形質転換用ベクターpBIGRZ2（バイオサイエンスとインダストリー55(1997)37-39）のNotI部位にクローニングして、植物形質転換用ベクターCHI/pBIGRZ2とした。以下に詳細を示す。
【０１３９】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100)中に、1μg のラムダクローンCHI ＤＮＡと10 unitの制限酵素NotI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。以下、上記のHpaI-SwaI断片を取り出した同様の方法で、ラムダクローンCHIのNotI断片を分離回収した。
【０１４０】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100)中に、1μgの植物形質転換用ベクターpBIGRZ2と10 unitの制限酵素NotI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。加温後、100μl の1M Tris-HCl(pH8.0)と、1 unitのBacterial Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)を加えて混和後、50℃で1時間加温して脱リン酸化した。
【０１４１】
200μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で飽和したフェノール・クロロホルムを加え、激しく攪拌した。15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチューブに移す。同様の操作をもう一度繰り返し、タンパク質を取り除いた。20μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と500μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に100μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、10ng/μlの濃度とした。
【０１４２】
10μlの精製されたNotI断片、1μlの脱リン酸化されたpBIGRZ2ベクター、11μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)I溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡを回収した。
【０１４３】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡと混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。25μg/mlのKanamycin（和光純薬社製）を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１４４】
寒天培地上に現れたコロニーを、25μg/mlのKanamycinを加えた2mlの LB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡに目的の断片がクローニングされていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認し、CHI/pBIGRZ2とした。
CHI/pBIGRZ2を保持した大腸菌DH10Bを、25μg/mlのKanamycinを加えた250ml のLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１４５】
実施例５：アグロバクテリウムへの植物形質転換用ベクターの導入
アグロバクテリウムのコンピテントセルを調製し、実施例４−１及び４−２で得られたcds6BT/pKM424ベクター及びCHI/pBIGRZ2ベクターのそれぞれを、調製した植物形質転換用アグロバクテリウムEHA101に導入した。以下、詳細に示す。
【０１４６】
アグロバクテリウムEHA101のエレクトロポレーション用コンピテントセルを以下の方法で作製した。アグロバクテリウムEHA101を、50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）を加えたLB寒天培地上でストリークして、28℃で24時間以上培養し、シングルコロニーを得た。50μg/ml Kanamycin, 25μg/ml Chloramphenicolを加えたLB培地20mlを50ml遠心管に入れ、直径1mm程度のコロニーを植菌し、28℃で40時間振とう培養した。40時間後、遠心管の蓋を一度開閉して、さらに4時間同様に培養した。培養液を1500×g, 4℃で遠心して集菌した。上清を捨てたチューブに40mlの氷冷した滅菌10%グリセロールを入れ、菌体を再懸濁し、1500×g, 4℃で遠心して集菌した。この操作を2回繰り返した。得られた菌体に氷冷した500μｌの滅菌10%グリセロールを加え、再懸濁した。滅菌したマイクロチューブに100μｌずつ菌体を分注し、液体窒素で凍結後、-80℃フリーザーに保存した。
【０１４７】
アグロバクテリウムEHA101のエレクトロポレーション用コンピテントセルを氷水上で溶かした。予め冷やした1.5mlチューブに40μｌのエレクトロコンピテントセルを入れ、それぞれ100ngのcds6BT/pKM424 又は、CHI/pBIGRZ2のプラスミドＤＮＡを加えて軽く混和した。
【０１４８】
予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)にＤＮＡと混和したアグロバクテリウムを移す。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.44kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに30℃に温めた500μｌのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。アグロバクテリウムを10mlの培養チューブに移し、30℃で1時間振とう培養する。
cds6BT/pKM424ベクターを導入したアグロバクテリウムは50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）, 50μg/ml Spectinomycin(Sigma社製), 2.5μg/ml Tetracycline(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(１% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養したアグロバクテリウムを拡げ、24時間以上28℃で培養した。
CHI/pBIGRZ2ベクターを導入したアグロバクテリウムは50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）, 30μg/ml Hygromycin(Sigma社製)を加えたLB寒天培地に、培養したアグロバクテリウムを拡げ、24時間以上28℃で培養した。
【０１４９】
寒天培地上に現れたコロニーを、それぞれのベクターごとに適合した上記の抗生物質を加えた2ml のLB培地にて、30℃で24時間以上培養した。培養したアグロバクテリウムから、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、cds6BT/pKM424ベクターもしくはCHI/pBIGRZ2ベクターがアグロバクテリウムに導入されていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認した。確認されたクローンは、24時間培養した培養液に滅菌80%グリセロールを等量加えて混和後、-80℃に保存し、ナタネの形質転換に用いた。
【０１５０】
実施例６：ナタネ形質転換体の作製
ナタネへの形質転換は以下のように行った。ダイコン由来のcms原因遺伝子orf125をもつCMSナタネ（SW18）の種子を１０％の次亜塩素酸溶液で滅菌処理し、ホルモンを含まないMS培地(T. Murashige and F. Skoog Physiol. Plant. 15: 485, 1962) で発芽させた。発芽後７日-１４日の幼植物から胚軸部分だけを切り取り３−５ｍｍの長さに切り分け、ＭＳ培地（シグマ社Ｍ５５１９）＋しょ糖３％＋２．４−Ｄ 1mg/l、アガロース（シグマ社、typeI）０．４％で２３度、１２〜１６時間前培養した。このとき、保護培養のためにタバコ由来の細胞系統ＢＹ−２と共存培養を行った。
【０１５１】
一方CHI/pBIGRZ2を含むアグロバクテリウムを28℃で８〜４８時間培養し、OD₆₀₀=1.0程度まで増殖させた。アグロバクテリウムの菌体は液体のMSホルモンフリー培地に懸濁した。切り分けた胚軸とこのアグロバクテリウム溶液を混ぜ合わせ、約20分共存培養した。共存培養後、アグロバクテリウムをろ紙で除去した胚軸は例えばMS基本培地＋B5ビタミン（シグマ社、Ｍ０４０４）＋スクロース３％＋２，４-Ｄ 1mg/lの培地で2日間培養し、感染させた。感染後、MS基本培地＋B5ビタミン＋スクロース３％＋２，４-Ｄ 1mg/lに抗生物質カルベニシリン（ファイザー社、ゼオペンまたはGIBCO-BRL社 Carbenicillin disodium salts）を500mg/lの濃度で添加した除菌培地に胚軸を移植し、アグロバクテリウムを除去した。
【０１５２】
上述の除菌培地で５日から1週間経過した後、胚軸はMS基本培地＋B5ビタミン＋スクロース１％＋ベンジルアミノプリン3mg/l＋カーベニシリン500mg/lに加え、硝酸銀5mg/l、また選抜用としてカナマイシン5-30mg/l（ナカライテスク社、カナマイシン硫酸塩）を添加した培地で14日-21日培養した。このとき緑色のカルスが出現する場合があるので、それらは速やかに次のステップの培地に植え替えた。
【０１５３】
次のステップの培地としては例えばMS培地(シグマ社、Ｍ５５１９)＋スクロース１％＋ベンジルアミノプリン3mg/l＋ゼアチン1mg/l＋カーベニシリン500mg/l＋カナマイシン5〜30mg/lを含む選抜培地がある。切り口からカルス形成した胚軸をこの培地に移植し23℃で3週間培養し、その後緑のカルスが出現するまで3週間後ごとに3〜5回移植を繰り返した。
【０１５４】
緑のカルスは、見つけ次第胚軸から切り取り同じ組成の培地に移した。その後、緑色の部分だけを切り取って植えついで行くと１〜３０％の確率で不定芽が形成された。不定芽はその後B5基本培地(シグマ社、Ｇ５８９３)＋スクロース３％＋ベンジルアミノプリン1mg/lに移して育成したあとMS培地（シグマ社Ｍ５５１９）＋スクロース３％＋ナフタレン酸0．1mg/l＋ベンジルアミノプリン0．01mg/lを含む培地で発根させた。
【０１５５】
実施例７：形質転換体の解析（導入ＤＮＡの検出）
実施例６により得られた、つぼみを形成した形質転換体の１個体から葉を１枚取りキアゲン社のＤＮＡ単離キット（DNeasy plant mini）を用いてＤＮＡを単離した。
ＰＣＲ法を用いて、導入ＤＮＡ断片の３カ所(a,b,c部位)について、検出した（結果を図３に示す）。a部位は配列番号１の塩基配列3186bpから3753bpまでの568bpであり、フォワードプライマーとして「5'-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3'」（配列番号４）、リバースプライマーとして「5'-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3'」（配列番号５）を使用した。b部位は配列番号１の塩基配列4869bpから5112bpまでの244bpであり、フォワードプライマーとして「5'-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3'」（配列番号６）、リバースプライマーとして「5'-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3'」（配列番号７）を使用した。c部位は配列番号１の塩基配列7766bpから8250bpまでの485bpであり、フォワードプライマーとして「5'-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3'」（配列番号８）、リバースプライマーとして「5'-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3'」（配列番号９）を使用した。
【０１５６】
1μlの形質転換体ＤＮＡ溶液（50ng/μl）に、12.1μlの滅菌水、2μlの10xＰＣＲ緩衝液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl) 、1.2μlの25mM MgCl2、1.6μlの2.5mM dNTP mix、1μlの各部位の10μMフォワードプライマー溶液、1μlの各部位の10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のrTaq ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、94℃40秒、55℃３０秒、72℃1分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII（Biometra社製）を使用した。反応終了後、4% Nusive3:1 Agarose(FMC社製)/1×TBE(89mM Tris-borate, 89mM boric acid, 2mM EDTA) 緩衝液のゲル電気泳動により、増幅産物を確認した（図３を参照）。
【０１５７】
その結果、a部位はこの形質転換ナタネには導入されていないことがわかった。残りの２カ所（b,c部位）は、ポジティブコントロールと同じ大きさの増幅産物が得られ、形質転換ナタネに当該ＤＮＡが組み込まれていることが確認された。
【０１５８】
実施例８：形質転換体の解析（cms原因タンパク質ＯＲＦ１２５蓄積量の減少の確認）
実施例７と同じ個体のつぼみを１つ取り、ＣＭＳタンパクであるＯＲＦ１２５の蓄積量の減少をウエスタンブロッティング法によって解析した。結果を図４に示す。
【０１５９】
（１）形質転換個体からのタンパク質抽出
タンパク質の抽出法、ウエスタンブロティング法に関して、N. Koizukaら(Theor Appl Genet(2000)100:949-955)の方法に準じて行った。
具体的には、得られた形質転換ナタネのつぼみ（長さ1mm）1つと、100μlの氷冷したタンパク質抽出緩衝液（50mM Tris-HCl(pH7.5), 2%(W/V)SDS）を氷冷した乳鉢に入れ、乳棒で磨り潰した。この液を、マイクロ遠心チューブに移し、15000rpm,15分間, 4℃で遠心した。遠心後、上澄み液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、100℃で5分間加熱した。再度15000rpm,15分間, 4℃で遠心し、上澄み液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、SDS可溶性タンパク質溶液とした。ブラッドフォード法によるタンパク質定量キット（Bio-rad社製）を用いてSDS可溶性タンパク質溶液の濃度を測定した。これと平行して、細胞質雄性不稔系統のナタネと稔性回復系統のナタネのつぼみからも同様にSDS可溶性タンパク質溶液を抽出、濃度測定を行った。
【０１６０】
（２）SDS-PAGE法によるタンパク質の分離とPVDF膜への転写：ウエスタンブロティング
7x10cm角の10%のSDSポリアクリルアミドゲルを用いて、1レーンあたり15μgのSDS可溶性タンパク質を乗せて電気泳動にて分離した。加えて、ＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量の比較のため、細胞質雄性不稔系統のナタネの希釈系列も同様に乗せて分離した。電気泳動条件は10mAで1時間、15mAで1時間行った。電気泳動後、セミドライブロティング装置（日本泳動社製）を用いて、PVDF膜（ミリポア社製）にポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、100mA, １時間の条件で転写した。
【０１６１】
（３）抗体を用いたタンパク質の検出：ウエスタンブロティング
タンパク質を転写したPVDF 膜を、上下2枚に分割し、10mlのブロッキング溶液（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20, 5%スキムミルク）に移し、１時間振とうして、ブロッキングした。上のPVDF膜でミトコンドリアタンパク質量のコントロールとしてATPAを、下のPVDF膜で細胞質雄性不稔関連タンパク質であるＯＲＦ１２５をそれぞれ検出した。10mlの１次抗体反応液（10mlのブロッキング溶液に、ATPA検出用として100μlのATPAモノクローナル抗体を加え、ＯＲＦ１２５検出用として2μlのＯＲＦ１２５に対するウサギ抗血清を加えた(M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)）に、PVDF膜を移し１８時間振とうした。100mlのTTBS（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20）にPVDF 膜を移し、10分間振とうした。この操作を3回繰り返し過剰の一次抗体液を洗い流した。10mlの２次抗体反応液（10mlのブロッキング溶液に、ATPA検出用として10μlのパーオキシダーゼを付加したヤギ抗マウスIgG（Amersham社製）、ＯＲＦ１２５検出用として10μlのアルカリフォスファターゼを付加したヤギ抗ウサギIgG（Bio-rad社製）を加えた (M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)））に、PVDF膜を移しそれぞれ1時間振とうした。100mlのTTBS（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20）にPVDF 膜を移し、10分間振とうした。この操作を3回繰り返し過剰の2次抗体液を洗い流した。ATPA検出用として、パーオキシダーゼに対する化学発光システム「ECL+」(Amersham社製)を用い、5秒間露光検出した。ＯＲＦ１２５検出用として、アルカリフォスファターゼの発色基質であるBCIP/NBT（MOSS Inc.社製）を用い、5分間発色検出した。
【０１６２】
その結果、２系統の細胞質雄性不稔ナタネのつぼみ、稔性回復ナタネ、細胞質雄性不稔系統に当該ＤＮＡが挿入された形質転換体ナタネのつぼみでは、コントロールであるATPAの蓄積量はほとんど変化しないが、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量は形質転換体ナタネで優位に減少していることが示された。この減少の度合いは、細胞質雄性不稔系統に交配によって稔性回復遺伝子が導入された稔性回復系統と同等である(図４、及びM. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)。また、ＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量の減少の度合いを希釈系列と比較すると、稔性回復ナタネで1/8〜1/16、形質転換ナタネで1/8程度であることが解った。以上、先に述べたようにナタネでは稔性が回復する事とＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が減少する事とは、強く連鎖し、同意の関係にあることから、当該ＤＮＡ配列は、ミトコンドリア内のＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量を減少させる働きがあり、稔性回復遺伝子を保持したゲノムＤＮＡ配列であることが証明された。
さらに開花体から葯を取り出し、顕微鏡観察したところ、正常な花粉が形成されていることが確認できた（図５）。
【０１６３】
実施例９：ｃＤＮＡの単離
ｃDNA の単離は、ＲＮＡ供与体として、遺伝子地図を作製したときに用いたＦ₂集団よりRf1遺伝子をホモに持つ花粉稔性のあるＦ₂個体を選び、つぼみからmRNAを精製した後、cDNAを合成後、5'-RACEまたは3'-RACE法を用いて行った。
（ｍRNAの精製）
Rf1遺伝子をホモに持つ花粉稔性のあるＦ₂個体のつぼみから、常法であるグアニジウムチオシアネート法により、RNeasyキット（Qiagen社）を用いて、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
【０１６４】
（5'-RACEと3'-RACEによるｃDNA の単離）
精製したmRNA・１μgを用いて、5'-RACEと3'-RACE法による「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キットを用いてｃDNA を単離した。遺伝子特異的プライマーとして5'-RACEには5'-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3'（配列番号１０）を使用し、3'-RACEには、
5'-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3'（配列番号１１）を使用した。得られたクローンの塩基配列を確定後、cDNA配列を得た（配列番号２）。
【０１６５】
実施例１０：cDNAのアミノ酸配列への変換と解析
（１）ｃDNA のアミノ酸配列への変換は、通常のジェネティックコードを用いて、遺伝子解析ソフト「Genetyx-SV」（ソフトウエア開発（株））を用いて行い、配列番号３に記載のアミノ酸配列を得た。PPRモチーフの解析は、Protein families database of alignments and HMNs (以下Pfamと略 http//:www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml )にあるプログラムで行った。解析の結果、配列番号１に示した稔性回復遺伝子の翻訳産物は16個のPPRモチーフを持つタンパク質である事を見出した。またPPRモチーフは、3つのPPRクラスターとなっていた。その3つとは、
▲１▼ PPRクラスター＃１：N末端から1番目のPPRモチーフから5番目のPPRモチーフが連続した１７５残基からなるPPRクラスター、
▲２▼ PPRクラスター＃２：N末端から６番目のPPRモチーフから12番目のPPRモチーフが連続した２４５残基からなるPPRクラスター、並びに
▲３▼ PPRクラスター＃３：N末端から13番目のPPRモチーフから16番目のPPRモチーフが連続した１４０残基からなるPPRクラスター、
であった。
【０１６６】
実施例１１：本発明のタンパク質の解析
コセナ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質ＯＲＦ１２５の遺伝子の転写産物(mRNA)に結合することで大腸菌において翻訳阻害を起こすかどうかの実験を行った。
配列番号２に示した稔性回復遺伝子を大腸菌発現ベクターpQE-80L（Qiagen社）のBamHI-SphI部位に導入し、6個のヒスチジン残基が（6XHis）N末端に付加する発現ベクターを構築した(pQEB1/cds6)。また、pSTV29（宝酒造）ベクターを鋳型として、BamHI部位を導入するプライマー：CGGGATCCGCTCACAATT（配列番号１２）と、M13プライマー RV（宝酒造（株））を用いてＤＮＡを増幅した。ＤＮＡの増幅は、Takara LA PCR Kit（宝酒造（株））を用いた。増幅したＤＮＡを、制限酵素BamHI、EcoRI（宝酒造（株））で切断後、Suprec-02（宝酒造（株））を用いて精製した。orf125遺伝子の5'-UTR領域とorf125の25アミノ酸の両端にBamHIとEcoRI部位を有するＤＮＡ断片を合成するために、２本のプライマーを用いて、藤本の方法（植物のPCR実験プロトコール：合成ＤＮＡの実際PP84-87（秀潤社））に従って、PCRを行った。プライマーは、

の２本を用いた。増幅したＤＮＡを、制限酵素BamHI、EcoRI（宝酒造（株））で切断後、Suprec-02（宝酒造（株））を用いて精製した。精製したＤＮＡはTaKaRa Ligation kit（宝酒造（株））を用いて結合させ、大腸菌DH10B(Gibco BRL社製)に形質転換した。50μg/mlのクロラムフェニコール(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar, 0.1mMIPTG, 20ug/ml X-Gal)にて、18時間以上37℃で培養した。薄く青いコロニーから、定法によりプラスミドを抽出し塩基配列を確認した。この様にして、EcoRI部位からlacZ遺伝子の転写開始点の間にorf125遺伝子の5'-UTR領域とorf125の25アミノ酸を含む174bp（図６に記載の塩基配列のうち、７〜１８０番目）を導入したベクターを構築した(pSTV125-5'#LA6)。また同時に該１７４bpに相当する部分に数箇所に変異を起こさせた断片（図６に記載の塩基配列の７〜１８３番目）を持つベクターが得られた(pSTV125-5'#LA12)。
【０１６７】
該ベクターpSTV125-5'#LA6及び#LA12をそれぞれ、大腸菌DH10B（GibcoBRL社）に導入し、LB培地に50μg/mlのクロラムフェニコール（和光純薬社）、200μMのIPTG(和光純薬社)、40μg/mlのX-Gal（宝酒造社）を加えた寒天培地で、37℃一晩静地培養し、コロニーを生育させたところ、薄く青色になった。すなわち、いずれのベクターを導入した大腸菌においても導入されたLacZ遺伝子が発現したことが認められた。
【０１６８】
さらに、上述のpSTV125-5'ベクターとpQEB1/cds6ベクターとを共に上記と同様の大腸菌に導入するために、上記培地に50μg/mlのアンピシリンを加えた培地を用いて培養したところ、pSTV125-5'#LA6と共存させた場合は、コロニーが白くなったが、導入断片部位に変異を有するpSTV125-5'#LA12と共存させた場合は、コロニーが薄く青くなり、青さの程度は#LA12単独の場合と変わり無かった。尚、導入したこれらのベクターが大腸菌から欠落していないかについては、それぞれのコロニーを培養後、常法によりベクターを抽出することで確認した。
【０１６９】
以上の結果より、pQEB1/cds6ベクターにより大腸菌内で発現したタンパク質は、pSTV125-5'#LA6のmRNAと結合した結果、LacZ遺伝子の発現が抑えられ白いコロニーになったと考えられる。また、pSTV125-5'#LA12と共存させた場合には、導入断片部位に変異を有することによりpQEB1/cds6由来のタンパク質がmRNAに結合することが出来ず、その結果LacZ遺伝子が発現し青色になったと考えられる。
【０１７０】
このことから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質はorf125のmRNA、より具体的には、少なくともorf125-5'UTR領域とORF125の25アミノ酸残基のコード領域の転写産物に関与して、ORF125タンパク質の発現を抑えているものと推察される。
【０１７１】
すなわち、本発明の遺伝子の翻訳産物は、ミトコンドリアに移送された後に、該ミトコンドリア内で、雄性不稔遺伝子と結合し、翻訳を阻害することで、細胞質雄性不稔の原因タンパク質の蓄積量を減少させることにより、細胞質雄性不稔性を可稔に回復していることが推察される。
【０１７２】
実施例１２：コセナナタネ稔性回復遺伝子の単離
コセナダイコンの稔性回復遺伝子を細胞融合により導入して得られたナタネの系統（以下コセナナタネ）から、PCR法を用いて稔性回復遺伝子のゲノム配列を得た。コセナナタネの葉0.1gからキアゲン社のDNA単離キット（DNeasy plant mini）を用いてＤＮＡを抽出した。DNA増幅のために、配列番号１の塩基配列1027bpから1059bpbpまでの配列である5'-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3'（配列番号３０）を、フォワードプライマーとして設定し、配列番号１の塩基配列7675bpから7651bpbpまでの配列である5'-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3'（配列番号３１）を、リバースプライマーとして設定した。
【０１７３】
10μlのコセナナタネＤＮＡ溶液（50ng/μl）に、49μlの滅菌水、10μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、10μlの25mM MgCl₂、16μlの2.5mM dNTP mix、2μlの10μMフォワードプライマー溶液、2μlの10μMリバースプライマー溶液、1μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq （宝酒造社製）を加えて混和後、98℃20秒、68℃15分のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。反応終了後、限外ろ過フィルターMicrocon-PCR（ミリポア社製）を用いて約６ｋｂの増幅産物を精製した。精製された増幅産物を鋳型として、配列番号１における４２８０〜７５８５番目に相当する部分について、定法により塩基配列3306bpを決定した（配列番号１５）。得られたコセナナタネのゲノム塩基配列と園紅ダイコンの配列を比較したところ、3306bpのうち7bpのみDNA塩基置換がみつかり、高い相同性を有することが解った。
【０１７４】
またコセナナタネの稔性回復遺伝子の3'部分cDNA配列を、RT-PCR法により取得し、イントロンが園紅ダイコンと同じ形でスプライスされている事を確認した。コセナナタネのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎 P161〜166）により、全RNA を抽出した。１μg の全RNAより、SUPERSCRIPT II RNaseH- Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を用いてｃDNA を合成した。稔性回復遺伝子3'部分特異的フォワードプライマーとして5'-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC-3'（配列番号３２）を使用し、稔性回復遺伝子3'部分特異的リバースプライマーとして、5'-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3'（配列番号３３）を使用した。1μlのコセナナタネcDNA溶液に、14.9μlの滅菌水、2.5μlの10x PCR緩衝液(宝酒造社製) 、1.5μlの25mM MgCl₂、2μlの2.5mM dNTP mix、1.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、1.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のTaKaRa Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、94℃40秒、60℃３０秒、72℃2分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）, 1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンについて定法により塩基配列を確定し、コセナナタネのcDNAは、園紅ダイコンと同様に、イントロンがスプライスされていることが確認できた。すなわち、先のゲノム配列の比較により見つかった7bpの塩基置換は配列番号１の5444bp-5814bpに存在し、スプライシングに影響を与えていないことが判明した。
【０１７５】
以上のことからコセナナタネの稔性回復遺伝子は、園紅ダイコンと同様な形でmRNAを発現していることが解った。翻訳領域のみをコードするcDNA配列を配列番号１６に記す。さらに、このcDNA配列からアミノ酸配列を得た（配列番号１７）。
【０１７６】
実施例１３：ダイコン野生種Raphanus raphanistrum (以下R.. raphanistrum)稔性回復遺伝子部分配列の単離
R.. raphanistrumの稔性回復遺伝子の部分配列をcDNAから単離した。
（mRNAの精製）
R.. raphanistrumのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎 P161〜166）により、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
（ｃDNAの部分配列単離）
精製した１μg のmRNAより、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いてｃDNA を合成した。
稔性回復遺伝子特異的フォワードプライマーとして
5'-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3'（配列番号３４）を使用し、
稔性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、
5'-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3'（配列番号３５）を使用した。
【０１７７】
1μlのR.. raphanistrum cDNA溶液に、14.4μlの滅菌水、2.5μlの10x Pyrobest PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの2.5mM dNTP mix、2.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、2.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、55℃３０秒、72℃1分30秒のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。増幅したDNA溶液に 0.1μlの5 unit/μl TaKaRa Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、72℃10分加温処理し、DNAの3'末端にアデニンヌクレオチドを付加した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）, 1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを定法により塩基配列を確定後、cDNA部分配列を得た（配列番号２０）。さらにcDNA配列から、アミノ酸配列を得た（配列番号２１）。
【０１７８】
実施例１４：オグラナタネ稔性回復遺伝子の単離
オグラダイコンの稔性回復遺伝子を交配により導入して得られたナタネの系統（以下オグラナタネ）から、5'-RACE法と3'-RACE法を用いて稔性回復遺伝子のcDNA配列を単離した。
（ｍRNAの精製）
オグラナタネのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎 P161〜166）により、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
（ｃDNAの部分配列単離）
精製した１μg のmRNAより、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いてｃDNA を合成した。稔性回復遺伝子特異的フォワードプライマーとして5'-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3'（配列番号３６）を使用し、稔性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、5'-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3'（配列番号３７）を使用した。
【０１７９】
1μlのオグラナタネcDNA溶液に、14.4μlの滅菌水、2.5μlの10x Pyrobest PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの2.5mM dNTP mix、2.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、2.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のPyrobest ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、55℃３０秒、72℃1分30秒のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。増幅したDNA溶液に 0.1μlの5 unit/μl のTaKaRa Taqを加えて混和後、72℃10分加温処理し、DNAの3'末端にアデニンヌクレオチドを付加した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）, 1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを定法により塩基配列を確定後、4種類のcDNA部分配列を得た。得られた４種類の配列情報を基にして、４つに共通な部分に5'-RACEと3'-RACE用のプライマーを設定し、それぞれcDNA単離を行った。
【０１８０】
（5'-RACEと3'-RACEによるｃDNA の単離）
上記と同様にcDNA を合成し、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いて5'-RACEと3'-RACE法を行いｃDNA を単離した。遺伝子特異的プライマーとして5'-RACEには
5'-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3'（配列番号３７）と5'-GTCCGGAGAGCAGCCCTTGGTAG-3'（配列番号３８）を使用し、3'-RACEには、5'-TCATCGTATAATTCTTCAGCCTC-3'（配列番号３９）を使用した。
【０１８１】
5'RACEでは、２回PCRを行いDNAを得た。2μlの250倍希釈したオグラナタネcDNA溶液に、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl₂、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号9907Fのプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、72℃3分のサイクルを５回、98℃5秒、70℃3分3のサイクルを５回、98℃5秒、68℃3分のサイクルを25回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。得られたDNA溶液を100倍希釈し、そのうちの2μlに、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl₂、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号5'ogu-1のプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、72℃3分のサイクルを５回、98℃5秒、70℃3分3のサイクルを５回、98℃5秒、68℃3分のサイクルを25回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。
【０１８２】
3'RACEでは、2μlの50倍希釈したオグラナタネcDNA溶液に、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl₂、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号3'ogu-1のプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、63℃30秒、72℃2分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。
【０１８３】
3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）、1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンの塩基配列を確定後、上記4種類のcDNA部分配列に対応する5'-RACE配列と3'-RACE配列を得て、各々の配列を結合して全長ｃDNA 配列を得た。この内園紅ダイコンのｃDNA 配列と最も相同性の高い配列をコセナナタネの稔性回復遺伝子とした（配列番号１８）。さらにcDNA配列から、アミノ酸配列を得た（配列番号１９）。
【０１８４】
実施例１５：稔性回復遺伝子の解析
上記の方法で得られた各々の稔性回復遺伝子について、cDNA 配列及びアミノ酸配列の相同性については遺伝子解析ソフト「Mac Vector6.5」（Oxford MolecularLtd.）を用い、モチーフ解析については、英国のサンガー研究所内にあるProtein families database of alignments and HMNsを用いて、解析を行った。
【０１８５】
本発明の園紅ダイコン、コセナナタネ及びオグラナタネ由来のＲｆ遺伝子は、いずれもＰＰＲモチーフを１６個有し、このＰＰＲモチーフ群はアミノ末端側から５個、７個及び４個の３つのブロックに分割されている上、アミノ末端側から２番目のＰＰＲモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギンであった。また、ラファナス・ラファニストラム由来の部分断片についても、上述の配列に対し相当する部分（配列番号２６の９４〜２６４番目）に当てはめて解析したところ、アミノ末端の１番目から６番目のPPRモチーフに相当する部分を有しており、PPRモチーフ群とアミノ末端側から２番目のＰＰＲモチーフに存在する４番目のアミノ酸についても上記の特徴を有していた。
【０１８６】
さらに園紅ダイコン、コセナナタネ、オグラナタネから得られた3種の稔性回復遺伝子とR.. raphanistrum稔性回復遺伝子部分配列についての解析の結果得られた本発明のタンパク質(配列番号２６）及びそれをコードする遺伝子(配列番号２２)の中でも、園紅ダイコンとコセナナタネは相同性が非常に高く、アミノ酸配列では９９．６％（3箇所のアミノ酸で違いが見られただけであった）、塩基配列では99.7％と高い値を示すことから、特に好ましくは配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びそれをコードする遺伝子(配列番号２５)が挙げられる。
【０１８７】
その一方で、オグラナタネと園紅ダイコン、そしてオグラナタネとコセナナタネを比較するといずれも高い相同性が認められたが、それぞれの相同性がアミノ酸配列ではオグラナタネと園紅ダイコンを比較すると92.0％、オグラナタネとコセナナタネでは91.6%であり、塩基配列ではいずれも95％程度と、園紅ダイコンとコセナナタネ間の値よりは低い値を示した。
【０１８８】
【発明の効果】
本発明により、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子が単離され、その構造が同定された。さらに、本発明によれば、単離したＲｆ遺伝子を利用してナタネ回復系統を確立する手段を提供することが可能になった。
【０１８９】
【配列表】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【０２０６】

【０２０７】

690
【０２０８】

【０２０９】

【０２１０】

【０２１１】

【０２１２】

【０２１３】

【０２１４】

【０２１５】

【０２１６】

【０２１７】

【０２１８】

【０２１９】

【０２２０】

【０２２１】

【０２２２】

【０２２３】

【０２２４】

【０２２５】

【０２２６】

【０２２７】

【０２２８】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｒｆマーカー遺伝地図を示す。
【図２】図２は、配列番号１に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローンCHIの構造の模式図を示す。
【図３】図３は、形質転換体中の導入ＤＮＡをＰＣＲ法を用いて検出した結果を示す。
【図４】図４は、形質転換体中におけるＣＭＳタンパクであるＯＲＦ１２５の蓄積量の減少をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す。
【図５】図５は、形質転換ナタネの開花体から葯を取り出し、顕微鏡観察した結果を示す。
【図６】図６は、pSTV125-5'#LA6とpSTV125-5'#LA12の塩基配列を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a gene involved in the recovery from cytoplasmic male sterility to manure. More specifically, the present invention relates to a gene involved in the recovery of a cytoplasmic male sterile trait (hereinafter abbreviated as cms) used for development of a primary hybrid (hereinafter abbreviated as F1) variety, The present invention relates to a vector and a transformant containing
[0002]
[Prior art]
For crops such as cereals and vegetables, 1) excellent agronomic traits due to hybrid stress, 2) uniformity of crops, and 3) the inheritance of the next generation will protect the breeder's interests. Under the characteristics, F1 varieties are actively developed and put into practical use in many major crops.
[0003]
One of the methods for producing seeds of the F1 variety is a cms / Rf seeding system comprising a cytoplasmic male sterility (cms) line and a line that recovers the male sterility (hereinafter abbreviated as Rf). For example, rice and sorghum, corn and other cereal grains and sunflower and other oily crops have been developed, and these are all developed using mating or cell fusion techniques.
[0004]
On the other hand, in Brassicaceae, F1 seeding system using self-incompatibility is widely used, but for rapeseed, there is no stable self-incompatibility, so F1 seeding system using cms line and Rf line is used. It has been demanded.
[0005]
On the other hand, in recent years, studies have been made on the use of rapeseed in the rapeseed of cytosolic male sterility (Cosena cms) derived from cosena radish or cytoplasmic male sterility (ogra cms) derived from radish. Both cms genes are encoded in the mitochondrial genome, a cytoplasmic organelle, and the base sequence is known, but radish has not been studied in molecular biology and is necessary for gene isolation. Since the marker is almost unknown, it is difficult to isolate genes from the nucleus, and Rf has only been introduced into rapeseed from radish fertile recovery lines using mating or cell fusion techniques. It is.
[0006]
Furthermore, for the Rf gene, there are one or more recovery genes for each cms line of the plant. In radish, the presence of the Rf1 gene and the Rf2 gene is necessary for the recovery of fertility, and in addition, the Rf1 gene is an ORF125 protein (M. Iwabuchi) in mitochondria, which is known as a radish cms-causing protein. et al. Plant Mol. Biol. 39: 183-188, 1999) is known to significantly reduce the amount of accumulation. (Breeding Journal 47 (Another 1) P186, 1997, Breeding Journal 48 (Another 1) P197, 1998).
[0007]
In rapeseed, the Rf1 gene of radish introduced by mating or cell fusion was analyzed by ORF125 or ORF138 protein (M. Grelon et al. Mol. Gen. Genet. : 540-547), the decrease in the ORF125 or ORF138 protein accumulation and the recovery of fertility are known to be completely consistent (N. Koizuka, et al Theor Appl Genet, 100: 949-955, 2000). That is, in order to restore fertility in the rape male sterile line, it is essential to reduce the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated, and therefore the Rf1 gene is an important gene.
However, as for the base sequence of the Rf gene, only the Rf2 gene, which is one of the recovery genes for T-cytoplasm, which is one of corn cms, has been identified and isolated. The nucleotide sequence of the Rf gene is not known at all.
[0008]
[Problem to be Solved by the Invention]
It can be seen that the rape recovery line introduced with the Rf1 gene derived from radish by mating or cell fusion and the F1 varieties produced with the line as the father have higher glucosinolate (hereinafter abbreviated as GSL) content than the regulatory value. It has become a practical problem. This is because the radish-derived gene involved in the biosynthesis of GSL is present in the vicinity of the Rf1 gene and genetically linked, so that the GSL content of the rape recovery line (Rf line) increases. It is considered. Since GSL is contained in oilseed rapeseed of rapeseed and is known to cause thyroid hypertrophy when fed to animals as a feed, the GSL content of rapeseed seeds in the breeding stage is 18μmole / g in North America in Europe. It is required to be 20 μmole / g or less.
[0009]
Furthermore, in recent years, the development of plants to which functions such as herbicide resistance have been added by genetic recombination has been active, and in order to efficiently create these plants, the rape recovery system obtained by mating or cell fusion Therefore, the isolation of the Rf gene, particularly the Rf1 gene derived from radish, has been desired.
[0010]
That is, an object of the present invention is to solve the problem of isolating an Rf gene, particularly an Rf1 gene derived from radish and identifying its structure. Furthermore, an object of the present invention is to provide a means for establishing a rape recovery line using the isolated Rf gene.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have succeeded in cloning the Rf1 gene from radish and rapeseed, and have solved the problem.
That is, according to the present invention, it has 14 or more Pentatricopeptide Repeat (hereinafter abbreviated as PPR) motifs, the PPR motif group is divided into three or more blocks, and each block has at least two or more PPR. Provided is a protein involved in recovering sterility of cytoplasmic male sterile individuals, characterized by having a motif and a carboxy-terminal (C-terminal) block having four PPR motifs Is done.
[0012]
According to a preferred embodiment of the above protein,
A protein having 14 to 16 PPR motifs;
A protein in which the PPR motif group is divided into three blocks and each block has 5, 7, and 4 PPR motifs in order from the amino-terminal (N-terminal) side;
A protein in which the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal (N-terminal) side is other than serine, threonine or cysteine;
A protein in which the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal (N-terminal) side is any of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid or histidine; and
And a protein having a signal peptide sequence for translocation to mitochondria at the amino terminus or a sequence consisting of -LysAspGluLeu- at the carboxy terminus;
Is provided.
[0013]
According to another aspect of the present invention, the sterility of a cytoplasmic male sterility individual is recovered aptly by contacting the transcription product of a cytoplasmic male sterility gene with a gel shift. Proteins involved in doing so are provided.
According to still another aspect of the present invention, a protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;
A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28; and
A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29:
Is provided.
According to still another aspect of the present invention, any one of the following proteins is provided.
(1) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having the second amino acid sequence; or
(2) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the second amino acid sequence, and which is involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual. .
[0014]
According to still another aspect of the present invention, any one of the following proteins is provided.
(1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19; or
(2) having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19, and cytoplasmic male sterility A protein involved in recovering the sterility of individuals.
Preferably, in the present invention, the cytoplasmic male sterility individual has a cytoplasmic male sterility gene of cosena radish and / or ogura radish or a homologue thereof.
[0015]
According to still another aspect of the present invention, DNA encoding any of the proteins of the present invention described above is provided.
According to yet another aspect of the invention,
DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 22;
DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 23;
DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 24; and
DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 25:
Is provided.
According to still another aspect of the present invention, any one of the following DNAs is provided.
(1) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18; or
(2) having a base sequence in which one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18, and cytoplasmic male sterility DNA involved in recovering an individual's sterility gracefully; or
(3) It hybridizes under stringent conditions with the DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 and recovers the sterility of cytoplasmic male sterile individuals. DNA involved.
[0016]
According to still another aspect of the present invention, any one of the following DNAs is provided.
(1) DNA having the base sequence of 3754 to 8553 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the base sequence of 812 to 3002 in the base sequence of SEQ ID NO: 15; or
(2) deletion or addition of one to a plurality of bases in the 3754th to 8553rd base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the 812st to 3002nd base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 15; And / or a DNA having a substituted base sequence and involved in recovering the sterility of cytoplasmic male sterile individuals with ease; or
(3) Hybridization under stringent conditions with DNA having the 3754th to 8553rd base sequence of SEQ ID NO: 1 or the 812st to 3002th base sequence of SEQ ID NO: 15 And DNA involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.
[0017]
According to still another aspect of the present invention, any one of the following DNAs is provided.
(1) DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15; or
(2) A sterility of a cytoplasmic male sterile individual having a nucleotide sequence in which one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 DNA involved in recovering fragile
(3) DNA that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 under stringent conditions and that is involved in recovering sterility of cytoplasmic male sterile individuals. .
Preferably, in the present invention, the cytoplasmic male sterility individual has a cytoplasmic male sterility gene of cosena radish and / or ogura radish or a homologue thereof.
[0018]
According to still another aspect of the present invention, a vector containing the DNA of the present invention is provided.
According to still another aspect of the present invention, a transformant having the DNA of the present invention or the vector of the present invention is provided. The transformant is preferably a transformed plant.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual, characterized by using the DNA of the present invention.
According to still another aspect of the present invention, by introducing a part or all of the DNA of the present invention together with an inducible promoter into a cell having a cytoplasmic male sterility gene and the DNA of the present invention. Thus, a transformant capable of controlling the expression of a male sterility recovery gene is provided.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for maintaining a cytoplasmic male sterile line by using the transformant described above.
[0019]
According to still another aspect of the present invention, a 15-50mer oligonucleotide primer arbitrarily set from the DNA of the present invention described above, or a probe of at least 15mer consisting of all or part of the DNA of the present invention described above In the target biological sample, the amount of the base sequence amplified by the primer or the amount of the base sequence detected by the probe is confirmed to be 1 gene or more in one genome, Methods are provided for detecting genes involved in cytoplasmic male sterility recovery.
According to still another aspect of the present invention, it has the 3754th to 5091th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the 1st to 811th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15. Promoter DNA is provided.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
(1) Protein aspect of the present invention
The protein of the present invention relates to any of the following proteins (i) to (v).
(I) It has 14 or more Pentatricopeptide Repeat (hereinafter abbreviated as PPR) motifs, the PPR motif group is divided into three or more blocks, and each block has at least two or more PPR motifs, And the carboxy-terminal (C-terminal) block has four PPR motifs, and is a protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual.
(Ii) a protein characterized by causing a gel shift in the transcript after contacting with the transcript of the cytoplasmic male sterility gene;
(Iii) A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 29.
(Iv) Any of the following proteins.
(1) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having the second amino acid sequence; or
(2) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the second amino acid sequence, and which is involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual. As well as
(V) Any of the following proteins.
(1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19; or
(2) having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19, and cytoplasmic male sterility A protein involved in recovering the sterility of individuals.
[0021]
In the present specification, the PPR motif refers to a “Pentatricopeptide Repeat” motif. This PPR motif is a new protein motif structure discovered by the progress of the Arabidopsis genome project. The basic motif is a 35 degenerate amino acid sequence repeated in tandem on the primary structure of the protein. The PPR motif has, as a consensus amino acid sequence, a sequence represented by amino terminus (N terminus)-“VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV” -carboxy terminus (C terminus). This motif was proposed by Small and Peeters (literature Trends Biochem Sci 2000, 25 46-47), and in the genome of Arabidopsis, a gene capable of taking this motif was found at the time this literature was published. It has been reported to gene banks such as GenBank (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / Genbank / index.html). At present, whether or not any protein can have this motif structure is determined by Protein families database of alignments and HMNs (hereinafter abbreviated as Pfam, http: ///www.sanger.ac. It can be easily judged by the program in uk / Software / Pfam / search.shtml).
[0022]
Examples of the functions of proteins with PPR motifs that have been elucidated so far are: 1) Yeast PET309 and red-knot mold CYA-5 that interact with mitochondria interact with the mitochondrial gene cox1 mRNA. Example of controlling cox1 expression at the level of post-transcriptional processing or translation (Manthey and McEwen EMBO J 1995 14 4031-4043, Coffin et.al. Curr Genet 1997 32 273-280) and 2) leaves An example where the CPR1 maize, a PPR motif protein that moves into the chloroplast, is essential for the translation of the chloroplast genes petA and petD, as well as for the processing step of petD mRNA (Fisk et.at EMBO J 1999 18 2621-2630) and the like. Therefore, it is speculated that a protein having a PPR motif is likely to be involved in translation control in some form.
[0023]
In this study, the present inventors isolated a gene involved in recovering the sterility of a male white cedar cytoplasm male sterile, and the protein encoded thereby is Pentatricopeptide Repeat (hereinafter abbreviated as PPR). ) Having 14 or more motifs, in addition, the PPR motif group is divided into 3 or more blocks, each block having at least 2 or more PPR motifs, and having the most carboxy terminal (C It was found that the block present on the (terminal) side has four PPR motifs.
[0024]
The protein involved in recovering the sterility of the cytoplasmic male sterile individual is preferably one having 14 to 16 PPR motifs, more preferably three blocks of the PPR motif group. Each block has 5, 7, and 4 PPR motifs in order from the amino terminal (N terminal) side.
In particular,
(1) PPR cluster # 1: A PPR cluster consisting of 175 residues in which the first PPR motif from the N-terminal to the fifth PPR motif are continuous,
(2) PPR cluster # 2: PPR cluster consisting of 245 residues in which the 12th PPR motif is continuous from the 6th PPR motif from the N-terminus,
(3) PPR cluster # 3: 140 residues from the 13th PPR motif to the 16th PPR motif from the N-terminus,
It consists of
[0025]
More preferably, the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal (N terminal) side is other than serine, threonine or cysteine, more preferably the second amino acid from the amino terminal (N terminal) side. The fourth amino acid present in the PPR motif is any one of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid or histidine, and particularly preferably the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal (N-terminal) side. The amino acid is asparagine.
[0026]
Usually, fertility recovery genes are present in the nuclear genome, and cytoplasmic male sterility genes are known to be present in mitochondria. The protein involved preferably further has a signal peptide sequence for translocation to the mitochondria at the amino terminus or a sequence consisting of “LysAspGluLeu” at the carboxy terminus.
[0027]
As the N-terminal signal peptide for migrating to the mitochondria, a prediction program “TargetP” (http: // http: // Emanuelsson et al., J. Mol. Biol. 300, 1005-1016 (2000)) is used. www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) or prediction program `` Psort '' (HYPERLINK http://psort.nibb.ac.jp) (http://psort.nibb.ac.jp/) Specific examples of the signal peptide include the signal peptide of Arabidopsis AtOXA1 gene (W. Sakamoto et al: Plant Cell Physiol, 41: 1157-1163) It is done. Among these, Preferably the amino acid sequence of 1-79 in the amino acid sequence of sequence number 3 is mentioned, Especially preferably, the amino acid sequence of 1-34 in the amino acid sequence of sequence number 3 is mentioned.
[0028]
In addition, the protein involved in recovering the sterility of the cytoplasmic male sterility individual of the present invention by binding to the transcription product of the cytoplasmic male sterility gene, thereby inhibiting translation of the cytoplasmic male sterility gene. This is to restore the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.
[0029]
Examples of transcripts of cytoplasmic male sterility genes include transcripts (mRNA) of each gene of ORF125, which is a causative protein that causes Cosena cytoplasmic male sterility, or ORF138, which is a causal protein that causes Ogura cytoplasmic male sterility, Preferably, the 5′-UTR (Bonhomme et al; Mol Gen Genet, 235: 340-348 (1992) region) of the gene is used.
As a method for confirming whether or not it binds to a transcription product of a cytoplasmic male sterility gene, the protein of the present invention is added to orf125 or orf138 mRNA artificially transcribed in vitro and electrophoresed, so-called gel shift. A specific operation method may be carried out under conditions that are usually performed as a gel shift method.
[0030]
In addition, is the expression suppressed by adding the protein of the present invention to a fusion gene of ORF125 or ORF138 and a detectable reporter gene such as β-galactosidase or luciferase expressed in E. coli, etc. There is also a method for confirming whether or not.
Specifically, a vector in which the fertility restoration gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is incorporated into an E. coli expression vector and a vector in which the 5'-UTR region of orf125 and a 25 amino acid coding portion are fused to the LacZ gene are used. When an expression vector that is integrated into the gene is created and induced, the expression of the LacZ gene is suppressed only when an expression vector incorporating the fertility-recovery gene is coexisted, and a blue E. coli colony is present in the presence of X-Gal. Turns white. Thus, by using the gene encoding the protein of the present invention and performing the above-described confirmation, it is possible to control the sterility of cytoplasmic male sterility individuals by inhibiting translation of the cytoplasmic male sterility gene. It can be confirmed that it has a function of recovering.
[0031]
Among the proteins involved in recovering the sterility of the cytoplasmic male sterile individual of the present invention, the most preferred protein is 70 against the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 26 to 29 which are consensus sequences. % Or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 92% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 97% or more. The consensus sequence includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, preferably the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28, and particularly preferably the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29.
Moreover, as a preferable specific example of the above-mentioned protein,
(1) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having the second amino acid sequence; or
(2) The 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 80-687th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, or the 82-690 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A protein having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the second amino acid sequence, and which is involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual. Is mentioned.
In addition, those having a mitochondria transition sequence in the sequence,
(1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19; or
(2) having an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19, and cytoplasmic male sterility Examples include proteins involved in recovering the sterility of individuals.
[0032]
The protein of the present invention is a protein that can be involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual. More specifically, fertility is restored when a transformed plant (Rf strain) into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced is crossed with an individual of a cytoplasmic male sterile strain (cms strain). F1 seed can be obtained. The individual of the cms strain is preferably an individual into which a cytoplasmic male sterility gene of cosena radish and / or white radish has been introduced. The protein of the present invention can be screened and isolated using the gel shift method as described above, or can be isolated or synthesized using the DNA of the present invention described below. The method for obtaining the protein of the present invention will be described later.
[0033]
(2) Embodiment of DNA of the present invention
The DNA of the present invention relates to any of the following DNAs (i) to (iv).
(I) DNA encoding the protein of the present invention described above.
(Ii) DNA having the base sequence described in any one of SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 25.
(Iii) Any of the following DNAs.
(1) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18; or
(2) having a base sequence in which one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18, and cytoplasmic male sterility DNA involved in recovering an individual's sterility gracefully; or
(3) It hybridizes under stringent conditions with the DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 and recovers the sterility of cytoplasmic male sterile individuals. DNA involved.
(Iv) Any of the following DNAs.
(1) DNA having the base sequence of 3754 to 8553 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the base sequence of 812 to 3002 in the base sequence of SEQ ID NO: 15; or
(2) deletion or addition of one to a plurality of bases in the 3754th to 8553rd base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the 812st to 3002nd base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 15; And / or a DNA having a substituted base sequence and involved in recovering the sterility of cytoplasmic male sterile individuals with ease; or
(3) Hybridization under stringent conditions with DNA having the 3754th to 8553rd base sequence of SEQ ID NO: 1 or the 812st to 3002th base sequence of SEQ ID NO: 15 And DNA involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.
(V) Any of the following DNA.
(1) DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15; or
(2) A sterility of a cytoplasmic male sterile individual having a nucleotide sequence in which one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 DNA involved in recovering fragile
(3) DNA that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 under stringent conditions and that is involved in recovering sterility of cytoplasmic male sterile individuals. .
[0034]
In the present specification, the DNA of the present invention may be referred to as the gene of the present invention.
The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a genomic DNA base sequence composed of 8553 bases, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a coding sequence obtained from SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
The base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is a genomic DNA base sequence composed of 3306 bases, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is a coding sequence obtained from SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
[0035]
In the present specification, the “base sequence from which one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, More preferably, it refers to a base sequence in which any number of 1 to 5 bases are deleted, added and / or substituted.
In the present specification, the “amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted” is, for example, 1-20, preferably 1-15, more preferably 1-10. More preferably, it refers to an amino acid sequence in which any number of 1 to 5 amino acids have been deleted, added or substituted.
[0036]
In this specification, “DNA that hybridizes under stringent conditions” means DNA obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. After performing hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using, for example, a colony or plaque-derived DNA or a filter on which the DNA fragment is immobilized, Examples include DNA that can be identified by washing the filter under a condition of 65 ° C. using a 0.1 to 2 × SSC solution (the composition of 1 × SSC is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
[0037]
Hybridization is performed according to the method described in Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. It can be carried out.
[0038]
Examples of DNA that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of DNA used as a probe. The homology above a certain level is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 97% or more. is there. Note that. As used herein, DNA having a certain degree of homology includes both the above-mentioned polynucleotide having homology and its complementary polynucleotide.
[0039]
The DNA of the present invention is DNA that can be involved in recovering the sterility of cytoplasmic male sterile individuals. More specifically, F1 seeds with restored fertility can be obtained by crossing a transformed plant (Rf line) introduced with the DNA of the present invention with an individual of a cytoplasmic male sterile line (cms line). it can. The individual of the cms strain is preferably an individual into which a cytoplasmic male sterility gene of cosena radish and / or white radish has been introduced.
[0040]
(3) DNA acquisition method of the present invention
The method for obtaining the DNA of the present invention is not particularly limited. PPR motifs and mitochondria obtained based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 Based on the amino acid sequence information obtained by combining the transfer sequences, the DNA of the present invention can be isolated or synthesized by utilizing general breeding techniques and general genetic engineering techniques known to those skilled in the art. .
[0041]
Specifically, suitable plant sources from which the gene of the present invention is expressed, specifically, plants of the genus Raphanus including radish varieties and closely related species, or cytoplasmic male sterility from these plants by crossing or cell fusion techniques. Other plants that have been transferred with genomic DNA containing the salmon-recovery gene, more specifically, Cosena radish, Ogura radish, Ryukyu radish or Raphanus plants such as varieties and related species of these radish, or mating and cell fusion Can be obtained from Brassica plants into which genomic DNA containing the cytoplasmic male sterility recovery gene of these plants has been transferred. For example, a DNA marker located in the vicinity of the Rf gene is isolated and the DNA marker A map of the genome showing the relationship between the genetic distance and the genetic distance of the Rf gene, and the position of the Rf region starting from the genome map By cloning method (also referred to as transchromosomic walking), the gene of the present invention isolated, can be obtained.
[0042]
This technique starts with finding a suitable DNA marker on the genomic DNA and preparing a genome map by measuring the genetic distance between the Rf gene and the DNA marker. The DNA marker needs to distinguish between the genome derived from the father and the genome derived from the mother, and generally has a length of several hundred bp. In addition, DNA markers must be located on the same chromosome as the gene, and because the distance from the gene is close, the genetic pattern is almost the same, that is, a marker that is genetically strongly linked is desirable. .
[0043]
For the DNA marker isolation method, the RFLP method has been used for some time. In recent years, the RAPD method and the AFLP (Amplified fragment length polymorphism) method (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21, 4407-4414). In particular, the AFLP method is effective as a means for obtaining a genetically strongly linked marker. As a material for measuring the genetic distance to the marker, the F2 population and F1 generation obtained by self-pollination of the F1 generation obtained by crossing a recessive homozygote without the Rf1 gene and a dominant homozygote with the Rf1 gene homozygously and this parent A BC1 population obtained by mating recessive homozygotes that do not have the gene of interest can be used.
[0044]
The recessive homo individuals include radish varieties of cytoplasmic male sterility lineage, Raphanus genus plants including closely related species, more specifically cosenada radish and ogura radish of cytoplasmic male sterility line, or cytoplasmic male sterility derived from cosenada radish. It is possible to use Brassica plants, more specifically cms rapeseed, into which cocoons (Cosena cms) and cytoplasmic male sterility (Ogura cms) derived from radish are introduced.
[0045]
The dominant homo individuals include radish varieties that are Rf strains, plants of the genus Raphanus including closely related species, and more specifically, cosena radish, ogra radish, garden radish, Use Brassica plants, more specifically Rf rapeseed, in which genomic DNA containing cytoplasmic male sterility recovery gene of Raphanus genus plants including radish varieties and related species has been transferred by means of mating and cell fusion be able to.
[0046]
The F2 population obtained by self-pollination of the F1 generation obtained by crossing these parents, and the BC1 population obtained by crossing the F1 generation with recessive homozygous individuals are usually 100 or more, more preferably 1000 individuals The above analysis is desirable, and as the number of individuals increases, the accuracy of the genome map increases, and the physical distance from the DNA marker to the target gene decreases. Similarly, in the case of the Rf gene, a DNA marker having a shorter physical distance can be obtained.
[0047]
As materials for measuring the genetic distance between the DNA marker and the Rf gene, for example, the cms line raccoon (Raphanus sativus cv. Kosena) and the Rf line radish (Raphanus sativus cv. Yuanhong) can be used by N. Koizuka, et al. In accordance with the method described in Theor Appl Genet, 100: 949-955, 2000, thousands of F2 populations obtained by self-pollination of crossed radish F1 generation can be used. By analyzing these, it is possible to isolate DNA markers linked to positions separated by a genetic distance of about 0.2 cM on both sides in such a manner that the Rf gene is sandwiched between them, as shown in FIG. A genome map showing the genetic distance between the marker and the Rf gene can be created.
[0048]
Following the mapping of the genome, it is necessary to clone the genomic DNA corresponding to that position and connect the DNA markers that sandwich the target gene. Usually, since the physical distance between the DNA marker and the target gene is long, the target gene region is covered from the DNA marker by connecting a plurality of clones having genomic DNA fragments. The process of connecting the DNA markers with a clone having a genomic DNA fragment is the production of a contig. Similarly, in the case of the Rf gene, a contig can be prepared by linking a plurality of clones having genomic DNA fragments so as to cover the Rf gene region between DNA markers located closer to the Rf gene. .
[0049]
A collection of clones having genomic DNA fragments can be obtained by preparing a genomic library. Usually, several types of vectors are used depending on the length of genomic DNA that can be cloned. For example, a lambda phage vector that can clone a fragment of up to about 20 kb, a cosmid vector that can clone a relatively long fragment (˜40 kb), Examples include libraries using BAC (Bacterial artificial chromosome) vectors that can clone longer fragments of 100 kb or more.
[0050]
In any library, the value obtained by multiplying the average length of the cloned fragment by the number of populations of the library is about 4 to 5 times the total length (genome size) of the genome provided to the library. This is very important. Since the genome size of radish is considered to be about 500 Mbp, when the lambda phage vector has an average length of 20 kb, the population number is 1.0 × 10 ^Five From 1.25x10 ^Five If the average length is 40 kb in a cosmid library, the number of population is 5.0 × 10 ^Four 6.25x10 from ^Four It becomes a piece. Since the rapeseed genome size is considered to be about 1000 Mbp, when the lambda phage vector has an average length of 20 kb, the population number is 2.0 × 10 ^Five 2.5 x 10 from ^Five When the average length is 40 kb in the cosmid library, the number of population is 1.0 × 10 ^Five From 1.25x10 ^Five It becomes a piece.
[0051]
The genomic DNA to be donated to the library may be extracted by a conventional method from an organism containing the target gene. In the case of the Rf gene, radish varieties that are Rf strains, plants of the genus Raphanus including closely related species, more specifically, cosena radish, ogura radish, garden red radish, or radish of these radish Plants belonging to the genus Brassica into which a genomic DNA containing a cytoplasmic male sterility recovery gene of a Raphanus genus plant including varieties and related species has been transferred by a method of mating or cell fusion, more specifically Rf rapeseed can be used. In general, it is considered most desirable to produce a genomic library by extracting genomic DNA from a plant of the same Rf line as the parent used when producing the F2 population or BC1 population. Genomic DNA can be prepared according to a conventional method such as CTAB method (Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321).
[0052]
First, a clone carrying DNA markers located on both sides of the Rf gene is isolated. From a genomic library, isolation is performed by a conventional method, in the case of a lambda phage library, using a plaque hybridization method, and in the case of a cosmid library and a BAC library, using a colony hybridization method. Next, using the terminal region of the isolated clone as an index, a contig is prepared by isolating a clone adjacent to the clone. After preparation, the base sequence of the contig is determined by a conventional method.
[0053]
With the recent progress of the genome project, a technique for estimating a functional gene from the base sequence of genomic DNA has been developed. Gene discovery programs represented by “Genscan” can estimate genes with considerable accuracy. A homology search program represented by “BLAST” can estimate the similarity of other genes and proteins. Using such analysis software, a target gene is estimated and isolated. In the case of the Rf gene as well, the contig genomic DNA sequence can be isolated and identified using the same analysis software. Analysis also reveals the promoter part, the structural gene part including the intron, and the terminator part on the genomic DNA base sequence. At the same time, for a structural gene containing an intron, a gene that is translated into a protein from which the intron has been removed and the amino acid sequence for that gene are clearly specified. In this way, the Rf gene on the contig can be estimated with considerable accuracy.
[0054]
In addition, based on the gene sequence estimated using the above analysis software, in order to confirm in what form the target genome is actually expressed in vivo, mRNA is purified, It can be proved by isolating the complementary DNA (cDNA) to. In addition, as a simple method, it can be proved from where transcription starts by using a method called PCR called 5'-RACE method, or more certainly using a primer extension method or S1 mapping method. Is possible.
The above method is described in Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.
[0055]
Specific examples of the isolated gene of the present invention based on the base sequence estimated by the above-described method include DNA represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, This makes it possible to easily isolate cDNA from other plant sources based on the DNA sequence by a general genetic engineering technique.
[0056]
Specifically, suitable plant sources from which the gene of the present invention is expressed, specifically, plants of the genus Raphanus including radish varieties and closely related species, or cytoplasmic male sterility from these plants by crossing or cell fusion techniques. Other plants into which genomic DNA containing the recovery gene has been transferred, more specifically, Cosena radish, Ogra radish, Ryukyu radish or Raphanus plants such as varieties and related species of these radish, or mating and cell fusion From these plants, a cDNA library was prepared according to a conventional method from a plant of the genus Brassica into which the genomic DNA containing the cytoplasmic male sterility recovery gene of these plants was transferred. From the library, a cDNA library unique to the gene of the present invention was prepared. Select a desired clone using an appropriate DNA fragment as a probe or an antibody against the translation product of the gene of the present invention. Accordingly, it is possible to isolate the cDNA corresponding to the gene of the present invention.
[0057]
In the above, examples of the origin of cDNA include various cells and tissues that express the gene of the present invention, and cultured cells derived therefrom. In addition, separation of total RNA from these, separation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can be performed according to conventional methods.
The method for screening the gene of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, and can be performed according to a usual method.
[0058]
As the probe used here, DNA chemically synthesized based on information on the base sequence of the gene of the present invention can be generally used. However, the already obtained gene of the present invention and fragments thereof are also excellent. Can be used. In addition, sense primers and antisense primers set based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention can also be used as screening probes.
[0059]
The nucleotide sequences of the sense primer and the antisense primer used as the probe are partial nucleotide sequences corresponding to DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19, and at least 15 One having ˜50 consecutive bases, preferably 20 to 30 consecutive bases. Alternatively, a positive clone itself having the above sequence can also be used as a probe.
[0060]
In obtaining the gene of the present invention, techniques commonly used for gene isolation such as DNA / RNA amplification by PCR and RACE represented by 5′-RACE may be combined.
[0061]
Primers used in adopting such a PCR method can be set in a timely manner based on the sequence information of the gene of the present invention clarified by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method. In addition, isolation / purification of the amplified DNA / RNA fragment can be performed according to a conventional method as described above, and can be performed, for example, by gel electrophoresis.
[0062]
Further, the base sequence of the gene or various DNA fragments of the present invention obtained above can be determined according to a conventional method.
According to the gene of the present invention thus obtained, for example, the presence or absence of expression of the gene of the present invention in an individual or various tissues can be detected characteristically by using part or all of the base sequence of the gene. can do.
[0063]
As described above, examples of the gene of the present invention include DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19, but the present invention is not particularly limited thereto. Also included are gene homologues.
Here, the homologue of a gene has a sequence homology with the gene of the present invention (or its gene product), and has a single gene family due to the structural features described above and the similarity of its biological functions as described above. It means a series of related genes that are recognized and naturally includes alleles of the genes.
[0064]
For example, the gene of the present invention is not limited to the gene having the specific base sequence shown by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but a base sequence selected by combining arbitrary codons for each amino acid residue shown by SEQ ID NO: 3 It is also possible to have Similarly, not only the gene having the specific base sequence shown by SEQ ID NO: 15 or 16 but also a base sequence selected by combining arbitrary codons for each amino acid residue shown by SEQ ID NO: 17 In addition to the gene having the specific base sequence shown in SEQ ID NO: 18, it is also possible to have a base sequence selected by combining arbitrary codons for each amino acid residue shown in SEQ ID NO: 19. The selection of codons can follow conventional methods, and can take into account, for example, the codon usage of the host to be used.
[0065]
In addition, as described above, the gene of the present invention is stringent under stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or a part thereof. DNA that hybridizes with is also included. Such DNA is DNA having a certain degree of homology with DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or a part thereof.
[0066]
The above-mentioned DNA having a certain homology is a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or a part thereof or SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 Or at least 70% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95%, even most preferably at least 97%, with the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 or a part thereof. A polynucleotide having identity and its complementary strand polynucleotide.
[0067]
More specifically, for example, under stringent conditions of 50 ° C. in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS or 1 × SSC containing 0.1% SDS, Examples thereof include DNA having a base sequence that hybridizes with DNA having the base sequence shown in No. 2, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16 or SEQ ID No. 18 or a partial base sequence thereof.
[0068]
Among the DNAs of the present invention, in particular,
Sterility of a cytoplasmic male sterile individual having a base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 or a part thereof, wherein one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted DNA involved in recovering the
A cytoplasmic male sterile individual having a base sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 or a part thereof, wherein one to a plurality of bases are deleted, added and / or substituted. DNA that is involved in recovering sterility of the skin; and
A cytoplasmic male sterile individual having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, added and / or substituted. DNA encoding a protein involved in recovering the sterility of the protein:
Can be prepared by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, and mutagenesis. For example, a mutant gene can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 15, 16, or 18 or a partial nucleotide sequence thereof and introducing a mutation into these DNAs. it can.
[0069]
Known methods such as random mutants, targeted mutants, methods using synthetic genes (new genetic engineering handbook, experimental medicine separate volume, Yodosha, 1996), etc., as methods for obtaining mutant genes The method can be used.
Specifically, a method of contacting a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or a partial base sequence thereof with a drug that is a mutagen, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering method, etc. Can be used. Site-directed mutagenesis, which is one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position, and should be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition etc. Can do.
[0070]
(4) Vector containing the DNA of the present invention
The DNA of the present invention can be incorporated into an appropriate vector and used as a recombinant vector. The type of vector may be an expression vector or a non-expression vector, and can be selected according to the purpose.
The cloning vector is preferably one that can autonomously replicate in E. coli K12 strain, and any expression vector of E. coli that can be used, such as a phage vector or a plasmid vector, may be used as the cloning vector. Specifically, ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)), pBluescrlpt II SK (+) (Nuclelc Acids Research, 17, 9494 (1989)), Lambda ZAP II (Stratagene) ), Λgt10, λgt11 (DNA Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49 (1985)), λTriplEx (Clontech), λExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 (Mo1.Cen.Bio1 , 3, 280 (1983)], pMW218 (Wako Pure Chemical Industries), pUC118 (Takara Shuzo), pEG400 (J.Bac., 172, 2392 (1990)), pQE-30 (QIAGEN), etc. Can give.
[0071]
The expression vector can be selected in consideration of the combination with the host, and preferably is capable of autonomous replication in the host cell or can be integrated into the chromosome, and contains a promoter at a position where the gene of the present invention can be transcribed. Is used.
When a bacterium is used as a host cell, an expression vector for expressing DNA is a recombinant vector composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the above DNA and a transcription termination sequence as well as being capable of autonomous replication in the bacterium. Preferably there is. A gene that controls the promoter may also be included.
[0072]
Examples of bacterial expression vectors include pBTrP2, pBTac1, pBTac2 (all available from Belinger Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega) ), PQE-8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (JP 58-110600), pKYP200 (Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), PLSA1 (Agrc) Blo1. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)), pBluescrlptII SK +, pBluescriptII SK (-) (Stratagene), pTrS30 ( FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)], pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara Shuzo), pSTV29 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pPA1 (JP-A 63-233798) PEG400 [J. Bacterio 1., 172, 2392 (1990)], pQE-30 (manufactured by QIAGEN) and the like. Examples of the promoter for bacteria include promoters derived from Escherichia coli and phage, such as trp promoter (P trp), lac promoter (P lac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SP01 promoter, SP02 promoter, penP A promoter etc. can be mentioned.
[0073]
Examples of expression vectors for yeast include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like. Examples of the promoter for yeast include promoters such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, and CUP1 promoter.
[0074]
Examples of expression vectors for animal cells include, for example, pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 (JP 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (JP 2-27075), pCDM8 (Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J.Blochem., 101, 1307 (1987)), pAGE210, etc. Can do. Examples of promoters for animal cells include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, etc. Can do.
[0075]
Examples of expression vectors for plant cells include pIG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)], pBI121 [EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)], pLAN411 and pLAN421 (Plant Cell). Reports 10 (1991) 286-290). In particular, when a long DNA fragment of 10 kb or more is introduced into a plant, it is desirable to use an improved vector so that long-chain DNA can be stably retained and introduced. Examples include pBIBAC2 (Gene 200 (1997) 107-116), pYLTAC7 (PNAS 96 (1999) 6535-6540) and pBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39).
Examples of promoters for plant cells include cauliflower mosaic virus 35S promoter [Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392]. Details of plant transformation will be described later.
[0076]
(5) Transformant having the DNA of the present invention
A transformant having the DNA of the present invention can be prepared by introducing the above-described recombinant vector (preferably an expression vector) into a host.
Specific examples of bacterial host cells include Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium Examples include genus, Erwinia genus, Methylobacterium genus, Phormidium genus, Rhodobacter genus, Rhodopseudomonas genus, Rhodospiri11um genus, Scenedesmun genus, Streptomyces genus, Synnecoccus genus, Zymomonas genus and the like. Examples of the method for introducing a recombinant vector into a bacterial host include a method using calcium ions and a protoplast method.
[0077]
Specific examples of yeast hosts include Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pu11uls, Trichosporon pu11uls, Trichosporon pu11uls Schwanniomyces a11uvius).
As a method for introducing a recombinant vector into a yeast host, any method can be used as long as it introduces DNA into yeast. Examples thereof include an electroporation method, a spheroblast method, and a lithium acetate method. .
[0078]
Examples of animal cell hosts include Namalva cells, COS1 cells, COS7 cells, CHO cells and the like.
As a method for introducing a recombinant vector into animal cells, any method capable of introducing DNA into animal cells can be used. For example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, or the like can be used.
A transformant using plant cells will be described later.
[0079]
(6) Method for obtaining the protein of the present invention
The method for obtaining the protein of the present invention is not particularly limited. A PPR motif obtained based on the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19, or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 disclosed in the present specification; Based on amino acid sequence information obtained by combining mitochondrial translocation sequences, the protein of the present invention can be isolated, expressed, or synthesized by utilizing general genetic engineering techniques for those skilled in the art.
For example, it can be expressed by isolating or synthesizing DNA encoding the protein of the present invention and introducing it into a cell.
The protein of the present invention can be obtained, for example, by culturing a transformant having the gene of the present invention, producing and accumulating the protein of the present invention in the culture, and collecting the protein from the culture. .
[0080]
The method for culturing the transformant having the gene of the present invention can be performed according to a usual method used for culturing a host.
When the transformant of the present invention is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the microorganism. As long as the medium can efficiently culture the transformant, either a natural medium or a synthetic medium may be used. The culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture, the culture temperature is usually 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 16 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0081]
As a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host cell, a commonly used RPM11640 medium (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle's MEM medium (Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] or medium supplemented with fetal calf serum etc. Etc. are used. Culture is usually pH 6-8, 30-40 ° C., 5% CO ₂ Perform for 1-7 days under conditions such as presence. Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and penicillin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0082]
As a medium for culturing a transformant obtained using plant cells as host cells, a medium usually used according to the plant species, such as an MS medium or an R2P medium, is used. The culture is usually performed for 1 to 21 days under conditions of pH 6 to 8, 15 to 35 ° C, and the like. Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and a hygromycin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0083]
To isolate and purify the protein of the present invention involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual from the transformant culture, conventional protein isolation and purification methods can be used. That's fine.
For example, when the protein of the present invention is expressed in a dissolved state in a cell, the cell is recovered by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer solution, an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer. Then, the cells are disrupted with dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), Cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, electrophoresis methods such as isoelectric focusing etc. Alternatively, it can be used in combination to obtain a purified preparation.
[0084]
In addition, when the protein is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the protein is recovered by a conventional method from the precipitate fraction obtained by crushing the cell and then performing centrifugation in the same manner. Thereafter, the insoluble material of the protein is solubilized with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution that does not contain a protein denaturant or the protein denaturant has such a concentration that the protein is not denatured. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method.
[0085]
When the protein of the present invention or a derivative such as a sugar modification product thereof is secreted extracellularly, the protein or its derivative such as a sugar chain adduct can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
[0086]
The protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Also, Kuwawa Trading (US Advanced Chem Tech), Perkin Elmer Jabang (Perkin Elmer US), Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech), Aloka (US Protein Technology Instrument), Kurabo (US) Synthecell-Vega>, Nippon Perceptive Limited (PerSeptive, USA), Shimadzu Corporation and other peptide synthesizers can be used for synthesis.
[0087]
(7) Plant transformant having the DNA of the present invention
The base sequences described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 15 are base sequences in a form obtained by extracting the original base sequence of the plant genome. This base sequence contains a promoter and terminator necessary for gene expression in an operable form. In the case of the direct introduction method, the gene to be introduced can be cloned into a general cloning vector such as cosmid pWE15 (manufactured by STRATAGENE). When Agrobacterium is used, it can be cloned into a general plant transformation vector such as pBI121 (Clontec).
[0088]
In addition, DNA of a base sequence obtained by extracting a part of introns from this sequence (genomic sequence), DNA of a base sequence obtained by extracting almost all introns, DNA represented by SEQ ID NO: 2 or its 238-2064th bases, DNA represented by SEQ ID NO: 16 or its 238-2064th base, DNA represented by SEQ ID NO: 18 or its 244-2073th base, or a portion corresponding to SEQ ID NO: 3 or its 80-687 residue, SEQ ID NO: Alternatively, DNA encoding a protein represented by 17 or a portion corresponding to residues 80 to 687 thereof, or SEQ ID NO: 19 or a portion corresponding to residues 82 to 690 thereof may be introduced into plant cells.
[0089]
Here, DNA having the 3754th to 5091th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the 1st to 811th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 transcribes mRNA with boil. It is a promoter with ability and is preferably used to restore male sterility.
Furthermore, the promoter and terminator moiety may be replaced with a promoter or terminator that functions in known plant cells.
In addition, it is represented by the above-mentioned DNA represented by SEQ ID NO: 2 or its 238-2064th base, DNA represented by SEQ ID NO: 16 or its 238-2064th base, SEQ ID NO: 18 or its 244-2073th base DNA, or SEQ ID NO: 3 or a portion corresponding to 80 to 687 residues thereof, SEQ ID NO: 17 or a portion corresponding to 80 to 687 residues thereof, or SEQ ID NO: 19 or a portion corresponding to residues 82 to 690 thereof In addition to this DNA, a promoter and a terminator are required when introducing DNA encoding a protein to be expressed into plant cells. A commonly used general expression vector is pBI121 (manufactured by clonetec), which is a cauliflower mosaic virus 35S promoter as a promoter and a nopaline synthase present in the A. tumefacience Ti plasmid as a terminator. The terminator is used. The promoter necessary for expression is not limited to the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus, but an rbcS promoter that is widely present in plants may be used, and more preferably a promoter of a type that is expressed during the pollen growing season, such as TA29. A promoter, more preferably, the original promoter coordinated upstream of the gene is used. The terminator is not limited to the terminator of the above-mentioned nopaline synthase, but a 35S terminator of cauliflower mosaic virus or the like can be used. More preferably, the original terminator coordinated downstream of the gene is used. In addition, it is represented by the above-mentioned DNA represented by SEQ ID NO: 2 or its 238-2064th base, DNA represented by SEQ ID NO: 16 or its 238-2064th base, SEQ ID NO: 18 or its 244-2073th base Or a portion corresponding to SEQ ID NO: 3 or 80-687 residues thereof, SEQ ID NO: 17 or a portion corresponding to 80-687 residues thereof, or a portion corresponding to SEQ ID NO: 19 or 82-690 residues thereof In addition to this sequence, a mitochondrial translocation sequence is required when using the DNA encoding the indicated protein for the purpose of recovering the sterility of cytoplasmic male sterile individuals.
The mitochondrial transition sequence is a DNA represented by the 1st to 237th bases of SEQ ID NO: 2 or a DNA encoding the 1st to 79th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the 1st to 237th positions of SEQ ID NO: 16 The DNA represented by the nucleotide or the DNA encoding the 1st to 79th amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, or the DNA represented by the 1st to 243rd base of SEQ ID NO: 18 or the 1st to 81st amino acid of SEQ ID NO: 19 The DNA encoding the sequence, and other known transfer sequences described above can be used.
[0090]
In the following Examples, the present inventors introduce the DNA of the Rf gene containing the intron contained in the genome from the original promoter to the terminator shown in SEQ ID NO: 1 into the plant in its original form. Therefore, a plant transformation vector was prepared. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was cut out from the clone forming a part of the contig using a restriction enzyme, subcloned into an appropriate cloning vector, and then introduced into the plant transformation vectors pKM424 and pBIGRZ2. Thus, a vector capable of introducing the fragment into a plant was obtained. This vector was introduced into Agrobacterium for plant transformation. By infecting a plant with Agrobacterium carrying this vector, the DNA fragment is integrated into the plant genome.
[0091]
Plants to which the gene of the present invention is applied include oil crops such as rapeseed, sunflower, soybean, and palm cocoon, for example, cereals such as rice, corn, and wheat, for example, florets such as tobacco and petunia, such as tomatoes, Examples include various vegetables such as broccoli, cabbage, Chinese cabbage, and carrots.
Of these, plants of the Brassica genus such as rapeseed, cabbage, Chinese cabbage, broccoli and tomatoes are preferred, rapeseed, cabbage, Chinese cabbage and broccoli are particularly preferred, and rapeseed is most preferred.
[0092]
In the present specification, transformed plant sources include seeds, seedlings, seedlings, callus, cultured cells, plant bodies, etc., for example, seedlings or protoplasts in the case of rapeseed; Cultured cells; sprout in the case of sunflower; callus or cultured cell in the case of palm palm; sprout, callus, cultured cell or protoplast in the case of rice; sprout, seedling, callus, cultured cell or protoplast in corn Seedlings, callus or cultured cells in the case of wheat; seedlings, callus, cultured cells or protoplasts in the case of cabbage and broccoli; seedlings, callus, cultured cells or protoplasts in the case of carrots; In addition, as is usually done by those skilled in the art, a preferred site is appropriately selected depending on the target plant. It may be performed in.
[0093]
Transformation methods to plants can be carried out according to conventional methods. For example, after introducing a vector into Agrobacterium once, the vector is introduced into a plant by infecting Agrobacterium with a plant cell, or electro Examples thereof include a method of directly introducing a vector into a cell using a poration method, a DEAE dextran method, a calcium phosphate method, a polyethylene glycol method, a particle gun method, and the like.
[0094]
For example, in the case of rapeseed, preferable gene introduction methods include the methods described below.
The hypocotyls of rapeseed cultivar germinated in MS medium containing saccharides such as sucrose as a carbon source are pre-cultured on MS medium containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and sucrose. Agrobacterium grown in YEB medium is collected by centrifugation and resuspended in MS medium containing sucrose. To this suspension, the previous rape hypocotyl was added and shaken, and then the taken hypocotyl was returned to the original preculture medium and co-cultured for 3 days, followed by plant hormones such as zeatin and benzylaminopurine, Selection is carried out by transferring to a selective medium containing carbenicillin and kanamycin. The green regenerated bud thus obtained is cultured in an elongation medium optionally containing plant hormones such as benzylaminopurine, and subsequently in a rooting medium optionally containing plant hormones such as naphthalene acetic acid and benzylaminopurine. Thus, a regenerated individual can be obtained, and by crossing this individual with an individual of the cms strain, an F1 hybrid in which fertility has been restored can be obtained.
[0095]
Thus, by introducing the DNA of the present invention into a plant, it becomes possible to recover the sterility of cytoplasmic male sterile individuals.
The regenerated individuals can be crossed with a rapeseed of the cms lineage, and the expression can be confirmed by investigating the fertility of its offspring, but when transformed using rapeseed having a cms cytoplasm as a material, The transformant (regenerated plant) having roots formed as described above is transferred to a soil containing normal fertilizer and allowed to flower, whereby pollen fertility can be investigated, which is preferable in terms of time and operation.
[0096]
In the above transformation, rapeseed cells or tissues having cms cytoplasm as cells to be used, preferably hypocotyls, cotyledons, leaves, pollen, cultured cells, callus, protoplasts were used for transformation as described above. In some cases, the plant body (regenerated individual) obtained by the above method can be transferred to a soil containing normal fertilizer and flowered to obtain a plant individual whose pollen fertility has been restored.
That is, a cms cell is used, the DNA of the present invention is introduced into the cms cell by the above-described gene transfer method, and the cell in which the DNA is incorporated into the nucleus is selected as an index for selecting a resistance marker for antibiotic resistance such as kanamycin or herbicide After selection, a plant body in which the DNA is incorporated into the nucleus can be obtained by culturing in the above-described extension medium and rooting medium. This plant body is made recoverable by recovering its male sterility character.
[0097]
As a method for detecting a gene involved in recovery of cytoplasmic male sterility, a 15-50mer oligonucleotide primer arbitrarily set from the DNA according to any one of claims 1 to 4, or any one of claims 1 to 4 The amount of the base sequence amplified by the primer or the amount of the base sequence detected by the probe in the target biological sample using a probe of at least 15 mer consisting of all or part of the DNA However, it can be performed by confirming that there are one or more genes in one genome.
[0098]
Specific confirmation methods include, for example, the PCR method and the Southern hybridization method, among which the PCR method is preferable. These methods are based on the methods described in Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Can be done.
[0099]
In order to confirm that there are one or more genes in one genome, the PCR method requires a DNA of the same copy number as a template as a simple method, and it is necessary to recognize the same degree of amplification. Using an arbitrary primer that amplifies a known gene that is known to exist in one genome as an internal standard using the PCR method, the amplification amount of this known gene and This can be confirmed by comparing the amount of the base sequence amplified by the primer. In the Southern hybridization method, the amount of DNA detected by comparing the DNA of a fertile recovery line plant individual whose DNA is known to be one gene in one genome with the DNA of the target plant sample in equal amounts. Are the same or higher.
[0100]
Examples of the primer used in the PCR method include 15 to 50-mer oligonucleotides having the same or complementary to the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
The probe used in the Southern hybridization method is the entire double-stranded DNA identical to the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a part thereof of at least 15 mer or more, or the entire single-stranded DNA or its complementary strand or A part of which is at least 15 mer or more. Further, as described above, DNA having a certain degree of homology with the base sequence of DNA used as a probe can be mentioned. The homology above a certain level is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 97% or more. is there. Note that. As used herein, DNA having a certain degree of homology includes both the above-mentioned polynucleotide having homology and its complementary polynucleotide.
[0101]
The method for detecting the gene described above not only confirms whether or not the DNA is integrated in the transformant, but also confirms the presence or absence of the Rf gene even in individuals attempting to introduce the Rf gene by mating. It can be used as a means to do. If this method is used, when the Rf gene is introduced into a cytoplasmic male sterile individual, it is possible to confirm the presence or absence of the Rf gene before flowering. In addition, when the Rf gene is introduced into an individual having normal cytoplasm, it is necessary to confirm the fertility of the next generation individual obtained by mating the pollen at the time of flowering to a cytoplasmic male sterile individual. By using this method, the presence or absence of the Rf gene can be confirmed before this. Such a utilization method is generally called utilization of marker DNA or marker DNA breeding. In the case of the Rf gene, it can be considered that the Rf gene is used as a marker DNA (Rf marker). As described above, the Rf marker is important in breeding practical varieties using a recombinant individual into which the DNA has been introduced or a plant into which the Rf gene has been introduced by mating as a non-recombinant. is there.
[0102]
In order to confirm whether or not the introduced DNA functions as an Rf gene, it is possible to confirm the recovery of fertility of the transformant as described above. But you can do it.
As described above, the Rf gene restores the fertility of the plant body by decreasing the accumulation amount in the mitochondria of the ORF125 or ORF138 protein that is the cms-causing protein. Therefore, in the mitochondria of the transformed individual, it can be confirmed that the transgene is the Rf gene by confirming a decrease in the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated.
[0103]
As a method for confirming a decrease in the amount of ORF125 or ORF138 protein accumulated in mitochondria, an antibody against a protein derived from a mitochondrial genome used as an internal standard when detecting ORF125 or ORF138 protein by Western blotting according to the conditions described in the present specification, For example, anti-F described in N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100: 949-955, 2000. ₁ -F ₀ The amount of ATPase (hereinafter abbreviated as ATPA) signal is equal between cytoplasmic male sterile individuals and those who have recovered the fertility or transformed individuals introduced with the DNA into cytoplasmic male sterile individuals, and are cytoplasmic male Compared with the accumulated amount of ORF125 or ORF138 protein in sterile individuals, the accumulated amount in fertile restored individuals or transformed individuals introduced with cytoplasmic male sterile individuals is reduced by more than 50%, preferably 60% or more More preferably, it is a method for confirming a decrease of 80% or more.
[0104]
In fact, in the buds of cytoplasmic male sterile radish with ORF125, when fertility recovery gene Rf is introduced, the amount of ORF125 protein accumulated is drastically reduced and hardly detected. In the rapeseed, it was observed that the accumulation of ORF125 protein decreased by 80% or more in the bud of fertile rapeseed in which the fertility-recovering rape was introduced into the cytoplasmic male sterile rapeseed having cytoplasmic ORF125 by mating. ing. Also in the Examples, it was observed that the amount of ORF125 protein accumulated was reduced by 80% or more in the buds of transformed rapeseed into which the DNA was introduced into cytoplasmic male sterile individuals.
In addition, the antibody with respect to ORF125 and ORF138 protein in the above-mentioned method can be obtained by using the following general methods. That is, antisera can be obtained by immunizing animals with these proteins as antigens, and immunoglobulin G antibodies can be purified by using an affinity column bound with protein A. The antigen to be used can be obtained by purifying a protein from an expressed cytoplasmic male sterile plant or this cultured cell by a conventional method. It can also be obtained by connecting the ORF125 or ORF138 gene to an expression vector, expressing it in E. coli or yeast, and purifying it in the same manner. Furthermore, peptides obtained by chemically synthesizing the full length or a part of ORF125 or ORF138 can also be used as antigens. An antibody against ATPA can be obtained in the same manner.
[0105]
Furthermore, by introducing a part or all of the gene of the present invention together with an inducible promoter into a cell having a cms cytoplasm and having the DNA of the present invention, the expression of the DNA of the present invention can be specifically performed. By temporarily controlling, it is possible to create a new hybrid seed production system that does not require a male sterility maintenance line (maintenance line) necessary for hybrid seed production.
[0106]
In other words, since the rapeseed of the cms line is usually sterile, in order to grow and maintain the cms line, a separate maintenance line that does not involve cms and Rf is necessary. For production, three plants of the Rf line, cms line, and maintenance line were required. However, since the Rf gene was isolated and identified according to the present invention, the promoter of the chemical substance was used during hybrid production. By using the method of inducing and controlling the expression of the recovery gene, it is possible to construct a cms line that can be grown and maintained without a maintenance line.
[0107]
Specifically, a part or the entire length of the gene of the present invention is incorporated in the antisense or sense orientation into a vector having a promoter derived from the outside, for example, a drug-sensitive promoter, and the vector is used to produce a cms cytoplasm. And a cell having the DNA of the present invention.
The cells having the cms cytoplasm and having the DNA of the present invention are not only those obtained by transforming cells having the cms cytoplasm with the DNA of the present invention according to the above-mentioned method, but also mating the cms line and the Rf line. May be obtained.
The above inducible promoter is known from, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-46697, and a method similar to that described above can be used as a method for creating and transforming a vector.
[0108]
A transformant having a cms cytoplasm obtained by the above method and having the DNA of the present invention and further incorporating part or all of the DNA of the present invention together with an inducible promoter is usually a promoter. Is not induced, the plant is pliable by the Rf gene originally present, and the strain can be maintained by self-pollination, but the ability to induce a promoter in this plant during hybrid production The expression of the Rf gene is inhibited by the action of a chemical substance having a Thereby, since the plant becomes male-sterile, it can be used as a cms line at the time of hybrid seed production.
Therefore, by using this method, even if it is a cms line, it can be propagated and maintained by self-pollination. Therefore, conventionally, 3 lines were necessary for the production of hybrid seed. Is no longer necessary, and production costs can be greatly reduced.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is described in more detail, this invention is not limited at all by these Examples.
[0109]
【Example】
Example 1: Isolation of DNA marker linked to cytoplasmic male sterility recovery gene and preparation of genome map
In order to isolate the fertility recovery gene (Rf gene), first, a DNA marker located in the vicinity of the Rf gene is isolated, and a genome map showing the relationship between the genetic distance of this DNA marker and the Rf gene is prepared. There is a need. As a starting point, positional cloning of the Rf region was performed.
[0110]
For the DNA marker isolation method, AFLP Analysis System I AFLP Starter Primer Kit of GIBCO BRL, which conforms to the AFLP (Amplified fragment length polymorphism) method (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21 4407-4414). AFLP was performed according to As a material for measuring the genetic distance to the marker, 1 individual ((KC2 / KA1) -1) of the cms line radish (Raphanus sativus cv. Kosena) and 1 of the radish radish (Raphanus sativus cv. Yuanhong) which is the Rf line. According to the method described in N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100: 949-955 2000, about 2100 individuals obtained by self-pollination of 8 radish F1 generation individuals The F2 population was used. As a result, five markers linked to positions separated by a genetic distance of 0.2 to 0.3 cM on both sides were isolated in such a way as to sandwich the Rf gene. A genome map showing the genetic distance between each DNA marker and the Rf gene is shown in FIG.
[0111]
Example 2: Preparation of contig based on genome map and analysis of Rf gene
Following the creation of the genome map, it is necessary to clone the genomic DNA corresponding to the position and connect the DNA markers sandwiching the Rf gene. Here, since the distance between the DNA marker and the Rf gene is large, a contig of the Rf gene region covering between the DNA markers was prepared by connecting a plurality of clones having genomic DNA fragments.
[0112]
A collection of clones having genomic DNA fragments is called a genomic library, and we have created two types of libraries. As DNA donor, F ₂ Genomic DNA was prepared by the CTAB method (Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321) from the same Japanese red radish as the parent of the recovery line used when creating the population. . The library uses a λDASHII vector (manufactured by STRATAGENE) as a lambda vector, an average length of 20 kb, and a population number of 1.5 × 10 ^Five Individual lambda phage libraries were generated. In addition, using pWEB :: TNC vector (manufactured by EPICENTRE TECHNOLOGIES) as a cosmid vector, the average length is 40 kb, the population number is 5.5 × 10. ^Four Individual cosmid libraries were prepared.
[0113]
First, lambda clones were isolated from the lambda phage library prepared above using the plaque hybridization method using the DNA markers located on both sides of the Rf gene as indicators. Further, a cosmid clone was isolated from the cosmid library using a colony hybridization method, and a contig covering between DNA markers at both ends as shown in FIG. 1 was completed. The base sequences of cosmid clones NIT7 / 2 and TO3-2, which are part of the contig, were determined by conventional methods.
[0114]
Subsequently, the base sequences of cosmid clones NIT7 / 2 and TO3-2, which are part of the above contig, are similar in radish and genomic DNA sequence using “Genscan” (Mitsubishi Space Software). Analysis was performed with the parameters for Arabidopsis thaliana for which the entire genome sequence was determined. As a result, a promoter part that is supposed to express the Rf gene, a structural gene part including an intron, and a terminator part were discovered. Furthermore, the gene was translated into the protein from which the intron was removed, and the amino acid sequence for that gene was obtained.
[0115]
Example 3: Subcloning of genomic DNA region
An HpaI-SwaI fragment (8546 bp) of DNA consisting of the nucleotide sequence of 1 to 8553 described in SEQ ID NO: 1, which sufficiently contains a terminator from the promoter estimated by “Genscan”, is used for fragment recovery agarose (manufactured by FMC). It was separated from the vector by gel electrophoresis using. The gel containing the DNA fragment was digested with a gel-degrading enzyme (manufactured by Epicentre Technologies) to recover the DNA. Furthermore, a cloned fragment obtained by cleaving the obtained fragment with the restriction enzyme BamHI was obtained. These DNA fragments were subcloned into pGEM-T easy vector (Promega) to obtain cds6BT / pGEM-T easy. Details will be described below.
[0116]
100 μl of 1 × K restriction enzyme buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM Dithiothreitol, 100 mM KCl), 1 μg of NIT7 / 2 cosmid DNA and 10 units of restriction enzyme HpaI (Takara Shuzo) were added and heated at 37 ° C. for 1 hour.
[0117]
After heating, add 10 μl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 250 μl of ethanol, stir, cool at −80 ° C. for 5 minutes, and centrifuge at 15000 rpm, 4 ° C. for 15 minutes. Remove the supernatant, add 1 ml of 70% ethanol gently, and centrifuge at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. Remove the supernatant and dry the precipitate for 5 minutes using a centrifugal vacuum dryer. Dissolve 89 μl of sterilized water in the recovered DNA precipitate.
[0118]
In the dissolved DNA solution, 10 μl of 10 × H restriction enzyme buffer (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl ₂ , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM NaCl) and 1 μl of 10 unit / μl restriction enzyme SwaI (Takara Shuzo) were added and heated at 25 ° C. for 1 hour. 11 μl of 10 × loading buffer (1% SDS, 50% Glycetrol, 0.05% Bromophenol Blue) was added.
[0119]
Add 1.2 g of low melting point agarose SeaPlaqueGTG agarose (FMC) and 150 ml of 1 × TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) buffer, heat to 100 ° C. to dissolve the agarose, and stir to 45 ° C. While cooling. A comb of 30 mm width × 1 mm thickness was placed on a 14 × 15 cm gel tray, and the cooled gel was poured and hardened. The DNA added with loading dye was poured into a gel comb and electrophoresed for 18 hours at a voltage of 1 × TAE and 30 V / 30 cm.
[0120]
The electrophoresed gel was transferred to a 0.5 μg / ml ethidium bromide / 1 × TAE solution and stained for 30 minutes. The gel was placed on a transilluminator that radiated 365 nm long wave ultraviolet light, and the desired 8546 bp fragment was cut out using a sterilized scalpel. Further, the gel was chopped into pieces of about 1 mm square, transferred to a pre-weighed 2 ml microtube, and the weight of the gel was weighed.
[0121]
1 μl of 50 × GELase Buffer (2M Bis-Tris (pH 6.0), 2M NaCl) was added to the gel weight of 50 mg. The tube containing the gel was placed in a dry heat block heated to 68 ° C., and the tube was sometimes stirred up and down and heated for 10 minutes to completely dissolve the gel. The tube was transferred to a 45 ° C. dry heat block, stirred while occasionally moving the tube up and down, and heated for 5 minutes. To this tube, 1 unit of GELase (manufactured by Epicentre Technologies) was added to the gel weight of 200 mg, and the mixture was stirred with a dry heat block at 45 ° C. while occasionally moving the tube up and down, and heated for 30 minutes.
[0122]
1/3 volume of 10M ammonium acetate (pH 7.0) was added to the gel volume, and the mixture was stirred and centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred to a new 2 ml microtube and 2 volumes of ethanol were added to the top. The tube was stirred and then centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The supernatant was removed, and 1 ml of 70% ethanol was gently added and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a centrifugal vacuum dryer. To the precipitate, 20 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added and completely dissolved, and the DNA fragment was recovered.
[0123]
To 20 μl of the collected DNA solution, add 10 μl of 10 × K restriction enzyme buffer (200 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM MgCl ₂ , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM KCl), 68

μl dH

₂ 0, 2 μl of 10 unit / μl of restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Shuzo) was added and heated at 30 ° C. for 1 hour. After heating, add 10 μl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 250 μl of ethanol, stir, cool at −80 ° C. for 5 minutes, and centrifuge at 15000 rpm, 4 ° C. for 15 minutes. Remove the supernatant, add 1 ml of 70% ethanol gently, and centrifuge at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. Remove the supernatant and dry the precipitate for 5 minutes using a centrifugal vacuum dryer. Dissolve 20 μl of sterilized water in the collected DNA precipitate. 55 μl sterile water, 10 μl 10 × PCR buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl), 6 μl 25 mM MgCl ₂ 8 μl of 2.5 mM dNTP mix and 1 μl of 5 unit / μl of rTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) were added and mixed, followed by heating at 72 ° C. for 30 minutes to add dATP to the 3 ′ end.
[0124]
The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration filter unit: Microcon-50 (Millipore) and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The trap water was discarded, 100 μl of sterilized water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. 20 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added, the filter unit was removed, and the orientation was inverted and attached to a new microtube. The filter unit DNA was recovered by centrifugation at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes.
[0125]
1 μl of 50 ng / μl pGEM-T easy vector (Promega) and 6 μl of DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) I solution were mixed with 5 μl of purified DNA obtained by the above method. Incubated at 16 ° C. for 30 minutes.
[0126]
The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration filter unit: Microcon-50 (Millipore) together with 100 μl of sterilized water and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The trap water was discarded, 100 μl of sterilized water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The filter unit was removed and mounted in a new microtube with the orientation reversed.
The filter unit DNA was recovered by centrifugation at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes.
[0127]
The collected DNA was placed on ice on a tube and cooled. 30 μl of E. coli DH10B for electroporation (manufactured by Gibco BRL) was placed in a tube and mixed gently. The Escherichia coli mixed with DNA was transferred to a cuvette (made by USA Scientific Plastics) for electroporation (electrode spacing 1 mm) previously cooled on ice. Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.25 kv, 129 Ω, 50 μF, and then immediately 500 μl of SOC medium (Gibco BRL) warmed to 37 ° C. was added to the cuvette. . E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. LB agar medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto) containing 100 μg / ml Ampiciline (Wako Pure Chemical Industries), 20 μg / ml X-Gal (Takara Shuzo), 1 mM IPTG (Takara Shuzo) -Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar), the cultured E. coli was spread and cultured at 37 ° C. for 18 hours or longer.
[0128]
White colonies that appeared on the agar medium were cultured at 37 ° C. for 18 hours or longer in 2 ml of LB medium supplemented with 100 μg / ml of AmpiciIlin. Plasmid DNA was extracted from the cultured Escherichia coli by a conventional method. It was confirmed by digestion with the restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) that the desired fragment was cloned into the plasmid DNA, and cds6BT / pGEM-T easy was obtained.
[0129]
Each Escherichia coli DH10B retaining cds6BT / pGEM-T easy obtained by the above method was cultured at 37 ° C. for 18 hours in 100 ml of LB medium supplemented with 100 μg / ml of AmpiciIlin. The product was purified by an alkaline SDS method using a Qiagen Midi kit (manufactured by Qiagen).
[0130]
Example 4-1 Production of Plant Transformation Vector (1)
After cds6BT / pGEM-Teasy was cleaved with restriction enzyme EcoRI, it was separated from the vector by gel electrophoresis using agarose for fragment recovery, and the recovered DNA fragment was converted into plant transformation vector pKM424 (pKM424 with CaMV35S promoter: GUS gene: A vector to which the NOS terminator fragment was added was cloned into the EcoRI site of pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290 vector) to obtain a plant transformation vector cds6BT / pKM424.
[0131]
100 μl of 1 × H restriction enzyme buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl), 1 μg of cds6BT / pGEM-T easy DNA and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) were added and heated at 37 ° C. for 1 hour.
Thereafter, an EcoRI fragment containing cds6BT was separated and recovered from cds6BT / pGEM-T easy in the same manner as the above HpaI-SwaI fragment was removed.
[0132]
100 μl of 1 × H restriction enzyme buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl), 1 μg of plant transformation vector pKM424 and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) were added and heated at 37 ° C. for 1 hour. After warming, 100 μl of 1M Tris-HCl (pH 8.0) and 1 unit of Bacterial Alkaline Phosphatase (Takara Shuzo) were added and mixed, and then heated at 50 ° C. for 1 hour to dephosphorylate.
[0133]
Phenol / chloroform saturated with 200 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added and stirred vigorously. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes, transfer the supernatant to a new tube. The same operation was repeated once more to remove the protein. 20 μl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 500 μl of ethanol were added and stirred, cooled at −80 ° C. for 5 minutes, and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed, and 1 ml of 70% ethanol was gently added and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a centrifugal vacuum dryer. 100 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to the precipitate to completely dissolve it to a concentration of 10 ng / μl.
[0134]
10 μl of the purified EcoRI fragment, 1 μl of dephosphorylated pKM424 vector and 11 μl of DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) I solution were mixed and incubated at 16 ° C. for 30 minutes.
[0135]
The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration filter unit: Microcon-50 (Millipore) together with 100 μl of sterilized water and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The trap water was discarded, 100 μl of sterilized water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The filter unit was removed and mounted in a new microtube with the orientation reversed.
The filter unit DNA was recovered by centrifugation at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes.
[0136]
The collected DNA was placed on ice on a tube and cooled. 30 μl of E. coli DH10B for electroporation (manufactured by Gibco BRL) was placed in a tube and mixed gently. The Escherichia coli mixed with DNA was transferred to a cuvette (made by USA Scientific Plastics) for electroporation (electrode spacing 1 mm) previously cooled on ice. Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.25 kv, 129 Ω, 50 μF, and then immediately 500 μl of SOC medium (Gibco BRL) warmed to 37 ° C. was added to the cuvette. . E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. Spread cultured E. coli on LB agar medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) with 50 μg / ml Spectinomycin (manufactured by Sigma) for 18 hours The cells were cultured at 37 ° C.
[0137]
Colonies that appeared on the agar medium were cultured at 37 ° C. for 18 hours or longer in 2 ml of LB medium supplemented with 50 μg / ml of spectinomycin. Plasmid DNA was extracted from the cultured Escherichia coli by a conventional method. The plasmid DNA was confirmed to have been cloned from the BamHI site to the HpaI site by digestion with the restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo), and designated as cds6BT / pKM424.
E. coli DH10B retaining cds6BT / pKM424 was cultured at 37 ° C. for 18 hours in 250 ml of LB medium supplemented with 50 μg / ml of spectinomycin. The product was purified by an alkaline SDS method using a Qiagen Midi kit (Qiagen).
[0138]
Example 4-2: Production of plant transformation vector (2)
A lambda clone CHI (see FIG. 2, having a cloning fragment length of about 17 kb) sufficiently retaining the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 is cleaved with a restriction enzyme NotI (Takara Shuzo Co., Ltd.) present at the multiple cloning site, and then agarose for fragment recovery. The DNA fragment separated from the vector by gel electrophoresis using, and the recovered DNA fragment cloned into the NotI site of the plant transformation vector pBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39) CHI / pBIGRZ2. Details are shown below.
[0139]
In 100 μl of 1 × H restriction enzyme buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100), 1 μg of lambda clone CHI DNA and 10 Unit restriction enzyme NotI (Takara Shuzo) was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the NotI fragment of lambda clone CHI was separated and recovered by the same method in which the HpaI-SwaI fragment was taken out.
[0140]
100 μl of 1 × H restriction enzyme buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100), add 1 μg of plant transformation vector pBIGRZ2 and 10 units of restriction enzyme NotI (Takara Shuzo) and add at 37 ° C for 1 hour. Warm up. After warming, 100 μl of 1M Tris-HCl (pH 8.0) and 1 unit of Bacterial Alkaline Phosphatase (Takara Shuzo) were added and mixed, and then heated at 50 ° C. for 1 hour to dephosphorylate.
[0141]
Phenol / chloroform saturated with 200 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added and stirred vigorously. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes, transfer the supernatant to a new tube. The same operation was repeated once more to remove the protein. 20 μl of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 500 μl of ethanol were added and stirred, cooled at −80 ° C. for 5 minutes, and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed, and 1 ml of 70% ethanol was gently added and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried for 5 minutes using a centrifugal vacuum dryer. 100 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to the precipitate to completely dissolve it to a concentration of 10 ng / μl.
[0142]
10 μl of purified NotI fragment, 1 μl of dephosphorylated pBIGRZ2 vector, and 11 μl of DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) I solution were mixed and incubated at 16 ° C. for 30 minutes.
The above reaction solution was transferred to an ultrafiltration filter unit: Microcon-50 (Millipore) together with 100 μl of sterilized water and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The trap water was discarded, 100 μl of sterilized water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The filter unit was removed and mounted in a new microtube with the orientation reversed. The filter unit DNA was recovered by centrifugation at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes.
[0143]
The collected DNA was placed on ice on a tube and cooled. 30 μl of E. coli DH10B for electroporation (manufactured by Gibco BRL) was placed in a tube and mixed gently. The Escherichia coli mixed with DNA was transferred to a cuvette (made by USA Scientific Plastics) for electroporation (electrode spacing 1 mm) previously cooled on ice. Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.25 kv, 129 Ω, 50 μF, and then immediately 500 μl of SOC medium (Gibco BRL) warmed to 37 ° C. was added to the cuvette. . E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. Spread the cultured E. coli on LB agar medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) supplemented with 25 μg / ml Kanamycin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Cultured at 37 ° C for 18 hours or more.
[0144]
Colonies that appeared on the agar medium were cultured at 37 ° C. for 18 hours or longer in 2 ml of LB medium supplemented with 25 μg / ml Kanamycin. Plasmid DNA was extracted from the cultured Escherichia coli by a conventional method. It was confirmed by digestion with the restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.) that the desired fragment had been cloned into the plasmid DNA, and designated CHI / pBIGRZ2.
E. coli DH10B retaining CHI / pBIGRZ2 was cultured at 37 ° C. for 18 hours in 250 ml of LB medium supplemented with 25 μg / ml Kanamycin. The product was purified by an alkaline SDS method using a Qiagen Midi kit (Qiagen).
[0145]
Example 5: Introduction of a vector for plant transformation into Agrobacterium
Agrobacterium competent cells were prepared, and each of the cds6BT / pKM424 vector and CHI / pBIGRZ2 vector obtained in Examples 4-1 and 4-2 was introduced into the prepared Agrobacterium EHA101 for plant transformation. . Details are shown below.
[0146]
A competent cell for electroporation of Agrobacterium EHA101 was produced by the following method. Streak Agrobacterium EHA101 on LB agar medium supplemented with 50 μg / ml Kanamycin (Wako Pure Chemical Industries), 25 μg / ml Chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries), and incubate at 28 ° C. for 24 hours or more. A single colony was obtained. 20 ml of LB medium supplemented with 50 μg / ml Kanamycin and 25 μg / ml Chloramphenicol was placed in a 50 ml centrifuge tube, colonies having a diameter of about 1 mm were inoculated, and cultured with shaking at 28 ° C. for 40 hours. After 40 hours, the lid of the centrifuge tube was opened and closed once, and further cultured for 4 hours. The culture was collected by centrifugation at 1500 × g at 4 ° C. 40 ml of ice-cooled sterilized 10% glycerol was placed in a tube in which the supernatant was discarded, and the cells were resuspended and collected by centrifugation at 1500 × g and 4 ° C. This operation was repeated twice. 500 μl of sterilized 10% glycerol cooled with ice was added to the obtained cells and resuspended. The cells were dispensed in 100 μl sterilized microtubes, frozen with liquid nitrogen, and stored in a −80 ° C. freezer.
[0147]
A competent cell for electroporation of Agrobacterium EHA101 was melted on ice water. 40 μl of electrocompetent cells were placed in a pre-chilled 1.5 ml tube, and 100 ng of cds6BT / pKM424 or CHI / pBIGRZ2 plasmid DNA was added and mixed gently.
[0148]
Agrobacterium mixed with DNA is transferred to a cuvette (manufactured by USA Scientific Plastics) for electroporation (electrode spacing 1 mm) previously cooled on ice. Using an Electro Cell Manipulator 600 (BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.44 kv, 129Ω, 50 μF, and immediately after that, 500 μl of SOC medium (Gibco BRL) heated to 30 ° C. was added to the cuvette. . Agrobacterium is transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 30 ° C for 1 hour.
Agrobacterium introduced with cds6BT / pKM424 vector is 50μg / ml Kanamycin (Wako Pure Chemicals), 25μg / ml Chloramphenicol (Wako Pure Chemicals), 50μg / ml Spectinomycin (Sigma), 2.5μg / ml Tetracycline Spread cultivated Agrobacterium on LB agar medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) with Sigma In culture.
Agrobacterium introduced with CHI / pBIGRZ2 vector is LB agar medium supplemented with 50μg / ml Kanamycin (Wako Pure Chemicals), 25μg / ml Chloramphenicol (Wako Pure Chemicals), 30μg / ml Hygromycin (Sigma) The cultured Agrobacterium was spread and cultured at 28 ° C. for 24 hours or longer.
[0149]
Colonies that appeared on the agar medium were cultured at 30 ° C. for 24 hours or longer in 2 ml of LB medium supplemented with the above antibiotics suitable for each vector. Plasmid DNA was extracted from the cultured Agrobacterium by a conventional method, and it was confirmed by digestion with restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) that the cds6BT / pKM424 vector or CHI / pBIGRZ2 vector was introduced into Agrobacterium. The confirmed clones were mixed with an equal volume of sterile 80% glycerol added to the culture medium cultured for 24 hours, and stored at −80 ° C., and used for rapeseed transformation.
[0150]
Example 6: Production of rapeseed transformant
Transformation into rapeseed was performed as follows. CMS rapeseed (SW18) seeds with corn root causative gene orf125 derived from radish were sterilized with 10% hypochlorous acid solution and hormone-free MS medium (T. Murashige and F. Skoog Physiol. Plant. 15: 485, 1962). Only the hypocotyl portion was cut out from the seedlings 7 to 14 days after germination and cut into 3-5 mm lengths, MS medium (Sigma M5519) + sucrose 3% + 2.4-D 1 mg / l, agarose (Sigma) , Type I) Precultured at 0.4% at 23 degrees for 12-16 hours. At this time, cocultivation with tobacco-derived cell line BY-2 was performed for protective culture.
[0151]
On the other hand, Agrobacterium containing CHI / pBIGRZ2 is cultured at 28 ° C for 8-48 hours, and OD ₆₀₀ Grow to about 1.0. Agrobacterium cells were suspended in a liquid MS hormone-free medium. The cut hypocotyl and this Agrobacterium solution were mixed and cultured together for about 20 minutes. After co-cultivation, the hypocotyl from which Agrobacterium was removed with filter paper was cultured for 2 days in a medium of MS basic medium + B5 vitamin (Sigma, M0404) + sucrose 3% + 2,4-D 1 mg / l and infected. . After infection, sterilization medium containing 500 mg / l of antibiotic carbenicillin (Pfizer, Zeopen or GIBCO-BRL Carbenicillin disodium salts) in MS basic medium + B5 vitamin + sucrose 3% + 2, 4-D 1mg / l The hypocotyl was transplanted to remove Agrobacterium.
[0152]
After 1 week from the above-mentioned sterilization medium, the hypocotyl is added to MS basic medium + B5 vitamin + sucrose 1% + benzylaminopurine 3mg / l + carbenicillin 500mg / l, silver nitrate 5mg / l, and for selection The cells were cultured for 14 to 21 days in a medium supplemented with kanamycin 5-30 mg / l (Nacalai Tesque, Kanamycin sulfate). Since green callus may appear at this time, they were promptly replanted in the medium of the next step.
[0153]
As the medium for the next step, for example, there is a selective medium containing MS medium (Sigma, M5519) + sucrose 1% + benzylaminopurine 3 mg / l + zeatin 1 mg / l + carbenicillin 500 mg / l + kanamycin 5-30 mg / l. The hypocotyl that formed callus from the cut was transplanted into this medium and cultured at 23 ° C. for 3 weeks. Thereafter, transplantation was repeated 3 to 5 times every 3 weeks until green callus appeared.
[0154]
As soon as the green callus was found, it was cut from the hypocotyl and transferred to a medium of the same composition. Then, when only the green part was cut and planted, adventitious buds were formed with a probability of 1 to 30%. Adventitious buds were then transferred to B5 basic medium (Sigma, G5893) + sucrose 3% + benzylaminopurine 1 mg / l, then MS medium (Sigma M5519) + sucrose 3% + naphthalene acid 0.1 mg / l + benzyl Rooted in a medium containing 0.01 mg / l aminopurine.
[0155]
Example 7: Analysis of transformant (detection of introduced DNA)
One leaf was taken from one individual of the transformant having a bud obtained in Example 6, and DNA was isolated using a DNA isolation kit (DNeasy plant mini) manufactured by Qiagen.
Using the PCR method, three sites (a, b, c sites) of the introduced DNA fragment were detected (results are shown in FIG. 3). The a site is 568 bp from the base sequence 3186 bp to 3753 bp of SEQ ID NO: 1, “5′-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3 ′” (SEQ ID NO: 4) as the forward primer, “5′-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3 ′” (sequence) as the reverse primer Number 5) was used. The b site is 244 bp from the nucleotide sequence 4869 bp to 5112 bp of SEQ ID NO: 1, “5′-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3 ′” (SEQ ID NO: 6) as the forward primer, and “5′-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3 ′” (sequence) as the reverse primer. Number 7) was used. The c site is 485 bp from the base sequence 7766 bp to 8250 bp of SEQ ID NO: 1, "5'-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3 '" (SEQ ID NO: 8) as a forward primer, and "5'-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3'" (sequence) as a reverse primer Number 9) was used.
[0156]
1 μl of the transformant DNA solution (50 ng / μl), 12.1 μl of sterile water, 2 μl of 10 × PCR buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl), 1.2 μl of 25 mM MgCl2, 1.6 μl of 2.5 Add 1 μl of 10 μM forward primer solution at each site, 1 μl of 10 μM reverse primer solution at each site, 0.1 μl of 5 unit / μl rTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) and mix at 94 ° C. for 40 seconds. The DNA was amplified by repeating a cycle of 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 minute 35 times. As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used. After completion of the reaction, amplification products were confirmed by gel electrophoresis of 4% Nusive3: 1 Agarose (manufactured by FMC) / 1 × TBE (89 mM Tris-borate, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA) buffer (see FIG. 3). ).
[0157]
As a result, it was found that the site a was not introduced into this transformed rapeseed. In the remaining two places (b and c sites), an amplification product having the same size as that of the positive control was obtained, and it was confirmed that the DNA was incorporated into the transformed rapeseed.
[0158]
Example 8: Analysis of transformant (confirmation of decrease in the amount of accumulated ORF125 of cms-causing protein)
One bud of the same individual as in Example 7 was taken, and the decrease in the accumulated amount of ORF125, which is a CMS protein, was analyzed by Western blotting. The results are shown in FIG.
[0159]
(1) Protein extraction from transformed individuals
The protein extraction method and Western blotting method were performed according to the method of N. Koizuka et al. (Theor Appl Genet (2000) 100: 949-955).
Specifically, one transformed rape bud (length 1 mm) and 100 μl of ice-cold protein extraction buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2% (W / V) SDS) Was placed in an ice-cooled mortar and ground with a pestle. This solution was transferred to a microcentrifuge tube and centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new microcentrifuge tube and heated at 100 ° C. for 5 minutes. The mixture was centrifuged again at 15000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was transferred to a new microcentrifuge tube to obtain an SDS soluble protein solution. The concentration of the SDS-soluble protein solution was measured using a protein quantification kit (manufactured by Bio-rad) based on the Bradford method. In parallel with this, an SDS soluble protein solution was similarly extracted from the buds of the rapeseed of the cytoplasmic male sterile line and the rapeseed of the restored fertile line, and the concentration was measured.
[0160]
(2) Separation of proteins by SDS-PAGE and transfer to PVDF membrane: Western blotting
Using a 7 × 10 cm square 10% SDS polyacrylamide gel, 15 μg of SDS soluble protein was loaded per lane and separated by electrophoresis. In addition, for comparison of the amount of ORF125 protein accumulation, a dilution series of rapeseed of cytoplasmic male sterile lines was also mounted and separated. The electrophoresis conditions were 10 mA for 1 hour and 15 mA for 1 hour. After electrophoresis, the protein in the polyacrylamide gel was transferred to a PVDF membrane (Millipore) under the condition of 100 mA for 1 hour using a semi-drying apparatus (Nippon Kagaku).
[0161]
(3) Protein detection using antibodies: Western blotting
Divide the protein-transferred PVDF membrane into two upper and lower pieces, transfer to 10 ml blocking solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween20, 5% skim milk) and shake for 1 hour. , Blocked. The upper PVDF membrane detected ATPA as a control of mitochondrial protein, and the lower PVDF membrane detected ORF125, a cytoplasmic male sterility related protein. 10 ml of the primary antibody reaction solution (100 ml of ATPA monoclonal antibody was added to 10 ml of blocking solution for detecting ATPA, and 2 μl of rabbit antiserum against ORF125 was added to detect ORF125 (M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology). (1999) 39: 183-188)), the PVDF membrane was transferred and shaken for 18 hours. The PVDF membrane was transferred to 100 ml of TTBS (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween20) and shaken for 10 minutes. This operation was repeated 3 times to wash away excess primary antibody solution. 10 ml secondary antibody reaction solution (goat anti-mouse IgG (Amersham) with 10 μl peroxidase added to 10 ml blocking solution for ATPA detection), goat anti-rabbit IgG with 10 μl alkaline phosphatase added to detect ORF125 (Bio-rad) was added (M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188))) and the PVDF membrane was transferred and shaken for 1 hour each. The PVDF membrane was transferred to 100 ml of TTBS (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween20) and shaken for 10 minutes. This operation was repeated three times to wash away excess secondary antibody solution. For detection of ATPA, a chemiluminescence system “ECL +” (manufactured by Amersham) for peroxidase was used for exposure detection for 5 seconds. For detection of ORF125, color development was detected for 5 minutes using BCIP / NBT (manufactured by MOSS Inc.) which is a chromogenic substrate for alkaline phosphatase.
[0162]
As a result, the accumulation amount of ATPA as a control hardly changes in the buds of two lines of cytoplasmic male sterilized rape, recovered rapeseed, and buds of transformed rapeseed in which the DNA was inserted into the cytoplasmic male sterilized line. However, it was shown that the amount of ORF125 protein accumulated was significantly reduced in the transformed rapeseed. The degree of this decrease is equivalent to that of a fertility restoration line in which a fertility restoration gene is introduced into a cytoplasmic male sterile line by mating (FIG. 4 and M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39: 183). -188). In addition, when the degree of decrease in the amount of ORF125 protein accumulated was compared with that of the dilution series, it was found that it was 1/8 to 1/16 for fertile rapeseed and about 1/8 for transformed rapeseed. As described above, the recovery of fertility in rapeseed and the decrease in the accumulated amount of ORF125 protein are strongly linked and have a consensus relationship, so that the DNA sequence is ORF125 in mitochondria. It was proved to be a genomic DNA sequence having a function of reducing protein accumulation and retaining a fertility recovery gene.
Furthermore, when buds were taken out from the flowering bodies and observed under a microscope, it was confirmed that normal pollen was formed (FIG. 5).
[0163]
Example 9: Isolation of cDNA
Isolation of cDNA was performed using the F used as the RNA donor when preparing the genetic map. ₂ Pollen fertile F with homozygous Rf1 gene from the population ₂ Individuals were selected, mRNA was purified from the buds, cDNA was synthesized, and 5′-RACE or 3′-RACE method was used.
(Purification of mRNA)
Pollen fertile F with homozygous Rf1 gene ₂ Total RNA was extracted from individual buds using the RNeasy kit (Qiagen) by the usual method, guanidinium thiocyanate. PolyA + RNA was purified from the total RNA using an “mRNA Purification kit” (Amersham Pharmacia) using an Origo (dT) cellulose column to obtain mRNA.
[0164]
(CDNA isolation by 5'-RACE and 3'-RACE)
Using 1 μg of purified mRNA, cDNA was isolated using the “Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE” kit based on 5′-RACE and 3′-RACE methods. As a gene-specific primer, 5′-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 10) is used for 5′-RACE, and 3′-RACE,
5′-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 11) was used. After determining the base sequence of the obtained clone, a cDNA sequence was obtained (SEQ ID NO: 2).
[0165]
Example 10: Conversion and analysis of cDNA into amino acid sequence
(1) The conversion of cDNA into an amino acid sequence is performed using a genetic analysis software “Genetyx-SV” (Software Development Co., Ltd.) using a normal genetic code, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 Obtained. Analysis of the PPR motif was performed with a program in the Protein families database of alignments and HMNs (hereinafter Pfam, abbreviated http //: www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml). As a result of the analysis, it was found that the translation product of the fertility restoration gene shown in SEQ ID NO: 1 is a protein having 16 PPR motifs. The PPR motif was composed of three PPR clusters. The three are:
(1) PPR cluster # 1: PPR cluster consisting of 175 residues in which the first PPR motif from the N-terminal to the fifth PPR motif are continuous,
(2) PPR cluster # 2: PPR cluster consisting of 245 residues from the 6th PPR motif to the 12th PPR motif from the N-terminus, and
(3) PPR cluster # 3: PPR cluster consisting of 140 residues from the 13th PPR motif to the 16th PPR motif from the N-terminus,
Met.
[0166]
Example 11: Analysis of the protein of the present invention
An experiment was conducted to determine whether or not translational inhibition was caused in Escherichia coli by binding to the transcription product (mRNA) of the gene of the causal protein ORF125 that causes Cosena cytoplasmic male sterility.
The fertility recovery gene shown in SEQ ID NO: 2 was introduced into the BamHI-SphI site of the E. coli expression vector pQE-80L (Qiagen) to construct an expression vector in which 6 histidine residues were added to the (6XHis) N-terminus. (pQEB1 / cds6). In addition, using the pSTV29 (Takara Shuzo) vector as a template, DNA was amplified using a primer for introducing a BamHI site: CGGGATCCGCTCACAATT (SEQ ID NO: 12) and M13 primer RV (Takara Shuzo). For amplification of DNA, Takara LA PCR Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used. The amplified DNA was cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara Shuzo) and then purified using Suprec-02 (Takara Shuzo). To synthesize a DNA fragment having the BamHI and EcoRI sites at both ends of the 5'-UTR region of the orf125 gene and 25 amino acids of orf125, Fujimoto's method (plant PCR experiment protocol: synthetic DNA) was used. The actual PCR was performed according to PP84-87 (Shyujunsha). Primer is

Two of these were used. The amplified DNA was cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara Shuzo) and then purified using Suprec-02 (Takara Shuzo). The purified DNA was ligated using TaKaRa Ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) and transformed into E. coli DH10B (Gibco BRL). LB agar medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar, 0.1 mMIPTG, 20ug / ml X with 50 μg / ml chloramphenicol (Sigma) -Gal) for 18 hours or more at 37 ° C. From a light blue colony, a plasmid was extracted by a conventional method and the nucleotide sequence was confirmed. In this manner, 174 bp (7th to 180th of the nucleotide sequence shown in FIG. 6) containing the 5'-UTR region of the orf125 gene and 25 amino acids of orf125 between the EcoRI site and the transcription start point of the lacZ gene. The introduced vector was constructed (pSTV125-5 ′ # LA6). At the same time, a vector having a fragment (7 to 183th position of the base sequence shown in FIG. 6) in which mutation was caused at several positions in the portion corresponding to 174 bp was obtained (pSTV125-5 ′ # LA12).
[0167]
The vectors pSTV125-5 ′ # LA6 and # LA12 were introduced into Escherichia coli DH10B (GibcoBRL), respectively, and 50 μg / ml chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries) and 200 μM IPTG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to the LB medium. ), 40 μg / ml of X-Gal (Takara Shuzo Co., Ltd.) added agar medium and cultured at 37 ° C. overnight to grow colonies, which turned pale blue. That is, it was confirmed that the introduced LacZ gene was expressed in E. coli introduced with any of the vectors.
[0168]
Furthermore, in order to introduce both the above-described pSTV125-5 ′ vector and pQEB1 / cds6 vector into E. coli as described above, the above-mentioned medium was cultured using a medium supplemented with 50 μg / ml ampicillin, and pSTV125-5 'When co-existing with # LA6, the colony turned white, but when co-existing with pSTV125-5'# LA12 having a mutation at the introduced fragment site, the colony became light blue and the degree of blueness was # LA12 It was no different from the case of alone. Whether or not these introduced vectors were missing from E. coli was confirmed by culturing each colony and extracting the vector by a conventional method.
[0169]
From the above results, it is considered that the protein expressed in E. coli with the pQEB1 / cds6 vector was bound to the mRNA of pSTV125-5 ′ # LA6, and as a result, the expression of the LacZ gene was suppressed and white colonies were formed. In addition, when co-existing with pSTV125-5 '# LA12, the protein derived from pQEB1 / cds6 cannot bind to mRNA due to the mutation at the introduced fragment site, and as a result, LacZ gene is expressed and turns blue It is thought that it became.
[0170]
From this, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is involved in the orf125 mRNA, more specifically, at least the orf125-5′UTR region and the transcription product of the 25 amino acid residue coding region of ORF125. It is speculated that the expression of ORF125 protein is suppressed.
[0171]
That is, after the translation product of the gene of the present invention is transferred to the mitochondria, it binds to the male sterility gene in the mitochondria and inhibits translation, thereby reducing the accumulation amount of the protein causing cytoplasmic male sterility. It is presumed that the cytoplasmic male sterility was recovered to a good degree by making it.
[0172]
Example 12: Isolation of cosenal rape dwarf recovery gene
The genome sequence of the fertility recovery gene was obtained from a rapeseed strain obtained by introducing the fertility recovery gene of cosena radish by cell fusion (hereinafter referred to as “cosena rape”) using the PCR method. DNA was extracted from 0.1 g of Cosenana rape leaves using a DNA isolation kit (DNeasy plant mini) manufactured by Qiagen. For DNA amplification, 5′-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 30), which is a sequence from 1027 bp to 1059 bpbp of SEQ ID NO: 1, is set as a forward primer, and from 7675 bp to 7651 bpbp of SEQ ID NO: 1 5′-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 31) was set as a reverse primer.
[0173]
In 10 μl of Cosenata rape DNA solution (50 ng / μl), 49 μl of sterile water, 10 μl of 10 × LA PCR buffer (Takara Shuzo), 10 μl of 25 mM MgCl ₂ Add 16 μl of 2.5 mM dNTP mix, 2 μl of 10 μM forward primer solution, 2 μl of 10 μM reverse primer solution, 1 μl of 5 unit / μl TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo), mix at 98 ° C. for 20 seconds, 68 ° C. DNA was amplified by repeating the 15 minute cycle 30 times. As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used. After completion of the reaction, an amplification product of about 6 kb was purified using an ultrafiltration filter Microcon-PCR (Millipore). Using the purified amplification product as a template, a base sequence of 3306 bp was determined by a conventional method for the portion corresponding to positions 4280 to 7585 in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 15). As a result of comparison of the genome sequence of the obtained Cosena rape and the sequence of the garden red radish, it was found that only 7 bp out of 3306 bp were found to have a DNA base substitution and had high homology.
[0174]
In addition, the 3 'partial cDNA sequence of the cosenal rape dwarf recovery gene was obtained by RT-PCR, and it was confirmed that the intron was spliced in the same manner as the garden radish. Total RNA was extracted from the bud of Cosena rape by the conventional method AGPC (Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) (Shujunsha Cell Engineering Separate Volume Bio-Experimental Illustrated (2) Basics of Gene Analysis P161-166). CDNA was synthesized from 1 μg of total RNA using SUPERSCRIPT II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen). 5'-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC-3 '(SEQ ID NO: 32) was used as the fertility recovery gene 3' partial specific forward primer, and 5'-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3 '(sequence) as the fertility recovery gene 3' partial specific reverse primer Number 33) was used. 1μl Cosenata rape cDNA solution, 14.9μl sterile water, 2.5μl 10x PCR buffer (Takara Shuzo), 1.5μl 25mM MgCl ₂ Add 2 μl of 2.5 mM dNTP mix, 1.5 μl of 10 μM forward primer solution, 1.5 μl of 10 μM reverse primer solution, 0.1 μl of 5 unit / μl TaKaRa Taq (Takara Shuzo), mix at 94 ° C. for 40 seconds, DNA was amplified by repeating a cycle of 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes 35 times. As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used. Add 1 μl of pGEM-Teasy vector (Promega) and 5 μl of 2xligation buffer (Promega) and 1 μl of T4 DNA ligase (Promega) to 3 μl of the amplification product. Bound to. This vector was transformed into Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) to obtain a clone. The base sequence of the obtained clone was determined by a conventional method, and it was confirmed that the cosenata rape cDNA was spliced in introns, similar to the garden radish. That is, it was found that the 7 bp base substitution found by comparison of the previous genomic sequences was present at 5444 bp to 5814 bp of SEQ ID NO: 1 and did not affect splicing.
[0175]
Based on the above, it was found that the fertility recovery gene of Cosena rape expressed mRNA in the same manner as radish. The cDNA sequence encoding only the translation region is shown in SEQ ID NO: 16. Furthermore, the amino acid sequence was obtained from this cDNA sequence (SEQ ID NO: 17).
[0176]
Example 13: Isolation of radish wild species Raphanus raphanistrum (hereinafter R .. raphanistrum) fertility restoration gene partial sequence
A partial sequence of R .. raphanistrum fertility recovery gene was isolated from cDNA.
(Purification of mRNA)
From the buds of R .. raphanistrum, total RNA can be obtained by the conventional method AGPC (Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) (Shujunsha Cell Engineering Separate Volume Bio-Experiment Illustrated (2) Basics of Gene Analysis P161-166) Extracted. PolyA + RNA was purified from the total RNA using an “mRNA Purification kit” (Amersham Pharmacia) using an Origo (dT) cellulose column to obtain mRNA.
(Partial sequence isolation of cDNA)
CDNA was synthesized from 1 μg of the purified mRNA using the “Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE” kit (Clontech).
As a forward primer specific to fertility recovery gene
5′-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 34) was used,
As a reverse primer specific to the fertility recovery gene,
5′-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 35) was used.
[0177]
1 μl R. raphanistrum cDNA solution, 14.4 μl sterile water, 2.5 μl 10x Pyrobest PCR buffer (Takara Shuzo), 2 μl 2.5 mM dNTP mix, 2.5 μl 10 μM forward primer solution, 2.5 μl 10 μM reverse Add primer solution, 0.1 μl of 5 unit / μl Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), mix, and repeat 30 cycles of 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds. Was amplified. As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used. 0.1 μl of 5 unit / μl TaKaRa Taq (Takara Shuzo) was added to the amplified DNA solution and mixed, followed by heating at 72 ° C. for 10 minutes to add adenine nucleotides to the 3 ′ end of the DNA. Add 1 μl of pGEM-Teasy vector (Promega) and 5 μl of 2xligation buffer (Promega) and 1 μl of T4 DNA ligase (Promega) to 3 μl of the amplification product. Bound to. This vector was transformed into Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) to obtain a clone. After the nucleotide sequence of the obtained clone was determined by a conventional method, a cDNA partial sequence was obtained (SEQ ID NO: 20). Further, an amino acid sequence was obtained from the cDNA sequence (SEQ ID NO: 21).
[0178]
Example 14: Isolation of Ogrape Seed Recovery Gene
The cDNA sequence of the fertility recovery gene was isolated from the rapeseed line obtained by mating the fertility recovery gene of ogura radish (hereinafter referred to as Ogura rape) using the 5'-RACE method and the 3'-RACE method. .
(Purification of mRNA)
Total RNA was extracted from the buds of Ogura rapeseed by the conventional method AGPC (Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) (Shujunsha Cell Engineering Separate Volume Bio-Experiment Illustrated (2) Fundamentals of Gene Analysis P161-166). PolyA + RNA was purified from the total RNA using an “mRNA Purification kit” (Amersham Pharmacia) using an Origo (dT) cellulose column to obtain mRNA.
(Partial sequence isolation of cDNA)
CDNA was synthesized from 1 μg of the purified mRNA using the “Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE” kit (Clontech). 5′-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 36) was used as a fertility recovery gene-specific forward primer, and 5′-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 37) was used as a fertility recovery gene-specific reverse primer. .
[0179]
1 μl of Ogura rape cDNA solution, 14.4 μl of sterile water, 2.5 μl of 10x Pyrobest PCR buffer (Takara Shuzo), 2 μl of 2.5 mM dNTP mix, 2.5 μl of 10 μM forward primer solution, 2.5 μl of 10 μM reverse primer solution, After adding 0.1 μl of 5 unit / μl Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) and mixing, DNA was amplified by repeating a cycle of 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute 30 seconds 30 times . As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used. To the amplified DNA solution, 0.1 μl of 5 unit / μl TaKaRa Taq was added and mixed, followed by heating at 72 ° C. for 10 minutes, and an adenine nucleotide was added to the 3 ′ end of the DNA. Add 1 μl of pGEM-Teasy vector (Promega) and 5 μl of 2xligation buffer (Promega) and 1 μl T4 DNA ligase (Promega) to 3 μl of the amplification product, and let stand at room temperature for 1 hour. Bound to. This vector was transformed into E. coli DH5α (Gibco BRL) to obtain a clone. After determining the nucleotide sequence of the obtained clone by a conventional method, four types of cDNA partial sequences were obtained. Based on the obtained four kinds of sequence information, primers for 5′-RACE and 3′-RACE were set at the common part of the four, and cDNA was isolated from each.
[0180]
(CDNA isolation by 5'-RACE and 3'-RACE)
CDNA was synthesized in the same manner as described above, and 5'-RACE and 3'-RACE methods were performed using a "Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE" kit (manufactured by Clontech) to isolate the cDNA. As a gene-specific primer, 5'-RACE
5'-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3 '(SEQ ID NO: 37) and 5'-GTCCGGAGAGCAGCCCTTGGTAG-3' (SEQ ID NO: 38) are used, and 3'-RACE uses 5'-TCATCGTATAATTCTTCAGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 39) did.
[0181]
In 5'RACE, DNA was obtained by performing PCR twice. 2 μl of 250-fold diluted Ogura rape cDNA solution, 8.6 μl of sterile water, 2 μl of 10 × LA PCR buffer (Takara Shuzo), 2 μl of 25 mM MgCl ₂ , 3.2 μl of 2.5 mM dNTP mix, 1 μl of 10 μM primer solution of SEQ ID NO: 9907F, 1 μl of 10 μM adapter primer solution (Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE kit, manufactured by Clontech), 0.2 μl of 5 unit / μl After adding TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo) and mixing, 5 cycles of 98 ° C 5 seconds, 72 ° C 3 minutes, 98 ° C 5 seconds, 5 cycles of 70 ° C 3 minutes 3, 98 ° C 5 seconds, DNA was amplified by repeating a cycle of 68 ° C. for 3 minutes 25 times. Dilute the obtained DNA solution 100 times, and add 2 μl of 8.6 μl of sterile water, 2 μl of 10 × LA PCR buffer (Takara Shuzo), 2 μl of 25 mM MgCl. ₂ 3.2 μl of 2.5 mM dNTP mix, 1 μl of 10 μM primer solution of SEQ ID NO: 5′ogu-1, 1 μl of 10 μM adapter primer solution (Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE kit, manufactured by Clontech), 0.2 μl of 5 After adding unit / μl TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo) and mixing, 5 cycles of 98 ° C 5 seconds, 72 ° C 3 minutes, 98 ° C 5 seconds, 70 ° C 3 minutes 3 cycles 5 times 98 The DNA was amplified by repeating 25 cycles of 5 minutes at 68 ° C. and 3 minutes at 68 ° C. As the thermal cycler, UNOII (manufactured by Biometra) was used.
[0182]
For 3'RACE, 2 μl of 50-fold diluted Ogura rape cDNA solution, 8.6 μl of sterile water, 2 μl of 10x LA PCR buffer (Takara Shuzo), 2 μl of 25 mM MgCl ₂ 3.2 μl of 2.5 mM dNTP mix, 1 μl of 10 μM primer solution of SEQ ID NO: 3′ogu-1, 1 μl of 10 μM adapter primer solution (Marathon RACE system 5′RACE 3′RACE kit, manufactured by Clontech), 0.2 μl of 5 After adding unit / μl TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo) and mixing, DNA was amplified by repeating a cycle of 98 ° C. for 5 seconds, 63 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes 35 times.
[0183]
Add 1 μl of pGEM-Teasy vector (Promega) and 5 μl of 2xligation buffer (Promega) and 1 μl of T4 DNA ligase (Promega) to 3 μl of amplification product, and let stand at room temperature for 1 hour. Bound to. This vector was transformed into E. coli DH5α (Gibco BRL) to obtain a clone. After determining the nucleotide sequence of the obtained clone, 5′-RACE sequence and 3′-RACE sequence corresponding to the above four kinds of cDNA partial sequences were obtained, and the respective sequences were combined to obtain a full-length cDNA sequence. A sequence having the highest homology with the cDNA sequence of the radish radish was used as a gene for restoring fertility of Cosena rape (SEQ ID NO: 18). Furthermore, the amino acid sequence was obtained from the cDNA sequence (SEQ ID NO: 19).
[0184]
Example 15: Analysis of fertility recovery gene
For each fertility-recovery gene obtained by the above method, the homology between the cDNA sequence and the amino acid sequence was determined using the gene analysis software “Mac Vector6.5” (Oxford Molecular Ltd.), and the motif analysis was performed using Sanger, UK. Analysis was performed using Protein families database of alignments and HMNs in the laboratory.
[0185]
The Rf genes derived from Japanese red radish, cosenata rape, and ogura rape of the present invention all have 16 PPR motifs, and this PPR motif group is divided into three blocks of 5, 7, and 4 from the amino terminal side. In addition, the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal side was asparagine. In addition, the partial fragment derived from Raphanus rafanistrum was also analyzed by applying it to the portion corresponding to the above sequence (positions 94 to 264 of SEQ ID NO: 26). As a result, the first to sixth PPR motifs at the amino terminus were analyzed. The 4th amino acid present in the PPR motif group and the 2nd PPR motif from the amino terminal side also had the above-mentioned characteristics.
[0186]
Furthermore, the protein of the present invention (SEQ ID NO: 26) obtained as a result of the analysis of the three types of fertility recovery genes obtained from lush red radish, cosenata rape, and Ogura rape, and the partial sequence of R. Among the encoded genes (SEQ ID NO: 22), Soho Daikon and Cosenatanae have very high homology, and the amino acid sequence was 99.6% (only 3 amino acids differed), nucleotide sequence Shows a value as high as 99.7%, and therefore, a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and a gene encoding the same (SEQ ID NO: 25) are particularly preferable.
[0187]
On the other hand, when comparing Ogura rapeseed and Soen radish, and Ogura rape and Cosena rape, high homology was observed, but the homology was 92.0% when comparing Ogura rape and Soen radish in terms of amino acid sequence. It was 91.6%, and the base sequence was about 95%, which was lower than the value between the garden red radish and cosenata seed.
[0188]
【The invention's effect】
According to the present invention, the Rf gene, particularly the radish-derived Rf1 gene was isolated and its structure was identified. Furthermore, according to the present invention, it has become possible to provide means for establishing a rape recovery line using the isolated Rf gene.
[0189]
[Sequence Listing]

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205]

[0206]

[0207]

690
[0208]

[0209]

[0210]

[0211]

[0212]

[0213]

[0214]

[0215]

[0216]

[0217]

[0218]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222]

[0223]

[0224]

[0225]

[0226]

[0227]

[0228]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an Rf marker genetic map.
FIG. 2 shows a schematic diagram of the structure of a lambda clone CHI that sufficiently retains the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
FIG. 3 shows the results of detection of introduced DNA in a transformant using a PCR method.
FIG. 4 shows the results of analysis by Western blotting of a decrease in the amount of ORF125, which is a CMS protein, in transformants.
FIG. 5 shows the results of taking a cocoon from a flowering body of transformed rapeseed and observing it under a microscope.
FIG. 6 shows the nucleotide sequences of pSTV125-5 ′ # LA6 and pSTV125-5 ′ # LA12.

Claims

A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.

A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

A protein involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

Any of the following proteins.
(1) a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19; or (2) 1 to 20 amino acid sequences described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19 A protein that has an amino acid sequence in which the amino acid is deleted, added, and / or substituted, and that is involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual.

The protein according to claim 1 or 2, wherein the cytoplasmic male sterilized individual has a cytoplasmic male sterility gene of cosena radish and / or ogura radish or a homologue thereof.

DNA encoding the protein according to any one of claims 1 to 3.

A DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 22 that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, which is involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.

A DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 23 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, which is involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.

A DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 24 that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, which is involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.

A DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 25 that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, which is involved in recovering the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.

Any of the following DNA.
(1) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, involved in recovering sterility of cytoplasmic male sterile individuals; or (2) SEQ ID NO: 2, having a base sequence in which 1 to 20 bases are deleted, added and / or substituted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 18 and being sterile in a cytoplasmic male sterile individual DN A involved in recovering fragile .

Any of the following DNA.
(1) The 3754th to 8553rd base sequence of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 that is involved in recovering the sterility of cytoplasmic male sterility individuals. DNA having the 812st to 3002nd base sequence; or (2) the 3754th to 8553th base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the 812st to 3002th bases of the base sequence described in SEQ ID NO: 15 A DNA having a base sequence in which 1 to 20 bases are deleted, added and / or substituted in the sequence, and being involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual .

Any of the following DNA.
(1) DNA having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterile individual; or (2) SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 1. It has a base sequence in which 1 to 20 bases are deleted, added and / or substituted in the base sequence described in 1. and is involved in recovering sterility of cytoplasmic male sterile individuals. DN A.

The DNA according to any one of claims 7 to 14, wherein the cytoplasmic male sterile individual has a cytoplasmic male sterile gene of cosena radish and / or ogura radish or a homologue thereof.

A vector containing the DNA according to any one of claims 7 to 15.

A transformant comprising the DNA according to any one of claims 7 to 15 or the vector according to claim 16.

The transformant according to claim 17, which is a transformed plant.

The DNA of any one of claims 7 to 15 is introduced into the genome of a host plant having cytoplasmic male sterility by genetic engineering techniques. How to recover to traps.

The DNA according to any one of claims 7 to 15, which has a cytoplasmic male sterility gene and is ligated to an inducible promoter and is involved in recovering sterility of a cytoplasmic male sterility individual. A transformant in which expression of a male sterility recovery gene can be controlled by introducing a chimeric DNA construct consisting of the above into a plant cell of a cytoplasmic male sterility lineage.

A method for maintaining a cytoplasmic male sterile line by using the transformant according to claim 20.

A promoter DNA having the 3754th to 5091th base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the 1st to 811th base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 15.