ES2367768T3

ES2367768T3 - Sensibilización de células neoplásicas resistentes a agentes quimioterapéuticos con reovirus.

Info

Publication number: ES2367768T3
Application number: ES02701122T
Authority: ES
Inventors: Matthew C. Coffey; Bradley G. Thompson
Original assignee: Oncolytics Biotech Inc
Current assignee: Oncolytics Biotech Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2011-11-08
Anticipated expiration: 2022-02-19
Also published as: WO2002066040A2; ATE516807T1; AU2002234453B2; IL157167A0; HK1060520A1; JP2008120837A; NZ537709A; DK1361884T3; EP2314301A3; IL157167A; WO2002066040A3; US20080031851A1; AU2007207860A1; EP2314301A2; US7264798B2; JP4951194B2; JP2004517966A; CA2437468C; US20100021432A1; JP2012072192A

Abstract

El uso de una cantidad eficaz de un reovirus y una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico para la preparación de una composición farmacéutica para sensibilizar una célula neoplásica refractaria a dicho agente quimioterapéutico.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a un método para aumentar la sensibilidad de las células neoplásicas aagentes quimioterapéuticos usando reovirus, y a un método para tratar trastornos proliferativos con reovirus y agentes quimioterapéuticos.

REFERENCIAS

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es una de las causas principales de muerte. Aunque ha sido el centro de la investigación médica duranteun largo periodo de tiempo, las terapias principales contra el cáncer hasta la fecha siguen siendo la cirugía, laradioterapia y la quimioterapia. Cada una de estas terapias está sometida a limitaciones que aún no han sidosuperadas, por lo que continúa la búsqueda de mejores terapias.

Un problema significativo de la quimioterapia es que los tumores pueden desarrollar resistencia a los fármacos. Porejemplo, un fármaco puede ser muy eficaz cuando se introduce por primera vez en el paciente, eliminando lascélulas tumorales y reduciendo el tamaño del tumor de modo que el paciente vaya en remisión. Sin embargo, eltumor puede volver a crecer después de un periodo de tiempo, y esta vez el mismo fármaco ya no es eficaz paraeliminar las células tumorales que han vuelto a crecer. Se cree que este fenómeno de resistencia progresiva alfármaco se debe a una pequeña población de células resistentes al fármaco del tumor que sobrevive al tratamientoinicial con el fármaco mientras que se elimina la mayoría del tumor. Estas células resistentes vuelven a crecerposteriormente para formar un tumor que consta esencialmente sólo de células resistentes al fármaco.

Inicialmente se propuso como solución el tratamiento con una combinación de fármacos, dada la baja probabilidadde que se dieran espontáneamente mutaciones que condujeran a dos o más vías de resistencia a fármacosdiferentes en la misma célula (DeVita. Jr., 1983). Sin embargo, se ha descubierto que las células que son resistentesa un fármaco a menudo son resistentes a múltiples fármacos, incluyendo fármacos estructuralmente no relacionadosque son capaces de eliminar células tumorales por diferentes vías. Por lo tanto, una terapia de combinación defármacos no resuelve el problema.

Aunque los mecanismos no están completamente claros, el mecanismo mejor documentado y clínicamente relevantede la resistencia a múltiples fármacos de las células tumorales está correlacionado con la expresión de laglicoproteína P, el producto del gen MDR1. La glicoproteína P es una bomba de flujo de amplia especificidadlocalizada en la membrana celular, y funciona disminuyendo la acumulación intracelular de muchos fármacoscitotóxicos lipófilos, incluyendo algunos agentes antineoplásicos ampliamente usados tales como antraciclinas, alcaloides de la vinca, epipodofilotoxinas, actinomicina D y taxol, volviendo de este modo a las células resistentes aestos fármacos (Pastan et al., 1991).

Además de MDR1, se ha descubierto otro transportador de fármacos pleiotrópico (Grant et al., 1994). Esta proteína,denominada proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos (MRP), ha demostrado conferir un patrón deresistencia a fármacos citotóxicos, particularmente fármacos quimioterapéuticos, similar al transportador de laglicoproteína P codificado por el gen MDR1. Posteriormente, se ha descubierto una cantidad creciente de proteínasrelacionadas con MRP (Borst et al., 2000). Cada una puede tener una especificidad de fármaco diferente, pero lasfunciones fisiológicas no son completamente conocidas.

Por lo tanto, las causas de la resistencia a fármacos no están completamente comprendidas y sigue existiendo lanecesidad de métodos para superar la resistencia a fármacos para tratar los tumores de forma más eficaz.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para sensibilizar células resistentes a fármacos a agentesquimioterapéuticos mediante el uso de reovirus. Los reovirus se han descubierto recientemente como un agenteantineoplásico selectivo que elimina células neoplásicas ras-activadas pero no células normales, debido a la replicación selectiva del reovirus en células con una vía ras activada (patente de Estados Unidos Nº 6.136.307; Coffey et al., 1998; Strong et al., 1998). Inesperadamente, se descubrió posteriormente en la presente invención quelos reovirus aumentaban también la sensibilidad de las células a agentes quimioterapéuticos. Así, un tumor que erarefractario al cisplatino se trató con una combinación de cisplatino y reovirus, y los resultados indicaron que lacombinación era más eficaz que el reovirus solo. Como el cisplatino no tenía efecto sobre el tumor cuando seadministraba en ausencia de reovirus, el efecto de la combinación no era simplemente un resultado aditivo o sinérgico de los efectos individuales. En su lugar, el reovirus sensibilizaba el tumor a un agente quimioterapéutico alque el tumor era normalmente refractario.

En consecuencia, puede utilizarse, un aspecto de la presente invención para sensibilizar una célula neoplásica, que consta de

(a): administrar a dicha célula una cantidad eficaz de reovirus; y

(b): administrar a dicha célula una cantidad eficaz del agente quimioterapéutico.

La célula es preferiblemente una célula neoplásica ras-activada. Más preferiblemente, el reovirus se administra encondiciones que provocan la infección de la célula neoplásica por el reovirus. La célula puede ser susceptible alagente quimioterapéutico en ausencia de reovirus, pero preferiblemente debe ser refractaria al agente quimioterapéutico.

Para sensibilizar la célula, el reovirus debe administrare preferiblemente antes de la administración del agentequimioterapéutico. Como alternativa, en otra realización preferida, el reovirus y el agente quimioterapéutico pueden administrarse de forma concomitante. Tanto el reovirus como el agente quimioterapéutico pueden administrarseindividualmente en una única dosis o en dosis múltiples.

La célula neoplásica debería estar localizada preferiblemente localizada en un mamífero, particularmente un perro,gato, oveja, cabra, vaca, caballo, cerdo, ser humano o primates no humanos. La célula debería estar mucho máspreferiblemente localizada en un ser humano.

La presente invención puede usarse para sensibilizar células a cualquier agente quimioterapéutico. Los agentesquimioterapéuticos preferidos incluyen 5-fluorouracilo, mitomicina C, metotrexato, hidroxiurea, ciclofosfamida, dacarbazina, mitoxantrona, antraciclinas (por ejemplo, epirrubicina y doxorrubicina), carboplatino, cisplatino, taxol,taxotere, tamoxifeno, anti-estrógenos, e interferones. Más preferiblemente, el agente quimioterapéutico es un platinato o taxol. El agente quimioterapéutico más preferido es cisplatino.

El reovirus puede ser cualquier reovirus, incluyendo reovirus de mamíferos y aves. Preferiblemente, el reovirus debeser un virus de mamíferos, particularmente un reovirus de seres humanos. El reovirus de seres humanos deberíanser preferiblemente un reovirus de serotipo 3 y mucho más preferiblemente una cepa Dearing del reovirus deserotipo 3.

La presente invención también puede usarse para tratar a un sujeto con un trastorno proliferativo, con célulasneoplásicas refractarias a un agente quimioterapéutico, que consta de:

(a): administrar al sujeto una cantidad eficaz de reovirus en condiciones que provocan la infección de las célulasneoplásicas por el reovirus; y

(b): administrar una cantidad eficaz del agente quimioterapéutico a dicho sujeto.

El reovirus puede administrarse en cualquier momento con respecto al agente quimioterapéutico. Preferiblemente, elreovirus se administra antes de o de forma concomitante con la administración del agente quimioterapéutico. Preferiblemente, el reovirus se administra en dosis múltiples. El agente quimioterapéutico también puedeadministrarse en dosis múltiples. Se contempla que el reovirus puede administrarse en dosis múltiples antes decualquier administración del agente quimioterapéutico.

El sujeto debería ser preferiblemente un mamífero, particularmente un perro, gato, oveja, cabra, vaca, caballo, cerdo,ser humano o primates no humanos, y más preferiblemente un ser humano.

El trastorno proliferativo puede ser un tumor sólido, particularmente cáncer pulmonar, cáncer de próstata, cáncercolorrectal, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer suprarrenal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer demama y cáncer del sistema nervioso central y periférico. Para tratar el tumor sólido, el reovirus puede administrarse,por ejemplo, por inyección en o cerca del tumor sólido o por administración sistémica.

El trastorno proliferativo puede, como alternativa, ser un tumor hematopoyético, particularmente linfomas yleucemias.

El trastorno proliferativo puede ser un tumor primario o un tumor metastásico.

La invención también puede usarse para evitar que una neoplasia en un sujeto desarrolle resistencia a fármacoscontra un agente quimioterapéutico, que comprende:

(a): administrar al sujeto una cantidad eficaz de reovirus en condiciones que provocan la infección de la neoplasia porel reovirus; y

(b): administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico.

El reovirus puede administrarse en cualquier momento con respecto al agente quimioterapéutico. Preferiblemente, elreovirus se administra antes de o de forma concurrente con la administración del agente quimioterapéutico. Preferiblemente, el reovirus se administra en dosis múltiples. El agente quimioterapéutico también puedeadministrarse en dosis múltiples. Se contempla que el reovirus puede administrarse en dosis múltiples antes decualquier administración del agente quimioterapéutico.

Preferiblemente, la administración del reovirus evita que la neoplasia desarrolle resistencia a fármacos contra múltiples fármacos, incluyendo fármacos estructuralmente no relacionados. Por consiguiente, una realizaciónpreferida de la presente invención proporciona que se evite que una neoplasia en un sujeto desarrolle resistencia afármacos contra un agente quimioterapéutico donde se evita también la resistencia a fármacos contra un segundoagente quimioterapéutico, comprendiendo el método:

(a): administrar al sujeto una cantidad eficaz de reovirus en condiciones que provocan la infección del neoplasia porel reovirus; y

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS GRÁFICOS

La Figura 1 muestra los efectos del reovirus y cisplatino sobre el crecimiento tumoral. Se administró a animales contumores singénicos tratamiento simulado (Serie 1), cisplatino solo (Serie 2), reovirus solo (Serie 3) o la combinaciónde cisplatino y reovirus (Serie 4). Los resultados indican que los tumores eran refractarios al cisplatino. Sin embargo,en presencia de reovirus, los tumores llegaban a ser sensibles al cisplatino.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para sensibilizar las células resistentes a fármacos a agentesquimioterapéuticos mediante el uso de reovirus. Recientemente se ha descubierto al reovirus como un agenteantineoplásico selectivo que elimina las células neoplásicas ras-activadas pero no células normales, debido a lareplicación selectiva del reovirus en células con una vía ras activada (patente de Estados Unidos Nº 6.136.307; Coffey et al., 1998; Strong et al., 1998). Inesperadamente, se descubrió adicionalmente en la presente invención que el reovirus aumentaba también la sensibilidad de las células a agentes quimioterapéuticos. La presente invención,por tanto, proporciona un método para potenciar tanto la eficacia como la selectividad de la quimioterapia contra elcáncer. También puede usarse para evitar el desarrollo de resistencia progresiva a los fármacos.

Antes de describir la invención en mayor detalle, se definen los términos usados en esta solicitud del siguiente modosalvo que se indique otra cosa.

Definiciones

"Sensibilizar" una célula neoplásica a un agente quimioterapéutico, como se usa en este documento, se refiere alacto de potenciar la sensibilidad de una célula neoplásica a un agente quimioterapéutico.

La "sensibilidad" de una célula neoplásica a un agente quimioterapéutico es la susceptibilidad de la célula neoplásicaal efecto inhibidor del agente quimioterapéutico. Por ejemplo, la sensibilidad de una célula neoplásica a un agentequimioterapéutico está indicada por la reducción en la tasa de crecimiento de la célula en respuesta al agentequimioterapéutico. La sensibilidad también puede demostrarse por una reducción de los síntomas causados por lascélulas neoplásicas.

Una célula neoplásica que es "refractaria" a un agente quimioterapéutico es una célula neoplásica no eliminada o noinhibida en su crecimiento por el agente quimioterapéutico. Para determinar si una célula neoplásica tiene el crecimiento inhibido, puede determinarse la tasa de crecimiento de la célula en presencia o ausencia del agente quimioterapéutico por métodos establecidos en la técnica. La célula neoplásica no tiene el crecimiento inhibido por elagente quimioterapéutico si la tasa de crecimiento no es significativamente diferente con o sin el agente quimioterapéutico.

Un tumor que es "refractario" a un agente quimioterapéutico es un tumor cuya tasa de aumento de tamaño o de pesono cambia en presencia del agente quimioterapéutico. Alternativamente, si el sujeto que alberga el tumor presentasíntomas o indicadores similares del tumor aunque el sujeto reciba el sujeto quimioterapéutico o no, el tumor esrefractario al agente quimioterapéutico. Por ejemplo, habitualmente se usa el recuento de leucocitos como unindicador de leucemia. Si el recuento de leucocitos de un paciente con leucemia no cambia significativamentedespués de recibir un fármaco quimioterapéutico, la leucemia de este paciente es refractaria al fármaco quimioterapéutico.

Una "célula neoplásica", también conocida como una "célula con un trastorno proliferativo", hace referencia a unacélula que prolifera a una tasa anormalmente alta. Un crecimiento nuevo que comprende células neoplásicas es unaneoplasia, también conocida como tumor. Una neoplasia es un crecimiento tisular anormal, que generalmente formauna masa definida, que crece por proliferación celular de forma más rápida que el crecimiento tisular normal. Unaneoplasia puede mostrar ausencia parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejidonormal. En este documento, se pretende que una neoplasia abarque tanto tumores hematopoyéticos como tumoressólidos.

Una neoplasia puede ser benigna (tumor benigno) o maligna (tumor maligno o cáncer). Los tumores malignospueden clasificarse ampliamente en tres tipos principales. Las neoplasias malignas que surgen de estructurasepiteliales se llaman carcinomas, las neoplasias malignas que se originan a partir de tejidos conectivos tales comomúsculo, cartílago, grasa o hueso se llaman sarcomas y los tumores malignos que afectan a estructuras hematopoyéticas (estructuras relacionadas con la formación de células sanguíneas) incluyendo componentes delsistema inmune, se llaman leucemias y linfomas. Otras neoplasias incluyen, aunque sin limitación, las neurofibromatosis.

Un "trastorno proliferativo" es una enfermedad o afección causada por células que crecen más rápidamente que lascélulas normales, es decir, células neoplásicas. Los trastornos proliferativos incluyen tumores benignos y tumoresmalignos. Cuando se clasifican según la estructura del tumor, los trastornos proliferativos incluyen tumores sólidos y tumores hematopoyéticos.

5 Las "células neoplásicas ras-activadas" o "células neoplásicas mediadas por ras" se refieren a células que proliferan a una tasa anormalmente alta debido a, al menos en parte, la activación de la vía ras. La vía ras puede activarsemediante mutación estructural del gen ras, un nivel elevado de la expresión del gen ras, una elevada estabilidad del mensaje del gen ras, o cualquier mutación o mecanismo que conduzca a la activación de ras o un factor o factoressituados corriente abajo o corriente arriba de ras en la vía ras, aumentando de este modo la actividad de la vía ras.Por ejemplo, la activación del receptor de EGF, el receptor de PDGF o sos provoca la activación de la vía ras. Lascélulas neoplásicas mediadas por ras incluyen, aunque sin limitación, células cancerosas mediadas por ras, que soncélulas que proliferan de un modo maligno debido a la activación de la vía ras.

"Infección por reovirus" se refiere a la entrada y replicación del reovirus en una célula. Asimismo, "infección de unaneoplasia por reovirus" se refiere a la entrada y replicación del reovirus en las células de una neoplasia.

15 Un "agente quimioterapéutico" o "fármaco quimioterapéutico" es cualquier compuesto químico usado en el tratamiento de un trastorno proliferativo. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitación, lassiguientes clases de agentes:

-mostazas nitrogenadas, por ejemplo, ciclofosfamida, trofosfamida, ifosfamida y clorambucil;

-nitrosoureas, por ejemplo, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil CCNU) y nimustina (ACNU);

-etileniminas y metilmelaminas, por ejemplo, tiotepa;

-: análogos de ácido fólico, por ejemplo, metotrexato;

-: análogos de pirimidina, por ejemplo, 5-fluorouracilo y citarabina;

-: análogos de purina, por ejemplo, mercaptopurina y azatioprina;

25 -alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina, vincristina y vindesina;

-epipodofilotoxinas, por ejemplo, etopósido y tenipósido;

-antibióticos, por ejemplo, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina a2, mitomicina c y mitoxantrona;

-estrógenos, por ejemplo, dietil estilbestrol;

-análogos de la hormona liberadora de gonadotropina, por ejemplo, leuprolida, buserelina y goserelina;

-antiestrógenos, por ejemplo, tamoxifeno y aminoglutetimida;

-andrógenos, por ejemplo, testolactona y drostanolonproprionato;

-platinatos, por ejemplo, cisplatino y carboplatino; y

-interferones, incluyendo interferón-alfa, beta y gamma.

35 Los agentes quimioterapéuticos de la presente invención son preferiblemente compuestos químicos pequeños. Por tanto, el agente quimioterapéutico tiene un peso molecular preferiblemente de menos de aproximadamente 5.000,más preferiblemente de menos de aproximadamente 3.000, aún más preferiblemente de menos de aproximadamente 2.000, y mucho más preferiblemente de menos de aproximadamente 1.000.

Un "platinato" es un agente quimioterapéutico que contiene platino como átomo central. Los ejemplos de platinatosincluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, ormaplatino, iproplatino, enloplatino, nedaplatino, ZD0473 (cisaminadicloro(2-metilpiridina)-platino (II)), BBR3464 y similares.

"Reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus, sea de origen natural, modificado o recombinante. Los reovirus son virus con un genoma de ARN segmentado bicatenario. Los viriones miden 60-80 nmde diámetro y tienen dos envueltas de cápside concéntricas, cada una de las cuales es icosaédrica. El genoma

45 consta de ARN bicatenario en 10-12 segmentos concretos con un tamaño de genoma total de 16-27 kbp. Los segmentos de ARN individuales varían en tamaño.

Se han recuperado tres tipos distintos pero relacionados de reovirus de muchas especies. Los tres tipos compartenun antígeno de fijación al complemento común.

El reovirus de seres humanos consta de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o T1L), tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3(cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos son fácilmente identificables en base a ensayos de neutralización e inhibición de hemaglutinina (véase, por ejemplo, Fields, B.N. et al., 1996).

El reovirus puede ser de origen natural o puede estar modificado. El reovirus es de origen natural cuando puedeaislarse de una fuente de la naturaleza y no se ha modificado de forma intencionada por el ser humano en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente de campo", es decir, de un ser humano que se hainfectado con el reovirus.

El reovirus puede modificarse pero ser aún capaz de infectar de forma lítica a una célula de mamífero que tenga unavía ras activa. El reovirus puede pretratarse química o bioquímicamente (por ejemplo, por tratamiento con unaproteasa, tal como quimotripsina o tripsina) antes de la administración a las células en proliferación. Elpretratamiento con una proteasa elimina la cubierta o cápside externa del virus y puede aumentar la infectividad delvirus. El reovirus puede estar recubierto por un liposoma o micela (Chandron y Nibert, 1998). Por ejemplo, el viriónpuede tratarse con quimotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micelas de detergentes de sulfatode alquilo para generar una nueva partícula de subvirión infeccioso.

El reovirus puede ser un reovirus recombinante (es decir recombinado) de dos o más tipos de reovirus con diferentesfenotipos patogénicos de modo que contenga diferentes determinantes antigénicos, reduciendo o evitando de estemodo una respuesta inmune por un mamífero previamente expuesto a un subtipo de reovirus. Dichos virionesrecombinantes pueden generarse por co-infección de células de mamífero con diferentes subtipos de reovirus con larecombinación e incorporación resultante de proteínas de recubrimiento de diferente subtipo en las cápsides devirión resultantes.

El reovirus puede modificarse por incorporación de proteínas de cubierta mutadas tales como, por ejemplo, 1, en la cápside externa del virión. Las proteínas pueden mutarse por sustitución, inserción o deleción. La sustitución incluyela inserción de diferentes aminoácidos en lugar de los aminoácidos nativos. Las inserciones incluyen la inserción derestos aminoacídicos adicionales en la proteína en una o más localizaciones. Las deleciones incluyen deleciones deuno o más restos aminoacídicos en la proteína. Dichas mutaciones pueden generarse por métodos conocidos en latécnica. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos del gen que codifica una de las proteínas derecubrimiento podrá provocar la generación de la proteína de recubrimiento mutante deseada. La expresión de laproteína mutada en células de mamífero infectadas con reovirus in vitro tales como células COS1 provocará laincorporación de la proteína mutada en la partícula de virión del reovirus (Turner y Duncan, 1992; Duncan et al., 1991; Mah et al., 1990).

El reovirus debe ser preferiblemente un reovirus modificado para reducir o eliminar una reacción inmune contra elreovirus. Dichos reovirus modificados se llaman "reovirus inmunoprotegidos". Dichas modificaciones podrían incluirel empaquetado del reovirus en un liposoma, una micela u otro vehículo para ocultar al reovirus del sistema inmunede los mamíferos. Como alternativa, puede eliminarse la cápside externa de la partícula de virión del reovirus, ya quelas proteínas presentes en la cápside externa son el determinante principal de las respuestas humorales y celularesdel huésped.

La "administración de reovirus" a un sujeto se refiere al acto de administrar reovirus a un sujeto de un modo quecontacte con las células neoplásicas diana. La vía por la cual se administra el reovirus, así como la formulación, el medio o vehículo, dependerán de la localización así como del tipo de las células diana. Puede emplearse una ampliadiversidad de vías de administración, que se analizan con más detalle a continuación.

"Tratar un trastorno proliferativo" significa aliviar o eliminar los síntomas de un trastorno proliferativo, o ralentizar elprogreso de un trastorno proliferativo.

Un "tumor metastásico" es un tumor que se metastatizado a partir de un tumor localizado en otro sitio del mismoanimal.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad de un agente quimioterapéutico o reovirus que es suficiente para provocar el efecto deseado. Para un agente quimioterapéutico usado para tratar una enfermedad, una cantidad eficaz es unacantidad suficiente para aliviar o eliminar los síntomas de la enfermedad, o ralentizar el progreso de la enfermedad. Para que un reovirus sensibilice un tumor a un agente quimioterapéutico, una cantidad eficaz es una cantidadsuficiente para aumentar la sensibilidad del tumor al agente quimioterapéutico.

"Resistencia progresiva al fármaco" hace referencia al fenómeno en el que una neoplasia es inicialmente susceptiblea un agente quimioterapéutico, pero la eficacia del agente para inhibir el crecimiento neoplásico o reducir lossíntomas de la enfermedad disminuye con el tiempo.

Métodos

Los reovirus son un agente terapéutico eficaz contra neoplasias activadas por ras porque se replican selectivamenteen células con una vía ras activada (patente de Estados Unidos Nº 6.136.307). La vía ras no está activada en célulasnormales, por lo tanto el reovirus elimina las células neoplásicas con una alta selectividad. Sin limitarse a una teoría, se cree que la transcripción de los genes virales en células normales está correlacionada con la fosforilación de unaproteína celular de aproximadamente 65 kDa, que se ha determinado que es la proteína quinasa activada por ARNbicatenario (PKR), que no se ha observado en células activadas por ras. La fosforilación de PKR conduce a lainhibición de la traducción, por lo tanto no puede completarse la replicación viral. Sin embargo en células activadaspor ras, ras o sus factores corriente abajo bloquean la fosforilación de PKR, permitiendo de este modo que procedala traducción y replicación viral.

En la presente invención, se trataron tumores con una combinación de reovirus y agentes quimioterapéuticos.Inesperadamente, se descubrió que el reovirus era capaz de sensibilizar células neoplásicas a agentesquimioterapéuticos, mientras que los agentes quimioterapéuticos no tenían efectos sobre las células cuando seadministraban solos. Como se muestra en la Figura 1, los tumores derivados de C3H10T1/2 eran refractarios alcisplatino. Estos tumores crecían de forma agresiva en presencia de cisplatino a una tasa de crecimiento que eraesencialmente igual que la de tumores no tratados. Por el contrario, los tumores tratados con reovirus y concisplatino dejaban de crecer casi por completo. El efecto inhibidor de la combinación (reovirus más cisplatino) era mucho mayor que el reovirus solo, lo que indica que el cisplatino contribuía a eliminar las células tumorales. Por lotanto, aunque las células son refractarias al cisplatino, el tratamiento con reovirus aumentaba la sensibilidad de lascélulas tumorales al fármaco.

Sin limitarse a una teoría, se cree que el reovirus sensibiliza las células tumorales a agentes quimioterapéuticos

5 potenciando la acumulación de los agentes en las células tumorales, o induciendo la apoptosis. Se sabe que el reovirus inhibe la síntesis de proteínas de la célula huésped en favor de la traducción de sus propias proteínas. Porlo tanto, la infección con reovirus puede inhibir la síntesis de proteínas transportadoras de fármacos, tales comoMDR1 o las MRP, y posibilita que los fármacos se acumulen en la célula. Como las proteínas transportadoras defármacos son responsables de transportar diversos fármacos fuera de la célula, incluyendo fármacos estructuralmente no relacionados, la inhibición de la síntesis de dichas proteínas transportadoras conduciría a lasensibilización de la célula a una diversidad de fármacos. Como alternativa, se sabe que los reovirus inducen laapoptosis de las células infectadas, que puede volver a las células más susceptibles a un estrés adicional.

La presente invención, por tanto, proporciona un método valioso para aumentar tanto la eficacia como la selectividadde la quimioterapia. La selectividad ha sido un problema principal de la quimioterapia, porque los agentes

15 quimioterapéuticos generalmente inhiben el crecimiento tanto de las células normales como de las células neoplásicas. Los agentes quimioterapéuticos presentan selectividad limitada pero, como las células neoplásicascrecen más rápido que la mayoría de las células normales, se inhibe su crecimiento en un grado mayor. Noobstante, las células normales de crecimiento rápido, tales como las células de médula ósea, tienden a dañarsegravemente por los fármacos quimioterapéuticos, con los consiguientes efectos secundarios significativos. Encontraste, los reovirus son altamente selectivos para las células neoplásicas y sensibilizan las células neoplásicassolamente. Por tanto, los reovirus potencian la acumulación de los fármacos quimioterapéuticos solamente en lascélulas neoplásicas, aumentando de este modo tanto la eficacia como la selectividad de los agentes quimioterapéuticos.

En la presente invención, es preferible que el reovirus aumente la sensibilidad de células o animales al fármaco en al

25 menos aproximadamente el 20% en comparación con el efecto del fármaco en ausencia de reovirus. El aumento en la sensibilidad es más preferiblemente de al menos aproximadamente el 40%, aún más preferiblemente de al menosaproximadamente el 70%, e incuso más preferiblemente de al menos aproximadamente el 100%. En la realizaciónmás preferida, como en el Ejemplo 1, el reovirus es útil para sensibilizar una célula que es refractaria al fármaco enausencia de reovirus, y el efecto de sensibilización no puede expresarse numéricamente.

La sensibilidad de una célula a un fármaco puede observarse o medirse de acuerdo con métodos establecidos en latécnica, que pueden variar con la naturaleza de la enfermedad. Por ejemplo, la sensibilidad de una célula neoplásicaa un fármaco puede determinarse por el tamaño del tumor o la tasa de crecimiento de la célula neoplásica (en estecaso, véase el Ejemplo 1). La sensibilidad también puede observarse en forma de una reducción de los síntomas o indicadores relacionados con la enfermedad, tales como el recuento de células sanguíneas en pacientes con

35 leucemia o la función hepática en pacientes con tumores hepáticos.

La presente invención puede usarse para aumentar la sensibilidad de las células neoplásicas a cualquier agentequimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen 5-fluorouracilo, mitomicina C, metotrexato,hidroxiurea, ciclofosfamida, dacarbazina, mitoxantrona, antraciclinas (por ejemplo, epirrubicina y doxorrubicina),carboplatino, cisplatino, taxol, taxotere, tamoxifeno, anti-estrógenos, e interferones. Aunque siguen desarrollándosenuevos agentes quimioterapéuticos, se espera que también exista resistencia a los nuevos fármacos del mismomodo que se produce resistencia a los agentes conocidos. Por consiguiente, se espera que los reovirus sensibilicenlas células neoplásicas a los nuevos agentes quimioterapéuticos, o eviten que la neoplasia desarrolle resistencia alos nuevos agentes. Un especialista en la técnica será capaz de determinar si el presente método se podrá aplicar alos nuevos agentes de acuerdo con los métodos descritos en este documento.

45 Los reovirus se administran de un modo que los ponga en contacto con las células neoplásicas diana. La vía por la cual ha que administrarse el reovirus, así como la formulación, el medio o vehículo, dependerán de la localizaciónasí como del tipo de células diana. Puede emplearse una amplia diversidad de vías de administración. Por ejemplo, para una neoplasia sólida accesible, el reovirus puede administrarse por inyección directamente en la neoplasia. Enneoplasias hematopoyéticas, por ejemplo, el reovirus puede administrarse por vía intravenosa o intravascular. Paraneoplasias que no son fácilmente accesibles dentro del cuerpo, tales como metástasis, el reovirus se administra detal modo que pueda transportarse sistémicamente a través del cuerpo del mamífero y alcanzar de este modo laneoplasia (por ejemplo, por vía intravenosa o intramuscular). Como alternativa, los reovirus pueden administrarsedirectamente a una única neoplasia sólida, desde donde después se transporta por vía sistémica a través del cuerpohasta las metástasis. Los reovirus también pueden administrarse por vía subcutánea, intraperitoneal, intratecal (por

55 ejemplo, para tumores cerebrales), tópica (por ejemplo, para melanoma), oral (por ejemplo, para neoplasias orales o esofágicas), rectal (por ejemplo, para neoplasia colorrectal), vaginal (por ejemplo, para neoplasia cervical o vaginal), nasal o por inhalación (por ejemplo, para neoplasias pulmonares).

El reovirus o el agente quimioterapéutico puede administrarse en una única dosis, o en dosis múltiples (es decir, más de una dosis). Las dosis múltiples pueden administrarse de forma concomitante en diferentes sitios o por diferentesvías, o de forma consecutiva (por ejemplo, durante un periodo de días o semanas). El reovirus se administrapreferiblemente antes de o de forma concomitante con la administración del agente quimioterapéutico.

El reovirus se formula preferiblemente en forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosificación de aproximadamente 102 pfu a aproximadamente 1013 pfu de reovirus. La expresión "formas de dosificación unitaria"hace referencia a unidades físicamente distintas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y

65 otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predetermina de reovirus calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado.

Se contempla que la presente invención pueda combinarse con otras terapias contra los tumores tales comoradioterapia o cirugía.

Además, la presente invención proporciona un método para evitar que una neoplasia desarrolle resistencia afármacos. La resistencia progresiva a los fármacos se desarrolla tratando una neoplasia con un fármaco que eliminalas células sensibles al fármaco dentro de la neoplasia, seleccionando de este modo las células resistentes alfármaco. Después de la expansión de las células resistentes al fármaco, la neoplasia manifiesta el fenotipo deresistencia al fármaco. Por consiguiente, el reovirus puede usarse para sensibilizar la neoplasia al inicio del curso dequimioterapia de modo que se eliminen o inhiban todas las células, incluyendo las células resistentes al fármaco. Porlo tanto, la neoplasia tratada de este modo no tendría oportunidad de desarrollar resistencia al fármaco.

Una célula que es resistente a un fármaco a menudo es resistente a otro fármaco debido al fenómeno de resistenciaa múltiples fármacos. Por lo tanto, el reovirus se administra preferiblemente a neoplasias que no se han tratado conningún agente quimioterapéutico, para evitar el desarrollo de resistencia a fármacos. No obstante, una vez se hadesarrollado la resistencia a fármacos, el reovirus aún puede usarse para sensibilizar las células resistentes afármacos y aumentar la eficacia y selectividad de la quimioterapia, así como para eliminar directamente las célulasneoplásicas por oncólisis.

Como se ha indicado anteriormente, creemos que el reovirus sensibiliza las células neoplásicas a agentes quimioterapéuticos inhibiendo la síntesis proteica de la célula huésped o induciendo la apoptosis.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar esta invención y no deben entenderse de ningún modo comolimitantes del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas nodefinidas tienen sus significados generalmente aceptados.

°C = grado Celsius h = hora min = minuto M = micromolar mM = milimolar M = molar ml = mililitro l = microlitro mg = miligramo g = microgramo PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida rpm = revoluciones por minuto FBS = suero bovino fetal DTT = ditiotreitol SDS = dodecil sulfato sódico PBS = solución salina tamponada con fosfato DMEM = medio de Eagle modificado por Dulbecco -MEM = medio de Eagle modificado  -ME = -mercaptoetanol MOI = multiplicidad de infección PFU o pfu = unidades formadoras de placas PKR = proteína quinasa activada por ARN bicatenario EGF = factor de crecimiento epidérmico PDGF = factor de crecimiento derivado de plaquetas DMSO = dimetilsulfóxido MDR = resistencia a múltiples fármacos MRP = proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos HSV = virus del herpes simple

EJEMPLO 1 Sensibilización de células tumorales refractarias a cisplatino por reovirus

A ratones C3H (Charles River) se les implantó por vía subcutánea 1,0 x 106 PFU de células C3H transformadas por ras (un presente de D. Edwards, Universidad de Calgary) y se dejó que desarrollaran tumores. La cepa Dearing dereovirus del serotipo 3 usada en estos estudios se propagó en cultivos de suspensión células L y se purificó de acuerdo con Smith (Smith et al., 1969), con la excepción de que se omitió el -mercaptoetanol (-ME) del tampón deextracción. La proporción partícula/PFU para reovirus purificado fue típicamente 100/1.

Los ratones que albergaban tumores se trataron con 4 regímenes diferentes que se describen a continuación:

Nº serie: Reovirus Fármaco

1: control control

2: control cisplatino

3: reovirus control

4: reovirus cisplatino

En los animales que recibieron reovirus (Series 3-4), se inyectaron por vía intravenosa 5 x 108 PFU de reovirus (en 20 l de solución salina) a través de la vena de la cola de los animales en los días 0, 6, 12, y 18. A los animales queno recibieron reovirus (Series 1-2) se les inyectó 20 l de solución salina en una forma similar y en el mismo periodode tiempo. El cisplatino se inyectó en la vena de la cola en los días 10, 16 y 22 a una dosis de 2,5 mg por kilogramode peso corporal. Los tumores se midieron diariamente desde el día 0 para evaluar la tasa de crecimiento de los tumores.

Los tumores eran refractarios al cisplatino. Como se muestra en la Figura 1, los tumores tratados con cisplatino solo(Serie 2) progresaron de forma casi indistinguible de los tumores de control (Serie 1), lo que indica que el cisplatinoesencialmente no tenía efectos inhibidores sobre la tasa de crecimiento de los tumores. En contraste, la combinación de cisplatino y reovirus (Serie 4) redujo significativamente el crecimiento tumoral. El nivel de inhibición por la combinación fue mucho más profundo que con el reovirus solo (Serie 3). Por lo tanto, el cisplatino contribuyó ala supresión tumoral cuando se usó junto con el reovirus.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

El uso de una cantidad eficaz de un reovirus y una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico para la preparación de una composición farmacéutica para sensibilizar una célula neoplásica refractaria a dicho agente quimioterapéutico.
2.

El uso de una cantidad eficaz de un reovirus y una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un sujeto portador de un trastorno proliferativo, donde dicho sujeto tiene células neoplásicas que son refractarias a dicho agente quimioterapéutico, por lo cual la composición farmacéutica tiene que administrarse en condiciones que provoquen la infección de las células neoplásicas por el reovirus.
3.

El uso de la reivindicación 2, en el que el trastorno proliferativo es un tumor sólido, un tumor hematopoyético o un tumor metastásico.
4.

El uso de la reivindicación 3, en el que el tumor sólido se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer pulmonar, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer suprarrenal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de mama y cáncer del sistema nervioso central y periférico.
5.

El uso de la reivindicación 3 ó 4, en el que el reovirus tiene que administrarse en o cerca del tumor sólido.
6.

El uso de la reivindicación 2, en el que el reovirus tiene que administrarse por vía sistémica.
7.

El uso de la reivindicación 3, en el que el tumor hematopoyético se selecciona del grupo compuesto por linfomas y leucemias.
8.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el reovirus tiene que administrarse antes de la administración del agente quimioterapéutico o de forma concurrente con el agente quimioterapéutico.
9.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula neoplásica está localizada en un mamífero, o el sujeto es un mamífero.
10.

El uso de la reivindicación 9, en el que el mamífero se selecciona entre el grupo compuesto por perros, gatos, ovejas, cabras, vacas, caballos, cerdos, seres humanos y primates no humanos.
11.

El uso de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo compuesto por 5-fluorouracilo, mitomicina C, metotrexato, hidroxiurea, ciclofosfamida, dacarbazina, mitoxantrona, antraciclinas, carboplatino, cisplatino, taxol, taxotere, tamoxifeno, anti-estrógenos, e interferones.
12.

El uso de la reivindicación 11, en el que el agente quimioterapéutico es cisplatino.
13.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el reovirus es un reovirus de mamíferos.
14.

El uso de la reivindicación 13, en el que el reovirus de mamíferos es un reovirus humano.
15.

El uso de la reivindicación 14, en el que el reovirus de seres humanos es un reovirus de serotipo 3.
16.

El uso de la reivindicación 15, en el que el reovirus de serotipo 3 es un reovirus de la cepa Dearing.
17.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el reovirus es un reovirus recombinante.
18.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el reovirus tiene que administrarse en dosis múltiples.
19.

El uso de la reivindicación 18, en el que el reovirus tiene que administrarse en múltiples dosis antes de la administración del agente quimioterapéutico.