ES2367285A1 - Conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal y kit para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal y kit para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal.La presente invención hace referencia a un conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal. Este conjunto, que incluye el marcador DCC (18q21.3) ya conocido en la literatura, comprende además los marcadores ASAPl (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13qll-q12), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1). Opcionalmente también comprende los marcadores MSRI (8p22), TNKS (8p23.1), CYP24A1 (20q13) y/o AURKA (20q13.2-13.3). Este conjunto de marcadores fue elegido a partir de resultados obtenidos mediante varios métodos como el CGHa de baja y alta densidad, el Q-PCR y el FISH, donde los resultados del Q-PCR fueron analizados enfrentando el método absoluto y relativo de éste análisis. Se presenta también un kit para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal que comprende este conjunto de marcadores.

Description

Conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal y kit para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal.

Objeto de la invención

La presente invención hace referencia a un conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal.

Este conjunto de marcadores fue elegido a partir de resultados obtenidos mediante varios métodos aplicados a tejidos, y ADN extraído de los mismos, de pacientes con metástasis hepática de cáncer colorrectal, comparado con personas sanas.

Un primer screening mediante arrays de Hibridación Genómica Comparada (CGHa) de baja (287 sondas) y alta densidad (44.000 sondas) proporcionó varias alteraciones numéricas que fueron analizadas posteriormente mediante la reacción en cadena de la DNA polimerasa cuantitativa a tiempo real (Q-PCR). Los datos de la Q-PCR fueron analizados enfrentando el método absoluto y relativo de éste análisis.

Además los resultados obtenidos mediante las metodologías anteriores fueron validados mediante la técnica de Hibridación In Situ con fluorescencia.

El conjunto de marcadores, que incluye el marcador DCC (18q21.3) ya conocido como un marcador para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal, comprende además los marcadores MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), SMAD4 (18q21.1), TDP52L2 (20qtel), MYBL2 (20q13.1), CYP24A1 (20q13) y AURKA (20q13.2-13.3).

Se presenta también un kit que comprende un conjunto de marcadores que comprende los marcadores MSR1(8p22), TNKS (8p23.1), ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), SMAD4 (18q21.1), DCC (18q21.3), TDP52L2 (20qtel), MYBL2 (20q13.1), CYP24A1 (20q13) y AURKA (20q13.2-13.3) para la detección de alteraciones numéricas, indicando una metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal mediante técnicas como la CGHa de baja y alta densidad, Q-PCR, FISH y métodos similares.

Antecedentes de la invención

El cáncer, es esencia un proceso genético. Debido a cambios o mutaciones en el ADN, la célula normal pasa a convertirse en una célula cancerosa, a veces, dichas células, mueren o son eliminadas en los ganglios linfáticos, pero, otras veces, siguen con vida y se reproducen de una manera anormal y desordenada. A su vez, debido a estas alteraciones, se ven comprometidos los mecanismos de reparación del ADN lo cual implica que las células cancerosas sean más susceptibles de sufrir nuevas mutaciones.

En algunos casos, las células cancerosas tienden a emigrar a otras regiones, a través de la sangre o de la linfa, y son capaces de sobrevivir en el medio sanguíneo y producir un nuevo crecimiento en un lugar diferente del organismo. A este proceso de propagación de un foco canceroso a un órgano distinto de aquel en que se inició, con capacidad de penetrar en los vasos sanguíneos y linfáticos, diseminarse a través de la circulación sanguínea, y después crecer en tejidos normales del cuerpo se le conoce como metástasis, término denominado así por vez primera por el médico francés Joseph Claude Recamier en 1823. Son las metástasis las responsables de la muerte de los enfermos de cáncer.

El cáncer no es solo una enfermedad sino muchas enfermedades, el término cáncer engloba a más de 200 enfermedades con distintas características genéticas y diferente evolución, incluso se podría decir que un mismo cáncer es distinto en cada individuo. A su vez se trata de una enfermedad multigénica, lo cual complica más el pronóstico y el tratamiento de la enfermedad, ya que cada individuo puede responder de forma distinta a los tratamientos establecidos. La heterogeneidad es la principal característica del cáncer y lo que hace que sea tan complicado curarlo, a la heterogeneidad genética hay que sumarle la influencia del microambiente tumoral. Debido a todos estos factores resulta muy complicado aplicar tratamientos efectivos.

En España, sólo un 54% de los pacientes que sufren un cáncer de colon sobreviven más de 5 años. El cáncer de colon se trata de uno de los que muestran mayor mortalidad, por delante incluso del de pulmón. Entre un 20 y un 30% de los pacientes a los que se diagnostica cáncer de colon presentan metástasis hepática sincrónicas clínicamente demostrables, y entre un 40 y 50% de los pacientes presentan recidiva hepática una vez resecado el tumor primario (Adam et al., 2001). Actualmente, la resección hepática constituye la única opción terapéutica con intención curativa de los pacientes con metástasis hepática de cáncer de colon, con Indices de supervivencia entre 26 y 45% a los 5 años (Fong et al., 1997; Figueras et al., 2001). A pesar de ello, la mitad de estos pacientes presentan una recidiva después de la cirugía, que en la mayoría de los casos se produce en los 2 primeros años (Fortner et al., 1984). En 2006 se cobró la vida de 98.046 personas en España aunque paradójicamente es uno de los más tratables, de forma que un diagnóstico precoz aumente enormemente la probabilidad de curación. Se calcula que hasta un 90% de los casos serian curables si se detectasen a tiempo (aecc).

Existen diferentes tipos de cáncer colorrectal, por un lado el cáncer colorrectal familiar poliposo (FAP), siendo entre el 10-12% de los casos, el cáncer colorrectal hereditario no poliposo (HNPCC) o síndrome de Lynch, que abarcan entre el 5 y 8% de los casos y por último el cáncer de colon esporádico siendo este el 80-85% de los casos.

Existen dos vías de carcinogénesis con distinto origen en las neoplasias colorrectales. La primera y la más común, afectando al 85% de los casos se denomina modelo supresor o LOH, y se caracteriza por la acumulación progresiva de alteraciones genéticas que tienen lugar paralelamente a la evolución de la alteración histológica adenoma-cáncer (Fearon y Vogelstein, 1990. Incluye eventos característicos como la anulación funcional de genes supresores tumorales, como APC (5q21-22), cuya mutación es uno de los eventos más tempranos en el desarrollo del cáncer de colon (Bodmer et al., 1989).

La segunda vía alternativa (modelo mutador) se caracteriza por la aparición de mutaciones diseminadas por todo el genoma (Ilyas et al. 1996). Algunas de estas mutaciones ocurren en regiones codificantes de genes implicados en el ciclo celular y en la progresión tumoral. La señal distintiva de esta vía es la alteración de la longitud y composición de pequeñas secuencias de bases del ADN (microsatélites). Este fenómeno se conoce como inestabilidad de microsatélites (Lothe, 1997) y, aunque también participa en el 15% de los tumores esporádicos, es característico del síndrome de Cáncer Colorrectal Hereditario No Poliposo (CCHPN) los cuales se corresponden con el 2-5% de todos los carcinomas colorrectales.

La gran mayoría de los cánceres de colon se generan a partir de una serie de cambios genéticos, ilustrado esquemáticamente en la Figura 1, en los que están implicadas la activación de oncogenes RAS y la inactivación de genes supresores de tumores como el gen APC en 5q21, P53 en 17p13 así como en 18q (Kinzler y Vogelstein, 1996). Por lo que debido a esta recurrencia común de mutaciones es asumible el papel de las mutaciones en estos genes como factores contribuyentes a la inestabilidad cromosómica en cáncer colorrectal. (Grady et al., 2008). La inestabilidad cromosómica (CIN) es el tipo más común de inestabilidad genómica observada en el cáncer de colon, y ocurre en un 80-85% de los tumores colorrectales. A pesar de la alta frecuencia de la inestabilidad cromosómica en el cáncer de colon, y el hecho de que la aneuploidia está considerada como un suceso inherente al cáncer, hasta el momento la predicción del pronóstico de pacientes con metástasis hepática resecadas de cáncer colorrectal continúa siendo problemática. La identificación de sucesos específicos de ganancias y pérdidas de cromosomas que ocurren durante el desarrollo de adenoma a carcinoma y la demostración de que la inestabilidad cromosómica es un evento temprano en la formación del tumor que incrementa su progresión, sugiere que la inestabilidad cromosómica es un fenómeno patogenético en el cáncer de colon. (Grady et al., 2008).

En cuanto a las deleciones cromosómicas descritas anteriormente para esta patología en concreto, no son útiles como marcadores moleculares ya que implican a grandes regiones del genoma. La gran cantidad de material genético implicado, hace que no se puedan detectar mediante técnicas clásicas de biología molecular, tales como PCR.

En comparación con los tumores primarios, en las metástasis se encuentran frecuentemente eventos adicionales de aberraciones cromosómicas (incluyendo ganancias y pérdidas alélicas). La incidencia de las alteraciones cromosómicas combinadas en el tumor primario, además de las aberraciones adicionales en las metástasis distantes, se correlaciona directamente con la supervivencia post-metastática.

Ha sido ya ampliamente demostrado que existe una relación directa entre los loci que se ven afectados por amplificaciones de alto nivel, o pérdida génica, con la tumorigénesis en tumores sólidos, y en muchas ocasiones, dichas alteraciones proporcionan dianas terapéuticas (Clark PE, 2008). Gracias a la integración de resultados citogenéticos y moleculares en una única plataforma, se ha demostrado que muchos tipos de cáncer mantienen una sobreexpresión en algunos de sus genes debida a alteraciones estructurales génicas (Croce CM., 2008).

Aunque no son muchos los estudios realizados acerca de los tumores primarios de carcinoma colorrectal presentando metástasis hepática sincrónicas, en la bibliografía no se ha descrito la existencia de diferencias significativas en cuanto a las alteraciones que presentan ambos tipos tumorales, de manera que aquéllas mostradas por las metástasis hepática se encontraban de igual manera en los tejidos primarios (Al-Mulla et al., 1999; Korn et al., 1999; Weber et al., 2001).

Existen en la práctica clínica una serie de biomarcadores, los cuales se analizan en muestras, ya sea de sangre, de tejido, de fluidos, etc., es imprescindible para la detección de signos de cáncer, su evolución y la respuesta ante un tratamiento. También puede contribuir a determinar la probabilidad de padecer un determinado tipo de cáncer, la probabilidad de desarrollar metástasis y en qué sitio se podrían manifestar estos y diagnosticar la fuente de la propagación de la enfermedad en un paciente cuando se desconoce el origen del tumor.

Se consideran marcadores tumorales todas las sustancias producidas o inducidas por la célula neoplásica que reflejen su crecimiento y/o actividad y que permitan conocer la presencia, la evolución o la respuesta terapéutica de un tumor maligno. Los marcadores tumorales pueden ser productos de las propias células tumorales o pueden producirse por células sanas como respuesta al crecimiento tumoral y/o a las nuevas condiciones fisiológicas que implican dicha patología. La sensibilidad de los marcadores tumorales varia en relación con el estadio tumoral, aumentando la sensibilidad a medida que el tumor avanza en grado, por lo que hoy en día contamos con un conjunto de biomarcadores tumorales enfocados al pronóstico y control evolutivo del tumor más que al diagnóstico.

El principal problema de los biomarcadores tumorales actuales en suero, es la detección de los mismos en pacientes sanos, o los denominados falsos positivos. El control de la detección de falsos positivos se basa en el incremento sérico de la mayoría de marcadores tumorales, ya que en pacientes sin neoplasias, este crecimiento es normalmente muy inferior al que presentan pacientes con neoplasias, además de mostrar una estabilización en 2-3 determinaciones seriadas, con respecto al incremento continúo que muestran los pacientes portadores de neoplasias.

Otro factor negativo a tener en cuenta es que, hoy en día, la mayoría de los marcadores tumorales no son específicos de un tumor. Los marcadores más ampliamente conocidos son indicadores bioquímicos de la presencia de un tumor, tales como antígenos de superficie celular, proteínas citoplasmáticas, enzimas y hormonas. En ocasiones, enfermedades no cancerosas también pueden provocar que niveles de ciertos marcadores tumorales se incrementen más de lo normal y también hay que destacar que no toda persona con cáncer puede presentar niveles elevados de algún marcador tumoral en particular.

Hoy en día no hay mercadores que den un pronóstico de la enfermedad, el cáncer de colon hoy en día es el que más muertes causa entre los hombres y el segundo entre las mujeres, sin embargo en 90% de los casos serian curables si se detectasen a tiempo. Otro punto a tener en cuenta es que no hay ningún marcador asociado a la progresión de la enfermedad, es decir no hay marcadores que se puedan ser evaluados ya en el tumor primario con el fin de identificar aquellos casos en los que el paciente tiene un peor pronóstico es decir las características genéticas de su tumor hacen que este sea más agresivo y mas invasivo y por lo tanto tiene mayor probabilidad de desarrollar metástasis.

Estos problemas son solventados en la invención que se procede a describir.

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Descripción de la invención

Para detectar la presencia de metástasis hepática en pacientes con un cáncer colorrectal se presenta un conjunto de marcadores que comprende, además del marcador DCC (18q21.3), los marcadores ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1). Opcionalmente también incluyen los marcadores MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), CYP24A1 (20q13) y/o AURKA (20q13.2-13.3).

Estos marcadores son elegidos a partir de resultados obtenidos de análisis de alteraciones citogenéticas mediante CGHa de baja y alta densidad, Q-PCR y FISH, donde los resultados de la Q-PCR fueron analizados enfrentando el método absoluto y relativo de éste análisis.

Se presenta además un kit para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal mediante varias técnicas biotecnológicas que comprende los marcadores ASAP1 (8q24.1-q2 4.2), ZMYM2 (13q11-q12), DCC (18q21.3), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4. Opcionalmente se pueden incluir dentro del kit los marcadores MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), CYP24A1 (20q13) y/o AURKA (20q13.2-13.3).

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Descripción de los dibujos

Se complementa la presente memoria descriptiva con planos ilustrativos de un ejemplo preferente y nunca limitativo de la invención.

La Figura 1 muestra esquemáticamente el desarrollo de la secuencia adenoma-carcinoma en el cáncer de colon, según el estado de la técnica. La Figura 1A muestra una sección de tejido colorrectal normal, sin ningún tipo de cambios en el fenotipo y genotipo de las células de la cripta (C), lumen (L) y endotelio (E). En el paso (1.1) de un fenotipo normal hacia una displasia con criptas focales aberrantes ilustrado en la Figura 1B, se halla la mutación en el gen APC. Los cambios en los siguientes fenotipos hacen que la displasia vaya cambiando de un adenoma temprano (1.2), a un adenoma intermedio, acabando en un adenoma tardío, ilustrado en la Figura 1C, con una mutación en el gen KRAS y DCC para el cambio entre un adenoma temprano a intermedio y de intermedio a tardío, respectivamente. En cuando haya una mutación del gen P53, se pasa a un fenotipo de adenoma tardío a un carcinoma invasivo (cáncer de colon; 1.3), ilustrado en la Figura 1D. Cambios genéticos adicionales hacen que evolucionen metástasis (1.4), que a su vez presentan más cambios genéticos para adaptarse al nuevo entorno en donde se encuentran las células de la metástasis.

La mayoría de los tumores colorrectales parecen asentarse sobre adenomas preexistentes que sufren un proceso de degeneración. El proceso adenoma-carcinoma representa un excelente modelo de carcinogénesis según el cual ocurren cambios morfológicos en la mucosa intestinal que conducen secuencialmente a hiperplasia, adenoma, carcinoma in situ, y carcinoma invasivo.

La Figura 2 muestra una representación esquemática de las alteraciones numéricas más significativas, encontradas en los 5 experimentos de CGH array de baja densidad (Genosensor, Vysis). Para cada cromosoma (de 1 a 22 y con la excepción de los cromosomas sexuales X e Y) se indica con el número 2.1 las regiones con ganancia de y con el número 2.2 las regiones que muestran deleciones.

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Figura 3 muestra una representación gráfica en diagrama de cajas (boxplot) de los valores de 2^{-\Delta \Delta Ct} (eje de coordenadas) obtenidos por 10 loci en un total de 140 muestras de metástasis hepática de CCR mediante Q-PCR. Los loci están presentados por números de la siguiente forma: 3.1: ASAPI; 3.2: ZMYM2; 3.3: CYP24A1; 3.4: MYBL2; 3.5: AURKA; 3.6: TDP52L2; 3.7: MSR1; 3.8: TNKS; 3.9:SMAD4; 3.10: DCC. Las líneas 3.11 y 3.12 indican los valores umbrales de ganancia (1,5) y pérdida (0,5), respectivamente.

Figura 4 muestra un ejemplo de una hibridación in situ fluorescente (FISH) sobre tejido tumoral. de metástasis hepática de carcinoma colorrectal, indicando una amplificación del gen ASAP1. El FISH se realizó junto con la sonda centromérica del cromosoma 9 como control. En la figura 4A se observa la amplificación del gen ASAP1 (4.1) sobre el centrómero del cromosoma 9 (4.2). En la figura 4B se observa un detalle de la muestra donde se observan de hasta 11 copias del gen ASAP1 (4.1) por una marca del centrómero del cromosoma 9 (4.2).

La figura 5 muestra el resultado para la hibridación in situ fluorescente (FISH) para el gen TNKS sobre tejido tumoral de metástasis hepática de carcinoma colorrectal, indicando una deleción. En la figura 5A se observa la deleción del gen TNKS (5.1) sobre el centrómero del cromosoma 9, utilizado como control (5.2). Se observa en detalle en la figura 5B un núcleo con pérdida de un alelo para el locus estudiado (5.1), con dos copias normales de la región control (5.2).

En la figura 6 se ilustra el resultado de la hibridación in situ fluorescente con sondas centroméricas para los cromosomas teloméricas del cromosoma 13 sobre tejido tumoral de metástasis hepática de carcinoma colorrectal, indicando un anapleudismo. En la figura 6A se observa la hibridación de las sonda centroméricas y telomérica del cromosoma 13 estudiado (6.1) y el centrómero del cromosoma 9 como control (6.2), indicando una poliploidia para el cromosoma 8. La figura 6B muestra la poliploidia del cromosoma 20.

La Figura 7 muestra la frecuencia de alteración génica (eje de coordenadas) en 100 muestras de metástasis hepática de carcinoma colorrectal mediante FISH. En el eje de abscisas se muestran los loci estudiados, que son: 7.1: TNKS; 7.2: ASAP1; 7.3: ZMYM2; 7.4: SMAD4; 7.5: DCC; 7.6: MYBL2; 7.7: CYP24A1; 7.8: AURKA y 7.9: TPD52L2. Los loci ASAP1, ZMYM2, MYBL2, CYP24A1, AURKA y TPD52L2 son marcadores de ganancia génica, con una alteración del 37%, 40%, 34%, 30%, 32% y 34% respectivamente, mientras que TNKS, SMAD4 y DCC son marcadores de pérdida génica, con una alteración del 38%, 67% y 60%, respectivamente. Junto a cada locus (a) se encuentra también representada la frecuencia de alteración de cada sonda control respectiva de cada locus. El centrómero del cromosoma 8 muestra una frecuencia de deleción del 8% (b) y una frecuencia de amplificación del 13% (c). El telómero del cromosoma 13 (d) muestra una frecuencia de amplificación del 45%. El centrómero del cromosoma 18 presenta una frecuencia de deleción del 31% (e). El centrómero del cromosoma 20 muestra una frecuencia de amplificación del 32% (f).

La Figura 8 representa la disminución en la frecuencia de alteración (eje de coordenadas) de los 4 loci analizados (8.1: ASAP1; 8.2: ZMYM2; 8.3: TPD52L2 y 8.4: SMAD4) en los tumores primarios no metastático (8.5) al comparar dichas frecuencias de alteración con las presentes en las metástasis hepática (8.6).

La figura 9 muestra una representación gráfica de los porcentajes de alteración (eje de coordenadas) de los loci ASAP1 (9.1), ZMYM2 (9.2), MYBL2 (9.3), TPD52L2 (9.4), SMAD4 (9.5) en los metástasis hepática (9.6), en los tumores primarios no metastáticos (9.7), en los tumores primarios metastáticos (9.8) y en las metástasis de los tumores primarios analizados (9.9).

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Exposición detallada de la invención

Para llevar a cabo la invención se utilizaron técnicas clásicas de técnicas de biología celular, microbiología, ingeniería genética y también tecnología de última generación de biología molecular y citogenética molecular, como son la Q-PCR y los arrays de Hibridación Genómica Comparada (CGH). Para ello se partió de muestras de tejido de metástasis hepática de pacientes con cáncer colorrectal (1-3 metástasis resecables).

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Muestras de biopsias, tejidos y células

Las biopsias fueron diseccionadas en dos partes, una se congeló en hielo carbónico y fueron almacenadas a una temperatura de -80ºC y otra se procesó para cortes histológicos y matrices titulares de tejido tumoral, tejido normal hepático y miofibroblastos.

También se utilizaron muestras de cáncer de colon primario que se obtuvieron a partir de biopsias fijadas e incluidas en parafina y como control se utilizó la línea celular continua del carcinoma colorrectal HT-29 de miofibroblastos se siguió un protocolo de aislamiento de células común, excepto en el último paso, donde una centrifugación a bajas revoluciones permite separar los hepatocitos de las células no parenquimáticas.

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Extracción del ADN

De los tejidos aislados se extrajo ADN mediante el siguiente procedimiento. Fueron digeridos por Proteinasa K en tampón Tris-EDTA y SDS 10%, ajustando las cantidades al tamaño y peso de la pieza de tejido, durante 12 horas a 55ºC en un incubador en agitación continúa. Se añadieron compuestos orgánicos inmiscibles con el agua, por ejemplo fenol y cloroformo, para dejar el ADN disuelto en la fase acuosa después de varios lavados y centrifugaciones. Los ácidos nucleicos se recuperaron por precipitación añadiendo NaAc 3M y EtOH frío al 100%, se dejó actuar durante 1 hora a una temperatura de -20ºC y se centrifugó, lo que permitió separar el ARN del ADN. Para determinar la concentración de ADN adquirido en las extracciones se han utilizado dos aparatos de medición, un espectrofotómetro para el caso de ADN destinado a PCRs y un nanodrop ND-1000 ("nanodrop®") para el caso de ADN utilizado en los experimentos de array de Hibridación Genómica Comparada (CGHa). Ambos miden la concentración del ADN por su absorbancia a una longitud de onda de 260 nm, sabiendo que una disolución con 50 \mug/ml de ADN de doble hebra en agua posee una absorbancia de 1. Además de las cuantificar el ADN y evaluar su pureza, y con el fin de asegurar la integridad del ADN, se realizó una electrofóresis en gel de agarosa al 0,8% en TBE 0.5X, añadiendo BrEt para visualizar el ADN bajo luz UV.

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Array de Hibridación Genómica Comparada (CGHa)

El CGH fue desarrollado para detectar cambios en el número de copias en cáncer y otras enfermedades (Kallioniemi A, 1992; Kallioniemi OP, 1994; du Manoir S, 1993).).

El CGH se puede llevar a cabo de varias maneras diferentes, con una mayor sofisticación de la técnica en un CGH array donde se realiza un mareaje diferente para ambas muestras (test y control), y una posterior hibridación sobre micro-matrices portadoras de secuencias de ADN específicas. Las matrices utilizadas han sido de dos tipos por un lado de 287 sondas (baja densidad) o 44.000 sondas (alta densidad). Estos fragmentos de ADN pueden provenir de fragmentos clonados en BACs (40-200 kpb), de productos de PCR (100 pb-1.5 kpb), de ADNc (0.5-2 kpb), o de oligonucleótidos 60-mer (25-80 pb) sintetizados in situ.

La unión específica del ADN de una muestra y del ADN de referencia, marcados fluorescentemente cada uno con un color (rojo y verde respectivamente), a cada sonda, tiene como resultado una emisión de fluorescencia en rojo y en verde respectivamente. La expresión del ratio entre ambas mediciones para determinar variaciones en el número de copias de un gen determinado en el CGH array es el logaritmo en base 2 (log_{2}) para poder representarlo en una escala de unidad. El log_{2} de un ratio de 1 en el que la emisión de ambos fluorocromos es la misma, es igual a 0, por lo tanto, valores del log_{2} del ratio de fluorescencia entorno a 0 representan el mismo número de copias para ambas muestras (test y control). Se consideraron amplificación los valores de log_{2} del ratio entre ambos fluorocromos (Cy3 y Cy5) por encima de 0,5, los valores de log2 cercanos a +0.5 se consideraron ganancias en heterocigosis y los cercanos a +1, ganancias en homocigosis. Valores cercanos a -1 se consideraron pérdida génica en heterocigosis, mientras que los que quedaron por debajo de -4 fueron considerados como pérdida de ambas copias para el locus en cuestión.

En primer lugar se analizaron 21 muestras de ADN extraído de biopsias de metástasis hepática de cáncer de colon mediante CGH arrays de baja densidad de la plataforma Genosensor de "Vysis" (287 sondas) en un principio, pasando posteriormente a la utilización de arrays de alta densidad (44.000 sondas) de la plataforma de "Agilent.Technologies". Para realizar este tipo de hibridaciones, el ADN tumoral, marcado fluorescentemente, se enfrentó con ADN normal de referencia, marcado con un fluorocromo diferente. La interpretación de los resultados obtenidos mediante CGH depende del tipo de array y la plataforma utilizada:

A.

En el caso de los arrays de 287 sondas de la plataforma Genosensor, el ADN problema se marca con el fluorocromo Cy3 y el ADN sano de referencia se marca con el fluorocromo Cy5 tal y como se ha explicado en el apartado de materiales y métodos. Los valores para el ratio Cy3/Cy5 iguales a 0 se interpretan como ausencia de alteraciones en la región representada por esa sonda. Valores mayores de 1,2 se interpretan como ganancia en dicha región genómica, mientras que los valores inferiores a 0,8 para dicho ratio se interpreta como pérdidas en dichas secuencias de ADN. Solamente se tuvieron en cuenta aquellas alteraciones donde la el coeficiente de variación fue inferior al 10% y con un valor de p estadísticamente significativo (\leq0.005).

B.

En el caso de los arrays de 44.000 y 244.000 sondas de "Agilent Technologies", y siguiendo el protocolo establecido por la casa comercial, el ADN problema se marca con el fluorocromo Cy5 y el ADN sano de referencia con Cy3. Tras la hibridación se llevó a cabo la extracción de los datos de las imágenes de los microarrays generadas ("Feature Extraction 10.5 Image Analysis"), y el análisis de los mismos se realizó mediante el programa informático "Agilent CGH Analytics 3.3.28 Software". Mediante la utilización de este programa obtuvimos valores (Y) dados como log2X (logaX=Y), siendo X el valor del ratio Cy5/Cy3 de las sondas para un gen o secuencia concreta. Si la media de los valores obtenidos para los ratios de las diferentes sondas que representan a un locus en el array, es igual a cero significa que no hay alteración en esa región genómica. Cuando se obtienen valores superiores a cero se habla de suceso de ganancia génica, mientras que si el valor es inferior a cero hablamos de deleción génica. Cuando obtenemos valores positivos o negativos pero muy cercanos al 0 hay que tratarlos con cautela.

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La interpretación de los resultados ha sido la siguiente:

\circ

log2 Cy5/Cy3= +0.5 \rightarrowCy5/Cy3 \approx 1.5. Ganancia génica.

\circ

log2 Cy5/Cy3= +1 \rightarrowCy5/Cy3 \approx 2. Amplificación génica.

\circ

log2 Cy5/Cy3= -1 \rightarrowCy5/Cy3 \approx 0.5. Deleción en heterocigosis.

\circ

log2 Cy5/Cy3= -4 \rightarrowCy5/Cy3 \approx 0. Deleción en homocigosis.

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Para evitar en la medida de lo posible las variaciones debidas al ADN sano proveniente de otros tipos celulares presentes en la biopsia variación se realizaron todas las mediadas necesarias de control: Evaluación del porcentaje de tejido tumoral presente en la biopsia mediante observación histológica de la misma, eligiéndose únicamente aquellas con un porcentaje en masa tumoral por encima del 95%, se realizaron varias hibridaciones controles para evitar una determinación errónea de las alteraciones genómicas encontradas debidas a factores intrínsecos a la metodología explicadas a continuación, dentro de estas hibridaciones están hibridaciones con ADN de esperma de salmón, el cual se utiliza en las hibridaciones como agente bloqueante de las secuencias altamente repetitivas, hibridación control de ADN normal para discriminar posibles falsas aberraciones, debido a la presencia de variaciones en el número de copias (CNVs) polimórficas e hibridaciones con ADN de fibroblastos tumorales extraídos de las metástasis hepática, con el fin de descartar que alguna de alteraciones encontradas en las biopsias mediante CGH fueran en realidad de los fibroblastos tumorales y no de las células tumorales.

Los resultados de CGH mediante el mareaje fluorescente del ADN control de esperma de salmón no produjo ninguna hibridación inespecífica sobre la micromatriz. Por lo tanto se esperó que las hibridaciones con ADN muestral no mostraran hibridaciones inespecíficas con regiones de secuencias altamente repetidas, así como ruido de fondo que se pudiera haber producido por restos de fluorocromos Cy3-dUTP y Cy5-dUTP.

Gracias al análisis en detalle del ADN de referencia contra el que se enfrentaron las muestras de ADN de metástasis hepática se pudieron encontrar pequeñas duplicaciones y deleciones consideradas como genotipo "normal", y que se eliminaron del estudio de las muestras de ADN aislado de las metástasis hepática, por ser consideradas como alteraciones sin valor genético.

Realizando un análisis de frecuencias de alteración cromosómica mediante la técnica de CGHa de baja densidad, se encontraron que los cromosomas 7, 8, 9, 13, 18, 19, 20, y 22 presentaron mayores porcentajes de alteración/cromosoma, con el 27%, 28%, 17%, 21%, 17%, 28%, 24% y 28% respectivamente. En un análisis de las regiones cromosómicas más frecuentemente alteradas y de una manera conjunta, destacaron las presentes en los cromosomas 7, 8, 18, 20, y 22. El resto del genoma presentó una serie de alteraciones aisladas que aparecen en el caso más frecuente en 2 de los 5 experimentos realizados, pudiéndose tratar de variaciones polimórficas o mutaciones aisladas de cada muestra. Estos resultados son ilustrados en la Figura 2.

Los resultados preliminares obtenidos a partir de las hibridaciones realizadas sobre arrays de baja densidad se repiten en este segundo análisis con arrays de alta densidad. Las frecuencias de alteración para cada cromosoma, así como los patrones de alteración que siguen se mantienen en ambos tipos de experimentos. Los cromosomas 7, 8, 13, 18 y 20 fueron de nuevo los que presentaron mayores frecuencias de alteración, y sus áreas mínimas de de amplificación/deleción ocuparon mayores tamaños que las presentadas por el resto del genoma.

A pesar de ser una tecnología altamente sensible y capaz de detectar deleciones o duplicaciones de IMpb de tamaño, el CGHa debería estar sujeto a validación mediante otras técnicas, para poder caracterizar la frecuencia y estructura de la alteración en el número de copias (CNAs) de una forma más detallada. Habitualmente los resultados de CGHa se validan mediante tecnologías in situ como FISH o moleculares como Q-PCR (Thompson CT, 1993), por lo que se procedió a la validación de los resultados mediante estas dos técnicas divulgadas posteriormente.

Para ello, de los experimentos de CGH se preseleccionaron 22 loci (13 de ganancia y 9 de deleción) que se analizaron mediante Q-PCR en 140 muestras de metástasis hepática, resumidos en la Tabla 1.

TABLA 1 Loci seleccionados a partir de los experimentos de CGHa. En la tabla se muestra el nombre de cada locus, su posición cromosómica, el tipo de alteración y el porcentaje de alteración de ese locus

1

PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR)

La PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR) surge con la finalidad de resolver el problema de la cuantificación del producto de PCR. La técnica de Q-PCR monitoriza la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción del amplicón en cada ciclo de PCR. Existen varios métodos de emisión de la fluorescencia, en cuanto al agente que la produce: Sybr Green, Sondas TaqMan, o sondas de hidrólisis y sondas de hibridación.

Una vez la fluorescencia se ha detectado durante todo el proceso de amplificación, el programa informático determina en qué ciclo, el valor de la fluorescencia emitida cruza la línea arbitraria o "threshold", a partir de la cual se considera que la fluorescencia emitida es debida al producto de amplificación, y no a componentes de la reacción, este punto se denomina Ct, (Ciclo crítico o Threshold cycle). Este valor es inversamente proporcional a la cantidad de ADN que habla en la muestra inicial.

Además de la sensibilidad, la Q-PCR tiene otras ventajas, entre ellas se encuentra el hecho de que los datos son tomados en la fase exponencial del proceso, de manera que ningún componente se encuentra limitado al proceso de amplificación.

Desde los primeros experimentos desarrollados de Q-PCR, esta tecnología ha sido utilizada en gran medida para la detección de alteraciones en la expresión génica, revelando importantes hitos tanto biológicos como médicos sin haberse aplicado rutinariamente a la detección de alteraciones en el número de copias del ADN como en este caso (Lehmann et al., 2001; Weksberg et al., 2005).

Como se ha descrito anteriormente, la PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR) permite el análisis cinético de la reacción y del producto de la misma en cada ciclo de amplificación. La técnica de Q-PCR monitoriza la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción del amplicón en cada ciclo de PCR. Para el análisis de los datos obtenidos existen dos métodos: análisis relativo y análisis absoluto.

Para el método de análisis relativo de los datos obtenidos, la fluorescencia que se ha detectado durante todo el proceso de amplificación para cada muestra es analizada mediante un programa informático que determina en qué ciclo, denominado Ct, (Ciclo crítico o Threshold cycle), el valor de la fluorescencia emitida cruza la línea arbitraria o "threshold", a partir de la cual se considera que la fluorescencia emitida es debida al producto de amplificación, y no a componentes de la reacción. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN que había en la muestra inicial. El número de copias iniciales de la muestra analizada se determina relativizándolo con el número de copias conocido en la muestra sana usando el método comparativo de Ct.

El método relativo deltadelta Ct (\Delta\DeltaCt) usa la fórmula:

\Delta\DeltaCt - (Ct_{gen \ diana} - Ct_{gen \ referencia})_{muestra} - (Ct_{gen \ diana} - Ct_{gen \ referencia})_{sano}

El número de copias relativo fue entonces determinado mediante la fórmula:

2^{-(\Delta \Delta Ct \ \pm \ SD)}

Donde la desviación estándar (SD) es calculada a partir de las tres réplicas existentes para cada dato creado. Según este cálculo, un valor de 2^{-(\Delta \Delta Ct \ \pm \ SD)} igual a 1 en la muestra sana indica una dotación normal para el locus analizado, sin alteraciones génicas, por lo tanto dos copias del gen estudiado.

Para el análisis absoluto se realizaron rectas patrón de todos los genes analizados clonados en un plásmido bacterian. Los datos de la Q-PCR fueron normalizados adaptando el método propuesto por Weksberg (2005), derivado de la fórmula:

KCti = (\DeltaCtR - CtRi/SR) * STi + Cti

Donde:

\circ

KCti es el Ct corregido del cebador del gen diana contra el cebador del de referencia;

\circ

\DeltaCtR es el valor de Ct medio del gen de referencia para todas las muestras (tumor y sano);

\circ

CtRi es el valor de Ct que toma el gen de referencia en cada placa de Q-PCR de cada gen analizado;

\circ

SR es el valor de la pendiente (en la recta patrón) del gen de referencia;

\circ

STi es el valor de la pendiente (en la recta patrón) del gen analizado en cada caso;

\circ

Cti es el valor de Ct que toma cada gen en cada muestra analizada.

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El valor final (\DeltakCt) se obtiene a partir de la resta entre el valor medio de Ct obtenido de la muestra sana control en todos los genes analizados y el valor de KCti en cada muestra tumoral. Todos los valores de \DeltakCt se analizaron a partir del valor relativo del KCt en el gen marcador y el KCt en el gen referencia en la muestra sana. Ese valor obtenido implica dos copias de gen en el ADN de la muestra tumoral, una unidad de \DeltakCt por encima implica una copia más y así sucesivamente. En el caso de la deleción una unidad menos del valor relativo implica la pérdida en heterocigosis del gen en la muestra analizada, y dos unidades menos, la pérdida de las dos copias del gen.

Tras varias rondas de cribado se seleccionaron 10 marcadores y tras el análisis estadístico se comprobó que los datos obtenidos no siguieron una distribución normal (p>0.05), por lo que el análisis estadístico se realizó de una forma no paramétrica atendiendo al valor de la mediana, y la comparación estadística se realizó mediante un análisis de comparación de medianas de muestras independientes U-Mann Whitney. Los loci seleccionados como putativos marcadores son MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), SMAD4 (18q21.1), DCC (18q21.3), TDP52L2 (20qtel), MYBL2 (20q13.1), CYP24A1 (20q13) y AURKA (20q13.2-13.3). En la Figura 3 se ilustra gráficamente en diagrama de cajas (boxplot) los valores de 2^{-\Delta \Delta Ct} obtenidos por estos loci en muestras de metástasis hepática de CCR.

En la tabla 2 se muestra un resumen de los datos obtenidos para los 10 loci analizados en 140 muestras de metástasis hepática de CCR. Se muestran los diferentes loci, así como el valor estadístico de p, y el resultado de diferencia significativa con respecto a la normalidad.

TABLA 2 Resultados de alteración obtenidos a partir del análisis de Q-PCR realizado sobre 140 muestras de metástasis hepática de CCR en 10 loci analizados. En la tabla se muestran los genes analizados con su localización cromosómica así como el tipo de alteración mostrada en cada caso. En la tercera columna se representa el porcentaje de alteración mostrado por los mismos tras el análisis. La cuarta y quinta columna muestran el valor de p obtenido mediante el estadístico U-Mann Whitney y la relación de igualdad/diferencia estadísticamente significativa con respecto a la normalidad respectivamente

2

Tras el análisis de Q-PCR en un total de 140 muestras de metástasis hepática de CCR se corroboraron los resultados obtenidos en un primer momento mediante la tecnología de CGHa. Los loci que destacaron en mayor medida mediante dicha tecnología volvieron a mostrarse como putativos marcadores de amplificación y deleción en las muestras de metástasis hepática de carcinoma colorrectal analizadas mediante Q-PCR. Los cromosomas 8, 13, 18, y 20 fueron los que portaron los loci seleccionados tras el análisis final en 140 casos (Q-PCR), mostrando una vez más su posible implicación en el establecimiento del carcinoma colorrectal en órganos a distancia, como en este caso, el hígado, como ya se intuyó en el análisis de CGHa realizado.

El análisis absoluto del número de copias para cada gen estudiado, en las muestras de ADN proveniente de las metástasis hepática, se llevó a cabo para los 10 últimos genes seleccionados como putativos marcadores de alteración génica en las 140 muestras de metástasis hepática de CCR analizadas anteriormente, y se realizó un estudio comparativo de ambas metodologías, tomando como valores de normalidad los que se encontraron dentro del rango (0,5-1,5), para el análisis relativo, y 2 copias en el caso del análisis absoluto.

Ambos análisis tuvieron altos porcentajes de coincidencia en los diez loci analizados, prediciendo alteración génica de una manera similar estadísticamente, sin mostrar diferencias significativas en su comparativa para ningún gen (p<0,001). La comparativa se realizó mediante un análisis de correlación de Pearson para aquellos loci que mostraron una distribución de los datos normal, y de Spearman para los que siguieron una distribución de datos no normal, resumiendo los resultados en la Tabla 3.

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TABLA 3 Análisis comparativo entre los métodos de análisis de datos de Q-PCR, método relativo vs absoluto

3

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FISH

El FISH ha revolucionado la biología molecular por ser una técnica citogenética de alta resolución para la mejor interpretación de los resultados en pacientes con anomalías cromosómicas, marcadores o con reordenamientos cromosómicos complejos (Kuznetzova T. 1995). Esta técnica permite confirmar una alteración detectada mediante una técnica convencional, y en otros casos, permite diagnosticar, gracias a su gran especificidad y sensibilidad, casos que hasta ahora no tenían diagnóstico, a pesar de tener un cariotipo "normal". Utilizando un sonda test marcada con un color, y otra sonda referencia, marcada en otro color, la tecnología FISH se puede aplicar para detectar en células interfásicas, deleciones y amplificaciones de secuencias específicas, así como aneuploidias, (Kallioniemi et al.,
1992).

Para obtener sondas FISH no comerciales ("home-made") es necesario conocer la secuencia específica a marcar. Cualquier secuencia se encuentra accesible hoy en día en las bases de datos públicas disponibles de una manera online (http://genome.ucsc.edu/). Para el diseño de la sonda se seleccionan varios clones a partir de, habitualmente, BACs (Bacterial Artificial Chromosome) que cubran la secuencia entera a marcar y que solapen entre sí en los extremos de manera que toda la totalidad de la secuencia quede cubierta con la sonda. Los BACs son la forma más adecuada para la creación de la sonda ya que pueden portar secuencias de ADN de 100-200 kpb, que resulta un tamaño ideal para el análisis de FISH interfásico. Los BACs deben tener polaridades opuestas para evitar en todo lo posible competencia inespecífica entre sí.

En la presente invención se crearon sondas FISH para cada gen de estudio a partir de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) procedentes de Escherichia coli, cepa DH10B, y vector pBACe3.6 o pTARBAC2.

El diseño se creó de forma que los clones solapantes tuvieran polaridad inversa para que la hibridación sobre el ADN diana se diera de forma completa y específica sobre las diferentes hebras del mismo, y no hubiera competencia entre los BACs.

La purificación de cromosomas artificiales bacterianos se realizó a partir de clones seleccionados en cultivo sólido en placas petri con Lysogeny broth (LB), agar y cloranfenicol como antibiótico, la masa celular se obtuvo a partir de un 11 de cultivo líquido y el ADN se extrajo siguiendo las instrucciones del kit comercial "Plasmid Maxi Kit" de "Qiagen".

Una vez purificados los clones, se procedió al mareaje del ADN de los BACs, para ello, se utilizó el kit de mareaje ARES de "Invitrogen" ("ARES Kit Alexa Fluor 488 labelling"), mediante una reacción de "Nick Translation". El ADN de cada BAC fue marcado en dos pasos de mareaje, primero, se incorporó la molécula aminoallyl-dUTP (5-[3-aminoallyl]-2'-deoxyuridine-5'-tri-phosphate) al ADN por la síntesis de la ADN polimerasa I a la vez que esté fue digerido por acción de la "DNasal" mediante la reacción de "Nick Translation". En un segundo paso del mareaje, la molécula aminoallyl-dUTP incorporada se unió al dye Alexa Fluor 488 covalentemente.

Para la realización del cálculo de ratio fluorocromo:ácido nucleico, se utilizó la siguiente fórmula:

dye:base = 100 / ((Abase x \varepsilonfluorocromo) / (Afluorocromo x \varepsilonbase))

Donde:

\bullet

\varepsilonfluorocromo es el coeficiente de extinción del fluorocromo utilizado (62, 000 cm^{-1}M^{-1}).

\bullet

\varepsilonbase es el coeficiente de extinción medio para una base nucleotídica en una cadena doble de ADN (6600 cm^{-1}M^{-1}).

\bullet

Afluorocromo es la absorbancia del fluorocromo a su longitud de onda máxima de absorción (492 nm).

\bullet

Abase es la absorbancia de las bases nucleotídicas según la fórmula:

Abase = A260 - (Afluorocromo x CF260)

Donde:

\bullet

A260 es la absorbancia de la muestra a 260 nm.

\bullet

Afluorocromo es la absorbancia del fluorocromo a su longitud de onda máxima de absorción (492 nm).

\bullet

CF260 es el factor de corrección para el fluorocromo en cuestión (CF260 de Alexa Fluor 488 es 0.30).

\newpage

Una vez se tuvieron las sondas FISH marcadas se comprobó su especificidad hibridándolas sobre metafases de células sanas y una vez comprobado que cada sonda diseñada hibridaba con la región cromosómica que le correspondía se llevó a cabo el FISH sobre cortes de 4 \mum de grosos de micromatrices de tejido tumoral. Cada corte de tejido sobre un portaobjetos se desparafinó mediante calor y tratamiento con sustitutivo de Xileno y alcohol. Posteriormente se lleva a cabo desenmascaramiento de las proteínas en tampón citrato pH 6 y se calentó en el microondas a 600W durante 20 minutos, este paso es crucial ya que es necesario eliminar los enlaces entre las proteínas del tejido y los grupos aldehído que se crean tras una fijación de la muestra en formol, sin este paso de desenmascaramiento la enzima Proteinasa K no podría acceder a las proteínas y realizar la digestión de las mismas. Se deja enfriar la solución con el portaobjetos durante al menos media hora. Una vez frío, se lavan los portaobjetos con las muestras en agua ultra pura Milli-Q, se secan y una vez secas las muestras, estás se digieren con Proteinasa K a una concentración de 60 \mug/ml a 37ºC para luego lavarlos en SSC2X durante 5 minutos. Después, la muestra se fija en formol tamponado al 10% durante 5 minutos. Se vuelve a realizar un lavado en SSC2X y se deja secar completamente.

Para la hibridación de la sonda sobre la muestra se realiza una co-desnaturalización de muestra y sonda simultáneamente. Para esto se colocan 10 \mul de la solución de hibridación (con la sonda y el tampón de hibridación) en el portaobjetos sobre el área del tejido, se dispone encima el cubreobjetos con cuidado de que no se formen burbujas y se sella con solución selladora DPX. Se coloca el portaobjetos sobre la placa calefactora a 90ºC y el ADN de la muestra a hibridar, así como el correspondiente a la sonda se co-desnaturalizó durante siete minutos. Pasados los 7 minutos se pasa rápidamente a hibridar en una cámara húmeda a 37ºC durante 20-24 horas. Después del tiempo de hibridación, se realizan los lavados post-hibridación con el fin de eliminar el exceso de sonda que pudiera producir ruido de fondo. Para que el tejido se hiciera visible al microscopio se contratiñó con solución DAPI. Los resultados se analizaron bajo el microscopio de epifluorescencia "Olympus BX61".

Para la evaluación de los resultados obtenidos se analizó el número de marcas fluorescentes encontradas en los núcleos de al menos 100 células repartidas en varios campos de visión, elegidos al azar, dentro del tejido seleccionado. Cuando el análisis incluyó una sonda centromérica como control, se contó el número de marcas encontradas para ambas sondas (problema y control) y se realizó el ratio entre las mismas.

Se consideró amplificación génica cuando por lo menos el 60% de las células de los campos analizados presentaban un ratio de marcas del gen problema/marcas del centrómero control superior a 1,5. El baremo fue similar en el caso de deleción génica, pero el valor umbral fue de 0,5.

Se diseñaron y fabricaron sondas FISH para los 10 loci seleccionado tras el análisis de Q-PCR y se comprobó la especificidad de cada una en metafases de células sanas, de esta manera descartamos el análisis mediante FISH del locus MSR1, debido a su inespecificidad de secuencia. También se comprobó el grado de alteración de dichos loci en la línea celular continua de carcinoma de colon HT29 y en tejido tumoral de cáncer de mama embebido en parafina. Además de comprobar en porcentaje de alteración de los loci, también se realizaron hibridaciones con sondas específicas comerciales FISH para los centrómeros (CEP, Abbott Molecular) de los cromosomas que contienen a los loci estudiados. Todas las hibridaciones se hicieron en compañía de una sonda control para el centrómero del cromosoma 9, el cual comprobamos no estaba alterado en ninguna de las muestras analizadas, dicha sonda era comercial (Abbott Molecular).

Tras estos análisis descubrimos que en algunos casos no solamente se encontraba alterado el loci analizado, sino que se trataba de una aneuploidia, viéndose afectado todo el cromosoma.

Un ejemplo de una amplificación de un gen se ilustra en la Figura 4, donde se muestra una mayor cantidad de muestras del gen ASAP1 (4.1) comparado con el control (4.2).

Un ejemplo de deleción se ilustra en la Figura 5, donde se muestra un resultado de un FISH para el gen TNKS sobre tejido tumoral de metástasis hepática de carcinoma colorrectal. Se observa que en comparación hay menos marcas de fluorescencia para el gen TNKS (5.1) que para el control (5.2).

Un ejemplo de anapleudismo se ilustra en la Figura 6A y 6B, donde se muestran los resultados de una FISH con sondas centroméricas para los cromosomas teloméricas del cromosoma 13 sobre tejido tumoral de metástasis hepática de carcinoma colorrectal en el cromosoma 13 y 20, respectivamente, tomando el centrómero del cromosoma 9 como control.

Se encontraron las frecuencias de alteración más altas en los genes SMAD4 y DCC, ambos en el cromosoma 18, que se mostraron delecionados en el 67% y 60% de las muestras analizadas, respectivamente. El locus TNKS -también marcador de pérdida génica- se mostró alterado en el 38% de las muestras analizadas. En cuanto a los genes marcadores de ganancia génica, destacó el locus ZMYM2 con el mayor porcentaje de amplificación (40%), seguido de ASAP1, con el 37% de las muestras alteradas. Los loci localizados en el cromosoma 20 (MYBL2, CYP24A1, AURKA y TPD52L2) se encontraron alterados en porcentajes muy similares rondando el 30% de las muestras presentando ganancia génica.

\newpage

Análisis estadístico de correlación intra-cromosómica e inter-cromosómica

La deleción del gen TNKS (8p23.1) encontrada en las 100 muestras metastáticas analizadas no se relaciona de una manera significativa (p>0,05) con el patrón de alteración encontrado para el centrómero del cromosoma 8, ni con la amplificación del gen ASAP1 (8q24.1-q24.2) para las mismas muestras analizadas.

En cambio, si se encontró una correlación fuerte (coeficiente de Spearman >0,7) y altamente significativa (p<0,001) entre el centrómero del cromosoma 8 y el gen ASAP1. Un análisis detallado de los resultados nos desvela que casi la totalidad de las muestras que presentaron amplificación del centrómero del cromosoma 8, mostraron a su vez amplificación del locus ASAP1, aunque hubo cerca de un 24% de muestras con una ganancia génica en ASAP1 independiente del centrómero. La deleción del brazo corto del cromosoma, en cambio, apareció como un evento independiente a la amplificación del brazo largo cromosómico analizados por los marcadores TNKS y ASAP1 respectivamente.

La amplificación encontrada para el gen ZMYM2 (13q11-q12) se correlacionó de una manera moderada (coeficiente de Spearman igual a 0,66) y altamente significativa (p<0,001) con respecto a la encontrada para la región telomérica del cromosoma 13. Ambas regiones aparecieron alteradas sin diferencias significativas.

Los genes SMAD4 (18q21.1) y DCC (18q21.3) aparecieron delecionados siguiendo un patrón estadísticamente similar de forma moderada (coeficiente de Spearman igual a 0,389) y muy significativa (p<0,01), por lo que las muestras que presentaron deleción génica para el locus SMAD4, presentaron también pérdida para DCC y viceversa.

En relación al centrómero cromosómico, mientras que DCC si se encontró delecionado sin diferencias significativas con la región centromérica (p<0,001), SMAD4 se mostró alterado de una forma independiente con respecto al centrómero 18 (p>0,05), apareciendo delecionado en un porcentaje de muestras significativamente mayor que el centrómero cromosómico. Estos resultados indican que la pérdida de DCC podría venir dada por una pérdida total del cromosoma mientras que SMAD4 lo haría además de una manera independiente, mostrando deleción génica en muestras cuyo cromosoma 18 se encuentre aún inalterado.

Los cuatro loci que se encuentran en el brazo largo del cromosoma 20, MYBL2 (20q13.1), CYP24A1 (20q13), AURKA (20q13.2-13.3) y TPD52L2 (20q13.2-q13.3) siguieron un patrón de alteración igual de una manera altamente significativa (p<0,001). La correlación más fuerte encontrada se dio entre AURKA y TPD52L2 con un coeficiente de correlación de Spearman de 0,766, ambos localizados en la misma citobanda (20q13.2-q13.3).

El centrómero 20 apareció alterado de igual manera que los genes CYP24A1, AURKA y TPD52L2, (p<0,05), pero no para el caso del gen MYBL2 que apareció alterado significativamente en un mayor número de muestras que la región centromérica (p>0,05).

Para conocer si existe alguna relación en el patrón de alteración entre genes localizados en diferentes cromosomas, se realizó un estudio de correlación entre todos los genes analizados.

La relación más fuerte significativa, aunque moderada (Coeficiencia Spearman 0,3-0,7) fue la encontrada entre el gen ASAP1 (8q24.1-q24.2) y los genes localizados en el cromosoma 20. Se muestran a continuación en la Tabla 4 el coeficiente del estadístico Spearman, así como el valor de significación entre dichas relaciones:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 La relaciones entre el gen ASAP1 y cuatro genes diferentes, el coeficiente del estadístico Spearman y el valor de significación entre dichas relaciones

4

La relación más fuerte fue la establecida entre el locus ASAP1 y MYBL2. Ambos siguen un patrón de alteración similar en las 100 muestras metastáticas analizadas de una forma moderada y altamente significativa.

El locus ZMYM2 también apareció relacionado de una forma moderada (Coef.Spearman 0,3-0,7) con los siguientes loci, resumido en la Tabla 5:

TABLA 5 La relaciones entre el gen ZMYM2 y cuatro genes diferentes, el coeficiente del estadístico Spearman y el valor de significación entre dichas relaciones

5

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En el caso de los marcadores de deleción, se encontró una asociación positiva entre los locus DCC y TNKS, aunque fue una relación débil (Coef.Spearman de 0,250) pero significativa (p<0,05).

Indicando en conjunto que las ganancias en los cromosomas 8q, 20q, y 13q se suceden de una manera simultánea desde un punto de vista estadístico, y que son independientes de las pérdidas analizadas para los cromosomas 8p y 18q que a su vez se relacionan entre sí aunque de una manera débil pero significativa.

De la misma manera que con los genes analizados, se llevó a cabo un estudio de correlación estadística entre los patrones de alteración encontrados en los centrómeros de los cromosomas 8, 18 y 20, y del telómero del cromosoma 13.

No se encontró ninguna correlación fuerte. La más alta y significativa (p<0,001), fue la entablada entre el centrómero del cromosoma 8 y la región telomérica del cromosoma 13, con un coeficiente de correlación moderado de 0,419. Estudiando los loci localizados en ambos cromosomas, se encuentra de la misma manera una correlación moderada (Coef.Spearman 0,308) muy significativa (p<0,01), entre los genes ASAP1 y ZMYM2.

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Análisis de los marcadores seleccionados en los tumores primarios de cáncer de colon metastáticos y no metastáticos

Las muestras de cáncer de colon primario analizadas en este estudio, se obtuvieron a partir de biopsias fijadas e incluidas en parafina. Dichas muestras procedieron de dos fuentes diferentes:

\bullet

Tumores primarios sin metástasis desarrolladas:

\circ

"Tissue array CO802" ("Biomax") de carcinoma de colon, con 78 casos/78 spots, y dos casos de tejido colónico normal incluidos, y con los siguientes datos clínicos asociados:

\circ

Código, edad y sexo del paciente;

\circ

Diagnóstico patológico;

\circ

Grado de diferenciación.

\bullet

Tumores primarios con metástasis desarrolladas:

\circ

"Tissue array A203 (IV)" ("AccuMax Array") de tejido de tumor primario de colon con sus correspondientes metástasis en hígado, y tejido colónico normal (14 casos/70 spots).

Con los siguientes datos clínicos asociados:

\circ

Código, edad y sexo del paciente;

\circ

Grado de diferenciación y clasificación de Duke's del tumor colorrectal;

\circ

Tamaño (cm) de las metástasis hepática;

\circ

Número de nódulos linfáticos afectados.

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Mediante la técnica FISH se analizó el grado de alteración de los marcadores ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), SMAD4 (18q21.1) y TPD52L2 (20q13.2-q13.3), en los tumores primarios sin metástasis, por ser los marcadores con mayor porcentaje de alteración en las metástasis hepática y además de esta manera quedan analizados todos los cromosomas estudiados en las metástasis. Y en los tumores primarios con metástasis, aparte de los marcadores anteriores también se analizó MYBL2 (20q13.1), en los tumores primarios con metástasis también se analizaron sus metástasis y tejido sano adyacente.

El estudio mediante FISH se llevó a cabo de la misma manera que para el tejido metastático analizando por lo menos 100 núcleos tumorales repartidos en dos o más campos de visión y realizando el ratio con respecto a la sonda control del centrómero del cromosoma 9. Igualmente que para el caso de las metástasis hepática, se clasificaron como muestras alteradas aquéllas que presentaron al menos el 60% de las células en cada campo analizado alteradas, en por lo menos el 60% de las células totales analizadas.

En el caso de los tumores primarios sin metástasis desarrolladas, el loci que apareció más frecuentemente alterado fue SMAD4, con el 39,62% de los casos estudiados delecionados (1,7 veces más baja que en las metástasis hepática). Los genes marcadores de ganancia génica presentaron valores más bajos, siendo el más frecuentemente alterado TPD52L2, amplificado en el 15,12% de los tumores primarios no metastáticos (2,25 veces más baja que en las metástasis hepática). Con porcentajes de alteración notablemente más bajos se encuentran el locus ZMYM2 y ASAP1, con el 7,1% y 6,6% de las muestras alteradas respectivamente (5,6 veces más baja que en las metástasis hepática).

Tras un análisis de correlación se concluyó que las muestras con el gen ASAP1 alterado se correlacionaban de una forma muy significativa (p<0,01) y moderada (Coef.Spearman 0,396), con las que mostraban alteración en el gen TPD52L2, al igual que lo hicieron en el análisis del tejido metastático explicado en el apartado anterior.

Atendiendo a la clasificación según la patología diagnosticada se llevó a cabo un análisis comparativo de medianas para muestras sin una distribución normal (Kruskal-Wallis), en el que se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre el tipo adenocarcinoma mucinoso, y el adenocarcinoma papilar para el locus ASAP1. El adenocarcinoma papilar está caracterizado por una localización tumoral proximal, así como frecuente metástasis hepática. Dicho gen, ASAP1, apareció amplificado de una manera mayor significativamente en el tipo tumoral adenocarcinoma papilar que en el tipo adenocarcinoma mucinoso.

El locus TPD52L2 no presentó diferencias significativas entre el tipo de patología diagnosticada, pero se recomendó aumentar el tamaño muestral de los tipos adenocarcinoma mucinoso y tubular debido a que un mayor número de muestras analizadas podrían esclarecer diferencias en la alteración de dicho locus en ambos tipos tumorales (0,05<p<0,15), aclarando la tendencia a la amplificación génica en un mayor número de muestras en el adenocarcinoma tubular que en el tipo mucinoso.

Para los tumores primarios con metástasis hepática desarrolladas, a demás de los 4 loci analizados en los tumores primarios sin metástasis se añadió MYBL2. Los resultados obtenidos indican que los porcentajes de alteración en estos tumores para cada marcador son similares a los valores obtenidos en el análisis de las de las metástasis hepática analizadas anteriormente, excepto para el marcador SMAD4 y estadísticamente iguales a los porcentajes obtenidos en las metástasis hepática de los propios tumores primarios. Los porcentajes de alteración encontrados en los tumores primarios son: ASAP1 (8q24.1-q24.2) del 57% en el tumor primario y del 50% en su metástasis, ZMYM2 (13q11-q12) del 42% en el tumor primario y del 54% en su metástasis, SMAD4 (18q21.1) del 8.3% en el tumor primario y del 16% en su metástasis, TPD52L2 (20q13.2-q13.3) del 64%. en el tumor primario y. del 64%. en su metástasis y MYBL1 (20q13.2) del 57% en el tumor primario y del 54% en su metástasis. Tras un análisis comparativo para muestras pareadas con el estadístico "t", se encontraron que los cinco loci analizados siguieron un patrón de alteración en los dos tipos tumorales (primario vs metastático) estadísticamente similar (p>0,05). Ambos tejidos tumorales fueron significativamente diferentes del tejido normal analizado en cada caso (p<0,05), excepto para el caso del locus SMAD4, que no se pudo analizar por no tener suficientes muestras de tejido sano normal. Estos resultados han sido resumidos en la Figura 8.

Se concluye, por tanto, que los cinco genes analizados siguieron un patrón de alteración sin diferencias significativas entre el tejido tumoral primario y la metástasis hepática derivada del mismo, encontrándose alterados en ambos tipos tumorales pudiendo determinar por tanto el proceso metastático desde los estadios tumorales primarios en el colon.

En esta invención se ha comprobado que hemos encontrado marcadores citogenéticos que caracterizan a los tumores primarios de cáncer de colon con capacidad metastática ya que estos se encuentran alterados con mayor frecuencia y estadísticamente iguales que las frecuencias encontradas en las metástasis, sin embargo estas frecuencias presentan diferencias estadísticamente diferentes con los porcentajes de alteración en los tumores primarios no metastáticos. Los resultados son resumidos en la Tabla 6.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Resumen de los porcentajes de alteración encontrados para los diferentes tipos de muestras analizados mediante las diferentes metodologías utilizadas

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El alto porcentaje de aneuploidia descrito en este trabajo para los cromosomas 8, 13, 18, y 20 se relaciona directamente con el 77% de las aberraciones genéticas estudiadas para los loci concretos, por lo que, parece que la alteración en el número de copias cromosómicas presente en las metástasis podría estar funcionando como fuente de muchas de las alteraciones genéticas encargadas de conferir al tumor su malignidad e invasividad necesaria para establecerse en órganos distantes como el hígado donde las células cancerosas mantienen dicha inestabilidad cromosómica.

Por lo tanto, el conjunto de marcadores que comprende ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1), junto con el marcador DCC (18q21.3) ya conocido en la literatura, es un conjunto óptimo para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal. Opcionalmente se pueden incluir los marcadores MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), CYP24A1 (20q13) y/o AURKA (20q13.2-13.3), aumentando la especificidad de los resultados obtenidos mediante varias técnicas biotecnológicas con estos marcadores para detectar la metástasis indicada. Dentro de este conjunto existen varias relaciones estadísticamente significativas, indicando una relación entre la alteración de estos genes y la presencia de una metástasis hepática de un tumor colorrectal, tal y como se ha presentado en las tablas 4 y 5 de esta memoria.

Para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal se presenta un kit que se puede emplear en varias técnicas biotecnológicas y que comprende los marcadores ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), DCC (18q21.3), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1), con opcionalmente también los marcadores. Opcionalmente se pueden incluir los marcadores MSR1 (8p22), TNKS (8p23.1), CYP24A1 (20q13) y/o AURKA (20q13.2-13.3).

Claims (2)

1. Método in vitro detectar metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal que comprende:

a) recoger una muestra de tejido colorectal del sujeto

b) detectar y cuantificar en esa muestra de tejido el patrón de expresión de la combinación de marcadores DCC (18q21.3), ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), MYBL2 (2 0q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1)

c) comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en dichos tejidos sin capacidad de metástasis hepática.

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2. Kit para la detección de metástasis hepática en pacientes con cáncer colorrectal para llevar a cabo él método de la reivindicación 1 que comprende un set de sondas adecuado para la detección del patrón de expresión de la combinación de los marcadores DCC (18q21.3), ASAP1 (8q24.1-q24.2), ZMYM2 (13q11-q12), MYBL2 (20q13.1), TDP52L2 (20qtel) y SMAD4 (18q21.1).