ES2361317T3 - Polímeros activos sobre membranas. - Google Patents
Polímeros activos sobre membranas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2361317T3 ES2361317T3 ES04707130T ES04707130T ES2361317T3 ES 2361317 T3 ES2361317 T3 ES 2361317T3 ES 04707130 T ES04707130 T ES 04707130T ES 04707130 T ES04707130 T ES 04707130T ES 2361317 T3 ES2361317 T3 ES 2361317T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polyanion
- biologically active
- active compound
- membrane
- vinyl ether
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 53
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims abstract description 12
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- DQJJMWZRDSGUJP-UHFFFAOYSA-N ethenoxyethene;furan-2,5-dione Chemical compound C=COC=C.O=C1OC(=O)C=C1 DQJJMWZRDSGUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims description 29
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 23
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 13
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical compound C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- -1 alkyl vinyl ether Chemical compound 0.000 claims description 11
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 1-ethenoxybutane Chemical compound CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- 125000003609 aryl vinyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- OVGRCEFMXPHEBL-UHFFFAOYSA-N 1-ethenoxypropane Chemical compound CCCOC=C OVGRCEFMXPHEBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 11
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 5
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical class CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 4
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEBDGRTWECSNNT-UHFFFAOYSA-N 2-methylidenepentanoic acid Chemical compound CCCC(=C)C(O)=O HEBDGRTWECSNNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 229920000147 Styrene maleic anhydride Polymers 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- WPDVGPMOHJJJLO-UHFFFAOYSA-N 1-ethenoxybutane;furan-2,5-dione Chemical compound CCCCOC=C.O=C1OC(=O)C=C1 WPDVGPMOHJJJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYSRRFNXTXNWCD-UHFFFAOYSA-N 3-(2-phenylethenyl)furan-2,5-dione Chemical compound O=C1OC(=O)C(C=CC=2C=CC=CC=2)=C1 PYSRRFNXTXNWCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000718430 Comocladia glabra Species 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical group OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- WROTXLSEMHAZEA-UHFFFAOYSA-N 4-diaminophosphoryloxymorpholine Chemical compound NP(N)(=O)ON1CCOCC1 WROTXLSEMHAZEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108700034637 EC 3.2.-.- Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical class O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003940 butylamines Chemical class 0.000 description 1
- MSZJEPVVQWJCIF-UHFFFAOYSA-N butylazanide Chemical compound CCCC[NH-] MSZJEPVVQWJCIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000005670 ethenylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008299 phosphorodiamidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005575 poly(amic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000003440 styrenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Un procedimiento in vitro para transportar un compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con dicho compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico - anhidrido maleico, dicho polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, tal que el polianión con actividad sobre la membrana y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula.
Description
REFERENCIA CRUZADA PARA SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud está relacionada con la solicitud anterior provisional de documento de patente de Estados Unidos Nº de serie 60-443906 presentada el 31 de enero de 2003.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La vía de penetración celular para la mayor parte de los fármacos convencionales es la difusión a través de las membranas biológicas. Por esta razón, los fármacos tienden a ser moléculas pequeñas (Pm < 500) y anfipáticas, que contienen tanto funcionalidades hidrófobas como hidrófilas. Estas características engendran moléculas con solubilidad acuosa, al tiempo que les permiten cruzar la bicapa lipídica no polar de la membrana celular. Por el contrario, los fármacos utilizados en las terapias antisentido y génicas son polímeros hidrófilos relativamente grandes y con frecuencia también ácidos nucleicos cargados muy negativamente. Ambas de estas características físicas obstaculizan su difusión directa a través de la membrana celular. Por esta razón, la principal barrera para la terapia génica y terapia antisentido es el transporte del fármaco al interior celular. Esta situación contrasta con el desarrollo de medicamentos estándar en el que la identificación del fármaco es la principal barrera en el desarrollo.
La ruta de entrada para la mayoría de las macromoléculas como el ADN y oligonucleótidos en células es la endocitosis. Una vez absorbidas por la célula, el endosoma es o bien reciclado de vuelta a la superficie celular, o madura a un endosoma final y finalmente a un lisosoma. En este proceso, el pH gradualmente disminuye de 7 a 6 a medida que el endosoma inicial se convierte en endosoma final. En el endosoma final, el pH disminuye de 6 a menos de 5 a medida que madura en un lisosoma. En el endosoma final y lisosoma, enzimas tales como proteasas, nucleasas y glicosilasas digieren los componentes hidrolizables en el compartimento. Para evitar la degradación de los ácidos nucleicos y otros fármacos potenciales en el lisosoma, debe romperse el endosoma, y su contenido liberado, antes de su evolución a un lisosoma. Una vez que se produce la endocitosis, el endosoma se convierte en un endosoma final en el curso de unos 10 minutos [Mukherjee et al. 1997]. El endosoma final contiene enzimas hidrolíticas tales como proteasas [Berg et al. 1995] y otras enzimas hidrolíticas. Enzimas digestivas adicionales aparecen a medida que el endosoma se transforma en un lisosoma.
Para que los materiales escapen de los endosomas al citoplasma, la membrana del endosoma debe romperse. La ruptura del endosoma puede ocurrir por presión osmótica que causa que la membrana se hinche y explote [Zuber et al. 2001], por agentes perturbadores de la membrana que desnaturalizan la estructura de dos capas de la membrana, o una combinación de estas fuerzas. Métodos para lograr la liberación del endosoma a menudo se basan en el entorno del lisosoma y/o endosoma para desencadenar la ruptura de la membrana y liberar su contenido. Por ejemplo, los vectores pueden ser sustratos de enzimas lisosomales tales como las proteasas. La proteolisis puede dar como resultado una activación de un compuesto activo sobre la membrana que a continuación desestabiliza las dos capas. Un ejemplo de rotura de membrana desencadenada por enzimas son las proteínas de la cubierta de los adenovirus que modifican su estructura y su capacidad disruptiva de la membrana con la ruptura proteolítica [Skehel et al. 2000].
La disminución en el pH a medida que un endosoma madura a un lisosoma puede también utilizarse para desencadenar la disrupción de la membrana y la liberación de su contenido. Las infecciones virales a menudo requieren la acidificación del compartimento endosomal [Carrasco 1994]. Para imitar esta actividad viral sintéticamente, se han diseñado muchos agentes de transfección no víricos con componentes dependientes de pH. Agentes que son débilmente básicos, pKa 5-7, pueden ser protonados de forma reversible en el entorno ácido del endosoma. Algunos ejemplos son la cloroquina, polietilenimina y poli-L-lisina histidilada. El efecto de estos compuestos tampón es aumentar el número de protones necesarios para una disminución en el pH. Se postula que el aumento del número de protones, y como consecuencia sus contraiones, produce un aumento en la presión osmótica del endosoma, que lleva a la ruptura de la membrana, el efecto de esponja de protones [Zuber et al. 2001].
Otro mecanismo para la disrupción de la membrana dependiente del pH es el uso de agentes cuya interacción con una membrana depende de su protonación, por ejemplo, el hemisuccinato de colesterol [Lai et al. 1985], péptidos de la cubierta vírica y sus derivados [Plank et al. 1998] y ácido polipropilacrílico (PPA) [Cheung et al. 2001]. Una característica común de estos agentes es que son moléculas que contienen ácidos carboxílicos y grupos hidrófobos que están menos cargados a medida que baja el pH. La disminución en la carga hace que las moléculas sean más hidrófobas, y por lo tanto más disruptivas de las membranas.
El polímero sintético más estudiado que contiene carboxilatos para la disrupción del endosoma es el PPA [Lackey et al. 2002]. El grupo de propilo en cada monómero de grupos de PPA constituyen los grupos hidrófobos del polímero. Otro polímero sintético que contiene carboxilatos es el ácido polietilacrílico (PEA). PEA también es activo en la membrana de manera dependiente del pH. Sin embargo, dependiendo del peso molecular del polímero, se produce el inicio de la actividad de membrana para PEA muy por debajo del pH de 6. Mediante el aumento de la longitud del grupo hidrófobo de PEA por un carbono, para producir PPA, la dependencia del pH del polímero cambia a condiciones menos ácidas tal que la iniciación de la actividad de la membrana se produce al pH fisiológicamente más pertinente de 6,5. Además de los ácidos poliacrílicos, polímeros de ácidos poliaminos que contengan residuos de aspartato o glutamato también exhiben carga negativa sensible al pH. Muchos polímeros naturales sensibles al pH dependen de estos residuos aniónicos para su dependencia del pH
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En una realización preferida, describimos una clase de polímeros aniónicos basados en el anhidrido maleico capaces de romper las membranas celulares. Los polímeros pueden ser homopolímeros, copolímeros aleatorios o copolímeros alternos. Se incorporan grupos hidrófóbos en los polímeros por medio de la copolimerización con monómeros hidrófobos o haciendo reaccionar grupos hidrófobos con anhidridos en el polímero.
En una realización preferida los polímeros descritos pueden utilizarse para transportar compuestos biológicamente activos a las células in vivo o in vitro. Los polímeros facilitan la liberación de compuestos biológicamente activos desde vesículas en el citoplasma después de la coendocitosis del polímero y el compuesto. En una realización, el compuesto biológicamente activo y el polímero se asocian con la célula de manera que en ambas moléculas se produce endocitosis por la célula. En otra realización el compuesto biológicamente activo y el polímero se asocian entre sí a través de una interacción no covalente para formar un complejo. El complejo es, a continuación, asociado a la célula. En otra realización, el compuesto biológicamente activo se une de forma covalente al polímero. La molécula de polímero-compuesto es, a continuación, asociada a la célula.
En una realización preferida, la funcionalidad del polímero puede ser modificada o mejorada por la unión covalente de grupos funcionales. Pueden agregarse grupos funcionales al polímero por medio de la copolimerización o por medio de la reacción con un anhidrido en el polímero.
Más objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada cuando se tome junto con los dibujos que la acompañan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 Ilustración de la formación de polianiones basada en la polimerización de anhidrido maleico: homopolímeros, copolímeros aleatorios, y copolímeros alternos. Los grupos carboxilo se muestran en forma protonada.
FIG. 2 Ilustración de polímeros sintetizados por polimerización del polímero de butil vinil éter -anhidrido maleico (BVEMA) con alcoholes y aminas para formar ésteres y amidas. Los grupos carboxilo se muestran en forma protonada.
FIG. 3. Ilustración gráfica del potencial hemolítico de los polímeros BVEMA, M-BVEMA y P-BVEMA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describe una nueva clase de polímeros aniónicos que se pueden utilizar para transportar compuestos biológicamente activos a las células. Estos polímeros contienen monómeros de anhidrido maleico y facilitan la liberación de compuestos biológicamente activos desde las vesículas después de la endocitosis. En la FIG 1 se muestran polianiones sintéticos basados en la polimerización del anhidrido maleico. El anhidrido maleico polimerizado por iniciación por radicales puede polimerizarse consigo mismo para formar un homopolímero, para formar homopolímeros de anhidrido maleico, o puede polimerizarse con comonómeros tales como el estireno o los éteres de vinilo para formar los copolímeros de anhidrido maleico. El estireno mismo se polimeriza por un mecanismo basado en radicales; por lo tanto, los copolímeros de estireno y anhidrido maleico (copolímeros basados en estireno -anhidrido maleico) son aleatorios, es decir, la composición total del polímero depende de la proporción de los monómeros, pero el orden de los monómeros es aleatorio. Por el contrario, los monómeros de éter de vinilo no se polimerizan por polimerización de radicales a menos que reaccionen con anhidrido maleico; por lo tanto, los polímeros compuestos de anhidrido maleico y éteres de vinilo (copolímeros basados en éter de vinilo -anhidrido maleico), son alternantes, es decir, el monómero de éter de vinilo va seguido del monómero de anhidrido maleico seguido del éter de vinilo y así sucesivamente. Los polímeros resultantes contienen grupos anhidrido. Estos grupos anhidrido, a continuación, pueden ser hidrolizados para formar grupos diácido. Alternativamente, puede hacerse reaccionar los polímeros con alcoholes y/o aminas para formar ácidos y ésteres y/o amidas. Los polímeros resultantes contienen de 1-2 grupos carboxilato por cada anhidrido maleico. Los polímeros son por lo tanto, polianiones.
Pueden incorporarse grupos hidrófobos en polianiones derivados del anhidrido maleico por copolimerización con estireno o éter de vinilo (FIG. I y 2), y/o haciendo reaccionar el polianhidrido con cualquier molécula (incluyendo, pero sin limitarse a, alcoholes y aminas) capaz de reaccionar con un anhidrido para formar un enlace covalente de manera que al menos permanezca un carboxilo en el monómero de anhidrido. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que la molécula puede formar un enlace covalente con cualquier carbonilo del anhidrido (FIG. 2). La reacción de alcoholes hidrófobos y/o aminas hidrófobas con grupos de anhidrido en el polianhidrido ocasiona la formación de ésteres hidrófobos y/o amidas hidrófobas de ácido polimaleico. Los polianiones resultantes puede adquirir hidrofobicidad por los grupos alquilo en el éter de vinilo, el grupo fenilo del estireno o por moléculas que se han hecho reaccionar con el anhidrido. Los éteres de vinilo pueden seleccionarse del grupo integrado por: alquil vinil éter, éteres de arilo vinilo y similares.
Otras moléculas capaces de reaccionar con un anhidrido también pueden ser vinculadas covalentemente al polímero. Moléculas que pueden asociarse al polímero pueden seleccionarse de la lista que comprende: compuestos biológicamente activos, grupos de señal con las células como dianas, modificadores de interacción, estabilizadores estéricos, moléculas reportero y otros grupos diseñados para agregar funciones al polímero o aumentar la utilidad del polímero.
Se ha estudiado el copolímero de estireno y anhidrido maleico (SMA) como un agente de transporte de fármacos [Maeda et al. 2001]. Diversos derivados de SMA han sido sintetizados en los que diversos grupos alquilo se han incorporado al polímero por reacción con el anhidrido. En concreto, se ha sintetizado un polímero de transporte de fármacos por medio de la reacción de los anhidridos de SMA con alcohol butílico a fin de producir un polímero que contiene tanto grupos butilo como fenilo seguido de la conjugación al fármaco anticancerígeno neocarzinostatina (NC). El polímero-fármaco conjugado resultante, SMANC, ha sido aprobado para los tratamientos de cáncer en Japón. SMANC y otros polianiones macromoleculares conjugados a fármacos se han utilizado para dirigir fármacos a los tumores por medio de un fenómeno de los tumores sólidos denominado permeabilidad y retención mejoradas (EPR). El efecto EPR es una función de la hipervascularización y la arquitectura vascular defectuosa asociados con los tumores sólidos. Esta vasculatura inusual da como resultado mayor permeabilidad de los vasos del tumor y mayor retención de las moléculas grandes. El efecto EPR facilita la extravasación de fármacos poliméricos más selectivamente a los tejidos del tumor y es un mecanismo ampliamente invocado para la selección de una variedad de polímeros a los tumores.
Se describen polímeros que contienen anhidrido maleico para transportar compuestos biológicamente activos al citoplasma de las células por medio de la endocitosis, no sólo como vehículos para el transporte basado en EPR de fármacos a la superficie de la célula. Estos polímeros son capaces de romper las membranas intracelulares después de la endocitosis. Nosotros hemos investigado copolímeros alternos de diversos vinil alquil éteres y anhidrido maleico. Los grupos de anhidrido de estos polímeros pueden ser hidrolizados para forma diácidos o pueden hacerse reaccionar con otras moléculas, tales como alcoholes y/o aminas para producir ésteres y/o amidas. Estos polímeros son sintetizados fácilmente a partir de los monómeros comercializados: alquil vinil éteres y anhidrido maleico. Por el contrario el polímero PPA se sintetiza a partir de un monómero que es el producto de una síntesis de 4 etapas [Borszeky et al. 1997]. Los copolímeros de anhidrido maleico -éter de vinilo resultantes contienen grupos anhidrido que pueden hacerse reaccionar con cualquier nucleófilo para producir fácilmente una variedad de nuevos polímeros.
Los polímeros que contienen anhidrido maleico pueden ser evaluados en cuanto a su potencial para endosomolisis por el ensayo de la lisis de glóbulos rojos de la sangre en función del pH. Por ejemplo, se polimerizaron etil, propil y butil vinil éter con anhidrido maleico y se hidrolizaron para formar los monómeros de diácido. Los polianiones obtenidos se probaron en cuanto a la lisis dependiente del pH. El polímero basado en butil vinil éter fue el único capaz de lisar la membrana de los glóbulos rojos. Por el contrario, los polímeros de ácido acrílico que contienen grupos de propilo son eficaces en la lisis.
También se describen los polímeros formados por reacción del polímero de butil vinil éter -anhidrido maleico (BVEMA) con alcoholes y aminas para formar ésteres y amidas (FIG. 2). El éster metílico de BVEMA (M-BVEMA) y la amida propílica de BVEMA (P-BVEMA) fueron sintetizados y probados en cuanto a su actividad hemolítica. La incorporación de ambos grupos alquilo aumentó la actividad de lisis de estos polímeros y aumentó el pH al que se produjo la actividad de lisis, de pH 6 a 6.5 (FIG. 3). Estos efectos sobre la actividad de la membrana pueden ser debidos a la disminución de densidad de carga del polímero por la formación de los grupos éster y amida y/o por el aumento de la hidrofobicidad de los polímeros.
El transporte de compuestos biológicamente activos al citoplasma de la célula se ve facilitado por la coendocitosis de los compuestos biológicamente activos con los polímeros que contienen anhidrido maleico. En uno de los aspectos de la invención, el compuesto biológicamente activo y los polímeros que contienen anhidrido maleico no están asociados entre sí pero ambos sufren endocitosis por la célula. En otro aspecto de la invención, el compuesto biológicamente activo y el polímero que contiene el anhidrido maleico están asociados entre sí por medio de interacciones covalentes o no covalentes. Las interacciones no covalentes incluyen interacciones iónicas, interacciones hidrófóbas, interacciones de Van der Waals e interacciones de afinidad. Esta asociación puede activar
o mejorar la co-endocitosis del compuesto biológicamente activo y los polímeros que contienen anhidrido maleico. La célula puede estar in vivo o in vitro. Para el transporte de un compuesto biológicamente activo a una célula in vivo, el polímero y compuesto biológicamente activo se insertan en el animal de una manera que permita que el polímero y el compuesto biológicamente activo se pongan en contacto con la célula. Las vías de administración parenteral incluyen intravascular, intramuscular, intraparenquimal, intradérmica, subdérmica, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal, intratecal, subdural, epidural y las inyecciones intralinfáticas que utilizan una jeringa y una aguja o catéter. Otras vías de administración incluyen intraparenquimal en tejidos como el músculo (intramuscular), hígado, cerebro y riñón. Las rutas epiteliales incluyen la vía de administración oral, nasal, respiratoria y vaginal.
Definiciones
5
15
25
35
45
Para facilitar la comprensión de la invención presente, se definen a continuación una serie de términos y frases:
Un polímero es una molécula construida por enlaces repetitivos de unidades más pequeñas llamadas monómeros. El polímero puede ser de tipo lineal, de red ramificada, estrella, peine o de escalera. El polímero puede ser un homopolímero en que se utiliza un único monómero o puede ser un copolímero, en el que se utilizan dos o más monómeros.
La cadena principal de un polímero se compone de los átomos cuyos enlaces se necesitan para la propagación de la longitud del polímero. Por ejemplo en poli-L-Iisina, se requieren el carbono carbonilo, carbono � y los grupos amino � para la longitud del polímero y son por lo tanto, átomos de la cadena principal. La cadena lateral de un polímero se compone de los átomos cuyos enlaces no son necesarios para la propagación de la longitud de polímero. Por ejemplo, en poli-L-Iisina, los carbonos �, �, � y � y el nitrógeno � no son necesarios para la propagación del polímero y son por lo tanto átomos de cadena lateral.
Otros componentes de los monómeros y polímeros: los polímeros pueden tener grupos funcionales que mejoran su utilidad. Estos grupos pueden ser incorporados en los monómeros antes de la formación del polímero o conectados al polímero después de su formación. Los grupos funcionales se pueden seleccionar de la lista que consiste en: grupos de diana, modificadores de interacción, estabilizadores estéricos y compuestos activos de membrana, grupos de afinidad y grupos reactivos.
Los grupos de diana o ligandos, se utilizan para dirigir el polímero o complejo polimérico a las células, a células específicas, a los tejidos o a ubicaciones específicas en una célula. Los grupos de diana mejoran la asociación de las moléculas con una célula. Ejemplos de grupos de diana incluyen aquellos que dirigen al receptor de la asialoglicoproteína mediante el uso de residuos de asialoglicoproteínas o galactosa. Otras proteínas tales como la insulina, EGF o transferrina pueden utilizarse para dirigir. Otros grupos de diana incluyen moléculas que interaccionan con las membranas, tales como los ácidos grasos, colesterol, compuestos de dansilo y derivados de anfotericina. Se han utilizado una variedad de ligandos para dirigir fármacos y genes a las células y a receptores celulares específicos. El ligando puede buscar un destino dentro de la membrana celular, sobre la membrana celular
o cerca de una célula. La unión de un ligando a un receptor puede iniciar la endocitosis.
Un estabilizador estérico es un grupo hidrófilo de cadena larga que previene la agregación del polímero final obstaculizando estéricamente las interacciones electrostáticas de partículas a partículas. Los ejemplos incluyen: grupos alquilo, cadenas de PEG, polisacáridos, moléculas de hidrógeno, y alquilaminas.
Un modificador de interacción cambia la manera en que una molécula interacciona con ella misma u otras moléculas, comparada con la molécula que no contiene ningún modificador de interacción. El resultado de esta modificación es que las auto interacciones o interacciones con otras moléculas o aumentan o disminuyen. Por ejemplo, el polietilenglicol es un modificador de interacción que disminuye las interacciones entre las moléculas con ellas mismas y con otras moléculas.
Los polímeros o compuestos activos sobre las membranas son moléculas que son capaces de modificar la estructura de la membrana. Este cambio en la estructura puede demostrarse cuando el compuesto induce uno o más de los siguientes efectos en una membrana: una alteración que permite la permeabilidad de moléculas pequeñas, la formación de poros en la membrana, una fusión o fisión de las membranas, una alteración que permite la permeabilidad de las moléculas grandes o una disolución de la membrana. Esta alteración puede ser funcionalmente definida por la actividad del compuesto en al menos uno de los siguientes ensayos: lisis de glóbulos rojos (hemólisis), fuga de liposomas, fusión de liposomas, fusión celular, lisis celular y liberación de endosomas. Más concretamente, los compuestos activos en la membrana permiten el transporte de moléculas para cruzar la membrana con un peso molecular superior a 50 unidades de masa atómica. Este transporte puede lograrse tanto por la pérdida total de la estructura de la membrana, como por la formación de agujeros (o poros) en la estructura de la membrana, o el transporte asistido del compuesto a través de la membrana.
Un compuesto biológicamente activo es un compuesto con el potencial de reaccionar con componentes biológicos y está diseñado para cambiar un proceso natural asociado con una célula. A efectos de esta solicitud, un proceso natural celular es un proceso que está asociado con la célula antes del transporte del compuesto biológicamente activo. Los compuestos biológicamente activos pueden seleccionarse de la lista que comprende: productos farmacéuticos/fármacos, proteínas, péptidos, inhibidores de enzimas, hormonas, citoquinas, antígenos, anticuerpos y polinucleótidos.
La estructura general de un éter de vinilo es:
R puede ser cualquier grupo que contiene carbono. Cualquiera de los dos átomos de carbono puede ser enlazado a átomos de hidrógeno o carbono.
La estructura general de un estireno es:
Pueden hacerse sustituciones en cualquiera de los átomos de carbono del fenilo. Cualquiera de los dos átomos de carbono que comparten un enlace doble puede ser enlazado a átomos de hidrógeno o carbono.
El término polinucleótido, o ácido nucleico o ácido polinucleico, es un término de la técnica que se refiere a un polímero que contiene al menos dos nucleótidos. Los nucleótidos son las unidades monómeras de los polímeros de polinucleótido. Los polinucleótidos con menos de 120 unidades monómeras suelen denominarse a menudo oligonucleótidos. Los ácidos nucleicos naturales tienen un esqueleto de desoxirribosa o ribosa-fosfato. Un polinucleótido artificial o sintético es cualquier polinucleótido que es polimerizado in vitro o en un sistema libre de células y contiene las mismas bases o similares, pero puede contener un esqueleto de un tipo distinto del esqueleto de ribosa-fosfato natural. Estos esqueletos incluyen: PNAs (ácidos nucleicos péptidos), fosforotioatos, fosforodiamidatos, morfolinos y otras variantes del esqueleto de fosfato de los ácidos nucleicos naturales. Las bases incluyen las purinas y pirimidinas, que además incluyen los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y análogos naturales. Los derivados sintéticos de las purinas y pirimidinas incluyen, pero no se limitan a, las modificaciones que colocan nuevos grupos reactivos tales como, pero no limitado a, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y alquilhaluros. El término base abarca cualquiera de los conocidos análogos de base de ADN y ARN. El término polinucleótido incluye el ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) y combinaciones de ADN, ARN y otros nucleótidos naturales y sintéticos.
Un polinucleótido puede ser transportado a una célula para expresar una secuencia de nucleótido exógeno, para inhibir, eliminar, aumentar o alterar la expresión de una secuencia de nucleótido endógeno, o para afectar a una característica fisiológica específica no naturalmente asociada con la célula.
Un inhibidor de la expresión de genes basado en un polinucleótido comprende cualquier polinucleótido que contenga una secuencia cuya presencia o expresión en una célula causa la degradación de o inhibe la función, transcripción o traslación de un gen de manera específica a la secuencia. Los inhibidores de la expresión basados en polinucleótidos pueden seleccionarse del grupo que comprende: siARN, microARN, ARN de interferencia o ARNi, bicatenario dsARN, ribozimas, polinucleótidos antisentido y casetes de expresión de ADN que codifican siARN, microARN, dsARN bicatenario, ribozimas o ácidos nucleicos antisentido. siARN comprende una estructura de cadena doble que por lo general contiene de 15-50 pares de bases y preferentemente de 19-25 pares de bases y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un gen diana expresado o ARN dentro de la célula. Un siARN puede constar de dos polinucleótidos anelados o un polinucleótido único que forma una estructura de horquilla. Los microARNs (miARNs) son polinucleótidos pequeños que no codifican, aproximadamente de 22 nucleótidos de longitud, que dirigen la destrucción o represión de la traslación de sus mARNs dianas. Los polinucleótidos antisentido comprenden una secuencia que es complementaria a un gen o mARN. Los polinucleótidos antisentido incluyen, pero no se limitan a: morfolinos, 2'-O-metil polinucleótidos, ADN, ARN y similares. El inhibidor de expresión basado en polinucleótidos puede ser polimerizado in vitro, recombinante, puede contener secuencias quiméricas, o pueden ser derivados de estos grupos. El inhibidor de expresión basado en polinucleótidos puede contener ribonucleótidos, desoxirribo-nucleótidos, nucleótidos sintéticos o cualquier combinación adecuada tal que el ARN y/o gen dianas sean inhibidos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Transporte del fármaco a las células usando polímeros aniónicos basados en anhidrido maleico: para evaluar la habilidad de estos polímeros como ayudantes en el transporte de un compuesto biológicamente activo elegimos evaluar la habilidad de estos polímeros para trasportar un oligonucleótido antisentido.
Los oligonucleótidos de morfolino fosforodiamidato (PMOs) son una clase de oligómeros antisentido que han demostrado ser muy eficaces en la inhibición de la expresión de genes específicos in vivo [Heasman et al. 2000; Nasevicius et al. 2000]. Estos agentes antisentido ejercen sus efectos por mecanismos de inhibición estérica y se pueden utilizar para bloquear la translación o división de un ARN diana [Kang et al. 1998; Giles et al. 1999; Ghosh et al. 2000]. PMOs son análogos de nucleótido sin carga en el que un anillo de morfolino de seis miembros está sustituido por ribosa y un enlace de fosforodiamidato sin carga reemplaza el enlace de fosfodiéster [Summerton et al. 1997]. Como PEG, los oligómeros antisentido con carga y sin carga pueden ser interiorizados por endocitosis [Carrasco 1994], pero no pueden difundirse a través de las membranas de la célula [Akhtar et al 1991; Akhtar et Al. 2000].
Para el transporte de oligómeros aniónicos, se utilizan habitualmente lípidos catiónicos [Hope et al. 1998; Audouy et al. 2001] y polímeros [Robaczewska et al. 2001] que son eficaces en el trasporte de ADN del plásmido. Sin embargo,
5
10
15
20
25
30
35
para poder utilizar estas estrategias para el trasporte de oligonucleótidos sin carga tales como PMOs, el PMO debe primero estar formando un complejo con una cadena complementaria de oligonucleótido aniónico para formar un complejo cargado. Dos otros métodos para el trasporte de PMOs, carga por raspadura y carga por jeringa, implican ambos físicamente dañar las células para crear lesiones transitorias en la membrana plasmática [Ghosh et al. 2000].
Para probar el trasporte de PMO por polianiones hidrofóbos, se utilizó una línea celular de HeLa disponible en el mercado que lleva un gen de luciferasa integrado con un sitio de empalme mutante [Kang et al. 1998]. Este lugar de empalme mutante origina la producción de un mARN que codifica una proteína de luciferasa inactiva truncada. Las bases del PMO bloqueante se emparejan, por lo tanto, bloqueando este sitio de empalme, permitiendo así la expresión de la enzima activa de longitud completa. Por lo tanto, el nivel de expresión de la luciferasa en esta línea celular es directamente proporcional a la cantidad de PMO que se puede trasportar al núcleo.
La coincubación de PMO bloqueante 2,5 µM con distintos polianiones anfifílicos, que incluyen PPA, SMA, BVEMA y sus derivados dio lugar a un aumento de la producción de luciferasa. La cantidad de unidades de luz, que es proporcional a la cantidad de luciferasa producida, se normaliza para las células cultivadas en ausencia de agentes de trasporte.
Tabla 1. Trasporte celular del fármaco de morfolino que utiliza polímeros basados en anhidrido maleico.
- Veces de aumento en unidades de luz relativa
- Agente
- Opti-DMEM (sin suero) medio de crecimiento + 10% de
- suero
- PPA (20 µg)
- 27 1
- BVEMA (80 µg)
- 1 _
- P-BVEMA (80 µg)
- 3 5
- P-BVEMA (320 µg)
- _ 15
- M-BVEMA (80 µg)
- 2 6
- M-BVEMA (320 µg)
- _ 8
- SMA diácido (500 µg)
- 1
- Éster butílico de SMA (500 µg)
- 1,6
- Propilamida de SMA
- 1
El polianión PPA es un agente de transporte muy bueno en los medios libres de suero como cabría esperar de datos publicados. Sin embargo, la adición de proteínas del suero a los medios de cultivo completamente inhibe cualquier transporte por PPA. Como se mencionó anteriormente, el polianión SMA se ha estudiado como un vehículo de transporte de fármacos únicamente por su capacidad, como se ha visto para otros polímeros, para secuestrarse en tumores por el efecto EPR. Muy poco se ha publicado en relación con la actividad sobre la membrana de SMA; sin embargo, se ha informado de que la capacidad de unión a la célula de SMA depende del pH y la temperatura del medio [Oda et al. 1987]. La dependencia de la temperatura de la unión a la célula sugiere que la unión aumentada a pH ácido puede no ser debido a cambios en SMA en si mismo, cuya protonación debería ser insensible a la temperatura, sino debido a un cambio en la membrana celular.
Cabe señalar que los valores en la tabla son para la cantidad máxima de polianión que podemos añadir sin ver toxicidad. Los intentos de aumentar el transporte mediante el aumento de la cantidad de PPA y el éster butilico de SMA produjeron considerable muerte celular, observada como una disminución en la confluencia celular.
Al contrario que con los polianiones basados en PPA y SMA, la asistencia en el transporte del polianiones derivados de BVEMA parece ser activa en la presencia de proteínas del suero. El polímero más hidrófobo de la serie BVEMA es el derivado de propilamida, que dio las concentraciones más altas de transporte de oligonucleótidos en presencia de proteínas de suero.
Estos resultados de transporte son importantes porque demuestran que los polianiones pueden transportar compuestos biológicamente activos. Además, los PMOs no sólo fueron transportados al citoplasma, sino que su difusión en el núcleo no fue obstruida.
Ejemplo 2. Copolimerización de anhidrido maleico con alquil viníl éteres VEMA: anhidrido maleico (1 eq molar) y azobisisobutironitrilo (0,01 a 0,1 eq molar) se disuelven en tolueno anhidro desgaseado en un vial de 30 ml. con cierre de rosca. Se agrega a este alquil vinil éter(1,5 eq molar) y el vial se lava con nitrógeno y se coloca en un baño de arena a 50° C de 6 a 24 horas. Después de que se ha completado el tiempo de polimerización el contenido del vial se vierte en éter de petróleo(150°C punto de ebullición) y se recupera por filtración, se lava con metanol seco y se seca a alto vacío. Los alquil vinil éteres que se pueden utilizar son C2-C18. En particular, puede utilizarse el butil viníl éter.
Ejemplo 3. Síntesis de ésteres del copolimero vinil eter -anhidrido maleico (VEMA): a una solución de VEMA en THF anhidro se agrega 100 eq de alcohol (en relación con el grupo funcional de anhidrido de VEMA). A esta solución se agrega 1 mol % HCI o H2S04. La solución se agita durante la noche. A esta solución se agrega agua y el polímero precipitado se aísla. El polímero, a continuación, se disuelve en agua al llevar el pH a 7,5 por adición de NaHC03. El polímero se precipita después de la solución por acidificación con HCI hasta llevar el pH a 2. Entonces, el polímero se disuelve nuevamente en agua a pH 7,5 con NaHC03. Una variedad de alcoholes pueden utilizarse para sintetizar los ésteres. En particular, pueden utilizarse los alcoholes metílico, etílico, propílico y alcoholes de butilo.
Ejemplo 4. Síntesis de amidas del copolimero viniléter -anhidrido maleico (VEMA): a una solución de amina en agua, se agrega 1 eq mol % de VEMA (en relación con el grupo funcional de anhidrido de VEMA). La solución se agita durante la noche. El polímero se precipita después de la solución por acidificación con HCI para llevar el pH a
2. El polímero, a continuación, se aísla y se disuelve de nuevo en agua a pH 7,5 con NaHC03. Una variedad de aminas pueden utilizarse para sintetizar las amidas. En particular, podrán utilizarse metilamina, etilamina, propilamina y butilamina.
Ejemplo 5. Síntesis de derivados del copolímero de estireno -anhidrido maleico (SMA): un polímero de SMA que contenía estireno al 50% y anhidrido maleico al 50% Pm 1.400 fue comprado a Polyscience Inc (Warrington, PA).
Diácido de SMA; 100 mg de polímero de SMA se hizo reaccionar con 100 mg de hidróxido de sodio en 50 ml de agua durante 16 horas. La solución acuosa fue colocada después en tubos de diálisis límite de 14.000 de Pm, y dializados con 80 l de agua durante 72 horas. La solución de polímero, a continuación, fue obtenida de los tubos de diálisis y precipitada por adición de HCl hasta llevar el pH a 2. Se formó a continuación una solución madre de diácido-SMA disolviéndolo en agua e hidróxido de sodio hasta llevar a pH 6.
Éster de butilo de SMA, 100 mg de polímero de SMA se hizo reaccionar con 0,5 ml de alcohol butílico en 15 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro durante 16 horas. El THF se separó por evaporación en rota vapor y el polímero fue disuelto en agua e hidróxido de sodio. La solución acuosa fue colocada en tubos de diálisis límite de 14.000 de PM y se dializó con 80 l de agua durante 72 horas. La solución de polímero, a continuación, fue extraída de la tubería de diálisis y se precipitó por adición de HCI hasta un pH de 2. La solución madre del ester butilico de SMA, se formó a continuación, disolviéndolo en agua e hidróxido de sodio hasta llevar el pH a 6.
Propil amida de SMA; 100 mg de polímero de SMA se hicieron reaccionar con 0,5 ml de propilamina en 15 ml de metanol durante 16 horas. El metanol fue eliminado en rota vapor y el polímero fue disuelto en agua e hidróxido de sodio. La solución acuosa se colocó después en tubos de diálisis límite de Pm de 14.000 y se dializó con 80 l de agua durante 72 horas. La solución de polímero, a continuación, fue extraída de los tubos de diálisis y se precipitó por adición de HCI hasta llevar el pH a 2. La solución madre del éster de butilo de SMA, se formó a continuación, disolviéndolo en agua e hidróxido de sodio hasta llevar el pH a 6.
Ejemplo 6: Síntesis del ácido polipropilacrílico: el ácido propilacrílico fue sintetizado según Borszeky et al [Borszeky et al. 1997]. El ácido propilacrílico fue polimerizado según Lackey et al [Lackey et al. 1999]. El ácido propilacrílico se mezcló con 1 mol % de azobisisobutironitrilo y se calentó a 60° C durante 16 horas. Se añadió éter a la mezcla de reacción y el precipitado de polímero se aisló.
Ejemplo 7: Ensayo de hemólisis: la actividad sobre la membrana de polímeros y péptidos se midió con un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (RBC). Sangre porcina entera fue aislada en vacutainers heparinizados. Los RBCs se aislaron por centrifugación a 2.500 rpm durante 5 minutos. Se lavaron tres veces con fosfato dibásico de sodio 100 mM al pH deseado y se resuspendieron al volumen inicial. El tampón de fosfato de pH deseado se obtuvo por la acidificación de una solución stock de fosfato dibásico de sodio. Los intentos de llegar al pH ácido deseado con fosfato monobásico produjo la hemólisis. Se añadieron 20 µl de la suspensión de RBCs lavada, que era de aproximadamente 108 células [Lackey et al 1999] en 500 µl de tampón de fosfatos. A esta solución se añadieron 20 µg de polímero. Las muestras se incubaron durante una hora y media en una incubadora a 37° C. A continuación fueron centrifugadas durante 1 min a 14.000 rpm. La lisis se determinó por la medición de la absorbancia del sobrenadante a 541 nm. El porcentaje de hemólisis se calculó suponiendo que el 100% de lisis era la absorbancia de la hemoglobina liberada por la adición de agua desionizada, todas las absorbancias de las muestras tenía la absorbancia del tampón solo sustraido.
Ejemplo 8. Ensayo del trasporte de morfolino: células HeLa Tet-Off (laboratorios Clontech, Palo Alto, CA) fueron cultivados en medio de Eagle modificado de Delbecco (DMEM, Cellgro, Herndon, VA), que contenía 10% de suero bovino fetal (BFS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) en una incubadora humidificada a 37° C con atmósfera de CO2 al 5%. Las células fueron dispuestas en placas de cultivo de 24 pocillos con una densidad de 3 x 106 células/pocillo e incubadas durante 24 horas. El medio fue reemplazado con 0,5 ml DMEM, con o sin 10% de EFB, que contenía morfolino 0,5 µmoles (CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A, número de identificación de
5
10
15
20
25
30
secuencia 10, Gene Tools, Philomath, OR) y que contenía o no 20 µg de diversos polianiones. Las células se incubaron durante 4 horas en una incubadora humidificada con 5% de C02, a 37° C. Los medios fueron después reemplazados por medios de Eagle modificados de Dubelco que contenían 10% de suero bovino fetal. Las células, a continuación, se incubaron durante 48 horas. Después, las células fueron cosechadas y el lisado, a continuación, se ensayó para expresión de luciferasa como se describió anteriormente [Wolff et al. 1990]. Se utilizó un luminómetro Lumat LB 9507 (EG & G de Berthold, Bad Wildbad, Alemania). La cantidad de luciferasa producida en la presencia de morfolino y polianión se normalizó para la cantidad producida en ausencia del polianión y como se comunica en la Tabla 1.
Ejemplo 9. Síntesis de la butilamida del copolimero de diviniléter -anhidrido maleico que contiene disulfuro (DBVEMA): a una solución de n-butilamina y cistamina (en una proporción molar de 50 a 1) en agua, se añade 1 eq mol % (grupo funcional de anhidrido de VEMA relativo a los grupos amina) de VEMA. La solución se agita durante la noche. El polímero se precipita luego de la solución por acidificación con HCI hasta llevar el pH a 2. El polímero, a continuación, se aísla y de nuevo se disuelve en agua a pH 7,5 con NaHC03 en presencia de 10 equivalentes molares de ditiotreitol (con relación a la cistamina de partida). Después de 4 horas, el polímero se precipita luego de la solución por acidificación con HCI hasta llevar el pH a 2. El polímero, a continuación, se aísla y de nuevo se disuelve en agua a pH 7,5 con NaHC03 en presencia de 10 equivalentes molares de 2,2'-ditiodipiridina (con relación a la cistamina de partida). Después de 4 horas, el polímero se precipita después de la solución por acidificación con HCl hasta llevar el pH a 2. El polímero, a continuación, se aísla y se disuelve en agua. Se confirma la presencia de la tiopiridina por la medición de la absorbancia del polímero a 280 nm. La tiopiridina puede utilizarse para conjugar cualquier molécula que contenga tiol. Una variedad de aminas pueden utilizarse para sintetizar las amidas. En particular, pueden utilizarse aminas de metilo, etilo, propilo y butilo.
Ejemplo 10. Conjugación del oligonucleótido de morfolino y la butilamida del copolimero de diviniléter-anhidrido maleico que contiene disulfuro (DBVEMA): el terminal amino del oligonucleótido de morfolino fue modificado con NSuccinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, Pierce Biotechnology Inc) de acuerdo al protocolo del fabricante. Se eliminó el grupo acetilo de SATA de acuerdo con el protocolo del fabricante para producir el oligonucleótido de morfolino modificado de tiol, que se conjugó a DBVEMA. Se agregaron 50 pmoles a 500 µg de DBVEMA en 25 ml de 5 mM de HEPES a pH 7,8. La actividad del oligonucleótido de morfolino se ensayó como anteriormente.
- Muestra
- Unidades relativas de luz
- Conjugado de morfolino-DBVEMA Morfolino solo
- 41710 5780
Lo anterior se consideró solamente como ilustrativo de los principios de la invención. Además, ya que numerosas modificaciones y cambios se le ocurrirán fácilmente a aquellos expertos en la técnica, no se desea limitar la invención a la construcción exacta y la operación mostrada y descrita. Por tanto, todas las modificaciones adecuadas y equivalentes caen dentro del alcance de la invención.
Claims (16)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento in vitro para transportar un compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con dicho compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico – anhidrido maleico, dicho polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, tal que el polianión con actividad sobre la membrana y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula.
-
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma no covalente al polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 3.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma covalente al polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 4.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el éter vinílico se selecciona del grupo que comprende alquil vinil éter y aril vinil éter.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el alquil vinil éter se selecciona del grupo que consiste en: propil vinil éter y butil vinil éter.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde un grupo hidrófobo se une de forma covalente al monómero anhídrido en el polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 6, en donde los grupos hidrófobos se seleccionan del grupo que consiste en: ésteres hidrófobos y amidas hidrófobas.
-
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde un grupo funcional se une de forma covalente a un monómero anhídrido en el polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 9.
- Un compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana, en donde el polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico – anhidrido maleico para uso en la terapia génica, en donde la terapia génica comprende el transporte del compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula poniendo en contacto dicha célula con el compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad en la membrana, de manera que el polianión y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula.
-
- 10.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma no covalente al polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 11.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma covalente al polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 12.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el éter vinílico se selecciona del grupo que comprende alquil vinil éter y aril vinil éter.
-
- 13.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 12, en donde el alquil vinil éter se selecciona del grupo que consiste en: propil vinil éter y butil vinil éter.
-
- 14.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde un grupo hidrófobo se une de forma covalente a un monómero anhidrido en el polianión con actividad sobre la membrana.
-
- 15.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 14, en donde los grupos hidrófobos se seleccionan del grupo que consiste en: ésteres hidrófobos y amidas hidrófobas.
-
- 16.
- El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde un grupo funcional está unido de forma covalente a un monómero anhidrido en el polianión con actividad sobre la membrana.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44390603P | 2003-01-31 | 2003-01-31 | |
| US443906P | 2003-01-31 | ||
| US765668 | 2004-01-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2361317T3 true ES2361317T3 (es) | 2011-06-16 |
Family
ID=44072469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04707130T Expired - Lifetime ES2361317T3 (es) | 2003-01-31 | 2004-01-30 | Polímeros activos sobre membranas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2361317T3 (es) |
-
2004
- 2004-01-30 ES ES04707130T patent/ES2361317T3/es not_active Expired - Lifetime
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2390875T3 (es) | Unión reversible de un polímero activo en la membrana a un polinucleótido | |
| Tan et al. | Polycation architecture and assembly direct successful gene delivery: micelleplexes outperform polyplexes via optimal DNA packaging | |
| US20080112916A1 (en) | CHEMICALLY MODIFIED POLYCATION POLYMER FOR siRNA DELIVERY | |
| Huh et al. | pH-sensitive polymers for drug delivery | |
| Zhao et al. | Folic acid modified cationic γ-cyclodextrin-oligoethylenimine star polymer with bioreducible disulfide linker for efficient targeted gene delivery | |
| Osada et al. | Drug and gene delivery based on supramolecular assembly of PEG-polypeptide hybrid block copolymers | |
| Dosta et al. | Stable and efficient generation of poly (β-amino ester) s for RNAi delivery | |
| US7682626B2 (en) | Polyvinylethers for delivery of polynucleotides to mammalian cells | |
| JP2015515530A (ja) | インビボ核酸送達のためのポリ（アクリラート）ポリマー | |
| US7871818B2 (en) | Membrane active polymers | |
| Berger et al. | Optimizing pDNA lipo-polyplexes: a balancing act between stability and cargo release | |
| Wang et al. | Double click-functionalized siRNA polyplexes for gene silencing in epidermal growth factor receptor-positive tumor cells | |
| Parker et al. | Enhanced gene transfer activity of peptide-targeted gene-delivery vectors | |
| Park et al. | Highly efficient gene transfer with degradable poly (ester amine) based on poly (ethylene glycol) diacrylate and polyethylenimine in vitro and in vivo | |
| US7094605B2 (en) | Formation of polyampholytes in the presence of a polyion | |
| JPWO2005078084A1 (ja) | ２本鎖オリゴ核酸を担持したポリイオンコンプレックスおよびその製造法とそれを含む医薬組成物 | |
| Son et al. | Recent progress in nanomedicine-mediated cytosolic delivery | |
| Xie et al. | ε-Caprolactone-modified polyethylenimine as efficient nanocarriers for siRNA delivery in vivo | |
| Fröhlich et al. | Peptide-and polymer-based delivery of therapeutic RNA | |
| Liu et al. | Zinc coordinated cationic polymers break up the paradox between low molecular weight and high transfection efficacy | |
| US8945927B2 (en) | Polymers for delivering molecules of interest | |
| ES2361317T3 (es) | Polímeros activos sobre membranas. | |
| US6881576B2 (en) | Formation of polyampholytes in the presence of a polyion | |
| Shuai et al. | Novel aromatic moieties-modified poly (glycidyl amine) s with potent siRNA delivery and cancer treatment effect | |
| US20170226246A1 (en) | Cationic particles comprising cyclopropenium, their preparation and uses |