ES2359749T3 - ENZIMA DICAMBA MONOOXIGENASA MODIFIED AND PROCEDURE OF USE. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 1; b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2; y c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEC ID Nº 1, en el que el polipéptido tiene actividad dicamba monooxigenasa y comprende cisteína en una posición correspondiente al aminoácido 112 de la SEC ID Nº 1.A nucleic acid molecule selected from the group consisting of: a) a nucleic acid molecule encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1; b) a nucleic acid molecule comprising the sequence of SEQ ID NO: 2; and c) a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide with at least 90% sequence identity with the polypeptide of SEQ ID No. 1, wherein the polypeptide has dicamba monooxygenase activity and comprises cysteine at a position corresponding to amino acid 112 of SEQ ID NO. 1.
Description
Antecedentes de la invención Background of the invention
La invención se refiere en líneas generales al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a enzimas dicamba monooxigenasa modificadas capaces de conferir tolerancia al herbicida dicamba en organismos transgénicos. The invention relates in general to the field of biotechnology. More specifically, the invention relates to modified dicamba monooxygenase enzymes capable of conferring tolerance to the dicamba herbicide in transgenic organisms.
Los procedimientos para la producción de cultivos de campo, tales como maíz, soja y algodón, han cambiado drásticamente durante la pasada década debido a la introducción de rasgos tales como la resistencia a insectos y la tolerancia a herbicidas a través del uso de técnicas de ingeniería genética en plantas. Estos cambios han provocado una mayor productividad por hectárea, costes disminuidos en la producción, mayor flexibilidad y eficacia en los regímenes de producción, uso disminuido de pesticidas y, en el caso del algodón resistente a insectos, una salud mejorada en los agricultores. Los cultivos transgénicos por tanto han logrado una adopción generalizada y ahora se cultivan en millones de acres en todo el mundo. Sin embargo, para que los cultivos transgénicos sigan siendo competitivos en el mercado, ahora requerirán nuevos rasgos de valor añadido. Procedures for the production of field crops, such as corn, soybeans and cotton, have changed dramatically over the past decade due to the introduction of traits such as insect resistance and herbicide tolerance through the use of engineering techniques. plant genetics These changes have led to greater productivity per hectare, reduced production costs, greater flexibility and efficiency in production regimes, decreased use of pesticides and, in the case of insect-resistant cotton, improved health in farmers. Transgenic crops have therefore achieved widespread adoption and are now grown on millions of acres worldwide. However, for GM crops to remain competitive in the market, they will now require new value-added features.
Aunque han aparecido nuevos rasgos que mejoran la cantidad y calidad de los cultivos agrícolas y hortícolas y continuarán apareciendo a una velocidad creciente en los años que vienen, existe una demanda de rasgos que mejoren los procedimientos para la producción de comida, pienso y otros productos. Por ejemplo, aunque actualmente están disponibles plantas transgénicas tolerantes a tratamientos con los herbicidas glifosato, bromoxinil, sulfonilureas y otros herbicidas, existen lagunas en el espectro de las malas hierbas controladas y las opciones de tratamiento que pueden abordarse a través del desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas adicionales. Además, la aparición de malas hierbas resistentes a los herbicidas indicados anteriormente, aunque está generalmente localizada y contenida de forma variable, impone la necesidad de medidas de control suplementarias o alternativas de las malas hierbas. Although new features have appeared that improve the quantity and quality of agricultural and horticultural crops and will continue to appear at an increasing rate in the coming years, there is a demand for features that improve the procedures for the production of food, feed and other products. For example, although transgenic plants that are tolerant to treatments with glyphosate, bromoxynil, sulfonylureas and other herbicides herbicides are currently available, there are gaps in the spectrum of controlled weeds and treatment options that can be addressed through the development of tolerant crops. additional herbicides In addition, the appearance of weeds resistant to the herbicides indicated above, although it is generally located and contained in a variable way, imposes the need for supplementary or alternative control measures of weeds.
Como se ha demostrado que la tolerancia transgénica a herbicidas es valiosa en un entorno comercial, se necesitan plantas tolerantes a otros herbicidas para evitar la dependencia excesiva de cualquier herbicida individual y para aumentar las opciones de manejar las dificultades para controlar las especies de malas hierbas. Es de particular interés el desarrollo de tolerancia a herbicidas para herbicidas que sean tanto respetuosos con el medioambiente como altamente eficaces para controlar las malas hierbas. El dicamba es uno de dichos ejemplos de un herbicida eficaz y respetuoso con el medio ambiente que han usado los agricultores durante más de 40 años. El dicamba es especialmente útil para el control de malas hierbas latifoliadas anuales y perennes y varias malas hierbas herbáceas en el maíz, el sorgo, los granos pequeños, el pasto, el heno, el pastizal forestal, la caña de azúcar, el espárrago, el césped, y cultivos de semillas de hierba (Crop Protection Reference, 1995). Desafortunadamente, el dicamba puede dañar muchos cultivos comerciales y plantas dicotiledóneas tales como la soja, el algodón, el guisante, la patata, el girasol, y la canola, que son particularmente sensibles incluso a bajos niveles del herbicida. A pesar de esto, el dicamba es altamente eficaz en el control del crecimiento de malas hierbas y por tanto es una herramienta importante en la agricultura. As it has been shown that transgenic herbicide tolerance is valuable in a commercial environment, plants tolerant to other herbicides are needed to avoid excessive dependence on any individual herbicide and to increase the options for handling difficulties in controlling weed species. Of particular interest is the development of herbicide tolerance for herbicides that are both environmentally friendly and highly effective in controlling weeds. Dicamba is one such example of an effective and environmentally friendly herbicide that farmers have used for more than 40 years. The dicamba is especially useful for the control of annual and perennial broadleaf weeds and various herbaceous weeds in corn, sorghum, small grains, grass, hay, forest pasture, sugarcane, asparagus, grass, and grass seed crops (Crop Protection Reference, 1995). Unfortunately, the dicamba can damage many commercial crops and dicotyledonous plants such as soybeans, cotton, peas, potatoes, sunflowers, and canola, which are particularly sensitive even at low levels of the herbicide. Despite this, the dicamba is highly effective in controlling weed growth and is therefore an important tool in agriculture.
Recientemente, se aisló un gen que codifica la dicamba monooxigenasa (DMO) de Pseudomonas maltophilia que confiere tolerancia a dicamba (patente de Estados Unidos Nº 7.022.896). La DMO está implicada en la conversión del herbicida dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico) en un ácido 3,6-diclorosalicílico no tóxico. Este gen se describe en la patente de Estados Unidos Nº 7.022.896 que proporciona tolerancia al dicamba en plantas que expresan el gen DMO. Sin embargo, el desarrollo de variantes de este gen sería de gran beneficio. Dichas variantes podrían tener potencialmente una eficacia de expresión alterada en condiciones ambientales específicas. De este modo, podría seleccionarse una variante que esté optimizada para un entorno específico en el que se pretende usar, y puede mostrar características cinéticas particularmente beneficiosas. La variante en particular puede mostrar eficacia máxima a diferentes temperaturas o condiciones de pH, y por tanto podría seleccionarse para una especie de cultivo particular dependiendo de las condiciones intracelulares y/o las condiciones previstas de crecimiento del cultivo. Recently, a gene encoding the dicamba monooxygenase (BMD) of Pseudomonas maltophilia that confers tolerance to dicamba (US Patent No. 7,022,896) was isolated. BMD is involved in the conversion of the herbicide dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) into a non-toxic 3,6-dichlorosalicylic acid. This gene is described in U.S. Patent No. 7,022,896 that provides tolerance to dicamba in plants expressing the DMO gene. However, the development of variants of this gene would be of great benefit. Such variants could potentially have an altered expression efficiency under specific environmental conditions. In this way, a variant that is optimized for a specific environment in which it is intended to be used could be selected, and can show particularly beneficial kinetic characteristics. The particular variant can show maximum efficiency at different temperatures or pH conditions, and therefore could be selected for a particular crop species depending on the intracellular conditions and / or the expected growth conditions of the crop.
Sumario de la invención Summary of the invention
En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: a) una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 1; b) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2; y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos el 90% con el polipéptido de la SEC ID Nº 1, donde el polipéptido tiene actividad dicamba monooxigenasa y comprende cisteína en una posición correspondiente al aminoácido 112 de la SEC ID Nº 1. En otras realizaciones, se proporciona un vector de ADN que comprende un ácido nucleico de DMO descrito en este documento unido de forma funcional a un promotor. El promotor puede ser funcional en una célula vegetal. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la dicamba monooxigenasa puede estar unida de forma funcional a un péptido de tránsito en cloroplastos. In one aspect, the invention provides a nucleic acid sequence selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1; b) a nucleic acid sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 2; and c) a nucleic acid sequence encoding a polypeptide with a sequence identity of at least 90% with the polypeptide of SEQ ID No. 1, where the polypeptide has dicamba monooxygenase activity and comprises cysteine at a position corresponding to amino acid 112 of SEQ ID NO. 1. In other embodiments, a DNA vector is provided comprising a DMO nucleic acid described herein functionally linked to a promoter. The promoter can be functional in a plant cell. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the dicamba monooxygenase may be functionally linked to a transit peptide in chloroplasts.
En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia polipeptídica con una identidad de al menos el 90% con la SEC ID Nº 1, donde el polipéptido tiene actividad dicamba monooxigenasa y comprende cisteína en una posición correspondiente al aminoácido 112 de la SEC ID Nº 1. In another aspect, the invention provides a polypeptide sequence with an identity of at least 90% with SEQ ID No. 1, where the polypeptide has dicamba monooxygenase activity and comprises cysteine at a position corresponding to amino acid 112 of SEQ ID No. 1.
En otro aspecto más, la invención proporciona una célula o tejido huésped transformado con un ácido nucleico codificante de dicamba monooxigenasa descrito en este documento. En ciertas realizaciones, la célula huésped puede ser una célula de una planta. En otras realizaciones, la célula vegetal puede definirse como una célula vegetal dicotiledónea o una célula de una planta monocotiledónea. En realizaciones específicas, la célula huésped es una célula vegetal de soja, algodón, maíz o colza. En otras realizaciones, se proporciona un cultivo tisular que comprende una célula transgénica descrita en este documento. In yet another aspect, the invention provides a host cell or tissue transformed with a nucleic acid encoding dicamba monooxygenase described herein. In certain embodiments, the host cell may be a plant cell. In other embodiments, the plant cell can be defined as a dicot plant cell or a cell of a monocot plant. In specific embodiments, the host cell is a plant cell of soy, cotton, corn or rapeseed. In other embodiments, a tissue culture is provided comprising a transgenic cell described herein.
En otro aspecto más, la invención proporciona una planta transgénica, y la descendencia de la misma, transformada con un ácido nucleico codificante de dicamba monooxigenasa descrito en este documento. En ciertas realizaciones, la planta puede definirse como una planta dicotiledónea o monocotiledónea. En realizaciones específicas, la planta es una planta de soja, algodón, maíz o colza. In yet another aspect, the invention provides a transgenic plant, and the offspring thereof, transformed with a nucleic acid encoding dicamba monooxygenase described herein. In certain embodiments, the plant can be defined as a dicot or monocot plant. In specific embodiments, the plant is a soybean, cotton, corn or rapeseed plant.
En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta tolerante a dicamba que comprende introducir en la planta una construcción de transformación proporcionada en este documento transformando de forma estable una o más células vegetales y regenerar la una o más células en una planta tolerante a dicamba. En una realización preferida, el procedimiento comprende adicionalmente cruzar una planta parental consigo misma o una segunda planta, donde la planta parental y/o la segunda planta comprende la construcción de transformación y la planta tolerante a dicamba hereda la construcción de transformación de la planta parental y/o la segunda planta. In yet another aspect, the invention provides a method for producing a dicamba tolerant plant comprising introducing into the plant a transformation construct provided herein by stably transforming one or more plant cells and regenerating the one or more cells in a plant. Dicamba tolerant. In a preferred embodiment, the method further comprises crossing a parental plant with itself or a second plant, where the parental plant and / or the second plant comprises the transformation construction and the dicamba tolerant plant inherits the transformation construction of the parental plant and / or the second floor.
En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para producir comida o pienso que comprende: a) obtener una planta de la invención proporcionada en este documento o una parte de la misma; y b) preparar comida In yet another aspect, the invention provides a process for producing food or feed comprising: a) obtaining a plant of the invention provided herein or a part thereof; and b) prepare food
- o pienso a partir de la planta o parte de la misma. En una realización de la invención, la parte de la planta es una semilla. En ciertas realizaciones adicionales, la comida o pienso es aceite, harina, proteína, grano, almidón o proteína. En otras realizaciones, el pienso comprende una planta de forraje o pasto tal como heno. La invención también proporciona procedimientos para producir fibras, agentes farmacéuticos, agentes nutracéuticos, y compuestos químicos industriales, incluyendo biocombustibles, así como cualquier otro producto derivado de una planta proporcionada en este documento. or I think from the plant or part of it. In one embodiment of the invention, the part of the plant is a seed. In certain additional embodiments, the food or feed is oil, flour, protein, grain, starch or protein. In other embodiments, the feed comprises a forage or grass plant such as hay. The invention also provides methods for producing fibers, pharmaceutical agents, nutraceutical agents, and industrial chemical compounds, including biofuels, as well as any other product derived from a plant provided herein.
En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para controlar el crecimiento de malas hierbas en un entorno de crecimiento de cultivos que comprende una planta de la invención proporcionada en este documento In yet another aspect, the invention provides a method for controlling weed growth in a crop growth environment comprising a plant of the invention provided herein.
- o una semilla de la misma, que comprende aplicar al entorno de crecimiento de cultivos una cantidad del herbicida dicamba eficaz para controlar el crecimiento de malas hierbas. En ciertas realizaciones de la invención, el herbicida dicamba puede aplicarse sobre la parte superior del entorno de crecimiento de cultivos. En realizaciones específicas, la cantidad del herbicida dicamba no daña la planta de la invención o la semilla de la misma y daña una planta del mismo genotipo que la planta que carece de una ácido nucleico codificante de DMO proporcionado por la invención. or a seed thereof, which comprises applying to the crop growth environment an amount of the effective dicamba herbicide to control the growth of weeds. In certain embodiments of the invention, the dicamba herbicide can be applied over the upper part of the crop growth environment. In specific embodiments, the amount of the dicamba herbicide does not damage the plant of the invention or the seed thereof and damages a plant of the same genotype as the plant that lacks a DMO coding nucleic acid provided by the invention.
En otra realización más de la invención, se proporciona una planta que comprende un ácido nucleico codificante de DMO proporcionado por la invención y al menos otra secuencia codificante transgénica incluyendo, por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco o más de dichas secuencias codificantes. En realizaciones particulares, las plantas comprenden un transgén que confiere uno o más rasgos beneficiosos adicionales, tales como tolerancia a herbicidas In yet another embodiment of the invention, there is provided a plant comprising a DMO coding nucleic acid provided by the invention and at least one other transgenic coding sequence including, for example, at least two, three, four, five or more of said sequences. encoders In particular embodiments, the plants comprise a transgene that confers one or more additional beneficial traits, such as herbicide tolerance.
- o plagas/insectos. Por ejemplo, puede proporcionarse tolerancia a uno o más herbicidas además de a dicamba, así como otro rasgo beneficioso, como se describe a continuación en este documento. La invención, por lo tanto, proporciona plantas que comprenden un ácido nucleico codificante de DMO de la presente invención "apilado" en cualquier combinación deseada con rasgos transgénicos adicionales. or pests / insects. For example, tolerance can be provided to one or more herbicides in addition to dicamba, as well as another beneficial trait, as described below in this document. The invention, therefore, provides plants comprising a DMO coding nucleic acid of the present invention "stacked" in any desired combination with additional transgenic features.
Breve descripción de las figuras Brief description of the figures
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos gráficos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en este documento. The following drawings form part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present invention. The invention can be better understood by reference to one or more of these graphs in combination with the detailed description of the specific embodiments presented herein.
FIG. 1. Esquema del casete usado para el diseño genético del gen de la dicamba monooxigenasa (DMOc) para su expresión en plantas superiores usando el promotor FLt36 del virus del estriado clorótico del cacahuete, la secuencia potenciadora de la traducción del virus del grabado del tabaco (líder TEV), y una región terminadora del gen de la subunidad pequeña de la Rubisco del guisante. Otra versión diseñada genéticamente del gen DMOc que se preparó contenía una región codificante de un péptido de tránsito del gen de la subunidad pequeña de la Rubisco del guisante para la localización en el cloroplasto de la DMO entre la región potenciadora de la traducción del TEV y la región codificante de DMOc. FIG. 1. Cassette scheme used for the genetic design of the dicamba monooxygenase (DMOc) gene for expression in higher plants using the FLt36 promoter of the peanut chlorotic striatum virus, the translation enhancer sequence of tobacco engraving virus ( TEV leader), and a terminator region of the small subunit gene of the Pea Rubisco. Another genetically engineered version of the DMOc gene that was prepared contained a region encoding a transit peptide of the small subunit gene of the Pea Rubisco for localization in the chloroplast of the BMD between the translation enhancing region of the TEV and the coding region of DMOc.
FIG. 2. Paneles de transferencia de ADN, ARN y proteína que demuestran la presencia y expresión del gen de la DMO modificado por ingeniería genética en plantas de tabaco transgénicas de la generación T1. Los carriles Q a V representan las muestras de ADN, ARNm y DMO extraídas de diversas plantas de tabaco de la generación T1. Los extractos de una planta de tabaco no transgénica se representan en el carril WT mientras que el carril Ox muestra FIG. 2. DNA, RNA and protein transfer panels that demonstrate the presence and expression of the genetically modified BMD gene in T1 generation transgenic tobacco plants. Lanes Q to V represent the DNA, mRNA and BMD samples extracted from various tobacco plants of the T1 generation. Extracts from a non-transgenic tobacco plant are represented in the WT lane while the Ox lane shows
5 un producto de digestión de restricción de la construcción génica de DMO clonada (panel superior) y la enzima DMO de 37 kDa super-producida en E. coli (panel inferior). La subunidad grande de 55 kDa de la Rubisco se detectó en la transferencia de proteína añadiendo anticuerpos contra la Rubisco a los anticuerpos DMO y la detección de la Rubisco sirvió como una patrón interno para comparar las cargas de proteína total en cada carril. Se cargaron cantidades iguales de ARN en cada carril que se midieron por tinción con bromuro de etidio de un gel duplicado. Las flechas indica la localización de la banda de ADN, ARNm o proteína, de DMO. 5 a restriction digestion product of the cloned DMO gene construct (upper panel) and the MO37 kDa DMO enzyme super-produced in E. coli (lower panel). The large subunit of 55 kDa from Rubisco was detected in protein transfer by adding antibodies against Rubisco to DMO antibodies and Rubisco detection served as an internal standard to compare total protein loads in each lane. Equal amounts of RNA were loaded into each lane that were measured by staining with ethidium bromide of a duplicate gel. The arrows indicate the location of the DNA, mRNA or protein band of BMD.
FIG. 3. Efecto del tratamiento con dicamba a 2,2 kg/ha en dos plantas de tabaco T1, una que contiene el gen DMOc modificado por ingeniería genética que carece de una secuencia codificante del péptido de tránsito en cloroplastos (derecha) y una que carece del gen DMOc (segunda desde la derecha). La planta transgénica de la derecha presenta poco, si lo hay, daño por el tratamiento con dicamba. Las dos plantas de la izquierda no se trataron con FIG. 3. Effect of the treatment with dicamba at 2.2 kg / ha in two T1 tobacco plants, one containing the genetically modified DMOc gene that lacks a transit peptide coding sequence in chloroplasts (right) and one that lacks of the DMOc gene (second from the right). The transgenic plant on the right shows little, if any, damage due to dicamba treatment. The two plants on the left were not treated with
15 dicamba y representan una planta no transgénica (izquierda) y una planta transgénica que contiene el gen DMOc (segunda desde la izquierda). 15 dicamba and represent a non-transgenic plant (left) and a transgenic plant that contains the DMOc gene (second from the left).
FIG. 4. Formación de DCSA frente al tiempo por DMOw. FIG. 4. DCSA training versus time by DMOw.
FIG. 5. Determinación del pH óptimo de ensayo para DMOw. FIG. 5. Determination of the optimum test pH for DMOw.
FIG. 6. Determinación de la temperatura óptima de ensayo para DMOw. FIG. 6. Determination of the optimum test temperature for DMOw.
FIG. 7. Determinación del pH óptimo para DMOc. FIG. 7. Determination of the optimum pH for BMDD.
FIG. 8. Determinación de la temperatura óptima para DMOc. FIG. 8. Determination of the optimum temperature for BMDD.
FIG. 9. Sumario de las condiciones óptimas de temperatura y pH para DMOc y DMOw. FIG. 9. Summary of the optimum temperature and pH conditions for DMOc and DMOw.
FIG. 10. Cinética en estado estacionario para DMOw. FIG. 10. Kinetics in steady state for DMOw.
FIG. 11. Cinética en estado estacionario para DMOc. FIG. 11. Kinetics in steady state for DMOc.
25 FIG. 12. Efectos de la preincubación de DMOc durante 45 minutos a 30ºC en TRIS 50 mM pH 7,5 y KPi 100 mM pH 7,0. 25 FIG. 12. Effects of pre-incubation of BMDc for 45 minutes at 30 ° C in 50 mM TRIS pH 7.5 and 100 mM KPi pH 7.0.
FIG. 13. Ensayos de DMOc con la enzima sedimentando una semana y almacenada a 4ºC en tampón TRIS (los dos ensayos de la izquierda; ensayos antes y después del almacenamiento, respectivamente) y tampón KPi (los dos ensayos de la derecha; ensayos antes y después del almacenamiento, respectivamente). FIG. 13. DMOc assays with the enzyme settling for one week and stored at 4 ° C in TRIS buffer (the two tests on the left; tests before and after storage, respectively) and KPi buffer (the two tests on the right; tests before and after of storage, respectively).
FIG. 14. Construcción del gen de la dicamba monooxigenasa modificado por ingeniería genética para la recombinación homóloga y expresión en cloroplastos de tabaco. FIG. 14. Construction of the genetically engineered dicamba monooxygenase gene for homologous recombination and expression in tobacco chloroplasts.
FIG. 15. Demostración del estado homoplástico de los genomas cloroplásticos de líneas de tabaco transgénicas transformadas con un gen DMO diseñado para la recombinación homóloga y expresión en cloroplastos de tabaco. El panel de la izquierda muestra una construcción para la integración de DMO en el cloroplasto por recombinación 35 homóloga (como se muestra en la FIG. 14). La barra por encima de la secuencia de direccionamiento izquierda se refiere a un fragmento de ADN amplificado para la reparación de la sonda de hibridación marcada con digoxigenina. Los paneles de la derecha muestran transferencias de ADN: El carril 1 contiene marcadores de tamaño. El carril 2 contiene ADN de plantas de tabaco no transgénicas. Los carriles 3-11 contienen ADN aislado de plantas transgénicas poco después de la primera ronda de selección y regeneración en presencia de espectinomicina (panel superior) y después de varias rondas de selección y regeneración cuando se obtuvo aparente homoplasticidad del genoma cloroplástico (panel inferior). El ADN para los análisis de transferencia de ADN se aisló de plantas transgénicas y no transgénicas y se sometió a digestión con enzimas de restricción con BamH I antes de la separación electroforética y el sondeo del ADN transferido con un fragmento de ADN marcado complementario a la "secuencia de direccionamiento izquierda" del vector de transformación del genoma cloroplástico (es decir, la sonda FIG. 15. Demonstration of the homoplastic state of the chloroplast genomes of transgenic tobacco lines transformed with a DMO gene designed for homologous recombination and expression in tobacco chloroplasts. The panel on the left shows a construction for the integration of BMD into the chloroplast by homologous recombination (as shown in FIG. 14). The bar above the left addressing sequence refers to an amplified DNA fragment for the repair of the hybridization probe labeled with digoxigenin. The panels on the right show DNA transfers: Lane 1 contains size markers. Lane 2 contains DNA from non-transgenic tobacco plants. Lanes 3-11 contain DNA isolated from transgenic plants shortly after the first round of selection and regeneration in the presence of spectinomycin (upper panel) and after several rounds of selection and regeneration when apparent homoplasticity of the chloroplast genome (lower panel) was obtained. . DNA for DNA transfer analysis was isolated from transgenic and non-transgenic plants and was digested with restriction enzymes with BamH I before electrophoretic separation and probing of the transferred DNA with a labeled DNA fragment complementary to the " left addressing sequence "of the chloroplast genome transformation vector (ie, the probe
45 de hibridación marcada con digoxigenina). La banda de ADN de 5,6 kb corresponde al fragmento de ADN del cloroplasto que contiene el gen DMO y la banda de 3,3 kb corresponde a la banda del cloroplasto nativo homólogo que carece de una construcción del gen DMO insertada. 45 of hybridization labeled with digoxigenin). The 5.6 kb DNA band corresponds to the chloroplast DNA fragment containing the DMO gene and the 3.3 kb band corresponds to the homologous native chloroplast band lacking an inserted DMO gene construct.
FIG. 16. Plantas de tabaco transgénicas homoplásticas de la generación T1 que contienen un gen de la dicamba monooxigenasa codificado en el cloroplasto tratadas con dicamba a un nivel de 28 kg/ha (las plantas 1-2 y las plantas 3-4 se obtuvieron de dos plantas R0 independientemente transformadas). FIG. 16. T1 generation homoplastic transgenic tobacco plants that contain a dicamba gene encoded in the chloroplast treated with dicamba at a level of 28 kg / ha (plants 1-2 and plants 3-4 were obtained from two independently transformed R0 plants).
FIG. 17. Expresión de DMO y sensibilidad y resistencia al tratamiento con dicamba en plantas de tabaco no transgénicas y transgénicas que contiene el gen DMO en el genoma cloroplástico. La transferencia de proteína se sondeó con anticuerpos contra DMO: El carril 1 contiene DMO purificada. El carril 2 es el blanco y el carril 3 contiene extractos proteicos de plantas de tabaco no transgénicas. Los carriles 4 y 8 contienen proteínas aisladas de plantas de tabaco "falso-positivas" que presentan resistencia a antibióticos durante la selección en espectinomicina, pero que carecen del gen DMO intacto. Los carriles 5-7 contienen extractos de plantas transgénicas que expresan DMO codificada por el gen DMO integrado en el genoma cloroplástico. S = plantas sensibles a dicamba a 0,56 kg/ha; R = plantas resistentes a dicamba a 5,6 kg/ha. Se cargaron cantidades casi iguales de los extractos en los carrilles 4-8 medidas por la cantidad de proteína de la subunidad grande de la Rubisco detectada con anticuerpos anti-Rubisco aunque se cargó significativamente más proteína de las plantas no transgénicas en el carril 3. La flecha indica la posición de la proteína DMO. FIG. 17. Expression of BMD and sensitivity and resistance to dicamba treatment in non-transgenic and transgenic tobacco plants that contain the BMD gene in the chloroplast genome. The protein transfer was probed with antibodies against BMD: Lane 1 contains purified BMD. Lane 2 is white and lane 3 contains protein extracts from non-transgenic tobacco plants. Lanes 4 and 8 contain proteins isolated from "false-positive" tobacco plants that exhibit antibiotic resistance during spectinomycin selection, but lack the intact BMD gene. Lanes 5-7 contain extracts of transgenic plants that express BMD encoded by the BMD gene integrated into the chloroplast genome. S = dicamba sensitive plants at 0.56 kg / ha; R = dicamba resistant plants at 5.6 kg / ha. Almost equal amounts of the extracts were loaded in lanes 4-8 measured by the amount of protein from the large subunit of Rubisco detected with anti-Rubisco antibodies although significantly more protein was loaded from non-transgenic plants in lane 3. The arrow indicates the position of the BMD protein.
FIG. 18. Comparación de una parte de la secuencia polipeptídica de DMO de tipo silvestre con regiones conservadas de otras oxigenasas de hierro-azufre que muestra que la DMO es única, con baja identidad con enzimas conocidas, pero W112 (flecha) está conservada en otras oxigenasas de hierro-azufre y está unida por dos dominios conservados, Rieske y Fe no hemo (SEC ID Nº 4-23). FIG. 18. Comparison of a part of the wild-type BMD polypeptide sequence with conserved regions of other iron-sulfur oxygenases showing that BMD is unique, with low identity with known enzymes, but W112 (arrow) is conserved in other oxygenases of iron-sulfur and is joined by two conserved domains, Rieske and Fe no heme (SEQ ID NO: 4-23).
Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention
La invención proporciona variantes de dicamba monooxigenasa (DMO) que comprenden una cisteína en una posición correspondiente a la posición 112 de la DMO mostrada en SEC ID Nº 1, denominada en este documento DMOc. Se demostró que DMOc produce un elevado nivel de tolerancia al herbicida dicamba cuando se expresa en plantas transgénicas. Los resultados fueron sorprendentes ya que la posición alterada del aminoácido está muy conservada en otras oxigenasas de hierro-azufre. De 78 secuencias de oxigenasa de hierro-azufre analizadas de 45 especies, las 52 secuencias de oxigenasa con al menos un 15% de identidad tenían un W correspondiente a la posición del aminoácido 112 de la SEC ID Nº 1, a pesar de la identidad total más alta de solamente el 38%. Esta posición también está unida por dos dominios funcionales conservados (FIG. 18). La DMOc de elevado nivel de tolerancia a herbicidas por tanto fue inesperada. The invention provides variants of dicamba monooxygenase (BMD) comprising a cysteine in a position corresponding to position 112 of the BMD shown in SEQ ID NO: 1, referred to herein as DMOc. It was shown that DMOc produces a high level of tolerance to the herbicide dicamba when expressed in transgenic plants. The results were surprising since the altered position of the amino acid is highly conserved in other iron-sulfur oxygenases. Of 78 iron-sulfur oxygenase sequences analyzed from 45 species, the 52 oxygenase sequences with at least 15% identity had a W corresponding to the position of amino acid 112 of SEQ ID No. 1, despite the total identity higher than only 38%. This position is also linked by two conserved functional domains (FIG. 18). The high level BMD of herbicide tolerance was therefore unexpected.
El análisis de los parámetros de Michaelis-Menten para DMOc con relación a la secuencia no alterada (DMOw; patente de Estados Unidos Nº 7.022.896) revelo que las enzimas eran diferentes en términos de eficacias catalíticas: DMOc era cinco veces más eficaz que DMOw y DMOc parecía tener una tasa de renovación mayor y una unión más fuerte al sustrato. Además, DMOc funcionaba mejor a condiciones de pH inferiores y mayor temperatura con relación a la enzima nativa. Estos resultados indicaron el potencial de seleccionar variantes de DMO para su uso en una planta transgénica particular en base a condiciones esperadas de uso, tales como condiciones de crecimiento de cultivos. Un aspecto de la invención, por lo tanto, implica identificar un entorno candidato de crecimiento de cultivos para al menos una primera especie de cultivo, e identificar la enzima DMO más adecuada para ese entorno en base a la cinética, por ejemplo de DMOc y DMOw. Por ejemplo, un especialista en la técnica puede, en realizaciones particulares, seleccionar una secuencia codificante de DMOc para su uso en plantas que presentan condiciones de pH inferiores in planta y/o en el caso de entornos de cultivo con mayores temperaturas con relación a otras especies vegetales o entornos de cultivo, respectivamente. El dicamba puede aplicarse por incorporación en la tierra (incorporación previa a la planta); pulverizando la tierra (pre-afloramiento); y sobre la parte superior de las plantas (tratamiento post-afloramiento), aunque los niveles de tolerancia a dicamba pueden diferir en diversos momentos durante el crecimiento de la planta. The analysis of Michaelis-Menten parameters for DMOc in relation to the unaltered sequence (DMOw; US Patent No. 7,022,896) revealed that enzymes were different in terms of catalytic efficiencies: DMOc was five times more effective than DMOw and DMOc seemed to have a higher renewal rate and a stronger bond to the substrate. In addition, DMOc worked better at lower pH conditions and higher temperature relative to the native enzyme. These results indicated the potential to select BMD variants for use in a particular transgenic plant based on expected conditions of use, such as crop growth conditions. One aspect of the invention, therefore, involves identifying a candidate crop growth environment for at least a first crop species, and identifying the most suitable BMD enzyme for that environment based on kinetics, for example DMOc and DMOw . For example, a person skilled in the art can, in particular embodiments, select a DMOc coding sequence for use in plants that have lower pH conditions in plant and / or in the case of culture environments with higher temperatures relative to others. plant species or cultivation environments, respectively. The dicamba can be applied by incorporation into the soil (prior incorporation to the plant); pulverizing the earth (pre-outcrop); and on the upper part of the plants (post-outcrop treatment), although the levels of tolerance to dicamba may differ at various times during plant growth.
Como se ha indicado anteriormente, se obtuvo tolerancia a niveles extremadamente altos del herbicida dicamba en plantas transgénicas que expresaban DMOc. En el tabaco, por ejemplo, que normalmente es sensible incluso a niveles muy bajos de dicamba, se crearon plantas transgénicas que expresaban DMOc que eran tolerantes al tratamiento con dicamba a 5,6 kg/ha o más, por ejemplo, 10-20 veces más que las tasas de aplicación en el campo normalmente recomendadas para el control de malas hierbas latifoliadas. Cuando se insertaba el gen DMOc en el genoma cloroplástico de plantas de tabaco, se obtenía una tolerancia a dicamba a al menos 28 kg/ha. También se crearon plantas transgénicas de soja, tomate y Arabidopsis thaliana que albergaban un gen DMOc codificado en el núcleo y se halló que eran tolerantes a elevados niveles de dicamba. Por ejemplo, la inserción de DMOc en el genoma nuclear de plantas de soja produjo tolerancia a tratamientos de 2,8 kg/ha, permitiendo de este modo el uso de dicamba para controlar las malas hierbas en campos de plantas que expresan DMOc. As indicated above, tolerance to extremely high levels of the dicamba herbicide was obtained in transgenic plants expressing DMOc. In tobacco, for example, which is normally sensitive even at very low levels of dicamba, transgenic plants that expressed BMDs were created that were tolerant to dicamba treatment at 5.6 kg / ha or more, for example, 10-20 times more than the rates of application in the field normally recommended for the control of broadleaf weeds. When the DMOc gene was inserted into the chloroplast genome of tobacco plants, a tolerance to dicamba was obtained at least 28 kg / ha. Transgenic soybean, tomato and Arabidopsis thaliana plants were also created that harbored a DMOc gene encoded in the nucleus and were found to be tolerant at high levels of dicamba. For example, the insertion of DMOc in the nuclear genome of soybean plants produced tolerance to treatments of 2.8 kg / ha, thus allowing the use of dicamba to control weeds in plant fields expressing DMOc.
Por tanto se ha demostrado que DMOc es eficaz para conferir tolerancia a dicamba sin la necesidad de secuencias codificantes adicionales tales como P. maltophilia, cepa DI-6, ferredoxina o reductasa. El gen DMO modificado se heredaba de forma estable como un gen mendeliano sin pérdida aparente de la penetrancia o expresión. Aunque se obtuvo una expresión algo más fuerte con un péptido de tránsito de cloroplastos, las plantas transgénicas con un transgén DMO que carece de la secuencia codificante del péptido de tránsito también mostraban un elevado nivel de tolerancia a dicamba post-afloramiento. Therefore it has been shown that DMOc is effective in conferring tolerance to dicamba without the need for additional coding sequences such as P. maltophilia, strain DI-6, ferredoxin or reductase. The modified BMD gene was stably inherited as a Mendelian gene with no apparent loss of penetrance or expression. Although somewhat stronger expression was obtained with a chloroplast transit peptide, transgenic plants with a DMO transgene lacking the transit peptide coding sequence also showed a high level of tolerance to post-outcrops dicamba.
A. Ácidos nucleicos y construcciones recombinantes A. Nucleic acids and recombinant constructs
1. Dicamba monooxigenasa (DMO) 1. Dicamba monooxygenase (BMD)
En una realización de la presente invención, se proporcionan construcciones de ADN que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de dicamba monooxigenasa que comprende una cisteína en una posición correspondiente a la posición 112 de la SEC ID Nº 1. En este documento se proporciona una secuencia codificante de DMO ejemplar como SEC ID Nº 2. Esta secuencia, además de comprender cisteína en la posición 112 de la SEC ID Nº 1, incluía la adición de un codón GCC (alanina) después del codón de inicio ATG para añadir un sitio de restricción Nco I con relación a la secuencia codificante nativa y para facilitar la clonación. El polipéptido de la SEC ID Nº 1, por lo tanto, también incluía un resto de Ala adicional inmediatamente después de la Met codificada por el codón de inicio. La secuencia peptídico de tránsito se escindió del plásmido con Bgl II y EcoR I y después se clonó en los sitios BamH I y EcoR I del vector pBluescript II KS+. Esta construcción se usó como molde en una reacción de PCR con cebadores que añadían sitios de restricción Nco I en cada extremo de la secuencia codificante del péptido de tránsito. La digestión del producto de PCR con Nco I permitió la inserción de la secuencia codificante del péptido de tránsito en el sitio del codón de inicio ATG del gen DMO modificado. In one embodiment of the present invention, DNA constructs comprising a nucleic acid encoding a dicamba monooxygenase polypeptide comprising a cysteine at a position corresponding to position 112 of SEQ ID NO: 1 are provided. Exemplary BMD coding sequence as SEQ ID NO. 2. This sequence, in addition to comprising cysteine at position 112 of SEQ ID NO. 1, included the addition of a GCC codon (alanine) after the ATG start codon to add a site of Nco I restriction in relation to the native coding sequence and to facilitate cloning. The polypeptide of SEQ ID No. 1, therefore, also included an additional Ala residue immediately after the Met encoded by the start codon. The transit peptide sequence was cleaved from the plasmid with Bgl II and EcoR I and then cloned into the BamH I and EcoR I sites of the pBluescript II KS + vector. This construct was used as a template in a PCR reaction with primers that added Nco I restriction sites at each end of the transit peptide coding sequence. Digestion of the PCR product with Nco I allowed the insertion of the coding sequence of the transit peptide into the ATG start codon site of the modified DMO gene.
Por tanto, en una realización de la invención, se proporcionan secuencias que codifican el polipéptido de la SEC ID Nº 1 incluyendo, aunque sin limitación, la SEC ID Nº 2. Como es bien sabido en la técnica, pueden prepararse y usarse fácilmente secuencias homólogas y derivados de estas secuencias. Por ejemplo, puede usarse un ácido nucleico que codifica un polipéptido DMO que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con el polipéptido DMOc de la SEC ID Nº 1, incluyendo una identidad de al menos aproximadamente el 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con dichas secuencias. También puede usarse un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de ácido nucleico proporcionada como SEC ID Nº 2, incluyendo una identidad de al menos aproximadamente el 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con dicha secuencia y que codifica una DMO que comprende una cisteína en la posición 112. En una realización, la identidad de secuencia se determina usando el paquete de software Sequence Analysis del GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) con parámetros por defecto. Dicho software aparea secuencias similares asignando grados de similitud o identidad. Thus, in one embodiment of the invention, sequences encoding the polypeptide of SEQ ID No. 1 are provided including, but not limited to, SEQ ID No. 2. As is well known in the art, homologous sequences can be easily prepared and used. and derivatives of these sequences. For example, a nucleic acid encoding a DMO polypeptide having a sequence identity of at least 90% can be used with the DMOc polypeptide of SEQ ID NO: 1, including an identity of at least about 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more with said sequences. A nucleic acid that shows a sequence identity of at least 90% can also be used with the nucleic acid sequence provided as SEQ ID NO: 2, including an identity of at least about 92%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% or more with said sequence and encoding a BMD comprising a cysteine at position 112. In one embodiment, the sequence identity is determined using the Sequence Analysis software package of the GCG Wisconsin Package ( Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) with default parameters. Said software matches similar sequences by assigning degrees of similarity or identity.
Puede obtenerse una molécula polinucleotídica que expresa un polipéptido DMO por técnicas bien conocidas en la técnica en vista de la presente descripción. Por tanto pueden prepararse variantes de DMO proporcionadas en este documento que tienen la capacidad de degradar el dicamba y ensayarse para su actividad de acuerdo con la metodología descrita en este documento. Dichas secuencias también pueden identificarse, por ejemplo, a partir de organismos adecuados incluyendo bacterias que degradan el dicamba (patente de Estados Unidos Nº 5.445.962; Krueger y col., 1989; Cork y Krueger, 1991; Cork y Khalil, 1995). Un medio para aislar una secuencia de DMO clonada es por hibridación de ácido nucleico, por ejemplo, con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o por RT-PCR usando ARNm del organismo fuente y cebadores basados en la DMO descrita. La invención, por lo tanto, abarca el uso de ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia codificante de DMO descrita en este documento. Un especialista en la técnica entiende que las condiciones pueden volverse menos rigurosas aumentando la concentración salina y disminuyendo la temperatura. Por tanto, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y por tanto generalmente será el procedimiento de elección dependiendo de los resultados deseados. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad es 5X SSC, formamida al 50% y 42ºC. Realizando un lavado en estas condiciones, por ejemplo, durante 10 minutos, pueden eliminarse aquellas secuencias que no hibridan con una secuencia diana particular en estas condiciones. Una realización de la invención, por tanto, comprende el uso de un ácido nucleico codificante de DMO que se define como hibridante en condiciones de lavado de 5X SSC, formamida al 50% y 42ºC durante 10 minutos con un ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº 2. A polynucleotide molecule expressing a DMO polypeptide can be obtained by techniques well known in the art in view of the present description. Therefore, BMD variants provided in this document can be prepared that have the ability to degrade the dicamba and be tested for activity according to the methodology described in this document. Such sequences can also be identified, for example, from suitable organisms including bacteria that degrade the dicamba (US Patent No. 5,445,962; Krueger et al., 1989; Cork and Krueger, 1991; Cork and Khalil, 1995). One means of isolating a cloned BMD sequence is by nucleic acid hybridization, for example, with a library constructed from the source organism, or by RT-PCR using mRNA from the source organism and primers based on the BMD described. The invention, therefore, encompasses the use of nucleic acids that hybridize under stringent conditions with a BMD coding sequence described herein. One skilled in the art understands that conditions can become less stringent by increasing the salt concentration and lowering the temperature. Therefore, hybridization conditions can be easily manipulated, and therefore will generally be the procedure of choice depending on the desired results. An example of high stringency conditions is 5X SSC, 50% formamide and 42 ° C. By washing under these conditions, for example, for 10 minutes, those sequences that do not hybridize with a particular target sequence under these conditions can be removed. An embodiment of the invention, therefore, comprises the use of a BMD-encoding nucleic acid that is defined as a hybridizer under 5X SSC wash conditions, 50% formamide and 42 ° C for 10 minutes with a nucleic acid according to SEC. ID No. 2.
Las variantes también pueden sintetizarse químicamente usando las secuencia polinucleotídicas de DMO descritas en este documento de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden sintetizarse secuencias de ADN por química de fosforamidita en un sintetizador automatizado de ADN. La síntesis química tiene varias ventajas. En particular, la síntesis química es deseable porque pueden usarse los codones preferidos por el huésped en el que se expresará la secuencia de ADN para optimizar la expresión. Un ejemplo de dicha secuencia que se optimizó para su expresión en dicotiledóneas usando el uso de codones de Arabidopsis thaliana es la secuencia de DMO mostrada en la SEC ID Nº 3. El polipéptido, que se ha predicho que tendrá una Ala, Thr, Cys en las posiciones 2, 3, 112, respectivamente, se da en la SEC ID Nº 1. El resto de Ala en la posición 2 se añadió con relación a la DMO de tipo silvestre como resultado de la adición de un codón para alanina inmediatamente después del codón de inicio ATG para simplificar la construcción de vector, como se explica a continuación. Variants can also be chemically synthesized using the BMD polynucleotide sequences described herein in accordance with techniques well known in the art. For example, DNA sequences can be synthesized by phosphoramidite chemistry in an automated DNA synthesizer. Chemical synthesis has several advantages. In particular, chemical synthesis is desirable because the codons preferred by the host in which the DNA sequence will be expressed to optimize expression can be used. An example of such a sequence that was optimized for dichotyledonous expression using the codons of Arabidopsis thaliana is the BMD sequence shown in SEQ ID NO. 3. The polypeptide, which has been predicted to have an Ala, Thr, Cys in Positions 2, 3, 112, respectively, are given in SEQ ID No. 1. The remaining Ala in position 2 was added relative to the wild type BMD as a result of the addition of a codon for alanine immediately after ATG start codon to simplify vector construction, as explained below.
No todos los codones tienen que alterarse para obtener una expresión mejorada, pero preferiblemente se cambian al menos los codones usados pocas veces en el huésped por los codones preferidos por el huésped, por ejemplo, codones usados más frecuentemente en el huésped y que generalmente se traducen más fácilmente que los codones raros no preferidos. Pueden obtenerse elevados niveles de expresión cambiando más de aproximadamente el 50%, mucho más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, de los codones no proferidos por los codones preferidos por el huésped. Se conocen las preferencias de codón de muchas células huésped (documentos PCT WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494; y las patentes de Estados Unidos Nº 5.689.052; 5.567.862; 5.567.600; 5.552.299 y 5.017.692). Las preferencias de codón de otras células huésped pueden deducirse por procedimientos conocidos en la técnica. Además, usando síntesis química, pueden cambiarse fácilmente la secuencia de la molécula de ADN o su proteína codificada para, por ejemplo, optimizar su expresión (por ejemplo, eliminar las estructuras secundarias de ARNm que interfieren con la transcripción o traducción), añadir sitios de restricción únicos en puntos adecuados, y eliminar sitios de escisión por proteasa. Not all codons have to be altered to obtain an improved expression, but preferably at least the codons rarely used in the host are changed to the codons preferred by the host, for example, codons most frequently used in the host and generally translated more easily than rare non-preferred codons. High levels of expression can be obtained by changing more than about 50%, much more preferably at least about 80%, of the codons not delivered by the codons preferred by the host. The codon preferences of many host cells are known (PCT documents WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494; and U.S. Patent Nos. 5,689,052; 5,567,862; 5,567,600; 5,552 .299 and 5,017,692). Codon preferences of other host cells can be deduced by methods known in the art. In addition, using chemical synthesis, the sequence of the DNA molecule or its encoded protein can be easily changed to, for example, optimize its expression (for example, eliminate secondary mRNA structures that interfere with transcription or translation), add sites of unique restriction at appropriate points, and eliminate protease cleavage sites.
Pueden hacerse modificaciones y cambios en la secuencia polipeptídica de una proteína tal como las secuencias de DMO proporcionadas en este documento reteniendo al mismo tiempo la actividad enzimática. Lo siguiente es un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear un polipéptido equivalente, o incluso uno modificado, mejorado y secuencias codificantes correspondientes. En realizaciones particulares de la invención, las secuencias de DMO pueden alterarse de este modo y usarse en los procedimientos de la invención. Los cambios de aminoácidos pueden conseguirse cambiando los codones de la secuencia de ADN. Modifications and changes in the polypeptide sequence of a protein such as the BMD sequences provided herein can be made while retaining enzymatic activity. The following is an analysis based on changing the amino acids of a protein to create an equivalent polypeptide, or even a modified, improved and corresponding coding sequences. In particular embodiments of the invention, BMD sequences can be altered in this way and used in the methods of the invention. Amino acid changes can be achieved by changing the codons of the DNA sequence.
Se sabe, por ejemplo, que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como sitios de unión en las moléculas sustrato. Como es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una secuencia proteica y, por supuesto, la secuencia codificante de ADN subyacente, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto se contempla que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias peptídicas de DMO descritas en este documento y las secuencias codificantes de ADN correspondientes sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. It is known, for example, that certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure without appreciable loss of interactive binding capacity with structures such as binding sites in the substrate molecules. As it is the interactive capacity and the nature of a protein that defines the biological functional activity of that protein, certain substitutions can be made in the amino acid sequence of a protein sequence and, of course, the underlying DNA coding sequence, and nevertheless Get a protein with similar properties. Therefore it is contemplated that various changes can be made in the BMD peptide sequences described herein and the corresponding DNA coding sequences without appreciable loss of their usefulness or biological activity.
Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína está generalmente comprendida en la técnica (Kyte y col., 1982). Se aprecia que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. Cada aminoácido tiene un índice hidropático asignado en base a sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y col., 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). In making such changes, the hydropathic index of amino acids can be considered. The importance of the hydropathic index of amino acids to confer interactive biological function in a protein is generally understood in the art (Kyte et al., 1982). It is appreciated that the relative hydropathic character of the amino acid contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of the protein with other molecules, for example, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, and the like. . Each amino acid has a hydropathic index assigned based on its hydrophobicity and charge characteristics (Kyte et al., 1982), these are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); Alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
En la técnica se sabe que los aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o valor hidropático similar y aún producir una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ±2, aquellos que están en ±1 son particularmente preferidos, y aquellos en ±0,5 son incluso más particularmente preferidos. Por tanto, la observación de que una DMO que tenía una sustitución de un triptófano en la posición 112 con cisteína tenía actividad biológica y producía plantas tolerantes a elevados niveles de dicamba, fue sorprendente dados los diferentes índices hidropáticos entre los aminoácidos nativos y alterados y por tanto los especialistas en la técnica no la usarían para crear variantes funcionales de acuerdo con la técnica previa. It is known in the art that amino acids can be substituted for other amino acids that have a similar hydropathic index or value and still produce a protein with similar biological activity, that is, still obtain a functionally equivalent biological protein. In making such changes, the substitution of amino acids whose hydropathic indices are in ± 2, those in ± 1 are particularly preferred, and those in ± 0.5 are even more particularly preferred. Therefore, the observation that a BMD that had a substitution of a tryptophan at position 112 with cysteine had biological activity and produced tolerant plants at high levels of dicamba, was surprising given the different hydropathic indices between native and altered amino acids and by both those skilled in the art would not use it to create functional variants according to the prior art.
En la técnica también se comprende que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de forma eficaz en base a la hidrofilicidad. La patente de Estados Unidos 4.554.101 indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, controlada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los restos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están en ±2, aquellos que están en ±1 son particularmente preferidos, y aquellos en ±0,5 son incluso más particularmente preferidos. Las sustituciones ejemplares que toman estas características y diversas características anteriores en consideración son bien conocidas para los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. De nuevo, la actividad de DMOc fue sorprendente dados los valores de hidrofilicidad tan diferentes entre los aminoácidos alterados y nativos y los especialistas en la técnica no usarían esta sustitución para crear variantes funcionales de acuerdo con la técnica previa. It is also understood in the art that the substitution of similar amino acids can be done efficiently based on hydrophilicity. US Patent 4,554,101 indicates that the higher average local hydrophilicity of a protein, controlled by the hydrophilicity of its adjacent amino acids, correlates with a biological property of the protein. As detailed in US Patent 4,554,101, the following hydrophilicity values have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartate (+3.0 ± 1); glutamate (+3.0 ± 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline (-0.5 ± 1); Alanine (0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity value and still obtain a biologically equivalent protein. In such changes, the substitution of amino acids whose hydrophilicity values are within ± 2 is preferred, those that are within ± 1 are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more particularly preferred. Exemplary substitutions that take these characteristics and various previous characteristics into consideration are well known to those skilled in the art and include: arginine and lysine; glutamate and aspartate; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine and isoleucine. Again, the activity of DMOc was surprising given the hydrophilicity values so different between the altered and native amino acids and those skilled in the art would not use this substitution to create functional variants according to the prior art.
La modificación de una secuencia de DMO de acuerdo con la invención puede estar guiada por la consideración de los dominios conservados dentro de la enzima. Por ejemplo, a continuación se demuestra que la enzima DMO contiene dominios funcionales tales como un grupo de Rieske hierro-azufre y un sitio de unión para hierro libre (véase la FIG. 18, por ejemplo). Esta información, combinada con el conocimiento en la técnica respecto a los dominios funcionales y la modificación de proteínas, generalmente puede usarse, por lo tanto, para generar enzimas DMO modificadas manteniendo al mismo tiempo la actividad enzimática dentro del alcance de la invención (véase, por ejemplo, Mason y Cammack, 1992; Jiang y col., 1996). The modification of a BMD sequence according to the invention can be guided by the consideration of the domains conserved within the enzyme. For example, it is shown below that the DMO enzyme contains functional domains such as a group of Rieske iron-sulfur and a binding site for free iron (see FIG. 18, for example). This information, combined with knowledge in the art regarding functional domains and protein modification, can generally be used, therefore, to generate modified BMD enzymes while maintaining enzymatic activity within the scope of the invention (see, for example, Mason and Cammack, 1992; Jiang et al., 1996).
Un polinucleótido codificante de DMO usado de acuerdo con la invención típicamente se introducirá en una célula como una construcción que comprende elementos de control de la expresión necesarios para la expresión eficaz. Los procedimientos para unir de forma funcional elementos de control de la expresión a secuencia codificantes son bien conocidos en la técnica (Maniatis y col., 1982; Sambrook y col., 1989). Las secuencias de control de la expresión son secuencias de ADN implicadas de cualquier modo en el control de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión adecuados y los procedimientos para usarlas son bien conocidos en la técnica. Puede usarse un promotor en particular, con o sin elementos potenciadores, una región 5' no traducida, péptidos de tránsito o señal para el direccionamiento de una proteína o producto de ARN a un orgánulo vegetal, particularmente a un cloroplasto y regiones 3' no traducidas tales como sitios de poliadenilación. Un especialista en la técnica sabrá que son útiles diversos potenciadores, promotores, intrones, péptidos de tránsito, secuencias señal de direccionamiento, y regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) en el diseño de vectores de expresión en plantas eficaces, tales como los divulgados, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2003/01403641. A DMO coding polynucleotide used in accordance with the invention will typically be introduced into a cell as a construct comprising expression control elements necessary for effective expression. Methods for functionally linking expression control elements to coding sequences are well known in the art (Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989). Expression control sequences are DNA sequences involved in any way in the control of transcription. Suitable expression control sequences and methods for using them are well known in the art. A particular promoter can be used, with or without enhancer elements, a 5 'untranslated region, transit peptides or signal for the targeting of a protein or RNA product to a plant organelle, particularly to a chloroplast and 3' untranslated regions such as polyadenylation sites. A person skilled in the art will know that various enhancers, promoters, introns, transit peptides, signaling targeting sequences, and 5 'and 3' untranslated regions (UTR) are useful in the design of expression vectors in effective plants, such as those disclosed, for example, in U.S. Patent Application Publication 2003/01403641.
Los promotores adecuados para el presente uso y otros usos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos que describen dichos promotores incluyen la patente de Estados Unidos 6.437.217 (promotor del maíz RS81), la patente de Estados Unidos 5.641.876 (promotor de la actina del arroz), la patente de Estados Unidos 6.426.446 (promotor del maíz RS324), la patente de Estados Unidos 6.429.362 (promotor del maíz PR-1), la patente de Estados Unidos Promoters suitable for the present use and other uses are well known in the art. Examples describing such promoters include U.S. Patent 6,437,217 (RS81 Corn Promoter), U.S. Patent 5,641,876 (Rice Actin Promoter), U.S. Patent 6,426,446 (Promoter RS324 corn), U.S. Patent 6,429,362 (PR-1 Corn Promoter), U.S. Patent
6.232.526 (promotor del maíz A3), la patente de Estados Unidos 6.177.611 (promotores constitutivos del maíz), las patentes de Estados Unidos 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 y 5.530.196 (promotor 35S), la patente de Estados Unidos 6.433.252 (promotor de la oleosina L3 del maíz), la patente de Estados Unidos 6.429.357 (el promotor de la actina 2 del arroz así como el intrón de la actina 2 del arroz), la patente de Estados Unidos 5.837.848 (promotor específico de la raíz), la patente de Estados Unidos 6.294.714 (promotores inducibles por la luz), la patente de Estados Unidos 6.140.078 (promotores inducibles por sales), la patente de Estados Unidos 6.252.138 (promotores inducibles por patógenos), la patente de Estados Unidos 6.175.060 (promotores inducibles por la deficiencia de fósforo), la patente de Estados Unidos 6.635.806 (el promotor de la gamma-coixina), y la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de serie 09/757.089 (promotor de la aldolasa de cloroplastos del maíz). Promotores adicionales que pueden encontrar uso son un promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert y col., 1987), el promotor de la octopina sintasa (OCS) (que lo portan plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton y col., 1987), el promotor 35S de CaMV (Odell y col., 1985), el promotor 35S del virus del mosaico del higo (Walker y col., 1987), el promotor de la sacarosa sintasa (Yang y col., 1990), el promotor del complejo génico R (Chandler y col., 1989), y el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/b, etc. Pueden ser particularmente beneficiosos para su uso con la presente invención el promotor CaMV35S (patentes de Estados Unidos Nº 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; y 5.530.196), un promotor FMV35S (patentes de Estados Unidos 6.051.753; 5.378.619), PC1SV (por ejemplo, patente de Estados Unidos 5.850.019, y la SEC ID Nº 24), y promotores AGRtu.nos (acceso a GenBank V00087; Depicker y col., 1982; Bevan y col., 1983). 6,232,526 (A3 corn promoter), United States patent 6,177,611 (corn constitutive promoters), United States patents 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 and 5,530,196 (35S promoter), United States Patent 6,433,252 (L3 oleosin promoter of corn), United States Patent 6,429,357 (rice actin 2 promoter as well as rice actin 2 intron), patent United States 5,837,848 (specific root promoter), United States patent 6,294,714 (light inducible promoters), United States patent 6,140,078 (salt inducible promoters), United States patent 6,252 .138 (pathogen-inducible promoters), U.S. 6,175,060 (phosphorus deficiency-inducible), U.S. 6,635,806 (the gamma-coixin promoter), and patent application United States Serial No. 09 / 757,089 (corn chloroplast aldolase promoter). Additional promoters that may find use are a nopaline synthase (NOS) promoter (Ebert et al., 1987), the octopine synthase (OCS) promoter (which is carried by tumor inducing plasmids of Agrobacterium tumefaciens), promoters of caulimovirus such as the 19S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) (Lawton et al., 1987), the 35S promoter of CaMV (Odell et al., 1985), the 35S promoter of the fig mosaic virus (Walker and col., 1987), the sucrose synthase promoter (Yang et al., 1990), the R gene complex promoter (Chandler et al., 1989), and the chlorophyll-binding protein gene promoter a / b, etc. The CaMV35S promoter (US Pat. Nos. 5,322,938; 5,352,605; 5,359,142; and 5,530,196), an FMV35S promoter (United States patents 6,051,753; can be particularly beneficial for use with the present invention. 5,378,619), PC1SV (e.g., U.S. Patent 5,850,019, and SEQ ID No. 24), and AGRtu.nos promoters (access to GenBank V00087; Depicker et al., 1982; Bevan et al., 1983 ).
Puede obtenerse beneficio para la expresión de genes heterólogos por el uso de una secuencia que codifica un péptido de tránsito. Los péptidos de tránsito generalmente se refieren a moléculas peptídicas que cuando se unen a una proteína de interés dirigen la proteína a un tejido, célula, localización subcelular, u orgánulo celular particular. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, péptidos de tránsito de cloroplastos, señales de direccionamiento nuclear, y señales vacuolares. Un péptido de tránsito de cloroplastos es de particular utilidad en la presente invención para dirigir la expresión de una enzima DMO a los cloroplastos. Se prevé que la función de la DMO estará facilitada por reductasas y ferredoxinas endógenas encontradas en las células vegetales para degradar el dicamba. Los cloroplastos vegetales son particularmente ricos en reductasas y ferredoxinas. Por consiguiente, en una realización preferida para la producción de plantas transgénicas tolerantes a dicamba, puede usarse una secuencia que codifica un péptido que dirigirá la oxigenasa degradante de dicamba al interior de los cloroplastos. Como alternativa o adicionalmente, la reductasa y/o ferredoxina endógena también puede expresarse en una célula. Benefit for the expression of heterologous genes can be obtained by the use of a sequence encoding a transit peptide. Transit peptides generally refer to peptide molecules that when bound to a protein of interest direct the protein to a particular tissue, cell, subcellular location, or cellular organelle. Examples include, but are not limited to, chloroplast transit peptides, nuclear targeting signals, and vacuolar signals. A chloroplast transit peptide is of particular utility in the present invention to direct the expression of a DMO enzyme to chloroplasts. It is expected that the function of BMD will be facilitated by endogenous reductases and ferredoxins found in plant cells to degrade the dicamba. Vegetable chloroplasts are particularly rich in reductases and ferredoxins. Accordingly, in a preferred embodiment for the production of dicamba-tolerant transgenic plants, a sequence encoding a peptide that will direct the degrading oxygenase of dicamba into the chloroplasts can be used. Alternatively or additionally, endogenous reductase and / or ferredoxin can also be expressed in a cell.
El ADN que codifica una secuencia de direccionamiento a cloroplastos puede colocarse preferiblemente cadena arriba (5') de una secuencia codificante de DMO, pero también puede colocarse cadena abajo (3') de la secuencia codificante, o tanto cadena arriba como cadena abajo de la secuencia codificante. Un péptido de tránsito de cloroplastos (CTP) en particular puede diseñarse para fusionarse al extremo N de proteínas que tienen que dirigirse al interior del cloroplasto vegetal. Muchas proteínas localizadas en los cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares en forma de precursores y se dirigen al cloroplasto por un CTP que se retira durante las etapas de importación. Los ejemplos de proteínas cloroplásticas incluyen la subunidad pequeña (RbcS2) de la ribulosa-1,5,bifosfato carboxilasa, la ferredoxina, la ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y proteína II del complejo de captación de luz, y la tiorredoxina F. Se ha demostrado in vivo e in vitro que proteínas no del cloroplasto pueden dirigirse al cloroplasto mediante el uso de fusiones de proteínas con un CTP y que un CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. Por ejemplo, se ha demostrado que la incorporación de un péptido de tránsito de cloroplastos adecuado tal como el CTP de EPSPS de Arabidopsis thaliana (Klee y col., 1987), y el CTP de EPSPS de Petunia hybrida (della-Cioppa y col., 1986) dirige secuencias heterólogas de la proteína EPSPS a cloroplastos en plantas transgénicas. Otras secuencias de direccionamiento a cloroplastos ejemplares incluyen la secuencia señal del maíz cab-m7 (Becker y col., 1992; documento PCT WO 97/41228) y la secuencia señal de la glutatión reductasa del guisante (Creissen y col., 1991; documento PCT WO 97/41228). En la presente invención, AtRbcS4 (CTP1; patente de Estados Unidos 5.728.925), AtShkG (CTP2; Klee y col., 1987), AtShkGZm (CTP2 sintético; véase la SEC ID Nº 14 del documento WO04009761), y PsRbcS (Coruzzi y col., 1984) pueden ser de beneficio particular, por ejemplo, con respecto a la expresión de un polipéptido DMO. The DNA encoding a chloroplast targeting sequence can preferably be placed upstream (5 ') of a BMD coding sequence, but can also be placed downstream (3') of the coding sequence, or both upstream and downstream of the sequence. coding sequence A particular chloroplast transit peptide (CTP) can be designed to fuse to the N-terminus of proteins that have to be directed into the plant chloroplast. Many proteins located in the chloroplasts are expressed from nuclear genes in the form of precursors and are directed to the chloroplast by a CTP that is removed during the import stages. Examples of chloroplastic proteins include the small subunit (RbcS2) of ribulose-1.5, carboxylase bisphosphate, ferredoxin, ferredoxin oxidoreductase, protein I and protein II of the light uptake complex, and thioredoxin F. demonstrated in vivo and in vitro that non-chloroplast proteins can be directed to the chloroplast through the use of protein fusions with a CTP and that a CTP is sufficient to direct a protein to the chloroplast. For example, it has been shown that the incorporation of a suitable chloroplast transit peptide such as the EPSPS CTP from Arabidopsis thaliana (Klee et al., 1987), and the EPSPS CTP from Petunia hybrida (della-Cioppa et al. , 1986) directs heterologous sequences of the EPSPS protein to chloroplasts in transgenic plants. Other exemplary chloroplast targeting sequences include the signal sequence of cab-m7 corn (Becker et al., 1992; PCT document WO 97/41228) and the signal sequence of glutathione reductase of the pea (Creissen et al., 1991; document PCT WO 97/41228). In the present invention, AtRbcS4 (CTP1; U.S. Patent 5,728,925), AtShkG (CTP2; Klee et al., 1987), AtShkGZm (synthetic CTP2; see SEQ ID No. 14 of WO04009761), and PsRbcS (Coruzzi et al., 1984) may be of particular benefit, for example, with respect to the expression of a DMO polypeptide.
Una 5' UTR que funciona como una secuencia líder de la traducción es un elemento genético de ADN localizado entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de la traducción está presente en el ARNm completamente procesado cadena arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de la traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario en ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficacia de traducción. Los ejemplos de secuencias líder de la traducción incluyen líderes de proteínas de choque térmico de maíz y petunia (patente de Estados Unidos Nº 5.362.865), líderes de proteínas de cubierta de virus de plantas, líderes de la rubisco vegetal entre otros (Turner y Foster, 1995). En la presente invención, las 5' UTR que pueden, en particular, encontrar beneficio, son GmHsp (patente de Estados Unidos 5.659.122), PhDnaK (patente de Estados Unidos 5.362.865), AtAnt1, TEV (Carrington y Freed, 1990), y AGRtunos (acceso a GenBank V00087; Bevan y col., 1983). A 5 'UTR that functions as a translational leader sequence is a genetic element of DNA located between the promoter sequence of a gene and the coding sequence. The leading translation sequence is present in the fully processed mRNA upstream of the translation initiation sequence. The leading translation sequence may affect the processing of the primary transcript in mRNA, mRNA stability or translation efficiency. Examples of translation leading sequences include corn and petunia heat shock protein leaders (U.S. Patent No. 5,362,865), plant virus cover protein leaders, plant rubisco leaders among others (Turner and Foster, 1995). In the present invention, the 5 'UTRs that may, in particular, find benefit, are GmHsp (U.S. Patent 5,659,122), PhDnaK (U.S. Patent 5,362,865), AtAnt1, TEV (Carrington and Freed, 1990 ), and AGRtunos (access to GenBank V00087; Bevan et al., 1983).
La secuencia 3' no traducida, la región de terminación de la transcripción 3', o la región de poliadenilación indican una molécula de ADN unida a y localizada cadena abajo de la región codificante de un gen e incluye polinucleótidos que proporcionan la señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la transcripción, el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación funciona en plantas causando la adición de nucleótidos de poliadenilato en el extremo 3' del precursor de ARNm. La secuencia de poliadenilación puede obtenerse del gen natural, de una diversidad de genes vegetales, o de genes ADN-T. Un ejemplo de una región de terminación de la transcripción 3' es la región 3' de la nopalina sintasa (nos 3'; Fraley y col., 1983). Se ha descrito el uso de diferentes regiones 3' no traducidas (Ingelbrecht y col., 1989). Las moléculas de poliadenilación de un gen RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi y col., 1984) y AGRtu.nos (Rojiyaa y col., 1987, acceso a Genbank E01312) en particular pueden ser beneficiosas para su uso con la invención. The 3 'untranslated sequence, the 3' transcription termination region, or the polyadenylation region indicates a DNA molecule attached to and located downstream of the coding region of a gene and includes polynucleotides that provide the polyadenylation signal and others. regulatory signals capable of affecting transcription, mRNA processing or gene expression. The polyadenylation signal works in plants causing the addition of polyadenylate nucleotides at the 3 'end of the mRNA precursor. The polyadenylation sequence can be obtained from the natural gene, from a variety of plant genes, or from DNA-T genes. An example of a 3 'transcription termination region is the 3' region of the nopaline synthase (nos 3 '; Fraley et al., 1983). The use of different 3 'untranslated regions has been described (Ingelbrecht et al., 1989). Polyadenylation molecules of a RbcS2 gene from Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984) and AGRtu.nos (Rojiyaa et al., 1987, access to Genbank E01312) in particular may be beneficial for use with the invention
Puede unirse una unidad de expresión de la molécula polinucleotídica codificante de DMO a una segunda molécula polinucleotídica en una unidad de expresión que contiene elementos genéticos para un marcador seleccionable/valorable o para un gen que confiere un rasgo deseado. Los genes habitualmente usados para explorar células supuestamente transformadas incluyen la -glucuronidasa (GUS), la -galactosidasa, la luciferasa, y la cloramfenicol acetiltransferasa (Jefferson, 1987; Teeri y col., 1989; Koncz y col., 1987; De Block y col., 1984), la proteína verde fluorescente (GFP) (Chalfie y col., 1994; Haseloff y col., 1995; y solicitud PCT WO 97/41228). An expression unit of the BMD-encoding polynucleotide molecule can be attached to a second polynucleotide molecule in an expression unit that contains genetic elements for a selectable / titratable marker or for a gene that confers a desired trait. Genes commonly used to explore supposedly transformed cells include -glucuronidase (GUS), -galactosidase, luciferase, and chloramphenicol acetyltransferase (Jefferson, 1987; Teeri et al., 1989; Koncz et al., 1987; De Block et al., 1984), the green fluorescent protein (GFP) (Chalfie et al., 1994; Haseloff et al., 1995; and PCT application WO 97/41228).
La segunda molécula polinucleotídica puede incluir, aunque sin limitación, un gene que actúa como marcador de selección. Un segundo gen o gen adicional puede proporcionar una característica deseable asociada con la morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo de la planta, la producción, la potenciación nutricional, la resistencia a enfermedades o plagas, o la tolerancia a entornos o compuestos químicos y puede incluir elementos genéticos que comprenden resistencia a herbicidas (patentes de Estados Unidos 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; 5.463.175), producción aumentada (patentes de Estados Unidos RE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; 5.716.837), control de insectos (patentes de Estados Unidos 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275; 5.763.245; 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (patentes de Estados Unidos 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316,407; 6.506.962), resistencia a virus (patentes de Estados Unidos 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; 5.304.730), resistencia a nematodos (patente de Estados Unidos 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de Estados Unidos 5.516.671), crecimiento y desarrollo de la planta (patentes de Estados Unidos 6.723.897; 6.518.488), producción de almidón (patentes de Estados Unidos 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción modificada de aceites (patentes de Estados Unidos 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), elevada producción de aceites (patentes de Estados Unidos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), contenido modificado de ácidos grasos (patentes de Estados Unidos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), elevada producción de proteínas (patente de Estados Unidos 6.380.466), maduración de los frutos (patente de Estados Unidos 5.512.466), nutrición animal y humana potenciada (patentes de Estados Unidos 6.723.837; 6.653.530; 6.541.259; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (patentes de Estados Unidos RE37.543; 6.228.623; 5.958.745 y publicación de patente de Estados Unidos Nº US20030028917), resistencia a estrés ambiental (patente de Estados Unidos 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (patentes de Estados Unidos 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorado (patente de Estados Unidos 6.476.295), digestibilidad mejorada (patente de Estados Unidos 6.531.648), bajo contenido en rafinosa (patente de Estados Unidos 6.166.292), producción de enzimas industriales (patente de Estados Unidos 5.543.576), aroma mejorado (patente de Estados Unidos 6.011.199), fijación de nitrógeno (patente de Estados Unidos 5.229.114), producción de semillas híbridas (patente de Estados Unidos 5.689.041), producción de fibra (patentes de Estados Unidos 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) y producción de biocombustible (patente de Estados Unidos 5.998.700). Cualquiera de estos u otros elementos genéticos, procedimientos, y transgenes pueden usarse con la invención como apreciarán los especialistas en la técnica en vista de la presente divulgación. The second polynucleotide molecule can include, but is not limited to, a gene that acts as a selection marker. An additional second gene or gene may provide a desirable characteristic associated with plant morphology, physiology, growth and development, production, nutritional enhancement, resistance to diseases or pests, or tolerance to chemical environments or compounds and may include genetic elements comprising resistance to herbicides (U.S. Patents 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175), production Increased (U.S. Patent RE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 5,716,837) , insect control (U.S. Patents 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,468,523; 6,326,351; 6,313 .378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 5,959,091; 5,942,664 ; 5,942,658, 5,880,275; 5,763 .245; 5,763,241), resistance to fungal diseases (US Patents 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 6,506,962), virus resistance (U.S. Patents 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304,730), nematode resistance (U.S. Patent 6,228,992) , resistance to bacterial diseases (U.S. Patent 5,516,671), plant growth and development (U.S. Patent 6,723,897; 6,518,488), starch production (U.S. Patent 6,538,181; 6,538,179 ; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), modified oil production (United States patents 6,444,876; 6,426,447; 6,380,462), high oil production (United States patents 6,495,739; 5,608 .149; 6,483,008; 6,476,295), modified fatty acid content (US Patents 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 6,459,018), high protein production (U.S. Patent 6,380,466), fruit ripening (U.S. Patent 5,512,466), animal nutrition and Enhanced Human (US Patents 6,723,837; 6,653,530; 6,541,259; 5,985,605; 6,171,640), biopolymers (U.S. Patent RE37,543; 6,228,623; 5,958,745 and U.S. Patent Publication No. US20030028917), environmental stress resistance (U.S. Patent 6,072,103), pharmaceutical peptides and secretable peptides (U.S. Patents 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560), improved processing features (U.S. Patent 6,476,295), improved digestibility (U.S. Patent 6,531,648), low raffinose content (United States patent 6,166,292), production of industrial enzymes (United States patent 5,543,576), improved aroma (United States patent 6,011,199), nitrogen fixation (United States patent 5,229. 114), hybrid seed production (U.S. Patent 5,689,041), fiber production (U.S. Patents 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 5,869,720) and biofuel production (U.S. patent 5,998,700). Any of these or other genetic elements, methods, and transgenes can be used with the invention as those skilled in the art will appreciate in view of the present disclosure.
Una unidad de expresión puede proporcionarse en forma de ADN-T entre las regiones del extremo de la derecha (RB) y el extremo de la izquierda (LB) de un primer plásmido junto con un segundo plásmido que porta las funciones de transferencia e integración del ADN-T en Agrobacterium. Las construcciones también pueden contener segmentos de ADN estructurales plasmídicos que proporcionan la función de replicación y la selección por antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación de amplio rango de huésped tal como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador de selección tal como Spec/Strp que codifica la aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador de selección por gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped a menudo es Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, o LBA4404. Sin embargo, otras cepas conocidas para los especialistas en la técnica de transformación de plantas pueden funcionar en la presente invención. An expression unit can be provided in the form of T-DNA between the regions of the right end (RB) and the left end (LB) of a first plasmid together with a second plasmid that carries the transfer and integration functions of the T-DNA in Agrobacterium. The constructs may also contain plasmid structural DNA segments that provide the replication function and antibiotic selection in bacterial cells, for example, an Escherichia coli replication origin such as ori322, a wide host range replication origin such as oriV or oriRi, and a coding region for a selection marker such as Spec / Strp encoding the aminoglycoside adenyltransferase (aadA) of Tn7 that confers resistance to spectinomycin or streptomycin, or a selection marker gene for gentamicin (Gm, Gent). For plant transformation, the host bacterial strain is often Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, or LBA4404. However, other strains known to those skilled in the art of plant transformation may function in the present invention.
La transformación de células vegetales puede conseguirse por cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para la introducción de transgenes en células (véase, por ejemplo, Miki y col., 1993). Los ejemplos de dichos procedimientos se cree que incluyen casi cualquier procedimiento por el que pueda introducirse ADN en una célula. Los procedimientos que se han descrito incluyen la electroporación como se ilustra en la patente de Estados Unidos Nº 5.384.253; el bombardeo con microproyectiles como se ilustra en las patentes de Estados Unidos Nº 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; y 6.403.865; la transformación mediada por Agrobacterium como se ilustra en las patentes de Estados Unidos Nº 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; y 6.384.301; y la transformación por protoplastos como se ilustra en la patente de Estados Unidos Nº 5.508.184. A través de la aplicación de técnicas como éstas, pueden transformarse de forma estable las células de casi cualquier especie de planta y seleccionarse de acuerdo con la invención y desarrollarse estas células en plantas transgénicas. The transformation of plant cells can be achieved by any of the techniques known in the art for the introduction of transgenes into cells (see, for example, Miki et al., 1993). Examples of such procedures are believed to include almost any procedure by which DNA can be introduced into a cell. The procedures that have been described include electroporation as illustrated in US Patent No. 5,384,253; bombardment with microprojectiles as illustrated in U.S. Patent Nos. 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; and 6,403,865; Agrobacterium-mediated transformation as illustrated in U.S. Patent Nos. 5,635,055; 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840; and 6,384,301; and transformation by protoplasts as illustrated in U.S. Patent No. 5,508,184. Through the application of techniques such as these, the cells of almost any plant species can be stably transformed and selected according to the invention and these cells developed in transgenic plants.
El procedimiento más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (por ejemplo, Horsch y col., 1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de la tierra patogénicas para las plantas que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformación genética de la planta (por ejemplo, Kado, 1991). Se proporcionan descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y procedimientos para la transferencia génica mediada por Agrobacterium en numerosas referencias, incluyendo Miki y col., supra, Moloney y col., 1989, y las patentes de Estados Unidos Nº 4.940.838 y The most widely used procedure to introduce an expression vector into plants is based on the Agrobacterium natural transformation system (for example, Horsch et al., 1985). A. tumefaciens and A. rhizogenes are pathogenic earth bacteria for plants that genetically transform plant cells. The Ti and Ri plasmids of A. tumefaciens and A. rhizogenes, respectively, carry genes responsible for the genetic transformation of the plant (eg, Kado, 1991). Descriptions of Agrobacterium vector systems and procedures for Agrobacterium-mediated gene transfer are provided in numerous references, including Miki et al., Supra, Moloney et al., 1989, and U.S. Patent Nos. 4,940,838 and
5.464.763. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium, y Mesorhizobium que interaccionan con plantas naturalmente pueden modificarse para que medien la transferencia génica a varias plantas diversas. Estas bacterias simbióticas asociadas con plantas pueden hacerse competentes para la transferencia génica por la adquisición tanto de un plásmido Ti desactivado como de un vector binario adecuado (Brothers y col., 2005). 5,464,763. Other bacteria such as Sinorhizobium, Rhizobium, and Mesorhizobium that interact with plants naturally can be modified to mediate gene transfer to several different plants. These symbiotic bacteria associated with plants can become competent for gene transfer by the acquisition of both a deactivated Ti plasmid and a suitable binary vector (Brothers et al., 2005).
La regeneración de una célula vegetal transformada en una planta fértil puede conseguirse cultivando primero un explante en un medio de brotamiento y posteriormente en un medio de enraizamiento. A veces, un explante puede cultivarse en un medio de callos antes de transferirse a un medio de brotamiento. Puede aplicarse y optimizarse una diversidad de medios y necesidades de transferencia para cada sistema vegetal para la transformación de plantas y la recuperación de plantas transgénicas. Por consiguiente, dichos medios y condiciones de cultivo pueden modificarse o sustituirse con componentes nutricionalmente equivalentes, o procedimientos similares para la selección y recuperación de casos transgénicos. The regeneration of a plant cell transformed into a fertile plant can be achieved by first cultivating an explant in a budding medium and then in a rooting medium. Sometimes, an explant can be grown in a callus medium before transferring to a budding medium. A variety of means and transfer needs can be applied and optimized for each plant system for plant transformation and recovery of transgenic plants. Accordingly, said culture media and conditions can be modified or substituted with nutritionally equivalent components, or similar procedures for the selection and recovery of transgenic cases.
Los medios nutrientes se preparan en forma de un líquido, pero estos pueden solidificarse añadiendo el líquido a materiales capaces de proporcionar un soporte sólido. El agar es el más habitualmente usado para este propósito. Bactoagar, agar Hazelton, Gelrite, y Gelgro son tipos específicos de soporte sólido que son adecuados para el crecimiento de células vegetales en cultivos tisular. Algunos tipos celulares crecerán y se dividirán en suspensión líquida o en medios sólidos o en ambos medios. Nutrient media are prepared in the form of a liquid, but these can be solidified by adding the liquid to materials capable of providing a solid support. Agar is the most commonly used for this purpose. Bactoagar, Hazelton agar, Gelrite, and Gelgro are specific types of solid support that are suitable for plant cell growth in tissue cultures. Some cell types will grow and divide into liquid suspension or solid media or both media.
Las dianas celulares receptoras incluyen, aunque sin limitación, células meristemáticas, callos, embriones inmaduros y células gaméticas tales como el esperma de las microesporas del polen y los óvulos. Puede usarse cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta transgénica fértil en ciertas realizaciones. Por ejemplo, pueden transformarse embriones inmaduros seguido de selección e inicio del callo y posterior regeneración de plantas transgénicas fértiles. La transformación directa de embriones inmaduros obvia la necesidad de desarrollo a largo plazo de cultivos celulares receptores. También pueden usarse células meristemáticas (es decir, células vegetales con capacidad de división celular continua y caracterizadas por un aspecto citológico indiferenciado, normalmente unidas en puntos o tejidos de crecimiento de las plantas tales como las puntas de las raíces, los ápices de los tallos, brotes laterales, etc.) como célula vegetal receptora. A causa de su crecimiento indiferenciado y su capacidad para la diferenciación en órganos y la totipotencia, podría recuperarse una planta transformada completa a partir de una única célula meristemática transformada. Receiving cell targets include, but are not limited to, meristematic cells, corns, immature embryos, and gamma cells such as sperm from pollen microspores and ovules. Any cell from which a fertile transgenic plant can be regenerated can be used in certain embodiments. For example, immature embryos can be transformed followed by callus selection and onset and subsequent regeneration of fertile transgenic plants. Direct transformation of immature embryos obviates the need for long-term development of recipient cell cultures. Meristematic cells can also be used (i.e., plant cells with a capacity for continuous cell division and characterized by an undifferentiated cytological aspect, normally joined at plant growth points or tissues such as root tips, stem apices, lateral shoots, etc.) as a recipient plant cell. Because of its undifferentiated growth and its capacity for organ differentiation and totipotence, a complete transformed plant could be recovered from a single transformed meristematic cell.
Las células somáticas son de diversos tipos. Las células embriogénicas son un ejemplo de células somáticas que pueden inducirse a regenerar una planta a través de la formación de embriones. Las células no embriogénicas son aquellas que típicamente no responden de dicho modo. Somatic cells are of various types. Embryogenic cells are an example of somatic cells that can be induced to regenerate a plant through embryo formation. Non-embryogenic cells are those that typically do not respond in that way.
Pueden usarse ciertas técnicas que enriquecen las células receptoras dentro de una población celular. Por ejemplo, el desarrollo de callos tipo II, seguido de la selección manual y cultivo del tejido embriogénico disgregable generalmente provoca un enriquecimiento de las células receptoras para su uso en, por ejemplo, transformación por microproyectil. Certain techniques that enrich the recipient cells within a cell population can be used. For example, the development of type II corns, followed by manual selection and culture of the disintegrable embryogenic tissue generally causes enrichment of the recipient cells for use in, for example, microprojectile transformation.
En ciertas realizaciones, las células receptoras se seleccionan después de su crecimiento en cultivo. Las células cultivadas pueden hacerse crecer en soportes sólidos o en forma de suspensiones líquidas. En cualquier caso, pueden proporcionarse nutrientes a las células en forma de medio, y controlarse las condiciones ambientales. Hay muchos tipos de medios de cultivo tisular compuestos por aminoácidos, sales, azúcares, reguladores del crecimiento y vitaminas. La mayoría de los medios empleados en la práctica de la invención tendrán algunos componentes similares, aunque los medios pueden diferir en la composición y proporciones de los ingredientes de acuerdo con las prácticas de cultivo tisular conocidas. Por ejemplo, diversos tipos celulares crecen en más de un tipo de medio, pero mostrarán diferentes tasas de crecimiento y diferentes morfologías, dependiendo del medio de cultivo. En algunos medios, las células sobreviven pero no se dividen. La composición de medio también se optimiza frecuentemente en base a la especie o tipo celular seleccionado. In certain embodiments, the recipient cells are selected after their growth in culture. Cultured cells can be grown on solid supports or in the form of liquid suspensions. In any case, nutrients can be provided to the cells in the form of medium, and environmental conditions can be controlled. There are many types of tissue culture media composed of amino acids, salts, sugars, growth regulators and vitamins. Most of the media employed in the practice of the invention will have some similar components, although the media may differ in the composition and proportions of the ingredients according to known tissue culture practices. For example, various cell types grow in more than one type of medium, but will show different growth rates and different morphologies, depending on the culture medium. In some media, cells survive but do not divide. The medium composition is also frequently optimized based on the species or cell type selected.
Se han descrito previamente diversos tipos de medios adecuados para el cultivo de células vegetales. Los ejemplos de estos medios incluyen, aunque sin limitación, el medio N6 descrito por Chu y col. (1975) y el medio MS (Murashige y Skoog, 1962). En algunas realizaciones, puede ser preferible usar un medio con una proporción amoniaco/nitrato algo inferior, tal como N6, para promover la generación de células receptoras manteniendo las células en un estado proembrionario capaz de soportar las divisiones. También puede usarse medio para plantas leñosas (WPM) (Lloyd y McCown, 1981). Various types of media suitable for plant cell culture have been previously described. Examples of these means include, but are not limited to, the N6 medium described by Chu et al. (1975) and the MS medium (Murashige and Skoog, 1962). In some embodiments, it may be preferable to use a medium with a somewhat lower ammonia / nitrate ratio, such as N6, to promote the generation of recipient cells by keeping the cells in a pro-embryonic state capable of supporting the divisions. Means for woody plants (WPM) can also be used (Lloyd and McCown, 1981).
El procedimiento de mantenimiento de los cultivos celulares puede contribuir a su utilidad como fuentes de células receptoras para su transformación. La selección manual de células para su transferencia a medio de cultivo fresco, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo fresco, la composición del medio de cultivo, y los factores ambientales incluyendo, aunque sin limitación, la calidad y cantidad de luz y la temperatura son todos los factores para el mantenimiento de callos y/o cultivos en suspensión que son útiles como fuentes de células receptoras. Alternar el callo entre diferentes condiciones de cultivo puede ser beneficioso para enriquecer las células receptoras en un cultivo. Por ejemplo, las células pueden cultivarse en cultivo en suspensión, pero transferirse a medio sólido a intervalos regulares. Después de un periodo de crecimiento en medio sólido, las células pueden seleccionarse manualmente para devolverlas a medio de cultivo líquido. Puede usarse la repetición de esta secuencia de transferencias a medio de cultivo fresco para enriquecer las células receptoras. Pasar cultivos celulares a través de un tamiz de 1,9 mm también puede ser útil para mantener la friabilidad de un callo o cultivo en suspensión y para enriquecer las células transformables cuando se usan dichos tipos celulares. The maintenance procedure of cell cultures can contribute to their usefulness as sources of recipient cells for their transformation. Manual selection of cells for transfer to fresh culture medium, the frequency of transfer to fresh culture medium, the composition of the culture medium, and environmental factors including, but not limited to, the quality and quantity of light and temperature they are all factors for the maintenance of calluses and / or suspension cultures that are useful as sources of recipient cells. Alternating the callus between different culture conditions can be beneficial to enrich the recipient cells in a culture. For example, cells can be grown in suspension culture, but transferred to solid medium at regular intervals. After a period of growth in solid medium, the cells can be manually selected to return them to liquid culture medium. Repeating this sequence of transfers to fresh culture medium can be used to enrich the recipient cells. Passing cell cultures through a 1.9 mm sieve can also be useful to maintain the friability of a callus or suspension culture and to enrich transformable cells when using such cell types.
Una vez se ha seleccionado una célula transgénica, la célula puede regenerarse en una planta transgénica fértil usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las plantas transformadas pueden analizarse posteriormente para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico particular de interés en una construcción de ADN. Los análisis moleculares pueden incluir, aunque sin limitación, transferencias de Southern (Southern, 1975) o análisis por PCR, enfoques de inmunodiagnóstico. También pueden usarse evaluaciones de campo. Estos y otros procedimientos bien conocidos pueden realizarse para confirmar la estabilidad de las plantas transformadas producidas por los procedimientos descritos. Estos procedimientos son bien conocidos para los especialistas en la técnica (Sambrook y col., 1989). Once a transgenic cell has been selected, the cell can be regenerated in a fertile transgenic plant using techniques well known in the art. The transformed plants can be subsequently analyzed to determine the presence or absence of a particular nucleic acid of interest in a DNA construct. Molecular analyzes may include, but are not limited to, Southern blots (Southern, 1975) or PCR analysis, immunodiagnostic approaches. Field evaluations can also be used. These and other well known procedures can be performed to confirm the stability of the transformed plants produced by the described procedures. These procedures are well known to those skilled in the art (Sambrook et al., 1989).
Por tanto pueden producirse plantas transgénicas que comprenden una secuencia codificante de DMO proporcionada en este documento. En particular, pueden transformarse plantas económicamente importantes, incluyendo cultivos, árboles, y otras plantas con construcciones de ADN de la presente invención de modo que sean tolerantes a dicamba o tengan tolerancia aumentada. Las plantas que se consideran actualmente tolerantes a herbicidas tipo auxina, por tanto, pueden transformarse para aumentar su tolerancia al herbicida. Algunos ejemplos no limitantes de plantas que pueden encontrar uso con la invención incluyen la alfalfa, la cebada, las judías, la remolacha, el brócoli, el repollo, la zanahoria, la canola, la coliflor, el apio, la col china, el maíz, el algodón, el pepino, la berenjena, el puerro, la lechuga, la sandía, la avena, la cebolla, el guisante, el pimiento, el cacahuete, la patata, la calabaza, el rábano, el arroz, el maíz dulce, el sorgo, la soja, la espinaca, el calabacín, la remolacha azucarera, el girasol, el tomate, el melón, y el trigo. Thus, transgenic plants comprising a sequence encoding BMD provided herein can be produced. In particular, economically important plants, including crops, trees, and other plants with DNA constructs of the present invention can be transformed so that they are tolerant to dicamba or have increased tolerance. Plants that are currently considered tolerant to auxin-type herbicides, therefore, can be transformed to increase their tolerance to the herbicide. Some non-limiting examples of plants that may find use with the invention include alfalfa, barley, beans, beets, broccoli, cabbage, carrots, canola, cauliflower, celery, Chinese cabbage, corn , cotton, cucumber, eggplant, leek, lettuce, watermelon, oatmeal, onion, pea, pepper, peanut, potato, pumpkin, radish, rice, sweet corn, sorghum, soy, spinach, zucchini, sugar beet, sunflower, tomato, melon, and wheat.
Una vez se ha preparado una planta transgénica que contiene un transgén, ese transgén puede introducirse en cualquier planta sexualmente compatible con la primera planta por cruce, sin la necesidad siquiera de transformar directamente la segunda planta. Por lo tanto, como se usa en este documento el término "descendencia" se refiere a los descendientes de cualquier generación de una planta parental preparada de acuerdo con la presente invención, donde la descendencia comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de acuerdo con la invención. Una "planta transgénica" por tanto puede ser de cualquier generación. "Cruzar" una planta para proporcionar una línea de plantas que tenga uno o más transgenes o alelos añadidos con relación a una línea inicial de plantas, como se describe en este documento, se define como las técnicas que provocan que una secuencia particular se introduzca en una línea de plantas cruzando una línea inicial con una línea de plantas donante que comprende un transgén o alelo de la invención. Para conseguir esto se podrían realizar, por ejemplo, las siguientes etapas: (a) plantar semillas de la primera (línea inicial) y la segunda (línea de plantas donante que comprende un transgén o alelo deseado) plantas parentales; (b) hacer crecer las semillas de la primera y la segunda plantas parentales en plantas que alberguen flores; (c) polinizar una flor de la primera planta parental con polen de la segunda planta parental; y (d) recoger las semillas producidas en la primera planta que alberga la flor fertilizada. Once a transgenic plant containing a transgene has been prepared, that transgene can be introduced into any plant that is sexually compatible with the first plant by crossing, without the need to even directly transform the second plant. Therefore, as used herein, the term "offspring" refers to the offspring of any generation of a parental plant prepared in accordance with the present invention, where the offspring comprises a selected DNA construct prepared in accordance with the invention. . A "transgenic plant" can therefore be of any generation. "Crossing" a plant to provide a plant line that has one or more transgenes or alleles added relative to an initial plant line, as described in this document, is defined as the techniques that cause a particular sequence to be introduced into a plant line crossing an initial line with a donor plant line comprising a transgene or allele of the invention. To achieve this, for example, the following steps could be carried out: (a) planting seeds of the first (initial line) and the second (donor plant line comprising a desired transgene or allele) parental plants; (b) grow the seeds of the first and second parental plants in plants that house flowers; (c) pollinate a flower of the first parental plant with pollen of the second parental plant; and (d) collect the seeds produced in the first plant that houses the fertilized flower.
La invención, por tanto, proporciona tejidos vegetales transgénicos que comprenden un ácido nucleico codificante de DMO proporcionado en este documento. Los tejidos pueden haberse transformado directamente con un ácido nucleico codificante de DMO o haber heredado el ácido nucleico de una célula progenitora. Los tejidos proporcionados por la invención incluyen específicamente, aunque sin limitación, células, embriones, embriones inmaduros, células meristemáticas, panojas inmaduras, microesporas, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de las raíces, flores y semillas. Cualquiera de dichos tejidos, incluyendo cualquier parte de la planta, que comprenda un ácido nucleico descrito en este documento, se proporciona de este modo por la invención. Las semillas, en particular, encontrarán un beneficio particular para su uso, tanto uso para comercial como de alimentación en forma de grano, así como para plantarlas para hacer crecer cultivos adicionales. The invention, therefore, provides transgenic plant tissues comprising a DMO coding nucleic acid provided herein. The tissues may have been directly transformed with a DMO coding nucleic acid or inherited the nucleic acid from a progenitor cell. The tissues provided by the invention specifically include, but are not limited to, cells, embryos, immature embryos, meristematic cells, immature panicles, microspores, pollen, leaves, anthers, roots, root tips, flowers and seeds. Any such fabric, including any part of the plant, comprising a nucleic acid described herein, is thus provided by the invention. The seeds, in particular, will find a particular benefit for their use, both for commercial use and for feeding in the form of grain, as well as for planting them to grow additional crops.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar realizaciones de la invención. Los especialistas en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención. The following examples are included to illustrate embodiments of the invention. Those skilled in the art should appreciate that the techniques described in the following examples represent techniques discovered by the inventor that work well in the practice of the invention.
EJEMPLO 1 EXAMPLE 1
Construcción de vector para diseñar por ingeniería genérica el gen DMO Vector construction to design the DMO gene by generic engineering
La secuencia codificante de la variante DMOc se generó inicialmente por amplificación por PCR a partir de un molde DMOw. En esta amplificación, la región codificante de DMOw se amplificó a partir del plásmido pPLH1, que contenía el gen DMOw en forma de un fragmento de ADN Xho I/Sst I de 3,5 kpb de P. maltophilia, cepa DI-6. Para la amplificación del ADN, se empleó un cebador 5' que insertaba un sitio de restricción Nco I cenca del extremo 5' del producto de PCR y un codón para alanina inmediatamente después del codón de inicio ATG y un cebador 3' que creaba un sitio de restricción Xba I en el extremo 3' del producto de PCR (los detalles del procedimiento se proporcionan a continuación). El cambio 112W a 112C se identificó posteriormente por secuenciación del ácido nucleico. Para la creación del vector de transformación de plantas, se insertó el gen DMOc usando los sitios Nco I y Xba I añadidos a los extremos 5' y 3', respectivamente, de la región codificante en el vector pRTL2 (Carrington y Freed, 1990) fusionando de este modo la región codificante al elemento potenciador de la traducción del virus del grabado del tabaco (líder de TEV) del vector. El sitio Nco I 5' se introdujo junto con la adición de un codón GCC (alanina) después del codón de inicio ATG y se creó un sitio de restricción Xba I en el extremo 3' de la región de codones usando cebadores de PCR diseñados específicamente. Para permitir el suministro de DMOc al cloroplasto, se colocó la región codificante del péptido de tránsito de cloroplastos del gen de la subunidad de la Rubisco del guisante (Coruzzi y col., 1983) cadena arriba de la región codificante de DMO para permitir su direccionamiento al cloroplasto. La secuencia codificante del péptido de tránsito portada en un fragmento Bgl II y EcoR I se clonó en los sitios BamH I y EcoR I del vector pBluescript II KS+. Esta construcción se usó como molde en una reacción de PCR que insertó un sitio Nco 1 tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la secuencia del péptido de tránsito. El producto amplificado se clonó en el sitio Nco I del vector pRLT2 de modo que la secuencia del péptido de tránsito estuviera directamente cadena arriba y en fase con la región codificante del gen DMO. Se escindió un casete que constaba del líder de TEV, la región del péptido de tránsito y las secuencias codificantes de ADN de DMO del vector pRTL2 con Xho I y Xba I y se clonó en el vector pKLP36 (documento U.S. 5.850.019; FIG. 5) usando los mismos sitios de restricción para unir el casete a un promotor PClSV y la secuencia poli A de PsRbcS2-E9. El nuevo vector se llamó pKLP36-TEV-TP-DMOc (también denominado pKLP36-DMOc), y se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 EEUU el 2 de febrero de 2006, y se ele asignó el número de acceso a la ATCC PTA-7357. The coding sequence of the DMOc variant was initially generated by PCR amplification from a DMOw template. In this amplification, the DMOw coding region was amplified from plasmid pPLH1, which contained the DMOw gene in the form of a 3.5 kbp Xho I / Sst I DNA fragment of P. maltophilia, strain DI-6. For DNA amplification, a 5 'primer was used that inserted an Nco I restriction site near the 5' end of the PCR product and a codon for alanine immediately after the ATG start codon and a 3 'primer that created a site Xba I restriction at the 3 'end of the PCR product (details of the procedure are provided below). Change 112W to 112C was subsequently identified by nucleic acid sequencing. For the creation of the plant transformation vector, the DMOc gene was inserted using the Nco I and Xba I sites added to the 5 'and 3' ends, respectively, of the coding region in the vector pRTL2 (Carrington and Freed, 1990) thereby fusing the coding region to the translation enhancer element of the tobacco engraving virus (TEV leader) of the vector. The 5 'Nco I site was introduced along with the addition of a GCC codon (alanine) after the ATG start codon and an Xba I restriction site was created at the 3' end of the codon region using specifically designed PCR primers . To allow the delivery of DMOc to the chloroplast, the coding region of the chloroplast transit peptide of the pea Rubisco subunit gene (Coruzzi et al., 1983) was placed upstream of the DMO coding region to allow its addressing to chloroplast. The transient peptide coding sequence carried on a Bgl II and EcoR I fragment was cloned into the BamH I and EcoR I sites of the pBluescript II KS + vector. This construct was used as a template in a PCR reaction that inserted an Nco 1 site at both the 3 'end and the 5' end of the transit peptide sequence. The amplified product was cloned into the Nco I site of the pRLT2 vector so that the transit peptide sequence was directly upstream and in phase with the coding region of the DMO gene. A cassette consisting of the TEV leader, the transit peptide region and the BMD DNA coding sequences of the pRTL2 vector with Xho I and Xba I was cleaved and cloned into the vector pKLP36 (US 5,850,019; FIG. 5) using the same restriction sites to bind the cassette to a PClSV promoter and the poly A sequence of PsRbcS2-E9. The new vector was called pKLP36-TEV-TP-DMOc (also called pKLP36-DMOc), and was deposited in the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA on February 2, 2006, and the ATCC access number PTA-7357 was assigned.
El vector pKLP36-DMOc se usó para transformar plantas de tabaco, Arabidopsis y de tomate. Para la transformación de la soja, el casete DMOc se cortó del pKLP36-TEV-TP-DMOc en forma de un segmento EcoR I/Acc I y se clonó en pPZP101 digerido con EcoR I/Acc I (Hajdukiewicz y col., 1994) para obtener los límites derecho e izquierdo. Este vector (pPZP101+casete DMOc) después se cortó con ScaI y el casete DMOc se clonó en el vector binario pPTN200 (véase a continuación), un derivado de pPZP201 (Hajdukiewicz y col., 1994), que contiene un casete bar flanqueado por límites de ADN-T en la izquierda y la derecha y permite la selección de transformantes en regeneración en presencia del herbicida Basta. El nuevo vector binario de dos ADN-T se denominó pPTN348 y se usó para la transformación de la soja. El vector pPTN200 se preparó clonando primero promotor nos-elemento bar a partir de pGPTV-bar (Becker y col., 1992) en forma de un segmento PstI/BamHI en pPZP201 (véase Hajdukiewicz y col., 1994) y el plásmido resultante se llamó pPTN193. El terminador nos de pE7113-GUS (véase Mitsuhara y col., 1996) se clonó en pPTN 193 cadena abajo del promotor nos-elemento bar para obtener el casete bar. The pKLP36-DMOc vector was used to transform tobacco, Arabidopsis and tomato plants. For soybean transformation, the DMOc cassette was cut from pKLP36-TEV-TP-DMOc in the form of an EcoR I / Acc I segment and cloned into pPZP101 digested with EcoR I / Acc I (Hajdukiewicz et al., 1994) to get the right and left limits. This vector (pPZP101 + DMOc cassette) was then cut with ScaI and the DMOc cassette was cloned into the binary vector pPTN200 (see below), a derivative of pPZP201 (Hajdukiewicz et al., 1994), which contains a bar cassette flanked by T-DNA boundaries on the left and right and allows the selection of transformants in regeneration in the presence of the Basta herbicide. The new binary vector of two T-DNAs was named pPTN348 and was used for soybean transformation. The pPTN200 vector was prepared by first cloning nos-element bar promoter from pGPTV-bar (Becker et al., 1992) in the form of a PstI / BamHI segment in pPZP201 (see Hajdukiewicz et al., 1994) and the resulting plasmid was called pPTN193. The nos terminator of pE7113-GUS (see Mitsuhara et al., 1996) was cloned into pPTN 193 downstream of the nos-element bar promoter to obtain the bar cassette.
Las enzimas de restricción y otras enzimas se obtuvieron de Fermentas o Invitrogen. DIG-11-dUTP (marcado con álcali), CSPD (listo para usar), los marcadores de peso molecular DIG III, anti-digoxigenina-AP (fragmentos Fab) y el reactivo de bloqueo se obtuvieron de Roche. La solución de prehibridación, ULTRAhyb, se obtuvo de Ambion. El marcador de peso molecular DIG-RNA I se obtuvo de Roche. El anticuerpo (de burro) anti-IgG de conejo, unido a peroxidasa y la membrana Hybond ECL (nitroceluosa) se obtuvieron de Amersham Biosciences. Las transferencias de ADN, ARN y proteína, las técnicas de ADN recombinante, y otros procedimientos de biología molecular se realizaron usando técnicas convencionales (Ausubel y col., 1995). Restriction enzymes and other enzymes were obtained from Fermentas or Invitrogen. DIG-11-dUTP (alkali labeled), CSPD (ready to use), DIG III molecular weight markers, anti-digoxigenin-AP (Fab fragments) and blocking reagent were obtained from Roche. The prehybridization solution, ULTRAhyb, was obtained from Ambion. The molecular weight marker DIG-RNA I was obtained from Roche. The (donkey) rabbit anti-IgG antibody, bound to peroxidase and the Hybond ECL (nitrocellulose) membrane were obtained from Amersham Biosciences. DNA, RNA and protein transfers, recombinant DNA techniques, and other molecular biology procedures were performed using conventional techniques (Ausubel et al., 1995).
EJEMPLO 2 EXAMPLE 2
Producción y análisis de plantas transgénicas Production and analysis of transgenic plants
Se usaron tabaco, tomate, soja y Arabidopsis para la expresión transgénica del gen DMOc modificado por ingeniería genética y la confirmación de la tolerancia a dicamba en plantas que expresan el gen. La secuencia codificante de DMOc en el vector binario pKLP36 se introdujo en A. tumefaciens cepa C58C1 que contenía el plásmido Ti desactivado pMP90 (Koncz y Schell, 1986) por apareamiento triparental (Ditta 1980). Los transconjugantes resultantes se usaron para la transformación de tabaco (cv Xanthi) y tomate (cv Rutgers) usando el protocolo de disco foliar descrito por Horsch y col. (Horsch 1985). Arabidopsis thaliana se transformó por la técnica de inmersión floral (Clough y Bent, 1998). La transformación de las variedades de soja Thome y NE-3001 se realizó por el sistema de transformación mediado por Agrobacterium de nódulo cotiledonal (Zhang y col., 1999). Tobacco, tomato, soybeans and Arabidopsis were used for the transgenic expression of the genetically modified DMOc gene and the confirmation of dicamba tolerance in plants expressing the gene. The DMOc coding sequence in the binary vector pKLP36 was introduced into A. tumefaciens strain C58C1 containing the deactivated Ti plasmid pMP90 (Koncz and Schell, 1986) by triparental mating (Ditta 1980). The resulting transconjugants were used for the transformation of tobacco (cv Xanthi) and tomato (cv Rutgers) using the leaf disc protocol described by Horsch et al. (Horsch 1985). Arabidopsis thaliana was transformed by the floral immersion technique (Clough and Bent, 1998). The transformation of the soybean varieties Thome and NE-3001 was carried out by the Agrobacterium-mediated transformation system of cotyledonal nodule (Zhang et al., 1999).
La transferencia génica mediada por Agrobacterium del gen DMOc al genoma nuclear de plantas de tabaco producto varias plantas de generación T1 obtenidas independientemente. Las plantas se ensayaron para la presencia y expresión del gen DMOc usando análisis de transferencia de ADN, ARN y proteína. La FIG. 2 ilustra que, aunque todas las plantas transgénicas (carriles 1-6) en este análisis contenían los mismos fragmentos de ADN después de la digestión con enzimas de restricción que el gen DMO clonado (carril 8), el nivel de transcritos de ARNm y proteína DMO variaba significativamente entre transformantes. Por ejemplo, la planta cuyos extractos se representan en el carril 5 muestra niveles relativamente elevados de ARNm de DMO pero niveles muy bajos de la enzima. Por el contrario, se acoplaron niveles casi iguales de ARNm de DMO en los extractos mostrados en el carril 3 con una expresión de alto nivel de DMO. Sin embargo, se mostró que los acontecimientos con fuerte expresión podían obtenerse de forma habitual por este procedimiento. Agrobacterium-mediated gene transfer from the DMOc gene to the nuclear genome of tobacco plants produces several T1 generation plants independently obtained. Plants were tested for the presence and expression of the DMOc gene using DNA, RNA and protein transfer analysis. FIG. 2 illustrates that, although all the transgenic plants (lanes 1-6) in this analysis contained the same DNA fragments after restriction enzyme digestion as the cloned DMO gene (lane 8), the level of mRNA and protein transcripts BMD varied significantly between transformants. For example, the plant whose extracts are represented in lane 5 shows relatively high levels of BMD mRNA but very low levels of the enzyme. In contrast, almost equal levels of BMD mRNA were coupled in the extracts shown in lane 3 with a high level of BMD expression. However, it was shown that events with strong expression could be obtained routinely by this procedure.
Las plantas en el invernadero se pulverizaron con disolvente y dicamba de calidad comercial (Clarity; BASF) usando un pulverizador de carril, accionado por motor, de aire comprimido con una boquilla 8002E de ventilador plano que viaja a 0,83 m/s (1,87 mph). Los aditivos incluían: urea al 28%, nitrato de amonio al 1,25% v/v y tensioactivo no iónico al 1,0% v/v. La solución que contenía dicamba a diversas concentraciones se aplicó a 182 l/ha (40 galones por acre). Las plantaciones de campo de soja se pulverizaron con herbicida Clarity a 2,8 kg/ha (2,5 lb/ac). The plants in the greenhouse were sprayed with commercial grade solvent and dicamba (Clarity; BASF) using a motor-driven rail sprayer of compressed air with a 8002E flat fan nozzle traveling at 0.83 m / s (1 , 87 mph). The additives included: 28% urea, 1.25% v / v ammonium nitrate and 1.0% v / v non-ionic surfactant. The solution containing dicamba at various concentrations was applied at 182 l / ha (40 gallons per acre). Soybean field plantations were sprayed with Clarity herbicide at 2.8 kg / ha (2.5 lb / ac).
Las plantas de tabaco, como la mayoría de las plantas dicotiledóneas, son bastante sensibles al tratamiento con dicamba. Esto se ilustró por comparación de plantas de tabaco no transgénicas no tratadas o tratadas con cantidades crecientes de dicamba. Los síntomas de daño del herbicida se detectaron fácilmente después de pulverizar dicamba a un nivel de 0,017 kg/ha. Los síntomas son bastante graves a 0,28 kg/ha y 0,56 kg/ha, los niveles normalmente usados para el control de malas hierbas en aplicaciones agrícolas. Tobacco plants, like most dicotyledonous plants, are quite sensitive to dicamba treatment. This was illustrated by comparison of untreated or treated non-transgenic tobacco plants with increasing amounts of dicamba. Symptoms of herbicide damage were easily detected after spraying dicamba at a level of 0.017 kg / ha. The symptoms are quite severe at 0.28 kg / ha and 0.56 kg / ha, the levels normally used for weed control in agricultural applications.
El tratamiento post-afloramiento de plantas transgénicas de tabaco que contenían DMOc con 5,6 kg/ha (10 a 20 veces mayor que las tasas de aplicación normales) causó pocos, si los había, síntomas mientras que una planta no transgénica padecía dañó grave. El daño a las hojas inferiores de las plantas transgénicas podía duplicarse pulverizando las plantas con la solución de disolvente que contenía tensioactivo usada como vehículo para la aplicación de dicamba. Las hojas producidas después del tratamiento de las plantas transgénicas con dicamba no mostraron signos visibles de daño. Las plantas transgénicas de tomate que portaban el gen DMOc modificado por ingeniería genérica, asimismo, no mostraron daño cuando se pulverizaban con elevados niveles de dicamba, en este caso particular, primero con 0,56 kg/ha y posteriormente con 5,6 kg/ha. Arabidopsis thaliana que expresaba el gen DMOc también presentó una fuerte tolerancia al tratamiento con dicamba. En este estudio, la concentración de dicamba empleada proporcionaba una dosis de 1,12 kg/ha. Un hallazgo inesperado fue la observación de que las plantas de tabaco transformadas con un gen DMOc que carecía de la región codificante del péptido de tránsito también eran tolerantes a tratamientos post-afloramiento con dicamba a concentraciones sólo ligeramente por debajo del promedio de las plantas que albergaban genes DMOc con regiones codificantes del péptido de tránsito. En este estudio, los tratamientos se compararon usando 2,2 kg/ha de dicamba en dos plantas de tabaco T1, una que portaba DMOc que carecía de un péptido de tránsito de cloroplastos y la otra que carecía completamente del gen DMOc debido a la segregación genética. La última planta era completamente susceptible al daño causado por el tratamiento con dicamba y sucumbió al tratamiento (FIG. 3). La planta transgénica que portaba el gen DMOc que carecía del péptido de tránsito era completamente tolerante al tratamiento con dicamba a 2,2, kg/ha. Los estudios genéricos de la herencia del gen DMOc en plantas transgénicas de tabaco también demostraron que el rasgo se heredaba en la mayoría de las plantas de un modo mendeliano normal y que mantenía los niveles originales de expresión con respecto a la tolerancia al herbicida. Post-outcrop treatment of transgenic tobacco plants containing BMDD with 5.6 kg / ha (10 to 20 times higher than normal application rates) caused few, if any, symptoms while a non-transgenic plant suffered serious damage. . The damage to the lower leaves of the transgenic plants could be doubled by spraying the plants with the solvent solution containing surfactant used as a vehicle for the application of dicamba. The leaves produced after the treatment of transgenic plants with dicamba showed no visible signs of damage. Transgenic tomato plants that carried the genetically modified DMOc gene also showed no damage when sprayed with high levels of dicamba, in this particular case, first with 0.56 kg / ha and then with 5.6 kg / he has. Arabidopsis thaliana expressing the DMOc gene also showed a strong tolerance to dicamba treatment. In this study, the concentration of dicamba used provided a dose of 1.12 kg / ha. An unexpected finding was the observation that tobacco plants transformed with a DMOc gene that lacked the coding region of the transit peptide were also tolerant of post-outcropping treatments with dicamba at concentrations only slightly below the average of the plants they housed DMOc genes with coding regions of the transit peptide. In this study, the treatments were compared using 2.2 kg / ha of dicamba in two T1 tobacco plants, one that carried BMD that lacked a transit peptide of chloroplasts and the other that completely lacked the DMOc gene due to segregation. genetics. The last plant was completely susceptible to damage caused by dicamba treatment and succumbed to treatment (FIG. 3). The transgenic plant that carried the DMOc gene that lacked the transit peptide was completely tolerant of dicamba treatment at 2.2, kg / ha. Generic studies of the inheritance of the DMOc gene in transgenic tobacco plants also demonstrated that the trait was inherited in most plants in a normal Mendelian manner and that it maintained the original levels of expression with respect to herbicide tolerance.
En soja, se produjeron más de 50 acontecimientos de soja transgénica R0 y se recogieron semillas de la generación T1, T2, y T3. Como se usó un sistema de vector binario de Agrobacterium tumefaciens, se recuperaron tanto plantas transgénicas que albergaban un gen marcador como plantas transgénicas sin marcador que contenían el gen DMOc. En cualquier caso, la mayoría de las líneas transgénicas de soja mostraron tolerancia significativa al tratamiento con dicamba a 2,8 kg/ha y 5,6 kg/ha en condiciones de invernadero y fuerte tolerancia a dicamba a 2,8 kg/ha (el mayor nivel ensayado) en dos años de ensayos de campo. Estos resultados sugieren un amplio margen de seguridad para la soja transgénica y otros cultivos que portan el gen DMOc unido a un control altamente eficaz de una amplia gama de malas hierbas latifoliadas. In soybeans, more than 50 R0 transgenic soybean events were produced and seeds of generation T1, T2, and T3 were collected. As a binary vector system of Agrobacterium tumefaciens was used, both transgenic plants that harbored a marker gene and transgenic plants without a marker containing the DMOc gene were recovered. In any case, most transgenic soybean lines showed significant tolerance to dicamba treatment at 2.8 kg / ha and 5.6 kg / ha under greenhouse conditions and strong tolerance to dicamba at 2.8 kg / ha ( the highest level tested) in two years of field trials. These results suggest a wide safety margin for transgenic soybeans and other crops that carry the DMOc gene together with a highly effective control of a wide range of broadleaf weeds.
Los elevados niveles de resistencia a dicamba en plantas transgénicas de soja que albergan el gen DMO indican la capacidad de aplicar dicamba en campos de soja para suprimir en gran medida la competición de malas hierbas latifoliadas sin daño al cultivo. Además, los cultivos resistentes a dicamba pueden ser un complemento importante a las actuales opciones de control de malas hierbas usando cultivos transgénicos tolerantes a herbicidas. Es decir, pueden ser un punto fuerte valioso en las estrategias para controlar las malas hierbas resistentes a herbicidas actualmente existentes y para suprimir la aparición de malas hierbas adicionales resistentes a herbicidas que finalmente podrían amenazar el uso a largo plazo y el valor de los herbicidas actuales y los cultivos tolerantes a herbicidas. The high levels of resistance to dicamba in GM soybean plants that house the DMO gene indicate the ability to apply dicamba in soybean fields to greatly suppress the competition of broadleaf weeds without damage to the crop. In addition, dicamba resistant crops can be an important complement to current weed control options using transgenic herbicide tolerant crops. That is, they can be a valuable strength in the strategies to control weeds resistant to existing herbicides and to suppress the appearance of additional weeds resistant to herbicides that could ultimately threaten the long-term use and value of current herbicides. and herbicide tolerant crops.
EJEMPLO 3 EXAMPLE 3
Sobre-expresión, purificación y comparación de las propiedades enzimáticas de DMOw y DMOc Overexpression, purification and comparison of the enzymatic properties of DMOw and DMOc
Las secuencias codificantes de DMO de tipo silvestre (DMOw) y variante (DMOc) se clonaron a partir de los plásmidos pMON95900DMO (DMOw) y pMON58499DMO (DMOc) en el vector pET28b (Novagen, San Diego, CA) y se introdujeron por transformación en células BL21 de Escherichia coli (Novagen, San Diego, CA). Las células se cultivaron en 1 litro de caldo Luria-Bertani a 37ºC a una absorbancia a 600 nm de 0,4 a 0,6. La expresión proteica se indujo añadiendo Fe(NH4)SO4 50 M, Na2S 100 M, e isopropil-beta-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM y las células se cambiaron después a 15ºC. Después de 48-72 horas a 15ºC, las células se recogieron por centrifugación a 10000xg durante 20 minutos. Para uso posterior, las células se almacenaron a -20ºC. The wild-type (DMOw) and variant (DMOc) BMD coding sequences were cloned from plasmids pMON95900DMO (DMOw) and pMON58499DMO (DMOc) into vector pET28b (Novagen, San Diego, CA) and introduced by transformation into BL21 cells from Escherichia coli (Novagen, San Diego, CA). The cells were grown in 1 liter of Luria-Bertani broth at 37 ° C at an absorbance at 600 nm of 0.4 to 0.6. Protein expression was induced by adding 50 FeM Fe (NH4), 100 NaM Na2S, and 1mM isopropyl beta-thiogalactopyranoside (IPTG) and the cells were then changed at 15 ° C. After 48-72 hours at 15 ° C, the cells were collected by centrifugation at 10,000 xg for 20 minutes. For later use, the cells were stored at -20 ° C.
El rendimiento de la expresión proteica en E. coli para DMOw y DMOc fue diferente. Aunque la producción de DMOw fue de aproximadamente 100 a 150 mg de proteína pura por litro de medio LB, la producción de DMOc fue 10 veces inferior, o de aproximadamente 10 a 15 mg de proteína pura por litro. Esto no se había previsto ya que E. coli no tiene codones raros para cisteína y hay solamente un codón para triptófano, pero en ambos casos se mostró capacidad de producir las proteínas de formar heteróloga en E. coli independientemente del rendimiento. La cantidad de proteína en los cuerpos de inclusión fue baja en ambos casos, lo que sugiere que la proteína principalmente permanece en la fracción soluble. The yield of protein expression in E. coli for DMOw and DMOc was different. Although the production of DMOw was about 100 to 150 mg of pure protein per liter of LB medium, the production of DMOc was 10 times lower, or about 10 to 15 mg of pure protein per liter. This was not anticipated since E. coli does not have rare codons for cysteine and there is only one codon for tryptophan, but in both cases the ability to produce heterologous proteins in E. coli was shown regardless of yield. The amount of protein in the inclusion bodies was low in both cases, suggesting that the protein mainly remains in the soluble fraction.
Se purificó la proteína DMOw recombinante marcada con His de Pseudomonas maltophilia, cepa DI-6 y la proteína DMOc recombinante marcada con His expresada en la cepa BL21 de E. coli, hasta homogeneidad por cromatografía en columna de Ni-NTA. Las células se suspendieron en tampón de lisis (NaPi 100 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, e imidazol 10 mM) y se alteraron por sonicación. El lisado celular se centrifugó a 55000xg durante 1 hora. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA, que se lavó con tampón de lavado (NaPi 100 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, e imidazol 20 mM) para retirar las proteínas que no se unen específicamente a la resina. La proteína marcada con His se eluyó con tampón de elución (NaPi 100 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, e imidazol 250 mM). Para la purificación de DMOw, un gradiente por etapas fue suficiente para obtener la enzima pura al 95%, mientras que para DMOc, se necesitó un gradiente lineal de 20 a 250 mM de concentración de imidazol para conseguir el mismo nivel de pureza. La enzima que se eluyó de la columna era pura a aproximadamente el 95% según la estimación por transferencias de proteína (transferencias de western) de la enzima después del fraccionamiento por tamaño en electroforesis en el de SDS-poliacrilamida. Una única banda principal a aproximadamente 40 kDa (enzima DMO de 37,3 kDa más 3 kDA para la marca His), indicó que la proteína correcta se había super-producido. His-labeled recombinant DMOw protein was purified from Pseudomonas maltophilia, strain DI-6 and His-labeled recombinant DMOc protein expressed in E. coli strain BL21, until homogeneous by Ni-NTA column chromatography. The cells were suspended in lysis buffer (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, and 10 mM imidazole) and altered by sonication. The cell lysate was centrifuged at 55000xg for 1 hour. The supernatant was loaded on a Ni-NTA column, which was washed with wash buffer (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, and 20 mM imidazole) to remove proteins that do not specifically bind to the resin. His-labeled protein was eluted with elution buffer (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, and 250 mM imidazole). For the purification of DMOw, a step gradient was sufficient to obtain the 95% pure enzyme, while for DMOc, a linear gradient of 20 to 250 mM of imidazole concentration was needed to achieve the same level of purity. The enzyme eluted from the column was pure at about 95% according to the estimate by protein transfers (western blots) of the enzyme after size fractionation in electrophoresis in that of SDS-polyacrylamide. A single main band at approximately 40 kDa (37.3 kDa DMO enzyme plus 3 kDA for the His brand) indicated that the correct protein had been super-produced.
Las concentraciones de proteína se determinaron por ensayo de Bradford con IgG de conejo como patrón. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie. La actividad DMO se midió después de la formación de DCSA que se separó por HPLC (Waters Corporation, Milford, MA) usando una columna Discovery C18 (Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El tiempo de retención para DCSA era de 8 minutos y para dicamba era de 9,5 minutos. Para los estudios cinéticos, se detectó el DCSA y se cuantificó por emisión de fluorescencia a 420 nm (longitud de onda de excitación de 310 nm) después de su separación en la columna de HPLC de mezcla de reacción. Se usaron concentraciones establecidas de DCSA (12 y 24 M) como patrones de cuantificación. Protein concentrations were determined by Bradford assay with rabbit IgG as a standard. Proteins were separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. DMO activity was measured after DCSA formation that was separated by HPLC (Waters Corporation, Milford, MA) using a Discovery C18 column (Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). The retention time for DCSA was 8 minutes and for dicamba it was 9.5 minutes. For kinetic studies, DCSA was detected and quantified by fluorescence emission at 420 nm (excitation wavelength of 310 nm) after separation in the HPLC column of the reaction mixture. Established concentrations of DCSA (12 and 24 M) were used as quantification standards.
Se usaron solución madre de dicamba (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000, y 10000 M), KPi 0,1 M pH 7,2, FeSO4 0,1 M, NADH 0,1 M, y MgCl2 1 M. Los ensayos se realizaron a 30ºC durante 20 minutos y la reacción se interrumpió por la adición de 40 l de H2SO4. Para las mediciones de actividad, DMO se acopló con un exceso de ferredoxina y reductasa purificadas de P. maltophilia cepa DI-6. Dicamba stock solution (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000, and 10000 M), 0.1 M KPi pH 7.2, 0.1 M FeSO4, 0.1 M NADH, and 1M MgCl2. The tests were performed at 30 ° C for 20 minutes and the reaction was stopped by the addition of 40 µL of H2SO4. For activity measurements, BMD was coupled with an excess of purified ferredoxin and reductase from P. maltophilia strain DI-6.
Como el ensayo para la actividad DMO fue un ensayo discontinuo, fue importante establecer el tiempo durante el cual tiene que proceder el ensayo para obtener parámetros cinéticos significativos. Por tanto el ensayo tiene que proceder en condiciones iniciales ya que la cantidad de DCSA producida es linear durante el tiempo que está procediendo el ensayo (FIG. 4). Los resultados sugerían que el ensayo podía proceder entre 20 a 30 minutos y aún mantener la linealidad. La FIG. 5 muestra que el pH óptimo para el ensayo realizado en presencia de tampón Kpi 0,1 M era de 7,2 y la temperatura óptima se halló a aproximadamente 37ºC (FIG. 6). Since the test for BMD activity was a discontinuous test, it was important to establish the time during which the test has to proceed to obtain significant kinetic parameters. Therefore the test must proceed under initial conditions since the amount of DCSA produced is linear during the time the test is proceeding (FIG. 4). The results suggested that the test could proceed between 20 to 30 minutes and still maintain linearity. FIG. 5 shows that the optimum pH for the test performed in the presence of 0.1 M Kpi buffer was 7.2 and the optimum temperature was approximately 37 ° C (FIG. 6).
Los parámetros de Michaelis-Menten se determinaron ajustando los datos a una ecuación en estado estacionario no lineal (Ecuación 1). Los datos se analizaron usando Sigma plot 8.0 (Jandel Scientific). The Michaelis-Menten parameters were determined by adjusting the data to a non-linear steady state equation (Equation 1). Data were analyzed using Sigma plot 8.0 (Jandel Scientific).
V0=Vmáx * [S]/(Km + [S]) Ecuación 1 V0 = Vmax * [S] / (Km + [S]) Equation 1
5 También se determinaron el pH y la temperatura óptimos para DMOw y DMOc. El pH óptimo se midió a 30ºC durante 20 minutos y la determinación de la temperatura óptima se midió también durante 20 minutos a pH 7,2 para ambas formas de la enzima. Los resultados se resumen en las FIG. 7-9 y se analizan a continuación. 5 The optimum pH and temperature for DMOw and DMOc were also determined. The optimum pH was measured at 30 ° C for 20 minutes and the optimum temperature determination was also measured for 20 minutes at pH 7.2 for both forms of the enzyme. The results are summarized in FIG. 7-9 and are analyzed below.
Los estudios muestran que DMOw y DMOc difieren en las propiedades cinéticas. Por ejemplo, los parámetros de Michaelis-Menten calculados para DMOw y DMOc son: para DMOw, Km = 49 ± 7 M y Vmáx = 633 ± 24 Studies show that DMOw and DMOc differ in kinetic properties. For example, the Michaelis-Menten parameters calculated for DMOw and DMOc are: for DMOw, Km = 49 ± 7 M and Vmax = 633 ± 24
10 nmoles/min/mg, y para DMOc, Km = 20,5 ± 5 M y Vmáx = 676 ± 37 nmoles/min/mg. Estos resultados se muestran en las FIG. 10 y 11 y se resumen en la siguiente Tabla 1. Además, dos análisis adicionales realizados para DMOw y DMOc produjeron resultados similares (Tabla 2 y 3). 10 nmoles / min / mg, and for BMDc, Km = 20.5 ± 5 M and Vmax = 676 ± 37 nmoles / min / mg. These results are shown in FIG. 10 and 11 and are summarized in the following Table 1. In addition, two additional analyzes performed for DMOw and DMOc produced similar results (Table 2 and 3).
Como puede observarse, en términos de eficacia catalítica, las enzimas DMOw y DMOc tienen diferentes propiedades: DMOc es una enzima cinco veces mejor que DMOw por este análisis. El perfil de pH para DMOc es As can be seen, in terms of catalytic efficacy, the DMOw and DMOc enzymes have different properties: DMOc is an enzyme five times better than DMOw by this analysis. The pH profile for BMDD is
15 diferente al de DMOw. Primero, parece que DMOc es sensible al sistema tamponante usado (TRIS frente a KPi) por comparación con DMOw (FIG. 9, 12, y 13). Segundo, DMOc muestra una actividad estacionaria sobre un amplio intervalo de pH cuando se ensaya en tampón KPi por comparación con TRIS cuando la actividad de DMOc disminuye con aumentos en unidades de pH. Los perfiles de temperatura para DMOc incubada en tampón KPi o TRIS son similares. 15 different from DMOw. First, it seems that DMOc is sensitive to the buffer system used (TRIS vs. KPi) by comparison with DMOw (FIG. 9, 12, and 13). Second, DMOc shows stationary activity over a wide pH range when tested in KPi buffer by comparison with TRIS when DMOc activity decreases with increases in pH units. The temperature profiles for BMD incubated in KPi or TRIS buffer are similar.
20 Mirando los perfiles de temperatura entre estas dos formas de la enzima, DMOw funcionaba mejor a 37ºC mientras que DMOc funcionaba mejor a temperaturas algo inferiores (FIG. 9). La FIG. 9 indica una temperatura óptima inferior para DMOc, que puede ser útiles en plantas transgénicas pronto en la temporada de cultivo. 20 Looking at the temperature profiles between these two forms of the enzyme, DMOw worked better at 37 ° C while DMOc worked better at somewhat lower temperatures (FIG. 9). FIG. 9 indicates a lower optimum temperature for BMDD, which may be useful in transgenic plants soon in the growing season.
Tabla 1. Los parámetros cinéticos en estado estacionario para DMOw y DMOc. Table 1. The steady state kinetic parameters for DMOw and DMOc.
- Enzima Enzyme
- Km (M) Vmáx (U/mg) kcat (s-1) Kcat/Km (M-1s -1) Km (M) Vmax (U / mg) kcat (s-1) Kcat / Km (M-1s -1)
- DMOw Dmow
- 49 ± 7 X 10-6 633 ± 24 X 10-3 36,63 7,47 X 105 49 ± 7 X 10-6 633 ± 24 X 10-3 36.63 7.47 X 105
- DMOc BMDD
- 20 ± 5 X 10-6 676 ± 37 X 10-3 70,41 35,21 X 105 20 ± 5 X 10-6 676 ± 37 X 10-3 70.41 35.21 X 105
Tabla 2. Sumario de los parámetros de Michaelis-Menten para DMOw. Table 2. Summary of the Michaelis-Menten parameters for DMOw.
- Estudio nº Study No.
- Rsqr Vmáx (nmoles/min/mg) Km (M) Rsqr Vmax (nmoles / min / mg) Km (M)
- 1. one.
- 0,983 633 ± 24 49 ± 7 0.983 633 ± 24 49 ± 7
- 2. 2.
- 0,988 583 ± 18 46 ± 5 0.988 583 ± 18 46 ± 5
- 3. 3.
- 0,987 590 ± 19 46 ± 5,5 0.987 590 ± 19 46 ± 5.5
Tabla 3. Sumario de los parámetros de Michaelis-Menten para DMOc. Table 3. Summary of the Michaelis-Menten parameters for DMOc.
- Estudio nº Study No.
- Rsqr Vmáx (nmoles/min/mg) Km (M) Rsqr Vmax (nmoles / min / mg) Km (M)
- 1. one.
- 0,933 713 ± 43 21 ± 6 0.933 713 ± 43 21 ± 6
- 2. 2.
- 0,948 676 ± 37 20 ± 5 0.948 676 ± 37 20 ± 5
EJEMPLO 4 EXAMPLE 4
Se realizó un análisis bioinformática para comparar la secuencia polipeptídica de DMO con otras oxigenasas de hierro-azufre y para identificar las regiones conservadas. Inicialmente, se seleccionaron 78 secuencias para el análisis en base al punto de corte de valor e Ie-08 y una cobertura del 70% de la secuencia de DMO sobre la alineación de secuencia. El análisis adicional de estas 78 secuencias reveló la presencia de dos dominios que se habían identificado en otros estudios, incluyendo los dominios de Rieske y de Fe no hemo (Herman y col., 2005). De estas 78 secuencias, 68 contenían ambos dominios, mientras 10 tenían solamente uno de los dominios. Las 68 moléculas con los dos dominios se usaron para el análisis adicional de motivos. A bioinformatic analysis was performed to compare the BMD polypeptide sequence with other iron-sulfur oxygenases and to identify conserved regions. Initially, 78 sequences were selected for analysis based on the value cut-off point and Ie-08 and a 70% coverage of the BMD sequence over the sequence alignment. Further analysis of these 78 sequences revealed the presence of two domains that had been identified in other studies, including the Rieske and nonheme Fe domains (Herman et al., 2005). Of these 78 sequences, 68 contained both domains, while 10 had only one of the domains. The 68 molecules with the two domains were used for further motive analysis.
La alineación de las 68 moléculas con ambos dominios en diferentes niveles de identidad reveló un nuevo motivo WXWX. Aunque algunas secuencias no contenían el motivo, el análisis filogenético indicó que las moléculas sin el motivo estaban en ciertos clados del árbol filogenético que no pretenden al mismo grupo que las moléculas con el motivo. Aquellas moléculas sin el motivo, por lo tanto, se eliminaron de la base de datos original, dejando 52 secuencias restantes que se re-alinearon para análisis adicional. The alignment of the 68 molecules with both domains at different levels of identity revealed a new WXWX motif. Although some sequences did not contain the motif, the phylogenetic analysis indicated that the molecules without the motive were in certain clades of the phylogenetic tree that do not pretend to the same group as the molecules with the motive. Those molecules without the motif, therefore, were removed from the original database, leaving 52 remaining sequences that were re-aligned for further analysis.
Las 52 secuencias re-alineadas mostraron conservación alrededor de dos restos de W que contenían el siguiente formato: WX1WX2G (W es Trp, G es el resto Gly, X1 es un resto no polar, y X2 es cualquier aminoácido). El segundo W en este caso corresponde a la posición 112 de la SEC ID Nº 1. El motivo WXG de WX1WX2G se ha presentado recientemente y proteínas con el motivo WXG está relacionadas con el sistema de secreción celular (Desvaux y col., 2005). The 52 re-aligned sequences showed conservation around two W residues that contained the following format: WX1WX2G (W is Trp, G is the Gly residue, X1 is a non-polar residue, and X2 is any amino acid). The second W in this case corresponds to position 112 of SEQ ID No. 1. The WXG motif of WX1WX2G has recently been presented and proteins with the WXG motif are related to the cellular secretion system (Desvaux et al., 2005).
El triptófano (W) y la cisteína (C) son restos con tamaños remarcadamente diferentes. El W es un resto grande, mientras que la C es uno relativamente pequeño. Como tanto W como C son aminoácidos polares, comparten algunos caracteres comunes, tales como la donación de protones. Como el resto de W está codificado por TGG y la Cys por TGC y TGT, ciertas conversiones en el tercer código (G->C o G->T) pueden producir una mutación sin sentido del W a C o de la C a W. Dichas conversiones se han identificado en la naturaleza y las bio-funciones y las actividades se cambiaron por esas mutaciones (véase, por ejemplo el gen BRCA1 en cáncer de mama y ovario hereditario (Xiaoman y Jinghe, 1999); la deficiencia del factor de coagulación XII (Wada y col., 2003), y la mutación de la lipoproteína lipasa en hiperlipoproteinemia tipo I (Hoffmann y col., 2000)). Tryptophan (W) and cysteine (C) are remnants with remarkably different sizes. W is a large remainder, while C is a relatively small one. Since both W and C are polar amino acids, they share some common characters, such as proton donation. Since the rest of W is encoded by TGG and Cys by TGC and TGT, certain conversions in the third code (G-> C or G-> T) can produce a nonsense mutation of W to C or C to W Such conversions have been identified in nature and the bio-functions and activities were changed by these mutations (see, for example, the BRCA1 gene in hereditary breast and ovarian cancer (Xiaoman and Jinghe, 1999); deficiency of the factor of coagulation XII (Wada et al., 2003), and the mutation of lipoprotein lipase in hyperlipoproteinemia type I (Hoffmann et al., 2000)).
Los resultados anteriores, por lo tanto, indicaron que, aunque la DMO es única y tiene baja identidad con las enzimas conocidas, el W112 está conservado en otras oxigenasas de hierro-azufre relacionadas. Además, la posición 112 está unida por dos dominios funcionales conservados (FIG. 18). Además, las conversiones de W a C típicamente afectan a la bioactividad. Por tanto fue particularmente sorprendente el hallazgo de que la DMOc producía una enzima funcional con parámetros cinéticos superiores que los de la enzima DMOw de tipo silvestre y producía una tolerancia de elevado nivel a dicamba cuando se expresaba en plantas transgénicas. The previous results, therefore, indicated that, although BMD is unique and has low identity with known enzymes, W112 is conserved in other related iron-sulfur oxygenases. In addition, position 112 is linked by two conserved functional domains (FIG. 18). In addition, conversions from W to C typically affect bioactivity. Therefore, the finding that DMOc produced a functional enzyme with higher kinetic parameters than those of the wild-type DMOw enzyme and produced a high tolerance to dicamba when expressed in transgenic plants was particularly surprising.
EJEMPLO 5 EXAMPLE 5
La DMO codificada en cloroplasto producía un elevado nivel de resistencia a dicamba The BMD encoded in chloroplast produced a high level of resistance to dicamba
Para determinar si la DMO podría funcionar exclusivamente en el interior de los cloroplastos y para explorar la posibilidad de limitar el "gen propagado" a través del polen arrastrado, se crearon construcciones basadas en el vector pFMDV1 (por ejemplo, Svab y col., 1990) para permitir la integración del gen DMOc en el genoma del cloroplasto del tabaco por recombinación homóloga y aislamiento de los transformantes usando selección para la resistencia a antibióticas (FIG. 14). En esta construcción, la región codificante del gen DMOc está dirigida por el promotor del gen psbA del cloroplasto que contiene la secuencia 5' UTR completa de de psbA. Los análisis iniciales de transferencia de ADN de las plantas transgénicas resistentes a antibióticos (FIG.15A) demostraron la presencia en los genomas cloroplásticos tanto del transgén DMOc (banda de 5,6 kb) como de la región génica nativa (banda de 3,3 kb) remplazada por integración homóloga del gen DMOc (es decir, los cloroplastos eran heteroplásticos para el gen nativo y el transgén DMOc). La regeneración y selección repetida de plantas transgénicas en medio que contenía antibiótico produjo cloroplastos aparentemente homoplásticos que albergaban el fragmento del gen DMOc pero no la región génica nativa remplazada (FIG. 15B). To determine whether BMD could function exclusively inside the chloroplasts and to explore the possibility of limiting the "propagated gene" through the entrained pollen, constructions based on the vector pFMDV1 were created (for example, Svab et al., 1990 ) to allow the integration of the DMOc gene into the genome of tobacco chloroplast by homologous recombination and isolation of the transformants using selection for antibiotic resistance (FIG. 14). In this construction, the coding region of the DMOc gene is directed by the chloroplast psbA gene promoter that contains the complete 5'UTR sequence of psbA. Initial DNA transfer analyzes of antibiotic-resistant transgenic plants (FIG. 15A) demonstrated the presence in the chloroplastic genomes of both the DMOc transgene (5.6 kb band) and the native gene region (3.3 band kb) replaced by homologous integration of the DMOc gene (i.e., the chloroplasts were heteroplastic for the native gene and the DMOc transgene). Regeneration and repeated selection of transgenic plants in medium containing antibiotic produced seemingly homoplastic chloroplasts that harbored the DMOc gene fragment but not the replaced native gene region (FIG. 15B).
Se ensayaron las generaciones T1, T2 y T3 de la descendencia de dos transformantes cloroplásticos obtenidos independientemente para la tolerancia al tratamiento con dicamba a diversas dosis. Todos mostraron elevados niveles de tolerancia. De hecho, los transformantes del genoma cloroplástico no presentaron daño aparente (diferente al "daño solamente del disolvente" en las hojas inferiores) cuando se pulverizaron con a una tasa de 28 kg/ha (25 1b/ac) (FIG. 16) y se observó daño solamente transitoria cuando las plantas se trataron con aplicaciones extremadamente altas de dicamba de 112 y 224 kg/ha. A estos niveles extremadamente altos, se causaba un daño inicial principalmente por los tensioactivos y otros componentes del disolvente en el que se suministraba el dicamba; los tejidos que crecen a partir del ápice dañado presentaban fenotipos casi normales a normales, lo que muestra ausencia de disminución en las tasas de crecimiento después de la atrofia inicial y retenía la capacidad de producir cantidades habituales de semillas y en su calidad habitual. The T1, T2 and T3 generations of the offspring of two independently obtained chloroplast transformants were tested for tolerance to dicamba treatment at various doses. All showed high tolerance levels. In fact, the transformants of the chloroplastic genome showed no apparent damage (other than "solvent-only damage" in the lower leaves) when sprayed at a rate of 28 kg / ha (25 1b / ac) (FIG. 16) and Only transient damage was observed when the plants were treated with extremely high applications of 112 and 224 kg / ha dicamba. At these extremely high levels, initial damage was caused primarily by the surfactants and other components of the solvent in which the dicamba was supplied; the tissues that grow from the damaged apex presented almost normal to normal phenotypes, which shows the absence of a decrease in growth rates after the initial atrophy and retained the ability to produce habitual quantities of seeds and in their usual quality.
Los resultados eran coherentes con la posibilidad de que la ferredoxina reducida en cloroplastos del tabaco podía ser el donante a la DMO de los electrones necesarios para la oxidación de dicamba en DCSA. Como ensayo directo de esta posibilidad, se examinó la capacidad de la ferredoxina purificada de la espinaca de soportar la conversión de dicamba en DCSA en presencia y ausencia de DMO purificada de P. maltophilia, cepa DI-6, o super-producida y purificada de E. coli (Tabla 4). Los resultados demostraron que la ferredoxina reducida de la espinaca o Clostridium era completamente capaz de donar electrones a DMO in vitro medido por degradación de dicamba o aparición de DCSA. The results were consistent with the possibility that reduced ferredoxin in tobacco chloroplasts could be the donor to the BMD of the electrons necessary for oxidation of dicamba in DCSA. As a direct test of this possibility, the ability of spinach purified ferredoxin to withstand the conversion of dicamba into DCSA in the presence and absence of purified BMD from P. maltophilia, strain DI-6, or super-produced and purified from E. coli (Table 4). The results demonstrated that reduced spinach ferredoxin or Clostridium was fully capable of donating electrons to BMD in vitro as measured by degradation of dicamba or appearance of DCSA.
Tablas 4A-B. La dicamba monooxigenasa purificada puede utilizar la ferredoxina reducida del cloroplasto o la ferredoxina reducida de Clostridium como fuente de electrones para catalizar la conversión in vitro de dicamba en ácido 3,6-diclorosalicílico. Tables 4A-B. Purified dicamba monooxygenase can use reduced chloroplast ferredoxin or Clostridium reduced ferredoxin as an electron source to catalyze the in vitro conversion of dicamba into 3,6-dichlorosalicylic acid.
Tabla 4A-Degradación de dicamba Table 4A-Dicamba degradation
- Tipo de reacción Type of reaction
- Degradación de dicamba (%) Dicamba degradation (%)
- (Ferr +Red)DI-6 +NADH (Ferr + Red) DI-6 + NADH
- 0 0
- (Oxi + Ferr + Red)DI-6 + NADH (Oxi + Ferr + Red) DI-6 + NADH
- 86 86
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)espinaca + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) Spinach + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- 83 83
- (Oxi)DI-6 + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- ND ND
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)espinaca + (Ferr:Oxidored)espinaca + No NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) Spinach + (Ferr: Oxidored) Spinach + No NADPH
- ND ND
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)clostridium + (Ferr:Oxidored)espinaca +NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) clostridium + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- 82 82
- (Ferr)clostridium + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Ferr) clostridium + (Ferr: Oxidored) spinach + NADPH
- ND ND
Tabla 4B-Formación de DCSA Table 4B-DCSA Training
- Tipo de reacción Type of reaction
- Formación de DCSA (%) DCSA training (%)
- (Ferr +Red)DI-6 + NADH (Ferr + Red) DI-6 + NADH
- ND ND
- (Oxi + Ferr + Red)DI-6 + NADH (Oxi + Ferr + Red) DI-6 + NADH
- 100 100
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)espinaca + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) Spinach + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- 95 95
- (Oxi)DI-6 + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- 2,5 2.5
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)espinaca + (Ferr:Oxidored)espinaca + No NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) Spinach + (Ferr: Oxidored) Spinach + No NADPH
- 1,2 1.2
- (Oxi)DI-6 + (Ferr)clostridium + (Ferr:Oxidored)espinaca + NADPH (Oxi) DI-6 + (Ferr) clostridium + (Ferr: Oxidored) Spinach + NADPH
- 90 90
- (Ferr)clostridium + (Ferr:Oxidored)espinaca +NADPH (Ferr) clostridium + (Ferr: Oxidored) spinach + NADPH
- 1,5 1.5
- ND, No determinado ND, Not determined
Aunque los resultados de la FIG. 2 mostraron que los niveles de DMO producidos eran variables y algunas veces los Although the results of FIG. 2 showed that the levels of BMD produced were variable and sometimes the
niveles de DMOc no se correlacionaban mucho con los niveles de tolerancia a dicamba, los resultados demostraron 10 la capacidad de obtener de forma habitual una tolerancia de elevado nivel a dicamba. Se mostró la producción de BMD levels did not correlate very much with dicamba tolerance levels, the results demonstrated 10 the ability to obtain a high dicamba tolerance on a regular basis. The production of
DMOc a partir tanto de un gen DMOc localizado en el núcleo como de un gen DMOc localizado en el cloroplasto en DMOc from both a DMOc gene located in the nucleus and a DMOc gene located in the chloroplast in
transformantes. En transformantes nucleares ninguno constituía un nivel excepcionalmente alto de DMOc total con transformants In nuclear transformants none constituted an exceptionally high level of total DMOc with
relación a las proteínas totales y la cantidad de DMOc en los transformantes cloroplásticos no era muy diferente y a ratio to total proteins and the amount of DMOc in the chloroplast transformants was not very different and at
veces inferior a los transformantes nucleares. Las estimaciones de la actividad enzimática relativa en extractos sin 15 células de muestras de tejido foliar indicaron que es activo un porcentaje mayor de la DMOc producida en los times lower than nuclear transformants. Estimates of relative enzyme activity in extracts without 15 cells from foliar tissue samples indicated that a higher percentage of the BMDD produced in the cells is active.
cloroplastos que la DMOc sintetizada en el citoplasma y supuestamente transferida a los cloroplastos. Chloroplasts that BMD synthesized in the cytoplasm and supposedly transferred to the chloroplasts.
En todas las plantas analizadas, la tolerancia a dicamba se conseguía sin cotransformación con genes de In all the plants analyzed, tolerance to dicamba was achieved without cotransformation with genes from
ferredoxina o reductasa. Los resultados demostraron que las plantas contenían una o más moléculas que podían ferredoxin or reductase. The results showed that the plants contained one or more molecules that could
transferir electrones necesarios a la DMO para permitir la conversión de dicamba en ácido 3,6-diclorosalicílico 20 (DCSA). El direccionamiento inicial de la DMO a los cloroplastos usando una secuencia del péptido de tránsito se transfer necessary electrons to the BMD to allow the conversion of dicamba into 3,6-dichlorosalicylic acid (DCSA). The initial addressing of the BMD to the chloroplasts using a transit peptide sequence is
abordó potencialmente utilizando ferredoxina reducida abundantemente disponible en los cloroplastos. A este potentially addressed using reduced ferredoxin abundantly available in chloroplasts. To this
respecto, es de interés observar que la transformación de plantas de tabaco con una construcción génica de DMOc In this regard, it is of interest to note that the transformation of tobacco plants with a gene construction of DMOc
que carece de una secuencia codificante del péptido de cloroplastos producía inesperadamente plantas que eran lacking a coding sequence of the chloroplast peptide unexpectedly produced plants that were
tolerantes al tratamiento post-afloramiento con dicamba. Los resultados de ensayos limitados con una pequeña 25 cantidad de plantas de la generación T1, no obstante, indicaron que el nivel de tolerancia obtenido con estas plantas tolerant to post-outcrop treatment with dicamba. The results of limited trials with a small amount of T1 generation plants, however, indicated that the tolerance level obtained with these plants
transgénicas era ligeramente inferior en promedio que el obtenido con plantas de tabaco que producían DMOc que GM was slightly lower on average than that obtained with tobacco plants that produced BMD that
contenía un péptido de tránsito. Estas observaciones suscitan cuestiones interesantes respecto a las moléculas en It contained a transit peptide. These observations raise interesting questions regarding the molecules in
plantas transgénicas que pueden donar de forma productiva electrones a DMO. El hecho de que los cloroplastos GM plants that can productively donate electrons to BMD. The fact that chloroplasts
homoplásticos que producen DMO de forma interna a partir de un gen DMOc integrado en el genoma del cloroplasto muestren resistencia a niveles extremadamente elevados de dicamba (FIG. 16) y el hecho de que la DMO purificada pueda funcionar in vitro con ferredoxina cloroplástica reducida de la espinaca (Tabla 4) sugieren que la ferredoxina cloroplástica puede interaccionar de forma productiva con DMO para permitir la transferencia de electrones. Sin embargo, la fuente de electrones para la DMO producida a partir de genes nucleares que carecen de una secuencia codificante del péptido de tránsito de cloroplastos sigue siendo desconocida. Suponiendo que las ferredoxinas no residan fuera de los cloroplastos de la planta, debe considerarse la posibilidad de que una proteína citoplasmática desconocida pueda proporcionar a DMO un suministro continuo de electrones. Como alternativa, la propia DMO puede contener un péptido de tránsito de cloroplastos gratuito que permita que entre suficiente DMO en los cloroplastos para proporcionar protección contra el dicamba que se mueve al interior de la célula después del tratamiento con dicamba. homoplastics that produce BMD internally from a DMOc gene integrated in the chloroplast genome show resistance to extremely high levels of dicamba (FIG. 16) and the fact that purified BMD can function in vitro with reduced chloroplastic ferredoxin of the Spinach (Table 4) suggests that chloroplastic ferredoxin can interact productively with BMD to allow electron transfer. However, the source of electrons for BMD produced from nuclear genes that lack a chloroplast transit peptide coding sequence remains unknown. Assuming that ferredoxins do not reside outside the plant's chloroplasts, the possibility that an unknown cytoplasmic protein can provide DMO with a continuous supply of electrons should be considered. Alternatively, the BMD itself may contain a free chloroplast transit peptide that allows sufficient BMD to enter the chloroplasts to provide protection against the dicamba that moves into the cell after the dicamba treatment.
Patente de Estados Unidos 4.554.101; patente de Estados Unidos 4.940.838; patente de Estados Unidos 5.015.580; patente de Estados Unidos 5.017.692; patente de Estados Unidos 5.229.114; patente de Estados Unidos 5.304.730; patente de Estados Unidos 5.322.938; patente de Estados Unidos 5.352.605; patente de Estados Unidos 5.359.142; patente de Estados Unidos 5.362.865; patente de Estados Unidos 5.378.619; patente de Estados Unidos 5.384.253; patente de Estados Unidos 5.445.962; patente de Estados Unidos 5.463.175; patente de Estados Unidos 5.464.763; patente de Estados Unidos 5.508.184; patente de Estados Unidos 5.512.466; patente de Estados Unidos 5.516.671; patente de Estados Unidos 5.530.196; patente de Estados Unidos 5.538.880; patente de Estados Unidos 5.543.576; patente de Estados Unidos 5.550.318; patente de Estados Unidos 5.552.299; patente de Estados Unidos 5.567.600; patente de Estados Unidos 5.567.862; patente de Estados Unidos 5.591.616; patente de Estados Unidos 5.633.435; patente de Estados Unidos 5.635.055; patente de Estados Unidos 5.641.876; patente de Estados Unidos 5.659.122; patente de Estados Unidos 5.689.041; patente de Estados Unidos 5.689.052; patente de Estados Unidos 5.716.837; patente de Estados Unidos 5.728.925; patente de Estados Unidos 5.750.876; patente de Estados Unidos 5.763.241; patente de Estados Unidos 5.763.245; patente de Estados Unidos 5.773.696; patente de Estados Unidos 5.804.425; patente de Estados Unidos 5.824.877; patente de Estados Unidos 5.837.848; patente de Estados Unidos 5.850.019; patente de Estados Unidos 5.850.023; patente de Estados Unidos 5.866.775; patente de Estados Unidos 5.869.720; patente de Estados Unidos 5.880.275; patente de Estados Unidos 5.942.658; patente de Estados Unidos 5.942.664; patente de Estados Unidos 5.958.745; patente de Estados Unidos 5.959.091; patente de Estados Unidos 5.981.834; patente de Estados Unidos 5.981.840; patente de Estados Unidos 5.985.605; patente de Estados Unidos 5.998.700; patente de Estados Unidos 6.011.199; patente de Estados Unidos 6.013.864; patente de Estados Unidos 6.015.940; patente de Estados Unidos 6.023.013; patente de Estados Unidos 6.051.753; patente de Estados Unidos 6.063.597; patente de Estados Unidos 6.063.756; patente de Estados Unidos 6.072.103; patente de Estados Unidos 6.080.560; patente de Estados Unidos 6.093.695; patente de Estados Unidos 6.107.549; patente de Estados Unidos 6.110.464; patente de Estados Unidos 6.121.436; patente de Estados Unidos 6.140.075; patente de Estados Unidos 6.140.078; patente de Estados Unidos 6.153.814; patente de Estados Unidos 6.156.573; patente de Estados Unidos 6.160.208; patente de Estados Unidos 6.166.292; patente de Estados Unidos 6.171.640; patente de Estados Unidos 6.175.060; patente de Estados Unidos 6.177.611; patente de Estados Unidos 6.177.615; patente de Estados Unidos 6.215.048; patente de Estados Unidos 6.221.649; patente de Estados Unidos 6.222.098; patente de Estados Unidos 6.225.114; patente de Estados Unidos 6.228.623; patente de Estados Unidos 6.228.992; patente de Estados Unidos 6.232.526; patente de Estados Unidos 6.235.971; patente de Estados Unidos 6.242.241; patente de Estados Unidos 6.248.536; patente de Estados Unidos 6.248.876; patente de Estados Unidos 6.252.138; patente de Estados Unidos 6.271.443; patente de Estados Unidos 6.281.016; patente de Estados Unidos 6.284.949; patente de Estados Unidos 6.294.714; patente de Estados Unidos 6.313.378; patente de Estados Unidos 6.316.407; patente de Estados Unidos 6.326.351; patente de Estados Unidos 6.372.211; patente de Estados Unidos 6.380.462; patente de Estados Unidos 6.380.466; patente de Estados Unidos 6.384.301; patente de Estados Unidos 6.399.330; patente de Estados Unidos 6.399.861; patente de Estados Unidos 6.403.865; patente de Estados Unidos 6.423.828; patente de Estados Unidos 6.426.446; patente de Estados Unidos 6.426.447; patente de Estados Unidos 6.429.357; patente de Estados Unidos 6.429.362; patente de Estados Unidos 6.433.252; patente de Estados Unidos 6.437.217; patente de Estados Unidos 6.441.277; patente de Estados Unidos 6.444.876; patente de Estados Unidos 6.448.476; patente de Estados Unidos 6.459.018; patente de Estados Unidos 6.468.523; patente de Estados Unidos 6.476.295; patente de Estados Unidos 6.483.008; patente de Estados Unidos 6.489.461; patente de Estados Unidos 6.495.739; patente de Estados Unidos 6.501.009; patente de Estados Unidos 6.506.962; patente de Estados Unidos 6.518.488; patente de Estados Unidos 6.521.442; patente de Estados Unidos 6.531.648; patente de Estados Unidos 6.537.750; patente de Estados Unidos 6.537.756; patente de Estados Unidos 6.538.109; patente de Estados Unidos 6.538.178; patente de Estados Unidos 6.538.179; patente de Estados Unidos 6.538.181; patente de Estados Unidos 6.541.259; patente de Estados Unidos 6.555.655; patente de Estados Unidos 6.573.361; patente de Estados Unidos 6.576.818; patente de Estados Unidos 6.589.767; patente de Estados Unidos 6.593.293; patente de Estados Unidos 6.596.538; patente de Estados Unidos 6.608.241; patente de Estados Unidos 6.617.496; patente de Estados Unidos 6.620.988; patente de Estados Unidos 6.635.806; patente de Estados Unidos 6.639.054; patente de Estados Unidos 6.642.030; patente de Estados Unidos 6.645.497; patente de Estados Unidos 6.653.280; patente de Estados Unidos 6.653.530; patente de Estados Unidos 6.657.046; patente de Estados Unidos 6.660.849; patente de Estados Unidos 6.663.906; patente de Estados Unidos 6.686.452; patente de Estados Unidos 6.706.950; patente de Estados Unidos 6.713.063; patente de Estados Unidos 6.716.474; patente de Estados Unidos 6.723.837; patente de Estados Unidos 6.723.897; patente de Estados Unidos 6.770.465; patente de Estados Unidos 6.774.283; patente de Estados Unidos 6.803.501; patente de Estados Unidos 6.809.078; U.S. Patent 4,554,101; U.S. Patent 4,940,838; U.S. Patent 5,015,580; U.S. Patent 5,017,692; U.S. Patent 5,229,114; U.S. Patent 5,304,730; U.S. Patent 5,322,938; U.S. Patent 5,352,605; U.S. Patent 5,359,142; U.S. Patent 5,362,865; U.S. Patent 5,378,619; U.S. Patent 5,384,253; U.S. Patent 5,445,962; U.S. Patent 5,463,175; U.S. Patent 5,464,763; U.S. Patent 5,508,184; U.S. Patent 5,512,466; U.S. Patent 5,516,671; U.S. Patent 5,530,196; U.S. Patent 5,538,880; U.S. Patent 5,543,576; U.S. Patent 5,550,318; U.S. Patent 5,552,299; U.S. Patent 5,567,600; U.S. Patent 5,567,862; U.S. Patent 5,591,616; U.S. Patent 5,633,435; U.S. Patent 5,635,055; U.S. Patent 5,641,876; U.S. Patent 5,659,122; U.S. Patent 5,689,041; U.S. Patent 5,689,052; U.S. Patent 5,716,837; U.S. Patent 5,728,925; U.S. Patent 5,750,876; U.S. Patent 5,763,241; U.S. Patent 5,763,245; U.S. Patent 5,773,696; U.S. Patent 5,804,425; U.S. Patent 5,824,877; U.S. Patent 5,837,848; U.S. Patent 5,850,019; U.S. Patent 5,850,023; U.S. Patent 5,866,775; U.S. Patent 5,869,720; U.S. Patent 5,880,275; U.S. Patent 5,942,658; U.S. Patent 5,942,664; U.S. Patent 5,958,745; U.S. Patent 5,959,091; U.S. Patent 5,981,834; U.S. Patent 5,981,840; U.S. Patent 5,985,605; U.S. Patent 5,998,700; U.S. Patent 6,011,199; U.S. Patent 6,013,864; U.S. Patent 6,015,940; U.S. Patent 6,023,013; U.S. Patent 6,051,753; U.S. Patent 6,063,597; U.S. Patent 6,063,756; U.S. Patent 6,072,103; U.S. Patent 6,080,560; U.S. Patent 6,093,695; U.S. Patent 6,107,549; U.S. Patent 6,110,464; U.S. Patent 6,121,436; U.S. Patent 6,140,075; U.S. Patent 6,140,078; U.S. Patent 6,153,814; U.S. Patent 6,156,573; U.S. Patent 6,160,208; U.S. Patent 6,166,292; U.S. Patent 6,171,640; U.S. Patent 6,175,060; U.S. Patent 6,177,611; U.S. Patent 6,177,615; U.S. Patent 6,215,048; U.S. Patent 6,221,649; U.S. Patent 6,222,098; U.S. Patent 6,225,114; U.S. Patent 6,228,623; U.S. Patent 6,228,992; U.S. Patent 6,232,526; US Patent 6,235,971; U.S. Patent 6,242,241; U.S. Patent 6,248,536; U.S. Patent 6,248,876; U.S. Patent 6,252,138; U.S. Patent 6,271,443; U.S. Patent 6,281,016; U.S. Patent 6,284,949; U.S. Patent 6,294,714; U.S. Patent 6,313,378; U.S. Patent 6,316,407; U.S. Patent 6,326,351; U.S. Patent 6,372,211; U.S. Patent 6,380,462; U.S. Patent 6,380,466; U.S. Patent 6,384,301; U.S. Patent 6,399,330; U.S. Patent 6,399,861; U.S. Patent 6,403,865; U.S. Patent 6,423,828; U.S. Patent 6,426,446; U.S. Patent 6,426,447; U.S. Patent 6,429,357; U.S. Patent 6,429,362; U.S. Patent 6,433,252; U.S. Patent 6,437,217; U.S. Patent 6,441,277; U.S. Patent 6,444,876; U.S. Patent 6,448,476; U.S. Patent 6,459,018; U.S. Patent 6,468,523; U.S. Patent 6,476,295; U.S. Patent 6,483,008; U.S. Patent 6,489,461; U.S. Patent 6,495,739; U.S. Patent 6,501,009; U.S. Patent 6,506,962; U.S. Patent 6,518,488; U.S. Patent 6,521,442; U.S. Patent 6,531,648; U.S. Patent 6,537,750; U.S. Patent 6,537,756; U.S. Patent 6,538,109; U.S. Patent 6,538,178; U.S. Patent 6,538,179; U.S. Patent 6,538,181; U.S. Patent 6,541,259; U.S. Patent 6,555,655; U.S. Patent 6,573,361; U.S. Patent 6,576,818; U.S. Patent 6,589,767; U.S. Patent 6,593,293; U.S. Patent 6,596,538; U.S. Patent 6,608,241; U.S. Patent 6,617,496; U.S. Patent 6,620,988; U.S. Patent 6,635,806; U.S. Patent 6,639,054; U.S. Patent 6,642,030; U.S. Patent 6,645,497; U.S. Patent 6,653,280; U.S. Patent 6,653,530; U.S. Patent 6,657,046; U.S. Patent 6,660,849; U.S. Patent 6,663,906; U.S. Patent 6,686,452; U.S. Patent 6,706,950; U.S. Patent 6,713,063; U.S. Patent 6,716,474; U.S. Patent 6,723,837; U.S. Patent 6,723,897; U.S. Patent 6,770,465; U.S. Patent 6,774,283; U.S. Patent 6,803,501; U.S. Patent 6,809,078;
patente de Estados Unidos 6.812.379; patente de Estados Unidos 6.822.141; patente de Estados Unidos 6.828.475; patente de Estados Unidos Nº 7.022.896; publicación de patente de Estados Unidos 2003/0028917; publicación de patente de Estados Unidos 2003/0135879; publicación de patente de Estados Unidos 2003/01403641; patente de Estados Unidos serie 09/757.089; patente de Estados Unidos RE37.543; patente de Estados Unidos RE38.446 U.S. Patent 6,812,379; U.S. Patent 6,822,141; U.S. Patent 6,828,475; U.S. Patent No. 7,022,896; United States Patent Publication 2003/0028917; U.S. Patent Publication 2003/0135879; U.S. Patent Publication 2003/01403641; United States patent series 09 / 757,089; US Patent RE37,543; U.S. Patent RE38,446
Ausubel y col., En: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, Nueva York, 1995. Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, New York, 1995.
Becker y col., Plant Mol. Biol. 20:1195-1197, 1992. Becker et al., Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197, 1992.
Becker y col., Plant Mol. Biol., 20:49, 1992. Becker et al., Plant Mol. Biol., 20:49, 1992.
Bevan y col., NAR, 11:369, 1983. Bevan et al., NAR, 11: 369, 1983.
Brothers y col., Nature, 433:630, 2005. Brothers et al., Nature, 433: 630, 2005.
Carrington y Freed, J. of Virology 64:1590-1597, 1990. Carrington and Freed, J. of Virology 64: 1590-1597, 1990.
Carrington y Freed, J. Virology, 64:1590, 1990. Carrington and Freed, J. Virology, 64: 1590, 1990.
Chalfie y col., Science, 263:802, 1994. Chalfie et al., Science, 263: 802, 1994.
Chandler y col., Plant Cell, 1:1175-1183, 1989. Chandler et al., Plant Cell, 1: 1175-1183, 1989.
Chang y col., J. Biol. Chem., 31; 278(44):42821-42828, 2003. Chang et al., J. Biol. Chem., 31; 278 (44): 42821-42828, 2003.
Chu y col., Scientia Sinica, 18:659, 1975. Chu et al., Scientia Sinica, 18: 659, 1975.
Clough y Bent, Plant J., 16:735, 1998. Clough and Bent, Plant J., 16: 735, 1998.
Cork y Khalil, Adv. Appl. Microbiol., 40: 289, 1995. Cork and Khalil, Adv. Appl. Microbiol., 40: 289, 1995.
Cork y Krueger, Adv. Appl. Microbiol., 38:1, 1991. Cork and Krueger, Adv. Appl. Microbiol., 38: 1, 1991.
Coruzzi y col., EMBO J., 3: 1671, 1984. Coruzzi et al., EMBO J., 3: 1671, 1984.
Coruzzi y col., J. Biol. Chem. 258:1399-1402, 1983. Coruzzi et al., J. Biol. Chem. 258: 1399-1402, 1983.
Creissen y col., Plant J., 2:129, 1991. Creissen et al., Plant J., 2: 129, 1991.
Crop Protection Reference, Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., NY, 11ª Ed., 1803-1821, 1995. Crop Protection Reference, Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., NY, 11th Ed., 1803-1821, 1995.
De Block y col., EMBO J., 3:1681, 1984. De Block et al., EMBO J., 3: 1681, 1984.
della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83:6873-6877, 1986. della-Cioppa et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 83: 6873-6877, 1986.
Depicker et al, J. Mol. Appl. Genet., 1:561, 1982. Depicker et al, J. Mol. Appl. Genet., 1: 561, 1982.
Desvaux y col., Biochimica et Biophysica Acta, 1745:223-253, 2005. Desvaux et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1745: 223-253, 2005.
Ditta y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77(12):7347-7351, 1980. Ditta et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 77 (12): 7347-7351, 1980.
Ebert y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:5745-5749, 1987. Ebert et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 84: 5745-5749, 1987.
Solicitud EP 553494. Application EP 553494.
Solicitud EP 646643. Application EP 646643.
Fraley y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 80:4803, 1983. Fraley et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 80: 4803, 1983.
Hajdukiewicz y col., Plant Mol. Biol. 25:989-994, 1994. Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25: 989-994, 1994.
Haseloff y col., TIG, 11:328-329, 1995. Haseloff et al., TIG, 11: 328-329, 1995.
Herman y col., J. Biol. Chem., 280:24759-24767, 2005. Herman et al., J. Biol. Chem., 280: 24759-24767, 2005.
Hoffmann y col. J. Clin. Endocrinol. Metab., 85(12):4795-498, 2000. Hoffmann et al. J. Clin. Endocrinol Metab., 85 (12): 4795-498, 2000.
Horsch y col., Science, 227:1229, 1985. Horsch et al., Science, 227: 1229, 1985.
Ingelbrecht y col., Plant Cell, 1:671, 1989. Ingelbrecht et al., Plant Cell, 1: 671, 1989.
Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep., 5:387, 1987. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep., 5: 387, 1987.
Jiang y col., J. Bacteriol. 178:3133-3139, 1996. Kado, Crit. Rev. Plant. Sci., 10:1, 1991. Klee y col., Mol. Gen. Genet., 210:437-442, 1987. Koncz y Schell, Mol. Gen. Genet., 204:383 396, 1986. Koncz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:131, 1987. Krueger y col., J. Agric. Food Chem., 37:534, 1989. Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982. Lawton y col., Plant Mol. Biol., 9:315-324, 1987. Lloyd y McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soc., 30:421, 1981. Maniatis, y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982. Mason, JR, y Cammack, R., Annu. Rev. Microbiol. 46:277-305, 1992. Miki y col., En: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y Thompson (Eds.), CRC Press, 67-88, 1993. Mitsuhara y col., Plant Cell Physiol. 37:49-59, 1996. Moloney y col., Plant Cell Reports, 8:238, 1989. Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962. Odell y col., Nature, 313:810-812, 1985. Solicitud PCT WO 04009761 Solicitud PCT WO 95/24492 Solicitud PCT WO 97/11086 Solicitud PCT WO 97/31115 Solicitud PCT WO 97/41228 Rojiyaa y col., (documento JP 1987201527-A), 1987. Sambrook y col., En: Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Southern, Mol. Biol., 98:503, 1975. Svab y col., Plant Mol. Biol., 14:197, 1990. Svab y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(21):8526-8530, 1990. Teeri y col., EMBO J., 8:343, 1989. Turner y Foster, Molec. Biotechn., 3:225, 1995. Wada y col., Thromb. Haemost., 90(1):59-63, 2003. Walker y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:6624-6628, 1987. Xiaoman y Jinghe, Chin. Med. Sci. J., 14(4):195-199, 1999. Yang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-4148, 1990. Zhang y col., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56: 37-46, 1999. LISTADO DE SECUENCIAS Jiang et al., J. Bacteriol. 178: 3133-3139, 1996. Kado, Crit. Rev. Plant. Sci., 10: 1, 1991. Klee et al., Mol. Gen. Genet., 210: 437-442, 1987. Koncz and Schell, Mol. Gen. Genet., 204: 383 396, 1986. Koncz et al., Proc. Natl Acad. Sci., USA, 84: 131, 1987. Krueger et al., J. Agric. Food Chem., 37: 534, 1989. Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157 (1): 105-132, 1982. Lawton et al., Plant Mol. Biol., 9: 315-324, 1987. Lloyd and McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soc., 30: 421, 1981. Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982. Mason, JR, and Cammack, R., Annu. Rev. Microbiol. 46: 277-305, 1992. Miki et al., In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson (Eds.), CRC Press, 67-88, 1993 Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37: 49-59, 1996. Moloney et al., Plant Cell Reports, 8: 238, 1989. Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962. Odell et al., Nature, 313: 810-812, 1985. PCT application WO 04009761 PCT application WO 95/24492 PCT application WO 97/11086 PCT application WO 97/31115 PCT application WO 97/41228 Rojiyaa et al., (JP document 1987201527-A), 1987. Sambrook et al., In: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Southern, Mol. Biol., 98: 503, 1975. Svab et al., Plant Mol. Biol., 14: 197, 1990. Svab et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87 (21): 8526-8530, 1990. Teeri et al., EMBO J., 8: 343, 1989. Turner and Foster, Molec. Biotechn., 3: 225, 1995. Wada et al., Thromb. Haemost., 90 (1): 59-63, 2003. Walker et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 84: 6624-6628, 1987. Xiaoman and Jinghe, Chin. Med. Sci. J., 14 (4): 195-199, 1999. Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87: 4144-4148, 1990. Zhang et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56: 37-46, 1999. SEQUENCE LIST
<110> CLEMENTE, THOMAS E. <110> CLEMENTE, THOMAS E.
DUMITRU, RAZVAN FENG, PAUL C. C. FLASINSKI, STAN WEEKS, DONALD P. DUMITRU, RAZVAN FENG, PAUL C. C. FLASINSKI, STAN WEEKS, DONALD P.
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Claims (7)
- (ii)(ii)
- la molécula de ácido nucleico está unida de forma funcional a un péptido de tránsito de cloroplastos. 5.- Una secuencia polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad The nucleic acid molecule is functionally linked to a chloroplast transit peptide. 5.- A polypeptide sequence comprising an amino acid sequence with at least 90% identity
- (i)(i)
- la célula vegetal es una célula vegetal dicotiledónea, preferiblemente la célula vegetal dicotiledónea es una célula vegetal de soja, algodón, maíz o colza; o the plant cell is a dicot plant cell, preferably the plant cell dicot is a plant cell of soy, cotton, corn or rapeseed; or
- (ii)(ii)
- la célula vegetal es una célula vegetal monocotiledónea. 8.- Un cultivo de tejido vegetal que comprende la célula vegetal de la reivindicación 6. 9.- Una planta transgénica transformada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1. 10.- La planta transgénica de la reivindicación 9, en la que The plant cell is a monocot plant cell. 8.- A plant tissue culture comprising the plant cell of claim 6. 9.- A transgenic plant transformed with the nucleic acid molecule of claim 1. 10.- The transgenic plant of claim 9, wherein
- (i)(i)
- la planta es una planta dicotiledónea, preferiblemente la planta es una planta de soja, algodón, maíz o colza; o the plant is a dicot plant, preferably the plant is a soybean, cotton, corn or rapeseed plant; or
- (i)(i)
- la planta tolerante a dicamba se produce cruzando una planta parental consigo misma, en el que la planta parental comprende la construcción de transformación de la reivindicación 3 y la planta tolerante a dicamba hereda la construcción de transformación de la reivindicación 3 a partir de dicha planta parental, o the dicamba tolerant plant is produced by crossing a parental plant with itself, wherein the parental plant comprises the transformation construction of claim 3 and the dicamba tolerant plant inherits the transformation construction of claim 3 from said parental plant or
- (ii)(ii)
- la planta tolerante a dicamba se produce cruzando una planta parental con una segunda planta, en el que la planta parental y/o la segunda planta comprende la construcción de transformación de la reivindicación 3 y la planta tolerante a dicamba hereda la construcción de transformación de la reivindicación 3 de dicha planta parental y/o la segunda planta. the dicamba tolerant plant is produced by crossing a parental plant with a second plant, in which the parental plant and / or the second plant comprises the transformation construction of claim 3 and the dicamba tolerant plant inherits the transformation construction of the claim 3 of said parental plant and / or the second plant.
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