ES2359545B1 - GENETICALLY IMPROVED FRUCTUFURANOSIDASA FOR THE OBTAINING OF THE 6-KESTOSA PREBIOTICS. - Google Patents
GENETICALLY IMPROVED FRUCTUFURANOSIDASA FOR THE OBTAINING OF THE 6-KESTOSA PREBIOTICS. Download PDFInfo
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Abstract
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa.#La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de dicho producto enzimático, al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos como por ejemplo 6-kestosa y 1-kestosa.Genetically enhanced fructofuranosidase for obtaining the 6-kestose prebiotic. # The present invention relates to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, wherein said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Asparragine by the amino acid Serine at position 52 and / or the substitution of the amino acid Proline for the amino acid valine at position 232. Likewise, the present invention relates to the use of said nucleotide sequence, to the use of the expression vector, to the use of the product of expression or use of the cell, to obtain an enzymatic product with fructofuranosidase activity by means of a heterologous expression system. Preferably the heterologous system is expressed in Saccharomyces cerevisiae. In addition, the present invention relates to a method for obtaining said enzymatic product, to the enzymatic product with fructofuranosidase activity obtainable by said method. Preferably said enzymatic product is capable of producing fructooligosaccharides such as 6-kestose and 1-kestose.
Description
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. Genetically enhanced fructofuranosidase for obtaining the 6-kestose prebiotic.
La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6 y aún más preferiblemente, son 6-kestosa y 1-kestosa. The present invention relates to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, wherein said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Asparragine by the amino acid Serine at position 52 and / or the substitution of the amino acid Proline by the amino acid valine at position 232. Likewise, the present invention relates to a vector comprising said nucleotide sequence, to the expression product of said nucleotide sequence or to the cell comprising them in any of their combinations. On the other hand, the present invention refers to the use of said nucleotide sequence, to the use of the expression vector, to the use of the expression product or to the use of the cell, to obtain an enzymatic product with fructofuranosidase activity by a heterologous system. expression. Preferably the heterologous system is expressed in Saccharomyces cerevisiae. In addition, the present invention relates to a method for obtaining an enzyme product with fructofuranosidase activity. Finally, the present invention refers to the enzymatic product with fructofuranosidase activity obtainable by said method as well as to a method for obtaining oligosaccharides. Preferably said enzymatic product is capable of producing fructooligosaccharides. More preferably, the fructooligosaccharides have β-1,2, and β-2,6 bonds and even more preferably, they are 6-kestose and 1-kestose.
Estado de la técnica anterior Prior art
Las moléculas prebióticas líderes en el mercado europeo son los fructooligosacáridos (FOS) (Sangeetha et al., 2005. Trends Food Sci. Technol. 16: 442-457). Los FOS, resisten la digestión en la parte superior del tracto intestinal, se metabolizan por las bacterias endógenas del colon y estimulan su crecimiento (Rao, 1998. J. Nutr. 80: 1442S1445S). Los efectos de estas moléculas sobre la persona que los consume son muy variados: reducción de los episodios de diarreas causadas por rotavirus; mejora de los síntomas de la intolerancia a la lactosa; control del estreñimiento por aumento de la masa fecal; aumento de la absorción de calcio, y en consecuencia una reducción del riesgo de osteoporosis; disminución de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la nitro-reductasa, asociadas con el cáncer de colon; posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias, etc. The leading prebiotic molecules in the European market are fructooligosaccharides (FOS) (Sangeetha et al., 2005. Trends Food Sci. Technol. 16: 442-457). FOS, resist digestion in the upper part of the intestinal tract, are metabolized by endogenous bacteria of the colon and stimulate their growth (Rao, 1998. J. Nutr. 80: 1442S1445S). The effects of these molecules on the person who consumes them are very varied: reduction of diarrhea episodes caused by rotavirus; improvement of the symptoms of lactose intolerance; control of constipation due to increased fecal mass; increased calcium absorption, and consequently a reduced risk of osteoporosis; decreased mutagenic capacity of certain microbial enzymes such as nitro-reductase, associated with colon cancer; possible reduction of diseases related to dyslipidemia, etc.
Los FOS que se comercializan actualmente pertenecen a la serie 1F, están formados por moléculas de fructosa unidas por enlaces β,2-1, con una molécula de glucosa en un extremo (Yun, 1996. Enzyme Microb. Technol., 19: 107117); se abrevian como GFn, donde n está por lo general comprendido entre 2 y 4 unidades de fructosa (1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa). Hay interés industrial en la búsqueda de nuevos FOS con actividad prebiótica mejorada. Los fructooligosacáridos de la serie 6F, consisten en moléculas de fructosa unidas por enlaces β,2-6, con una molécula de glucosa en el extremo no reductor. Generalmente se obtienen mediante hidrólisis ácida a partir del polímero levano. Por vía sintética, se ha descrito la formación de FOS de la serie 6F como producto minoritario en la formación de 1kestosa a partir de la levansacarasa de Zymomonas mobilis (M. Bekers et al., 2002. Process Biochem., 38: 701-706). The FOS currently marketed belong to the 1F series, are formed by fructose molecules linked by β, 2-1 bonds, with a glucose molecule at one end (Yun, 1996. Enzyme Microb. Technol., 19: 107117) ; They are abbreviated as GFn, where n is usually between 2 and 4 units of fructose (1-kestose, nistose and fructosylnistose). There is industrial interest in the search for new FOS with improved prebiotic activity. The 6F series fructooligosaccharides consist of fructose molecules linked by β, 2-6 bonds, with a glucose molecule at the non-reducing end. They are generally obtained by acid hydrolysis from the polymer levano. Synthetically, the formation of FOS of the 6F series has been described as a minor product in the formation of 1kestosa from the Zymomonas mobilis levansacarase (M. Bekers et al., 2002. Process Biochem., 38: 701-706 ).
Es conocido que el uso de una fructofuranosidasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis (también conocida como Debaryomyces occidentalis) para la producción de FOS, que produce principalmente 6-kestosa, y 1-kestosa como producto secundario (WO/2007/074187). Utilizando como sustrato sacarosa a 600 g L−1 se obtuvo un nivel de producción máximo de FOS a las 24 h de reacción, y fue de 101 g L−1 delos76gL−1 son 6-kestosa, con una conversión total de sacarosa del 64%, (�?lvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol., 132(1): 75-81). It is known that the use of a fructofuranosidase from the yeast Schwanniomyces occidentalis (also known as Debaryomyces occidentalis) for the production of FOS, which produces mainly 6-kestose, and 1-kestose as a secondary product (WO / 2007/074187). Using as a sucrose substrate at 600 g L − 1 a maximum level of FOS production was obtained at 24 h reaction, and it was 101 g L − 1 delos76gL − 1 are 6-kestose, with a total sucrose conversion of 64 %, (? Lvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol., 132 (1): 75-81).
Por tanto, a pesar ser conocidos métodos de producción de oligosacáridos prebióticos, debido a la importancia industrial de los mismos, la mejora de su producción, mediante un proceso eficaz y viable industrialmente, es un aspecto pendiente de resolver en la actualidad. Therefore, despite being known methods of production of prebiotic oligosaccharides, due to their industrial importance, the improvement of their production, through an efficient and industrially viable process, is an aspect that must be resolved today.
Explicación de la invención Explanation of the invention.
La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6 y aún más preferiblemente, son 6-kestosa y 1-kestosa. El producto enzimático de la presente invención presenta una alta actividad específica, siendo candidatos idóneos para generar 6-kestosa como principal producto de transglicosilación. The present invention relates to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, wherein said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Asparragine by the amino acid Serine at position 52 and / or the substitution of the amino acid Proline by the amino acid valine at position 232. Likewise, the present invention relates to a vector comprising said nucleotide sequence, to the expression product of said nucleotide sequence or to the cell comprising them in any of their combinations. On the other hand, the present invention refers to the use of said nucleotide sequence, to the use of the expression vector, to the use of the expression product or to the use of the cell, to obtain an enzymatic product with fructofuranosidase activity by a heterologous system. expression. Preferably the heterologous system is expressed in Saccharomyces cerevisiae. In addition, the present invention relates to a method for obtaining an enzyme product with fructofuranosidase activity. Finally, the present invention refers to the enzymatic product with fructofuranosidase activity obtainable by said method as well as to a method for obtaining oligosaccharides. Preferably said enzymatic product is capable of producing fructooligosaccharides. More preferably, the fructooligosaccharides have β-1,2, and β-2,6 bonds and even more preferably, they are 6-kestose and 1-kestose. The enzymatic product of the present invention has a high specific activity, being suitable candidates to generate 6-kestose as the main transglycosylation product.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector agroalimentario dedicado a la obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales. También se relaciona con el campo de la industria farmacéutica y cosmética. The present invention falls within the field of the biotechnology industry and, in particular, in the agri-food sector dedicated to obtaining prebiotic oligosaccharides to be used as functional ingredients in dietary products, dairy products, baby foods and animal feed. It also relates to the field of the pharmaceutical and cosmetic industry.
En la presente invención, los productos enzimáticos nuevos producen aproximadamente 6 veces más 6-kestosa que la proteína nativa (sin modificar) en las mismas condiciones. Este aumento se relaciona con la modificación de la posición 196 de la proteína nativa (cuyo código genético no es el estándar), donde se sustituye el aminoácido Serina por Leucina (S196L) y con la sustitución de la posición Asparragina 52 por Serina (N52S) y Prolina 232 por Valina (P232V). Es decir, debido a la lectura del código genético del microorganismo S. occidentalis, en la posición 196 de dicha secuencia aminoacídica, hay una Serina. Cuando la secuencia nucleotídica que codifica para esta secuencia aminoacídica, procedente de S. occidentalis, se expresa en un sistema heterólogo que interpreta el código genético estándar, se inserta una Leucina en la posición 196 en el proceso de traducción. Esta secuencia con Leucina en la posición 196 es la que ha sido citada en el documento de patente WO/2007/074187. En la presente invención se demuestra que dicha secuencia con una Leu en la posición 196 es mucho más efectiva en la producción de 6-kestosa que una secuencia que tiene Serina en dicha posición (al igual que en la proteína nativa) cuando son expresadas ambas en un sistema heterólogo de expresión. Además, la sustitución del aminoácido Asparragina en la posición 52 por Serina (N52S) y la sustitución de Prolina en la posición 232 por Valina (P232V), en la secuencia que tiene una Leucina en la posición 196, mejora significativamente la eficacia en la producción del prebiótico 6-kestosa. In the present invention, new enzyme products produce approximately 6 times more 6-kestose than the native protein (unmodified) under the same conditions. This increase is related to the modification of position 196 of the native protein (whose genetic code is not the standard one), where the amino acid Serine is replaced by Leucine (S196L) and with the replacement of the position Asparagine 52 by Serine (N52S) and Prolina 232 for Valine (P232V). That is, due to the reading of the genetic code of the S. occidentalis microorganism, at position 196 of said amino acid sequence, there is a Serine. When the nucleotide sequence encoding this amino acid sequence, from S. occidentalis, is expressed in a heterologous system that interprets the standard genetic code, a Leucine is inserted at position 196 in the translation process. This sequence with Leucine at position 196 is the one cited in patent document WO / 2007/074187. In the present invention it is demonstrated that said sequence with a Leu in position 196 is much more effective in the production of 6-kestose than a sequence that has Serine in said position (as in the native protein) when both are expressed in a heterologous expression system. In addition, the replacement of the amino acid Asparagine in position 52 with Serine (N52S) and the replacement of Proline in position 232 with Valine (P232V), in the sequence that has a Leucine in position 196, significantly improves production efficiency. of the 6-kestosa prebiotic.
Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Thus, one aspect of the present invention refers to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, wherein said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Asparagine by the amino acid Serine at position 52 and / or the replacement of the amino acid Proline with the amino acid valine at position 232.
Una realización preferida de la presente invención se refiere a la secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquier secuencia nucleotídica cuya transcripción origine un ARN mensajero y su posterior traducción a la secuencia de aminoácidos. Debido a que el código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas secuencias de nucleótidos. Una realización más preferida se refiere a la secuencia nucleotídica, donde dicha secuencia, que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3. A preferred embodiment of the present invention refers to the nucleotide sequence according to claim 1, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence may be encoded by any nucleotide sequence whose transcription originates a messenger RNA and its subsequent translation. to the amino acid sequence. Because the genetic code is degenerated, the same amino acid can be encoded by different codons (triplets), therefore, the same amino acid sequence can be encoded by different nucleotide sequences. A more preferred embodiment refers to the nucleotide sequence, wherein said sequence, which codes for the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, is SEQ ID NO: 3.
La secuencia SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52. The sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, where said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Asparagine by the amino acid Serine at position 52.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a la secuencia nucleotídica, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 4. Según una realización más preferida de la secuencia nucleotídica, dicha secuencia nucleotídica, que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5. Another preferred embodiment of the present invention refers to the nucleotide sequence, where the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4. According to a more preferred embodiment of the nucleotide sequence, said nucleotide sequence, which codes for the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 , is SEQ ID NO: 5.
La secuencia SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición The sequence SEQ ID NO: 4 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 of Schwanniomyces occidentalis, where said amino acid sequence exhibits the replacement of the amino acid Proline by the amino acid valine in the position
232. 232.
En adelante, para hacer referencia a cualquiera de las secuencias nucleotídicas descritas en los párrafos anteriores, se puede usar la expresión “secuencia nucleotídica de la presente invención” o “secuencia nucleotídica de la invención”. Hereinafter, to refer to any of the nucleotide sequences described in the preceding paragraphs, the expression "nucleotide sequence of the present invention" or "nucleotide sequence of the invention" may be used.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de la invención. En adelante, para referirse al vector de expresión, se puede emplear la expresión “vector de la presente invención” o “vector de la invención”. Another aspect of the present invention relates to an expression vector comprising the nucleotide sequence of the invention. Hereinafter, to refer to the expression vector, the expression "vector of the present invention" or "vector of the invention" may be used.
El término “vector de expresión” se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención, el vector puede comprender la secuencia nucleotídica de la invención que, fusionadas al mismo puede replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector. Preferiblemente el vector de expresión es capaz de expresarse en un microorganismo tipo levadura. Más preferiblemente el vector es un vector de la serie pYES o pYC, capaces de expresarse en la levadura Saccharomyces cerevisiae. The term "expression vector" refers to a DNA fragment that has the ability to replicate in a given host and, as the term implies, can serve as a vehicle to multiply another DNA fragment that has been fused to it (insert ). Insert refers to a DNA fragment that is fused to the vector; In the case of the present invention, the vector may comprise the nucleotide sequence of the invention which, fused thereto, can be replicated in the appropriate host. The vectors can be plasmids, cosmids, bacteriophages or viral vectors, without excluding other types of vectors that correspond to the definition made of vector. Preferably the expression vector is capable of expressing itself in a yeast-like microorganism. More preferably, the vector is a vector of the pYES or pYC series, capable of expressing in Saccharomyces cerevisiae yeast.
Otro aspecto de la presente invención es el producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, Another aspect of the present invention is the expression product of the nucleotide sequence of the invention,
o del vector de la invención. El término “producto de la expresión” tal como se entiende en la presente invención hace referencia a cualquier producto resultante de la expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención. Así pues, como producto resultante de la expresión de la secuencia se entiende, por ejemplo, el ARN que se obtiene de la transcripción de la secuencia, el ARN procesado, la proteína resultante de la traducción del ARN modificada postraduccionalmente o no, o posteriores modificaciones de la secuencia nucleotídica en el interior de la célula siempre que la secuencia resultante tenga su origen en la secuencia original transferida o no pierda la característica funcional que la caracteriza en la presente invención. or of the vector of the invention. The term "expression product" as understood in the present invention refers to any product resulting from the expression of the nucleotide sequence of the invention. Thus, as a product resulting from the expression of the sequence it is understood, for example, the RNA that is obtained from the transcription of the sequence, the processed RNA, the protein resulting from the translation of the RNA modified post-translationally or not, or subsequent modifications of the nucleotide sequence inside the cell as long as the resulting sequence has its origin in the original sequence transferred or does not lose the functional characteristic that characterizes it in the present invention.
Otro aspecto de la presente invención es una célula que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, o el vector de la invención o el producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, o cualquiera de las combinaciones de secuencia nucleotídica, vector de expresión o producto de expresión. En adelante, para referirse a dicha célula, se puede emplear la expresión “célula de la presente invención” o “célula de la invención”. El término “célula” tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una célula procariótica o eucariótica. Así pues, el término célula comprende, al menos, una célula diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular). Another aspect of the present invention is a cell comprising the nucleotide sequence of the invention, or the vector of the invention or the expression product of the nucleotide sequence of the invention, or any combination of nucleotide sequence, expression vector or expression product. Hereinafter, to refer to said cell, the expression "cell of the present invention" or "cell of the invention" can be used. The term "cell" as understood in the present invention refers to a prokaryotic or eukaryotic cell. Thus, the term cell comprises at least one differentiated or undifferentiated cell. Likewise, a protoplast (cell of a plant that lacks a cell wall) is also included in this definition.
La célula transformada con un vector que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, puede incorporar la secuencia en alguno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial y/o cloroplástico, o permanecer como parte de un vector que posee su propia maquinaria para autoreplicarse. La selección de la célula que ha incorporado cualquiera de las secuencias de la invención se lleva a cabo por medio de la adición de antibióticos al medio de cultivo o por medio de la no adición al medio de cultivo de algún aminoácido esencial para el metabolismo de dicha célula. En el primer caso, la resistencia de estas células a sustancias como los antibióticos está producida por la síntesis de moléculas codificadas por una secuencia comprendida en la secuencia del vector. En el segundo caso, las células transformadas con el vector de la invención deben ser auxótrofas para un determinado aminoácido esencial y el vector de expresión debe comprender al menos una secuencia que codifique para dicho aminoácido. The cell transformed with a vector comprising the nucleotide sequence of the invention, can incorporate the sequence into any of the cell's DNA; nuclear, mitochondrial and / or chloroplast, or remain as part of a vector that has its own machinery for self-replication. The selection of the cell that has incorporated any of the sequences of the invention is carried out by adding antibiotics to the culture medium or by not adding to the culture medium any amino acid essential for the metabolism of said cell. In the first case, the resistance of these cells to substances such as antibiotics is produced by the synthesis of molecules encoded by a sequence comprised in the sequence of the vector. In the second case, the cells transformed with the vector of the invention must be auxotrophic for a certain essential amino acid and the expression vector must comprise at least one sequence encoding said amino acid.
Un aspecto más de la presente invención es el uso de la secuencia nucleotídica de la invención, del vector de la invención, de la célula de la invención, o del producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. A further aspect of the present invention is the use of the nucleotide sequence of the invention, of the vector of the invention, of the cell of the invention, or of the expression product of the nucleotide sequence of the invention, to obtain a product Enzymatic with fructofuranosidase activity by a heterologous expression system.
El término “producto enzimático con actividad fructofuranosidasa” se refiere a una enzima identificada cuya actividad es identificada con el número EC 3.2.1.26, es decir, dicho número ha sido asignado por la Enzyme Commission number de acuerdo a las reacciones químicas que cataliza (IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number 9001-42-7). La enzima capaz de llevar a cabo este tipo de reacción química se denomina Beta-fructofuranosidasa (β-fructofuranosidasa) o alternativamente invertasa o sacarasa. Dicha enzima es capaz de hidrolizar la sacarosa en fructosa y glucosa. Esta enzima también es capaz de catalizar reacciones fructotransferasa (transfructosidasa). The term “enzymatic product with fructofuranosidase activity” refers to an identi fi ed enzyme whose activity is identi fi ed with EC number 3.2.1.26, that is, that number has been assigned by the Enzyme Commission number according to the chemical reactions it catalyzes (IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number 9001-42-7). The enzyme capable of carrying out this type of chemical reaction is called Beta-fructofuranosidase (β-fructofuranosidase) or alternatively invertase or sucrose. Said enzyme is capable of hydrolyzing sucrose in fructose and glucose. This enzyme is also capable of catalyzing fructotransferase (transfructosidase) reactions.
El término “sistema heterólogo de expresión” tal como se emplea en la presente invención hace referencia a un sistema de expresión que comprende las herramientas necesarias para que la secuencia nucleotídica, el vector o la célula de la invención pueda transcribirse y traducirse en una secuencia aminoacídica, donde dicho sistema de expresión es capaz de expresarse en una especie distinta de la especie Schwanniomyces occidentalis o de una especie cuyo código genético sea diferente del código genético estándar. The term "heterologous expression system" as used in the present invention refers to an expression system comprising the necessary tools so that the nucleotide sequence, the vector or the cell of the invention can be transcribed and translated into an amino acid sequence. , where said expression system is capable of expressing itself in a species other than the Schwanniomyces occidentalis species or of a species whose genetic code is different from the standard genetic code.
La expresión de la secuencia nucleotídica de la invención mediante dicho sistema de expresión heterólogo es importante ya que, de expresarse en un sistema capaz de expresar dicha secuencia en el organismo Schwanniomyces occidentales, el codón CUG que, según el código genético corresponde a Leucina, daría lugar a una secuencia aminoacídica diferente ya que según el código genético 12 (Alternative Yeast Nuclear Code), dicho triplete codifica para el aminoácido Serina. The expression of the nucleotide sequence of the invention by said heterologous expression system is important since, if expressed in a system capable of expressing said sequence in the Western Schwanniomyces organism, the CUG codon which, according to the genetic code corresponds to Leucine, would give instead of a different amino acid sequence because according to genetic code 12 (Alternative Yeast Nuclear Code), said triplet codes for the amino acid Serine.
Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso de la secuencia nucleotídica de la invención, del vector de la invención, de la célula de la invención, o del producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, donde el sistema heterólogo expresa dicha secuencia nucleotídica en al menos una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae. A preferred embodiment of the present invention refers to the use of the nucleotide sequence of the invention, of the vector of the invention, of the cell of the invention, or of the expression product of the nucleotide sequence of the invention, where the heterologous system expresses said nucleotide sequence in at least one host cell of Saccharomyces cerevisiae.
Además, el producto enzimático de la invención o las células de S cerevisiae, productoras de dicho producto, pueden usarse como tal o de manera inmovilizada, acopladas física o químicamente a un material portador. In addition, the enzymatic product of the invention or S cerevisiae cells, producers of said product, can be used as such or in an immobilized manner, physically or chemically coupled to a carrier material.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity comprising:
a) modificar la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 de tal forma que se obtenga una secuencia nucleotídica que codifique para una secuencia aminoacídica que presente la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232, a) modify the nucleotide sequence that codes for SEQ ID NO: 1 so that a nucleotide sequence is obtained that codes for an amino acid sequence that presents the substitution of the amino acid Asparagine by the amino acid Serine at position 52 and / or the substitution of the amino acid proline by the amino acid valine at position 232,
b) insertar al menos una secuencia nucleotídica obtenida en el paso (a) en un vector de expresión capaz de expresar dicha secuencia nucleotídica en un microorganismo que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis (mediante dicho sistema heterólogo de expresión), b) inserting at least one nucleotide sequence obtained in step (a) into an expression vector capable of expressing said nucleotide sequence in a microorganism belonging to a different species of Schwanniomyces occidentalis (by said heterologous expression system),
c) transformar el producto obtenido en el paso (b) al menos en una célula de dicho microorganismo, y c) transforming the product obtained in step (b) into at least one cell of said microorganism, and
d) cultivar la célula obtenida en el paso (c) en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las levaduras transformadas o del sistema heterólogo seleccionado. d) culturing the cell obtained in step (c) in a culture medium suitable for the growth of the transformed yeasts or the selected heterologous system.
La transformación a la que se hace referencia en el paso (c) del método se lleva a cabo por medio de técnicas que forman parte del conocimiento general común, como por ejemplo, transformación genética mediada por electroporación, mediante acetato de litio, etc. Mediante estas técnicas se puede conseguir introducir, de forma estable, un vector que incluye cualquiera de las secuencias de la invención, de forma que, tras sucesivas divisiones de la célula, la secuencia incorporada sigue expresándose. The transformation referred to in step (c) of the method is carried out by means of techniques that are part of the common general knowledge, such as, for example, electroporation-mediated genetic transformation, by lithium acetate, etc. By means of these techniques it is possible to introduce, in a stable manner, a vector that includes any of the sequences of the invention, so that, after successive divisions of the cell, the incorporated sequence continues to be expressed.
El medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las levaduras transformadas o del sistema heterólogo seleccionado es conocido por el experto en la materia y dependerá del tipo de levadura transformada (teniendo en cuenta también las auxotrofías) así como del vector de expresión. En los ejemplos de la presente invención se emplea un medio de cultivo con galactosa donde se activa la expresión del gen introducido ya que dicha secuencia nucleotídica se ha colocado bajo el control del promotor GAL. The suitable culture medium for the growth of the transformed yeasts or of the selected heterologous system is known to the person skilled in the art and will depend on the type of transformed yeast (also taking into account auxotrophies) as well as the expression vector. In the examples of the present invention, a galactose culture medium is used where the expression of the introduced gene is activated since said nucleotide sequence has been placed under the control of the GAL promoter.
Una realización preferida de la presente invención se refiere el método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde además comprende el paso e); recuperar el producto enzimático con actividad fructofuranosidasa del medio de cultivo y/o de las células del microorganismo. Dicho producto enzimático puede ser excretado por las células al medio de cultivo en el que están creciendo. El producto también puede recuperarse del interior de las células que lo producen mediante cualquier técnica que permita la lisis de dichas células o mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica que permita la salida de dicho producto enzimático de las células. A preferred embodiment of the present invention refers to the method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, where it also comprises step e); recover the enzymatic product with fructofuranosidase activity from the culture medium and / or the microorganism cells. Said enzymatic product can be excreted by the cells to the culture medium in which they are growing. The product can also be recovered from within the cells that produce it by any technique that allows the lysis of said cells or by any technique known in the state of the art that allows the exit of said enzymatic product from the cells.
El producto enzimático crudo, resultado del anterior método de la invención, puede ser utilizado industrialmente para la obtención de oligosacáridos sin requerir etapas de separación o purificación posteriores. No obstante, se puede proceder a la recuperación de dicho producto enzimático del medio de cultivo y/o de las células, pues la enzima objeto de la invención se libera extracelularmente de forma parcial. Así pues, en la presente invención, el producto enzimático puede encontrarse tanto en la suspensión de células con el medio de cultivo, como en la fracción celular o en la fracción libre de células. Mediante métodos convencionales, el experto en la materia escogerá el producto enzimático de partida más apropiado a cada procedimiento industrial, es decir, crudo o con más o menos nivel de purificación. La recuperación del producto enzimático con actividad fructofuranosidasa se lleva a cabo mediante técnicas que forma parte del conocimiento general común y por tanto, están disponibles a un experto en la materia. Por ejemplo, el aislamiento o recuperación del producto enzimático se lleva a cabo por ejemplo, pero sin limitarse, mediante precipitación de dicho producto con fraccionamiento salino, precipitación por calor, precipitación isoeléctrica, con disolventes orgánicos o con polímeros, con acetona fría o mediante cromatografía. The crude enzyme product, the result of the previous method of the invention, can be used industrially to obtain oligosaccharides without requiring subsequent separation or purification steps. However, said enzymatic product can be recovered from the culture medium and / or the cells, since the enzyme object of the invention is partially released extracellularly. Thus, in the present invention, the enzyme product can be found both in the cell suspension with the culture medium, as in the cell fraction or in the cell-free fraction. By means of conventional methods, the person skilled in the art will choose the most appropriate starting enzyme product for each industrial process, that is, crude or with more or less purification level. The recovery of the enzymatic product with fructofuranosidase activity is carried out by means of techniques that are part of the common general knowledge and are therefore available to a person skilled in the art. For example, the isolation or recovery of the enzymatic product is carried out, for example, but not limited, by precipitation of said product with saline fractionation, heat precipitation, isoelectric precipitation, with organic solvents or with polymers, with cold acetone or by chromatography .
Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde la secuencia aminoacídica del paso (a) es SEQ ID NO: 2. Otra realización más preferida de la presente invención es el método, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, where the amino acid sequence of step (a) is SEQ ID NO: 2. Another more preferred embodiment of the present invention is the method, wherein said nucleotide sequence, which codes for the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, is SEQ ID NO: 3.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde la secuencia aminoacídica del paso (a) es SEQ ID NO: 4. Una realización más preferida es el método, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, esSEQ IDNO: 5. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, where the amino acid sequence of step (a) is SEQ ID NO: 4. A more preferred embodiment is the method, wherein said nucleotide sequence , which codes for the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, is SEQ IDNO: 5.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde el microorganismo que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis del paso (b) es Saccharomyces cerevisiae. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, where the microorganism belonging to a different species of Schwanniomyces occidentalis of step (b) is Saccharomyces cerevisiae.
Según otra realización preferida del método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, el cultivo de la célula según el paso (c) se lleva a cabo a una temperatura de entre 28 y 30ºC. According to another preferred embodiment of the method for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, the cell culture according to step (c) is carried out at a temperature between 28 and 30 ° C.
En adelante, para referirse a cualquiera de los métodos para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, descrito en párrafos anteriores, puede usarse la expresión “método de la presente invención” o “método de la invención”. Hereinafter, to refer to any of the methods for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity, described in previous paragraphs, the expression "method of the present invention" or "method of the invention" can be used.
Otro aspecto de la presente invención es el producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por el método de la invención. Según una realización preferida, el producto enzimático tiene actividad transfructosidasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos. El sustrato glucídico se selecciona de entre sacarosa, glucosa, fructosa, 6-kestosa o 1-kestosa. Preferiblemente el sustrato glucídico es sacarosa. Another aspect of the present invention is the enzymatic product with fructofuranosidase activity obtainable by the method of the invention. According to a preferred embodiment, the enzyme product has transfructosidase activity in the presence of one or more glycidic substrates. The glycidic substrate is selected from sucrose, glucose, fructose, 6-kestose or 1-kestose. Preferably the glycidic substrate is sucrose.
Otra realización preferida se refiere al producto enzimático, donde los productos resultantes de la actividad transfructosidasa son fructooligosacáridos. Una realización más preferida se refiere al producto eznimático donde los productos resultantes de la actividad transfructosidasa son fructooligosacáridos con enlaces β-1,2, y β-2,6. Según otra realización aún más preferida, los fructooligosacáridos con enlaces β-1,2, y β-2,6 son 6-kestosa y 1-kestosa. Además de la actividad fructofuranosidasa, el producto enzimático de la invención tiene actividad transfructosidasa. Los productos resultantes de la actividad transfructosidasa son, entre otros, fructooligosacáridos de la serie 6F (en particular 6-kestosa) y muy minoritariamente de la serie 1F (en particular 1-kestosa). Another preferred embodiment refers to the enzyme product, where the products resulting from the transfructosidase activity are fructooligosaccharides. A more preferred embodiment refers to the eznimatic product where the products resulting from the transfructosidase activity are fructooligosaccharides with β-1,2, and β-2,6 bonds. According to another even more preferred embodiment, the fructooligosaccharides with β-1,2, and β-2,6 bonds are 6-kestose and 1-kestose. In addition to the fructofuranosidase activity, the enzyme product of the invention has transfructosidase activity. The products resulting from the transfructosidase activity are, among others, fructooligosaccharides of the 6F series (in particular 6-kestosa) and very minority of the 1F series (in particular 1-kestosa).
En adelante, para referirse a cualquiera de los productos enzimáticos con actividad fructofuranosidasa obtenible por el método de la invención, descrito en párrafos anteriores, puede usarse la expresión “producto enzimático de la presente invención” o “producto enzimático de la invención”. Hereinafter, to refer to any of the enzymatic products with fructofuranosidase activity obtainable by the method of the invention, described in the preceding paragraphs, the expression "enzymatic product of the present invention" or "enzymatic product of the invention" can be used.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención de oligosacáridos que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining oligosaccharides comprising:
a) poner en contacto, in vitro, el producto enzimático de la invención con al menos un sustrato glucídico, e a) contacting, in vitro, the enzyme product of the invention with at least one glycidic substrate, and
b) incubar la mezcla descrita en el paso (a). b) incubate the mixture described in step (a).
La incubación de la mezcla del paso (b) se lleva a cabo mediante condiciones óptimas para una enzima fructofuranosidasa. Un ejemplo de dichas condiciones se muestra en la tabla 5 de los ejemplos de la presente invención. The incubation of the mixture from step (b) is carried out by optimal conditions for a fructofuranosidase enzyme. An example of such conditions is shown in Table 5 of the examples of the present invention.
Una realización preferida se refiere al método para la obtención de oligosacáridos, que además comprende el paso c); recuperar los oligosacáridos obtenidos tras la incubación descrita en el paso (b). A preferred embodiment refers to the method for obtaining oligosaccharides, which further comprises step c); recover the oligosaccharides obtained after the incubation described in step (b).
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Descripción de las figuras Description of the fi gures
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras: With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes. :
Fig. 1. Muestra el análisis por MALDI-TOF de la Fructofuranosidasa de S. occidentalis. Fig. 1. Shows the MALDI-TOF analysis of the S. occidentalis Fructofuranosidase.
Se muestra la intensidad relativa (intensidad [u.a; unidades de cuentas]) de los péptidos trípticos ionizados frente a la masa/carga (m/z) de los mismos. El sobrenadante de la digestión con tripsina se analizó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF modelo Autoflex de Bruker equipado con reflector, empleando HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) como matriz en condiciones de saturación. The relative intensity (intensity [u.a; units of counts]) of the ionized tryptic peptides against the mass / charge (m / z) thereof is shown. Trypsin digestion supernatant was analyzed on a Bruker Auto fl ex model MALDI-TOF mass spectrometer equipped with a reflector, using HCCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) as a matrix under saturation conditions.
Fig. 2. Muestra la actividad de la enzima fructofuranosidasa extracelular valorada en S. cerevisiae SoINV-Leu en medio de cultivo rico YPGal. Fig. 2. Shows the activity of the extracellular fructofuranosidase enzyme valued in S. cerevisiae SoINV-Leu in YPGal rich culture medium.
La levadura se precultivó en el medio mínimo SC(U)D y se creció en YPGal con agitación constante a 200 rpm y 30ºC durante 28 h. Se representa el crecimiento del cultivo en UD0660 nm (círculos) y la actividad valorada en el medio extracelular, en U (cuadrados). La actividad se ensayó sobre sacarosa al 5%. The yeast was precultured in the minimum medium SC (U) D and grown in YPGal with constant stirring at 200 rpm and 30 ° C for 28 h. The growth of the culture in UD0660 nm (circles) and the activity valued in the extracellular medium are represented in U (squares). The activity was tested on 5% sucrose.
Fig. 3 Muestra el perfil de productos obtenidos tras la incubación de sacarosa con la enzima purificada (F-2) de SoINV-Ser. Fig. 3 Shows the profile of products obtained after incubation of sucrose with the purified enzyme (F-2) of SoINV-Ser.
Las condiciones de reacción son las indicadas en el texto y las condiciones de análisis mediante HPLC y los nombres de los compuestos son los mismos que en la tabla 5. El análisis corresponde a las6hde reacción. The reaction conditions are those indicated in the text and the HPLC analysis conditions and the names of the compounds are the same as in Table 5. The analysis corresponds to the reaction hours.
Fig. 4. Muestra el perfil de productos obtenidos tras la incubación de sacarosa con la enzima purificada (F-2) de SoINV-Leu. Fig. 4. It shows the profile of products obtained after incubation of sucrose with the purified enzyme (F-2) of SoINV-Leu.
Las condiciones de reacción son las indicadas en el texto y las condiciones de análisis mediante HPLC y los nombres de los compuestos son los mismos que en la tabla 5. El análisis corresponde a las 72 h de reacción. The reaction conditions are those indicated in the text and the HPLC analysis conditions and the names of the compounds are the same as in Table 5. The analysis corresponds to the 72 h reaction.
Fig. 5. Muestra la comparación del % total de FOS producido a lo largo de 75 h de reacción por la fructofuranosidasa de S. occidentalis. Fig. 5. It shows the comparison of the total% of FOS produced during 75 hours of reaction by fructofuranosidase of S. occidentalis.
Fructofuranosidasa expresada en el organismo donante (triángulos), la fructofuranosidasa expresada en S. cerevisiae, SoINV-Ser (cuadrados) y SoINV-Leu (rombos). Fructofuranosidase expressed in the donor organism (triangles), fructofuranosidase expressed in S. cerevisiae, SoINV-Ser (squares) and SoINV-Leu (rhombuses).
Fig. 6. Muestra el máximo nivel de producción de los FOS (6-kestosa y 1-kestosa) obtenido por la SoINV de S. occidentalis (SoI) y la expresada en S. cerevisiae que incluye Serina (196S) o Leucina (196L) en la posición 196 de la proteína nativa. Fig. 6. It shows the maximum production level of the FOS (6-kestosa and 1-kestosa) obtained by the SoINV of S. occidentalis (SoI) and the one expressed in S. cerevisiae that includes Serina (196S) or Leucine (196L ) at position 196 of the native protein.
Fig. 7. Muestra el máximo nivel de producción de los FOS (6-kestosa y 1-kestosa) obtenido por diferentes secuencias que codifican para diferentes fructofuranosidas. Fig. 7. It shows the maximum level of FOS production (6-kestosa and 1-kestosa) obtained by different sequences that code for different fructofuranosides.
En la figura se representa SoINV de S. occidentalis (SoI) y la expresada en S. cerevisiae que incluye Serina (196S), The figure represents SoINV of S. occidentalis (SoI) and that expressed in S. cerevisiae which includes Serina (196S),
o Leucina (196L) en la posición 196 y de esta última que incluye, además, Serina en la posición 52 en lugar de Asparragina (196L N52S) o Valina en la posición 232 en lugar de Prolina (196L P232V). or Leucine (196L) at position 196 and the latter which also includes Serina at position 52 instead of Asparagine (196L N52S) or Valine at position 232 instead of Prolina (196L P232V).
Ejemplos Examples
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen la modificación de la secuencia amininoacídica original (SEQ ID NO: 1) y expresión de las fructofuranosidasas modificadas de S. occidentalis en un sistema heterólogo así como su uso para la producción de FOS. The invention will now be illustrated by illustrative and non-limiting tests carried out by the inventors describing the modification of the original amininoacidic sequence (SEQ ID NO: 1) and expression of the modified fructofuranosidases of S. occidentalis in a heterologous system as well as its use for the production of FOS.
Ejemplo 1 Example 1
Modificación de la secuencia amininoacídica original (SEQ ID NO: 1) y expresión de las fructofuranosidasas modificadas de S. occidentalis en un sistema heterólogo Modification of the original amininoacidic sequence (SEQ ID NO: 1) and expression of the modified fructofuranosidases of S. occidentalis in a heterologous system
La Fructofuranosidasa con actividad fructosiltransferasa de S. occidentalis se se purificó a partir del medio extracelular de esta levadura tal y como se describió anteriormente (�?lvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol., 132(1): 75-81). La proteína purificada se digirió con tripsina y analizó por espectrometría de masas MALDI-TOF en el Servicio de Proteómica del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). El resultado del análisis se muestra en la Fig 1. El análisis de los péptidos trípticos fue compatible con la secuencia del gen codificante descrito en el documento de patente WO/2007/074187 salvo en lo referente al fragmento de 2005.023 m/z, marcado con una flecha en la Fig Fructofuranosidase with fructosyltransferase activity of S. occidentalis was purified from the extracellular medium of this yeast as described above (�? Lvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol., 132 (1): 75- 81). The purified protein was digested with trypsin and analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry at the Proteomics Service of the Severo Ochoa Molecular Biology Center (UAM-CSIC). The result of the analysis is shown in Fig. 1. The analysis of the tryptic peptides was compatible with the sequence of the coding gene described in patent document WO / 2007/074187 except for the 2005.023 m / z fragment, labeled with a arrow in Fig
1. La secuencia aminoacídica de dicho fragmento tríptico marcado con una flecha en la figura 1, fue determinada por espectrometría seguida de electrospray-trampa iónica y se corresponde una secuencia donde en la posición 196 de la proteína nativa hay una Serina en lugar de una Leucina tal y como correspondería con la lectura estándar del código genético, y con la secuencia citada en dicho documento de patente WO/2007/074187. Es decir, debido a la lectura del código genético del microorganismo S. occidentalis, en la posición 196 de dicha secuencia aminoacídica, hay una Serina. Cuando la secuencia nucleotídica que codifica para esta secuencia aminoacídica, procedente de S. occidentalis, se expresa en un sistema heterólogo que interpreta el código genético estándar, se inserta una Leucina en la posición 196 en el proceso de traducción. 1. The amino acid sequence of said triptych fragment marked with a arrow in Figure 1, was determined by spectrometry followed by ionic trap-ion trap and corresponds to a sequence where at position 196 of the native protein there is a Serine instead of a Leucine as it would correspond to the standard reading of the genetic code, and with the sequence cited in said patent document WO / 2007/074187. That is, due to the reading of the genetic code of the S. occidentalis microorganism, at position 196 of said amino acid sequence, there is a Serine. When the nucleotide sequence encoding this amino acid sequence, from S. occidentalis, is expressed in a heterologous system that interprets the standard genetic code, a Leucine is inserted at position 196 in the translation process.
La Serina que ocupa la posición 196 no parece formar parte, a priori, de los motivos estructurales implicados en la reacción catalizada por la enzima de S. occidentalis. De hecho, esta posición está ocupada por el aminoácido Glutámico en otras fructosiltransferasas, como en la levansucrasa de Bacillus subtilis (Meng y Fütterer, 2003. Nat Struct Biol., 10(11): 935-41) o la de Gluconoazetobacter diazotrophicus (C. Martínez-Fleites et al., 2005. Biochem J., The Serine occupying position 196 does not appear to be a priori part of the structural motives involved in the reaction catalyzed by the enzyme of S. occidentalis. In fact, this position is occupied by the glutamic amino acid in other fructosyltransferases, such as in Bacillus subtilis levansucrase (Meng and Fütterer, 2003. Nat Struct Biol., 10 (11): 935-41) or Gluconoazetobacter diazotrophicus (C Martínez-Fleites et al., 2005. Biochem J.,
15: 19-27). 15: 19-27).
Se amplificó el gen codificante (1.6 kb) de la actividad fructofuranosidasa de S. occidentalis ATCC26077, utilizando la técnica estándar de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), ADN genómico de la levadura y oligonucleótidos dirigidos hacia la secuencia de los extremos de la fase de lectura abierta (ORF) del gen, ya depositada en las bases de datos (secuencia de acceso número X17604). Se obtuvo la secuencia SEQ ID NO: 1, descrita en el documento de patente WO/2007/074187. En la amplificación se utilizaron los oligonucleótidos descritos en la Tabla 1. The coding gene (1.6 kb) of the fructofuranosidase activity of S. occidentalis ATCC26077 was amplified using the standard PCR technique (Polymerase Chain Reaction), yeast genomic DNA and oligonucleotides directed towards the sequence of the ends of the Open reading phase (ORF) of the gene, already deposited in the databases (access sequence number X17604). The sequence SEQ ID NO: 1, described in patent document WO / 2007/074187, was obtained. In the ampli fi cation the oligonucleotides described in Table 1 were used.
TABLA 1 TABLE 1
Oligonucleótidos empleados en la amplificación del gen codificante para la Fructofuranosidasa de S. occidentalis Oligonucleotides used in the ampli fi cation of the gene coding for Fructofuranosidase of S. occidentalis
En negrita se muestra la secuencia de corte de la enzima de restricción BamHI y XbaI utilizada para el posterior clonaje del fragmento amplificado. Las secuencias se muestran de 5’ a 3’. The sequence of the restriction enzyme BamHI and XbaI used for the subsequent cloning of the amplified fragment is shown in bold. The sequences are shown from 5 ’to 3’.
El producto amplificado se insertó en el plásmido pstBlue1 (pstBlue1; Perfectly cloning vector; Novagen) y su integridad se comprobó por secuenciación utilizando oligonucleótidos dirigidos hacia la secuencia de la Fructofuranosidasa utilizando la metodología estándar (Servicio de secuenciación del SIDI, UAM). A tenor de que en la posición 196 de la proteína nativa, según se determinó por espectrometría de masas, hay una Serina en lugar de una Leucina, se indujo en ella el cambio del triplete CTG (596-598) por TCA (596-598) utilizando PCR y los oligonucleótidos 196S Fw y 196S Rv que figuran en la Tabla 2. The ampli fi ed product was inserted into plasmid pstBlue1 (pstBlue1; Perfectly cloning vector; Novagen) and its integrity was checked by sequencing using oligonucleotides directed to the Fructofuranosidase sequence using the standard methodology (SIDI Sequencing Service, UAM). Given that at position 196 of the native protein, as determined by mass spectrometry, there is a Serine instead of a Leucine, the change of the CTG triplet (596-598) by TCA (596-598) was induced ) using PCR and the 196S Fw and 196S Rv oligonucleotides shown in Table 2.
La Serina 196 se sustituyó también por Glutámico, realizando el cambio del triplete CTG (596-598) por GAA (596-598); se utilizó PCR y los oligonucleótidos 196E Fw y 196E Rv que figuran en la Tabla 2. Serine 196 was also replaced by Glutamic, changing the CTG triplet (596-598) with GAA (596-598); PCR was used and oligonucleotides 196E Fw and 196E Rv shown in Table 2.
TABLA 2 TABLE 2
Oligonucleótidos empleados en la sustitución del triplete CTG por TCA y del triplete CTG por GAA del gen codificante para la Fructofuranosidasa de S. occidentalis Oligonucleotides used to replace the CTG triplet with TCA and the CTG triplet with GAA of the S. Westernis Fructofuranosidase coding gene
En negrita se resalta el triplete sustituido. Las secuencias se muestran de 5’ a 3’. In bold, the substituted triplet is highlighted. The sequences are shown from 5 ’to 3’.
Además, utilizando una metodología similar a la anteriormente descrita se sustituyeron distintos residuos aminoacídicos de la secuencia aminoacídica de la proteína SoINV-Leu (SEQ ID NO: 1), es decir, se sustituyeron algunos aminoácidos de la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Se llevaron a cabo las siguientes sustituciones: In addition, using a methodology similar to the one described above, different amino acid residues of the amino acid sequence of the SoINV-Leu protein (SEQ ID NO: 1) were substituted, that is, some amino acids of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 were substituted. The following substitutions were made:
- --
- Asparragina por Serina de la posición 52. Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término N52S. La secuencia aminoacídica que presenta esta modificación es SEQ ID NO: 2. Serine asparagine from position 52. To refer to this substitution, the term N52S can be used. The amino acid sequence presented by this modification is SEQ ID NO: 2.
- --
- Prolina por Valina en la posición 232. Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término P232V. La secuencia aminoacídica que presenta esta modificación es SEQ ID NO: 4. Proline for Valine at position 232. To refer to this substitution, the term P232V can be used. The amino acid sequence presented by this modification is SEQ ID NO: 4.
Para la sustitución de la posición 52 ó 232 de la proteína SoINV-Leu196 se utilizó PCR, y como ADN molde el gen codificante para la fructofuranosidasa de S. occidentalis que contiene Leucina en la posición 196 incluido en el vector pYES2.0 obtenido tal y como se describe en el apartado correspondiente de la presente solicitud. Cada reacción incluía: 5U (1 μl) de High Fidelity Plus TM (Roche), 10 μl del tampón para esta enzima 5x, 1 μl de dNTs 40 mM, 1 μl del ADN descrito, 1 μl de cada uno de los oligonucleótidos cebadores que se muestran en la tabla 3. For the replacement of position 52 or 232 of the SoINV-Leu196 protein, PCR was used, and as a template DNA the coding gene for fructofuranosidase of S. occidentalis containing Leucine at position 196 included in the vector pYES2.0 obtained as and as described in the corresponding section of this application. Each reaction included: 5U (1 μl) of High Fidelity Plus TM (Roche), 10 μl of the buffer for this 5x enzyme, 1 μl of 40 mM dNTs, 1 μl of the described DNA, 1 μl of each of the oligonucleotide primers that are shown in table 3.
TABLA 3 TABLE 3
Oligonucleótidos empleados en la sustitución de la posición 52 ó 232 de la proteína SoINV-Leu196 Oligonucleotides used in the replacement of position 52 or 232 of the SoINV-Leu196 protein
En negrita se resalta el triplete sustituido. Las secuencias se muestran de 5’ a 3’. In bold, the substituted triplet is highlighted. The sequences are shown from 5 ’to 3’.
- --
- Triptófano por Tirosina en la posición 47. Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término W47Y. Tryptophan for Tyrosine at position 47. To refer to this substitution, the term W47Y can be used.
- --
- Asparragina por Serina en la posición 49. Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término N49S. Serine asparagine at position 49. To refer to this substitution, the term N49S can be used.
- --
- Lisina por Fenilalanina en la posición 181. Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término K181F. Lysine by Phenylalanine at position 181. To refer to this substitution, the term K181F can be used.
En el clonaje y amplificación de los productos de PCR se utilizó la cepa de Escherichia coli DH5α [(F’I EndA1, hsdR17 (rk-mk-) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Naf) relA1 Δ(laclZYA-argF) U169 deoR (ϕ80dlacΔ(lacZ)M15)] que fue crecida y transformada siguiendo la metodología estándar. In the cloning and amplification of the PCR products, the Escherichia coli strain DH5α [(F'I EndA1, hsdR17 (rk-mk-) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Naf) relA1 Δ (laclZYA-argF) U169 deoR was used (ϕ80dlacΔ (lacZ) M15)] which was grown and transformed following the standard methodology.
El gen codificante para la fructofuranosidasa de S. occidentalis incluido en el vector pstBlue1, que contiene Leucina, Serina o Glutámico en la posición 196 o que contiene Leucina en la posición 196 más Serina, Valina, Tirosina, Serina o Fenilalanina en las posiciones 52, 232, 47, 49 y 181, respectivamente, se obtuvo digiriendo con BamHI y XbaI y se fusionó al vector bifuncional (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) pYES2.0 (Invitrogen) previamente linearizado con estas mismas enzimas de restricción. Este plásmido incluye como marcador bacteriano el gen que confiere resistencia a ampicilina, el origen de replicación del plásmido de 2 μm de levadura, el promotor de S. cerevisiae regulable por galactosa pGAL1 y URA3 como marcador de selección. The gene coding for the fructofuranosidase of S. occidentalis included in the vector pstBlue1, which contains Leucine, Serine or Glutamic in position 196 or which contains Leucine in position 196 plus Serine, Valine, Tyrosine, Serine or Phenylalanine at positions 52, 232, 47, 49 and 181, respectively, was obtained by digesting with BamHI and XbaI and fused to the bifunctional vector (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) pYES2.0 (Invitrogen) previously linearized with these same restriction enzymes. This plasmid includes as a bacterial marker the gene that confers resistance to ampicillin, the origin of plasmid replication of 2 μm of yeast, the promoter of S. cerevisiae adjustable by galactose pGAL1 and URA3 as a selection marker.
La construcción obtenida en E. coli, SoINV-pYES2 Leu 196 (SoINV-Leu), Ser 196 (SoINV-Ser), o Glu 196 (SoINV-Glu) así como SoINV-Leu con las modificaciones N52S, P232V, W47Y, N49S o K181F, se verificaron por PCR y posterior secuenciación; se incluyeron en la cepa de S. cerevisiae EUROSCARF YIL162w [BY4741; Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0; YIL162w::kanMX4] (accession code Y02321) utilizando la metodología estándar de transformación por acetato de litio. En ausencia del plásmido recombinante, esta cepa de S. cerevisiae es incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono por la deleción del gen YIL162w. Se seleccionaron clones URA3, que fueron verificados por PCR utilizando oligonucleótidos dirigidos hacia el gen codificante de la fructofuranosidasa de S. occidentalis y análisis electroforéticos en geles de agarosa. Se comprobó la inclusión del gen seleccionado y su funcionalidad por crecimiento positivo de los clones seleccionados en placas de medio mínimo utilizando sacarosa como única fuente de carbono SC(U)Suc (YNB: Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), sacarosa 2%, 50 μg/ml His y Met y 100 μg/ml Leu. Agar 3%) y Antimicina A (2 μg/ml) como agente bloqueante de la posible utilización de los aminoácidos como fuente de carbono. The construction obtained in E. coli, SoINV-pYES2 Leu 196 (SoINV-Leu), Ser 196 (SoINV-Ser), or Glu 196 (SoINV-Glu) as well as SoINV-Leu with the modifications N52S, P232V, W47Y, N49S or K181F, were verified by PCR and subsequent sequencing; S. cerevisiae strain EUROSCARF YIL162w [BY4741; Bush; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0; YIL162w :: kanMX4] (accession code Y02321) using the standard lithium acetate transformation methodology. In the absence of the recombinant plasmid, this S. cerevisiae strain is unable to use sucrose as a carbon source because of the deletion of the YIL162w gene. URA3 clones were selected, which were verified by PCR using oligonucleotides directed towards the S. westernis fructofuranosidase coding gene and electrophoretic analyzes on agarose gels. The inclusion of the selected gene and its functionality were checked by positive growth of the selected clones in minimal medium plates using sucrose as the sole source of carbon SC (U) Suc (YNB: Yeast Nitrogen Base w / o Aminoacids, DIFCO 0.7% ( p / v), 2% sucrose, 50 μg / ml His and Met and 100 μg / ml Leu. 3% agar) and Antimycin A (2 μg / ml) as a blocking agent for the possible use of amino acids as a carbon source .
La producción de actividad fructofuranosidasa se analizó en cultivos de S. cerevisiae que incluían la construcción SoINV-Leu, SoINV-Glu ó SoINV-Ser, así como SoINV-Leu con las modificaciones N52S, P232V, W47Y, N49S The production of fructofuranosidase activity was analyzed in S. cerevisiae cultures that included the SoINV-Leu, SoINV-Glu or SoINV-Ser construction, as well as SoINV-Leu with the N52S, P232V, W47Y, N49S modifications.
o K181F, crecidos en medio mínimo glucosa para levaduras SC(U)D (YNB: Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), glucosa 2%, 50 μg/ml His y Met y 100 μg/ml Leu). Los cultivos se realizaron en matraces de vidrio incubados a una temperatura comprendida entre 28-30ºC y una agitación orbital constante de 100-250 rpm. Las condiciones óptimas para el crecimiento fueron 30ºC y 200 rpm. or K181F, grown in minimal glucose for yeast SC (U) D (YNB: Yeast Nitrogen Base w / o Aminoacids, DIFCO 0.7% (w / v), 2% glucose, 50 μg / ml His and Met and 100 μg / ml Leu). The cultures were performed in glass flasks incubated at a temperature between 28-30 ° C and constant orbital agitation of 100-250 rpm. The optimal conditions for growth were 30 ° C and 200 rpm.
Estos cultivos fueron empleados para inocular los medios utilizados para la expresión del gen bajo el control del promotor pGAL1, inoculados en todos los casos a 0,4UDO 660 nm y utilizando el medio mínimo de inducción SC(U) G (YNB: Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), galactosa 2%, 50 μg/ml His y Met y 100 μg/ml Leu), o el medio rico YPGal (extracto de levadura 1%, galactosa 2%, bactopeptona 1%). These cultures were used to inoculate the means used for gene expression under the control of the pGAL1 promoter, inoculated in all cases at 0.4UDO 660 nm and using the minimum induction medium SC (U) G (YNB: Yeast Nitrogen Base w / o Aminoacids, 0.7% DIFCO (w / v), 2% galactose, 50 μg / ml His and Met and 100 μg / ml Leu), or YPGal rich medium (1% yeast extract, 2% galactose, 1% bactopeptone).
Se fueron obteniendo muestras de los cultivos a distintos tiempos, se centrifugaron y fueron separadas la fracción extracelular, Sn, y la fracción celular, C, que es tratada con el agente Yeast Buster (Novagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se valoró la actividad fructofuranosidasa tanto en la fracción celular (C) como en la libre de células (Sn). Samples of the cultures were obtained at different times, centrifuged and separated the extracellular fraction, Sn, and the cell fraction, C, which is treated with the Yeast Buster agent (Novagen) following the manufacturer's recommendations. Fructofuranosidase activity was assessed both in the cell fraction (C) and in the cell free (Sn).
Se ensayó la actividad fructofuranosidasa valorando la liberación de glucosa sobre sacarosa al 5%. Se usó un ensayo colorimétrico y la metodología estándar. La glucosa liberada se cuantificó utilizando la reacción acoplada de la glucosa oxidasa-peroxidasa: 0.4 ml de la solución a valorar se mezcló con 0.1 ml de solución A:B (20:1) (A: 0.85 U/ml glucosa oxidasa, 0.40 U/ml peroxidasa en tampón fosfato sódico pH 5; B: O-Dianisidina 0.6%). Se incubó 30 minutos a 37ºC y cuantificó espectrofotométricamente a 450 nm. Se utilizó una curva patrón de glucosa (1 a 100 μg/ml). La unidad de actividad fructofuranosidasa se define en μg glucosa valorada/ml de enzima y min de reacción en las condiciones descritas. Fructofuranosidase activity was assayed assessing glucose release on 5% sucrose. A colorimetric assay and standard methodology were used. The released glucose was quantified using the coupled glucose oxidase-peroxidase reaction: 0.4 ml of the solution to be titrated was mixed with 0.1 ml of solution A: B (20: 1) (A: 0.85 U / ml glucose oxidase, 0.40 U / ml peroxidase in sodium phosphate buffer pH 5; B: O-Dianisidine 0.6%). It was incubated 30 minutes at 37 ° C and quantitatively spectrophotometrically at 450 nm. A standard glucose curve (1 to 100 μg / ml) was used. The unit of fructofuranosidase activity is defined in μg glucose valued / ml enzyme and min reaction under the conditions described.
La tabla 4 muestra los niveles de actividad fructofuranosidasa asociada a la fracción celular y extracelular de S. cerevisiae que expresa las construcciones mencionadas anteriormente. Table 4 shows the levels of fructofuranosidase activity associated with the cellular and extracellular fraction of S. cerevisiae expressing the above-mentioned constructs.
TABLA 4 TABLE 4
Unidades de actividad fructofuranosidasa valorada en las fracciones extracelular (Sn) y celular (c) de Units of fructofuranosidase activity assessed in the extracellular (Sn) and cellular (c) fractions of
S. cerevisiae SoINV-Leu y SoINV-Ser. Se muestra el valor máximo de actividad producido en cultivos crecidos durante 12-20 h en medio rico YPGal S. cerevisiae SoINV-Leu and SoINV-Ser. It shows the maximum value of activity produced in crops grown for 12-20 h in YPGal rich medium
No se valoró actividad fructofuranosidasa en el medio extracelular ni en la fracción asociada a células cuando se empleó la cepa de S. cerevisiae SoINV-Glu. No fructofuranosidase activity was assessed in the extracellular medium or in the cell-associated fraction when the S. cerevisiae SoINV-Glu strain was used.
En la Fig. 2 se muestra la evolución de la actividad fructofuranosidasa valorada en el medio de cultivo del organismo que expresan SoINV-Leu crecido en medio rico YPGal. En los organismos crecidos en medio mínimo SC(U) G se observó menor actividad fructofuranosidasa que en los crecidos en medio rico YPGal; se obtuvieron valores de actividad que oscilaron entre el 30-40% de los obtenidos en el medio rico tanto para la fracción celular (c) como para la extracelular (sn). Se obtuvo aproximadamente 25 veces más actividad extracelular con la construcción SoINV-Ser que en la SoINV-Leu. The evolution of fructofuranosidase activity assessed in the organism culture medium expressing SoINV-Leu grown in YPGal rich medium is shown in Fig. 2. In organisms grown in minimal medium SC (U) G, less fructofuranosidase activity was observed than in those grown in YPGal rich medium; activity values were obtained ranging from 30-40% of those obtained in the rich medium for both the cell fraction (c) and the extracellular (sn). Approximately 25 times more extracellular activity was obtained with the SoINV-Ser construct than in the SoINV-Leu.
Ejemplo 2 Example 2
Caracterización enzimática de la enzima de S. occidentalis expresada en S. cerevisiae y medida de su actividad transferasa Enzymatic characterization of the S. occidentalis enzyme expressed in S. cerevisiae and measurement of its transferase activity
A tenor de que en la fracción extracelular hay siempre un menor contenido de proteínas totales que en el celular, para la purificación de las enzimas expresadas en S. cerevisiae se partió de 1000 ml de fracción extracelular de los microorganismos. Se utilizó el siguiente método: Given that in the extracellular fraction there is always a lower total protein content than in the cellular one, for the purification of the enzymes expressed in S. cerevisiae, 1000 ml of extracellular fraction of the microorganisms was started. The following method was used:
1º) Concentración de la fracción extracelular utilizando un sistema de filtración tangencial (filtro de 30 kDa) seguida de diálisis frente a HCl-Tris 20 mM pH 7 (tampón A) durante 2,5 horas a una temperatura de 22ºC (Fracción-1, F-1). 1st) Concentration of the extracellular fraction using a tangential filtration system (30 kDa filter) followed by dialysis against 20 mM HCl-Tris pH 7 (buffer A) for 2.5 hours at a temperature of 22 ° C (Fraction-1, F-1).
2º) Cromatografía de intercambio iónico a pH 7.0. Se aplicaron 50 ml de la muestra a una columna de 20 ml de intercambio iónico de DEAE-Sephacel equilibrada con tampón A. La elución se llevó a cabo utilizando un gradiente de NaCl de 0 a 0,5 M. La fracción eluida a 0.1 M de sal presentaba la actividad fructofuranosidasa, ésta se dializó frente a tampón A, y concentro mediante filtros Amicon 10 kDa (Fracción-2; F-2). 2nd) Ion exchange chromatography at pH 7.0. 50 ml of the sample was applied to a 20 ml column of DEAE-Sephacel ion exchange equilibrated with buffer A. Elution was carried out using a NaCl gradient from 0 to 0.5 M. The fraction eluted at 0.1 M of salt had fructofuranosidase activity, it was dialyzed against buffer A, and concentrated by Amicon 10 kDa filters (Fraction-2; F-2).
La purificación fue valorada analizando las proteínas presentes tras cada uno de los pasos de la purificación en geles de poliacrilamida SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. Purification was assessed by analyzing the proteins present after each step of purification in polysacrylamide gels SDS-PAGE and Coomassie blue staining.
La actividad fructofuranosidasa de la enzima purificada se ensayó utilizando sacarosa como sustrato siguiendo el procedimiento previamente descrito. The fructofuranosidase activity of the purified enzyme was tested using sucrose as a substrate following the procedure previously described.
Se ensayó la actividad de transglicosilación de la proteína urificada (F-2) de las cepas de S. cerevisiae que portan la construcción SoINV-Leu y SoINV-Ser crecidas en medio rico YPGal. Se prepararon reacciones utilizando una alta concentración de sacarosa (1M=342 g/l), para favorecer la formación de enlaces glicosídicos en detrimento de la reacción de hidrólisis, y una actividad enzimática final en la mezcla de reacción de aproximadamente 0,3 U. La Fig 3 muestra el cromatograma de la mezcla de reacción a las 6 horas obtenido con la construcción SoINV-Ser. La enzima presenta actividad de hidrólisis y de transferencia. Se forman fructosa (pico 1) y glucosa (pico 2) como productos hidrolíticos, y dos trisacáridos: uno mayoritario (pico 5), identificado como 6-kestosa [β-D-Fru-(2→6)-βD-Fru-(2→1)-α-D-Glu] y otro minoritario (pico 4), identificado como 1-kestosa [β-D-Fru-(2→1)-β-D-Fru-(2→1)-αD-Glu]. La sacarosa no hidrolizada se corresponde con el pico 3. The transglycosylation activity of the uri fi ed protein (F-2) of the S. cerevisiae strains bearing the SoINV-Leu and SoINV-Ser construct grown in YPGal rich medium was tested. Reactions were prepared using a high concentration of sucrose (1M = 342 g / l), to favor the formation of glycosidic bonds to the detriment of the hydrolysis reaction, and a final enzymatic activity in the reaction mixture of approximately 0.3 U. Fig 3 shows the chromatogram of the reaction mixture at 6 hours obtained with the SoINV-Ser construction. The enzyme has hydrolysis and transfer activity. Fructose (peak 1) and glucose (peak 2) are formed as hydrolytic products, and two trisaccharides: a major one (peak 5), identified as 6-kestose [β-D-Fru- (2 → 6) -βD-Fru- (2 → 1) -α-D-Glu] and another minority (peak 4), identified as 1-kestosa [β-D-Fru- (2 → 1) -β-D-Fru- (2 → 1) - αD-Glu]. Unhydrolyzed sucrose corresponds to peak 3.
En la tabla 5 se muestra la composición (en g/l) de los carbohidratos presentes en la mezcla de reacción a lo largo de 72 horas de incubación a 50ºC. La relación molar 6-kestosa/1-kestosa alcanza un valor máximo de 6.9 a las 4 horas de reacción para SoINV-Ser. En el punto de máxima producción de FOS (6 horas), se obtuvieron 25,48 g/l de FOS, lo que corresponde a un porcentaje del 8,72% de FOS respecto al total de carbohidratos en la mezcla de reacción para una conversión de sacarosa del 47%. Utilizando la enzima nativa expresada en S. occidentalis y las mismas condiciones de ensayo se obtuvieron 21,55 g/l de FOS, lo que representa un 6,21% de FOS respecto al total de carbohidratos en la mezcla para una conversión de sacarosa del 62,9%. Table 5 shows the composition (in g / l) of the carbohydrates present in the reaction mixture over 72 hours of incubation at 50 ° C. The 6-kestosa / 1-kestosa molar ratio reaches a maximum value of 6.9 at 4 hours of reaction for SoINV-Ser. At the point of maximum production of FOS (6 hours), 25.48 g / l of FOS were obtained, which corresponds to a percentage of 8.72% of FOS with respect to the total carbohydrates in the reaction mixture for a conversion of 47% sucrose. Using the native enzyme expressed in S. occidentalis and the same test conditions, 21.55 g / l of FOS were obtained, which represents 6.21% of FOS with respect to the total carbohydrates in the mixture for a sucrose conversion of the 62.9%
TABLA 5 TABLE 5
Composición de la mezcla de reacción con el tiempo tras la incubación a 50ºC de sacarosa con el concentrado enzimático, F-2, de SoINV-Ser. Condiciones de reacción: 342 g sacarosa/l en 0.1 M acetato sódico (pH 5.6), 150 rpm. El ensayo se realizó con 0,3 U de biocatalizador. Análisis mediante HPLC utilizando una bomba Waters delta 500, columna Lichrospher 100-NH2 (Merck) de 250 x 4.6 mm, acetonitrilo:agua 75:25 v/v, 0.7 ml/min, 25ºC, detector de evaporativo de dispersión de luz (light-scattering). Nombre de los compuestos: 1, fructosa; 2, glucosa; 3, sacarosa [α-D-Glu-(1→2)-β-D-Fru]; 4, 1 -kestosa [β-D-Fru-(2→1)-β-D-Fru-(2→1)-α-D-Glu]; 5, 6-kestosa [β-D-Fru-(2→6)-β-D-Fru-(2→1)-α-D-Glu] Composition of the reaction mixture over time after incubation at 50 ° C of sucrose with the enzymatic concentrate, F-2, of SoINV-Ser. Reaction conditions: 342 g sucrose / l in 0.1 M sodium acetate (pH 5.6), 150 rpm. The test was performed with 0.3 U of biocatalyst. HPLC analysis using a Waters delta 500 pump, Lichrospher 100-NH2 (Merck) 250 x 4.6 mm column, acetonitrile: water 75:25 v / v, 0.7 ml / min, 25 ° C, evaporative light scattering detector (light -scattering). Name of the compounds: 1, fructose; 2, glucose; 3, sucrose [α-D-Glu- (1 → 2) -β-D-Fru]; 4,1-kestosa [β-D-Fru- (2 → 1) -β-D-Fru- (2 → 1) -α-D-Glu]; 5, 6-kestosa [β-D-Fru- (2 → 6) -β-D-Fru- (2 → 1) -α-D-Glu]
La enzima SoINV-Ser, que tiene la misma secuencia aminoacídica que la proteína de partida, expresada en el organismo heterólogo se comporta de una forma bastante similar a como lo hace la enzima nativa expresada en S. occidentalis. The SoINV-Ser enzyme, which has the same amino acid sequence as the starting protein, expressed in the heterologous organism behaves in a manner quite similar to the native enzyme expressed in S. occidentalis.
Se ensayó la actividad de transglicosilación de la enzima SoINV-Leu. Se preparó una reacción utilizando, como anteriormenete, una concentración de sacarosa de 342 g/l y una actividad enzimática final en la mezcla de reacción de aproximadamente 0.3 U. La Fig. 4 muestra el cromatograma de la mezcla de reacción a las 72 horas. El perfil de los productos generados es muy similar al obtenido con SoINV-Ser pero la relación 6-kestosa/1-kestosa es de aproximadamente 60 y el nivel de fructooligosacáridos producido es mayor al obtenido previamente, ya sea utilizando la enzima nativa expresada en S. occidentalis oen S. cerevisiae (SoINV-Ser). The transglycosylation activity of the enzyme SoINV-Leu was tested. A reaction was prepared using, as above, a sucrose concentration of 342 g / l and a final enzymatic activity in the reaction mixture of approximately 0.3 U. Fig. 4 shows the chromatogram of the reaction mixture at 72 hours. The profile of the products generated is very similar to that obtained with SoINV-Ser but the 6-kestose / 1-kestose ratio is approximately 60 and the level of fructooligosaccharides produced is higher than previously obtained, either using the native enzyme expressed in S Occidentalis oen S. cerevisiae (SoINV-Ser).
En la tabla 6 se muestra la composición (en g/l) de los carbohidratos presentes en la mezcla de reacción a lo largo de 120 horas de incubación a 45ºC. La relación molar 6-kestosa/1-kestosa es aproximadamente 60 en el punto de máxima producción de FOS (72 horas de reacción), aquí se obtuvieron 66,85 g/l de FOS, lo que corresponde a un porcentaje del 20,57% de FOS respecto al total de carbohidratos en la mezcla para una conversión de sacarosa del 48,2%. Transcurridas 120 horas de reacción, se siguen obteniendo 63,99 g/l de FOS. El porcentaje total (p/p) de fructooligosacáridos fue del 19,81%, valor referido al peso total de carbohidratos en el medio. Table 6 shows the composition (in g / l) of the carbohydrates present in the reaction mixture over 120 hours of incubation at 45 ° C. The 6-kestose / 1-kestose molar ratio is approximately 60 at the point of maximum FOS production (72 hours of reaction), here 66.85 g / l of FOS were obtained, which corresponds to a percentage of 20.57 % of FOS with respect to the total carbohydrates in the mixture for a sucrose conversion of 48.2%. After 120 hours of reaction, 63.99 g / l of FOS are still obtained. The total percentage (w / w) of fructooligosaccharides was 19.81%, a value based on the total weight of carbohydrates in the medium.
TABLA 6 TABLE 6
Composición de la mezcla de reacción con el tiempo tras la incubación a 45ºC de sacarosa con el concentrado enzimático, F2, de SoINV-Leu. Condiciones de reacción: 342 g sacarosa/l en 0.1 M acetato sódico (pH 5.6), 150 rpm. El ensayo se realizó con 0,3 U/ml de biocatalizador. Análisis mediante HPLC utilizando una bomba Waters delta 500, columna Lichrospher 100-NH2 (Merck) de 250 x 4.6 mm, acetonitrilo:agua 75:25 v/v, 0.7 ml/min, 25ºC, detector de evaporativo de dispersión de luz (light-scattering). Nombre de los compuestos: 1, fructosa; 2, glucosa; 3, sacarosa [α-D-Glu-(1→2)-β-D-Fru]; 4, 1-kestosa [β-D-Fru-(2→1)-β-D-Fru-(2→1)-α-D-Glu]; 5, 6-kestosa [β-D-Fru-(2→6)-β-D-Fru-(2→1)-α-D-Glu] Composition of the reaction mixture over time after incubation at 45 ° C of sucrose with the enzymatic concentrate, F2, of SoINV-Leu. Reaction conditions: 342 g sucrose / l in 0.1 M sodium acetate (pH 5.6), 150 rpm. The test was performed with 0.3 U / ml biocatalyst. HPLC analysis using a Waters delta 500 pump, Lichrospher 100-NH2 (Merck) 250 x 4.6 mm column, acetonitrile: water 75:25 v / v, 0.7 ml / min, 25 ° C, evaporative light scattering detector (light -scattering). Name of the compounds: 1, fructose; 2, glucose; 3, sucrose [α-D-Glu- (1 → 2) -β-D-Fru]; 4,1-kestosa [β-D-Fru- (2 → 1) -β-D-Fru- (2 → 1) -α-D-Glu]; 5, 6-kestosa [β-D-Fru- (2 → 6) -β-D-Fru- (2 → 1) -α-D-Glu]
La Fig 5 muestra la comparación del porcentaje de FOS totales producidos por las distintas enzimas evaluadas en este apartado con respecto al tiempo de reacción. Fig 5 shows the comparison of the percentage of total FOS produced by the different enzymes evaluated in this section with respect to the reaction time.
La Fig 6 muestra el nivel de FOS producido por los organismos utilizados. La nueva enzima que contiene Leucina en la posición 196 produce aproximadamente 2.5 veces más 6-kestosa que la proteína nativa que contiene Serina en esta posición. Fig 6 shows the level of FOS produced by the organisms used. The new enzyme that contains Leucine at position 196 produces approximately 2.5 times more 6-kestose than the native protein that Serine contains at this position.
Utilizando una metodología similar a la anteriormente descrita se sustituyeron distintos residuos aminoacídicos de la proteína SoINV-Leu y se valoró la actividad transferasa de las proteínas obtenidas. Las sustituciones Asparragina por Serina de la posición 52 y Prolina por Valina de la 232 dieron lugar a nuevas proteínas con una actividad transferasa mejorada, se obtuvieron niveles máximos de producción de 6-kestosa unas 6 veces superiores a los obtenidos con la proteína de partida expresada en S. occidentalis. Using a methodology similar to that described above, different amino acid residues of the SoINV-Leu protein were substituted and the transferase activity of the obtained proteins was assessed. Asparragine substitutions for Serine at position 52 and Proline for Valine at 232 gave rise to new proteins with improved transferase activity, maximum production levels of 6-kestose were obtained about 6 times higher than those obtained with the expressed starting protein in S. occidentalis.
La tabla 7 y la Fig 7 muestran los resultados de producción obtenidos con estas nuevas enzimas y la enzima de partida (SoI). Table 7 and Fig 7 show the production results obtained with these new enzymes and the starting enzyme (SoI).
TABLA 7 TABLE 7
Producción máxima de FOS y de 6-kestosa (% y g/l) obtenido por la enzima nativa (SoI), y las expresadas en S. cerevisiae que incluyen Serina en la posición 196 (196S), Leu en esta posición (196L) y 196L más Serina en la posición 52 (N52S) o Valina en la posición 232 (P232V). Las reacciones se siguieron durante 155hyse utilizaron Maximum production of FOS and 6-kestose (% yg / l) obtained by the native enzyme (SoI), and those expressed in S. cerevisiae that include Serine at position 196 (196S), Leu at this position (196L) and 196L plus Serine at position 52 (N52S) or Valine at position 232 (P232V). The reactions were followed for 155h and used
las condiciones de ensayo y análisis que se indican en la Tabla 5 the test and analysis conditions indicated in Table 5
En negrita se resaltan los resultados más significativos. Bold highlights the most significant results.
Se crecieron las cepas de S. cerevisiae que portan el gen codificante para la fructofuranosidasa SoINV-Leu196 que incluye las sustituciones en la posición 49 Asparragina por Serina y en la 181 Lisina por Fenilalanina. Se utilizó medio rico YPGal y la metodología descrita en apartados anteriores de la presente invención. La actividad enzimática se purificó y se valoró tal como se ha descrito en otros apartados. Se utilizó como sustrato sacarosa a 342 g/l. El ensayo se llevó a cabo a 45ºC con agitación de 200 rpm durante 155 h. Se recogieron fracciones a distintos tiempos de la reacción y los productos generados se analizaron mediante HPLC tal y como se ha descrito anteriormente. En el máximo de producción de FOS se obtuvo 26,18 g/l y 0,42 g/l de 6-kestosa y 1-kestosa para la enzima que incluye la sustitución N49S, y 39,5 g/l y 0,77 g/l de 6-kestosa y 1-kestosa para la que porta la sustitución K181F. Por tanto las sustituciones del residuo 47 Triptófano por Tirosina (W47Y), del residuo 49 Asparragina por Serina (N49S) y del residuo 181 Lisina por Fenilalanina (K181F) dieron lugar a nuevas enzimas con una actividad transferasa disminuida. The S. cerevisiae strains bearing the coding gene for SoINV-Leu196 fructofuranosidase were grown, including substitutions at position 49 Asparagine by Serine and at 181 Lysine by Phenylalanine. YPGal rich medium and the methodology described in previous sections of the present invention were used. Enzymatic activity was purified and assessed as described in other sections. It was used as a sucrose substrate at 342 g / l. The test was carried out at 45 ° C with stirring of 200 rpm for 155 h. Fractions were collected at different reaction times and the products generated were analyzed by HPLC as described above. In the maximum FOS production, 26.18 g / l and 0.42 g / l of 6-kestose and 1-kestose were obtained for the enzyme that includes the N49S substitution, and 39.5 g / l and 0.77 g / l of 6-kestosa and 1-kestosa for which it carries the K181F substitution. Therefore, substitutions of Tryptophan 47 residue by Tyrosine (W47Y), residue 49 Asparagine by Serine (N49S) and residue 181 Lysine by Phenylalanine (K181F) gave rise to new enzymes with decreased transferase activity.
A continuación se especifican los detalles de algunos de los métodos o procedimientos necesarios para obtener los resultados descritos en la presente invención. The details of some of the methods or procedures necessary to obtain the results described in the present invention are specified below.
Producción de fructofuranosidasa mediante cultivos de S. occidentalis crecido en medios de cultivo empleando Inulina como fuente de carbono Production of fructofuranosidase by cultures of S. occidentalis grown in culture media using Inulin as a carbon source
Para la producción de la enzima de S. occidentalis se empleo un medio basado en inulina. Previamente se creció la levadura en 50 ml de medio YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2% y glucosa 2%) durante 16 horas. Se utilizaron matraces de vidrio de 250 ml incubados a 200 rpm y 29ºC. Todo el volumen se transfirióa1Lde medio basado en inulina (2% peptona, 2% inulina) y se creció durante 72 horas en las mismas condiciones descritas. Se recogieron fracciones cada 6 horas y se separaron las células (C) del sobrenadante (Sn) por centrifugación. Se determinó la actividad fructorfuranosidasa como se describe anteriormente. Se obtuvo un máximo de actividad enzimática en el medio extracelular del organismo de 15 a 20 U a las 48 horas de cultivo. Inulin-based medium was used for the production of the enzyme of S. occidentalis. The yeast was previously grown in 50 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% Peptone and 2% glucose) for 16 hours. 250 ml glass flasks incubated at 200 rpm and 29 ° C were used. The entire volume was transferred to the inulin-based medium (2% peptone, 2% inulin) and was grown for 72 hours under the same conditions described. Fractions were collected every 6 hours and the cells (C) were separated from the supernatant (Sn) by centrifugation. Fructorfuranosidase activity was determined as described above. A maximum of enzymatic activity was obtained in the extracellular medium of the organism from 15 to 20 U at 48 hours of culture.
Uso de la enzima producida en S. occidentalis utilizando medios que comprenden inulina para la producción de FOS Use of the enzyme produced in S. occidentalis using means comprising inulin for the production of FOS
El producto liberado y valorado en el apartado correspondiente de la presente invención fue empleado para la producción de FOS utilizando como sustrato sacarosa a 342 g/l en tampón Acetato sódico 100 mM pH 5,2. El ensayo se realizó a 45ºC y una agitación de 200 rpm durante 72 h. Se recogieron fracciones a distintos tiempos de la reacción y los productos generados se analizaron mediante HPLC tal y como se describió anteriormente. El máximo de producción de FOS se obtuvo a las 12 h de reacción llegando a producirse unos 21,25 g/l; la hidrólisis de sacarosa fue prácticamente total tras 48 h de reacción. The product released and evaluated in the corresponding section of the present invention was used for the production of FOS using as a sucrose substrate at 342 g / l in 100 mM sodium acetate buffer pH 5.2. The test was performed at 45 ° C and stirring of 200 rpm for 72 h. Fractions were collected at different reaction times and the products generated were analyzed by HPLC as described above. The maximum production of FOS was obtained at 12 h of reaction reaching about 21.25 g / l; sucrose hydrolysis was practically total after 48 h of reaction.
Producción de fructofuranosidasa mediante un cultivo de S. cerevisiae SoINV-Leu crecido en medio mínimo Production of fructofuranosidase through a culture of S. cerevisiae SoINV-Leu grown in minimal medium
La cepa de S. cerevisiae SoInv-Leu se creció en medio mínimo SC(U)Gal (YNB: Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), galactosa 2%, 50 μg/ml His y Met y 100 ug/ml Leu) con agitación de 250 rpm durante 48 h. Se alcanzó un máximo de crecimiento de 2,4 unidades a D0660 nm, que coincide prácticamente con el máximo de actividad fructofuranosidasa valorada en tanto en la fracción celular (0,4 U) como en la extracelular (0,15 U). The S. cerevisiae SoInv-Leu strain was grown in minimal medium SC (U) Gal (YNB: Yeast Nitrogen Base w / o Aminoacids, 0.7% DIFCO (w / v), 2% galactose, 50 μg / ml His and Met and 100 ug / ml Leu) with stirring of 250 rpm for 48 h. A maximum growth of 2.4 units was reached at D0660 nm, which coincides practically with the maximum fructofuranosidase activity assessed in both the cell fraction (0.4 U) and the extracellular (0.15 U).
Producción de fructofuranosidasa en cultivos de distintos clones de S. cerevisiae SoINV-Leu crecidos en medio rico Production of fructofuranosidase in cultures of different S. cerevisiae SoINV-Leu clones grown in rich medium
Se valoró la actividad fructofuranosidasa asociada a la fracción celular y extracelular de distintos clones de S. cerevisiae SoInv-Leu crecidos en medio rico. Los cultivos se precrecieron en medio mínimo SC(U)D hasta saturación, posteriormente las células se pasaron a medio rico, YPGal (1% Yeast Extract, 1% Peptona y 2% Galactosa) hasta obtener una densidad óptica inicial de 0,4 unidades a D0660 nm. Se analizó la actividad fructofuranosidasa de las fracciones asociadas a las células (C) y del medio extracelular (Sn) según se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron valores máximos de actividad asociados a la fracción celular y extracelular comprendidos entre 0,95-0,45 U y 0,470,37 U, respectivamente, para los distintos clones analizados. The fructofuranosidase activity associated with the cellular and extracellular fraction of different S. cerevisiae SoInv-Leu clones grown in rich medium was assessed. The cultures were pre-grown in minimal medium SC (U) D until saturation, then the cells were transferred to rich medium, YPGal (1% Yeast Extract, 1% Peptone and 2% Galactose) until obtaining an initial optical density of 0.4 units at D0660 nm. The fructofuranosidase activity of the fractions associated with the cells (C) and the extracellular medium (Sn) was analyzed as described above. Maximum activity values associated with the cellular and extracellular fraction between 0.95-0.45 U and 0.470.37 U, respectively, were obtained for the different clones analyzed.
Sustitución de los tripletes de la secuencia original del gen de la fructofuranosidasa (secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1) mediante la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Substitution of the triplets of the original sequence of the fructofuranosidase gene (amino acid sequence SEQ ID NO: 1) by the PCR technique (Polymerase Chain Reaction)
Para la sustitución de la posición 196 (al igual que el resto de posiciones descritas en la presente invención) de la proteína nativa se utilizó PCR, y como ADN molde el gen codificante para la fructofuranosidasa de S. occidentalis incluido en el vector pstBlue1 obtenido tal y como se describe en el apartado correspondiente. Cada reacción incluía: 5U (1 μl) de High Fidelity Plus TM (Roche), 10 μl del tampón para esta enzima 5 x, 1 μl de dNTs 40 mM, 1 μl del ADN descrito, 1 μl de cada uno de los oligonucleótidos cebadores y H2O hasta un volumen final de 50 μl. Esta mezcla de reacción se incubó: a) 3 minutos a 94ºC, b) 20 ciclos de 94ºC 1 minuto, 55ºC 30 segundos y 72ºC 7,5 minutos, y c) 1 ciclo de 72ºC 5 minutos. El producto se analizó en gel de agarosa. El producto resultado de la amplificación se incubó con la enzima de restricción DpnI durante 1-2 horas en la siguiente mezcla de reacción: 40 μl del producto de la amplificación, 4 μ de H2Oy5 μl de solución tampon Tango 10x junto con 1 μl (10U) de la enzima. El resultado de la reacción se empleó para transformar E. coli, seleccionando en placas de LB con ampicilina y comprobando la sustitución del triplete CTG por TCA (o del los tripletes correspondientes a las sustituciones deseadas) por secuenciación utilizando la metodología estándar (SIDI, UAM). For the substitution of position 196 (like the other positions described in the present invention) of the native protein, PCR was used, and as a template DNA the coding gene for the fructofuranosidase of S. occidentalis included in the vector pstBlue1 obtained such and as described in the corresponding section. Each reaction included: 5U (1 μl) of High Fidelity Plus TM (Roche), 10 μl of the buffer for this 5 x enzyme, 1 μl of 40 mM dNTs, 1 μl of the described DNA, 1 μl of each of the oligonucleotide primers and H2O to a final volume of 50 μl. This reaction mixture was incubated: a) 3 minutes at 94 ° C, b) 20 cycles of 94 ° C 1 minute, 55 ° C 30 seconds and 72 ° C 7.5 minutes, and c) 1 cycle of 72 ° C 5 minutes. The product was analyzed on agarose gel. The product resulting from the ampli fi cation was incubated with the restriction enzyme DpnI for 1-2 hours in the following reaction mixture: 40 μl of the amplification product, 4 μ of H2O and 5 μl of Tango 10x buffer solution together with 1 μl (10U ) of the enzyme. The reaction result was used to transform E. coli, selecting in LB plates with ampicillin and checking the substitution of the CTG triplet with TCA (or of the triplets corresponding to the desired substitutions) by sequencing using the standard methodology (SIDI, UAM ).
Obtención de la fracción proteica asociada a células (C) empleando el reactivo comercial Yeast Buster (Novagen) Obtaining the protein fraction associated with cells (C) using the commercial reagent Yeast Buster (Novagen)
Con independencia del medio de crecimiento utilizado, para valorar la actividad fructofuranosidasa asociada a la fracción celular, la fracción extracelular se retiró por centrifugación (5 min a 5000 x g) y posterior decantación. El precipitado celular se pesó e incubó con el reactivo comercial Yeast Buster en una proporción 1:5 (p:v) utilizando agitación constante durante 20 minutos y 20ºC. La suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 5000 x g. La fracción soluble obtenida, libre de precipitado, se utilizó directamente para la determinación de actividad fructofuranosidasa siguiendo la metodología anteriormente descrita. Regardless of the growth medium used, to assess the fructofuranosidase activity associated with the cell fraction, the extracellular fraction was removed by centrifugation (5 min at 5000 x g) and subsequent decantation. The cell precipitate was weighed and incubated with the commercial Yeast Buster reagent in a 1: 5 ratio (p: v) using constant stirring for 20 minutes and 20 ° C. The suspension was centrifuged for 10 minutes at 5000 x g. The soluble fraction obtained, free of precipitate, was used directly for the determination of fructofuranosidase activity following the methodology described above.
Claims (30)
- 232. 232.
- 3. 3.
- Secuencia nucleotídica según la reivindicación 2, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3. Nucleotide sequence according to claim 2, wherein said nucleotide sequence, encoding SEQ ID NO: 2, is SEQ ID NO: 3.
- 5. 5.
- Secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5. Nucleotide sequence according to claim 4, wherein said nucleotide sequence, encoding SEQ ID NO: 4, is SEQ ID NO: 5.
- 7. 7.
- Producto de expresión de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del vector de expresión según la reivindicación 6. Expression product of the nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 5, or of the expression vector according to claim 6.
- 8. 8.
- Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones1a5,elvector de expresión según la reivindicación 6, el producto de expresión según la reivindicación 7, o cualquiera de sus combinaciones. Cell comprising the nucleotide sequence according to any one of claims 1-5, the expression vector according to claim 6, the expression product according to claim 7, or any combination thereof.
- 9. 9.
- Uso de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Use of the nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 5, for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity by means of a heterologous expression system.
- 10. 10.
- Uso del vector de expresión según la reivindicación 6, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Use of the expression vector according to claim 6, for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity by a heterologous expression system.
- 11. eleven.
- Uso de la célula según la reivindicación 7, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Use of the cell according to claim 7, for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity by a heterologous expression system.
- 12. 12.
- Uso del producto de expresión según la reivindicación 8, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Use of the expression product according to claim 8, for obtaining an enzymatic product with fructofuranosidase activity by a heterologous expression system.
- 13. 13.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el sistema heterólogo expresa dicha secuencia nucleotídica en Saccharomyces cerevisiae. Use according to any of claims 9 to 12, wherein the heterologous system expresses said nucleotide sequence in Saccharomyces cerevisiae.
- 15. fifteen.
- Método según la reivindicación 14, donde además comprende: Method according to claim 14, further comprising:
- 16. 16.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2. Method according to any of claims 14 or 15, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2.
- 17. 17.
- Método según la reivindicación 16, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3. Method according to claim 16, wherein said nucleotide sequence, encoding SEQ ID NO: 2, is SEQ ID NO: 3.
- 19. 19.
- Método según la reivindicación 14, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5. Method according to claim 14, wherein said nucleotide sequence, which codes for SEQ ID NO: 4, is SEQ ID NO: 5.
- 20. twenty.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde el microorganismo que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis es Saccharomyces cerevisiae. Method according to any of claims 14 to 19, wherein the microorganism belonging to a different species of Schwanniomyces occidentalis is Saccharomyces cerevisiae.
- 21. twenty-one.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde el cultivo de la célula según el paso (c) se lleva a cabo a una temperatura de entre 28 y 30ºC. Method according to any of claims 14 to 20, wherein the cell culture according to step (c) is carried out at a temperature between 28 and 30 ° C.
- 22. 22
- Producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21. Enzymatic product with fructofuranosidase activity obtainable by the method according to any of claims 14 to 21.
- 23. 2. 3.
- Producto enzimático según la reivindicación 22, donde dicho producto tiene actividad transfructosidasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos. Enzymatic product according to claim 22, wherein said product has transfructosidase activity in the presence of one or more glycidic substrates.
- 24. 24.
- Producto enzimático según la reivindicación 23, donde los productos resultantes de la actividad transfructosidasa son fructooligosacáridos. Enzymatic product according to claim 23, wherein the products resulting from the transfructosidase activity are fructooligosaccharides.
- 25. 25.
- Producto enzimático según la reivindicación 24, donde los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6. Enzymatic product according to claim 24, wherein the fructooligosaccharides have β-1,2, and β-2,6 bonds.
- 26. 26.
- Producto enzimático según la reivindicación 25, donde los productos son 6-kestosa y 1-kestosa. Enzymatic product according to claim 25, wherein the products are 6-kestose and 1-kestose.
- 27. 27.
- Método para la obtención de oligosacáridos que comprende: a) poner en contacto, in vitro, el producto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 con al Method for obtaining oligosaccharides comprising: a) contacting, in vitro, the enzyme product according to any of claims 22 to 26 with the
- 28. 28.
- Método para la obtención de oligosacáridos según la reivindicación 27, que además comprende: c) recuperar los oligosacáridos obtenidos tras la incubación descrita en el paso (b). Method for obtaining oligosaccharides according to claim 27, further comprising: c) recover the oligosaccharides obtained after the incubation described in step (b).
- Categoría Category
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected
- X X
- WO 2007074187 A1 (UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID; CONSEJO SUPERIOR DEINVESTIGACIONES CIENT�?FICAS) 05.07.2007, página 22. 1-8 WO 2007074187 A1 (AUTONOMOUS UNIVERSITY OF MADRID; HIGHER COUNCIL OF SCIENTIFIC RESEARCH) 05.07.2007, page 22. 1-8
- A TO
- ALVARO-BENITO M. et al. Characterization of a �-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose. 2007. Journal of Biotechnology. Vol. 132 (1), páginas 75-81. 1-28 ALVARO-BENITO M. et al. Characterization of a �-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose. 2007. Journal of Biotechnology. Vol. 132 (1), pages 75-81. 1-28
- A TO
- KLEIN R.D. Cloning and sequence analysis of the gene encoding invertase from the yeast Schwanniomyces occidentalis.1989. Current Genetics. Vol.16, páginas 145-152. 1-28 KLEIN R.D. Cloning and sequence analysis of the gene encoding invertase from the yeast Schwanniomyces occidentalis. 1989. Current Genetics Vol. 16, pages 145-152. 1-28
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:
- Fecha de realización del informe 21.02.2011 Date of realization of the report 21.02.2011
- Examinador I. Rueda Molins Página 1/4 Examiner I. Rueda Molins Page 1/4
- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-28 SI NO Claims Claims 1-28 IF NOT
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 9-28 1-8 SI NO Claims Claims 9-28 1-8 IF NOT
- Documento Document
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date
- D01 D01
- WO 2007074187 A1 (UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID;CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENT�?FICAS), página 22. 05.07.2007 WO 2007074187 A1 (AUTONOMOUS UNIVERSITY OF MADRID; HIGHER RESEARCH COUNCIL), page 22. 05.07.2007
- D02 D02
- ALVARO-BENITO M. et al. Characterization of a �fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose. Journal of Biotechnology. Vol. 132 (1), páginas 75-81. 2007 ALVARO-BENITO M. et al. Characterization of a �fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose. Journal of Biotechnology. Vol. 132 (1), pages 75-81. 2007
- D03 D03
- KLEIN R.D. Cloning and sequence analysis of the gene encoding invertase from the yeast Schwanniomyces occidentalis. Current Genetics. Vol.16, páginas 145-152. 1989 KLEIN R.D. Cloning and sequence analysis of the gene encoding invertase from the yeast Schwanniomyces occidentalis. Current Genetics Vol. 16, pages 145-152. 1989
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