ES2356220A1 - Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos.Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos basado en un método de depósito electroasistido de capas de sílice impresas molecularmente sobre electrodos. Además la invención se refiere a estos electrodos biomiméticos y a su uso para la fabricación de sensores amperométricos, voltamperométricos, impedimétricos o potenciométricos para la detección altamente selectiva de sustancias de interés ambiental, bioquímico o alimentario.
Description
Procedimiento de fabricación de electrodos
biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos basado en un
método de depósito electroasistido de capas de sílice impresas
molecularmente sobre diversos electrodos. Estos electrodos
biomiméticos se utilizan para la detección altamente selectiva de
sustancias de interés ambiental, bioquímico y alimentario.
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Con el fin de buscar soluciones a los
inconvenientes que presentan los materiales sensores "clásicos"
(largos tiempos de respuesta, baja sensibilidad y selectividad, así
como poca estabilidad) se están siguiendo diversas líneas de
investigación. Una de las más prometedoras y novedosas tecnologías
utilizadas es la preparación de polímeros de impronta molecular
(MIPs, "molecularly imprinted polymers") (cfr. F.L. Dickert y
col., Trends in Anal. Chem., 1999, 18, 192).
Los polímeros de impronta molecular son matrices
sintetizadas artificialmente que presentan, en teoría, la capacidad
de reconocer e interaccionar de forma específica con determinados
compuestos. Es decir, se trata de materiales biomiméticos que
reproducen de un modo más básico el mecanismo de reconocimiento de
los sistemas biológicos (hormona-receptor,
enzima-sustrato,
antígeno-anticuerpo).
En general, la síntesis de MIPs se lleva a cabo
mediante la formación de un polímero entrecruzado por
copolimerización inicial de una serie de monómeros funcionales y
entrecruzadores en presencia de la molécula molde (que generalmente
será el analito de interés o una análoga) en un disolvente adecuado.
La posterior liberación de la molécula molde permite la obtención de
un material nanoestructurado, con "memoria" selectiva para el
molde, y que simula el reconocimiento molecular típico en sistemas
biológicos. Variando las condiciones de polimerización, como son la
temperatura, el grado de entrecruzamiento de los monómeros, y la
molécula molde, estos polímeros pueden ser obtenidos con
características altamente selectivas. Poseen buena estabilidad
química a largo plazo, resistencia mecánica y química elevada, y la
posibilidad de diseñar receptores específicos para un elevado número
de sustratos, lo que justifica el enorme potencial que presentan los
MIPs en el desarrollo de nuevas fases sensoras.
Aunque hay diversas vías para la preparación de
los MIPs, son dos las más utilizadas: covalente y
no-covalen-
te.
te.
La vía covalente se basa en la
co-polimerización inicial de monómeros funcionales
con un derivado polimerizable de la molécula molde. Esto supone
derivatizar previamente dicha molécula. Por adición de un monómero
entrecruzador y en presencia de un agente iniciador de la
polimerización, se fija la estructura del aducto en una red
tridimensional. La posterior liberación de la molécula molde se
lleva a cabo por métodos químicos, generalmente hidrólisis que rompa
los enlaces covalentes creados.
Las ventajas más importantes de esta vía son la
creación de sitios de unión muy específicos y la no influencia del
disolvente empleado en la síntesis. Por el contrario, tienen el
inconveniente de ser lentos, no reversibles para el proceso de
reconocimiento, por lo que dichos polímeros no resultan adecuados
para su utilización en sistemas donde se requiera una respuesta
rápida y además, las capacidad de reocupación de éstos oscila entre
10-15%; este hecho es atribuido a que los sitios de
unión se encuentran fundamentalmente en zonas internas del
mismo.
En la vía no-covalente, la
molécula molde interacciona con los monómeros funcionales formando
un agregado en el que predominan interacciones de tipo enlace de
hidrógeno, interacciones electroestáticas, enlaces de Van der Waals,
etc. Los monómeros funcionales y de entrecruzamiento suelen ser de
la misma naturaleza que los utilizados en la vía covalente. El
proceso comienza con un ordenamiento de los monómeros funcionales
alrededor de la molécula molde, en un disolvente adecuado, para
producir un sistema pre-organizado cuya estructura
se fija durante el entrecruzamiento, análogo al caso anterior. La
extracción de la molécula no requiere ahora roturas de enlaces
covalentes y puede llevarse a cabo por un proceso de extracción
suave con un disolvente de características adecuadas.
Los inconvenientes de este tipo de polímeros son
que se crean huecos menos específicos y que el disolvente compite
con los monómeros funcionales en la interacción con la molécula
molde. Sin embargo, la capacidad de reocupación de éstos oscila
80-90%; en este caso los puntos de unión se
encuentran en zonas más accesibles.
Se encuentran en la literatura científica
numerosas referencias a la modificación de electrodos con capas de
polímeros de impronta molecular para su aplicación a la detección
biomimética de diversos analitos (cfr. US6057377). En concreto, la
modificación de electrodos con capas de polímero de impronta
molecular como el polifenol (cfr. E. Granot y col, Advanced
Functional Materials, 2008, 18, 478-484) capas
acrílicas (cfr. M. C. Blanco-López y col.,
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, 378,
1922-1928) o la
poli-o-fenilenediamina (cfr. R. Z.
Ouyang y col., Advanced Functional Materials, 2007, 17,
3223-3230) encuentran aplicación en la detección
selectiva de diversas sustancias de interés biológico, como
monosacáridos y neurotransmisores.
Especial interés tienen los electrodos
modificados con sílice o sílices orgánicas que pueden ser impresos
molecularmente. Las capas de sol-gel de sílice
impresa suelen ser depositadas sobre el electrodo transductor
mediante técnicas habituales (depósito por giro
spin-coating, o por inmersión
dip-coating), partiendo de disoluciones precursoras
(sol) que contienen la molécula molde y se dejan gelificar en su
presencia.
El molde generalmente se extrae del interior de
la capa mediante lavado con disolventes. Estas capas se han aplicado
a la detección electroquímica de diversas especies (cfr. R. Gupta y
A. Kumar, Biotechnology Advances, 2008, 26,
533-547). Detección selectiva de neurotransmisores:
epinefrina o dopamina (cfr. C. W. Hsu y M. C. Yang, Sensors and
Actuators B: Chemical, 2008, 134, 680-686; P. C.
Pandey y B. C. Upadhyay, Talanta, 2005, 67,
997-1006; N. Gao y col., Electroanalysis,
2007, 19, 1655-1660), detección de aminoácidos (cfr.
Z. Zhang y col., Analytical Biochemistry, 2005, 336,
108-116), detección de proteínas (cfr. Z. Zhang y
col., Biosensors and Bioelectronics, 2006, 21,
1244-1251), detección enantioselectiva y
reconocimiento quiral (S. Marx y D. Avnir, Accounts of Chemical
Research, 2007, 40, 768-776; S.
Fireman-Shoresh y col., Langmuir, 2005, 21,
7842-7847).
El proceso de depósito y extracción del molde es
clave para la obtención de una fase sensora altamente selectiva ya
que la formación de agujeros o grietas producidos durante el
procesado de la capa empeora sensiblemente la selectividad de la
fase sensora.
En muchas ocasiones, el depósito de las capas de
polímero se realiza por técnicas electroquímicas
(electropolimerización). Este tipo de depósito permite obtener capas
finas con un elevado control en su morfología y propiedades.
Habitualmente, para realizar el depósito electroquímico de un
polímero, se introduce un electrodo en una disolución precursora (de
un monómero o mezcla de varios) y se aplica un potencial de
oxidación. Los monómeros oxidados (en forma de
radical-catión) se acoplan entre sí dando lugar a un
polímero que se va depositando en la superficie del electrodo
(reacción radicalaria). Polímeros conductores típicos preparados de
esta forma son la polianilina, el polipirrol, el politiofeno,
etc.
En un principio, los polímeros
electroquímicamente generados de esta forma podrían ser considerados
de gran interés para formar capas impresas molecularmente, sin más
que introducir la molécula molde de interés en la disolución
precursora, junto a los monómeros. Sin embargo, el hecho de que sea
necesario aplicar un potencial elevado para oxidar el monómero (p.
ej. +1.1 V/ENH, para la anilina) limita las moléculas molde
utilizables ya que éstas deben tener un potencial de oxidación mayor
que el propio monómero. Si esto no es así, la molécula molde se
degradaría a los potenciales en los que se obtiene el polímero
deseado.
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La presente invención proporciona un
procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos basado en un
método de depósito electroasistido de capas de sílice impresas
molecularmente sobre diversos electrodos. Estos electrodos
biomiméticos se utilizan para la detección altamente selectiva de
sustancias de interés ambiental, bioquímico y alimentario.
En los ejemplos se demuestra cómo el depósito
electroasistido de sílice en presencia de una molécula molde en la
disolución precursora da lugar a la formación de una capa que actúa
como filtro con elevada selectividad para la detección de la
molécula de interés.
Las capas de sol-gel impresas
depositadas sobre electrodos aumentan la selectividad frente al
analito de interés. El depósito electroasistido por reducción
electroquímica se realiza en presencia de una molécula molde (que
generalmente será el analito de interés o un análogo estructural).
Se pueden optimizar fácilmente las propiedades de la capa mediante
los potenciales de reducción, los tiempos empleados en el depósito,
concentración de molécula molde, entre otros parámetros.
Una vez realizado el depósito se procede a la
eliminación de la molécula molde, por ejemplo por degradación
electroquímica o por lavado con disolventes. Al eliminar la molécula
molde los poros de sílice quedan impresos a nivel molecular, lo que
produce un material de carácter biomimético con una elevada
especificidad y afinidad por la molécula de interés. Posteriormente,
el analito será detectado amperométricamente sobre la superficie del
electrodo tras atravesar los poros de material. Las ventajas del
procedimiento de la invención vienen dadas por el elevado control en
el depósito de la sílice cuando se realiza de forma electroasistida,
permitiendo modular el espesor de dicha capa de sílice y la
morfología de la misma, con lo que produce una capa altamente
coherente y reproducible.
Por tanto, en un primer aspecto la presente
invención se refiere a un procedimiento de fabricación de un
electrodo biomimético (en adelante procedimiento de la invención)
que comprende:
- a)
- mezclar una disolución precursora de sílice con una disolución acuosa que contiene un electrolito soporte, la disolución final puede estar a un pH ácido o básico,
- b)
- agitar la mezcla de la etapa (a) para producir la hidrólisis de los precursores
- c)
- añadir a la mezcla obtenida en la etapa (b) una molécula molde,
- d)
- introducir un electrodo en la mezcla de la etapa (c) y aplicar a dicho electrodo un potencial eléctrico o una corriente eléctrica de reducción u oxidación, y
- e)
- eliminar la molécula molde del electrodo modificado obtenido en la etapa (d).
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En la presente invención, por "electrodos
biomiméticos" se entiende a aquellos electrodos modificados con
matrices sintetizadas y que han sido diseñados de tal forma que
tienen la capacidad de reconocer e interaccionar de forma específica
con determinados compuestos. Estos electrodos reproducen de manera
básica el mecanismo de reconocimiento de los sistemas biológicos
(hormona-receptor, enzima-sustrato,
antígeno-anticuerpo, etc.).
Para la fabricación del electrodo biomimético se
prepara una disolución precursora de la sílice, esta disolución
puede contener al menos un alcóxido de silicio o una mezcla de
alcóxidos de silicio y, si fuera necesario la disolución precursora
además contiene un alcohol.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención, en la etapa (a) el alcóxido de silicio se
selecciona entre tetraetilortosilano (TEOS), tetrametoxisilano
(TMOS) o combinación de los mismos. Más preferiblemente, el alcóxido
de silicio es tetraetilortosilano.
En otra realización preferida de dicho
procedimiento, en la etapa (a) el alcohol que se selecciona entre
etanol, metanol, iso-propanol, n-propanol, butanol o
alcohol bencílico. Más preferiblemente, el alcohol es etanol.
A dicha disolución precursora de sílice se le
adiciona una disolución acuosa con un electrolito soporte. Este
electrolito soporte se utiliza para que proporcione conductividad a
la disolución final y puede ser una sal inerte.
En otra realización preferida del procedimiento,
dicho electrolito soporte es una sal que se selecciona de la lista
que comprende KCl, NaCl, Na_{2}SO_{4}, NaNO_{3} o cualquiera
de sus combinaciones. Más preferiblemente, la sal es KCl. Dicho
electrolito puede estar a una concentración de entre 0.001 y 3 M,
más preferiblemente a una concentración de entre 0.1 y 1.0 M, más
preferiblemente a una concentración de 0.5 M.
Esta disolución precursora junto con la
disolución del electrolito soporte de la etapa (a) se acondiciona a
un pH adecuado, para dar lugar a la hidrolización de los precursores
de la sílice. Para que se produzca la hidrólisis de los precursores
esta etapa debe estar catalizada por protones (es decir, a pH ácido)
o bien por -OH (es decir, a un pH básico), sin embargo a pH neutro
la hidrólisis se produce muy lentamente o no se produce. Esta etapa
de hidrólisis del procedimiento de la invención se produce mediante
agitación (paso (b) del procedimiento de la invención). Una
posterior reacción de condensación catalizada a un pH diferente al
de la hidrólisis daría lugar a la gelificación de la matriz de
sílice, como se describe a continuación en el paso (d) del
procedimiento de la invención.
En otra realización preferida, en la etapa (a)
la mezcla resultante se lleva a un valor de pH comprendido entre 0 y
7, para la hidrólisis del precursor en la etapa (b), empleando un
ácido que se selecciona entre HCl, H_{2}S, H_{2}SO_{4},
CH_{3}COOH, HCOOH, HOOC-COOH HClO_{4}, HNO_{3}
con una concentración entre 0.0001 y 2 M. Más preferiblemente, el
ácido es HCl, con una concentración de 0.1 M.
Adicionalmente, en esta etapa (a) del
procedimiento de la invención se puede añadir algún compuesto
organoalcoxisilano para modificar las propiedades del material
obtenido. Preferiblemente, un organoalcoxisilano que se selecciona
de la lista que comprende metiltrietoxisilano, metiltrimetoxisilano,
feniltrietoxisilano, viniltrietoxisilano o cualquiera de sus
combinaciones.
Tras la etapa de hidrólisis, esta disolución
precursora se introduce en una célula electroquímica y se le añade
una cantidad de la molécula molde de interés con la que se quiere
imprimir la matriz de sílice, para poder ser detectada
posteriormente. En la célula electroquímica se sumerge un electrodo
de referencia y un electrodo auxiliar.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención, en la etapa (c) la molécula molde puede ser una
hormona, un enzima, una proteína, un antígeno, un azúcar, en general
cualquier molécula orgánica o metabolito biológicamente activo
susceptibles de ser analizados, como por ejemplo pero sin limitara a
dopamina, epinefrina, ácido úrico, glucosa colesterol o resveratrol,
preferiblemente con una concentración entre 0.001 y 3 M. Más
preferiblemente, la molécula molde es dopamina o glucosa, más
preferiblemente aún la concentración de la molécula molde está en
una concentración de entre 0.05 y 1.5 M, más preferiblemente a 0.1
M.
El electrodo sobre el que se realiza el depósito
actúa como electrodo de trabajo. Como electrodos de trabajo se
pueden utilizar gran variedad de materiales, como por ejemplo pero
sin limitarse a materiales carbonosos como carbono vítreo, grafito,
diamante dopado con boro, electrodos modificados con nanotubos de
carbono o electrodos metálicos como oro, plata, platino, acero,
cobre, níquel, entre otros. Alternativamente, se puede utilizar
electrodos serigrafiados, habitualmente de carbono, oro o platino,
soportado en base cerámica o plástica. Más preferiblemente, el
electrodo es carbono vítreo u oro.
Una vez adicionada la molécula molde y el
electro de trabajo, se aplica un potencial eléctrico o una corriente
eléctrica de reducción u oxidación sobre el electrodo de trabajo con
el fin de que se produzca una reacción electroquímica como, por
ejemplo, reducción u oxidación electroquímica de agua, reducción
electroquímica de oxígeno disuelto, reducción de nitratos, entre
otras reacciones conocidas por cualquier experto en la materia. Esto
produce un cambio del pH local en el entorno del electrodo,
produciéndose la deposición de matriz de sílice que contiene la
molécula molde.
En una realización preferida de dicho
procedimiento, en la etapa (d) para realizar el depósito
electroasistido cuando se realiza de forma potenciostática se aplica
un potencial eléctrico con un valor de entre +0.5 y -3.0 V frente a
un electrodo normal de hidrógeno y más preferiblemente durante un
tiempo de entre 5 s y 30 min.
Y en otra realización preferida del
procedimiento, en la etapa (d) cuando se realizar el depósito
galvanostático se aplica una densidad de corriente eléctrica con un
valor de entre 0 y -100 mA cm^{-2} y más preferiblemente durante
un tiempo de entre 5 s y 30 min.
En la presente invención, el "depósito
electroasistido" se refiere a un proceso electroquímico en el que
se usa una corriente eléctrica para reducir u oxidar especies
disueltas en una solución acuosa que los contiene que no son las
especies que se depositan, pero que propician la precipitación de
otras moléculas o coloides presentes en la disolución sobre un
objeto conductivo que será el cátodo o ánodo de la celda, creando un
fino recubrimiento alrededor de éste con el material depositado por
el cambio de pH.
Este cambio de pH produce una aceleración de los
procesos de gelificación por la rápida agregación de los coloides de
sílice en la disolución precursora en el entorno del electrodo de
trabajo. Estos coloides agregados se generan en la disolución que
contiene la molécula molde atrapándola en su interior (Figura 1).
Los coloides así formados se depositan sobre la superficie del
electrodo. Al depositarse, la molécula molde queda atrapada en el
interior de los poros la matriz de sílice.
Una vez depositada la capa de sílice se procede
a eliminar la molécula molde. Para ello se puede introducir el
electrodo modificado en un disolvente donde sea soluble la molécula
molde o, alternativamente, se introduce el electrodo modificado en
una célula electroquímica con una disolución acuosa con un
electrolito soporte en ausencia de la molécula molde, y se procede a
la degradación electroquímica de la molécula contenida en la capa
(Figura 1). Este procedimiento libera los poros permitiendo la
entrada posterior de nuevas moléculas objeto del análisis.
Por tanto, en una realización preferida del
procedimiento de la invención, en la etapa (e) la eliminación de la
molécula molde se realiza mediante extracción con un disolvente que
se selecciona entre aquellos en los que sea soluble la molécula
molde.
En otra realización preferida de dicho
procedimiento, en la etapa (e) la eliminación de la molécula molde
se realiza mediante extracción electroquímica utilizando una
disolución acuosa con un electrolito que se puede seleccionar entre
KCl, NaCl, sales de sulfato, sales de nitrato, sales de fosfato,
etc., más preferiblemente con una concentración entre 0.001 y 3 M, y
aplicando un potencial eléctrico en el que se produzca la reacción
de degradación electroquímica de la molécula molde. Más
preferiblemente, el electrolito es KCl, con una concentración de 0.1
M, y se aplica un potencial eléctrico ciclando entre +0.2 y +1.0
V.
El hecho de forzar el paso de las moléculas
presentes en la disolución a través de los poros específicos
generados asegura la elevada selectividad del sensor electroquímico.
La capa formada permite el paso sólo de la molécula molde empleada,
impidiendo en gran medida el acceso de otras moléculas
potencialmente interferentes hasta la superficie del electrodo
(Figura 1.b).
La mayor ventaja que presenta el método de
depósito electroasistido para preparar fases sensoras sobre
electrodos respecto de otros métodos convencionales (como
spin-coating o dip-coating) está
fundamentalmente relacionada con el control de la coherencia y
porosidad de las capas.
El principal problema que puede tener una capa
sensora preparada mediante impresión molecular y depositada sobre un
electrodo por las técnicas habituales es la presencia de agujeros
(pinholes) que permitan el paso indiscriminado de especies desde la
disolución hasta la superficie del electrodo, lo que interfiere en
la detección del analito de interés.
El depósito electroasistido propuesto en la
presente invención previene la formación de estos poros no
controlados. Cuando se polariza el electrodo para realizar el
deposito del material se generan líneas de corriente en la dirección
normal a la superficie del electrodo (Figura 2.a). La velocidad de
la reacción electroquímica, y por tanto del depósito
electroasistido, es proporcional a la densidad de estas líneas de
corriente.
La capa de sílice depositada es de carácter no
conductor, lo que hace que en las zonas donde se deposita la sílice
se inhiba parcialmente la reacción electroquímica. Las líneas de
corriente se concentrarían, por tanto, en otras zonas desprovistas
de depósito que son más conductoras (Figura 2.b), donde se
produciría un aumento en la velocidad del depósito de sílice.
En el caso límite en que casi todo el electrodo
estuviera recubierto de una capa de sílice excepto un pequeño
agujero (Figura 2.c), todas las líneas de corriente se concentrarían
en esa pequeña zona acelerando el depósito de sílice en ese punto.
Por tanto, la propiedad fundamental en este proceso de deposito
electroasistido de una capa no conductora es su capacidad de
autocurarse, evitando la formación de agujeros, obteniéndose así una
capa de elevada coherencia.
Por tanto, en un segundo aspecto la presente
invención se refiere a un electrodo biomimético obtenible por el
procedimiento de la invención (en adelante electrodo biomimético de
la invención), que comprende:
- a)
- un electrodo y
- b)
- un recubrimiento que comprende una capa de sílice impresa molecularmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los electrodos así fabricados se utilizan para
la detección electroquímica en muestras que contienen una
concentración desconocida de la molécula de interés que se ha
utilizado como molde. La capa de sílice impresa muestra gran
afinidad por el analito de interés e impide el acceso de moléculas
interferentes hacia la superficie del electrodo.
Por tanto, en un tercer aspecto la presente
invención se refiere al uso del electrodo biomimético de la
invención para la fabricación de un sensor amperométrico,
voltamperométrico, impedimétrico o potenciométrico. Preferiblemente,
el sensor es amperométrico.
Además, en un cuarto aspecto, la presente
invención se refiere a un sensor (en adelante sensor de la
invención) que comprende el electrodo biomimético de la
invención.
Y en un último aspecto, la presente invención se
refiere al uso del sensor de la invención para la detección
electroquímica de la concentración de la molécula molde en una
muestra. Preferiblemente, la detección electroquímica es
amperométrica, voltamperométrica, impedimétrica o potenciométrica. Y
más preferiblemente, la detección electroquímica es
amperométrica.
Tras el uso continuado del sensor, es posible
que comience a perder efectividad por el colapso de los poros con la
especie a determinar. El procedimiento de regeneración es muy
sencillo y se basa en repetir el tratamiento de extracción de la
molécula molde que se realizó tras la gelificación de la capa, bien
limpieza con disolventes, o bien extracción electroquímica. De esta
forma, los poros de la fase sensora se liberan para su posterior
uso.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: a) muestra un esquema ilustrativo de una
capa de sílice impresa depositada sobre un electrodo con la molécula
molde atrapada en su interior. Tras el tratamiento de limpieza se
consigue liberar los poros para que el analito pueda acceder a
través de ellos hasta la superficie del electrodo; b) muestra cómo
una vez liberados los poros del material éste permite el paso de la
molécula de interés evitando el acceso de interferentes hasta la
superficie electródica.
Fig. 2: muestra esquemáticamente las líneas de
corriente generadas durante una reacción electroquímica y cómo el
depósito electroasistido de la sílice modifica la distribución de
estas líneas de corriente, promoviendo la formación de un depósito
de sílice muy coherente y homogéneo.
Fig. 3: muestra una micrografía obtenida en un
microscopio electrónico de barrido donde se observa el depósito de
sílice obtenido sobre un electrodo de carbono vítreo por reducción a
-2.2 V/RHE en presencia de una molécula molde (dopamina).
Fig. 4: muestra los voltamperogramas cíclicos
obtenidos en una disolución acuosa tamponada a pH 7 de ácido
ascórbico (AA) 0.5 mM y dopamina (DA) 0.5 mM (relación de
concentraciones AA:DA 1:1) a 100 mV s^{-1}. Cada curva corresponde
a la respuesta de un electrodo diferente: a) Electrodo de Carbono
vítreo; b) Electrodo modificado con una capa de sílice (NIP,
potencial de depósito -2.5 V); c) Electrodo modificado con una capa
de sílice impresa molecularmente con dopamina (MIP, potencial de
depósito -2.5 V).
Fig. 5: muestra un diagrama de barras que
cuantifica la selectividad de los distintos electrodos utilizados
(GC, NIP y MIP) preparados a distintas condiciones de potencial de
depósito, en el caso de los electrodos modificados con sílice.
Tiempo de depósito 1 min.
Fig. 6: muestra los voltamperogramas cíclicos
obtenidos en una disolución acuosa tamponada a pH 7 de ácido
ascórbico 6 mM y dopamina 0.5 mM (relación 12:1) a 100 mV s^{-1}.
Cada curva corresponde a la respuesta de un electrodo diferente: GC
Electrodo de Carbono vítreo; NIP Electrodo modificado con una capa
de sílice; MIP Electrodo modificado con una capa de sílice impresa
molecularmente con dopamina.
\newpage
Fig. 7: muestra la respuesta amperométrica a
+0.9 V de un electrodo modificado con sílice impresa con dopamina
(electrodo MIP), al realizar adiciones sucesivas de dopamina en
presencia de interferente, ácido ascórbico 0.05 M.
Fig. 8: muestra la respuesta amperométrica
estabilizada a +0.9 V de un electrodo modificado con sílice impresa
con dopamina (electrodo MIP) frente a la concentración de dopamina
en presencia de interferente, ácido ascórbico 0.05 M (relación de
concentraciones en torno a 200000:1).
Fig. 9: muestra la respuesta voltamétrica de un
electrodo modificado con sílice impresa que ha sido utilizado en la
detección de dopamina en una disolución KCl 0.1 M. Al realizar
sucesivos barridos voltamétricos se observa la
oxidación-degradación de la dopamina atrapada en los
poros del material. Tras 10 ciclos voltamétricos los poros quedan
liberados pudiendo reutilizarse el electrodo para la detección de
dopamina.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de los electrodos
biomiméticos con aplicaciones en el desarrollo de sensores
amperométricos altamente selectivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección amperométrica de dopamina en presencia
de interferente (ácido ascórbico).
La dopamina pertenece a la familia de las
catecolaminas y tiene una función como neurotransmisor. Es además un
intermedio metabólico de la conversión de la adrenalina en tirosina.
Los niveles normales en sangre de dopamina se encuentran entre
0.01-1 mM. La presencia de niveles anormales se ha
relacionado con procesos neurodegenerativos, como la enfermedad del
Parkinson.
La detección electroquímica de esta sustancia
suele estar interferida por la presencia del ácido ascórbico en los
fluidos fisiológicos. El ácido ascórbico se oxida a potenciales
parecidos a la dopamina pero la principal causa de interferencia es
que está en concentraciones mucho mayores (relaciones de
concentración de 100000:1).
Es por tanto necesario para tener una correcta
determinación de dopamina en fluidos obtener fases sensoras de
elevada selectividad. Se muestra a continuación en detalle el método
de síntesis de un electrodo para la detección selectiva de
dopamina.
Se prepara una disolución precursora de las
capas de sílice con la siguiente composición: Se mezclan 6 ml de
TEOS con 8.2 ml de etanol. A esta mezcla se le añaden 5.8 ml de una
disolución acuosa de KCl 0.5 M + HCl 0.1 M. Esta disolución se agita
bajo campo de ultrasonidos durante 15 minutos en un envase cerrado
para que se produzca la hidrólisis del TEOS.
La disolución precursora hidrolizada se
introduce en una célula electroquímica y se añade la molécula molde,
dopamina en este caso, hasta alcanzar una concentración 0.1 M. Como
electrodo de referencia se emplea un electrodo reversible de
hidrógeno (RHE) y el electrodo auxiliar o contraelectrodo es una
espira de platino. El electrodo de trabajo sobre el que se realiza
el depósito es un electrodo de carbono vítreo pulido que se
introduce en la disolución.
Se aplica sobre este electrodo un potencial de
reducción para que se dé la reacción de reducción del disolvente
(generación de hidrógeno). Se realizó la optimización de la sílice
impresa realizando depósitos de la misma a potenciales comprendidos
entre -2.0 y -2.5 V, realizando depósitos de sílice durante
distintos tiempos comprendidos entre 30 s y 2 min.
Tras formarse el depósito, el electrodo se
extrae de la célula de gelificación para proceder a la extracción de
la molécula molde. Para ello, se introduce el electrodo en otra
célula electroquímica de limpieza que contiene una disolución acuosa
0.1 M KCl y se procede a oxidar voltamétricamente la dopamina
contenida en los poros del material, ciclando entre +0.2 y +1.0 V.
Tras 5 ciclos voltamétricos, la carga neta de oxidación es nula, lo
que indica que toda la dopamina incluida en la capa ha sido
efectivamente eliminada.
Para obtener las mejores condiciones de depósito
se probaron las distintas capas obtenidas sobre los electrodos de
carbono vítreo en una disolución que contenía dopamina 0.5 mM y
ácido ascórbico 0.5 mM (relación de concentraciones 1:1) en una
disolución acuosa a pH 7 (tampón fosfato). La Figura 4 muestra la
respuesta voltamétrica de los distin-
tos electrodos: Carbono vítreo desnudos (Figura 4.a) y electrodos modificados con capas de sílice (Figuras 4.b y 4.c).
tos electrodos: Carbono vítreo desnudos (Figura 4.a) y electrodos modificados con capas de sílice (Figuras 4.b y 4.c).
Con el fin de atestiguar el efecto de la
impresión molecular en la detección selectiva de la dopamina, se
realizó un depósito de sílice en condiciones parecidas de potencial,
en ausencia de la molécula molde, sílice no impresa (electrodo NIP,
Figura 4.b) y en presencia de dopamina (MIP, Figura 4.c).
En el caso del electrodo de carbono vítreo se
observa un pico de oxidación a +0.64 V correspondiente a la
oxidación irreversible del ácido ascórbico. Este pico de oxidación
se solapa parcialmente con el pico de oxidación de la dopamina a
+0.83 V, por lo que interfiere la correcta determinación
amperométrica de esta especie. Cuando se emplean electrodos
recubiertos de una capa de sílice se obtienen picos de oxidación
mejor definidos en el caso del electrodo NIP y una inhibición
parcial del proceso de oxidación del ascórbico con el electrodo
MIP.
La selectividad de la detección amperométrica se
ha definido en nuestro caso como la relación de corrientes de
oxidación de dopamina (pico en torno a 0.8 V) y de ácido ascórbico
(pico en torno a 0.6 V), siendo tanto mejor la selectividad cuanto
mayor sea este parámetro. La Figura 5 muestra los valores de
selectividad obtenidos para distintas capas preparadas a distintos
potenciales.
Se observan bajos valores de selectividad (en
torno a 1) parta los electrodos de carbono vítreo, como cabía
esperar. Se observan valores algo mayores de selectividad (en torno
a 2) para los electrodos modificados con sílice no impresa (NIP).
Sin embargo, los electrodos que presentan mejores valores de
selectividad son los de sílice impresa molecularmente (MIP). En
concreto las condiciones de depósito óptimas son un potencial de
-2.2 V durante 1 min (Figura 5).
La Figura 6 muestra la respuesta
voltamperométrica de una disolución que contiene dopamina 0.5 mM y
ácido ascórbico 6 mM en una disolución acuosa a pH 7 (tampón
fosfato). Los electrodos empleados fueron carbono vítreo pulido (GC)
y los electrodos NIP y MIP optimizados.
En el caso del electrodo de carbono vítreo se
observa un pico de oxidación a +0.63 V correspondiente a la
oxidación irreversible del ácido ascórbico. Este pico de oxidación
se solapa con el pico de oxidación de la dopamina a +0.82 V por lo
que interfiere la correcta determinación amperométrica de esta
especie. Cuando se emplea un electrodo recubierto de una capa de
sílice no impresa (electrodo NIP) se definen algo mejor los picos de
oxidación de ambas especies pero la corriente de oxidación del ácido
ascórbico tiene una intensidad similar a la obtenida con el
electrodo de carbono vítreo, lo que indica que esta capa no impide
el acceso del interferente a la superficie del elemento transductor.
Cuando se realiza la medida con el electrodo impreso se observa que
la corriente relacionada a la presencia de ácido ascórbico en
disolución prácticamente desaparece pero se mantiene el pico
relativo a la oxidación de dopamina. Este resultado indica que el
depósito de sílice impresa actúa como filtro altamente selectivo que
impide el acceso de la molécula interferente a la superficie del
transductor, permitiendo, por el contrario, el paso a las moléculas
de dopamina.
Se realizó la detección amperométrica de la
dopamina en presencia de interferente, ácido ascórbico en
concentración 0.05 M. El electrodo se polariza a un potencial de
+0.9 V, potencial al que se produce tanto la oxidación de la
dopamina como la del ácido ascórbico sobre los electrodos de carbono
vítreo pulido.
La respuesta del electrodo MIP se muestra en la
Figura 7. Inicialmente la concentración de dopamina es 0 y al ir
adicionando se observa un incremento proporcional de la corriente
medida. Sin embargo, si se adiciona más ácido ascórbico en la
disolución (10 \muM) no se observan cambios en la corriente.
La Figura 8 muestra cómo la respuesta del sensor
es adecuada para el intervalo de concentraciones comprendido entre
100-800 nM en presencia de ácido ascórbico 0.05 M.
La relación de concentración Dopamina: Ácido ascórbico en estas
medidas está en torno a 1:200000, lo que son condiciones similares o
incluso más exigentes a las que se encuentra habitualmente en
fluidos fisiológicos.
El sensor tras un número de usos pierde
efectividad y es necesario regenerarlo. Para ello se introduce el
electrodo en la célula electroquímica de limpieza que contiene una
disolución acuosa 0.1 M KCl. Tras aplicar 5 barridos voltamétricos
entre +0.2 y +1.0 V se recupera la respuesta inicial del sensor
(Figura 9).
Claims (29)
1. Procedimiento de fabricación de un electrodo
biomimético que comprende:
- a)
- mezclar una disolución precursora de sílice con una disolución acuosa que contiene un electrolito soporte, a un pH ácido o básico,
- b)
- agitar la mezcla de la etapa (a),
- c)
- añadir a la mezcla obtenida en la etapa (b) una molécula molde,
- d)
- introducir un electrodo en la mezcla de la etapa (c) y aplicar a dicho electrodo un potencial eléctrico o una corriente eléctrica y
- e)
- eliminar la molécula molde del electrodo modificado obtenido en la etapa (d).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde en la etapa (a) la disolución precursora de sílice contiene un
alcóxido de silicio.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
donde el alcóxido de silicio se selecciona entre
tetraetilortosilano, tetrametoxisilano o combinación de los
mismos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
donde el alcóxido de silicio es tetraetilortosilano.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde la disolución precursora además
contiene un alcohol.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
donde el alcohol se selecciona entre etanol, metanol,
iso-propanol, n-propanol, butanol o alcohol
bencílico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
donde el alcohol es etanol.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde en la etapa (a) el electrolito soporte
es una sal.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
donde la sal se selecciona de la lista que comprende KCl, NaCl,
Na_{2}SO_{4}, NaNO_{3} o cualquiera de sus combinaciones.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde el electrolito soporte se encuentra a
una concentración de entre 0.001 y 3 M.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde la mezcla de la etapa (a) tiene un
valor de pH de entre 0 y 7 empleando un ácido.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
donde el ácido se selecciona de la lista que comprende HCl,
H_{2}S, H_{2}SO_{4}, CH_{3}COOH, HCOOH,
HOOC-COOH, HClO_{4} y HNO_{3}.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, donde en la etapa (c) la molécula molde se
selecciona de la lista que comprende dopamina, epinefrina, ácido
úrico, glucosa, colesterol o resveratrol.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
donde la molécula molde es dopamina o glucosa.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 o 14, donde la molécula molde se encuentra a una
concentración de entre 0.001 y 3 M.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, donde en la etapa (d) el electrodo se
selecciona de la lista que comprende carbono vítreo, grafito,
diamante dopado con boro, electrodo modificado con nanotubos de
carbono, electrodo metálico o electrodo serigrafiado de carbono, oro
o platino soportado en base cerámica o plástica.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
donde el electrodo es carbono vítreo u oro.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, donde en la etapa (d) el potencial
eléctrico a aplicar es de entre +0.5 y -3.0 V frente a un electrodo
normal de hidrógeno.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
donde el potencial se aplica durante un tiempo de entre entre 5 s y
30 min.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, donde en la etapa (d) la corriente
eléctrica de reducción a aplicar tiene un valor de entre 0 y -100 mA
cm^{-2}.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
donde la corriente eléctrica se aplica durante un tiempo de entre
entre 5 s y 30 min.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, donde en la etapa (e) la eliminación de la
molécula molde se realiza mediante extracción con un disolvente.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, donde en la etapa (e) la eliminación de la
molécula molde se realiza mediante extracción electroquímica.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, donde en la etapa (a) además se añade un
compuesto organoalcoxisilano que se selecciona de la lista que
comprende metiltrietoxisilano, metiltrimetoxisilano,
feniltrietoxisilano, viniltrietoxisilano o cualquiera de sus
combinaciones.
25. Electrodo biomimético obtenible por el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
26. Uso del electrodo biomimético según la
reivindicación 25 para la fabricación de un sensor amperométrico,
voltamperométrico, impedimétrico o potenciométrico.
27. Uso según la reivindicación 26, donde el
sensor es amperométrico.
28. Sensor que comprende el electrodo
biomimético según la reivindicación 25.
29. Uso del sensor según la reivindicación 28
para la detección electroquímica de la molécula molde en una
muestra.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200930727A ES2356220B1 (es) | 2009-09-23 | 2009-09-23 | Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos. |
| PCT/ES2010/000394 WO2011036319A1 (es) | 2009-09-23 | 2010-09-23 | Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos |
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| ES200930727A ES2356220B1 (es) | 2009-09-23 | 2009-09-23 | Procedimiento de fabricación de electrodos biomiméticos y sus usos como sensores amperométricos. |
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| ES2356220A1 true ES2356220A1 (es) | 2011-04-06 |
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2009
- 2009-09-23 ES ES200930727A patent/ES2356220B1/es active Active
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- 2010-09-23 WO PCT/ES2010/000394 patent/WO2011036319A1/es active Application Filing
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|---|---|
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