ES2354343B2 - EARLY SEX IDENTIFICATION METHOD IN SPECIES OF THE SCOPHTHALMUS GENDER. - Google Patents
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Abstract
Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus.Method of early identification of sex in species of the genus Scophthalmus .
Método para identificar el sexo en especies del género Scophthalmus antes de que tenga lugar la maduración sexual, que comprende: la extracción de DNA de una muestra biológica aislada de un individuo; poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD; amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa el marcador microsatélite M-SmaSD; y realizar el genotipado del individuo. Además se refiere a los dos cebadores mencionados utilizados en dicho método, así como a un kit de diagnóstico que comprende los elementos adecuados para llevar a cabo este método.Method for identifying sex in species of the genus Scophthalmus before sexual maturation takes place, comprising: the extraction of DNA from an isolated biological sample of an individual; contacting the sample to be analyzed with a reaction mixture, which contains primers capable of amplifying the M-SmaSD microsatellite marker; amplify the microsatellite marker M-SmaSD by polymerase chain reaction; and perform the genotyping of the individual. It also refers to the two mentioned primers used in said method, as well as to a diagnostic kit comprising the elements suitable for carrying out this method.
Description
Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus.Method of early identification of sex in species of the genus Scophthalmus .
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la acuicultura y se refiere a un método para identificar el sexo en especies del género Scophthalmus antes de que tenga lugar la maduración sexual, lo que permite la selección precoz de los individuos de mayor interés productivo, en este caso, las hembras.The present invention is within the field of molecular biology and aquaculture and refers to a method to identify sex in species of the genus Scophthalmus before sexual maturation takes place, allowing early selection of older individuals. productive interest, in this case, females.
El rodaballo (Scophthalmus maximus) posee un alto valor comercial y ha sido cultivado intensivamente durante la última década. Con el fin de conseguir el éxito en la acuicultura a gran escala, es necesaria la mejora genética de esta especie y/o la selección asistida por marcadores genéticos de los individuos más interesantes para los cultivos.Turbot ( Scophthalmus maximus ) has a high commercial value and has been intensively cultivated during the last decade. In order to achieve success in large-scale aquaculture, genetic improvement of this species and / or selection assisted by genetic markers of the most interesting individuals for crops is necessary.
La evaluación de los recursos genéticos en poblaciones naturales constituye una herramienta esencial que se ha venido aplicando en diferentes especies, y en particular en rodaballo (Bouza et al., 2002, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: 1460-1473), mediante el análisis de las variantes alélicas de diferentes marcadores (isoenzimas, AFLP, RAPD, microsatélites, etc.) o mediante el análisis de secuencias mitocondriales (Moritz, 1994, Trends in Ecology and Evolution 9: 373-375). La estimación de parentescos moleculares tiene gran interés para los programas de selección genética, y para ello se precisa de marcadores genéticos altamente polimórficos, técnicamente fiables y preferentemente codominantes. Los candidatos idóneos son los loci microsatélites que se han usado ampliamente para tal fin (Liu y Cordes, 2004, Aquaculture 238: 1-37), y en particular en rodaballo (Castro et al., 2004, Aquaculture, 242: 119-135). Los marcadores moleculares, además suponen un método para confirmar la herencia exclusiva paterna o materna en individuos androgenéticos y ginogenéticos, respectivamente (Felip et al., 2000, Marine Biotechnology 2: 301-306), metodología que también se ha aplicado a rodaballo (Castro et al., 2003, Marine Biotechnology, 5: 584-592). Estos marcadores moleculares, tienen múltiples aplicaciones en la fundación de stocks de reproductores y en el desarrollo de planes de selección.The evaluation of genetic resources in natural populations is an essential tool that has been applied in different species, and in particular in turbot (Bouza et al ., 2002, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: 1460-1473), through the analysis of allelic variants of different markers (isoenzymes, AFLP, RAPD, microsatellites, etc.) or by the analysis of mitochondrial sequences (Moritz, 1994, Trends in Ecology and Evolution 9: 373-375). The estimation of molecular relationships is of great interest for genetic selection programs, and for this, highly polymorphic, technically reliable and preferably codominant genetic markers are required. The suitable candidates are microsatellite loci that have been widely used for this purpose (Liu and Cordes, 2004, Aquaculture 238: 1-37), and in particular in turbot (Castro et al ., 2004, Aquaculture , 242: 119-135 ). Molecular markers also represent a method to confirm exclusive paternal or maternal inheritance in androgenetic and gynogenetic individuals, respectively (Felip et al ., 2000, Marine Biotechnology 2: 301-306), a methodology that has also been applied to turbot (Castro et al ., 2003, Marine Biotechnology , 5: 584-592). These molecular markers have multiple applications in the foundation of breeder stocks and in the development of selection plans.
Aunque los marcadores genéticos son una herramienta empleada en acuicultura para llevar a cabo la selección asistida por marcadores de individuos de interés productivo dentro de una población en cultivo (Thomas Moen et al., 2008, BMC Genetics. 9:18), nunca habían sido empleados para seleccionar individuos de rodaballo en base a su sexo, porque se desconocían los marcadores asociados a su determinación.Although genetic markers are a tool used in aquaculture to carry out the selection assisted by markers of individuals of productive interest within a growing population (Thomas Moen et al ., 2008, BMC Genetics . 9:18), they had never been used to select turbot individuals based on their sex, because the markers associated with their determination were unknown.
En aquellas especies en cultivo en que las ventajas de crecimiento, maduración o adaptación al mercado estén asociadas a uno de los sexos, el estudio de los mecanismos de determinación sexual es esencial para poder obtener poblaciones monosexo. El conocimiento del sexo a edades tempranas es necesario en el manejo de las poblaciones en cultivo y en el establecimiento de stocks de reproductores. No obstante, la determinación del sexo en peces presenta características peculiares dado que existe una mayor labilidad y versatilidad que en el resto de los vertebrados (Bull, 1983, Benjamin Cumming Pub. Menlo Park, California. EE UU: 316 pp): son poco frecuentes los heteromorfismos cromosómicos asociados al sexo, se han descrito mecanismos poligénicos de determinación sexual, es factible la reversión sexual mediante tratamientos hormonales, es frecuente el hermafroditismo y los factores ambientales pueden influir en la determinación sexual. Sin embargo, hay indicios de mecanismos genéticos de determinación sexual similares a los de los vertebrados (Hunter y Donaldson, 1983, Fish Physiology 9 B: 223-303. Academic Press. Nueva York; Nanda et al., 1992, Chromosoma 101: 301-310).In those species in culture in which the advantages of growth, maturation or adaptation to the market are associated with one of the sexes, the study of the mechanisms of sexual determination is essential to obtain monosex populations. Knowledge of sex at an early age is necessary in the management of growing populations and in the establishment of breeding stock . However, the determination of sex in fish has peculiar characteristics since there is greater lability and versatility than in the rest of vertebrates (Bull, 1983, Benjamin Cumming Pub . Menlo Park, California. USA: 316 pp): they are few frequent chromosomal heteromorphisms associated with sex, polygenic mechanisms of sexual determination have been described, sexual reversal is feasible through hormonal treatments, hermaphroditism is common and environmental factors can influence sexual determination. However, there are indications of genetic mechanisms of sexual determination similar to those of vertebrates (Hunter and Donaldson, 1983, Fish Physiology 9 B: 223-303. Academic Press. New York; Nanda et al ., 1992, Chromosome 101: 301 -310).
Como en otras especies de peces teleósteos, en el rodaballo las hembras crecen más rápidamente que los machos alcanzando el tamaño comercial entre tres y seis meses antes que estos. Además, las hembras maduran sexualmente más tarde (a los 24 meses de edad frente a los 15-18 meses de los machos). Dicha maduración está asociada con una pérdida de calidad de la carne, una mayor susceptibilidad a enfermedades y una ralentización del crecimiento. Por todo ello, en el cultivo intensivo de esta especie es de gran interés incrementar la proporción de hembras, ya que presentan un mayor valor económico.As in other species of teleost fish, in the turbot females grow faster than males reaching commercial size between three and six months before these. In addition, females mature sexually later (at 24 months of age compared to 15-18 months of males) This maturation is associated with a loss of quality of meat, a greater susceptibility to diseases and a growth slowdown For all this, in cultivation intensive of this species is of great interest to increase the proportion of females, since they have a higher value economic.
Sin embargo, la determinación del sexo en rodaballo es compleja y no se puede realizar con fiabilidad hasta después de que se produzca la maduración sexual, lo que imposibilita la detección precoz de machos y hembras necesaria para llevar a cabo los planes de selección. El gen o genes responsables de que la gónada esté predeterminada a convertirse en ovario o testículo pueden estar en un solo par cromosómico, en el par sexual, o distribuidos en distintos lugares del genoma.However, the determination of sex in Turbot is complex and cannot be performed reliably until after sexual maturation occurs, which makes it impossible the early detection of males and females necessary to carry out Selection plans The gene or genes responsible for the gonad is predetermined to become an ovary or testicle they can be in a single chromosomal pair, in the sexual pair, or distributed in different places of the genome.
Con anterioridad, se ha detectado la existencia de un comportamiento cromosómico diferencial durante la meiosis entre machos y hembras triploides, que podría explicar la diferencia en la maduración gonadal entre ambos sexos de rodaballo (Cuñado et al., 2001, Genome 44: 1143-1147; Cuñado et al., 2002, Heredity 89: 460-464). Además se ha visto que los triploides de esta especie tienen la ventaja de evitar los problemas asociados a la maduración gonadal y muestran una proporción superior de hembras (Piferrer et al., 2000, Aquaculture 188: 79-90; Cal et al., 2006, Aquaculture, 251: 99-108), lo cual es interesante en las poblaciones de rodaballo, en las que las hembras crecen más rápidamente que los machos. Sin embargo, la metodología de obtención de triploides aún ha de ser valorada y adaptada para su aplicación a escala industrial.Previously, the existence of a differential chromosomal behavior has been detected during meiosis between males and triploid females, which could explain the difference in gonadal maturation between both sexes of turbot (Cuñado et al ., 2001, Genome 44: 1143-1147 ; Brother-in-law et al ., 2002, Heredity 89: 460-464). It has also been seen that triploids of this species have the advantage of avoiding the problems associated with gonadal maturation and show a higher proportion of females (Piferrer et al ., 2000, Aquaculture 188: 79-90; Cal et al ., 2006 , Aquaculture, 251: 99-108), which is interesting in turbot populations, where females grow faster than males. However, the methodology for obtaining triploids has yet to be valued and adapted for application on an industrial scale.
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Algo similar ocurre en el caso de los ginogenéticos (individuos de constitución genética matrilineal). El análisis de la proporción de sexos en ginogenéticos ha aportado información relevante en relación con la elucidación de los mecanismos de determinación sexual en diferentes especies, y en particular en rodaballo (Cal et al, 2006, Journal of Fish Biology, 68: 401-413).Something similar occurs in the case of gynogenetic (individuals of matrilineal genetic constitution). The analysis of the sex ratio in gynogenetics has provided relevant information regarding the elucidation of the mechanisms of sexual determination in different species, and in particular in turbot (Cal et al , 2006, Journal of Fish Biology, 68: 401-413 ).
Otra de las aproximaciones a esta cuestión ha sido la búsqueda de secuencias de ADN específicas asociadas al sexo en otras especies de peces (Nakayama et al, 1994, Chromosoma 103: 31-39). Así, en el lenguado japonés se han logrado asociar determinadas regiones genéticas con la determinación del sexo y se ha desarrollado un método basado en la técnica de PCR para amplificar estas regiones de ADN, las cuales posteriormente son analizadas en un gel en el que la diferencia de tamaños de los fragmentos obtenidos permite determinar el sexo del individuo analizado (W02008117715 A1). No obstante, no existe ninguna técnica similar a esta que permita una identificación sexual en Scophthalmus maximus, por no haberse encontrado ninguna región genética asociada con la determinación sexual, de manera que la selección en base al sexo asistida por marcadores se ha podido desarrollar en otras especies de peces pero no así en el rodaballo.Another approach to this issue has been the search for specific DNA sequences associated with sex in other fish species (Nakayama et al , 1994, Chromosoma 103: 31-39). Thus, in the Japanese sole, certain genetic regions have been associated with sex determination and a method based on the PCR technique has been developed to amplify these DNA regions, which are subsequently analyzed in a gel in which the difference The size of the fragments obtained allows to determine the sex of the analyzed individual (W02008117715 A1). However, there is no technique similar to this that allows sexual identification in Scophthalmus maximus , because no genetic region associated with sexual determination has been found, so that selection based on sex assisted by markers has been developed in other species of fish but not so in the turbot.
En rodaballo, se han realizado aproximaciones citogenéticas con cromosomas mitóticos (Bouza, Sánchez y Martínez, 1994, Mar. Biol. 120: 609-613) y meióticos (Cuñado, Terrones, Sánchez, Martínez y Santos, 2001, Genome, 44: 1143-1147) para tratar de evidenciar heteromorfismos asociados al sexo, pero sin resultados positivos.In turbot, cytogenetic approaches have been made with mitotic chromosomes (Bouza, Sánchez and Martínez, 1994, Mar. Biol . 120: 609-613) and meiotic (Cuñado, Terrones, Sánchez, Martínez and Santos, 2001, Genome , 44: 1143 -1147) to try to show heteromorphisms associated with sex, but without positive results.
Se han aplicado técnicas de genómica estructural (mapas genéticos y "quantitative trait loci" o QTL) y proteómica para detectar regiones genómicas o genes específicos relacionados con los mecanismos de diferenciación gonadal en esta especie (Martínez, P., 2005, Boletín Instituto Español de Oceanografía. 21 (1-4): 225-238). En relación a ello, se ha construido un mapa genético con microsatélites de Scophthalmus maximus (Bouza, 2007, Genetics 177: 2457-2467), que ha aportado la posibilidad de identificar QTLs relacionados con el crecimiento y la resistencia a enfermedades y con la detección de regiones genómicas asociadas con la determinación sexual, que pueden tener aplicación en la selección asistida por marcadores. No obstante, hasta la fecha no se había conseguido asociar ninguna región genética concreta a la determinación sexual.Structural genomics techniques (genetic maps and "quantitative trait loci" or QTL) and proteomics have been applied to detect specific genomic regions or genes related to gonadal differentiation mechanisms in this species (Martínez, P., 2005, Bulletin Instituto Español de Oceanography 21 (1-4): 225-238). In this regard, a genetic map has been constructed with microsatellites of Scophthalmus maximus (Bouza, 2007, Genetics 177: 2457-2467), which has provided the possibility of identifying QTLs related to growth and resistance to diseases and detection of genomic regions associated with sexual determination, which may have application in marker-assisted selection. However, to date, no specific genetic region had been associated with sexual determination.
Debido a todas estas dificultades, hasta el momento la selección se realiza a una edad en la que todavía no se puede identificar el sexo, por lo que no es posible seleccionar a aquellos individuos de interés en los casos en que las ventajas en términos de producción estén asociadas a uno de los sexos.Because of all these difficulties, until the At this time, the selection is made at an age when can identify sex, so it is not possible to select those individuals of interest in cases where the advantages in terms of production are associated with one of the sexes.
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Un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos para la identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:A first aspect of the invention relates to a method of obtaining data for the early identification of sex in species of the genus Scophthalmus , hereinafter the first method of the invention, comprising:
- a)to)
- la extracción de DNA de una muestra biológica aislada de un individuo,the DNA extraction from a biological sample isolated from a individual,
- b)b)
- poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD que se encuentra incluido en la SEQ ID NO: 3,put on contact the sample to be analyzed with a reaction mixture, which contains primers capable of amplifying the microsatellite marker M-SmaSD that is included in SEQ ID NO: 3,
- c)C)
- amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa el marcador microsatélite M-SmaSD,amplify by reaction in polymerase chain the microsatellite marker M-SmaSD,
- d)d)
- realizar el genotipado del individuo.perform genotyping of individual.
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En una realización preferida de este aspecto de
la invención los cebadores para el marcador microsatélite
M-SmaSD son los que se recogen en la SEQ ID NO: 1,
de ahora en adelante primera secuencia nucleotídica de la invención,
y en la SEQ ID NO: 2, de ahora en adelante segunda secuencia
nucleotídica de la invención. En otra realización preferida, la
muestra biológica aislada del paso (a) proviene de la aleta caudal.
En otra realización preferida uno de los cebadores capaces de
amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD del
paso (b) está marcado con un fluorocromo. En otra realización más
preferida el marcador microsatélite M-SmaSD incluye
una o más secuencias de tipo: (TA)_{n}. En otra
realiza-
ción aún más preferida de este aspecto de la
invención, la especie del género Scophthalmus es
Scophthalmus maximus.In a preferred embodiment of this aspect of the invention the primers for the M-SmaSD microsatellite marker are those set forth in SEQ ID NO: 1, hereinafter the first nucleotide sequence of the invention, and in SEQ ID NO: 2, hereafter second nucleotide sequence of the invention. In another preferred embodiment, the biological sample isolated from step (a) comes from the caudal fin. In another preferred embodiment one of the primers capable of amplifying the M-SmaSD microsatellite marker of step (b) is labeled with a fluorochrome. In another more preferred embodiment the microsatellite marker M-SmaSD includes one or more sequences of type: (TA) n. In another realization-
Even more preferred of this aspect of the invention, the species of the genus Scophthalmus is Scophthalmus maximus .
Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos del método de obtención de datos (primer método de la invención), y además:Method of early identification of sex in species of the genus Scophthalmus , hereinafter second method of the invention, comprising the steps of the method of data collection (first method of the invention), and in addition:
- e.and.
- asociar un determinado genotipo del paso (d) al sexo masculino y otro al sexo femenino.associate a certain genotype of step (d) to the male sex and another to the female sex.
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En una realización preferida de este aspecto de la invención los cebadores para el marcador microsatélite M-SmaSD son los que se recogen en la primera secuencia nucleotídica de la invención (SEQ ID NO: 1) y en la segunda secuencia nucleotídica de la invención (SEQ ID NO: 2). En otra realización preferida, la muestra biológica aislada del paso (a) proviene de la aleta caudal. En otra realización preferida uno de los cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD del paso (b) está marcado con un fluorocromo. En otra realización más preferida el marcador microsatélite M-SmaSD incluye una o más secuencias de tipo: (TA)_{n}. En otra realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la especie del género Scophthalmus es Scophthalmus maximus.In a preferred embodiment of this aspect of the invention the primers for the M-SmaSD microsatellite marker are those that are collected in the first nucleotide sequence of the invention (SEQ ID NO: 1) and in the second nucleotide sequence of the invention (SEQ ID NO: 2). In another preferred embodiment, the biological sample isolated from step (a) comes from the caudal fin. In another preferred embodiment one of the primers capable of amplifying the M-SmaSD microsatellite marker of step (b) is labeled with a fluorochrome. In another more preferred embodiment the microsatellite marker M-SmaSD includes one or more sequences of type: (TA) n. In another even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the species of the genus Scophthalmus is Scophthalmus maximus .
Método de selección de individuos del sexo femenino en especies del género Scophthalmus, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos del método de obtención de datos (primer método de la invención) y/o del método de identificación precoz del sexo (segundo método de la invención), y que además comprende testar la presencia de un QTL (quantitative trait loci) relacionado con el sexo y asociado con el marcador microsatélite M-SmaSD.Method of selection of female individuals in species of the genus Scophthalmus , hereinafter third method of the invention, comprising the steps of the method of data collection (first method of the invention) and / or the method of early identification of the sex (second method of the invention), and which also includes testing the presence of a QTL (quantitative trait loci) related to sex and associated with the microsatellite marker M-SmaSD.
En una realización preferida de este aspecto de la invención los cebadores para el marcador microsatélite M-SmaSD son los que se recogen en la primera secuencia nucleotídica de la invención (SEQ ID NO: 1) y en la segunda secuencia nucleotídica de la invención (SEQ ID NO: 2). En otra realización preferida, la muestra biológica aislada del paso (a) proviene de la aleta caudal. En otra realización preferida uno de los cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD del paso (b) está marcado con un fluorocromo. En otra realización más preferida el marcador microsatélite M-SmaSD incluye una o más secuencias de tipo: (TA)_{n}. En otra realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la especie del género Scophthalmus es Scophthalmus maximus.In a preferred embodiment of this aspect of the invention the primers for the M-SmaSD microsatellite marker are those that are collected in the first nucleotide sequence of the invention (SEQ ID NO: 1) and in the second nucleotide sequence of the invention (SEQ ID NO: 2). In another preferred embodiment, the biological sample isolated from step (a) comes from the caudal fin. In another preferred embodiment one of the primers capable of amplifying the M-SmaSD microsatellite marker of step (b) is labeled with a fluorochrome. In another more preferred embodiment the microsatellite marker M-SmaSD includes one or more sequences of type: (TA) n. In another even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the species of the genus Scophthalmus is Scophthalmus maximus .
Otro aspecto de la invención se refiere a los dos cebadores recogidos en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.Another aspect of the invention relates to two primers collected in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de los dos cebadores recogidos en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.Another aspect of the invention relates to the use of the two primers listed in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to carry out any of the methods of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos de tipo microsatélite que se incluye en la SEQ ID NO: 3, de ahora en adelante tercera secuencia nucleotídica de la invención, capaz de ser amplificada por los cebadores cuyas secuencias se recogen en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en el genoma de las especies del género Schophthalmus.Another aspect of the invention relates to a nucleotide sequence of the microsatellite type that is included in SEQ ID NO: 3, hereafter the third nucleotide sequence of the invention, capable of being amplified by the primers whose sequences are collected in the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, in the genome of the species of the genus Schophthalmus .
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la tercera secuencia nucleotídica de la invención para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.Another aspect of the invention relates to the use of the third nucleotide sequence of the invention to lead to perform any of the methods of the invention.
Otro aspecto se refiere a un kit de diagnóstico precoz del sexo en especies del género Schophthalmus, de ahora en adelante kit de la invención, que comprende los medios adecuados para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención. En una realización preferida de este aspecto, el kit de la invención comprende los cebadores para el marcador microsatélite M-SmaSD cuya secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.Another aspect relates to a kit for the early diagnosis of sex in species of the genus Schophthalmus , hereafter referred to as the kit of the invention, which comprises suitable means for carrying out any of the methods of the invention. In a preferred embodiment of this aspect, the kit of the invention comprises the primers for the M-SmaSD microsatellite marker whose sequence is recorded in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
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La presente invención proporciona un método de obtención de datos para la identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus, y en concreto del rodaballo (Scophthalmus maximus). La ventaja del método propuesto en la invención radica en que permite identificar de manera precoz (antes de que se produzca la maduración sexual) el sexo del rodaballo, lo que posibilita la selección de los individuos más interesantes desde el punto de vista productivo, las hembras, para su cultivo. La identificación precoz del sexo en las especies de este género supone una valiosa herramienta para los programas de selección y producción de poblaciones en cultivo.The present invention provides a method of obtaining data for the early identification of sex in species of the genus Scophthalmus , and specifically of the turbot ( Scophthalmus maximus ). The advantage of the method proposed in the invention is that it allows the sex of turbot to be identified early (before sexual maturation occurs), which makes it possible to select the most interesting individuals from a productive point of view, females , for its cultivation. The early identification of sex in species of this genus is a valuable tool for the selection and production programs of growing populations.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos para la identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus, que comprende:Therefore, a first aspect of the invention relates to a method of obtaining data for the early identification of sex in species of the genus Scophthalmus , which comprises:
- a.to.
- la extracción de DNA de una muestra biológica aislada de un individuo,the DNA extraction from a biological sample isolated from a individual,
- b.b.
- poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene los cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD que se encuentra incluido en la SEQ ID NO: 3,put on contact the sample to be analyzed with a reaction mixture, which contains the primers capable of amplifying the marker M-SmaSD microsatellite that is included in SEQ ID NO: 3,
- c.C.
- amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa el marcador microsatélite M-SmaSD,amplify by reaction in polymerase chain the microsatellite marker M-SmaSD,
- d.d.
- realizar el genotipado del individuo.perform genotyping of individual.
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En la presente memoria se entiende como "identificación precoz del sexo" aquella que se realiza a cualquier edad del individuo a analizar con anterioridad a la maduración sexual.It is understood herein as "early identification of sex" that which is performed at any age of the individual to analyze before the sexual maturation
Dado que las especies del género Scophthalmus son afines en cuanto a su evolución, la homología global de los genomas al nivel de la secuencia de nucleótidos es elevada. Esto ha permitido la amplificación del marcador microsatélite M-SmaSD, útil para la identificación del sexo en rodaballo, en otra especie del género Scophtthalmus de valor comercial, S. rhombus, denominado rémol o coruxo. Por tanto, aunque la presente invención se ejemplifica con individuos de la especie Scophthalmus maximus, los métodos que aquí se proporcionan podrían servir para la obtención de datos útiles y para el diagnóstico precoz del sexo en otras especies del género Scophthalmus, como por ejemplo pero sin limitarnos, Scophthalmus rhombus.Since the species of the genus Scophthalmus are related in their evolution, the global homology of genomes at the level of the nucleotide sequence is high. This has allowed the amplification of the M-SmaSD microsatellite marker, useful for the identification of sex in turbot, in another species of the commercially valuable Scophtthalmus genus, S. rhombus , called rémol or coruxo. Therefore, although the present invention is exemplified with individuals of the species Scophthalmus maximus , the methods provided herein could be used to obtain useful data and for the early diagnosis of sex in other species of the genus Scophthalmus , such as but without Limit ourselves, Scophthalmus Rhombus .
El término "Género", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la categoría de la clasificación biológica (categoría taxonómica) que comprende una o más especies relacionadas filogenéticamente y morfológicamente similares. También se espera que compartan, características bioquímicas y metabólicas similares. Por "categoría taxonómica" se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos. El término "filogenia" como aquí se usa se refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de taxones.The term "Gender", as used in this report, refers to the category of the classification biological (taxonomic category) comprising one or more species related phylogenetically and morphologically similar. Too They are expected to share, biochemical and metabolic characteristics Similar. "Taxonomic category" means the level of hierarchy used for the classification of organisms. He term "phylogeny" as used herein refers to the relationship True historical among a set of taxa.
En la presente memoria se entiende por individuo un organismo de cualquiera de las especies del género Scoph- thalmus, pez perteneciente a la familia Scophthalmidae, del orden Pleuronectiformes, de la clase Actinopterigios.An individual organism of any of the species of the genus Scoph-thamus , a fish belonging to the family Scophthalmidae , of the order Pleuronectiformes , of the Actinopterygium class is understood herein.
Una muestra biológica aislada incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.An isolated biological sample includes, but without limit ourselves to, cells, tissues and / or biological fluids of a organism, obtained by any method known to a expert in the field that serves this purpose.
En una realización preferida de la invención, la muestra biológica aislada procede de la aleta caudal del individuo, entendiéndose como aleta caudal la aleta única vertical en la parte posterior del pez, en la cola. Para la amplificación del marcador microsatélite M-SmaSD se pueden diseñar numerosos cebadores. Sin embargo, cuando se diseñan cebadores es necesario hacer una serie de predicciones, como la temperatura de fusión (Tm), la presencia de pares indeseables (a) o la posibilidad de formación de horquillas (b) que puedan reducir, por competencia, la efectividad de emparejamiento con la secuencia de ADN diana. Así pues, en otra realización preferida los cebadores para el marcador microsatélite M-SmaSD son los que se recogen en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.In a preferred embodiment of the invention, the isolated biological sample comes from the caudal fin of the individual, understood as caudal fin the single vertical fin in the part rear of the fish, in the tail. For marker amplification M-SmaSD microsatellite can be designed numerous primers However, when designing primers it is necessary make a series of predictions, such as melting temperature (Tm), the presence of undesirable peers (a) or the possibility of training of forks (b) that can reduce, by competition, the effectiveness of pairing with the target DNA sequence. So thus, in another preferred embodiment the primers for the marker M-SmaSD microsatellite are those that are collected in the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
La metodología empleada en la presente invención, se basa en el principio de "selección asistida por marcadores" que consiste en utilizar como criterio de selección una variable genética, en este caso marcadores moleculares, asociados a la característica de interés, en este caso el sexo. Se trata de identificar previamente en el genoma marcadores próximos a las regiones cromosómicas implicadas en la manifestación de caracteres de interés dentro de las familias. Estas regiones se llaman "QTL" o "Quantitative Trait Loci".The methodology used in the present invention is based on the principle of "marker-assisted selection" which consists in using a genetic variable, in this case molecular markers, associated with the characteristic of interest, in this case sex . It is about previously identifying in the genome markers close to the chromosomal regions involved in the manifestation of characters of interest within families. These regions are called "QTL" or " Quantitative Trait Loci ".
La contribución de estas regiones QTL que están involucradas en la expresión de un carácter se puede evaluar seleccionando genes candidatos (aquellos involucrados en la fisiología del carácter). La secuencia de ADN de la región QTL candidata permite identificar marcadores que se encuentran en ella, o cerca de ella. Estos marcadores son entonces utilizados para posicionar a la región QTL en el mapa de ligamiento, y para establecer su asociación con el carácter de interés. Como ejemplo, si un marcador se identifica en una región QTL determinante del sexo, las diferentes formas del marcador (conocidas como alelos) se utilizan para establecer qué alelo del marcador genético está asociado al fenotipo correspondiente con el sexo femenino, y qué alelo está asociado con el fenotipo correspondiente al sexo masculino. Esta estrategia permite establecer el efecto de una región QTL en la expresión de un carácter productivo.The contribution of these QTL regions that are involved in the expression of a character can be evaluated selecting candidate genes (those involved in the character physiology). The DNA sequence of the QTL region candidate allows to identify markers that are in it, or near her. These markers are then used to position the QTL region on the linkage map, and to Establish your association with the character of interest. As an example, if a marker is identified in a determining QTL region of the sex, the different forms of the marker (known as alleles) are use to establish which allele of the genetic marker is associated with the corresponding phenotype with the female sex, and what allele is associated with the phenotype corresponding to sex male. This strategy allows to establish the effect of a QTL region in the expression of a productive character.
Para asociar un fenotipo a un alelo concreto del marcador asociado a la región determinante del carácter estudiado, se hace un análisis del marcador dentro de las familias, de los descendientes y/o ascendientes, para ello se establece por medio de técnicas de biología molecular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el análisis de fragmentos, qué alelos ha heredado de los progenitores cada miembro de la familia.To associate a phenotype with a specific allele of marker associated with the region determining the character studied, an analysis of the marker within the families, of the descendants and / or ascendants, for it is established by means of molecular biology techniques, for example, but without limit ourselves, fragment analysis, what alleles have inherited from parents each family member.
Los inventores han identificado una región genética o QTL implicada en la determinación sexual, que se recoge en la SEQ ID NO: 3. En concreto, han localizado el gen SmaSD (del inglés "Scophthalmus maximus sex determinant"), principal responsable de la determinación del sexo en la especie. A una distancia de 1 centimorgan de este gen se ha detectado un marcador microsatélite, M-SmaSD, cuyo motivo de repetición es (TA)_{n}. Los autores de la presente invención han diseñado dos cebadores específicos de las secuencias adyacentes a este marcador (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) que permiten la amplificación por PCR de la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 3.The inventors have identified a genetic region or QTL involved in sexual determination, which is included in SEQ ID NO: 3. Specifically, they have located the SmaSD gene (from the English " Scophthalmus maximus sex determinant"), the main responsible for the determination of sex in the species. A microsatellite marker, M-SmaSD, whose repetition motive is (TA) n, has been detected at a distance of 1 centimorgan from this gene. The authors of the present invention have designed two specific primers of the sequences adjacent to this marker (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) that allow PCR amplification of the sequence collected in SEQ ID NO: 3.
Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos de tipo microsatélite que se incluye en la secuencia SEQ ID NO: 3, capaz de ser amplificada por los cebadores cuyas secuencias se recogen en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en el genoma de las especies del género Scophthalmus.Therefore, a second aspect of the invention relates to a microsatellite type nucleotide sequence that is included in the sequence SEQ ID NO: 3, capable of being amplified by primers whose sequences are collected in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, in the genome of the species of the genus Scophthalmus .
En esta memoria se entiende por "secuencia microsatélite" una región del genoma formada por repeticiones nucleotídicas de 1-6 pares de bases, que difiere de un genoma a otro en función del número de repeticiones, es decir, cuya longitud varía entre genomas, y que puede ser empleada como marcador, por permitir la discriminación entre individuos. El análisis de estos marcadores puede aplicarse, por ejemplo, a estudios de herencia familiar o al mapeo del genoma. En base a esto, dicha secuencia es utilizada en la invención para llevar a cabo el método descrito.In this report it is understood as "sequence microsatellite "a region of the genome formed by repetitions 1-6 base pair nucleotides, which differs from one genome to another depending on the number of repetitions, that is, whose length varies between genomes, and that can be used as marker, for allowing discrimination between individuals. He analysis of these markers can be applied, for example, to studies of family inheritance or genome mapping. Based on this, said sequence is used in the invention to carry out the described method
En esta memoria se entiende por "Quantitative Trait Loci" ó "QTL" aquella región del ADN cuya información genética es capaz de influenciar en la expresión de un carácter, en el individuo o en su descendencia. Por ello, como se ha explicado anteriormente, el análisis en individuos emparentados de un marcador microsatélite asociado a una región QTL, permite hacer un seguimiento familiar del carácter o caracteres influenciados por esta región y así asociar un determinado fenotipo a un alelo del marcador, de manera que dicho marcador puede ser usado en los planes de selección.In this report, " Quantitative Trait Loci " or "QTL" means that region of DNA whose genetic information is capable of influencing the expression of a character, the individual or its offspring. Therefore, as explained above, the analysis in related individuals of a microsatellite marker associated with a QTL region, allows a family monitoring of the character or characters influenced by this region and thus associates a certain phenotype with an allele of the marker, of such a marker can be used in the selection plans.
El método proporcionado por la presente invención permite analizar el marcador M-SmaSD, independientemente de la procedencia de las muestras. Dichas muestras pueden proceder, por ejemplo, pero sin limitarnos, de cualquier región de tejido epitelial que no afecte a la viabilidad del pez. La muestra una vez tomada es pretratada para poder llevar a cabo una PCR y un posterior análisis de los fragmentos obtenidos mediante el genotipado de los mismos.The method provided herein invention allows to analyze the M-SmaSD marker, regardless of the origin of the samples. These samples may come, for example, but not limited to, from any region of epithelial tissue that does not affect viability of the fish The sample once taken is pretreated to carry carry out a PCR and a subsequent analysis of the fragments obtained by genotyping them.
En base a este marcador, los machos y las hembras presentan un genotipo distinto, y es precisamente esto lo que permite la discriminación entre sexos. Este genotipo además no es igual para todos los rodaballos, por lo que es necesario genotipar a cada individuo mediante el análisis del marcador M-SmaSD así como a otros parientes (los abuelos, los hermanos de la madre o a otros descendientes o ascendientes de la misma progenie analizada), sexados con anterioridad, para identificar qué alelo de este marcador está asociado al sexo masculino o femenino en su progenie. El análisis de este marcador ha permitido también evidenciar que la determinación del sexo en las progenies depende únicamente de la madre, de manera que dependiendo de qué alelo materno porten los descendientes pueden ser identificados como machos o hembras.Based on this marker, males and females females have a different genotype, and this is precisely what which allows discrimination between sexes. This genotype also does not It is the same for all turbot, so it is necessary genotyping each individual by analyzing the marker M-SmaSD as well as other relatives (grandparents, the brothers of the mother or other descendants or ascendants of the same progeny analyzed), sexed previously, to identify which allele of this marker is associated with sex male or female in their progeny. The analysis of this marker has also allowed to show that the determination of sex in progenies depends solely on the mother, so depending what maternal allele the descendants carry may be identified as male or female.
Para llevar a cabo este estudio, los fragmentos obtenidos en la PCR se analizan, por ejemplo pero sin limitarse, en un secuenciador automático, que permite identificar las variantes alélicas del marcador en función de su tamaño en pares de bases. El locus microsatélite de M-SmaSD, es codominante, por lo que se puede determinar el tamaño de los dos alelos.To carry out this study, the fragments obtained in the PCR are analyzed, for example but not limited, in an automatic sequencer, which allows to identify the variants allele of the marker depending on its size in base pairs. He M-SmaSD microsatellite locus, is codominant, by what can be determined the size of the two alleles.
Por tanto, el marcador M-SmaSD es de gran valor a la hora de predecir el sexo de las progenies conociendo información adicional del genotipo de otros parientes, según la metodología de "selección asistida por marcadores".Therefore, the M-SmaSD marker It is of great value when predicting the sex of the progeny knowing additional information on the genotype of other relatives, according to the methodology of "selection assisted by markers".
La visualización de los microsatélites puede realizarse por medios bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, pero sin limitarse, mediante electroforesis en geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata, o empleando radioisótopos. Actualmente suele realizarse con secuenciadores automáticos, empleando cebadores pre-marcados con fluorescencia. Así, en otra realización preferida de la invención, uno de los cebadores empleados en la reacción de PCR está unido a un fluorocromo, que permitirá detectar los fragmentos de la PCR en el secuenciador y visualizar el tamaño de los mismos en un software de imagen.The display of microsatellites can be carried out by means well known in the state of the art. By example, but not limited, by electrophoresis in gels of acrylamide, staining with silver nitrate, or using radioisotopes. Currently it is usually done with automatic sequencers, using fluorescent pre-labeled primers. Thus, in another preferred embodiment of the invention, one of the primers used in the PCR reaction is bound to a fluorochrome, which will detect the fragments of the PCR in the sequencer and display the size of them in a software image.
En la presente memoria se define fluorocromo como el grupo funcional de una molécula fluorescente que absorbe energía de una longitud de onda específica y la vuelve a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, por ejemplo, pero sin limitarnos, el isotiocianato de fluoresceína o la rodamina.Fluorochrome is defined herein as the functional group of a fluorescent molecule that absorbs energy of a specific wavelength and emit it again in another one with a longer wavelength, for example, but without limit ourselves, fluorescein isothiocyanate or rhodamine.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de diagnóstico adecuado para llevar a cabo el método de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit de diagnóstico comprende los cebadores de la invención, específicos para la amplificación de la secuencia recogida en SEQ ID NO: 3, u otras secuencias homologas a la SEQ ID NO: 3, que incluyan el marcador M-SmaSD.Another aspect of the invention relates to a kit of appropriate diagnosis to carry out the method of invention. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the diagnostic kit comprises the primers of the invention, specific for sequence amplification collected in SEQ ID NO: 3, or other sequences homologous to SEQ ID NO: 3, which include the M-SmaSD marker.
En la presente descripción, el termino "específicos" implica que los cebadores comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complementaria a las secuencias adyacentes al marcador M-SmaSD empleado por el método de la presente invención.In the present description, the term "specific" implies that the primers comprise a nucleotide sequence completely complementary to the sequences adjacent to the M-SmaSD marker used by the method of the present invention.
Dicho kit puede comprender cebadores, sondas y todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el kit contendrá todos los elementos necesarios para la identificación del sexo en el rodaballo, o en otras especies del género Scophthalmus, por la técnica que se ha descrito anteriormente.Said kit may comprise primers, probes and all those reagents necessary to carry out the method of the invention. The kit can also include, without any limitation, the use of buffers, polymerases, cofactors to obtain optimum activity from these, agents to prevent contamination, etc. On the other hand, the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization. Preferably, the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention. By way of illustration and without limiting the scope of the invention, the kit will contain all the elements necessary for the identification of sex in the turbot, or in other species of the genus Scophthalmus , by the technique described above.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
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Fig. 1. Análisis de fragmentos del locus microsatélite M-SmaSD en 4 hembras de la especie Scophthalmus maximus . Los individuos hembras son heterocigóticos (dos picos) muestran dos alelos.Fig. 1. Analysis of fragments of the M-SmaSD microsatellite locus in 4 females of the species Scophthalmus maximus . Female individuals are heterozygous (two peaks) show two alleles.
Fig. 2. Análisis de fragmentos del locus microsatélite M-SmaSD en 4 machos de la especie Scophthalmus maximus . Los individuos machos son homocigóticos, presentan un único tipo alélico (un sólo pico).Fig. 2. Analysis of fragments of the M-SmaSD microsatellite locus in 4 males of the species Scophthalmus maximus . Male individuals are homozygous, have a single allelic type (a single peak).
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A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método de obtención de datos para la identificación del sexo en especies del género Scophthalmus mediante el análisis del marcador microsatélite M-SmaSD.The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which show the specificity and effectiveness of the method of obtaining data for the identification of sex in species of the genus Scophthalmus by analyzing the microsatellite marker M-SmaSD.
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\global\parskip0.950000\baselineskip\ global \ parskip0.950000 \ baselineskip
Para la identificación de la región genómica asociada con el sexo, se utilizó el mapa genético del rodaballo (Bouza et al., 2007, Genetics 177: 2457-246) con 248 marcadores microsatélite anónimos. De ellos, se seleccionaron 99 marcadores distribuidos homogéneamente a lo largo de todo el genoma a distancias mayoritariamente alrededor de 10 cM.For the identification of the genomic region associated with sex, the genetic map of turbot (Bouza et al ., 2007, Genetics 177: 2457-246) was used with 248 anonymous microsatellite markers. Of these, 99 homogeneously distributed markers were selected throughout the entire genome at distances mostly around 10 cM.
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Estos marcadores previamente seleccionados fueron genotipados en abuelos, padres y descendientes de tres familias sexadas con anterioridad. Las tres familias estaban constituidas por 96 (F-1), 50 (F-2) y 50 (F-3) individuos sexados respectivamente, con proporciones equilibradas de machos y hembras.These previously selected markers were genotyped in grandparents, parents and descendants of three previously sexed families. The three families were constituted by 96 (F-1), 50 (F-2) and 50 (F-3) sexed individuals respectively, with balanced proportions of males and females.
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La búsqueda de asociaciones significativas entre el sexo de los descendientes y los marcadores genotipados a lo largo de todo el genoma se realizó usando el programa QTL Express. La significación de la asociación se realizó mediante un análisis de la varianza. En la familia más amplia (F-1) se identificó un marcador con una asociación muy elevada (F=7815,63; g.l.=3229; P=0). Además, se detectaron otras 4 asociaciones de mucho menor efecto, algunas de ellas significativas después de la corrección para múltiples test. En las otras dos familias de 50 individuos (F-2 y F-3), se detectó únicamente la fuerte asociación previamente observada en la familia F-1.The search for significant associations between the sex of the descendants and the genotyped markers throughout The entire genome was performed using the QTL Express program. The Significance of the association was performed using an analysis of the variance In the wider family (F-1) you identified a marker with a very high association (F = 7815.63; g.l. = 3229; P = 0). In addition, another 4 associations of much were detected minor effect, some of them significant after the correction for multiple tests. In the other two families of 50 individuals (F-2 and F-3), was detected only the strong association previously observed in the family F-1
La utilización del marcador SmaSD, que presentaba el valor de asociación más elevado, permitió sexar correctamente el 97% de los individuos de la familia F-1 y el 100% de los individuos de las familias F-2 y F-3. Globalmente, esto representa un 98.5% de individuos correctamente sexados. El análisis de segregación en las familias indicó igualmente que el sexo de la progenie venía determinado únicamente por la madre. De manera que dependiendo del alelo del marcador que la madre trasmitía a sus descendientes, estos eran machos o hembras.The use of the SmaSD marker, which had the highest association value, allowed sexing correctly 97% of the individuals in the family F-1 and 100% of individuals in families F-2 and F-3. Globally this It represents 98.5% of correctly sexed individuals. The analysis of segregation in families also indicated that the sex of the progeny was determined solely by the mother. So that depending on the marker allele that the mother transmitted to her descendants, these were male or female.
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Para la extracción de ADN se tomó una muestra epitelial de la aleta caudal del rodaballo, Scophthalmus maximus. Una vez tomada la muestra, se almacenó a 4ºC en un tubo de 1,5 mL con alcohol de 96º hasta su análisis. Para la extracción del ADN genómico se aplicó el método de Chelex-100. El protocolo se describe en detalle a continuación:For the extraction of DNA, an epithelial sample was taken from the caudal fin of the turbot, Scophthalmus maximus . Once the sample was taken, it was stored at 4 ° C in a 1.5 mL tube with 96 ° alcohol until analysis. For the extraction of genomic DNA, the Chelex-100 method was applied. The protocol is described in detail below:
- 1.one.
- Precalentar a 60ºC la solución Chelex al 10%.Preheat the Chelex solution to 60 ° C at 10%
- 2.2.
- Cortar un pequeño trozo de tejido muestral conservado en etanol absoluto a 4ºC.Cut a small piece of tissue sample conserved in absolute ethanol at 4 ° C.
- 3.3.
- Disponer el fragmento muestral (aleta) en un tubo estéril de 2 mL (con tapa enroscada) y añadir 500 \muL de Chelex al 10%.Arrange the sample fragment (fin) in a sterile 2 mL tube (with screwed cap) and add 500 µL 10% Chelex.
- 4.Four.
- Agitar utilizando un vortex.Shake using a vortex.
- 5.5.
- Añadir 15 \muL de Proteinasa K (20 mg/mL).Add 15 µL Proteinase K (20 mg / mL)
- 6.6.
- Incubación a 56ºC durante 1 hora en el horno de hibridación con frecuentes agitaciones, cada 10 minutos.Incubation at 56 ° C for 1 hour in the hybridization oven with frequent agitations, every 10 minutes
- 7.7.
- Incubar 15 minutos a 100ºC.Incubate 15 minutes at 100 ° C.
- 8.8.
- Conservar a 4ºC.Store at 4 ° C.
- 9.9.
- Antes de cada uso:Before of each use:
- i)i)
- Agitar con vortex durante 10 segundos.Shake with vortex for 10 seconds.
- ii)ii)
- Centrifugar 10 minutos a 10.000 r.p.m. Centrifuge 10 minutes at 10,000 r.p.m.
- iii)iii)
- Cargar 1 \muL para cada reacción de PCR.Load 1 µL for each reaction of PCR
\global\parskip1.000000\baselineskip\ global \ parskip1.000000 \ baselineskip
Para el análisis del marcador M-SmaSD, es necesaria su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN genómico. A continuación se detalla la mezcla de reacción:For marker analysis M-SmaSD, its amplification is necessary by Polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA. The reaction mixture is detailed below:
- --
- H_{2}O-miliQ, 35,5 \muL.H 2 O-miliQ, 35.5 \ muL.
- --
- Tampón, 5 \muL buffer 10x.Buffer, 5 µL buffer 10x.
- --
- dNTPs, 2 \muL (stock 10 mn) - 0,4 mn final.dNTPs, 2 µL (stock 10 mn) - 0.4 mn final.
- --
- Cebador forward (SEQ. ID NO: 1), 2 \muL (200 ng).Forward primer (SEQ. ID NO: 1), 2 µL (200 ng).
- --
- Cebador reverse (SEQ. ID NO: 2), 2 \muL (200 ng).Reverse primer (SEQ. ID NO: 2), 2 µL (200 ng).
- --
- MgCl_{2}, 1,5 \muL (stock 50 mn).MgCl2, 1.5 µL (stock 50 mn).
- --
- Taq polimerasa, 1 \muL (0,5 un).Taq polymerase, 1 µL (0.5 un).
- --
- ADN genómico, 1 \muL (50 ng).DNA genomic, 1 µL (50 ng).
- --
- Volumen total: 50 \muL.Total volume: 50 µL.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
Las secuencias de los dos cebadores específicos desarrollados en la presente invención para la amplificación de M-SmaSD, son las recogidas en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y la secuencia amplificada es la recogida en la SEQ ID NO: 3.The sequences of the two specific primers developed in the present invention for the amplification of M-SmaSD, are those included in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the amplified sequence is collected in SEQ ID NO: 3.
A uno de los dos cebadores se le añade un fluorocromo.One of the two primers is added a fluorochrome
Las condiciones de la reacción de amplificación son las siguientes: desnaturalización inicial a 95ºC 10 minutos; 35 ciclos de desnaturalización (94ºC 45 segundos), anillamiento (58ºC 50 segundos), y elongación (72ºC 50 segundos); finalmente un paso de extensión a 72ºC durante 10 minutos.The amplification reaction conditions they are as follows: initial denaturation at 95 ° C 10 minutes; 35 denaturation cycles (94ºC 45 seconds), banding (58ºC 50 seconds), and elongation (72 ° C 50 seconds); finally a step of extension at 72 ° C for 10 minutes.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
A continuación se realiza el genotipado del individuo mediante el análisis de 50 ng de la solución de amplificación. Los fragmentos de la reacción de amplificación se analizan en un secuenciador automático. Este análisis permite identificar las variantes alélicas del marcador en función de su tamaño en pares de bases.Next, genotyping of the individual by analyzing 50 ng of the solution of amplification. The amplification reaction fragments are analyzed in an automatic sequencer. This analysis allows identify allelic variants of the marker based on their size in base pairs.
El fluorocromo añadido en el paso anterior a uno de los cebadores empleados en la reacción de PCR, permite la detección de los fragmentos con el láser del secuenciador y la visualización en el software de imagen.The fluorochrome added in the previous step to one of the primers used in the PCR reaction, allows the fragment detection with the sequencer laser and the visualization in the image software.
Siguiendo el principio de la selección asistida por marcadores, es necesario genotipar adicionalmente a: i) los abuelos, ii) los hermanos de la madre, iii) otros descendientes de la misma progenie analizada, sexados con anterioridad. Cualquiera de las tres opciones es válida.Following the principle of assisted selection by markers, it is necessary to genotype additionally to: i) grandparents, ii) mother's brothers, iii) other descendants of the same progeny analyzed, sexed previously. Any of All three options is valid.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
Una vez genotipado el individuo a analizar y cualquiera de sus familiares descritos en el apartado anterior, previamente sexado, se puede asociar un genotipo al sexo femenino o masculino en la progenie analizada.Once genotyped the individual to analyze and any of your relatives described in the previous section, previously sexed, a genotype can be associated with the female sex or male in the progeny analyzed.
En el ejemplo de la presente invención, dicho análisis permitió asociar la heterocigosis con las hembras, como se muestra en la Figura 1, y la homocigosis con los machos, como se muestra en la Figura 2.In the example of the present invention, said analysis allowed to associate heterozygosis with females, as shown in Figure 1, and homozygosis with males, as shown in Figure 2.
\global\parskip0.000000\baselineskip\ global \ parskip0.000000 \ baselineskip
<110> Universidade de Santiago de Compostela<110> University of Santiago de Compostela
\hskip1cmUniversidad Politécnica de Madrid
\ hskip1cmPolytechnic University of Madrid
\hskip1cmInstituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)
\ hskip1cmNational Institute of Agricultural and Food Research and Technology (INIA)
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<120> Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus <120> Method of early identification of sex in species of the genus Scophthalmus
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<130> 1596.19<130> 1596.19
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<160> 3<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 1<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 20<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Scophthalmus maximus <213> Scophthalmus maximus
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 1<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgaaagat cggaggcata
\hfill20
\ hskip-.1em \ dddseqskipgctgaaagat cggaggcata
\ hfilltwenty
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 2<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 20<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
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<213> Scophthalmus maximus <213> Scophthalmus maximus
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
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<400> 2<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagtggt tgcatattga
\hfill20
\ hskip-.1em \ dddseqskipcccaagtggt tgcatattga
\ hfilltwenty
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 3<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 462<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Scophthalmus maximus <213> Scophthalmus maximus
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 3<400> 3
Claims (11)
- a.to.
- la extracción de DNA de una muestra biológica aislada de un individuo,the DNA extraction from a biological sample isolated from a individual,
- b.b.
- poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD que se encuentra incluido en la SEQ ID NO: 3,put on contact the sample to be analyzed with a reaction mixture, which contains primers capable of amplifying the microsatellite marker M-SmaSD that is included in SEQ ID NO: 3,
- c.C.
- amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa el marcador microsatélite M-SmaSD,amplify by reaction in polymerase chain the microsatellite marker M-SmaSD,
- d.d.
- realizar el genotipado del individuo.perform genotyping of individual.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
- e.and.
- asociar un determinado genotipo del paso (d) al sexo masculino y otro al sexo femenino.associate a certain genotype of step (d) to the male sex and another to the female sex.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2354343 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20111021 |
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| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180924 |