ES2352987T3 - Cartografía física de alto rendimiento utilizando aflp. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la generación de un mapa físico de por lo menos una parte de un genoma que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra ADN; (b) generar un banco de clones de un cromosoma artificial (BAC, YAC) en el que cada clon de un cromosoma artificial; (c) combinar los clones de cromosomas artificiales en uno o más agrupaciones, en los que cada clon se encuentra presente en más de una agrupación, para crear una genoteca; (d) digerir el ADN de una o más agrupaciones con una o más endonucleasas de restricción para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción para cada agrupación; (e) ligar los adaptadores a uno o ambos lados de los fragmentos de restricción, en los que por lo menos un adaptador contiene un identificador específico de la agrupación o una sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador; (f) opcionalmente, combinar los fragmentos de restricción ligados al adaptador; (g) opcionalmente, amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador de etapa (e) con por lo menos un cebador, comprendiendo dicho cebador una sección específica de la agrupación que corresponde a la sección del identificador específica de la agrupación en el adaptador o comprendiendo un identificador específico de la agrupación en la posición de la sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados etiquetados (amplicones); (h) opcionalmente, combinar los amplicones en un conjunto de amplicones combinados; (i) determinar la secuencia de por lo menos el identificador específico de la agrupación y una parte del fragmento de restricción de los fragmentos de restricción ligados al adaptador, de los amplicones o conjunto de amplicones combinados; (j) asignar las secuencias de fragmentos de restricción determinadas en los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones de la etapa (i) a los clones correspondientes utilizando los identificadores específicos de la agrupación; (k) construir un cóntigo basado en el emparejamiento de la secuencia de las secciones obtenidas del fragmento de restricción; (l) ordenar los fragmentos de restricción de la etapa (k) para construir de este modo cóntigo del clon y generar un mapa físico.
Description
Cartografía física de alto rendimiento
utilizando AFLP.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y al de la biotecnología. En particular, la
presente invención se refiere al campo de la detección e
identificación de ácidos nucleicos. Más particularmente, la
presente invención se refiere a la generación de un mapa físico de
un genoma, o una parte del mismo, utilizando tecnología de
secuenciación de alto rendimiento.
Los mapas genómicos genéticos y físicos
integrados resultan muy valiosos para el aislamiento de genes
basándose en la cartografía, análisis comparativos de genomas y
como fuentes de clones con la secuencia preparada para proyectos de
secuenciación de genomas. El efecto de la disponibilidad de un mapa
integrado de marcadores físicos y genéticos de una especie para la
investigación del genoma es enorme. Los mapas integrados permiten la
realización de una cartografía genética precisa y rápida y una
cartografía precisa de locus de microsatélites y marcadores SNP. Se
han desarrollado diversos procedimientos para integrar mapas físicos
de genomas de complejidad diversa. Uno de los métodos mejor
caracterizados utiliza enzimas de restricción para generar un número
elevado de fragmentos de ADN a partir de subclones genómicos
(Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1989), 86,
8902-8906; Gregory et al., Genome Res.
(1997), 7, 1162-1168; Marra et al., Genome
Res. (1997), 7, 1072-1084). Se comparan dichas
huellas genéticas para identificar clones relacionados y para
integrar clones superpuestos en cóntigos. La utilidad de la
obtención de la huella genética para ordenar clones insertos
grandes de un genoma complejo es limitada, sin embargo, gracias a la
variación de la migración del ADN de gel a gel, la presencia de ADN
repetitivos, la distribución anómala de sitios de restricción y la
representación sesgada de los clones. La mayoría de mapas físicos
de calidad elevada de genomas complejos se han realizado, por lo
tanto, utilizando una combinación de obtención de la huella genética
y procedimientos basados en la PCR o en la hibridación. Sin
embargo, una de las desventajas de las que adolece la utilización de
la tecnología de la obtención de la huella genética es que se basa
en la compatibilidad fragmento - molde, lo que constituye un
procedimiento indirecto.
Se prefiere crear mapas físicos generando los
cóntigos basándose en los datos de la secuencia real, es decir, un
procedimiento más directo. Un mapa físico basado en la secuencia no
es únicamente más preciso, sino que al mismo tiempo contribuye
asimismo a la determinación de la secuencia genómica entera de la
especie de interés. Recientemente se dispone de procedimientos de
secuenciación de alto rendimiento que permiten la determinación de
secuencias completas de nucleótidos de clones de un modo más
eficiente y rentable.
Sin embargo, la detección por secuenciación del
fragmento de restricción completo resulta todavía relativamente
poco rentable. Además, el estado actual de la tecnología de
secuenciación tal como se da a conocer en las publicaciones (de 454
Life Sciences, www.454.com, Solexa, www.solexa.com, y Helicos,
www.helicosbio.com), a pesar de su gran potencia en la
secuenciación, únicamente puede proporcionar la secuenciación de
fragmentos con una longitud limitada. Asimismo, los procedimientos
actuales no permiten el procesamiento simultáneo de diversas
muestras en una serie.
Constituye el objetivo de la presente invención
diseñar y describir una estrategia que permita la generación de
alto rendimiento de un mapa físico basado en una combinación de
digestión por restricción, agrupación, amplificación de alta
precisión y secuenciación de alto rendimiento. Utilizando dicho
procedimiento, se pueden generar, mapas físicos, incluso de genomas
complejos.
En la descripción y ejemplos siguientes, se
utiliza un cierto número de términos. A fin de proporcionar una
comprensión clara y consistente de la presente memoria y
reivindicaciones, comprendiendo el alcance a proporcionar a dichos
términos, se proporcionan las siguientes definiciones. Excepto si se
define de otro modo en la presente memoria, todos los términos
técnicos y científicos tienen el mismo significado que les atribuyen
habitualmente los expertos en la materia a la que pertenece la
presente invención.
Ácido nucleico: un ácido nucleico según la
presente invención puede comprender cualquier polímero u oligómero
de bases de pirimidina y purina, preferentemente citosina, timina y
uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (véase Albert L.
Lehninger, Principles of Biochemistry ("Principios de
Bioquímica"), en 793-800 (Worth Pub. 1982)). La
presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido,
ribonucleótido o componente peptídico de un ácido nucleico, y
cualquier variante química de los mismos, tales como las formas
metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de dichas bases y
similares. Los polímeros u oligómeros pueden presentar una
composición heterogénea u homogénea, y se pueden aislar a partir de
fuentes naturales o se pueden producir artificialmente o
sintéticamente. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o
una mezcla de los mismos, y pueden existir de un modo permanente o
transitorio en forma monocatenaria o bicatenaria, comprendiendo los
estados homodúplex, heterodúplex e híbrido.
AFLP: AFLP se refiere a un procedimiento de
amplificación selectiva de ácidos nucleicos que se basa en digerir
un ácido nucleico con una o más endonucleasas de restricción para
proporcionar fragmentos de restricción, ligar adaptadores a los
fragmentos de restricción y amplificar los fragmentos de restricción
ligados al adaptador con por lo menos un cebador que es (en parte)
complementario al adaptador, (en parte) complementario a los restos
de la endonucleasa de restricción, y que comprende además por lo
menos un nucleótido seleccionado aleatoriamente de entre A, C, T o
G (o U si este es el caso). El AFLP no requiere información previa
alguna de la secuencia y se puede realizar en cualquier ADN
inicial. En general, el AFLP comprende las etapas de:
- (a)
- digerir un ácido nucleico, en particular a ADN, con una o más endonucleasas de restricción específicas, para fragmentar el ADN en la serie correspondiente de fragmentos de restricción;
- (b)
- ligar los fragmentos de restricción obtenidos de este modo con un adaptador de un oligonucleótido sintético bicatenario, siendo un extremo del mismo compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción, para producir de este modo fragmentos de restricción del ADN inicial ligados al adaptador, preferentemente etiquetados;
- (c)
- poner en contacto los fragmentos de restricción ligados al adaptador, preferentemente etiquetados, en unas condiciones de hibridación con uno o más cebadores de oligonucleótidos que contienen nucleótidos selectivos en su extremo 3';
- (d)
- amplificar el fragmento de restricción ligado al adaptador, preferentemente etiquetado, hibridado con los cebadores mediante la PCR o una técnica similar de tal modo que provoque una elongación adicional de los cebadores hibridados a lo largo de los fragmentos de restricción del ADN inicial con los que se hibridan los cebadores; y
- (e)
- detectar, identificar o recuperar el fragmento amplificado o alargado de ADN obtenido de este modo.
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El AFLP proporciona de este modo un subconjunto
reproducible de fragmentos ligados al adaptador. El AFLP se
describe, entre otros, en los documentos EP 534858, US 6045994 y en
Vos et al. (Nucleic Acid Research, 1995, 23, 21,
4407-4414). Se hace referencia a dichas
publicaciones para los detalles adicionales relacionados con el
AFLP. El AFLP se utiliza habitualmente como técnica de reducción de
la complejidad y técnica de la obtención de la huella genética del
ADN. En el contexto de la utilización del AFLP como técnica de la
obtención de la huella genética, se ha desarrollado el concepto de
marcador del AFLP.
Base selectiva: localizada en el extremo 3' del
cebador que contiene una parte complementaria al adaptador y una
parte complementaria a los restos del sitio de restricción, la base
selectiva se selecciona aleatoriamente de entre A, C, T o G. Al
extender un cebador con una base selectiva, la amplificación
posterior producirá únicamente un subconjunto reproducible de
fragmentos de restricción ligados al adaptador, es decir, únicamente
los fragmentos que se puedan amplificar utilizando el cebador que
presenta la base selectiva. Se pueden añadir nucleótidos selectivos
al extremo 3' del cebador en un número comprendido entre 1 y 10.
Habitualmente de 1 a 4 resultan suficientes y se prefiere de este
modo. Ambos cebadores pueden comprender un número variable de bases
selectivas. Con cada base selectiva añadida, el número de fragmentos
de restricción ligados al adaptador amplificados (amplicones) del
subconjunto se reduce en un factor de aproximadamente 4.
Habitualmente, el número de bases selectivas utilizado en el AFLP
se indica mediante +N+M, en el que cebador presenta N nucleótidos
selectivos y los otros cebadores presentan M nucleótidos selectivos.
De este modo, un Eco/Mse AFLP +1/+2 es la abreviatura para la
digestión del ADN de iniciación con EcoRI y MseI, la ligación de
adaptadores apropiados y la amplificación con un cebador dirigido a
la posición restringida EcoRI que presenta base selectiva y el otro
cebador dirigido al sitio restringido MseI que presenta 2
nucleótidos selectivos. Un cebador utilizado en el AFLP que
presenta por lo menos un nucleótido selectivo en su extremo 3' se
indica asimismo como cebador AFLP. Los cebadores que no presentan
un nucleótido selectivo en su extremo 3' y que de hecho son
complementarios al adaptador y los restos del sitio de restricción
se indican a veces como cebadores AFLP+0.
Agrupamiento: con el término "agrupamiento"
se entiende la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos
basándose en la presencia de extensiones cortas o largas de
nucleótidos idénticos o similares y agrupar entre sí las secuencias
con un nivel mínimo determinado de homología en la secuencia
basándose en la presencia de extensiones cortas (o más largas) de
secuencias idénticas o similares.
Ensamblaje: construcción de un cóntigo basándose
en la ordenación de un grupo de secuencias que se superponen
(parcialmente), denominado asimismo "construcción de
cóntigos".
Alineación: posicionamiento de una pluralidad de
secuencias en una presentación tabular para maximizar la
posibilidad de obtener regiones con identidad de secuencia en
diversas secuencias de la alineación, por ejemplo introduciendo
huecos. Se conocen en la técnica diversos procedimientos para la
alineación de secuencias de nucleótidos, tal como se describirá
posteriormente.
Identificador: secuencia corta que se puede
añadir a un adaptador o un cebador o incluir en su secuencia o
utilizar de algún otro modo como etiqueta para proporcionar un
identificador único. Dicho identificador de la secuencia (etiqueta)
puede ser una secuencia de bases única con una longitud variable
pero definida utilizada únicamente para identificar una muestra
específica de ácido nucleico. Por ejemplo, las etiquetas de 4 pares
de bases permiten 4(elevado a la 4) = 256 etiquetas
distintas. Los ejemplos típicos son las secuencias ZIP, conocidas
en la técnica como etiquetas utilizadas habitualmente para una
detección única por hibridación (Iannone et al. Cytometry
39: 131-140, 2000). Al utilizar dicho identificador,
se puede determinar el origen de una muestra de PCR con un
procesamiento adicional. En el caso de la combinación de productos
procesados que proceden de distintas muestras de ácidos nucleicos,
las distintas muestras de ácidos nucleicos se identifican
generalmente utilizando distintos identificadores.
Secuenciación: el término secuenciación se
refiere a la determinación del orden de nucleótidos (secuencias de
bases) en una muestra de ácido nucleico, por ejemplo ADN o ARN.
Técnicas de alta capacidad de identificación:
las técnicas de alta capacidad de identificación, con frecuencia
abreviadas como HTS, consisten en un procedimiento de
experimentación científica especialmente adecuado para los campos
de la biología y la química. Mediante una combinación de robótica
actual y otro hardware especializado para laboratorios, permite al
investigador identificar simultáneamente con efectividad grandes
cantidades de muestras.
Endonucleasa de restricción: una endonucleasa de
restricción o enzima de restricción es un enzima que reconoce unas
secuencias específicas de nucleótidos (sitio seleccionado) en una
molécula de ADN bicatenario y separará ambas cadenas de la molécula
de ADN en cada sitio seleccionado.
Fragmentos de restricción: moléculas de ADN
producidas mediante la digestión con una endonucleasa de restricción
como fragmentos de restricción. Cualquier genoma determinado (o
ácido nucleico, con independencia de su origen) se digerirá
mediante una endonucleasa de restricción particular en un conjunto
descrito de fragmentos de restricción. Los fragmentos de ADN que se
obtienen a partir de la escisión mediante la endonucleasa de
restricción se pueden continuar utilizando en diversas técnicas y,
por ejemplo, se pueden detectar mediante electroforesis en gel.
Ligación: reacción enzimática catalizada por un
enzima ligasa en la que dos moléculas de ADN bicatenario se unen
entre sí con un enlace covalente como ligación. En general, ambas
cadenas de ADN se unen entre sí con un enlace covalente, pero es
asimismo posible evitar la ligación de una de las dos cadenas
mediante la modificación química o enzimática de uno de los
extremos de las cadenas. En dicho caso, el enlace covalente se
producirá en únicamente en una de las dos cadenas de ADN.
Oligonucleótido sintético: moléculas de ADN
monocatenario que presentan preferentemente entre aproximadamente
10 y aproximadamente 50 bases, que se pueden sintetizar químicamente
como oligonucleótidos sintéticos. En general, dichas moléculas
sintéticas de ADN se diseñan para que presenten una secuencia de
nucleótidos única o pretendida, aunque resulta posible sintetizar
familias de moléculas que presenten secuencias relacionadas y que
presenten unas composiciones distintas en los nucleótidos en unas
posiciones específicas de la secuencia de nucleótidos. El término
oligonucleótido sintético se utilizará para hacer referencia a
moléculas de ADN que presenten una secuencia de nucleótidos diseñada
o pretendida.
Adaptadores: moléculas cortas de ADN bicatenario
con un número limitado de pares de bases, por ejemplo entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 50 pares de bases en longitud,
que se diseñan de tal modo que se puedan ligar a los extremos de
fragmentos de restricción. Los adaptadores están compuestos
generalmente de dos oligonucleótidos sintéticos que presentan unas
secuencias de nucleótidos que son parcialmente complementarias entre
sí. Cuando se mezclan dos oligonucleótidos sintéticos en disolución
con unas condiciones apropiadas, se aparearán entre sí formando una
estructura bicatenaria. Tras el apareamiento, un extremo de la
molécula adaptadora se diseña de tal modo que sea compatible con el
extremo de un fragmento de restricción y se pueda ligar al mismo; el
otro extremo del adaptador se puede diseñar de tal modo que no se
pueda ligar, pero esta necesidad no constituye el caso (adaptadores
con doble ligación).
Fragmentos de restricción ligados al adaptador:
fragmentos de restricción que se han rematado con adaptadores como
resultado de la ligación.
Cebadores: en general, el término cebadores se
refiere a una cadena de ADN que puede iniciar la síntesis de ADN.
La ADN polimerasa no puede sintetizar ADN de novo sin
cebadores: únicamente puede extender una cadena existente de ADN en
una reacción en la que la cadena complementaria se utiliza como
molde para dirigir el orden de nucleótidos a ensamblar. Nos
referiremos a las moléculas de oligonucleótidos sintéticos que se
utilizan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como
cebadores.
Amplificación del ADN: el término amplificación
del ADN se utilizará habitualmente para indicar la síntesis in
vitro de moléculas de ADN bicatenario utilizando la PCR. Se ha
de indicar que existen otros procedimientos de amplificación y que
se pueden utilizar en la presente invención sin apartarse del
alcance de la misma.
Los presentes inventores han descubierto que
utilizando una combinación de digestión con enzimas de restricción
de clones en una genoteca, ligación con adaptadores, amplificación
(selectiva), secuenciación de alto rendimiento y deconvolución de
las secuencias resultantes se obtienen cóntigos que se pueden
utilizar para integrar mapas físicos, incluso de genomas grandes y
complejos.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un procedimiento la generación de un mapa físico de por lo menos
una parte de un genoma que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar una muestra ADN;
- (b)
- generar un banco de clones de un cromosoma artificial (BAC, YAC) en el que cada clon de un cromosoma artificial;
- (c)
- combinar los clones de cromosomas artificiales en uno o más agrupaciones, en los que cada clon se encuentra presente en más de una agrupación, para crear una genoteca;
- (d)
- digerir el ADN de una o más agrupaciones con una o más endonucleasas de restricción para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción para cada agrupación;
- (e)
- ligar los adaptadores a uno o ambos lados de los fragmentos de restricción, en los que por lo menos un adaptador contiene un identificador específico de la agrupación o una sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (f)
- opcionalmente, combinar los fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (g)
- opcionalmente, amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador de etapa (e) con por lo menos un cebador, comprendiendo dicho cebador una sección específica de la agrupación que corresponde a la sección del identificador específica de la agrupación en el adaptador o comprendiendo un identificador específico de la agrupación en la posición de la sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados etiquetados (amplicones);
- (h)
- opcionalmente, combinar los amplicones en un conjunto de amplicones combinados;
- (i)
- determinar la secuencia de por lo menos el identificador específico de la agrupación y una parte del fragmento de restricción de los fragmentos de restricción ligados al adaptador, de los amplicones o conjunto de amplicones combinados;
- (j)
- asignar las secuencias de fragmentos de restricción determinadas en los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones de la etapa (i) a los clones correspondientes utilizando los identificadores específicos de la agrupación;
- (k)
- construir un cóntigo basado en el emparejamiento de la secuencia de las secciones obtenidas del fragmento de restricción;
- (l)
- ordenar los fragmentos de restricción de la etapa (k) para construir de este modo cóntigo del clon y generar un mapa físico.
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En etapa (a) del procedimiento se proporciona
una muestra ADN. Ello se puede realizar mediante cualquier medio de
la técnica tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook et
al. (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual ["Clonación molecular: manual de
laboratorio"] (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press). El ADN de la muestra puede ser de
cualquier especie, en particular de origen humano, vegetal o
animal. Resulta posible utilizar únicamente una parte de un genoma,
pero ello no es necesario ya que la presente invención proporciona
asimismo procedimientos para adaptarse a genomas de cualquier
tamaño, por ejemplo mediante la creación de subconjuntos
reproducibles por amplificación selectiva basándose en el AFLP, tal
como se describe en otras partes de la presente memoria. De este
modo, habitualmente, el presente procedimiento utiliza el genoma
entero.
En etapa (b) se genera un banco de clones
artificiales. La genoteca puede ser una genoteca de cromosomas
artificiales bacterianos (BAC) o basados en levaduras (YAC).
Resultan asimismo posibles otras genotecas de este tipo que se
basan en cósmidos, PAC, TAC o MAC. Se prefiere la genoteca BAC. La
genoteca es preferentemente de una calidad elevada y
preferentemente es una genoteca genómica con un tamaño de inserción
elevado. Ello significa que la BAC individual contiene un inserto
grande del ADN genómico que se está investigando (habitualmente >
125 kpb). El tamaño del inserto grande preferido depende de la
especie. A lo largo de la presente solicitud se hace referencia a
los BAC como ejemplos de cromosomas artificiales. Sin embargo, se ha
de indicar que la presente invención no se limita a los mismos y
que se pueden utilizar otros cromosomas artificiales can be sin
apartarse del alcance de la presente invención. Preferentemente, las
genotecas comprenden por lo menos cinco equivalentes genómicos, más
preferentemente por lo menos 7, aún más preferentemente por lo menos
8. Se prefiere en particular por lo menos 10. Cuanto mayor sea el
número de equivalentes genómicos de la genoteca, más fiables serán
los cóntigos resultantes y el mapa físico.
Los clones individuales de la genoteca se
agrupan para formar agrupaciones que contengan una pluralidad de
cromosomas artificiales o clones. La agrupación puede ser la simple
combinación de un cierto número de clones individuales en una
muestra (por ejemplo, 100 clones en 10 agrupaciones, comprendiendo
cada uno 10 clones), pero se pueden utilizar estrategias de
agrupación más elaboradas. La distribución de los clones en las
agrupaciones es preferentemente de tal modo que cada clon se
encuentra presente en por lo menos dos o más de las agrupaciones.
Preferentemente, las agrupaciones comprenden entre 10 y 10000 clones
por agrupación, preferentemente entre 100 y 1000, más
preferentemente entre 250 y 750. Se observa que el número de clones
por agrupación puede variar ampliamente, y dicha variación se
refiere, por ejemplo, al tamaño del genoma que se está investigando.
Habitualmente, el tamaño máximo de una agrupación o subagrupación
viene determinado por la capacidad para identificar específicamente
un clon en una agrupación mediante un conjunto de identificadores.
Tal como se describirá adicionalmente a continuación en la presente
memoria, un intervalo habitual para un equivalente genómico de una
agrupación es aproximadamente de 0,2 a 0,3 y ello puede variar de
nuevo por genoma. Las agrupaciones se generan basándose en
estrategias muy conocidas en la técnica. Los expertos en la materia
pueden seleccionar la estrategia de agrupación óptima basándose en
factores tales como el tamaño del genoma etc. La estrategia de
agrupación resultante dependerá de las circunstancias y constituyen
ejemplos de las mismas la agrupación en placa, las agrupaciones
N-dimensionales tales como la agrupación 2D, la
agrupación 3D, la agrupación 6D o la agrupación compleja. Para
facilitar la manipulación de grandes números de agrupaciones, las
agrupaciones se pueden, a su vez, combinar en superagrupaciones (es
decir, las superagrupaciones son agrupaciones de agrupaciones de
clones) o dividirse en subagrupaciones, tal como se representa a
título de ejemplo en la figura adjunta 1 en al que se ilustra una
agrupación 3D. Otros ejemplos de estrategias de agrupación y su
deconvolución (es decir, la identificación correcta del individual
clon en una genoteca mediante la detección de la presencia de un
indicador asociado conocido (es decir, etiqueta o identificador)
del clon en uno o más agrupaciones o subagrupaciones) se describen,
por ejemplo, en el documento US n.º 6975943 o en Klein et al.
en Genome Research, (2000), 10, 798-807. La
estrategia de agrupación es preferentemente tal que cada clon en la
genoteca se distribuye de tal modo en los grupos que se realiza una
única combinación de grupos para cada clon. El resultado de ello es
que una determinada combinación de (sub)agrupaciones
identifica específicamente un clon.
Las agrupaciones se digieren con endonucleasas
de restricción para proporcionar fragmentos de restricción. Cada
agrupación se somete preferentemente por separado a digestión con
endonucleasas. Cada agrupación se trata con la misma (combinación
de) endonucleasa(s). En principio, se puede utilizar
cualquier endonucleasa de restricción. Las endonucleasas de
restricción pueden ser cortadoras frecuentes (4 ó 5 cortadoras,
tales como MseI o PstI) o cortadoras inusuales (6 y más cortadoras
tales como EcoRI, HindIII). Habitualmente, se seleccionan las
endonucleasas de restricción de tal modo que los fragmentos de
restricción que se obtienen se encuentran presentes, en promedio,
en una cierta cantidad o presentan una cierta distribución de
longitud adecuada para las etapas posteriores. En determinadas
formas de realización, se pueden utilizar dos o más endonucleasas de
restricción y en determinadas formas de realización, se pueden
utilizar combinaciones de cortadoras inusuales y frecuentes. En el
caso de genomas grandes, puede resultar ventajosa la utilización de,
por ejemplo, tres o más endonucleasas de restricción.
En uno o ambos extremos de los fragmentos de
restricción, los adaptadores se ligan en la etapa (e) para
proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador.
Habitualmente, los adaptadores son oligonucleótidos sintéticos tal
como se definen en otras partes de la presente memoria. Los
adaptadores utilizados en la presente invención comprenden
preferentemente una sección del identificador, en esencia tal como
se define en otras partes de la presente memoria. En determinadas
formas de realización, el adaptador comprende un identificador
específico de la agrupación, es decir, para cada agrupación, se
utiliza un adaptador que comprende un identificador único que
indica inequívocamente la agrupación. En determinadas formas de
realización, el adaptador contiene una sección redundante del
identificador que se utiliza en combinación con un cebador que
contiene un identificador específico de la agrupación.
En determinadas formas de realización, los
fragmentos de restricción ligados al adaptador se pueden combinar
en grupos más grandes, en particular cuando los adaptadores
contienen un identificador específico de la agrupación. Dicha
combinación en grupos más grandes puede ayudar a reducir el número
de amplificaciones paralelas de cada conjunto de fragmentos de
restricción ligados al adaptador obtenidos a partir de una
agrupación.
Los fragmentos de restricción ligados al
adaptador se pueden amplificar utilizando un conjunto de cebadores
de los que por lo menos un cebador contiene un identificador
específico de la agrupación en la posición del identificador
específico de la agrupación o redundante en el adaptador. Dicha
forma de realización permite asimismo la agrupación de fragmentos
de restricción ligados al adaptador antes de la amplificación tal
como se ha indicado anteriormente. En una forma de realización
alternativa, cada agrupación de fragmentos de restricción ligados
al adaptador, en los que el adaptador comprende una sección
redundante del identificador, se amplifica por separado utilizando
un conjunto de cebadores de los que por lo menos un cebador contiene
una sección específica de la agrupación, con lo que se identifica
específicamente la agrupación.
De cualquier modo, el resultado es un conjunto
de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador,
indicados asimismo como amplicones, que se enlazan con la agrupación
a partir del que se originan mediante la presencia en el amplicón
del identificador específico de la agrupación. En determinadas
formas de realización, se pueden crear subconjuntos de amplicones
mediante amplificación selectiva utilizando cebadores que presentan
nucleótidos selectivos en su extremo 3', sustancialmente tal como se
describe en otras partes de la presente memoria.
Los amplicones se pueden combinar en
determinadas formas de realización, en un conjunto de amplicones
combinados o una denominada genoteca de secuencias.
En etapa (i) del procedimiento, los amplicones
se someten a secuenciación, preferentemente una secuenciación de
alto rendimiento tal como se describirá posteriormente en la
presente memoria. Durante la secuenciación, se determina por lo
menos una parte de la secuencia de nucleótidos de los amplicones.
Preferentemente, se determina por lo menos la secuencia del
identificador específico de la agrupación y una parte del fragmento
de restricción de los amplicones. Preferentemente, se determina una
secuencia de por lo menos 10 nucleótidos del fragmento de
restricción. En determinadas formas de realización, se determinan
por lo menos 11, 12, 13, 14 ó 15 nucleótidos del fragmento de
restricción. El número de nucleótidos a determinar como mínimo
dependerá, de nuevo, del genoma. Por ejemplo, en los vegetales se
encuentran secuencias más repetitivas, por lo tanto, se han de
determinar secuencias más largas (25-30 pares de
bases). Por ejemplo, los cálculos en el genoma conocido de
Arabidopsis han demostrado que, cuando se comprende un sitio
de restricción de 6 pares de bases en la etapa de secuenciación,
resulta necesario determinar aproximadamente 20 pares de bases por
fragmento de restricción. Resulta posible determinar la secuencia
del fragmento de restricción completo, pero ello no resulta en
absoluto necesario para la construcción de cóntigos de un clon
BAC.
En la etapa de secuenciación, para proporcionar
una mayor precisión, la genoteca de secuencias se puede secuenciar
con una cobertura de por lo menos 5. Ello significa que se determina
la secuencia de por lo menos 5 amplicones obtenida a partir de la
amplificación de un fragmento de restricción específico ligado al
adaptador. En otras palabras: cada fragmento de restricción se
secuencia (estadísticamente) por lo menos cinco veces. Se prefiere
una cobertura aumentada ya que mejora la precisión aún más, de tal
modo que preferentemente la cobertura es de por lo menos 7, más
preferentemente de por lo menos 10. Se utiliza cobertura aumentada
para compensar el fenómeno conocido como "variación del
muestreo".
En la etapa siguiente, los amplicones
(parcialmente) secuenciados se correlacionan con el clon
correspondiente, habitualmente informáticamente utilizando
ordenadores. Los amplicones se seleccionan de tal modo que
comprendan secciones idénticas de nucleótidos en la parte obtenida
a partir del fragmento de restricción. Posteriormente, se
identifican los distintos identificadores específicos de la
agrupación que son presentes en dichos amplicones. La combinación
de los distintos identificadores específicos de la agrupación y, por
lo tanto, la secuencia del fragmento de restricción se puede
asignar específicamente a un clon específico (un procedimiento que
se ha descrito anteriormente como 'deconvolución'). Por ejemplo, en
el case de una estrategia de agrupación 3D (X, Y, Z), cada
agrupación de la genoteca se trata específicamente mediante una
combinación de 3 identificadores específicos de la agrupación. Cada
clon aparece más de una vez en la genoteca, de tal modo que cada vez
que aparece un clon en la genoteca, se puede realizar una
combinación de 3 identificadores específicos de la agrupación en
combinación con la misma sección obtenida a partir de un fragmento
de restricción. Dicho en otras palabras: una sección obtenida a
partir de un fragmento de restricción que se origina a partir de un
clon se etiquetará con 3 identificadores distintos. Las secciones
específicas obtenidas a partir de un fragmento de restricción,
cuando se observan en combinación con los 3 identificadores se
pueden asignar a un clon BAC simple. Ello se puede repetir para
cada amplicón que contenga otras secciones específicas de
nucleótidos en la parte obtenida a partir del fragmento de
restricción. Dicho procedimiento de deconvolución se puede realizar
con mayor facilidad manteniendo el equivalente genómico por
agrupación relativamente bajo (< 0.3, preferentemente 0,2),
reduciendo de este modo la probabilidad de que el mismo fragmento
se encuentre presente dos veces en la misma agrupación obtenido a
partir de distintos clones.
Una representación de ejemplo del concepto de
agrupación se proporciona en la figura 1. Un ADN de muestra se
convierte en una genoteca BAC. La genoteca BAC se agrupa en un
conjunto de agrupaciones (M) (se representan 3 agrupaciones,
comprendiendo cada uno de los mismos aproximadamente 0,3 GE,). Cada
agrupación se divide en
(X + Y + Z) subagrupaciones (habitualmente una pluralidad de placas de microvaloración).
(X + Y + Z) subagrupaciones (habitualmente una pluralidad de placas de microvaloración).
Los amplicones secuenciados que se enlazan ahora
con un clon particular de la genoteca se utilizan en la construcción
de un cóntigo basándose en correspondencia de la secuencia de las
secciones obtenidas a partir de un fragmento de restricción. Los
cóntigos de cada clon se alienan a continuación para generar un mapa
físico.
Las ventajas del presente procedimiento radican,
entre otras, en la mayor precisión para la construcción de cóntigos
BAC en comparación con las tecnología convencional de construcción
de cóntigos BAC. Además, la construcción del mapa físico basado
basada en la información de la secuencia es más precisa, ya que es
un modo directo de construcción del mapa físico basado y contribuye
a la determinación de la secuencia genómica y aporta además
información de la secuencia apta para el desarrollo de STS (sitios
de secuencia identificada) y para la cartografía comparativa.
La secuenciación de alto rendimiento que se
utiliza en la presente invención constituye un procedimiento de
experimentación científica especialmente adecuado para los campos de
la biología y la química. Mediante una combinación de la robótica
actual y otro hardware especializado de laboratorio, el investigador
puede identificar efectivamente grandes cantidades de muestras
simultáneamente.
Se prefiere que la secuenciación se realice
utilizando procedimientos de secuenciación de alto rendimiento,
tales como los procedimientos que se dan a conocer en los documentos
WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO
2004/070007, y WO 2005/003375 (todos ellos a nombre de 454 Life
Sciences), en Seo et al. (2004) Proc. Natl. Acad.
Sci. EE. UU. 101: 5488-93, y las tecnologías de
Helicos, Solexa, US Genomics.
\vskip1.000000\baselineskip
En determinadas formas de realización, se
prefiere que la secuenciación se realice utilizando el aparato y/o
el procedimiento descrito en los documentos WO 03/004690, WO
03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO
2005/003375 (todos ellos a nombre de 454 Life Sciences). La
tecnología descrita permite la secuenciación de 40 millones bases
en una serie simple y es 100 veces más rápida y económica que la
tecnología alternativa. La tecnología de secuenciación consiste
aproximadamente en 5 etapas: 1) fragmentación de ADN y ligación de
un adaptador específico para crear una genoteca de ADN monocatenario
(ADNmc); 2) apareamiento del ADNmc con perlas, emulsificación de
las perlas en microrreactores de agua en aceite y realizar la PCR
en emulsión para amplificar las moléculas individuales de ADNmc en
las perlas; 3) selección de/enriquecimiento de las perlas que
contienen moléculas ADNmc amplificado en su superficie 4)
sedimentación del ADN que transporta las en una
PicoTiter^{TM}Plate; y 5) secuenciación simultánea en 100.000
pocillos mediante la generación de una señal óptica de pirofosfato.
El procedimiento se explicará posteriormente con mayor detalle.
En una forma de realización preferida, la
secuenciación comprende las etapas de:
- a.
- aparear los fragmentos adaptados a las perlas, apareándose cada perla con un fragmento adaptado simple;
- b.
- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una perla simple;
- c.
- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple; y generar una señal de pirofosfato.
- \quad
- En la primera etapa (a), los adaptadores de la secuenciación se enlazan con fragmentos en la genoteca de la combinación. Dicho adaptador de la secuenciación comprende por lo menos una región "clave" para aparearse con una perla, una región del cebador de la secuenciación y una región del cebador de la PCR. De este modo se obtienen los fragmentos adaptados.
\vskip1.000000\baselineskip
En la primera etapa, los fragmentos adaptados se
aparean con las perlas, apareándose cada perla con un fragmento
adaptado simple. A la agrupación de fragmentos adaptados, se añaden
las perlas en exceso para garantizar el apareamiento de un
fragmento adaptado simple por perla en el caso de la mayoría de las
perlas (distribución de Poisson). En la presente invención, los
adaptadores que se ligan a los fragmentos de restricción obtenidos
a partir de clones pueden comprender una sección capaz de aparearse
con una perla.
En una etapa posterior, se emulsionan las perlas
en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada
microrreactor de agua en aceite una perla simple. Los reactivos de
la PCR se encuentran presentes en los microrreactores de agua en
aceite permitiendo que se produzca una reacción de la PCR en los
microrreactores. Posteriormente, se rompen los microrreactores y se
enriquecen las perlas que comprenden ADN (perlas positivas en ADN),
es decir, se separan de las perlas que no contienen fragmentos
amplificados.
En una etapa posterior, se cargan las perlas en
pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple. Los pocillos
forman parte preferentemente de una PicoTiter^{TM}Plate que
permite la secuenciación simultánea de una gran cantidad de
fragmentos.
Tras la adición de perlas que transportan
enzimas, se determina la secuencia de los fragmentos utilizando la
pirosecuenciación. En etapas sucesivas, la PicoTiter^{TM}Plate y
las perlas así como las los enzimas de las mismas se someten a
distintos desoxirribonucleótidos en presencia de reactivos
convencionales de la secuenciación y, mediante la incorporación de
un desoxirribonucleótido, se genera una señal óptica que se
registra. La incorporación del nucleótido correcto generará una
señal de pirosecuenciación que se puede detectar.
La propia pirosecuenciación resulta conocida en
la técnica y se describe, entre otros, en www.biotagebio.com;
www.pyrosecuencing.com/sección tecnología. La tecnología se aplica
además en, por ejemplo, los documentos WO 03/004690, WO 03/054142,
WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375
(todos ellos a nombre de 454 Life Sciences) y en Margulieset et
al. Nature 2005, 437, 376-380.
En la presente invención, las perlas están
provistas preferentemente de secuencias cebadoras o partes de las
mismas con capacidad para extenderse mediante polimerización para
proporcionar amplicones enlazados a perlas. En otras formas de
realización, los cebadores utilizados en la amplificación están
provistos de secuencias, por ejemplo en su extremo 5', que permiten
el enlace de los amplicones con las perlas a fin de permitir la
posterior polimerización y emulsión, y a continuación la
secuenciación. Alternativamente, los amplicones se pueden ligar con
adaptadores de la secuenciación antes de la ligación con las perlas
o la superficie. Los amplicones secuenciados revelarán la identidad
del identificador y, por lo tanto, la combinación de identificadores
revela la identidad del clon.
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de los procedimientos de secuenciación de
alto rendimiento se encuentra disponible en Solexa, Reino Unido
(www.solexa.co.uk) y se describe, entre otros, en los documentos
WO0006770, WO0027521, WO0058507,
WO0123610, WO0157248, WO0157249, WO02061127, WO03016565, WO03048387, WO2004018497,
WO2004018493, WO2004050915, WO2004076692, WO2005021786, WO2005047301, WO2005065814,
WO2005068656, WO2005068089, WO2005078130. Básicamente, el procedimiento se inicia con fragmentos de ADN ligados al adaptador, en este caso particular agrupaciones de fragmentos de restricción ligados al adaptador del cromosoma artificial tal como se describe en otras partes de la presente memoria. El ADN ligado al adaptador se une aleatoriamente a una capa densa de cebadores que se unen a una superficie sólida, habitualmente en un flujo celular. El otro extremo del fragmento ligado al adaptador se hibrida con un cebador complementario en la superficie. Los cebadores se extienden en presencia de nucleótidos y polimerasas en la denominada amplificación intermedia en fase sólida para proporcionar fragmentos bicatenarios. Dicha amplificación intermedia en fase sólida puede ser una amplificación selectiva. La desnaturalización y la repetición de la amplificación intermedia en fase sólida tienen como resultado la formación de agrupaciones densas de fragmentos amplificados distribuidos por la superficie. La secuenciación se inicia añadiendo cuatro nucleótidos finalizadores reversibles marcados de un modo distinto, los cebadores y la polimerasa al flujo celular. Tras la primera serie de extensión del cebador, se detectan las etiquetas, se registra la identidad de las primeras bases incorporadas y se retiran el extremo 3' y el fluoróforo de la base incorporada. A continuación se determina del mismo modo la identidad de la segunda base y se continúa la secuenciación de este modo.
WO0123610, WO0157248, WO0157249, WO02061127, WO03016565, WO03048387, WO2004018497,
WO2004018493, WO2004050915, WO2004076692, WO2005021786, WO2005047301, WO2005065814,
WO2005068656, WO2005068089, WO2005078130. Básicamente, el procedimiento se inicia con fragmentos de ADN ligados al adaptador, en este caso particular agrupaciones de fragmentos de restricción ligados al adaptador del cromosoma artificial tal como se describe en otras partes de la presente memoria. El ADN ligado al adaptador se une aleatoriamente a una capa densa de cebadores que se unen a una superficie sólida, habitualmente en un flujo celular. El otro extremo del fragmento ligado al adaptador se hibrida con un cebador complementario en la superficie. Los cebadores se extienden en presencia de nucleótidos y polimerasas en la denominada amplificación intermedia en fase sólida para proporcionar fragmentos bicatenarios. Dicha amplificación intermedia en fase sólida puede ser una amplificación selectiva. La desnaturalización y la repetición de la amplificación intermedia en fase sólida tienen como resultado la formación de agrupaciones densas de fragmentos amplificados distribuidos por la superficie. La secuenciación se inicia añadiendo cuatro nucleótidos finalizadores reversibles marcados de un modo distinto, los cebadores y la polimerasa al flujo celular. Tras la primera serie de extensión del cebador, se detectan las etiquetas, se registra la identidad de las primeras bases incorporadas y se retiran el extremo 3' y el fluoróforo de la base incorporada. A continuación se determina del mismo modo la identidad de la segunda base y se continúa la secuenciación de este modo.
En la presente invención, los fragmentos de
restricción ligados al adaptador o los amplicones son se enlazan
con la superficie mediante la secuencia de enlace con el cebador o
la secuencia cebadora. La secuencia se determina tal como se ha
descrito, comprendiendo la secuencia identificadora y (parte de) el
fragmento de restricción. La tecnología Solexa disponible
actualmente permite la secuenciación de fragmentos de
aproximadamente 25 pares de bases. Mediante el diseño económico de
los adaptadores y los cebadores de enlace con la superficie, la
etapa de secuenciación lee a través del identificador de la muestra
los restos de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de
restricción y cualquier base selectiva opcional. Cuando se utiliza
un identificador de la muestra con 6 pares de bases, los restos son
de la cortadora inusual EcoRI (AACCT), la utilización de dos bases
selectivas proporciona una secuencia interna del fragmento de
restricción de 12 pares de bases que se puede utilizar para
identificar específicamente el fragmento de restricción en la
muestra.
En una forma de realización preferida basada en
la tecnología de secuenciación anterior de Solexa, la amplificación
de los fragmentos de restricción ligados al adaptador se realiza con
un cebador que contiene como máximo nucleótido selectivo en su
extremo 3', preferentemente sin nucleótidos selectivos en su extremo
3', es decir, el cebador es únicamente complementario al adaptador
(un cebador +0).
En los procedimientos de secuenciación descritos
en la presente memoria, los cebadores utilizados en la amplificación
pueden comprender secciones específicas (como alternativa al
cebador o a las secuencias de enlace con el cebador descritos en la
presente memoria) que se utilizan en la etapa de secuenciación
posterior para enlazar los fragmentos de restricción cubiertos con
el adaptador o los amplicones con la superficie. Éstas se indican
generalmente como la región clave o secuencia compatible con el
cebador 5'.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: representación esquemática de
estrategias de agrupación.
Figura 2: cuatro cóntigos BAC continuos en una
estrategia de agrupación del cromosoma 4 de Arabidopsis.
Figura 3: Sin superposiciones en el grupo, una
red de colocación con alternancia mínima.
Figura 4: secuencia de reconocimiento dirigida a
agrupaciones BAC - producto amplificado en gel de agarosa.
Figura 5: red de colocación con reensamblaje
mínimo - parte del cóntigo de 1,9 Mb alargado.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo se basa en las
generalizaciones siguientes.
El genoma total de Arabidopsis thaliana
es de \sim125 Mbp. Un cromosoma artificial bacteriano (BAC)
presenta un inserto genómico de \sim100 kb en promedio. Un
equivalente genómico (GE) de BAC para una cobertura física 1x del
genoma de Arabidopsis comprende \sim1250 BAC. Para unos
resultados óptimos, se prefiere que la construcción de las
agrupaciones BAC se realice de tal modo que una agrupación BAC no
contenga más de 0,34 GE (\sim384 BAC). El análisis estadístico
predice que en 0,34 GE la probabilidad de encontrar 2 BAC idénticos
(es decir, 2 BAC que se cartografiarían exactamente en la misma
posición física) es < 5%. Un GE' inferior en una agrupación BAC
reduce aún más la probabilidad de encontrar dos BAC cartografiados
en la misma posición. Se utiliza un sistema de agrupación 3D
directo para realizar los cálculos. Un total de 10 GE de BAC de 2
genotecas distintas BAC de alta calidad (2 enzimas de clonación
distintos, por ejemplo, EcoRI y HindIII) resultan suficientes para
la construcción de un mapa físico de alta calidad. 10 GE de BAC para
Arabidopsis son \sim12.500 BAC.
Las etiquetas de la secuencia (la combinación de
una parte del fragmento de restricción y el identificador) se
generan a partir de un sitio de restricción de una cortadora
inusual, por ejemplo fragmentos AFLP tales como EcoRI/MseI, o
HindIII/MseI o una combinación de diversas combinaciones enzimáticas
(EC).
En el presente ejemplo, se utiliza la
combinación enzimática HindIII/MseI. Se estima que la distribución
de fragmentos HindIII/MseI en el genoma de Arabidopsis se
encuentra comprendida entre 50 y 120 fragmentos por 100 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Véase asimismo la figura 1. 0,3 GE corresponde a
384 BAC. La agrupación 3D de 384 BAC, con unas dimensiones X + Y + Z
produce 8 + 12 + 4 = 24 subagrupaciones. Para 10 GE : M (X + Y + Z)
= 30 (8 + 12 + 4) = 720 subagrupaciones.
Se pretende generar para cada subagrupación:
- -
- 100 etiquetas secuenciadas BAC
- -
- 10 veces de repetición de la secuencia por etiqueta
- -
- agrupación tridimensional (cada fragmento BAC se secuencia en cada dimensión (X, Y, Z)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ello significa que para la formación de puentes
en la secuenciación de alto rendimiento basada en la amplificación
de una agrupación de 0,34 GE, un conjunto de secuenciación lee: 8
subagrupaciones x (12 x 4 x 100 x 10) + 12 subagrupaciones x (8 x 4
x 100 x 10) + 4 subagrupaciones x (12 x 8 x 100 x 10) = 1.152.000
lecturas resultan necesarias. Ello significa que para un GE se
necesitan 3 * 1.152.000 = 3.456.000 lecturas por GE y 10 x 3.456.000
lecturas por 10 GE = 34.560.000 lecturas.
Un BAC simple genera un potencial de \sim100
etiquetas de secuencia únicas de \sim20 pares de bases
(comprendiendo el sitio de restricción). El número de secuencias
dependerá de la selección y/o combinación de combinaciones
enzimáticas.
Se pueden deducir las coordenadas de las
etiquetas y las secuencias que acompañan los BAC individuales a
partir de las secuencias de la subagrupación localizadas mediante
la etapa de "deconvolución". Por consiguiente, mediante la
deconvolución cada etiqueta de secuencia se puede asignar al BAC
individual correspondiente. Las etiquetas de secuencia repetitivas
se ignoran. El proceso de deconvolución tendrá como resultado una
cadena de 100 etiquetas por BAC y posteriormente se realiza el
ensamblaje de un mapa físico de novo mediante un
procedimiento de tipo FPC (FingerPrintedContigs [Obtención de la
huella genética de cóntigos]), tal como describió Cari Soderlund
para fragmentos BAC analizados en geles de agarosa (Soderlund et
al. 2000 - Genome Research 10;
1772-1787). Por último, la relación del mapa físico
con el mapa genético se realiza informáticamente. En el caso de
genomas grandes puede resultar necesario utilizar otras estrategias
de agrupación.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo se basa en las
generalizaciones siguientes.
El genoma total de Cucumis sativus es de
\sim350 Mbp. Un cromosoma artificial bacteriano (BAC) presenta un
inserto genómico de \sim100 kb en promedio. Un equivalente
genómico (GE) de BAC para una cobertura física 1x del genoma de
\sim3500 BAC. Para unos resultados óptimos, se prefiere que la
construcción de las agrupaciones BAC se realice de tal modo que una
agrupación BAC no contenga más de 0,34 GE (\sim384 BAC). El
análisis estadístico predice que en 0,34 GE la probabilidad de
encontrar 2 BAC idénticos (que es 2 BAC que se cartografiarían
exactamente en la misma posición física) es < 5%. Un GE'
inferior en una agrupación BAC reduce aún más la probabilidad de
encontrar dos BAC cartografiados en la misma posición. Se utiliza un
sistema de agrupación 3D directo para realizar los cálculos. Un
total de 10 GE de BAC de 2 genotecas distintas BAC de alta calidad
(2 distintos enzimas de clonación, por ejemplo, EcoRI y HindIII)
resultan suficientes para la construcción de un mapa físico de alta
calidad. 10 GE de BAC para Arabidopsis son \sim35.000
BAC.
Las etiquetas de la secuencia (la combinación de
una parte del fragmento de restricción y el identificador) se
generan a partir de un sitio de restricción de una cortadora
inusual, por ejemplo fragmentos AFLP tales como EcoRI/MseI, o
HindIII/MseI o una combinación de diversas combinaciones enzimáticas
(EC).
En el presente ejemplo, se utiliza la
combinación enzimática HindIII/MseI. Se estima que la distribución
de fragmentos HindIII/MseI en el genoma de Cucumis sativus se
encuentra comprendida entre 50 y 120 fragmentos por cada 100 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Véase asimismo la figura 1. 0.3 GE corresponde a
1152 BAC. La agrupación 3D de 1152 BAC, con unas dimensiones X + Y +
Z produce 8 + 12 + 12 = 32 subagrupaciones. Para 10 GE : M (X + Y +
Z) = 30 (8 + 12 + 12) = 960 subagrupaciones.
Se pretende generar para cada subagrupación:
- -
- 100 etiquetas secuenciadas BAC
- -
- 10 veces de repetición de la secuencia por etiqueta
- -
- agrupación tridimensional (cada fragmento BAC se secuencia en cada dimensión (X, Y, Z)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ello significa que para la formación de puentes
en la secuenciación de alto rendimiento basada en la amplificación
de una agrupación de 0,34 GE, un conjunto de secuenciación lee: 8
subagrupaciones x (12 x 12 x 100 x 10) + 12 subagrupaciones x (8 x
12 x 100 x 10) + 12 subagrupaciones x (12 x 8 x 100 x 10) =
3.456.000 lecturas resultan necesarias. Ello significa que para un
GE se necesitan 3 * 3.456.000 = 10.368.000 lecturas por GE y 10 x
10.368.000 lecturas por 10 GE = 103.680.000 lecturas.
Un BAC simple genera un potencial de \sim100
etiquetas de secuencia únicas de \sim20 pares de bases
(comprendiendo el sitio de restricción). El número de secuencias
dependerá de la selección y/o combinación de combinaciones
enzimáticas.
Se pueden deducir las coordenadas de las
etiquetas y las secuencias que acompañan los BAC individuales a
partir de las secuencias de la subagrupación localizadas mediante
la etapa de "deconvolución". Por consiguiente, mediante la
deconvolución cada etiqueta de secuencia se puede asignar al BAC
individual correspondiente. Las etiquetas de secuencia repetitivas
se ignoran. El proceso de deconvolución tendrá como resultado una
cadena de 100 etiquetas por BAC y posteriormente se realiza el
ensamblaje de un mapa físico de novo mediante un
procedimiento de tipo FPC (FingerPrintedContigs [Obtención de la
huella genética de cóntigos]), tal como describió Cari Soderlund
para fragmentos BAC analizados en geles de agarosa (Soderlund et
al. 2000 - Genome Research 10;
1772-1787). Por último, la relación del mapa físico
con el mapa genético se realiza informáticamente. En el caso de
genomas grandes puede resultar necesario utilizar otras estrategias
de agrupación.
Las plantillas de AFLP (EcoRI/MseI o
HindIII/MseI) se preparan a partir de BAC agrupados. Se realiza la
amplificación AFLP utilizando una combinación de 2 HindIII + 1
cebador y un MseI +0 cebadores (lo mismo en el caso de EcoRI). La
utilización de dos +1 cebadores garantiza la amplificación de
aproximadamente 50% de los fragmentos H/M (o E/M) de las
agrupaciones, es decir, se amplifican una media de 70/2 = 35
fragmentos de restricción por cada combinación enzimática. Las
reacciones de amplificación AFLP se realizan con cebadores AFLP que
contienen etiquetas identificadoras únicas en el extremo 5' para
cada uno de las agrupaciones BAC. De este modo, se necesitan por lo
menos 74 secuencias identificadoras. Ello se puede conseguir con 4
etiquetas de bases (4^{4} = 256 posibilidades). Las secuencias
identificadoras se necesitan únicamente para el cebador HindIII, ya
que en este ejemplo se realizará la secuenciación
unidireccional.
Las mezclas de la reacción de AFLP de todos las
agrupaciones se mezclan en cantidades iguales, creando una genoteca
de fragmentos. La genoteca de fragmentos se utiliza para construir
una genoteca de secuencias.
Dada una estrategia 3D de agrupación, ello
significa que se obtienen muestras de cada fragmento una pluralidad
de veces de media en cada dimensión. Los resultados son 100 pares de
secuencias de bases obtenidas del sitio HindIII (o EcoRI) de los
fragmentos de restricción. Tal como se ha comentado, para cada clon
BAC, se obtiene una media de 35 secuencias. Las secuencias
constituyen la base del ensamblaje de cóntigos utilizando un
procedimiento similar al FPC (Paquete de software de Soderlund que
se puede obtener en http://www.agcol.arizona.edu/software/fpc/)
pero que se basa en la correspondencia de la secuencia (más
detallada).
La ventaja de la utilización de una reducción de
la complejidad reproducible es que se necesitan menos fragmentos
para la construcción de una cartografía física. Una reducción de la
complejidad del 50% en el ejemplo anterior con Cucumis
produce 51.840.000 lecturas en vez de 103.680.000. Una ventaja
adicional de la presente invención consiste en que, utilizando la
reducción de la complejidad tal como se describe en la presente
memoria, se pueden generar mapas físicos con una calidad
controlable. Ello significa que al reducir la complejidad de una
agrupación BAC en +1 de amplificación AFLP, por ejemplo una
combinación de cebadores con +C, se obtiene una cartografía física
de aproximadamente un 25% de calidad (cobertura) en comparación con
una amplificación +1 con las cuatro combinaciones de cebadores (A,
C, T, G). Sin embargo, cuando se utilizan dos o tres combinaciones
de cebadores, se obtiene una mayor cobertura, es decir, por ejemplo
un 55 % o un 90%, respectivamente, en comparación con la cobertura
obtenida con una amplificación +1 con las cuatro combinaciones de
cebadores (A, C, T, G).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos obtenidos a partir el mismo clon
BAC se amplifican con 3 cebadores etiquetados distintos. De este
modo, se asignan unas secuencias únicas observadas en combinación
con 3 etiquetas a un clon BAC simple de la genoteca. Se observan
secuencias repetidas en combinaciones con una pluralidad de
etiquetas y, por lo tanto, no se pueden conectar con un clon BAC
simple. Ello afecta a una proporción considerable de fragmentos,
pero entre 35 fragmentos/clon BAC, por lo menos un subconjunto es
único.
Una secuencia con 10 veces de cobertura de las
agrupaciones BAC (3,3 veces/dimensión) significa que no se observan
todos los fragmentos esperados (debido a diferencias en la
concentración de clones individuales y a la variación del muestreo,
etc.). De este modo, se observa únicamente una fracción de las
secuencias (únicas) en combinación con 1 ó 2 etiquetas (o ninguna),
lo que impide asignar las mismas a un clon BAC simple. Sin embargo,
el grado en que ello se produce se debe a la variación del muestreo
entre los fragmentos de restricción obtenidos a partir el mismo
clon, el hecho de que se obtienen muestras de 35 fragmentos
significa que la combinación de etiquetas proporciona la
localización correcta del BAC: véase a continuación.
El esquema anterior ilustra como la construcción
de cóntigos agrupa los fragmentos entre sí en un cóntigo; el
fragmento 5, que presenta una secuencia única y del que se obtuvo la
muestra junto con 3 etiquetas define la localización del BAC en la
genoteca, de la que probablemente derivan asimismo los fragmentos 1
a 4 (+35).
De este modo, la ventaja de la técnica es que la
información de la secuencia en un número de fragmentos de
restricción suficientemente grande (35 en el ejemplo anterior) se
utiliza para construir cóntigos precisos, mientras que la
utilización de un sistema de etiquetado tridimensional permite la
identificación directa de la mayoría de BAC, aunque la localización
del no se pueda obtener a partir de cada secuencia de fragmento
individual (debido a la variación experimental). Sin embargo, la
combinación de etiquetas de los fragmentos obtenidos a partir el
mismo BAC proporcionará la localización del BAC.
De este modo, la información obtenida de la
formación de cóntigos BAC basada en la secuencia es la misma que
para las técnicas convencionales (es decir, cóntigo + localización
BAC). Se observa que para las técnicas de obtención de la huella
genética de clones individuales, se conocerá la localización BAC por
definición.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó un total de 72 BAC (BAC =
cromosoma artificial bacteriano) que cartografían el cromosoma 4 de
Arabidopsis y que abarcan una extensión física total de 5.4
Mb en 4 cóntigos BAC (1,8 Mb, 1,2 Mb, 0,5 Mb y 1,9 Mb) a partir de
TAIR y otras bases de datos. El vegetal donador de las genotecas BAC
es Arabidopsis thaliana ecotipo Colombia. Los 72 BAC, con un
tamaño comprendido entre 70 kb y 150 kb, se separaron en 2 grupos
de 36 BAC, el grupo "AB" y el grupo "XY". En los 2 grupos,
los 36 BAC no presentaban superposición interna, mientras que los
BAC del grupo AB y del grupo XY combinados se podían ensamblar en 4
redes de colocación cóntigos mínimas continuas con BAC alternantes
de los grupos AB y XY (véanse las figuras 2 a 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se procedió al crecimiento de los 72 BAC durante
la noche como clones individuales en 200 microlitros de medio TY
estándar que comprendía cloranfenicol (clones BAC TAMU) o kanamicina
(clones BAC IGF). Se desarrollaron todos los clones en un formato 6
x 6 para facilitar el procedimiento de agrupación. Por la mañana, se
procedió a la agrupación del cultivo líquido en 2 dimensiones (6 x
6) de tal modo que se generaron 12 agrupaciones por grupo. Cada
agrupación contenía 600 microlitros de medio con BAC desarrollados
(100 microlitros por BAC individual). Se aisló el ADN a partir de
las 24 agrupaciones BAC siguiendo un procedimiento de
minipreparación alcalina estándar según Sambrook et al.
(2001).
Se digirieron 50 ng ADN de cada agrupación BAC
con enzimas de restricción EcoRI y MseI, y posteriormente se
ligaron los adaptadores EcoRI y MseI AFLP, según el procedimiento
estándar AFLP descrito por Vos et al. (1995). Se diluyó la
mezcla de restricción/ligación 10x en MilliQ-agua y
se utilizaron 5 microlitros en la etapa de amplificación. Los
cebadores utilizados en la amplificación etapa se indicaron con una
secuencia de reconocimiento de 4 nucleótidos, de tal modo que cada
agrupación se etiquetó con una secuencia de localización específica
de 4 nucleótidos. Dicha secuencia de reconocimiento resulta
necesaria para facilitar la deconvolución de todas las secuencias a
una coordenada de un BAC individual.
Los dos cebadores utilizados, EcoRI+0 y MseI+0,
eran cebadores fosforilados en la posición 5' compatibles con el
adaptador que presentaban secuencias de reconocimiento 5' y
distintos para la coordenada de la agrupación (véase la figura 4).
La fosforilación de la posición 5' resulta necesaria para la
ligación de los adaptadores de la pirosecuenciación. Se realizó la
amplificación para 30 ciclos con el perfil: 94ºC (30 seg.), 56ºC
(60 seg.), 72ºC (60 seg.). Tras la amplificación, se verificaron los
productos en gel de agarosa (figura 4) y los 12 productos de
agrupación amplificada de cada grupo se agruparon en un
grupo-agrupación (AB cq. XY) y se cuantificaron.
Cinco microgramos de ADN de cada grupo-agrupación se
procesaron inmediatamente en unas etapas adicionales de preparación
para la secuenciación con la técnica 454. Se realizó la
pirosecuenciación con la técnica 454 en la plataforma GS20 según
Margulies et al. (2005).
\vskip1.000000\baselineskip
El listado de las lecturas de la secuencia de
ADN generado mediante la máquina de pirosecuenciación GS20 se
analizó en 3 etapas:
- Etapa 1)
- Se identificaron los códigos los 4 primeros nucleótidos que consisten en la muestra de la agrupación y se asignaron las etiquetas de las agrupaciones correspondientes. Si se desconocía el código, se retiró la lectura del conjunto.
- Etapa 2)
- Se identificaron los siguientes 16 ó 17 nucleótidos (en función del enzima de restricción) que contenían la secuencia cebadora. Cuando eran un 100% idénticos a la secuencia cebadora, se admitieron las lecturas y se añadieron al conjunto de datos y de lo contrario se retiraron.
- Etapa 3)
- Todas las lecturas de la etapa 2 se recortaron a 14 nucleótidos después de la secuencia cebadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Posteriormente se agruparon todas las lecturas
correctas de la secuencia recortada: se identificaron las lecturas
un 100% idénticas y se asignaron a la agrupación correspondiente.
Cada grupo de lecturas único se denominó "etiqueta". Las
etiquetas que se encontraron en exactamente 2 agrupaciones, una para
la coordenada X y una para la coordenada Y, se vincularon aun BAC
específico: dicho procedimiento se denomina deconvolución.
Se realizó la lista de todas las etiquetas
únicas para los BAC sometidos a deconvolución para todos los grupos
BAC grupos. Se identificaron los pares de BAC con una o más
etiquetas comunes. Posteriormente, se pudieron ensamblar los
cóntigos BAC cóntigos tal como se representa en la tabla 1.
Se demostró que las 4 redes de colocación
mínimas de BAC de 1,8 Mb, 1,2 Mb, 0,5 Mb y 1,9 Mb se podían
reensamblar de un modo directo tras la deconvolución de las
etiquetas de secuencia en los BAC individuales (tabla 1 y figura 4).
La comparación de las etiquetas GS20 generadas con los fragmentos
predichos informáticamente demostró que se secuenció entre el 70 y
el 80% de los fragmentos EcoRI/MseI. Por lo tanto, en el
reensamblaje de los 4 cóntigos BAC, no se pudieron detectar algunas
de las superposiciones físicas más pequeñas entre 2 BAC.
El hecho de que las lecturas cortas (14 pares de
bases) resultan suficientes para reensamblar las redes de colocación
BAC indica que las plataformas de secuenciación de alto rendimiento
con una longitud de lectura corta (tal como la Illumina Genome
Analyser y SOliD (ABI)) permiten el montaje de un mapa físico de
alto rendimiento siguiendo el procedimiento propuesto.
Claims (11)
1. Procedimiento para la generación de un mapa
físico de por lo menos una parte de un genoma que comprende las
etapas de:
- (a)
- proporcionar una muestra ADN;
- (b)
- generar un banco de clones de un cromosoma artificial (BAC, YAC) en el que cada clon de un cromosoma artificial;
- (c)
- combinar los clones de cromosomas artificiales en uno o más agrupaciones, en los que cada clon se encuentra presente en más de una agrupación, para crear una genoteca;
- (d)
- digerir el ADN de una o más agrupaciones con una o más endonucleasas de restricción para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción para cada agrupación;
- (e)
- ligar los adaptadores a uno o ambos lados de los fragmentos de restricción, en los que por lo menos un adaptador contiene un identificador específico de la agrupación o una sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (f)
- opcionalmente, combinar los fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (g)
- opcionalmente, amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador de etapa (e) con por lo menos un cebador, comprendiendo dicho cebador una sección específica de la agrupación que corresponde a la sección del identificador específica de la agrupación en el adaptador o comprendiendo un identificador específico de la agrupación en la posición de la sección redundante del identificador, respectivamente, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados etiquetados (amplicones);
- (h)
- opcionalmente, combinar los amplicones en un conjunto de amplicones combinados;
- (i)
- determinar la secuencia de por lo menos el identificador específico de la agrupación y una parte del fragmento de restricción de los fragmentos de restricción ligados al adaptador, de los amplicones o conjunto de amplicones combinados;
- (j)
- asignar las secuencias de fragmentos de restricción determinadas en los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones de la etapa (i) a los clones correspondientes utilizando los identificadores específicos de la agrupación;
- (k)
- construir un cóntigo basado en el emparejamiento de la secuencia de las secciones obtenidas del fragmento de restricción;
- (l)
- ordenar los fragmentos de restricción de la etapa (k) para construir de este modo cóntigo del clon y generar un mapa físico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los fragmentos de restricción se asignan al clon
correspondiente mediante el agrupamiento de fragmentos de
restricción ligados al adaptador que contienen secuencias idénticas
en (parte de los) fragmentos de restricción pero que presentan
distintos identificadores específicos de la agrupación.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la secuenciación se realiza mediante secuenciación de alto
rendimiento.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la secuenciación de alto rendimiento se realiza en un soporte
sólido.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la secuenciación de alto rendimiento se basa en la
secuenciación por síntesis.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la secuenciación de alto rendimiento comprende las etapas
de:
- \bullet
- aparear los amplicones o fragmentos de restricción ligados al adaptador con perlas, apareándose cada perla con unos fragmentos de restricción simples ligados al adaptador o amplicón;
- \bullet
- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una perla simple;
- \bullet
- realizar la PCR por emulsión para amplificar los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones en la superficie de la perlas;
- \bullet
- opcionalmente, seleccionar/enriquecer las perlas que contienen los amplicones amplificados;
- \bullet
- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple; y
- \bullet
- generar una señal de pirofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la secuenciación de alto rendimiento comprende las etapas
de:
- \bullet
- aparear los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones con una superficie que contiene los cebadores primero y segundo o las secuencias de enlace con el cebador primero y segundo respectivamente,
- \bullet
- realizar la amplificación intermedia para proporcionar agrupamientos de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador o amplicones amplificados,
- \bullet
- determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador o amplicones amplificados utilizando nucleótidos finalizadores marcados de un modo reversible.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el identificador presenta entre 4 y 16 pares de bases,
preferentemente entre 4 y 10, más preferentemente entre 4 y 8, aún
más preferentemente entre 4 y 6 pares de bases.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el identificador no contiene 2 o más bases consecutivas
idénticas.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que para dos o más clones, los identificadores correspondientes
contienen por lo menos dos nucleótidos distintos.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos un cebador
presenta entre 1 y 10 nucleótidos selectivos en su extremo 3',
preferentemente entre 1 y 4, para proporcionar subconjunto aleatorio
de amplicones.
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