ES2349836B1 - Metodo para el diagnostico de la fibrosis y/o la cirrosis hepatica enpacientes infectados con vhc o coinfectados con vih y vhc. - Google Patents

Abstract

Método para el diagnóstico de la fibrosis y/o la cirrosis hepática en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC.#La presente invención se refiere al campo del diagnóstico y pronóstico clínico de la fibrosis hepática. Más concretamente, la presente invención se refiere a métodos para la cuantificación conjunta de los marcadores MMP2, ASP y del número de plaquetas en pacientes infectados con VHC o bien en pacientes coinfectados con VIH y VHC para su uso en diferentes métodos para el diagnóstico de la presencia de fibrosis hepática o cirrosis hepática en dichos pacientes. La invención se refiere asimismo a un kit de diagnóstico para llevar dichos métodos. La invención también se refiere a un programa de ordenador capaz de ejecutar un algoritmo basado en la introducción de unos valores previamente determinados de MMP2, ASP y del número de plaquetas para inferir un diagnóstico con respecto a la presencia de fibrosis hepática en pacientes con VHC o coinfectados con VIH y VHC así como para determinar su estudio. Por último, la invención se refiere a un aparato electrónico que incorpora dicho programa de ordenador y es capaz de ejecutarlo.

Description

Método para el diagnóstico de la fibrosis y/o la cirrosis hepática en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIHyVHC.

Campo de la invención

La presenteinvenciónse refiereal campodel diagnósticoypronóstico clínicodela fibrosis hepática.Más concretamente,la presenteinvención se refierea métodos parala cuantificación conjuntade los marcadores MMP2, ASPydel númerode plaquetas en pacientes infectados con VHCo bien en pacientes coinfectados con VIHyVHC para suuso en diferentes métodos para el diagnóstico de la presencia de fibrosis hepática o cirrosis hepática en dichos pacientes. La invención se refiere asimismo a un kit de diagnóstico para llevar dichos métodos. La invención también se refiere a un programa de ordenador capaz de ejecutar un algoritmo basado en la introducción de unos valores previamente determinadosde MMP2, ASPydelnúmerode plaquetas para inferir un diagnóstico con respectoala presenciade fibrosis hepática en pacientes con VHCo coinfectados con VIHy VHC así como para determinar su estadio. Por último,lainvenciónse refiere aun aparato electrónicoque incorpora dicho programade ordenadory es capazde ejecutarlo.

Antecedentes de la invención

La extensión de la fibrosis hepática tiene importantes implicaciones pronosticas así como sobre el manejo en la hepatitis crónicaC.La fibrosis hepáticase estadía siguiendola clasificaciónde Scheuersegúnlacualexisten5estadios de fibrosis hepática: Fibrosis ligerao ausente (hígado sin fibrosiso fibrosisportal sin septos lobares,F0yF1), fibrosis moderada (fibrosis portal con pocos septos, F2), fibrosis grave (septos numerosos con distorsión de la arquitectura hepática, pero sin cirrosis,F3),ycirrosis (F4). Dependiendo del gradoo estadiode fibrosisel pronóstico del paciente es mejor o peor, siendo el estadio de cirrosis (F4) el más grave.

El diagnósticode fibrosisseha basadotradicionalmenteenla biopsia hepática.Sin embargo, esta técnicaesinvasiva, limitadapor problemasdevariabilidad(1,2)yde difícil repetición periódica.Por estosmotivos,se necesitantests no invasivos que puedan reemplazar a la biopsia hepática. Entre ellos se encuentran los índices sanguíneos simples, basados en datos disponibles enla rutina clínica diaria,yla elastometría transitoria hepática,validados en pacientes con hepatitis crónicaCy coinfección por VIH (3-6).

Los índices sanguíneos simples se implementan fácilmentey son baratos. Sin embargo, la precisión diagnóstica de estos índices es menor en los pacientes coinfectados por VIH/VHC que en los monoinfectados por VHC (3, 4). En concreto, el diagnóstico de cirrosis no se puede establecer con seguridad (3).

La elastometría transitoria hepática es una técnica prometedora en los pacientes coinfectados por VIH/VHC (5, 6). Sin embargo, la tasa de errores de clasificación utilizando un único punto de corte de rigidez hepática impide su aplicación para detectar a los pacientes coinfectados con ausencia de fibrosis o fibrosis mínima (5, 6). El empleo de dos puntosde corte para detectary excluirla presenciade fibrosis significativa mejoralaexactitud diagnósticadela elastometría transitoria hepática enla coinfecación por VIH/VHC,pero deja un número sustancialde pacientessin clasificar(7). Además, esta técnicanoestádisponible ampliamenteen todoslos centrossanitarios debidoasu coste,y al hecho de que en algunos países no se encuentra aprobada como técnica de diagnóstico de la fibrosis.

La fibrosis es una respuesta universal para curar laslesiones tisulares que se acompaña de aumento de la fibrogénesisyla fibrolisis. Ambos procesos de acumulaciónyeliminación de fibrosis pueden producir elevaciones enlos niveles circulantes de componentes de la matriz extracelular o de fragmentos de los mismos (8, 9). Se han elaborado testsqueincluyen marcadoresdelamatrizextracelularen combinacionesdiversasconotrosdatosparaintentarpredecir la presencia de fibrosis hepática en la infección por VHC (9-17). Sin embargo, hay poca información sobre el valor diagnóstico de estos biomarcadores séricos en los pacientes coinfectados por VIH/VHC (18, 19).

El diagnóstico no invasivo de la fibrosis en la infección por VIHy VHC necesita mejorar. Los índices séricos simples pueden evitar la realización de una biopsia hepática en hasta la mitad de los pacientes (20). Los tests séricos que incluyen biomarcadores de la matriz extracelular, como el índice SHASTA, o completamente basados en biomarcadoresdefibrogénesis también dejan unaproporción significativade pacientes sin un diagnóstico definitivo(18, 19). La elastometría transitoria hepática es menos precisa para detectar a los pacientes con fibrosis mínima o ausente (5, 6).

Por tanto, existe una clara necesidad de desarrollar métodos alternativos de diagnostico de fibrosis hepática en pacientes con VHC que combinen una alta sensibilidadyespecificidad con un altovalor predictivo.

Los autores de la presente invención tras el ensayo de diferentes marcadores han descubierto un método basado en elvalorpredictivo combinadodetresmarcadores séricoscomosonlametaloproteinasa2(MMP2),la aspartatoamino transferasa (AST)yel recuentode plaquetas. Estos tres marcadores sirven para establecerla presenciao ausenciade fibrosis hepática tanto en pacientes infectados con VHC, como coinfectados con VIHyVHCytambién para establecer el grado de la misma, especialmente para establecer si dicho paciente padece cirrosis hepática.

Breve descripción de las figuras

Figura1.A) Medianadelosniveles séricosde MMP-2segúnel estadiode fibrosishepática (p=0.009).B) Mediana de los niveles séricos de TIMP-1 según el estadio de fibrosis hepática (p=0.16). C) Mediana de los niveles séricos de ASTsegúnel estadiode fibrosishepática (p=0.002).D) Medianadel recuentode plaquetassegúnel estadiode fibrosis hepática (p=0.004).

Figura2.CurvasROCdel modelopara predecirla presenciayausenciade fibrosisen pacientes infectadosporVIH yVHC. Se muestran los puntos de corte de la puntuación obtenida del modelo elegidos para maximizar los valores predictivos negativo (VPN)ypositivo (VPP).A) CurvaROC parala discriminacióndela fibrosis significativa (F0-F1 vs. F2-F4), área bajola curvaROC 0.74.B) CurvaROC parala discriminacióndela cirrosis (F0-F3 vs. F4),áreabajo la curvaROC 0.88.

Descripción de la invención

Un primer objeto de de la invención se refiere a un método de cuantificación para su uso en el diagnóstico de la fibrosis hepática en pacientes infectados con VHCo en pacientes coinfectados conVIHyVHC que comprende:

a) determinar conjuntamente losvaloresde MMP2, ASTyel recuentode plaquetasde una muestrade un paciente infectado VHCo coinfectado con VIHyVHC,

b) compararlosvalores obtenidosena) frenteavaloresde referenciadepacientes infectados conVHCque no padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)o coinfectadosconVIHyVHC que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1).

Por tanto, una realización particular del método de cuantificación antes mencionado comprende en una etapa a) determinar conjuntamentelosvaloresdeMMP2,ASTyel recuentode plaquetasen pacientes infectados simplemente conVHC.Laetapab)enesta realización comprende compararlosvaloresobtenidosparalos marcadoresMMP2,AST ypara el recuento de plaquetas en dicho paciente infectado solo con VHC frente a valores de referencia de pacientes infectadossoloconVHCquenopadecen fibrosishepáticaopadecen fibrosishepáticaligera(F0oF1).

Otra realización particularypreferida del métodode cuantificación antes mencionado comprende enla etapaa) determinar conjuntamentelosvaloresde MMP2,ASTyel recuentode plaquetasen pacientes coinfectados conVIH yVHCyenla etapab) compararlosvalores obtenidos para MMP2, ASTyparael recuentodeplaquetas en dicho paciente coinfectado conVIHyVHC frenteavaloresde referenciade pacientes coinfectados conVIHyVHCqueno padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1).

Enambasrealizaciones,la cuantificacióndelos marcadoressepuedellevaracabopor cualquier métodoo técnica comúnmente conocidaparaunexpertoenla materia.Son especialmente preferidaslastécnicas inmunoquímicascomo radioinmunoensayo,ELISA, inmunofluorescencia, westernbloto citometríadeflujo.Aunquedichas técnicasinmunoquímicas son aplicables enla cuantificación tantode MMP2 comode ASTyparael recuentode plaquetas, cualquiera de ellas es especialmentepreferida parala cuantificaciónde los dos primeros marcadores, es decir,de MMP2yAST. El recuento de plaquetas se lleva a cabo preferiblemente por citometría de flujo, por recuento de las células en el microscopio, o por recuento automático con un equipamiento especializado.

Las muestras usadas para la cuantificación de MMP2, AST y para el recuento de plaquetas pueden ser tanto muestras de sangre como de suero o plasma.

El método de cuantificación descrito anteriormente es útil para llevar a cabo otro de los objetos de la presente invención, un métodode diagnosticode fibrosis hepática en pacientes infectados con VHCo coinfectados con VIHy VHC.

Por tanto,es también objetodela presenteinvención un métodode diagnósticodela fibrosis hepática en pacientes infectados VHCo en pacientes coinfectados con VIHyVHC que comprende:

i) cuantificarlosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetasde acuerdo conelmétodode cuantificación descrito anteriormente,

ii) determinarla presenciade unavariación conjuntadelosvaloresde MMP2,ASTydel recuentode plaquetas,

caracterizado porque unavariación conjunta significativade todosy cada unode losvaloresde MMP2, ASTy del recuento de plaquetas frente a dichos valores de referencia en pacientes infectados con VHC que no padecen fibrosishepáticao padecen fibrosis hepática ligera (F0o F1)o en pacientes coinfectados con VIHy VHC que no padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepáticaligera(F0oF1), implicala presenciade fibrosis hepáticaen dicho paciente infectado con VHCo coinfectado con VIHyVHC.

Por tanto, el método para el diagnóstico de la presencia de fibrosis hepática se vale de los resultados obtenidos en el método cuantificación antes descrito para inferir un resultado de valor diagnóstico.

Una realización particular del método de diagnostico de fibrosis hepática aquí descrito comprende i) cuantificar losvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetasen pacientes infectados conVHCde acuerdo conel métodode cuantificación mencionadomásarriba.Enlaetapaii)sedeterminalapresenciadeunavariaciónconjuntadelosvalores deMMP2,ASTydel recuentodeplaquetasentreelolospacientesconVHCquesedesea(n) diagnosticarfrentealos valores de referencia para pacientes con VCH que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0

oF1).Sise determinaqueexiste unavariación conjunta significativadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuento de plaquetas de los pacientes infectados con VCH frente a dichos valores de referencia en pacientes infectados con VHC que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1), se concluye que dicho paciente con VHC padece fibrosis hepática. Si la determinación estableciese que no existe una diferencia conjunta significativa de dichos valores la conclusión sería que dicho paciente con VHC no presenta fibrosis hepática o que presenta una fibrosis hepática ligera.

Normalmente,lavariacióndelosvaloresde MMP2,ASTydelnúmerode plaquetasenlos pacientes conVHCque han sido diagnosticados positivamente de fibrosis hepática mediante el método de la invención implica que tantolos valoresde MMP2yAST se encuentran significativamente aumentados frentea losvaloresde referenciade pacientes infectadosconVHCquenopadecen fibrosis hepática(F0)opadecen fibrosis hepáticaligera(F1), mientrasquelos valores del recuento de plaquetas se ven normalmente disminuidos frente a dichos valores de referencia o valores control.

Otrarealización particularypreferidadel métodode diagnosticode fibrosis hepáticaaquí descrito comprendei) cuantificar los valores de MMP2, ASTy del recuento de plaquetas enpacientes coinfectados con VIHy VHC de acuerdo con el método de cuantificación mencionado más arriba. En la etapa ii) se determina la presencia de una variación conjuntadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetas entreelolos pacientes coinfectadoscon VIHyVHCquesedesea(n) diagnosticarfrentealosvaloresdereferenciaparapacientes coinfectadosconVIHyVCH quenopadecen fibrosis hepáticaopadecen fibrosis hepáticaligera(F0oF1).Sisedeterminaqueexisteunavariación conjunta significativade losvaloresde MMP2, ASTydel recuentode plaquetas en los pacientes coinfectados con VIHyVCH frenteadichosvaloresde referenciaen pacientes coinfectados conVIHyVHCquenopadecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepática ligera(F0oF1),se concluyeque dicho paciente conVIHyVHC padece fibrosis hepática. Si la determinación estableciese que no existe una diferencia conjunta significativa de dichos valores la conclusiónseríaquedichopacienteconVIHyVHCnopresenta fibrosishepáticaoquepresentauna fibrosishepática ligera.

Normalmente,lavariacióndelosvaloresdeMMP2,ASTydel númerode plaquetasenlos pacientes coinfectados con VIHyVHC que han sido diagnosticados positivamente de fibrosis hepática mediante el método de la invención implicaquetantolosvaloresdeMMP2yASTse encuentran significativamente aumentados frentealosvaloresde referenciadepacientes coinfectadosconVIHyVHCquenopadecen fibrosishepática(F0)opadecen fibrosishepática ligera(F1), mientrasquelosvaloresdel recuentode plaquetassevennormalmente disminuidos frentea dichosvalores de referencia o valores control.

Otro objeto de la presente invención es un método de cuantificación para su uso en el diagnóstico de cirrosis hepática en pacientes infectados con VHCo en pacientes coinfectados con VIHyVHC que comprende:

a) determinar conjuntamente losvaloresde MMP2, ASTyel recuentode plaquetasde una muestrade un paciente infectado con VHCo coinfectado con VIHyVHC,

b) comparar los valores obtenidos en a) frente a valores de referencia de pacientes infectados VHC que

padecen como máximo una fibrosis hepáticagrave(F0,F1,F2oF3)o coinfectados conVIHyVHCque

padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3).

Por tanto, una realización particular del método antes mencionado comprende en una etapaa)determinar conjuntamente losvaloresde MMP2, ASTyel recuentode plaquetas en pacientes infectados simplemente con VHC.La etapa b) en esta realización comprende comparar losvalores obtenidos para los marcadoresMMP2, ASTyparael recuento de plaquetas en dicho paciente infectado solo con VHC frente a valores de referencia de pacientes infectados VHC que padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3).

Otra realización particularypreferida del método antes mencionado comprende enla etapaa) determinar conjuntamentelosvaloresdeMMP2,ASTyel recuentode plaquetasenel paciente coinfectadoconVIHyVHCyenlaetapa b)compararlosvalores obtenidosparaMMP2,ASTyparael recuentode plaquetasen dicho paciente coinfectadocon VIHyVHC frenteavaloresde referenciade pacientes coinfectados conVIHyVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0,F1,F2o F3).

Enambasrealizaciones,la cuantificacióndelosmarcadoressepuedellevaracabopor cualquier métodoo técnica comúnmente conocidaparaunexpertoenla materia.Son especialmente preferidaslastécnicas inmunoquímicascomo radioinmunoensayo, ELISA, inmunofluorescencia, western bloto citometríade flujo. Aunquedichas técnicas inmunoquímicas son aplicables enla cuantificación tantode MMP2 comode ASTyparael recuentode plaquetas, cualquiera de ellas es especialmentepreferida parala cuantificaciónde los dos primeros marcadores, es decir,de MMP2yAST. El recuento de plaquetas se lleva a cabopreferiblemente por citometría de flujo, por recuento de las células en el microscopio, o por recuento automático con un equipamiento especializado.

Las muestras usadas para la cuantificación de MMP2, AST y para el recuento de plaquetas pueden ser tanto muestras de sangre como de suero o plasma.

El método de cuantificación descrito anteriormente es útil para llevar a cabo otro de los objetos de la presente invención,un métodode diagnosticodelas cirrosis hepáticaenpacientes infectados conVHCo coinfectados conVIH yVHC.

Por tanto, es también objeto de la presente invención un método de diagnóstico de la cirrosis hepática en pacientes infectados VHCo en pacientes coinfectados con VIHyVHC que comprende:

a) cuantificarlosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetasde acuerdo conelmétodode cuantificación descrito anteriormente,

b) determinarlapresenciadeunavariaciónconjuntadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentodeplaquetas

caracterizado porque unavariación conjunta significativade todosy cada unode losvaloresde MMP2, ASTy del recuento de plaquetas frente a dichos valores de referencia en pacientes infectados con VHC que padecen como máximo una fibrosishepáticagrave(F0,F1,F2oF3)oen pacientes coinfectados conVIHyVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3) implica que dicho paciente infectado con VHC o coinfectado con VIHyVHC padece cirrosis hepática.

Por tanto, el método para el diagnostico de la presencia de cirrosis hepática se vale de los resultados obtenidos en el método cuantificación antes descrito para inferir un resultado de valor diagnóstico.

Una realización particulardel métodode diagnosticode cirrosis hepática aquídescrito comprendei) cuantificar losvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetasenelolos pacientes infectadosconVHCde acuerdoconel método de cuantificación mencionado más arriba. En la etapa ii) se determina la presencia de una variación conjunta delosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetas entreelolos pacientesconVHCquese desean diagnosticar frenteadichosvaloresde referenciaenpacientes infectados conVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave(F0,F1,F2oF3).Sise determinaqueexisteunavariaciónconjunta significativadelosvaloresdeMMP2,AST ydel recuento de plaquetas los pacientes infectadoscon VHC que se desea diagnosticar frente a dichos valores de referenciaen pacientes infectados conVHCque padecen como máximouna fibrosis hepáticagrave(F0,F1,F2o F3), la conclusión sería que dicho paciente con VHC padece cirrosis hepática. Si la determinación establecieseque no existe una diferencia conjunta significativa de dichos valores la conclusión sería que dicho paciente con VHC no presenta cirrosis hepática.

Normalmente,lavariaciónde losvaloresde MMP2, ASTydel númerode plaquetas en los pacientes con VHC que han sido diagnosticados positivamente de cirrosis hepática mediante el método aquí descrito implica que tanto losvaloresde MMP2y AST se encuentran significativamente aumentados frentea dichosvaloresde referencia en pacientes infectados con VHC que padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3), mientras que los valores del recuento de plaquetas se ven normalmente disminuidos frente a dichos valores de referencia o valores control.

Otra realización particularypreferidadel métodode diagnosticode cirrosis hepáticaaquí descrito comprendei) cuantificar los valores de MMP2, ASTy del recuento de plaquetas en pacientes coinfectados con VIHy VHC de acuerdo con el método de cuantificación mencionado más arriba. En la etapa ii) se determina la presencia de una variación conjuntadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetas entreelolos pacientes coinfectadoscon VIHyVHCquese desean diagnosticar frenteadichosvaloresde referenciaenpacientes coinfectados conVIHyVHC que padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3). Si se determina que existe una variación conjuntasignificativadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetaslos pacientes coinfectadosconVIHy VHC frentea dichosvaloresde referenciaen pacientes coinfectados conVIHyVHCque padecen comomáximo una fibrosishepáticagrave(F0,F1,F2oF3),seconcluyequedichopacienteconVIHyVHCpadece cirrosishepática.Si la determinación estableciese que no existe una diferencia conjunta significativa de dichos valores la conclusión sería que dicho paciente con VIHyVHC no presenta cirrosis hepática.

Normalmente,lavariaciónde losvaloresde MMP2, ASTydel númerode plaquetas en los pacientes coinfectados con VIHy VHC que han sido diagnosticados positivamente de cirrosis hepática mediante el método aquí descrito implicaque tantolosvaloresde MMP2yASTse encuentran significativamente aumentados frentea dichosvaloresde referencia en pacientes coinfectados con VIHyVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0,F1, F2 o F3), mientras que los valores del recuento de plaquetas se ven normalmente disminuidos frente a dichos valores de referencia o valores control.

Los métodosde diagnósticode fibrosisy cirrosis hepáticaaquí descritos tantopara pacientes infectados solo con VHC como para pacientes coinfectados con VIHyVHC tienen una elevada sensibilidadyespecificidad. En el caso del métodode diagnósticodela presenciade fibrosisenpacientes coinfectados conVIHyVHClasensibilidadllega al 90% y la especificidad al 98% y en el caso del método de diagnóstico de la presencia de cirrosis hepática en pacientes coinfectadoscon VIHyVHCla sensibilidad llegaal 97%yla especificidadal 94%. Estos elevadosvalores de sensibilidadyespecificidad dan ideadelavalidez del modelo aquí presentado.

Por otro lado, los métodos de diagnóstico de fibrosisy cirrosis hepática aquí descritos tanto para pacientes infectadossoloconVHC comopara pacientes coinfectadosconVIHyVHC tienenunaaltovalorpredictivo.Elvalor predictivosemide medianteelvalorpredictivopositivo(VPP)yelvalorpredictivonegativo(VPN).ElVPP representa la probabilidad de que un paciente que ha sido diagnosticado positivamente padezca de hecho la enfermedad. El VPN representala probabilidadde que un paciente diagnosticadode forma negativa esté realmente sano.

En el caso del método de diagnóstico de fibrosis hepática en pacientes coinfectados con VIH y VHC, el VPP alcanza 87%yel VPN 88%.Es decir, quede 100 sujetos diagnosticados positivamente solo13 no padecerán fibrosis en realidadyde 100 sujetosdiagnosticados negativamente solo12 padecerán en realidad fibrosis hepática.

En el caso del método de diagnóstico de cirrosis hepática en pacientes coinfectados con VIH y VHC, el VPP alcanza 83%yel VPN el 98%. Es decir, que de 100 sujetos diagnosticados positivamente solo 17 no padecerán en realidad cirrosisyde 100 sujetos diagnosticados negativamente solo2padecerán cirrosis en realidad.

Para comprenderla importanciade del modelo predictivode diagnosticode fibrosisycirrosis enfermos con VCH

o VIHyVCH aquí descrito sírvase comparar los datos de los métodos aquí descritos con el modelo APRI (AST to PlateletRatioIndex)queestá basadoenelíndicederazón entreASTyplaquetas,dosdelosparámetrosutilizadosen los métodos de diagnostico de la presente invención.

La siguiente tabla1representa una comparación entreelvalor predictivo (VPPyVPN) del modelo APRIylos métodosdela presenteinvención enel diagnosticode fibrosisycirrosis en pacientes coinfectados con VIHyVHC:

TABLA1

Como resulta evidente el método de diagnostico de fibrosis de la presente invención posee un mayor valor predictivo que el modelo APRI para el diagnostico de fibrosis ya que reduce sustancialmente el número de falsos negativos.

No obstante, la diferencia más notable resulta del modelo predictivo de cirrosis donde el VPP pasa del 46% en el modeloAPRIal83%enel métodode diagnósticode cirrosisdela presenteinvención.Esto significaque antes,según el modelo APRI de cada 100 pacientes diagnosticados de cirrosis 54 no la padecían en realidad, lo cual resulta un porcentajemuyelevado.De acuerdoconelmétodode diagnosticode cirrosisdelainvencióneste porcentajedefalsos positivos se ha reducido solo a 17 de cada 100.

Portanto,losmétodosparael diagnósticode fibrosisycirrosisen pacientes infectadosconVHCo coinfectados con VIHyVHCdela presenteinvención son altamente fiables.

Otro aspecto de la presente invención es un kit de diagnóstico de fibrosis y/o cirrosis hepática en pacientes coinfectadosconVIHyVHCque comprende mediospara cuantificarlosvaloresdeMMP2,ASTyparael recuentode plaquetas de una muestra de un paciente de acuerdo con cualquiera de los métodos de cuantificación anteriormente descritos.

El kit está especialmente adaptado para el análisis de muestras de sangre suero o plasma.

Un objeto adicional de la invención es un programa de ordenador que comprende instrucciones para comparar los valoresde MMP2,ASTyel recuentodeplaquetaspreviamente determinados enun paciente infectado conVHCo coinfectado con VIHyVHC

a) frenteavaloresde referenciade pacientesinfectados conVHCqueno padecen fibrosis hepáticaopadecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)ode pacientes coinfectados conVIHyVHCqueno padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosishepáticaligera(F0oF1),y/o

b) frenteavaloresde referenciade pacientes infectados con VHCo coinfectados con VIHyVHC que padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3)

para inferirun diagnóstico estadísticamentesignificativoen dichospacientes con respectoala presenciao ausencia de fibrosis hepática así como el grado de la misma, cuando se ejecuta en un ordenador.

El programa de ordenador comprende la ejecución en un ordenador de un algoritmo basado en la introducción de tres parámetros medidos previamente en una muestra de sangre, suero o plasma en el paciente, que puede ser un paciente infectadode VHCo coinfectado con VIHyVHC. Estos parámetros sonelvalor MMP2 (ng/ml), AST (Ul/I) yel recuento de plaquetas (recuento 109/l).

Estos valores son comparados frente a:

a)valoresdereferenciadepacientes infectadosconVHCquenopadecenfibrosishepáticaopadecenfibrosis hepática ligera(F0oF1)ode pacientes coinfectados conVIHyVHCqueno padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1) y/o

b) frenteavaloresde referenciade pacientes infectados con VHCo coinfectados con VIHyVHC quepadecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3).

De esta comparación el programa de ordenador es capaz mediante un análisis estadístico de inferir la presencia o ausenciade fibrosisenun determinado paciente conVCHo coinfectado conVIHyVHCasí comode determinarel grado de la misma.

Otro objeto de la invención es un soporte físico que comprende almacenado el programa de ordenador anteriormente descrito. El programa soporte físico puede estar dentro de un ordenador como por ejemplo en un disco duro

o en cualquier otra forma de soporte de almacenamiento transportable mediante el cual pueda ser transferida a un ordenador como por ejemplo,un CD-ROM, un discode31/2, un llavero de memoria etc.

Un último objeto de la presente invención es un aparato electrónico que comprende un programa de ordenador comoel anteriormente descrito incorporadoyquees capazde ejecutarlo.El aparato electrónico tienelos mediospara introducir lasvariables relativasa los parámetros MMP2, ASTyrecuentode plaquetas.

Realización preferida de la invención

1-Pacientesymétodos

Diseño del estudio: Estudio transversal retrospectivo, llevado a cabo en la Unidad de Enfermedades Infecciosas del Hospital UniversitariodeValme,Sevilla, desde noviembrede 1999 hasta diciembrede 2006.

Criterios de inclusión: Los pacientes infectados por VIH vistos en nuestra Unidad se consideraron candidatos a entrar el este estudio si reunían los siguientes criterios:

1.

Infección por VHC confirmada por la detección de ARN del VHC en suero.

2.

Biopsia hepática disponible, extraída para estudiarla fibrosis como parte del protocolode cribadopara decidir el inicio del tratamiento frente al VHC.

3.

Suero congelado a -80ºC, nunca descongelado anteriormente, como máximo tres meses antes de la fecha de la biopsia hepática.

Criterios de exclusión: Se excluyeron los pacientes que presentaran otra causa de enfermedad hepática concomitante, como hepatopatías de origen autoinmune, vascular, biliar o tumoral.

Histología hepática: La fibrosis hepática se estadio siguiendo la clasificación de Scheuer del siguiente modo: Fibrosis ligerao ausente(hígadosinfibrosiso fibrosis portalsin septos lobares,F0yF1), fibrosis moderada (fibrosis portal con pocos septos, F2), fibrosis grave (septos numerosos con distorsión de la arquitectura hepática, pero sin cirrosis,F3),ycirrosis(F4).Lasbiopsias hepáticasde menosde15mmdelongitudseexcluyerondel estudio,excepto en los caso de diagnóstico de cirrosis. Un único patólogo experto evaluó todas las biopsias.

Biomarcadores séricos:Losnivelesséricosde TIMP-1yMMP-2 se determinaronen suero congeladoa -80ºC,y nunca descongelado anteriormente. Se utilizaron tests comerciales basados en una técnica de enzimo-inmunoensayo cuantitativo para medir los niveles séricos de TIMP-1(Quantikine®, Human TIMP-1Immunoassay, R&D Systems, Inc., MN, USA)yMMP-2(Quantikine®, Human/Mouse/Rat MMP-2(total) Immunoassay R&D Systems, Inc., MN, USA). Estos tests se llevarona cabo siguiendo las recomendaciones delfabricante.

Análisis estadístico:Lavariable desenlacefuela deteccióndeF≥2ydeF4 conuna combinacióndevariables enla fecha de la biopsia. Las variables independientes que se incluyeron fueron las siguientes: Edad, género, consumo de alcohol, glucosaen ayunas, alanina aminotransferasa(ALT),AST,gamma-glutamil-transpeptidasa(GGT), bilirrubina, colesterol, recuento de plaquetasyrecuento de células CD4, MMP-2, TIMP-1, cargas virales del VIHydel VHC,y genotipo del VHC.

Lasvariables categóricasseexpresaron como número (porcentaje)ylasvariables continuas como mediana(Q1-Q3). Las variables continuas se transformaron logarítmicamente para mejorar su distribución normal. Las variables categóricas se compararon usandoel testdela Chi-cuadradooel testexactode Fisher, según procediera.El testdela tde Student o el test de Mann-Whitneytest, si era apropiado, se usaron para comparar variables continuas. El test de Kruskal-Wallisse aplicóalas comparacionesdevariables continuas entrevarios grupos.Lasvariablesque presentaron asociaciones con un nivel de significación <0.2 en el análisis univariante se introdujeron en modelos multivariantes de regresión logística para establecer los predictores independientesdeF≥2yF4.

La ecuación de la regresión logística se testó como modelo predictivo. Se testó el rendimiento del modelo elaborado para diagnosticarF≥2parala deteccióndeF4.Elvalor diagnósticodel modeloseevaluó midiendolas áreasbajola curva característicade receptor-operador (receiver operating characteristic,ROC). Losvaloresde corte se seleccionaronapartirdelas curvasROCpara maximizarelVPPyelvalor predictivonegativo(VPN).Laexactituddiagnósticase calculóapartirdela sensibilidad,especificidad, VPPyVPN, considerandoF≥2yF4 como la enfermedad. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS 15 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.).

Cuestiones éticas:El estudiose realizóde acuerdoconla declaraciónde Helsinkiyseaprobóporel ComitéÉtico del Hospital UniversitariodeValme.

2-Resultados

Características de los pacientes

Noventapacientes infectadosporVIHyVHC cumplieronlos criteriosde inclusióndel estudio.Las características de los pacientes se resumen enlaTabla2. Cincuentaynueve (66%) individuos presentabanF≥2, 33 (37%)mostraban F3oF4,y18(20%)eranportadoresde cirrosisenlabiopsiahepática. Ochentay tres(92%)pacientes estabanen tratamiento antirretroviral, 68 (82%) de los cuales presentaban carga viral VIH indetectable en el momento de la biopsia.

(Tabla pasa a página siguiente) TABLA2

Características de la población (n=90)

Correlacionesde TIMP-1yMMP-2 conla fibrosis hepática

La mediana (Q1-Q3) de los niveles séricos de TIMP-1 eran 141.6 (126.4-171) ng/mly de MMP-2 eran 303.8 (255.5-369.9) ng/ml. Losniveles séricosde TIMP-1yMMP-2 segúnelestadiode fibrosis se muestran enla Figura1.Únicamente losnivelesdeMMP-2 se asociaron conla fibrosis hepática.

Eláreabajola curvaROC(intervalode confianza95%)delosniveles séricosdeTIMP-1fue0.57(0.44-0.69),y ladelosnivelesdeMMP-2fuede0.64(0.52-0.75)parael diagnósticodeF≥2. El área bajo la curvaROC (intervalo de confianza95%)delosniveles séricosdeTIMP-1fuede0.64(0.47-0.81),ladelosnivelesdeMMP-2fuede0.79 (0.67-0.93)parael diagnósticodeF4.Eláreabajola curvaROCdeTIMP-1tantopara detectarF≥2como F4 no fue significativamente distintade 0.5.El mejor puntode cortede MMP-2 para diagnosticarF≥2fue≥344 ng/ml.Veintey ocho(31%) pacientes se clasificaron comoF≥2empleando estepunto de corte. Cuatro (14%) de ellos mostraban F1 en la biopsia. El punto de corte de MMP-2 ≥344 dio lugar a un VPP de 86%. El mejor punto de corte de MMP-2 para detectar la cirrosisfue ≥500 ng/ml. Ocho (9%) sujetos se clasificaron como cirróticos utilizando este punto de corte. Tres (38%) de ellos fueron errores de clasificación, dos de ellos mostraban en la biopsia F2yuno F3. Este punto de corte diolugara un VPPde 63%yVPNde 87%. Once (11%) pacientes con cirrosis mostraronnivelesde MMP-2por debajo de 500 mg/ml.

Modelos para predecir la fibrosis

Fibrosis significativa.LosnivelesdeASTyMMP-2yel recuentode plaquetasse asociaron conla fibrosis (Figura 1)y se identificaron como predictores independientes deF≥2 (Tabla 3). Se elaboró un modelo combinando estos parámetros aplicando una constanteala ecuaciónde regresión logística:2+ 1.54 × In (MMP-2, ng/ml)+ 0.89 × In (AST, IU/I) -2.78 × In (recuento de plaquetas, 109/l). Este modelo mostró un área bajo la curvaROC (intervalo de confianza) de 0.74 (0.63-0.85). Se eligieron dos puntos de corte para identificarla ausencia (puntuación ≤1.5)yla presencia (puntuación ≥3.5) deF≥2(Figura 2). Utilizando el punto de corte más bajo (puntuación≤1.5), se clasificó correctamentea siete (23%)de los31 sujetos sinF≥2enla biopsia hepática(Tabla4).La presenciadeF≥2se podría excluir con una certeza del 88%. Uno (13%) de los ocho pacientes con una puntuación ≤1.5 presentaba F2 en la biopsia (Tabla 4). Utilizando elpunto de corte más alto (puntuación ≥3.5), se identificaron 23 (26%) pacientes.Tres (10%) de ellos mostraron F1 en la biopsia hepática. Finalmente, se podría evitar la biopsia hepática en un total de 31 (34%) empleando estos puntos de corte.

(Tabla pasa a página siguiente)

ES2349 836A1

Cirrosis. Losnivelesde ASTyMMP-2yel recuentode plaquetas se asociaron independientemente conF4(Tabla 5). El mismo modelo combinando estas variables para diagnosticar F≥2 se evaluó para detectar F4. Este modelo mostróunáreabajola curvaROC(intervalode confianza95%)de0.88(0.78-0.97).Se seleccionóelmejorpuntode corte para identificar la ausencia (puntuación ≤2.66)yla presencia (puntuación ≥4.28) de cirrosis (Figura 2). Se pudo excluir la presencia de cirrosis con una certeza del 98% utilizando el punto de corte más bajo (Tabla 5). Uno (2%) de los 46 pacientes con una puntuación ≤2.66 tenía F4 en la biopsia hepática (Tabla 6). Aplicando el punto de corte más alto, se podría detectar la cirrosis con una probabilidad del 83%. Diez (63%) de los 16 cirróticos se diagnosticaron correctamente. Dos (17%) de los pacientes con una punto de corte ≥4.28 no mostraron F4 en la biopsia, uno tenía F2 yel otro F3.

ES2349 836A1 ES2349 836A1 ES2349 836A1

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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de cuantificación para su uso en el diagnóstico de la fibrosis hepática en pacientes infectados VHC o en pacientes coinfectados conVIHyVHC que comprende:

   a) determinar conjuntamente losvaloresde MMP2, ASTyel recuentode plaquetasde una muestrade un paciente infectado VHCo coinfectado con VIHyVHC,

   b) compararlosvalores obtenidosena) frenteavaloresde referenciade pacientes infectados conVHCque no padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)o coinfectadosconVIHyVHC que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1).

2. 2.

   Método de acuerdo con la reivindicación1donde la determinación de MMP2, ASPyel recuento de plaquetas se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas.

3. 3.

   Métodode acuerdo conlareivindicación2donde dichas técnicas inmunoquímicas comprenden radioinmunoensayo, ELISA, inmunofluorescencia, western blot o citometría de flujo.

4. 4.

   Métodode acuerdo con cualquieradelasreivindicaciones anteriores dondela muestraes unamuestrade sangre, suero o plasma.

5. 5.

   Métododediagnósticodela fibrosishepáticaen pacientes infectadosVHCoen pacientescoinfectados conVIH yVHC que comprende:

   a) cuantificar losvaloresde MMP2, ASTydel recuentode plaquetas en una muestrade acuerdo con cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-4,

   b) determinarlapresenciadeunavariaciónconjuntadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentodeplaquetas,

   caracterizado porque unavariación conjunta significativade todosy cada unode losvaloresde MMP2, AST ydel recuento de plaquetas frente a dichos valores de referenciaen pacientes infectados con VHC que no padecen fibrosishepáticao padecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)oen pacientes coinfectados conVIHyVHCqueno padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepáticaligera(F0oF1), implicala presenciade fibrosis hepáticaen dicho paciente infectado conVHCo coinfectado con VIHyVHC.

6. 6.

   Métodode acuerdo conla reivindicación5donde dichavariación conjunta significativade todosycada unode losvaloresde MMP2,ASTydel recuentode plaquetas frentea dichosvaloresde referenciaen pacientes infectados conVHCqueno padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)oen pacientes coinfectadoscon VIHyVHCqueno padecen fibrosis hepáticao padecen fibrosis hepáticaligera(F0oF1), resultandoenla presencia de fibrosis hepática del paciente infectado con VHCo coinfectado con VIHyVHC, comprende un aumento enlos valoresde MMP2yASTyeldescenso enel recuentode plaquetas en una muestra.

7. 7.

   Método de cuantificación para su uso en el diagnóstico de cirrosis hepática en pacientes infectados con VHC o en pacientes coinfectados con VIHyVHC que comprende:

   a) determinar conjuntamente losvaloresde MMP2, ASTyel recuentode plaquetasde una muestrade un paciente infectado con VHCo coinfectado con VIHyVHC,

   b) comparar los valores obtenidos en a) frente a valores de referencia de pacientes infectados VHC que padecen como máximo una fibrosis hepáticagrave(F0,F1,F2oF3)o coinfectados conVIHyVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3).

8. 8.

   Métodode acuerdo conla reivindicación7dondeladeterminaciónde MMP2, ASTyplaquetas se llevaa cabo por medio de de técnicas inmunoquímicas.

9. 9.

   Métodode acuerdo conalreivindicación8donde dichas técnicas inmunoquímicas comprenden radioinmunoensayo, ELISA, inmunofluorescencia, western blot o citometría de flujo.

10. 10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9 donde la muestra es una muestra de sangre, suero

    o plasma.
11. 11. Método de diagnóstico de la cirrosis hepática en pacientes infectados VHC o en pacientes coinfectados con VIHyVHC que comprende:

    a) cuantificar losvaloresde MMP2, ASTydel recuentode plaquetas en una muestrade acuerdo concualquiera de los métodos de las reivindicaciones 7-10,

    b) determinarlapresenciadeunavariación conjuntadelosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentodeplaquetas

    caracterizado porque unavariación conjunta significativade todosycada unode losvaloresde MMP2, ASTy del recuento de plaquetas frente a dichos valores de referencia en pacientes infectados con VHC que padecen como máximo una fibrosishepáticagrave(F0,F1,F2oF3)oen pacientes coinfectados conVIHyVHCque padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3) implica que dicho paciente infectado con VHC o coinfectado con VIHyVHC padece cirrosis hepática.
12. 12. Métodode acuerdo conlareivindicación11 donde dichavariación conjunta significativade todosycada uno delosvaloresdeMMP2,ASTydel recuentode plaquetas frentea dichosvaloresde referenciaenpacientes infectados con VHC que padecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3) o en pacientes coinfectados con VIHyVHCque padecen comomáximo una fibrosis hepáticagrave(F0,F1,F2oF3), resultandoenla presenciade cirrosishepática del paciente infectado con VHCo del paciente coinfectado con VIHyVHC, comprendeel aumento en losvaloresde MMP2yASTyel descenso enel recuentode plaquetas en una muestra.
13. 13.Kitde diagnósticode fibrosisy/o cirrosishepáticaen pacientes coinfectados conVIHyVHCque comprende un anticuerpo contra MMP-2ylos mediospara cuantificar ASTyparael recuentode plaquetasde una muestrade un pacientede acuerdo con cualquierade los métodosde las reivindicaciones 1-4y7-10.

14. 14.

    Kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 13 caracterizado porque comprende un anticuerpo contra MMP-2ylos medios para cuantificar ASTyparael recuentode plaquetasde una muestrade sangre sueroo plasma.

15. 15.

    Un programa de ordenador que comprende instrucciones para comparar los valores de MMP2, AST y el recuentode plaquetas previamente determinados en un paciente infectado con VHCo coinfectado con VIHyVHC

    a) frenteavaloresde referenciade pacientesinfectados conVHCqueno padecen fibrosis hepáticaopadecen fibrosis hepática ligera(F0oF1)ode pacientes coinfectados conVIHyVHCqueno padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (F0 o F1), y/o

    b) frenteavaloresde referenciade pacientes infectados con VHCo coinfectados con VIHyVHC quepadecen como máximo una fibrosis hepática grave (F0, F1, F2 o F3)

    para inferirun diagnóstico estadísticamentesignificativoen dichos pacientes con respectoala presenciao ausencia de fibrosis hepática así como el grado de la misma, cuando se ejecuta en un ordenador.
16. 16.Un soporte físico que comprende almacenado un programade ordenadorde acuerdo conla reivindicación 15.
17. 17.Un aparato electrónicoque comprendeunsoporte físicode acuerdo conlareivindicación16 incorporadoyque es capaz de ejecutar un programa de ordenador de acuerdo con la reivindicación 15.

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud:200930115

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 29.04.2009

    Fecha de prioridad: 00-00-0000

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A

    FR 2870349 A1 (UNIVERSITÉ D'ANGERS ET CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE D'ANGERS) 18.11.2005 páginas 8, líneas 15-19,30-36; página 9, línea 37 -página 10, línea 27,29-35; página 13, líneas 4-7; página 16, líneas 17-22; reivindicación 1. 1-17

    A

    ADAMS L. A., et al. &quot;Hepascore: An accurate validated predictor of liver fibrosis in chronic hepatitis C infection.&quot; Clinical Chemistry (2005) 51:10 1967-1873. Páginas 1867-1868. 1-17

    A

    MANNING D. S. y AFDHAL N. H. &quot;Diagnosis and quantification of fibrosis.&quot; Gastroenterology (2008) Vol. 134, páginas 1670-1681. Páginas 1671-1672 y 1675. 1-17

    A

    STAUBER R. E. y LACKNER C. &quot;Noninvasive diagnosis of hepatic fibrosis in chronic hepatitis C.&quot; World Journal of Gastroenterology (2007) Vol. 13, páginas 4287-4294. Páginas 4288-4289. 1-17

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº: TODAS

    Fecha de realización del informe 24.11.2010

    Examinador M. García Bueno Página 1/5

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud:200930115

    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD G01N33/68 (2006.01)

    C12Q1/37 (2006.01) C12Q1/48 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    G01N, C12Q

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, TXTF, MEDLINE, BIOSIS, NPL, XPESP, EMBASE, EMBL ALL.

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud:200930115

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita:

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-17 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-17 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud:200930115

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    FR 2870349 A1 (UNIVERSITÉ D'ANGERS ET CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE D'ANGERS) 18.11.2005

    D02

    ADAMS L. A., et al. &quot;Hepascore: An accurate validated predictor of liver fibrosis in chronic hepatitis C infection.&quot; Clinical Chemistry (2005) 51:10 1967-1873. 2005

    D03

    MANNING D. S. AND AFDHAL N. H. &quot;Diagnosis and quantification of fibrosis.&quot; Gastroenterology (2008) Vol. 134, pages 1670-1681. 2008

    D04

    STAUBER R. E. AND LACKNER C. &quot;Noninvasive diagnosis of hepatic fibrosis in chronic hepatitis C.&quot; World Journal of Gastroenterology (2007) Vol. 13, pages 4287-4294 2007

18. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La presente solicitud de invención consiste en un método de cuantificación de la fibrosis hepática y/o la cirrosis en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC que comprende determinar conjuntamente los valores de MMP2, AST, y el recuento de plaquetas del paciente, en una muestra de sangre, suero o plasma, mediante técnicas inmunológicas, y comparar los valores obtenidos frente a valores de referencia de pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (reivindicaciones 1-4), o padecen como máximo una fibrosis hepática grave (reivindicaciones 7-10).

    La presente solicitud de invención también consiste en un método de diagnóstico de la fibrosis hepática y/o la cirrosis en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC que comprende determinar los valores de MMP2, AST y del recuento de plaquetas, y determinar la presencia de una variación conjunta de dichos valores frente a valores de referencia, que comprende un aumento de los valores MMP2 y AST y el descenso en el recuento de plaquetas, en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC que no padecen fibrosis hepática o padecen fibrosis hepática ligera (reivindicaciones 5-6), o padecen como máximo una fibrosis hepática grave (reivindicaciones 11-12).

    Por último, la presente solicitud de invención también consiste en un kit de diagnóstico de fibrosis y/o cirrosis (reivindicaciones 13-14), y un programa de ordenador para inferir un diagnóstico estadísticamente significativo (reivindicaciones 15-17).

    El documento D01 divulga método de diagnóstico de la fibrosis hepática que comprende determinar diferentes marcadores de fibrosis directos, asociados a unos marcadores indirectos puestos en una combinación específica, en una muestra de sangre, serum o plasma, entre otros (ver página 8, líneas 15-19 y 30-36, página 16, líneas 17-22 y reivindicación 1). Para determinar el grado de fibrosis se mide en una muestra del sujeto al menos tres variables elegidas de un grupo de marcadores entre los que se encuentran plaquetas, AST y MMP-2 (ver página 9, línea 37-página 10, línea 27). La medida de estos marcadores se realiza mediante técnicas inmunológicas (ver página 13, líneas 4-7).

    El documento D01 también divulga un kit de diagnóstico de fibrosis hepática (ver página 10, líneas 29-35).

    El documento D02 divulga marcadores séricos, utilizados de forma individual o en combinación, como medida rutinaria para diagnosticar fibrosis en pacientes con hepatitis C. El recuento de plaquetas, la proporción de AST/ALT, o una combinación de AST y recuento de plaquetas son indicadores fiables de la cirrosis, pero su valor predictivo para la fibrosis leve o moderada no es suficiente para ser de utilidad clínica.

    Existen marcadores bioquímicos más sofisticados asociados al colágeno y la matriz extracelular. Las concentraciones séricas de ácido hialurónico, el tejido inhibidor de la metaloproteasa-1 (TIMP-1), y la metaloproteasa de matriz extracelular 2 (MMP-2) se correlacionan con la fibrosis hepática, pero tienen bajo valor predictivo para el diagnóstico de la fibrosis de forma significativa (ver páginas 1867-1868).

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud:200930115

    El documento D03 divulga una revisión de 14 estudios de biomarcadores de la fibrosis en pacientes con hepatitis C crónica, entre los que se encuentran el recuento de plaquetas, AST y metaloproteasas de matriz extracelular, entre otros (ver página 1671-1672, 1675).

    El documento D04 divulga pruebas indirectas de la fibrosis que consisten en la medida de marcadores indirectos de la fibrosis hepática, entre los que se encuentran, los marcadores AST/ALAT y el recuento de plaquetas, y test directos de fibrosis, entre los que se encuentra el marcador MMP-2, entre otros, para el diagnóstico de la fibrosis hepática (ver páginas 4288-4289).

    La invención reivindicada difiere principalmente de los documentos citados en que ninguno de los documentos citados muestra un método basado en el valor predictivo combinado de los tres valores de los marcadores séricos MMP2, AST y el recuento de plaquetas en pacientes infectados con VHC o coinfectados con VIH y VHC.

    Así, la invención reivindicada implica un efecto mejorado comparado con el estado de la técnica. Además, no se considera obvio que un experto en la materia obtenga la invención a partir de los documentos mencionados anteriormente. Por lo tanto, los documentos D01, D02, D03 y D04 son solo documentos que reflejan el estado de la técnica. En consecuencia la invención es nueva y se considera que implica actividad inventiva y que tiene aplicación industrial.

    1.-NOVEDAD (Art. 6 Ley 11/1986) Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 8 Ley 11/1986).

    Las reivindicaciones 1-17 parecen ser nuevas e implican actividad inventiva en el sentido de los artículos 6 y 8 de la Ley 11/1986.

    Informe del Estado de la Técnica Página 5/5