ES2344932B1 - METHOD FOR THE DETECTION OF CANCER OF BLADDER. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección de cáncer de vejiga.Method for the detection of cancer bladder.
La presente invención se refiere a un método y kit para la detección de cáncer de vejiga mediante la determinación del nivel de expresión de la cadena beta de la proteína del complemento C4A.The present invention relates to a method and Bladder cancer detection kit by determination of the expression level of the protein beta chain C4A complement.
Description
Método para la detección de cáncer de vejiga.Method for the detection of cancer bladder.
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La presente invención se encuadra en general en el campo de la biomedicina y en particular se refiere a un método y kit para la detección del cáncer de vejiga.The present invention is generally framed in the field of biomedicine and in particular refers to a method and Bladder cancer detection kit.
El cáncer de vejiga es uno de los tipos de cáncer más frecuentes, siendo el cuarto cáncer más frecuente en hombres y el octavo en mujeres, representado aproximadamente el 5% del total de los cánceres diagnosticados en Estados Unidos (A. Jemal, T. Murray, A. Samuels, A. Ghafoor, E. Ward, M.J. Thun, CA Cáncer J Clin 53 (2003) 5). De éstos, más del 90% son carcinomas transicionales (TCC) (E.M. Messing, T.B. Young, V.B. Hunt, K.W. Gilchrist, M.A. Newton, L.L. Bram, W.J. Hisgen, E.B. Greenberg, M.E. Kuglitsch, J.D. Wegenke, Urology 45 (1995) 387), (J.P. Stein, G.D. Grossfeld, D.A. Ginsberg, D. Esrig, J.A. Freeman, A.J. Figueroa, D.G. Skinner, R.J. Cote, J Urol 160 (1998) 645). Alrededor del 75% de los casos diagnosticados son superficiales y pueden ser extirpados sin demasiadas complicaciones mientras que el 25% restante son de carácter invasivo (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528). En estos casos la detección precoz condicionaría el tratamiento y mejoraría las expectativas de los pacientes. Además, el índice de recurrencia del cáncer de vejiga es del os más elevados por lo que los. pacientes suelen ser sometidos a controles periódicos tras la primera aparición. La detección precoz de los tumores invasivos así como de los recurrentes, que frecuentemente revisten mayor gravedad que los primariamente detectados, sería de una enorme utilidad para aumentar las expectativas de los pacientes.Bladder cancer is one of the types of most frequent cancer, being the fourth most frequent cancer in men and the eighth in women, represented approximately 5% of all cancers diagnosed in the United States (A. Jemal, T. Murray, A. Samuels, A. Ghafoor, E. Ward, M.J. Thun, CA Cancer J Clin 53 (2003) 5). Of these, more than 90% are carcinomas Transitional (CBT) (E.M. Messing, T.B. Young, V.B. Hunt, K.W. Gilchrist, M.A. Newton, L.L. Bram, W.J. Hisgen, E.B. Greenberg, M.E. Kuglitsch, J.D. Wegenke, Urology 45 (1995) 387), (J.P. Stein, G.D. Grossfeld, D.A. Ginsberg, D. Esrig, J.A. Freeman, A.J. Figueroa, D.G. Skinner, R.J. Cote, J Urol 160 (1998) 645). About 75% of the cases diagnosed are superficial and can be removed without too many complications while 25% The remaining are invasive (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528). In these cases early detection would condition the treatment and improve the expectations of patients In addition, the bladder cancer recurrence rate is of the highest ones as far as the. patients are usually subjected to periodic checks after the first appearance. Early detection of invasive tumors as well as recurrent tumors, which they are often more serious than those primarily detected, it would be very useful to increase patient expectations
En la actualidad, el diagnóstico más seguro se realiza mediante cistoscopia y biopsia. Ambos métodos son invasivos, complicados y costosos. Es por ello que el coste por paciente de cáncer de vejiga desde su detección hasta su muerte sea el más alto de todos los tipos de cáncer (G.F. Riley, A.L. Potosky, J.D. Lubitz, L.G. Kessler, Med.Care 33 (1995) 828), (H. Hedelin, S. Holmang, L. Wiman, Scand J Urol Nephrol 36 (2002) 344), (M.F. Botteman, C.L. Pashos, A. Redaelli, B. Laskin, R. Hauser, Pharmacoeconomics 21 (2003) 1315). El diagnóstico no invasivo más utilizado es la citología de orina. Aunque tiene una alta especificidad presenta una baja sensibilidad y alta variabilidad dependiendo del patólogo que realice en examen (M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, M.C. Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595). Recientemente se han descrito nuevos marcadores, algunos de ellos aprobados por la Food and Drug Administration de Estados Unidos, que han mostrado una alta sensibilidad (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528), (M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, M.C. Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595), (V.B. Lokeshwar, T. Habuchi, H.B. Grossman, W.M. Murphy, S.H. Hautmann, G.P. Hemstreet, 3rd, A.V. Bono, R.H. Getzenberg, P. Goebell, B.J. Schmitz-Drager, J.A. Schalken, Y. Fradet, M. Marberger, E. Messing, M.J. Droller, Urology 66 (2005) 35), (H.B. Grossman, M. Soloway, E. Messing, G. Katz, B. Stein, V. Kassabian, Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (B.W. van Rhijn, H.G. van der Poel, T.H. van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736). No obstante, la relativamente baja especificidad y reproducibilidad hacen que la cistoscopia y la citología sean todavía las técnicas más utilizadas (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528), ((M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, M.C. Benson, i. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595), (V.B. Lokeshwar, T. Habuchi, H.B. Grossman, W.M. Murphy, S.H. Hautmann, G.P. Hemstreet, 3rd, A.V. Bono, R.H. Getzenberg, P. Goebell, B.J. Schmitz-Drager, J.A. Schalken, Y. Fradet, M. Marberger, E. Messing, M.J. Droller, Urology 66 (2005) 35), (H.B. Grossman, M. Soloway, E. Messing, G. Katz, B. Stein, V. Kassabian, Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (B.W. van Rhijn, H.G. van der Poel, T.H. van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736), (H. Boman, H. Hedelin, S. Holmang, J Urol 167 (2002) 80). El funcionamiento y utilidad de estos marcadores también difiere según se trate de una detección primaria o durante el seguimiento de los pacientes ya diagnosticados. Hasta el momento, los resultados obtenidos no justifican su utilización de forma generalizada ya que, si bien suelen ser más sensibles que la citología urinaria, su grado de especificidad está por debajo.Currently, the safest diagnosis is made by cystoscopy and biopsy. Both methods are invasive, complicated and expensive. That is why the cost per patient of bladder cancer from detection to death is the highest of all types of cancer (GF Riley, AL Potosky, JD Lubitz, LG Kessler, Med.Care 33 (1995) 828) , (H. Hedelin, S. Holmang, L. Wiman, Scand J Urol Nephrol 36 (2002) 344), (MF Botteman, CL Pashos, A. Redaelli, B. Laskin, R. Hauser, Pharmacoeconomics 21 (2003) 1315 ). The most commonly used non-invasive diagnosis is urine cytology. Although it has a high specificity, it has a low sensitivity and high variability depending on the pathologist who performs the exam (M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, MC Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000 ) 595). New markers have recently been described, some of them approved by the United States Food and Drug Administration , which have shown high sensitivity (VB Lokeshwar, MG Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528), (M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, MC Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595), (VB Lokeshwar, T. Habuchi, HB Grossman, WM Murphy, SH Hautmann, GP Hemstreet, 3rd, AV Bono, RH Getzenberg, P. Goebell, BJ Schmitz-Drager, JA Schalken, Y. Fradet, M. Marberger, E. Messing, MJ Droller, Urology 66 (2005) 35), (HB Grossman, M. Soloway, E Messing, G. Katz, B. Stein, V. Kassabian, Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (BW van Rhijn, HG van der Poel, TH van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736) . However, the relatively low specificity and reproducibility make cystoscopy and cytology the most commonly used techniques (VB Lokeshwar, MG Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528), ((M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille, MC Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595), (VB Lokeshwar, T. Habuchi, HB Grossman, WM Murphy, SH Hautmann, GP Hemstreet, 3rd, AV Bonus, RH Getzenberg, P. Goebell, BJ Schmitz-Drager, JA Schalken, Y. Fradet, M. Marberger, E. Messing, MJ Droller, Urology 66 (2005) 35), (HB Grossman, M. Soloway, E. Messing, G Katz, B. Stein, V. Kassabian, Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (BW van Rhijn, HG van der Poel, TH van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736), (H. Boman, H. Hedelin, S. Holmang, J Urol 167 (2002) 80) The functioning and usefulness of these markers also differs depending on whether it is a primary detection or during the follow-up of patients already diagnosed. results obtained do not justify its use in general since, although they tend to be more sensitive than urinary cytology, their specificity level is below.
La búsqueda de nuevos biomarcadores de cáncer de vejiga sigue teniendo, por tanto, un gran interés médico y de salud pública.The search for new cancer biomarkers of Bladder still has, therefore, a great medical and health interest public
La presente invención proporciona un método de diagnóstico de cáncer de vejiga de forma sencilla y fiable, de tal forma que puede ser incluido en la práctica clínica habitual.The present invention provides a method of diagnosis of bladder cancer simply and reliably, in such a way form that can be included in the usual clinical practice.
Así pues en primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para la detección de cáncer de vejiga que comprendeThus, in the first aspect, the present invention relates to an in vitro method for the detection of bladder cancer comprising
- a)to)
- analizar una muestra obtenida de un paciente,analyze a sample obtained from a patient,
- b)b)
- determinar el nivel de expresión de la cadena beta de la proteína de complemento C4A,determine the level of expression of the C4A complement protein beta chain,
- c)C)
- comparar dicho nivel de expresión con un valor control,compare said level of expression with a control value,
donde la alteración del nivel de expresión de dicha proteína es indicativo de cáncer de vejiga.where the alteration of the level of expression of said protein is indicative of cancer of bladder.
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En un aspecto más en particular, el término "alteración del nivel de expresión" tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a la expresión anormalmente alta de la cadena beta de la proteína de complemento C4A comparado con un valor control. En un aspecto más en particular, la proteína expresa de 3 a 15 veces más en las muestras tumorales que las muestras control. En un aspecto más en particular, la proteína se expresa 10 veces más en las muestras tumorales que en las muestras control.In a more particular aspect, the term "alteration of the level of expression" as used in the present invention, refers to the abnormally high expression of the C4A complement protein beta chain compared to a control value In a more particular aspect, the express protein 3 to 15 times more in tumor samples than samples control. In a more particular aspect, the protein is expressed. times more in tumor samples than in control samples.
Por valor control en la presente invención, nos referimos a un valor obtenido de muestras sin cáncer de vejiga y sin ninguna otra enfermedad.For control value in the present invention, we we refer to a value obtained from samples without bladder cancer and without No other illness.
En un aspecto más en particular, en el método de la presente invención, el nivel de expresión de la cadena beta de la proteína de complemento C4A se determina mediante técnicas de inmunoquímica. A título ilustrativo y sin que se limite el alcance de la invención, el término "técnicas inmunoquímicas" tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a: ELISA, Western blot, biochips o microarrays de proteínas, o cualquier otra técnica que incluya anticuerpos específicos frente a la cadena beta de la proteína de complemento C4A.In a more particular aspect, in the method of the present invention, the level of expression of the beta chain of the C4A complement protein is determined by techniques of immunochemistry By way of illustration and without limiting the scope of the invention, the term "immunochemical techniques" such and As used in the present invention, it refers to: ELISA, Western blot, biochips or protein microarrays, or any other technique that includes specific antibodies against the beta chain of complement protein C4A.
En un aspecto más en particular de la presente invención, el nivel de la cadena beta de la proteína de complemento C4A se determina mediante anticuerpos policlonales. En otro aspecto más en particular, el método de la presente invención se realiza mediante anticuerpos monoclonales.In a more particular aspect of the present invention, the level of the complement protein beta chain C4A is determined by polyclonal antibodies. In another aspect more particularly, the method of the present invention is performed by monoclonal antibodies.
El término "muestra" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere pero no se limita, a tejidos y/o fluidos (sangre, orina). En un aspecto más en particular de la presente invención, la muestra obtenida del paciente es un fluido, más en particular, es orina, y más en particular es la fracción celular de la orina. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección de cáncer de vejiga que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método descrito en la presente invención.The term "sample" as used in the present invention it refers but is not limited to tissues and / or fluids (blood, urine). In a more particular aspect of the present invention, the sample obtained from the patient is a fluid, more in particular, it is urine, and more in particular is the fraction urine cell In a second aspect, the present invention is refers to a kit for the detection of bladder cancer comprising the reagents necessary to carry out the method described in the present invention
La figura 1 muestra el gel de electroforesis bidimensional.Figure 1 shows the electrophoresis gel two-dimensional
La figura 2 se refiere a la cuantificación de la cadena beta de la proteína de complemento C4A mediante el análisis DIGE para cada una de las bandas (spots) de la proteína: 2A: Average ratio (tumor/control). 14.35, t-test: 0.0122; presente en 8 de 9 geles, 2B: Average ratio (tumor/control). 13.39, t-test: 0.0134; presente en 9 de 9 geles, 2C: Average ratio (tumor/control). 17.72, t-test: 0.0095; presente en 8 de 9 geles, 2D: Average ratio (tumor/control). 10.51, t-test: 0.0122; presente en 9 de 9 geles.Figure 2 refers to the quantification of the C4A complement protein beta chain by analysis DIGE for each of the protein bands (spots): 2A: Average ratio (tumor / control). 14.35, t-test: 0.0122; present in 8 of 9 gels, 2B: Average ratio (tumor / control). 13.39, t-test: 0.0134; present in 9 of 9 gels, 2C: Average ratio (tumor / control). 17.72, t-test: 0.0095; present in 8 of 9 gels, 2D: Average ratio (tumor / control). 10.51, t-test: 0.0122; present in 9 of 9 gels.
La figura 3 muestra el resultado del Western blot. C1, C2, C3 y C4 se refieren a las muestras control, T1, T2, T3, T4 y T5 se refieren a las muestras obtenidas de los pacientes con tumor de vejiga, a) muestra los resultados después de un minuto de exposición y b) muestra los resultados tras tres minutos de exposición.Figure 3 shows the Western result blot C1, C2, C3 and C4 refer to control samples, T1, T2, T3, T4 and T5 refer to samples obtained from patients with bladder tumor, a) show results after one minute of exposure and b) show the results after three minutes of exposition.
Mediante técnicas de proteómica, en concreto mediante la metodología DIGE detectamos que la cadena beta de la proteína de complemento C4A tenía una expresión diferencial en pacientes con cáncer de vejiga y en pacientes control o sanos.Through proteomics techniques, specifically using the DIGE methodology we detect that the beta chain of the C4A complement protein had a differential expression in Bladder cancer patients and in control or healthy patients.
Las muestras se obtuvieron en el Servicio de Urología del Hospital Lluís Alcanyís de Xátiva (Valencia) tras la correspondiente aprobación de su Comité Ético y el consentimiento informado de los pacientes.Samples were obtained from the Service of Urology of Lluís Alcanyís Hospital in Xátiva (Valencia) after the corresponding approval of its Ethical Committee and consent informed of patients.
Se utilizaron muestras de orina de 10 sujetos control, 10 pacientes diagnosticados con carcinoma transicional de vejiga que todavía no habían recibido tratamiento y 10 pacientes con tumores recurrentes.Urine samples from 10 subjects were used control, 10 patients diagnosed with transitional carcinoma of bladder who had not yet received treatment and 10 patients with recurring tumors
Las muestras de orina recién colectadas se fijaron añadiendo etanol al 15% (v/v final) y se mantuvieron a 4ºC hasta su procesamiento. Posteriormente, el componente celular se concentró mediante centrifugación a 1000 g x 45 min a 4ºC. El sobrenadante se congeló a -20ºC hasta su utilización. El sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón PBS (Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,2.) y se pasó a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. A continuación se creó un colchón de sacarosa depositando 100 \mul de sacarosa 250 mM en el fondo del tubo y se centrifugó a 13400 g x 50 min 4ºC. En estas condiciones, sólo el componente celular atravesó la solución de sacarosa. Las células se lavaron nuevamente en PBS. El sedimento se congeló a -20ºC hasta su utilización.Freshly collected urine samples are fixed by adding 15% ethanol (final v / v) and kept at 4 ° C Until processing. Subsequently, the cellular component is concentrated by centrifugation at 1000 g x 45 min at 4 ° C. He supernatant was frozen at -20 ° C until use. Sediment it was resuspended in 1 ml of PBS buffer (4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.2.) And passed to a 2 ml microcentrifuge tube. Next, a sucrose mattress depositing 100 µl of 250 mM sucrose in the bottom of the tube and centrifuged at 13400 g x 50 min 4 ° C. In these conditions, only the cellular component went through the solution of saccharose. The cells were washed again in PBS. The sediment is froze at -20 ° C until use.
Las células purificadas se lisaron en tampón de lisis (urea 7M, tiourea 2 M, CHAPS 4% y Tris 20 mM) mediante homogeneización mecánica en un tubo microcentrífuga de 1,5 ml seguido de varios pulsos breves de sonicación para romper el DNA. A continuación se precipitaron las proteínas para la eliminación de sales y otras sustancias que interfieren con el mareaje y la electroforesis usando el kit 2-D Clean-Up de GE Healthcare siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se resuspendieron en tampón de lisis y se determinó la concentración mediante el método de Bradford (BioRad Protein ASsay), usando immunoglobulina gamma como estándar. El mareaje de las muestras con los fluoróforos CyDye DIGE Fluor de GE Healthcare se realizó siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. La mitad de las muestras de cada grupo se marcaron con Cy3 y la otra mitad con Cy5. El estándar interno se preparó mediante mezcla a partes iguales de todas las muestras y se marcó con Cy2. El mareaje se realizó incubando en hielo y en oscuridad 50 \mug de proteína y 400 pmoles de fluoróforo durante 30 minutos. La reacción de mareaje se terminó incubando las muestras con lisina durante 10 minutos. Posteriormente se mezclaron para cada gel 50 \mug de proteína marcada con cada uno de los fluoróforos según la siguiente tabla (C: control; T: tumor primario; R: tumor recurrente; S: estándar interno):The purified cells were lysed in buffer lysis (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS and 20 mM Tris) by mechanical homogenization in a 1.5 ml microcentrifuge tube followed by several brief sonication pulses to break the DNA. TO proteins were then precipitated for the elimination of salts and other substances that interfere with dizziness and electrophoresis using the 2-D kit GE Healthcare Clean-Up following the manufacturer's instructions Proteins were resuspended in lysis buffer and the concentration was determined by the method from Bradford (BioRad Protein ASsay), using gamma immunoglobulin as standard The marking of samples with CyDye fluorophores DIGE Fluor from GE Healthcare was performed following the procedure recommended by the manufacturer. Half of the samples of each group were marked with Cy3 and the other half with Cy5. The standard internal was prepared by mixing in equal parts of all samples and marked with Cy2. The marking was done by incubating in ice and dark 50 \ mug of protein and 400 pmoles of fluorophore for 30 minutes. The tidal reaction is over incubating the samples with lysine for 10 minutes. Later 50 µg of labeled protein was mixed for each gel one of the fluorophores according to the following table (C: control; T: primary tumor; R: recurrent tumor; S: internal standard):
A continuación se realizó una electroforesis bidimensional. En la 1ª dimensión, isoelectroenfoque (IEF), las proteínas se separaron por punto isoeléctrico en tiras Immobiline DryStrips de 24 cm, rango de pH 3-10 (NL). Para ello primero se hidrataron las tiras durante 20 horas en urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, DeStreak (12 \mul/ml) y 1% de tampón IPG (rango de pH 3-10). La muestra se cargó en la tira por el procedimiento de cup loading anódico. La separación se realizó según el siguiente protocolo: Step 300V 3h, Gradiente 1000V 6h, Gradiente 8000V 3h, Step 8000V 32000 Vh a 20ºC.Next, a two-dimensional electrophoresis was performed. In the 1st dimension, isoelectric focusing (IEF), the proteins were separated by isoelectric point into Immobiline DryStrips strips of 24 cm, pH range 3-10 (NL). For this, the strips were first hydrated for 20 hours in 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, DeStreak (12 µL / ml) and 1% IPG buffer (pH range 3-10). The sample was loaded into the strip by the anodic cup loading procedure. The separation was performed according to the following protocol: Step 300V 3h, Gradient 1000V 6h, Gradient 8000V 3h, Step 8000V 32000 Vh at 20 ° C.
En la 2ª dimensión, SDS-PAGE, la separación se realizó en función del peso molecular. Para ello se utilizaron geles de 25 cm x 21 cm del 12.5% acrilamida. La electroforesis se desarrolló a 2 w/gel durante 1 hora y a 15 w/gel durante 5 horas. Tras la electroforesis los geles se escanearon para cada uno de los tres fluoróforos de manera independiente utilizando un Typhoon™ 9400 Variable Mode Imager. Figura 1.In the 2nd dimension, SDS-PAGE, the Separation was performed based on molecular weight. To do this they used gels of 25 cm x 21 cm of 12.5% acrylamide. The electrophoresis was developed at 2 w / gel for 1 hour and at 15 w / gel for 5 hours After electrophoresis the gels were scanned to each of the three fluorophores independently using a Typhoon ™ 9400 Variable Mode Imager. Figure 1.
Posteriormente se llevó a cabo el Análisis DIGE. El análisis de las imágenes de los geles se realizó con el programa DeCyder™ Differential Analysis Software. Este análisis incluyó la co-detección y cuantificación de los spots de proteína marcados con cada uno de los fluoróforos. Dentro de cada gel se calculó la abundancia relativa (respecto al estándar interno) de cada una de las muestras a comparar.Subsequently, the DIGE Analysis was carried out. The image analysis of the gels was performed with the DeCyder ™ Differential Analysis Software . This analysis included the co-detection and quantification of the protein spots marked with each of the fluorophores. Within each gel the relative abundance (with respect to the internal standard) of each of the samples to be compared was calculated.
Como resultado comprobamos que había varios spots que de manera estadísticamente significativa estaban aumentados con respecto al control.As a result we found that there were several spots that were statistically significant increased with respect to control.
El siguiente paso fue la identificación de proteína correspondiente. Para ello se recortaron los spots correspondientes de los geles y las proteínas se digirieron con tripsina mediante protocolos establecidos (A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann, Analytical Chemistry 68 (1996) 850). Una alícuota de los péptidos obtenidos se analizó inicialmente utilizando un MALDI TOF/TOF 4700 (Applied Biosystems). Con los espectros de masas obtenidos se realizó una búsqueda en la base de datos UniProt (http://www.expasy.org/sprot/) utilizando el motor de búsqueda Mascot (http://www.matrixscience.com/) instalado en nuestros servidores para identificar la proteína correspondiente mediante huella peptídica. Los resultados se muestran en la figura 1.The next step was the identification of corresponding protein. For this, the corresponding spots of the gels were cut and the proteins were digested with trypsin by established protocols (A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann, Analytical Chemistry 68 (1996) 850). An aliquot of the peptides obtained was initially analyzed using a MALDI TOF / TOF 4700 (Applied Biosystems). With the mass spectra obtained, a search was made in the UniProt database ( http://www.expasy.org/sprot/ ) using the Mascot search engine ( http://www.matrixscience.com/ ) installed in our servers to identify the corresponding protein by peptide fingerprint. The results are shown in figure 1.
Los presentes ejemplos pretenden ser ilustrativos de la invención y nunca limitativosThe present examples are intended to be illustrative of the invention and never limiting
Con la fracción celular de las muestras de orina se realizó una electroforesis de SDS/PAGE con 30 \mug de proteína. Como control positivo se utilizaron distintas cantidades de proteína "Complement C4" de Sigma (C8195). Después se transfirieron a una membrana y se revelaron con anticuerpo C4beta (H-300): sc-25816 (Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1/200.With the cell fraction of urine samples SDS / PAGE electrophoresis was performed with 30 µg of protein. Different amounts of protein were used as a positive control "Complement C4" by Sigma (C8195). Then they transferred to a membrane and developed with C4beta antibody (H-300): sc-25816 (Santa Cruz Biotechnology) at a 1/200 dilution.
Los resultados mostraron que los niveles de la cadena beta de la proteína de complemente C4A están sobreexpresados en las muestras correspondientes a los pacientes con cáncer de vejiga (figura 3).The results showed that the levels of the Completely C4A protein beta chain are overexpressed in the samples corresponding to patients with cancer of bladder (figure 3).
Claims (8)
- d)d)
- analizar una muestra obtenida de un paciente,analyze a sample obtained from a patient,
- e)and)
- determinar el nivel de expresión de la cadena beta de la proteína de complemento C4A,determine the level of expression of the C4A complement protein beta chain,
- f)F)
- comparar dicho nivel de expresión con un valor control,compare said level of expression with a control value,
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| LOKESHWAR, V.B. et al. "{}Urinary bladder tumor markers"{}. UROLOGI ONCOLOGY. Noviembre-Diciembre 2006. Vol. 24, N$^{o}$. 6, páginas 528-537; todo el documento. * |
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