ES2342252B1 - Proteina sod1 truncada y metodo de deteccion de celulas tumorales. - Google Patents
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Abstract
Proteína SOD1 truncada y método de detección de
células tumorales.
Proteína truncada derivada de la proteína
superóxido dismutasa 1 (SOD1). La proteína SOD1 truncada tiene una
masa molecular relativa (Mr) de entre 13,5 y 14,5 KDa. Asimismo, un
método para detectar la proteína SOD1
truncada y para detectar células tumorales con un índice de proliferación (IP) menor de 0.8 teniendo en cuenta la relación entre el tiempo de proliferación de las células de la muestra respecto del tiempo de proliferación de células tumorales de referencia.
truncada y para detectar células tumorales con un índice de proliferación (IP) menor de 0.8 teniendo en cuenta la relación entre el tiempo de proliferación de las células de la muestra respecto del tiempo de proliferación de células tumorales de referencia.
Description
Proteína SOD1 truncada y método de detección de
células tumorales.
La presente invención se refiere a una proteína
truncada derivada de la proteína superóxido dismutasa 1 (SOD1). La
proteína SOD1 truncada tiene una masa molecular relativa (Mr) de
entre 13,5 y 14,5 KDa. Asimismo, la presente invención también se
refiere a un método para detectar la proteína SOD1 truncada y para
detectar células tumorales con un índice de proliferación (IP) menor
de 0.8 teniendo en cuenta la relación entre el tiempo de
proliferación de las células de la muestra respecto del tiempo de
proliferación de células tumorales de referencia.
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Las enzimas "superóxido dismutasa" (SOD)
constituyen una familia de metaloproteínas pertenecientes al grupo
de antioxidantes celulares que tienen como función principal la
eliminación de aniones superóxido generados en la célula como
consecuencia de su metabolismo o como resultado de tratamientos
celulares externos. La principal proteína SOD es la
Cu,Zn-SOD o SOD1, tradicionalmente ubicada en el
citosol, aunque recientemente se ha descrito su presencia en el
espacio mitocondrial intermembranal, en el que parece desempeñar un
papel importante en la depuración de los aniones superóxidos
generados en la función respiratoria (Iñarrea et al. (2007).
Biochem. J. 405: 173-9).
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se han
considerado como moléculas citotóxicas perjudiciales durante
décadas. Además, los ROS se han convertido en agentes capaces de
promover la iniciación de tumores y su posterior progresión. La
mayor parte de las células cancerosas parecen tener aumentados sus
niveles de ROS en lo que respecta a las células normales. Se ha
documentado que los procesos de metástasis están favorecidos en
ausencia de Cu, ZnSOD (Tanaka et al (1997). Int J
Cáncer 73(2): 187-192).
Previamente se ha descrito que la ausencia de
SOD1 causa la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (Hiranoa et
al. (2000). Biochemical and Biophysical Research
Communications 276(1) 52-56) así como un
aumento en la incidencia de procesos neoplásicos (Elchuri et
al. (2005). Oncogene
24(3):367-380). Por otra parte, se ha
descrito que las mutaciones o truncamientos en el gen SOD1 causan el
25% de los casos de ELA (Ghanashyam et al. (2005).
Neurobiology of disease 21(1):
194-205). También se han relacionado niveles altos
de SOD1 en suero con un aumento en el riesgo de padecer cáncer de
estómago, tanto en etapas tempranas como avanzadas (Lin et
al. (2002). Japanese journal of cáncer research
93(10): 1071-1075).
Reciben el nombre de linfoma un grupo de tipos
de cáncer que comienzan en el sistema linfático. Se calcula que por
cada 100.000 habitantes un 7,7 por ciento de hombres y un 5,2 por
ciento de mujeres sufren linfoma, y se estima que la incidencia del
linfoma aumenta entre un 3 y un 4% cada año. Los linfomas son una
enfermedad clínicamente heterogénea, existiendo más de 35 tipos de
linfomas que se dividen en dos categorías principales: linfoma de
Hodgkin y todos los demás linfomas, denominados linfomas no
Hodgkin.
A pesar de la incidencia del linfoma en los
países industrializados, la etiología de la mayoría de los linfomas
es desconocida, pudiendo existir diferentes rutas moleculares
afectadas. En este sentido, se ha relacionado una menor expresión de
SOD1 durante el proceso de diferenciación de células leucémicas
(Hiroyuki Saito et al. (1989). FEBS Letters
249(2): 253-256).
En la actualidad, la mayoría de los tratamientos
empleados son aproximaciones no específicas a cada tipo de linfoma o
alteración molecular, sino tratamientos generales basados en la
quimioterapia o la radioterapia. Hasta la fecha actual no se han
descrito proteínas o biomarcadores que permitan discriminar entre
diferentes actividades proliferativas de células tumorales.
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La presente invención se refiere a una proteína
derivada de la proteína SOD1 de células T leucémicas de humanos, que
presenta un truncamiento que consiste en la reducción de la masa
molecular relativa (Mr) de entre 1,5 y 2,5 KDa respecto de la SOD1
completa. La proteína SOD1 truncada tiene una (Mr) de entre 13,5 y
14,5 KDa. La proteína truncada se localiza en células tumorales que
tienen un tiempo de proliferación menor que las células tumorales de
referencia. Estas células tumorales de referencia expresan una
proteína SOD1 que tiene una Mr de 16 KDa. Asimismo, la presente
invención también se refiere a un método para detectar la proteína
SOD1 truncada y para detectar células tumorales con un índice de
proliferación (IP) menor de 0.8 teniendo en cuenta la relación entre
el tiempo de proliferación de las células de la muestra respecto del
tiempo de proliferación de células tumorales de referencia (ver más
adelante). El método de detección es reproducible, con alta
sensibilidad, especificidad y sencillez.
Se entiende como tiempo de proliferación el
tiempo necesario para la duplicación del número de células. Las
células tumorales de referencia expresan una proteína SOD1 con Mr de
16 KDa y se seleccionan dependiendo del tipo de células tumorales
que se deseen detectar. Así pues, si se desean detectar células
tumorales leucémicas, las células tumorales de referencia han de ser
células tumorales leucémicas del mismo tipo.
Según la IUBMB (International Union of
Biochemistry and Molecular Biology), la enzima superoxido
dismutasa, SOD (EC 15.1.1), es una oxidoreductasa (EC 1), que tiene
como aceptor al ión superoxido O_{2}^{\bullet -} (EC 1.15). El
nombre sistemático de la proteína es el de superoxido
oxidoreductasa. La SOD cataliza la reacción: 2 O_{2}^{\bullet -}
+ 2 H^{+} = O_{2} + H_{2}O_{2}.
Los nombres de la superoxido dismutasa aceptados
son: superoxido dismutasa, cobre-zinc superoxido
dismutasa, Cu-Zn superoxido dismutasa,
ferrisuperóxido dismutasa, superoxido dismutasa I, superoxido
dismutasa II, SOD, Cu,Zn-SOD,
Mn-SOD, Fe-SOD, SODF, SODS,
SOD-1, SOD-2, SOD-3,
SOD-4, hemocupreina, eritrocupreina, citocupreina,
cupreina o hepatocupreina.
En humanos existen tres formas de superoxido
dismutasa; SOD1 se encuentra en el citoplasma, SOD2 en las
mitocondrias y SOD3 en el líquido extracelular. La primera es un
dímero (consiste en dos subunidades), mientras que las otras son
tetrámeros (cuatro subunidades). SOD1 y SOD3 contienen cobre y zinc,
mientras que SOD2 tiene manganeso en su centro reactivo. El gen que
codifica para la proteína SOD1 se encuentra localizado en el
cromosoma 21 (21q22.1).
La enzima SOD1 también se conoce como superoxido
dismutasa I, cobre-zinc superoxido dismutasa o
Cu,Zn-SOD. La proteína SOD1 es un homodímero de masa
molecular relativa (Mr) 32,5 kDa (se detectan las dos subunidades en
una misma banda de alrededor de 16 KDa). Las dos subunidades están
unidas por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Los
ligandos de cobre y zinc son cadenas laterales de histidina.
La proteína SOD1 de Homo sapiens tiene
154 aminoácidos, su número de acceso (Accesión number) es
CAG46542 (para la secuencia aminoacídica). El número de acceso en el
EMBL (European Molecular Biology Laboratory) es CR541742.1
(para su secuencia nucleotídica).
En la presente invención se detecta la proteína
SOD1 en células Jurkat, una leucemia humana tipo T, y se compara con
la proteína SOD1 en linfocitos de sangre periférica (PBL) obtenidos
de un individuo sano. Además, se estudia la correspondiente
expresión de isoformas de SOD1 en dos sublíneas celulares (Jhp y
Jws), que se han seleccionado a partir de las células Jurkat
parentales (células de referencia), mediante el cultivo continuado a
altas densidades celulares (Jhp) y en un medio modificado carente de
suero fetal bovino (SFB) (Jws). Estas sublíneas presentan un
fenotipo tumoral con un IP menor de 0.8 (ver más adelante).
La detección de la proteína de la presente
invención, asociada a una mayor capacidad de proliferación (respecto
de células de referencia) y mayor resistencia a la apoptosis
inducida por drogas, podría ser de interés en el futuro diagnóstico
y tratamiento de este tipo de patologías de características
tumorales más agresivas. Mediante la detección de proteínas de la
presente invención en células tumorales se pueden identificar
células tumorales con alta capacidad de proliferación que dan lugar
a patologías tumorales más agresivas y, de este modo, se podrían
llevar a cabo tratamientos más eficaces en un momento clave en la
evolución de la enfermedad, crítico para la supervivencia de la
persona que la padece.
En este sentido, un aspecto de la presente
invención es una proteína que consiste en una isoforma de la
proteína SOD1 con una masa molecular relativa (Mr) de entre 13,5 y
14,5 KDa (en adelante, proteína de la presente invención o proteína
de la invención).
Otro aspecto de la presente invención es un
método para la detección de la proteína de la invención que
comprende:
- a.
- Obtener una muestra biológica aislada,
- b.
- obtener el extracto celular de la muestra biológica del apartado (a) y separar las proteínas en un medio de soporte capaz de retenerlas,
- c.
- añadir anticuerpos anti-SOD1 (Ac1) unidos a un compuesto marcador, al soporte del apartado (b) y
- d.
- detectar la proteína según la reivindicación 1 mediante la adición de un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente al producto obtenido en el apartado (c).
La muestra biológica aislada puede proceder de
cualquier tipo de tejido biológico de un animal, ya sea de un tumor
o neoplasia o de cualquier otra muestra no tumoral. Preferiblemente
la muestra biológica aislada comprende células tumorales.
Preferiblemente el animal es un mamífero.
El extracto celular se obtiene por lisis de las
células presentes en la muestra y las proteínas presentes en el
extracto celular han de separarse en un medio de soporte que sea
capaz de retenerlas. La separación proteica se hace bien por
cromatografía o bien por electroforesis.
Mediante las técnicas cromatográficas se pueden
separar moléculas en función de sus cargas, tamaños, masas
moleculares, a través de la polaridad de sus enlaces o sus
potenciales redox, entre otros. La técnica cromatográfica se
selecciona de la lista que comprende cromatografía de líquidos
(Cromatografía de reparto, C. de adsorción, C. de exclusión o C. de
intercambio iónico), cromatografía de gases o cromatografía de
fluidos supercríticos.
La electroforesis es una técnica analítica de
separación de fundamento cinético basada en el movimiento o
migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio
(solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o
soporte reticulado como resultado de la acción de un campo
eléctrico. El comportamiento de la molécula viene dado por su
movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la
misma. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un
ión en el seno del campo eléctrico.
Existen numerosas variaciones de esta técnica en
función del equipo utilizado, soporte y condiciones
físico-químicas en las cuales se va a llevar a cabo
la separación. La electroforesis se selecciona de la lista que
comprende electroforesis capilar, electroforesis en papel,
electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de
poliacrilamida, isoelectroenfoque, electroforesis bidimensional.
Preferiblemente la electroforesis se lleva a cabo en gel de
poliacrilamida (PAGE). La electroforesis PAGE se selecciona de la
lista que comprende SDS-PAGE, PAGE no
desnaturalizante o PAGE desnaturalizante.
El soporte capaz de retener tanto las proteínas
de la invención como las proteínas SOD1 debe permitir el movimiento
de las mismas a su través. El soporte debe tener poros de tamaño
controlable. Así pues, el soporte es preferentemente no restrictivo
(en los que el entramado no interfiere en la migración en el caso de
que el tamaño de las proteínas esa muy pequeño en comparación con el
tamaño de poro del soporte), en este caso, la separación depende de
la densidad de carga de las moléculas. El soporte puede ser, pero
sin limitarse, de agar-agar, almidón o
poliacrilamida.
Una vez acabada la electroforesis, se practica
en el gel un canal paralelo a la dirección de migración en el que se
deposita un antisuero que contenga anticuerpos específicos frente a
la proteína SOD1. El gel se incuba a una temperatura de entre 15 y
28ºC durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las
proteínas difunden si se encuentran en la proporción adecuada,
produciendo precipitados de los complejos
SOD1-anticuerpo insolubles. Una vez formadas las
bandas de precipitación, el gel puede lavarse para eliminar las
proteínas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, teñirse
o añadirse un sustrato en el caso de que el anticuerpo empleado esté
marcado (tal como se describe más adelante).
Una vez separadas las proteínas, y antes de la
detección, las proteínas también pueden ser transferidas a un
soporte diferente donde pueden ser detectadas. En este caso el
soporte es, preferentemente, acetato de celulosa.
Los anticuerpos anti-SOD1 (Ac1)
pueden ser policlonales o monoclonales. Estos anticuerpos reconocen
tanto a la proteína SOD1 como a la proteína de la presente invención
con lo que se simplifica el método de detección ya que permite
detectar ambos tipos de proteína con el mismo anticuerpo.
El anticuerpo Ac1 unido a un compuesto marcador,
tal como se entiende en la presente invención, es un anticuerpo
conjugado con un compuesto capaz de reaccionar con algún sustrato,
de forma que se derive de ello una detección cromogénica,
fluorogénica y/o quimioluminiscente. El compuesto marcador se
selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas,
fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con
otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este
compuesto puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de
otro compuesto. Un ejemplo de compuesto susceptible de ser detectado
es la enzima fosfatasa alcalina. Preferiblemente el sustrato
indicador es cromogénico, como por ejemplo,
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP), nitro azul tetrazolio (NBT) o iodoblue tetrazolium
(IBT), o cualquiera de las combinaciones de NBT o IBT con BCIP, sin
limitación de utilizar otros sustratos.
En el caso de emplear un sustrato cromogénico,
la presencia de proteína SOD1 o de la proteína de la presente
invención en la muestra se evidencia por la aparición de un color
cuya intensidad varía directamente con el número de moléculas de las
proteínas anteriores unidas a los anticuerpos Ac1 y su
cuantificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de
espectrofotometría. Si se emplea un sustrato fluorogénico la
detección y cuantificación se realiza por medio de fiuorimetría y si
el sustrato es quimioluminiscente, la señal se puede cuantificar por
medio de un luminómetro.
La proteína de la invención se detecta, tal como
se ha descrito anteriormente, mediante la adición de un sustrato
indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente al
producto obtenido en el apartado (c) del método donde reacciona con
alguno de los compuestos del producto y da lugar a un compuesto
diferente del sustrato y que a su vez es detectable. Una vez
detectada la proteína, se debe determinar su Mr, comparando su
migración con la migración de una proteína control que se detecte de
forma simultánea, preferiblemente en el mismo soporte, que tiene un
tamaño conocido.
Otro aspecto más de la presente invención es un
método de detección de células tumorales con un índice de
proliferación (IP) menor de 0.8 que incluye los apartados (a)-(d)
según el aspecto anterior, y que además comprende:
- e.
- comparar la Mr de la proteína del apartado (d) con la Mr de una proteína SOD1 de referencia y
- f.
- asignar la diferencia de Mr del apartado (e) a la presencia de células tumorales con un IP menor de 0.8.
Preferiblemente las células tumorales de la
muestra son de un animal. Más preferiblemente las células son de
mamífero.
El término "índice de proliferación" (IP),
tal como se entiende en la presente invención, hace referencia a la
relación entre el tiempo necesario para la duplicación de un tipo
determinado de células respecto del tiempo de proliferación de
células de referencia. Las células tumorales de referencia expresan
una proteína SOD1 con Mr de 16 KDa y se seleccionan dependiendo del
tipo de células tumorales que se deseen detectar. Así pues, si se
desean detectar células tumorales leucémicas, las células tumorales
de referencia han de ser células tumorales leucémicas del mismo
tipo.
El índice de proliferación (IP) se definió
como;
IP = tiempo de
proliferación de las células de la muestra/tiempo de proliferación
de las células de
referencia.
Las células de referencia de los ejemplos de la
presente invención son células T leucémicas Jurkat aisladas in
vitro procedentes de humanos. Tal como se ha descrito
anteriormente, las células Jurkat de referencia tienen un tiempo de
proliferación de 24 horas. Las células Jhp tienen un tiempo de
proliferación de 12 horas (su IP es de 0,5). Las células Jws tienen
un tiempo de proliferación de 18 horas (su IP es de 0,75). Además,
las células con un IP menor de 0.8 sobreviven a densidades celulares
de entre 3 (Jws) y 5 (Jhp) veces las de la leucemia parental Jurkat
(1-1.5 millón de células/ml de cultivo).
La proteína de referencia es SOD1, que tiene una
masa molecular relativa (Mr) de 16 KDa. Esta proteína se encuentra
en las células con metabolismo normal y también en células tumorales
de referencia. El método de la presente invención presenta una
ventaja que se basa en que, mediante la utilización de los mismos
anticuerpos anti-SOD1, se pueden detectar tanto la
proteína SOD1 normal como la proteína de la invención (SOD1
truncada). Por tanto, se detectan de forma simultánea y de este modo
se puede comparar la masa molecular relativa de ambas. Para ello se
compara el valor Rf de la proteína de la invención con el de
proteína SOD1 de referencia cuyo Mr se conoce. El Rf se define como
el cociente entre la distancia que migra una determinada proteína y
la distancia que migra el frente del gel. El frente del gel se
determina por la posición de un compuesto de referencia de movilidad
máxima, como por ejemplo, pero sin limitarse, el colorante azul de
bromofenol.
La Masa molecular relativa (Mr) se refiere a la
masa de un mol de moléculas, es decir, la masa de 6,02 10^{23}
moléculas de una misma sustancia e indica las veces que es más
pesada una molécula de una sustancia respecto de la unidad de masa
atómica (u.m.a.) o de 1 Dalton (Da), que corresponde a la Mr del
átomo de hidrógeno. Así, la Mr de la proteína SOD1 es de 16.000 Da,
es decir, que es 16.000 veces más pesada que un átomo de hidrógeno o
que tiene la misma masa que 16.000 átomos de hidrógeno.
Puesto que la masa Mr de la proteína de
referencia es siempre la misma, la diferencia de Mr con respecto a
otra proteína detectada en alguna de las muestras significa que las
células de la muestra presentan un IP menor de 0.8 teniendo en
cuenta la relación entre el tiempo de proliferación de las células
de la muestra respecto del tiempo de proliferación de las células de
referencia.
Un IP menor de 0.8 indica que el tiempo de
proliferación de las células de la muestra es menor de 19 horas y 12
minutos en el caso de que el tiempo de proliferación de las células
referencia sea de 24 horas.
Según una realización preferida del método, las
células de la muestra son leucémicas. Preferiblemente las células
leucémicas son células T. Las células T leucémicas pueden proceder,
pero sin limitarse, de la lista que comprende linfomas precursores
de células T que producen leucemia linfoblástica precursora aguda de
células T (LLA-T), linfoma linfoblástico precursor
de células T (LBL), linfoma periférico de célula T, linfoma
hepatoesplénico de células T gamma y delta, linfoma subcutáneo de
células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma
extranodal de células T de tipo nasal, linfoma intestinal de células
T de tipo enteropático, linfoma que produce leucemia de células T en
adultos (HTLV 1+), linfoma anaplásico de células grandes tipo
cutáneo primario, leucemia agresiva de células NK (Natural
Killer). Las células también se seleccionan, pero sin limitarse,
de la lista que comprende células cuya proliferación da lugar a
leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfoide crónica (LLC),
leucemia linfoide aguda (Leucemia Linfoblástica; LLA), leucemia
mieloide aguda (Leucemia Mieloblástica; LMA) o leucemia
mielógena
(LM).
(LM).
Según una realización aún más preferida, las
células leucémicas pertenecen a las sublíneas Jhp o Jws que son
células leucémicas con un IP menor de 0.8. Las sublíneas celulares
anteriores proceden del clon de células Jurkat E6.1 que se generan
tal como se describe en los ejemplos de la presente invención.
Otra realización preferida es el método en el
que se añaden anticuerpos anti-Ac1 (Ac2) unidos a un
compuesto marcador, a los anticuerpos Ac1 (pero sin marcar) del
apartado (c) del método, para formar el complejo
Ac1-Ac2-compuesto marcador. Los
anticuerpos Ac2 se unen al compuesto marcador definido anteriormente
y el complejo Ac2-compuesto marcador se añade a los
anticuerpos Ac1 que, en el caso de esta realización preferida, no
están unidos a ningún compuesto marcador, de modo que se forma el
complejo Ac1-Ac2-compuesto marcador
que puede ser detectado mediante la adición del sustrato
correspondiente, tal como se ha definido anteriormente.
Según otra realización preferida del método, se
incluye además un paso de cultivo de las células presentes en la
muestra biológica, previo a la obtención del extracto celular
descrito en el apartado (b) del método. Este paso adicional puede
ser necesario para obtener un número de células suficiente para
obtener una concentración detectable tanto de proteínas SOD1 como de
las proteínas de la invención.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de la proteína de la invención como biomarcador de células
tumorales.
El término "biomarcador" tal como se
entiende en la presente invención hace referencia a la
identificación de una señal fisiológica concreta inducida por un
metabolismo celular alterado que produce una mayor proliferación
celular respecto de células cancerígenas control. La señal
fisiológica concreta se basa en el truncamiento de la proteína SOD1
de modo que se obtiene una proteína de menor Mr que puede ser
detectada de forma reproducible, con alta sensibilidad,
especificidad y sencillez. Es decir, es una molécula biológica que
"marca" los cambios medibles bioquímicos, fisiológicos o
morfológicos, que se asocian a un cáncer muy agresivo. Las células
tumorales que dan lugar al cáncer agresivo tienen un IP menor de
0.8, tal como se entiende el término IP en la presente invención.
Este biomarcador permite distinguir el cáncer agresivo de otros
menos agresivos.
Un aspecto más de la presente invención es el
uso de la proteína biomarcadora para la monitorización de la
respuesta a un tratamiento de células tumorales con un IP menor de
0.8.
Las decisiones acerca de comenzar, seguir,
cambiar o suspender el tratamiento de las células tumorales cuyo IP
sea menor de 0.8, pueden basarse en los resultados de pruebas que
ayuden a monitorizar la evolución de un cáncer.
El tratamiento principal del cáncer
habitualmente suele ser la cirugía en el caso de existir neoplasias
o tumores definidos (esplenectomía en el caso de la extirpación de
bazo). Después de la cirugía, muchos pacientes reciben terapia
adyuvante. El término "terapia adyuvante", tal y como se
utiliza en la presente invención, se refiere al tratamiento que se
da después de la cirugía, con el objetivo de prevenir la recaída del
cáncer. Las personas afectadas de tumores producidos por las células
que expresan la proteína de la presente invención (con un IP menor
de 0.8) pueden recibir la terapia adyuvante, un tratamiento previo a
la cirugía, o un tratamiento sin cirugía.
El tratamiento del cáncer se selecciona, pero
sin limitarse, de la lista que comprende radioterapia,
quimioterapia, terapia biológica, transplante de células madre o
plasmaféresis.
La radioterapia es un tratamiento para el cáncer
el cual utiliza rayos X de alta energía u otros tipos de radiación
para destruir las células cancerosas e impedir que crezcan.
La quimioterapia es un tratamiento del cáncer
que utiliza medicamentos para interrumpir la proliferación de
células cancerosas, mediante la eliminación de las células o
evitando su multiplicación. Los compuestos quimioterapeúticos se
seleccionan, pero sin limitarse, de la lista que comprende inhibidor
de la tirosina cinasa (por ejemplo, pero sin limitarse, mesilato de
imatinib o dasatinib), corticosteroides, inhibidores de la
angiogénesis (por ejemplo, pero sin limitarse, talidomida o
lenalidomida), inhibidor de la proteasa (por ejemplo, pero sin
limitarse, bortezomib), interleucina-2 o interferón
alfa, inhibidor de la mitosis (por ejemplo, pero sin limitarse
paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina o
vinorelbina), antibiótico antitumoral (por ejemplo, pero sin
limitarse bleomicina o antraciclinas. La antraciclina se selecciona
de la lista que comprende, pero sin limitarse daunorrubicina,
doxorrubicina, epirrubicina o idarrubicina).
La terapia biológica es un tratamiento que
utiliza el sistema inmunitario del paciente para combatir el cáncer.
Se utilizan sustancias elaboradas por el cuerpo o en un laboratorio
para reforzar, dirigir o restaurar las defensas naturales del cuerpo
contra el cáncer.
El trasplante de células madre reemplaza las
células que generan la sangre que fueron destruidas por el
tratamiento del cáncer. La plasmaféresis es un procedimiento
mediante la cual se extrae la sangre del paciente y se procesa en
una máquina que separa el plasma. Las células sanguíneas normales se
devuelven a la corriente sanguínea junto con plasma de un
donante.
La monitorización de la respuesta a un
tratamiento de células tumorales que tienen un IP menor de 0.8,
puede llevarse a cabo mediante la aplicación del método de la
presente invención sólo o en combinación con la medida de un
parámetro que sea indicativo de la enfermedad como por ejemplo, pero
sin limitarse, morfología linfocitaria, índice proliferativo
linfocitario, velocidad de crecimiento que tiene el linfoma,
extensión de la enfermedad, determinada según el número,
localización y tamaño de las áreas ganglionares y extraganglionares
afectas, marcadores séricos (como por ejemplo, pero sin limitarse,
LDH y beta2-microglobulina), la expresión de
marcadores de la superficie linfocitaria y la morbilidad o
mortalidad, donde un cambio favorable con el nivel del indicador en
relación con el cambio de referencia usando animales no tratados en
condiciones comparables, indica que el compuesto es activa/o para
tratar dicha enfermedad. El estudio de dichos parámetros puede ser
realizado por diferentes técnicas conocidas por un experto en la
materia, entre los que se encuentran, pero sin limitarse, hemograma,
radiografías, ultrasonido, tomografía axial computarizada (CT Sean),
resonancia magnética por imágenes (MRI), centellograma con galio,
tomografía por emisión de positrones TEP (PET sean), gammagrafía
ósea, análisis de médula ósea, punción lumbar, citometría de flujo,
biopsia quirúrgica o necropsia. La determinación de la efectividad
del tratamiento, puede ser llevada a cabo mediante la aplicación del
método de la presente invención en células derivadas de modelos
experimentales de animales mamíferos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1.- Muestra la detección de dos
isoformas de la proteína SOD1 por inmunoblot en diferentes células
humanas aisladas.
Jurkat: Linfocitos T que sufren leucemia; Jhp:
Sublínea celular con fenotipo muy proliferativo derivada de células
Jurkat; Jws: Sublínea celular con fenotipo muy proliferativo
derivada de células Jurkat; PBL: Linfocitos T normales de sangre
periférica de un individuo sano.
A la izquierda se indican los Mr
correspondientes a las isoformas de SOD1 detectadas en las células
analizadas. Los resultados son representativos de tres experimentos
independientes.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos que describen el uso de la proteína de la
presente invención para discriminar células tumorales con menor
tiempo de proliferación que las células tumorales de referencia.
El clon E6.1 de células Jurkat, leucemia humana
tipo T (ATCC, Rockville Pike, EE.UU.) y la sublínea Jhp se
cultivaron en medio RPMI-1640 (El medio RPM11640 es
una mezcla de sales enriquecida con aminoácidos y otros componentes
esenciales para el crecimiento celular utilizado para obtener la
sincronización de la división celular por no tener timidina en su
composición. GIBCO, Merk) suplementado con 5% SFB (Suero Fetal
Bovino), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y
100 mg/ml estreptomicina. La sublínea Jws se cultivó en el medio
RPMI 1640/DMEM/Ham's F12 (2:1:1) complementado con albúmina de suero
bovino (BSA) (1 mg/ml), selenito de sodio (4,3 ng/ml) y etanolamina
(1,53 \mug/ml). Las células estaban libres de Mycoplasma, por la
prueba rutinaria por RT-PCR.
Las células Jurkat del clon E6.1 están
disponibles en el American Type Culture Collection (ATCC) con
el número TIB 152. Estas células se emplean como células de
referencia.
Las sublíneas celulares Jhp y Jws proceden de
las células Jurkat descritas. La obtención de la sublínea celular
Jhp se llevó a cabo por medio de cultivos prolongados de células
parentales (Células Jurkat del clon E6.1) en el medio
RPMI-1640 (GIBCO) suplementado con 5% SFB, 2 mM
L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 microg/ml
estreptomicina, produciendo una alta densidad de células. La
selección de las células supervivientes fue llevada a cabo por medio
de varias centrifugaciones en gradiente de Ficoll. Las células Jws
fueron generadas por cultivos de células parentales en un medio de
cultivo libre de suero que contiene
RPMI-1640/DMEM/Ham's F-12 (2:1:1
v/v) complementado con albúmina de suero bovino (BSA) (1mg/ml),
selenito de sodio (4.3 ng/ml), etanolamina (1.53 \mug/ml),
transferrina (10 \mug/ml), insulina (5 \mug/ml), glutamina (2
mM) y los antibióticos (penicilina, 100 U/ml; estreptomicina, 100
\mug/ml). El cultivo de células en medio libre de suero causa la
muerte de la mayor parte de células parentales y las subpoblaciones
viables fueron seleccionadas por varias centrifugaciones en
gradiente de Ficoll.
Se recogieron los cultivos celulares a 37ºC, 5%
CO2 y atmósfera con vapor de agua (tiempos de cultivo, 3 días Jhp y
Jws y 5 días para Jurkat, densidad de sembrado, 100.000 células/ml
de cultivo) y las células se lavaron dos veces en suero fosfatado
salino (PBS). Se prepararon los lisados celulares (1 millón de
células por carril) por incubación de 30 minutos a 4ºC en el tampón
de lisis que contiene Tritón X-100 (1% final) e
inhibidores de fosfatasas y proteasas celulares (leupeptina 10
microgramos/ml; PMSF 1 mM; ortovanadato sódico 1 mM; pirofosfato
sódico 10 mM). Tras centrifugar, 10 minutos a 12000 rpm en Minifuga
Beckman, los sobrenadantes se incubaron con el tampón de
electroforesis (SDS 1% y azul de bromofenol), durante 5 minutos a
100ºC, y se aplicaron de entre 20 y 60 microlitros/carril) en los
pocilios para la electroforesis. Las proteínas se separaron por
SDS-PAGE (15%) y posteriormente se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa [2], El inmunoblot se realizó con
anti-SOD1 (la proteína SOD1 procede de humanos),
obtenido en conejo, como anticuerpo primario, y un
anti-inmunoglobulina contra conejo obtenido en ratón
conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma, Madrid), como anticuerpo
secundario. La membrana se reveló durante 30 minutos a temperatura
ambiente de entre 15 y 28ºC por incubación con
bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
y nitro azul tetrazolio (BCIP/NBT).
Las células (15 x 10^{6}) se resuspendieron en
1 ml de PBS y se sonicaron para obtener un extracto celular para el
análisis enzimático. El contenido total de proteína se determinó por
el método de Bradford (Bio-rad, Heidemannstrase,
München). La actividad enzimática de SOD se midió con la reacción
xanthina/xanthina oxidasa que produjo un flujo de O_{2}^{\bullet
-} con la sal de tetrazolium sulfononada XXT, como lo indican los
captadores de iones O_{2}^{\bullet -}. Se utiliza CN^{-} 5 mM
para inhibir la actividad de Cu,Zn-SOD y obtener la
de la MnSOD (Iñarrea et al. (2007). Biochem. J.
405:173-179).
Se determinó que el tiempo de proliferación de
las células procedentes de las líneas celulares Jhs o Jws era
inferior al tiempo de proliferación de las células parentales,
empleadas estas últimas como células de referencia para el cálculo
del IP. Así pues, el tiempo de proliferación de las células de
referencia fue de 24 horas mientras que el tiempo de proliferación
de las células Jhs fue de 12 horas y el de las células Jws de 18
horas. El índice de proliferación (IP) se definió como;
IP = tiempo de
proliferación de las células de la muestra/tiempo de proliferación
de las células de
referencia.
Por tanto, el IP de las células Jhs = 12/24, es
decir, IP_{Jhs}= 0.5. Por otro lado, el IP de las células Jws =
18/24, es decir IP_{Jhs}= 0.75
En la Fig. 1 se muestra la detección de la
proteína SOD1 normal que correspondió con una única banda de Masa
molecular relativa (Mr) de 16 KDa en las células Jurkat (células de
referencia). Se observó un resultado similar en el carril
correspondiente a los PBLs obtenidos de un donante sano. Sin
embargo, se observó que la expresión de SOD1 en las células Jhp y en
las Jws correspondió también a una única banda, de intensidad
comparable, pero con Mr de 14 KDa. Este resultado indicó que estas
células expresaron una ¡soforma truncada de SOD1 (2 KDa menor con
respecto a las células Jurkat de referencia y a sus homólogos País
(Leucocitos de sangre periférica normales).
La aparición de esta isoforma truncada de SOD1
estuvo asociada a una disminución de la actividad SOD1 en estas
células en relación con las células de referencia, determinada por
las técnicas espectrofotométricas de rutina en la literatura
(Iñarrea et al. (2007). Biochem J.
405:173-179). Así, la actividad SOD1 de ambas
sublíneas fue menor que la correspondiente a las células Jurkat de
referencia, siendo la disminución más marcada en las células Jhp,
con una reducción de alrededor de dos veces la de las células
Jurkat. Siendo la actividad SOD1 en Jurkat (5 U/mg); Jhp (0,2 U/mg)
y Jws (2 U/mg).
Claims (9)
1. Proteína que consiste en una isoforma de la
proteína SOD1 con una masa molecular relativa (Mr) de entre 13,5 y
14,5 KDa.
2. Método de detección de la proteína según la
reivindicación 1 que comprende:
- a.
- Obtener una muestra biológica aislada,
- b.
- obtener el extracto celular de la muestra biológica del apartado (a) y separar las proteínas en un medio de soporte capaz de retenerlas,
- c.
- añadir anticuerpos anti-SOD1 (Ac1) unidos a un compuesto marcador, al soporte del apartado (b) y
- d.
- detectar la proteína según la reivindicación 1 mediante la adición de un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente al producto obtenido en el apartado (c).
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método de detección de células tumorales con
un índice de proliferación (IP) menor de 0.8, que incluye los
apartados (a)-(d) según la reivindicación 2, y que además
comprende:
- e.
- comparar la Mr de la proteína del apartado (d) con la Mr de una proteína SOD1 de referencia y
- f.
- asignar la diferencia de Mr del apartado (e) a la presencia de células tumorales con un IP menor de 0.8.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3 donde las células de la muestra son células
leucémicas.
5. Método según la reivindicación 4 donde las
células leucémicas pertenecen a las sublíneas Jhp o Jws.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5 donde se añaden anticuerpos
anti-Ac1 (Ac2) unidos a un compuesto marcador, a los
anticuerpos Ac1 sin marcar del apartado (c).
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 donde además se incluye un paso de cultivo de
las células presentes en la muestra biológica, previo a la obtención
del extracto celular del apartado (b).
8. Uso de la proteína según la reivindicación 1
como biomarcador de células tumorales.
9. Uso de la proteína según la reivindicación 8,
para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de células
tumorales con un IP de las células de la muestra respecto de células
tumorales de referencia, menor de 0.8.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200803728A ES2342252B1 (es) | 2008-12-29 | 2008-12-29 | Proteina sod1 truncada y metodo de deteccion de celulas tumorales. |
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|---|---|---|---|
| ES200803728A ES2342252B1 (es) | 2008-12-29 | 2008-12-29 | Proteina sod1 truncada y metodo de deteccion de celulas tumorales. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2342252A1 ES2342252A1 (es) | 2010-07-02 |
| ES2342252B1 true ES2342252B1 (es) | 2011-06-10 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2342252B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4910133A (en) * | 1985-08-29 | 1990-03-20 | Ube Industries, Limited | Diagnostic test drug comprising monoclonal antibody to human copper.zinc-superoxide dismutase and diagnostic test method using the same |
-
2008
- 2008-12-29 ES ES200803728A patent/ES2342252B1/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JACKSON, M. et al. "{}Copper/Zinc superoxide dismutase 1 and sporadic amyotrophic lateral sclerosis: analysis of 155 cases and identification of a novel insertion mutation"{}. ANNALS OF NEUROLOGY. 01.11.1997. Vol. 42, N$^{o}$. 5, páginas 803-807; Resultados y Fig. 3. * |
| ZUO, X.L. et al. "{}Levels of Selenium, Zinc, Copper, and antioxidant enzyme activity in patients with leukemia"{}. BIOLOGICAL TRACE ELEMENTS RESEARCH. 2006. Vol. 114, N$^{o}$. 1-3, páginas 41-53; discusión. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2342252A1 (es) | 2010-07-02 |
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