ES2341122T3 - Metodo de determinacion de la lipofilia. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la lipofilia de un compuesto de interés que comprende a) proporcionar una capa unida al fondo de un tubo, b) proporcionar un solvente A y un solvente B, en el que el solvente A es no polar y el solvente B es polar, o el solvente A es polar y el solvente B es no polar c) impregnar dicha capa con un solvente A, en el que el solvente A está unido a la capa y no se fuga en el solvente B, d) aplicar un compuesto de interés en la capa impregnada, e) añadir el solvente B en una placa e insertar el tubo en la placa de forma que la capa impregnada con el solvente A esté en contacto con el solvente B, f) eliminar el solvente B tras alcanzar el equilibrio de distribución, y g) determinar la cantidad del compuesto de interés en al menos una de las fases del solvente.

Description

Método de determinación de la lipofilia.

La presente invención proporciona un método para la determinación de valores de lipofilia altos, medios y bajos.

La lipofilia es una propiedad molecular importante en la investigación de fármacos. El conocimiento exacto de la lipofilia del fármaco es útil para la correlación con los procedimientos farmacéuticos como la permeabilidad de membrana, solubilidad, volumen de distribución, estabilidad metabólica y unión de proteínas. La lipofilia se expresa mediante log P (coeficiente de partición octanol-agua para especies neutrales) o log D (coeficiente de distribución octanol-agua para moléculas cargadas).

Normalmente, la lipofilia viene determinada por el método convencional de frasco agitado (M.M. Abraham, H.S. Chadha, J.P.Dixon, y A.J. Leo. Puentes de hidrógeno. Parte 9. La partición de solutos entre el agua y varios alcoholes. Phys. Org. Chem. 7:712-716 (1994). Cuando se realiza manualmente, este método es muy costoso en tiempo (sólo 2-5 compuestos por día). No obstante, el número de compuestos producidos en el descubrimiento de fármacos aumenta drásticamente gracias a la síntesis rápida de análogos y a la química combinatoria. Esta situación requiere de un método rápido y eficiente para determinar la lipofilia de los compuestos.

Además, los métodos anteriores de la técnica no funcionan con compuestos de baja solubilidad. Desde el año 2002 alrededor del 35% de las mediciones log D fallaron debido a la precipitación de compuestos en la solución de referencia o a concentraciones bajas de la muestra en la fase acuosa (fuente: RODIN y base de datos SPC, 2004). Por otro lado, existe una necesidad para las mediciones de alto rendimiento de log D > 4, especialmente para los fármacos diana en los que son necesarios una alta lipofilia.

La WO 2005/095950 (estado anterior de la técnica de acuerdo al Art. 54(3) EPC) describe un método para evaluar una composición farmacéutica que comprenden un fármaco. Este método comprende proporcionar una membrana microporosa con una serie de poros. Dicha membrana posee un lado de alimentación y un lado del permeado. Dicho lado de alimentación es hidrofílico y en comunicación fluida con una solución de alimentación acuosa y dicho lado del permeado está en comunicación fluida con una solución permeada (fluido orgánico). La composición farmacéutica que contiene el fármaco se administra en la solución acuosa y la concentración de dicho fármaco se mide en la solución permeada.

Por lo tanto, existe una necesidad para un método que sea rápido y que permite la determinación de lipofilia de compuestos de baja solubilidad.

La presente invención está relacionada con un método para determinar la lipofilia de un compuesto de interés que comprende:

a) proporcionar una capa unida al fondo de un tubo,

b) proporcionar un solvente A y un solvente B en el que el solvente A es no polar y el solvente B es polar, o el solvente A es polar y el solvente B es no polar

c) impregnar dicha capa con un solvente A, en el que el solvente A está unido a la capa y no se fuga en el solvente B,

d) aplicar un compuesto de interés en la capa impregnada,

e) añadir el solvente B en una placa e insertar el tubo en la placa de forma que la capa impregnada con el solvente A esté en contacto con el solvente B,

f) eliminar el solvente B tras alcanzar el equilibrio de distribución, y

g) determinar la cantidad del compuesto de interés en al menos una de las fases del solvente. Preferiblemente, la cantidad de compuesto de interés se determina en la fase de solvente pegada a la capa.

El compuesto de interés puede ser cualquier compuesto químico o biológico. El compuesto de interés puede ser por ejemplo un compuesto orgánico, una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Un compuesto orgánico puede incluir también moléculas orgánicas-inorgánicas. El término molécula orgánica-inorgánica tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula orgánica en la que al menos un átomo inorgánico está unido a un átomo de carbono. Un átomo inorgánico puede ser por ejemplo un átomo metálico como por ejemplo, silicio (Si) o germanio (organometálicos, es decir, bioisoéster de Si o Ge de moléculas orgánicas).

El compuesto de interés puede ser sólido o líquido. El compuesto de interés puede disolverse en un solvente adecuado como por ejemplo DMSO (dimetilsulfóxido). El compuesto de interés puede ser un compuesto lipofílico o un compuesto hidrofílico. Un solvente adecuado para un compuesto hidrofílico es preferiblemente un solvente polar; un solvente adecuado para un compuesto lipofílico es preferiblemente un solvente no polar.

El término "capa" tal como se utiliza aquí se refiere a un transportador para un solvente, en el que la capa es capaz de absorber completamente el solvente. El término "completamente absorbido" significa que el solvente aplicado a la capa (es decir, el Solvente A) está unido a la capa y no se traspasará a la otra fase (es decir, el Solvente B).

La capa posee huecos. Estos huecos pueden ser poros, cavidades, agujeros o ranuras. Los huecos pueden estar formados por el material transportador, como en el caso de las fibras que forman una malla. Los huecos pueden también crearse por ejemplo al penetrar la capa con iones. Preferiblemente, la capa es permeable.

La capa puede ser por ejemplo una malla o una membrana (por ejemplo, membrana de señal clara Westran (Whatman), Immobilon-P PVDF (Millipore), PVDF-Plus, membrana de transferencia (Koma Biotech)). Preferiblemente, la capa es una membrana. Si el solvente es no polar el material transportador es preferiblemente hidrofóbico como por ejemplo fluoruro de polivinilideno (PVDF), politetrafluoretileno (PTFE), copolímero de olefina cíclica (COC), polipropileno (PP) o policarbonato (PC). Si el solvente es polar el material transportador es preferiblemente lipofílico como por ejemplo acetato de celulosa, fibras de vidrio, fluoruro de polivinilideno hidrofílico (PVDF), policarbonato hidrofilizado y otro material de filtro hidrofilizado.

El solvente A puede ser un solvente no polar o polar. El solvente B puede ser un solvente no polar o polar. El solvente A es inmiscible o difícilmente miscible con el solvente B. Si el solvente A es un solvente no polar, el solvente B es un solvente polar, si el solvente A es un solvente polar, el solvente B es un solvente no polar.

El término "solvente no polar" tal como se utiliza aquí se refiere a un solvente hidrofóbico. Los solventes no polares son inmiscibles, o difícilmente miscibles con los solventes polares como por ejemplo el agua. Un compuesto lipofílico tiene la tendencia natural de ser más soluble en un solvente no polar que en un solvente polar. La constante dieléctrica de un solvente no polar es normalmente inferior a la del agua. Ejemplos de un solvente hidrofóbico son los solventes orgánicos como por ejemplo octanol o hidrocarburos alifáticos (dodecano, hexadecano o hidrocarburos halogenizados).

El término "solvente hidrofílico" o "solvente polar" tal como se utiliza aquí se refiere a un solvente que posee moléculas cuyas cargas eléctricas no están distribuidas equitativamente y están por lo tanto cargadas electrónicamente. Los solventes polares son inmiscibles o difícilmente miscibles con los solventes no polares o hidrofóbicos. Los compuestos polares o ionizables tienen la tendencia a ser más solubles en solventes polares. El solvente polar puede ser por ejemplo una solución de tampón hidrofílico que puede consistir de una sal tamponada (es decir, soluciones acuosas de fosfato o sales TAPSO tamponadas a pH 7,4) en agua con alta capacidad de tamponamiento dentro del rango de pH de interés. El pH de interés puede estar en el rango entre pH 0 y 14, preferiblemente el pH es alrededor de 7,4.

El término "equilibrio de distribución" tal como se utiliza aquí se refiere al equilibrio de distribución entre el solvente polar y el solvente no polar para los compuestos de interés tras un tiempo específico. Preferiblemente, los equilibrios de distribución se alcanzan entre 0,1-24 h., más preferiblemente se alcanzan a las 2 h.

La capa puede impregnarse aplicando el solvente a la capa mientras la capa sea capaz de absorbes el solvente por completo. El solvente puede aplicarse, por ejemplo, con un dispensador. Otros métodos con conocidos en la técnica como por ejemplo un sistema de manejo de líquidos robotizado, que permite dispensar entre 0,1 \mul y 50 \mul/cm2 del modificador orgánico en la superficie de la capa que actuará como filtro de membrana.

La cantidad de compuesto de interés en el solvente (solvente A o solvente B) puede determinarse mediante métodos que comprenden pero no se limitan al grupo que consiste de UV y/o espectroscopia de masas, electroforesis por capilaridad (EC) y cromatografía líquida de alta presión (HPLC).

La capa se une al fondo de un tubo. Un tubo comprende pero no se limita a, una cubeta, un pocillo y una placa de múltiples pocillos. Preferiblemente, dicho tubo al que la capa está unida es el tubo descrito en la solicitud de Patente Europea PE 1232792. Más preferiblemente, el tubo al que la capa está unida es el tubo descrito en la PE 05111522.8.

La cubeta preferible a la que la capa está unida, posee una cámara superior 17 y una cámara inferior 18 que poseen un eje de simetría común Y-Y que pasa a través de los centros de ambas cámaras. La cámara superior 17 y la cámara inferior 18 poseen cada una una forma sustancialmente cilíndrica. La sección transversal de la cámara superior 17 en la que la parte central de la misma es más larga que la sección transversal de la cámara inferior 18 (Figura 5).

Esta cubeta posee una cámara inferior 18 con el extremo inferior abierto 23 y en la cámara superior 17 con el extremo superior abierto 24 y una pared del fondo anular 25. Esta pared del fondo posee una obertura central circular 26 que conecta dicha cámara superior 17 con la cámara inferior 18 (Figura 5).

La superficie interna 27 de la pared del fondo 25 es parte de la superficie cónica de la sección transversal de la que forma un ángulo de alrededor de 80 grados con el eje de simetría Y-Y de la cubeta, de forma que hay un cambio brusco de la sección transversal entre dicha cámara superior 17 y dicha cámara inferior 18.

Tras los materiales hay ejemplos de materiales que pueden utilizarse para fabricar una cubeta: acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilideno (PVDF), polisulfonas, poliestireno, polipropileno (PP), copolimero de olefina cíclica (COC). Materiales con coeficiente de contracción similar (en conexión con el moldeado por inyección) y las propiedades de fusión pueden también utilizarse para fabricar un tubo.

Preferiblemente, la cubeta es parte de un conjunto 11 (Figura 4). Cada una de las cubetas en el conjunto posee las mismas dimensiones de forma, y las cubetas adyacentes están conectadas entre ellas mediante una red única 15, 16. Cada una de estas redes únicas 15, 16 posee una forma curvada.

El eje de simetría Y-Y de cada cubeta 12 que forma parte del conjunto 11 de las cubetas yace sustancialmente por un lado en el mismo plano A-A que es un plano de simetría de del conjunto de cubetas 11. La parte superior de una cubeta intermedia 12 de un conjunto 11 está conectada mediante una primera red única 15 a la cubeta adyacente 13 que yace en un lado de la cubeta intermedia 12 y está conectada mediante una segunda red única 16 a la cubeta adyacente 14 que yace en el lado opuesto de la cubeta intermedia 12. La primera red única 15 y la segunda red única 16 yacen en los lados opuestos de dicho plano de simetría A-A.

Las redes 15, 16 son flexibles y por lo tanto facilitan la inserción de las cubetas en un soporte de cubetas a pesar de las variaciones de la longitud del conjunto de cubetas 11 que se debe a diferentes coeficientes de contracción de los diferentes materiales utilizados para la fabricación de los conjuntos de cubetas 11 mediante moldeado por inyección.

Algunas de las cubetas del conjunto de cubetas 11 poseen cierres 21 y 22 (Figura 4B) que forman parte de la cubeta y que sirven para fijar o desfijar la cubeta al soporte de cubetas 52. En otra realización preferible, el soporte de cubetas 52 tiene una forma sustancialmente rectangular y posee cuatro costillas centrales localizadas cada una en la superficie externa de una de las esquinas del soporte de cubetas 52 (Figura 8).

Alguna de las cubetas del conjunto de cubetas 11 presenta costillas orientadas de forma radial 19, 29 (Figura 4B) que sirven para posicionar de forma exacta la cubeta en una obertura del soporte de cubetas 32.

El conjunto de cubetas 11 está hecho mediante moldeado por inyección a partir de un primer material plástico seleccionado que es particularmente adecuado para utilizarlo en combinación con un segundo material plástico seleccionado del que se hace la capa. Esta capa está adaptada para estar unida estrechamente a cada cubeta del conjunto de cubetas para cubrir al menos una obertura de cada cubeta.

El aparato de moldeado por inyección para fabricar el conjunto de cubetas está configurado y dimensionado preferiblemente para poder llevar a cabo el moldeado por inyección de diferentes materiales con diferentes coeficientes de contracción con el mismo aparato.

Tras los materiales están los ejemplos de materiales que pueden utilizarse para fabricar el conjunto de cubetas 11: acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilideno (PVDF), polisulfonas, poliestireno, polipropileno (PP), copolimero de olefina cíclica (COC). Materiales con coeficiente de contracción similar (en conexión con el moldeado por inyección) y las propiedades de fusión pueden también utilizarse para fabricar el conjunto de cubetas 11.

La unión de la capa a cada cubeta puede realizarse mediante el pegado de la capa y de la cubeta o mediante un proceso de soldadura. La capa unida a cada cubeta individual se une solo a esta cubeta individual y no posee conexión con ninguna otra cubeta o con una lámina unida a una cubeta diferente.

La unión de la capa a la cubeta debe asegurar una conexión fuerte media (conexión fuerte líquida) de estos componentes.

Un tubo más preferible a la que la capa se une es una cubeta que posee una cámara superior 37 y una cámara inferior 38 y un eje de simetría común Y-Y que pasa a través de los centros de ambas cámaras. La cámara superior 37 y la cámara inferior 38 poseen cada una una forma sustancialmente cilíndrica. La sección transversal de la cámara superior 37 en la parte central de la misma es más grande que la sección transversal de la cámara inferior 38 (Figura 7A).

La cámara inferior 38 posee un extremo inferior abierto 33. La cámara superior 37 posee un extremo superior abierto 34 y una pared del fondo en anillo 35. Esta pared del fondo posee una obertura central circular 36 que conecta dicha cámara superior 37 con la cámara inferior 38.

La superficie interna de la pared del fondo 45 es parte de una superficie cónica cuya sección transversal forma un ángulo de alrededor de 80 grados con el eje de simetría Y-Y de la cubeta, de forma que hay un cambio brusco de la sección transversal entre dicha cámara superior 37 y dicha cámara inferior 38.

El conjunto de cubetas 31 está hecho mediante moldeado por inyección de un primer material plástico seleccionado que es particularmente adecuado para utilizar en combinación con un segundo material plástico seleccionado del que se fabrica una capa. Esta capa se adapta para estar estrechamente unida al menos a una cubeta del conjunto de cubetas para cubrir al menos una obertura de la cubeta. E mismo material plástico puede utilizarse para dicho primer material plástico y dicho segundo material plástico.

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La unión de la capa a cada cubeta puede realizarse mediante el pegado de la capa y de una o más cubetas o mediante un proceso de soldadura. La capa unida a cada cubeta individual se une sólo a esta cubeta individual y no posee conexión con ninguna otra cubeta o con una capa unida a una cubeta diferente.

La unión de la capa a la cubeta debe asegurar una conexión fuerte media (conexión fuerte líquida o gaseosa) de estos componentes.

Cada cubeta del conjunto 31 posee la misma forma y dimensiones y las cubetas adyacentes están conectadas entre ellas mediante una red única 35, 36. Cada una de estas redes únicas 35, 36 es flexible y presenta una forma curvada (Figura 6).

El eje de simetría Y-Y de cada cubeta 32 que forma parte del conjunto 31 de cubetas yace sustancialmente en el mismo plano A-A que es un plano de simetría del conjunto de cubetas 31. La parte superior de una cubeta intermedia 32 del conjunto 31 está conectada mediante una primer red única 35 a la cubeta adyacente 33 que yace en un lado de la cubeta intermedia 32 y está conectada mediante una segunda red única 36 a la cubeta adyacente 34 que yace en el lado opuesto de la cubeta intermedia 32.

Las redes únicas 35, 36 son flexibles y facilitan de esta manera la inserción de las cubetas en un soporte de cubetas, por ejemplo el soporte de cubetas 52, a pesar de las variaciones en la longitud del conjunto de cubetas 31 que se deben a los diferentes coeficientes de contracción de los materiales utilizados para fabricar los conjuntos de cubetas 31 mediante moldeado por inyección. Estas redes únicas 35, 36 pueden yacer en cualquiera de los dos lados opuestos del plano A-A (Figura 5).

Al menos dos de las cubetas del conjunto 31 disponen de medios que son parte integrante de la cubeta para conectar de forma reversible las cubetas al soporte de cubetas. Preferiblemente, estas formas de conexión son los cierres 41 y 42. En una realización preferible, el soporte de cubetas es de una forma sustancialmente rectangular y posee cuatro costillas centrales localizadas en la superficie externa de una de las esquinas del soporte de cubetas como el soporte de cubetas 52 en la Figura 8.

Preferiblemente, la distribución de cubetas con medios de conexión a lo largo del conjunto es equitativa. Si dos cubetas poseen medios de conexión, preferiblemente la primera y la última cubeta poseen medios de conexión, o la segunda y la penúltima cubeta poseen medios de conexión, o la tercera y la antepenúltima cubeta poseen medios de conexión, y así sucesivamente.

En una realización preferible, en una disposición de ocho cubetas, la primera cubeta, la tercera cubeta, la cuarta, la quinta, la sexta y la octava cubeta poseen medios de conexión.

Como puede apreciarse en la Figura 8, una disposición de dos dimensiones 51 de las cubetas de acuerdo con el soporte de cubetas 52 con un conjunto matriz 53 de aperturas 54 para colocar las cubetas 12, 32 de al menos un conjunto de cubetas lineal 11, 31 con las características descritas anteriormente. Cada una de las cubetas 12, 32 del conjunto de cubetas 11, 31 tiene una forma y unas dimensiones que encajan perfectamente en una de las aperturas 54 del soporte de cubetas 52.

Como se muestra en la Fig. 9, pueden apilarse dos o más conjuntos de cubetas de dos dimensiones 51 y 81, cada una de las cuales posee la estructura anteriormente descrita con referencia a la Figura 8, una sobre otra para formar un conjunto de cubetas de tres dimensiones. Los componentes de tal conjunto se han configurado y dimensionado de forma que las cubetas con la misma posición relativa en sus respectivos soportes se sitúan de forma precisa una sobre la otra con coincidencia de sus ejes de simetría, una de dichas cubetas tomando la posición de una cubeta superior 91 y la otra cubeta tomando la posición de una cubeta inferior 92. En una realización preferible, una porción de la parte inferior de cada cubeta superior 91 se sitúa dentro de la cámara superior de la correspondiente cubeta inferior 92 y el extremo inferior de la cubeta superior 91 está a una distancia predeterminada de la pared del fondo de la cámara superior de la cubeta inferior 92.

Como se muestra en la Figura 10, un conjunto de cubetas de dos dimensiones 51 que posee la estructura anteriormente descrita en referencia a la Figura 8, también puede apilarse sobre una placa de soporte estándar 85 de una placa de múltiples pocillos estándar.

Una realización de la presente invención está relacionada con un método de determinación de la lipofilia de un compuesto lipofílico de interés que comprende: a) proporcionar una capa hidrofóbica unida al fondo del tubo, b) proporcionar un solvente no polar y un solvente polar hidrofílico, c) impregnar dicha capa con un solvente no polar, estando el solvente no polar unido a la capa y sin que se vierta al solvente polar, d) aplicar el compuesto de interés de la capa impregnada, e) añadir el solvente hidrofílico a una placa e insertar el tubo en la placa, de forma que la capa impregnada con el solvente no polar esté en contacto con el solvente polar, f) eliminar el solvente hidrofílico después de alcanzarse el equilibrio de distribución, y g) determinar la cantidad del compuesto de interés en la fase de solvente lipofílico unida a la capa hidrofóbica.

El término "capa hidrofóbica" como se utiliza aquí se refiere a un transportador de solvente no polar. Preferiblemente, la capa hidrofóbica es una membrana hidrofóbica. Tales membranas pueden estar formadas como una malla del material hidrofóbico o una capa con poros. Preferiblemente, el tamaño de poro o el tamaño de la malla está en el rango entre 0,01 - 100 \mum. El material transportador de la membrana hidrofóbica comprende pero no se limita a PVDF, PTFE, copolímero de oleofina cíclica (COC), PP o PC.

Los compuestos lipofílicos de interés pueden ser por ejemplo hidrocarburos aromáticos o alifáticos policíclicos, vitaminas solubles en grasas, fármacos hidrofóbicos como los fungicidas, hidrocarburos aromáticos o alifáticos que contienen halógenos, hidrocarburos aromáticos o alifáticos que contienen nitrógeno y oxígeno.

El solvente no polar es inmiscible o difícilmente miscible con el solvente polar. El solvente no polar preferible es el octanol (octan-1-ol). El solvente polar preferible es el agua o un tampón.

Otra realización de la presente invención está relacionada con un método para determinar la lipofilia de un compuesto hidrofílico de interés que comprende: a) proporcionar una capa hidrofílica unida al fondo del tubo, b) proporcionar un solvente polar y un solvente no polar, c) impregnar dicha capa con un solvente polar, estando unido el solvente polar a la capa y sin que se vierta al solvente no polar, d) aplicar el compuesto de interés sobre la capa impregnada, e) añadir el solvente no polar en una placa e insertar el tubo en la placa, de forma que la capa impregnada con el solvente polar entre en contacto con el solvente no polar, f) eliminar el solvente no polar, y g) determinar la cantidad del compuesto de interés en la fase hidrofílica unida a la capa hidrofílica.

El término "capa hidrofílica" como se utiliza aquí se refiere a un transportador del solvente polar. Preferiblemente, la capa hidrofílica es una membrana hidrofílica. Tal membrana puede estar formada como una malla de material hidrofílico o como una capa con poros. Preferiblemente, el tamaño de poro o tamaño de malla está en el rango entre 0.01- 100 \mum. El material transportador hidrofílico comprende pero no se limita a la celulosa acetato, fibras de vidrio, difluoruro de polivinilideno hidrofílico (PVDF), policarbonato hidrofilizado y otros materiales de filtrado hidrofilizados.

El solvente no polar es inmiscible o difícilmente miscible con el solvente polar. El solvente no polar preferible es el octanol (octan-1-ol). El solvente polar preferible es el agua o un tampón.

La presente descripción está relacionada con la utilización de una capa impregnada con un solvente para la determinación de la lipofilia de un compuesto de interés.

La capa puede ser una capa hidrofóbica o hidrofílica. El solvente puede ser un solvente no polar (hidrofóbico) o polar (hidrofílico). Si el solvente es un solvente no polar la capa es preferiblemente hidrofóbica. Si el solvente es un solvente polar, la capa es preferiblemente hidrofílica.

El compuesto de interés puede ser cualquier compuesto químico o biológico. El compuesto de interés puede ser por ejemplo un compuesto orgánico, una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Un compuesto orgánico también puede incluir moléculas orgánicas-inorgánicas. El término moléculas orgánicas-inorgánicas como se utiliza aquí se refiere a una molécula orgánica en la que al menos un átomo inorgánico se une a un átomo de carbono. Un átomo inorgánico puede ser por ejemplo un átomo metálico como por ejemplo silicio (Si) o germanio (organometálicos, por ejemplo un bioisoéster de Si o Ge de moléculas orgánicas).

El compuesto de interés puede ser sólido o líquido. El compuesto de interés puede disolverse en un solvente adecuado como por ejemplo DMSO (dimetilsulfóxido). Un solvente adecuado para un compuesto hidrofílico es preferiblemente un solvente polar y un solvente adecuado para un compuesto lipofílico es preferiblemente un solvente no polar.

El compuesto de interés puede ser un compuesto lipofílico o un compuesto hidrofílico. Si el compuesto de interés es un compuesto lipofílico, la capa puede ser una capa hidrofóbica impregnada de un solvente no polar. Preferiblemente, el solvente no polar es el octanol. Si el compuesto es un compuesto hidrofílico, la capa puede ser una capa hidrofílica impregnada de un solvente polar. Preferiblemente, el solvente no polar es agua o un tampón.

En una realización preferible, la capa está unida al fondo de un tubo. El tubo comprende, pero no se limita a, una cubeta, un pocillo y una placa de múltiples pocillos. Más preferiblemente dicha capa hidrofóbica está unida a un tubo como se describe en las solicitudes de Patente Europea PE 1232792 o PE 05111522.8. Un tubo preferible se ha descrito en otro punto de este documento.

Los siguientes materiales son ejemplos de materiales que pueden utilizarse para fabricar un tubo: acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilideno (PVDF), polisulfonas, poliestireno, polipropileno (PP) o copolímero de oleofina cíclica (COC). También pueden utilizarse para la fabricación del tubo materiales con un coeficiente de contracción (en relación con el moldeado por inyección) y con propiedades de fusión similares.

El método de la presente invención permite una determinación rápida de valores elevados de lipofilia. Además, se ha de utilizar menos material para analizar un compuesto y el método puede automatizarse fácilmente con un equipo de manipulación de líquidos estándar. Además, no son necesarias soluciones acuosas de referencia con riesgo de precipitación.

Una vez descrita esta invención en general, su comprensión puede mejorarse en referencia a los ejemplos específicos, que se incluyen aquí con el único propósito de ser ilustrativos y que no pretenden ser limitantes a no se rque se especifique de otro modo, en relación con las siguientes figuras.

Figuras

La Figura 1 muestra un esquema del método anteriormente utilizado. El compuesto de interés se disuelve en un solvente adecuado y se añade con un tampón hidrofílico (H) en una placa de múltiples pocillos (W). Un solvente lipofílico (L) se añade al tampón. La placa se sella (S) y mantiene en agitación hasta que se alcanza un equilibrio de distribución. Entonces se elimina la fase acuosa y se determina la cantidad del compuesto de interés en el tampón hidrofílico. Debido al volumen reducido, la separación de las fases es difícil y a menudo no es satisfactoria.

La Figura 2 muestra un esquema de una realización del método de la presente invención. Las membranas (M) están unidas a tubos (T). Las membranas están impregnadas con octanol y el compuesto de interés disuelto se aplica en la membrana. Los tubos (T) se insertan en una placa (P) que está llena con un tampón hidrofílico (HB), de forma que las membranas están en contacto con el tampón. Tras alcanzar el equilibrio los tubos simplemente pueden separarse de la placa para obtener una separación de las fases.

La Figura 3 muestra una curva de regresión lineal del log D obtenida mediante el método de la presente invención (DIFI-log D) y los valores de la bibliografía (Lit.log D). Los valores de la bibliografía se encontraron en las bases de datos de MEDChem (base de datos comercial de DAYLIGHT Chemical Information Systems Inc. 27401 Los Alto, USA), Winiwarter et al, J. Med. Chem, 41:4939-49 (1998) y Sirius Technical Application Notes, Volumen 2 (1995).

La Figura 4 muestra un conjunto lineal de cubetas 11. A) vista desde arriba del conjunto de cubetas, B) sección transversal a través del plano A-A del conjunto de cubetas en A).

La Figura 5 muestra una vista de la sección transversal de una de las cubetas 12 del conjunto lineal de cubetas 11 de la Figura 4. A) sin capa, B) con la capa unida 61.

La Figura 6 muestra un conjunto lineal de cubetas 31. A) vista desde arriba del conjunto de cubetas, B) sección transversal a través del plano A-A del conjunto de cubetas de A).

La Figura 7 muestra una vista de la sección transversal de una de las cubetas 32 del conjunto lineal de cubetas 31 de la Figura 6. A) sin capa, B) con la capa unida 71.

La Figura 8 muestra una vista desde arriba de un conjunto de cubetas de dos dimensiones 51 con un soporte de cubetas 52, un conjunto matriz 53 y apertura para las cubetas 54. En el conjunto de cubetas de dos dimensiones 51 hay insertadas dos conjuntos lineales de cubetas 11.

La Figura 9 muestra una representación de la sección transversal de los conjuntos de cubetas de dos dimensiones 51 y 81 apilados.

La Figura 10 muestra una representación de la sección transversal de un conjunto de cubetas de dos dimensiones 51 apilado sobre una placa de múltiples pocillos de análisis estándar 85.

Listado de números de referencia

11

conjunto lineal de cubetas

12

cubeta

13

cubeta

14

cubeta

15

red

16

red

17

cámara superior

18

cámara inferior

19

costilla

21

cierre

22

cierre

23

extremo inferior abierto

24

extremo superior abierto

25

pared del fondo

26

apertura

27

superficie interior de la pared del fondo 25

29

costilla

31

conjunto

32

cubeta

33

cubeta vecina

34

cubeta vecina

35

red única

36

red única

37

cámara superior

38

cámara inferior

41

costilla

42

costilla

43

extremo inferior abierto

44

extremo superior abierto

45

pared del fondo

46

apertura

51

conjunto de cubetas de dos dimensiones

52

soporte de cubetas

53

conjunto matriz de aperturas

54

aperturas (para colocar las cubetas)

61

capa

71

capa

81

conjunto de cubetas de dos dimensiones

82

soporte de cubetas

83

placa soporte

85

placa soporte estándar para una placa de múltiples pocillos estándar

91

cubeta superior

92

cubeta inferior

Ejemplos

Los reactivos disponibles a nivel comercial a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a no ser que se indique de otro modo.

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Ejemplo 1

Los experimentos de lipofilia se llevaron a cabo en placas microtituladas de 96 pocillos profundos en combinación con los nuevos tubos DIFI como se ha describe en la solicitud de Patente Europea PE 1232792.

Todos los compuestos del grupo de validación se disolvieron en dimetilsulfóxido a una concentración de 10 mM (DMSO de reserva).

El experimento se inició con una recubrimiento preciso de las membranas de PVDF hidrofóbicas de 0,45 \mum (Immobilon-P PVDF (Millipore) y PVDF-Plus (Whatman, Central: 27 Great West Road, Brentford, Middlesex, TW8 9BW, UK), que se fijaron en el fondo de los tubos DIFI.

Cada membrana se impregnó con exactamente 1 \mul de octanol y 1 \mul del DMSO de reserva.

Tras una corta incubación de 10 min. los tubos con las membranas recubiertas se conectaron a una placa de 96 pocillos profundos que se había pre-rellenado con exactamente 1600 \mul de la solución de tampón seleccionada (TAPSO 50 mM (FLUKA, BioChemika, Nº Art. 93357), pH 7,4). La construcción en sándwich resultante garantiza que la membrana está completamente sumergida en la solución de tampón (Figura 2).

Entonces se selló la placa y se mantuvo en agitación durante dos horas. Durante este tiempo la sustancia se distribuyó como corresponde entre la membrana, el octanol y la solución tampón.

Una vez se alcanzó el equilibrio de distribución (tras 2 h) los tubos se desensamblaron cuidadosamente desde la parte superior de la placa de pocillos profundos para analizar la fase del octanol que sigue atrapado en la membrana.

A continuación, el compuesto remanente en la fase de octanol se eliminó mediante lavados con octanol adicional como eluyente. La concentración de la sustancia en el eluyente se determinó entonces mediante espectroscopia UV a una longitudes de onda de absorción entre 250 y 450 nm.

Para conocer la concentración exacta en la muestra antes de la incubación con tampón, se generó una placa de referencia bajo las mismas condiciones descritas para la placa de muestra anterior. La placa de referencia se trató directamente con el eluyente y la concentración de referencia resultante en la fase de octanol se midió mediante espectroscopia UV.

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Evaluación

El valor de lipofilia log D puede calcularse a partir de la concentración de muestra tras la incubación con tampón analizada (Co) y la concentración de referencia antes de la distribución (Cref).

1

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Debido al hecho de que todas las medidas de UV se realizaron bajo las mismas condiciones, el término concentración se reemplazó por valores de absorción UV (Abs) a la misma longitud de onda.

2

En esta ecuación, Vw que es el volumen de la fase acuosa se dividió entre el volumen de la fase de octanol Vo.

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Validación

Un grupo de 14 fármacos químicamente diferentes bien caracterizados, con valores de log D conocidos a partir de bibliografía se utilizaron para validar este método. Para cada uno de los compuestos se realizaron tres determinaciones de acuerdo con el anterior método descrito. La preparación de las placas de referencia y de muestra se realizó manualmente.

Los valores de log D obtenidos (DIFI-log D) se compararon entonces con los valores de la bibliografía (Lit.log D). La Tabla 1 resume los resultados de la validación. Los datos correspondientes se utilizaron en la Figura 3.

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TABLA 1 Conjunto de validación de 14 fármacos con valores conocidos de log D a partir de la bibliografía (Lit.log D). La comparación de los valores de la bibliografía de las diferentes fuentes con los datos obtenidos mediante el nuevo método valida el método de la presente invención

3

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En comparación con el HTlog D el método de la presente invención requiere de una proporción extremadamente baja de octanol-agua para la determinación de valores altos de log D. Otras ventajas recaen en el consumo reducido de muestras y en la fácil separación de la fase de octanol y la transferencia del transportador fijado al solvente no polar a múltiples pocillos con solvente polar, aumentando así el volumen de distribución y por lo tanto el rango de medición para compuestos altamente lipofílicos (Tabla 2).

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TABLA 2 HTlog D en comparación con la nueva aproximación

4

Claims (6)

1. Un método para determinar la lipofilia de un compuesto de interés que comprende

a)

proporcionar una capa unida al fondo de un tubo,

b)

proporcionar un solvente A y un solvente B, en el que el solvente A es no polar y el solvente B es polar, o el solvente A es polar y el solvente B es no polar

c)

impregnar dicha capa con un solvente A, en el que el solvente A está unido a la capa y no se fuga en el solvente B,

d)

aplicar un compuesto de interés en la capa impregnada,

e)

añadir el solvente B en una placa e insertar el tubo en la placa de forma que la capa impregnada con el solvente A esté en contacto con el solvente B,

f)

eliminar el solvente B tras alcanzar el equilibrio de distribución, y

g)

determinar la cantidad del compuesto de interés en al menos una de las fases del solvente.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la cantidad del compuesto de interés se determina en la ase del solvente que se adhiere a la capa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que la capa es una capa hidrofóbica.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 el que la capa es una capa hidrofílica.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el solvente no polar es octanol.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la capa es una membrana.