ES2339763T3 - Molecula de motor rotativo v1-atpasa. - Google Patents
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Abstract
Una variante de una molécula de motor rotativo V1-ATPasa, resistente al calor que es capaz de continuar la actividad de ATP por al menos una hora después de la adición de ATP como sustrato, la V1-ATPasa es una porción V1 de una V0V1-ATPasa obtenible de la bacteria termófila, Thermus thermophilus, y es una molécula compleja que tiene tres subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D que constituyen la porción V1 de una V0V1-ATPasa, en donde, en la variante, las subunidades A tienen un resto Ala que sustituye al resto Ser en la posición 232 y un resto Ser que sustituye al resto Thr en la posición 235 en la secuencia de Nº de identificación 3.
Description
Molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa.
La presente invención se refiere a una nueva
molécula de motor rotativo V_{1}-ATPasa útil como
un nano actuador de una micro máquina o una nano máquina, o
similar.
Se está prestando atención al desarrollo de una
micro máquina o una nano máquina que se mueva mecánicamente según
el tamaño de una molécula. Esto es debido a que dicha micro máquina
o nano máquina se considera útil para, por ejemplo, un robot
molecular que realiza el cableado de un ordenador molecular o un
robot médico que opera una cura en el cuerpo humano.
Para la fabricación de una micro máquina y una
nano máquina, se requiere el desarrollo de una variedad de
tecnologías, que incluyen dispositivos de elementos individuales (un
sensor, un actuador y una máquina miniatura) para procesarlos o
ensamblarlos (micro maquinado y nano maquinado). En particular, el
desarrollo de micro actuadores y nano actuadores (motores
rotativos), por ejemplo, dispositivos de conducción de micro
máquinas, es esencial para el movimiento auto regulado de las
máquinas, y se está persiguiendo el desarrollo de dispositivos para
motor que utilizan diversas tecnologías de manejo precisas. Sin
embargo, incluso los micro actuadores fabricados mediante
procedimientos que usan tecnologías de manejo precisas no son más
pequeños de alrededor de 100 \mum. Se requieren más
miniaturizaciones de los instrumentos del motor para instalarlos en
micro máquinas y nano máquinas.
De forma que, se propone además de la
construcción de un motor mediante la tecnología de manipulación
precisa, la utilización de una molécula única que tenga la
capacidad de movimiento rotativo como un motor.
En general, una molécula capaz de actuar como un
motor necesita satisfacer dos factores: que tenga un mecanismo de
fuerza que convierta la energía exterior en un movimiento rotativo,
y que la rotación lograda sea en una dirección. Los compuestos
orgánicos de bajo peso molecular conocidos que satisfacen tales
condiciones incluyen por ejemplo
(3R,3'R)-(P,P)-trans-1,1',2,2',3,3',4,4'-octahidro-3,3'-dimetil-4,4'-bifenantridieno
(Nature 401: 152-155, 1999) y
Tripticil(4)heliceno (Nature 401:
150-152, 1999). El anterior tiene simetría a la
derecha y a la izquierda del doble enlace
carbono-carbono, pero tiene una estructura retorcida
debido al bloqueo interno estérico. La adición del calor adecuado o
la luz adecuada hace posible rotar la molécula en una dirección a
través de cuatro etapas de proceso. Además, se completa un ciclo a
través de dos reacciones de luz y una isomerización por calor, y el
movimiento procede en solamente una dirección. En otras palabras,
este compuesto orgánico conduce al movimiento rotativo vía la
isomerización por calor y la reacción por la luz. La rotación vía
la reacción por la luz es muy rápida (a nivel de picosegundos), pero
la rotación vía isomerización por calor necesita unos pocos
minutos, y por ello es inadecuada para el uso actual. Además, el
compuesto tiene el problema de que la fuerza conductora de rotación
es extremadamente débil. Por otro lado el calor de isomerización
causa la rotación en una dirección de la molécula que utiliza las
reacciones químicas de adición de fosgeno y la formación y rotura
del enlace de uretano. Sin embargo, esta molécula es incapaz de
repetir la rotación, un defecto fatal para un actuador.
Por otra parte, se conocen biomoléculas que como
un motor de molécula única capaz de ser utilizado en una micro
máquina, una nano máquina o similar, incluyen un motor de flagelo
(Microbiol. 6: 1-18, 1967, Nature 245:
380-382, 1973), una ATP sintasa (Nature 386:
299-302, 1997), un motor de miosina (Biochem.
Biophis. Res. Comm. 199: 1057-1063, 1994, Curr.
Opin. Cell. Biol. 7: 89-93, 1995), un motor basado
en el microtúbulo (Cell 42: 39-50, 1985), una
proteína de motor de la sintasa del ácido nucleico (Nature 409.
113-119, 2001), y semejantes.
De estos, una ATP sintasa es una proteína de
membrana presente por doquier, en localizaciones tales como las
membranas internas de la mitocondria en eucariotas, membranas
tilacoides de los cloroplastos, membranas de célula procariota, y
semejantes, y sintetiza la mayoría del ATP consumido en las células.
Una ATP sintasa (F_{0}F_{1}-ATP sintasa) es un
complejo de proteína de membrana muy grande con peso molecular de
hasta alrededor de 500.000, y consiste en una porción F_{0}
presente dentro de una membrana y una porción F_{1} presente
fuera de la membrana. La porción F_{0} es un pasaje para un protón
(H^{+}) que pasa a través de la membrana, y la porción F_{1} es
una porción catalítica que sintetiza e hidroliza ATP. El peso
molecular de la porción F_{1} es de alrededor de 380.000, por
ejemplo, la composición de la subunidad de la porción F_{1} en
una ATP sintasa derivada de las bacterias es \alpha_{3}
\beta_{3} \delta \gamma_{1} \varepsilon_{1}. Las
subunidades \alpha y \beta ambas tienen una porción de unión a
ATP similar, pero la actividad catalítica está presente en la
subunidad \beta. Ambas alternativamente se alinean para formar un
anillo y en el centro de este anillo \alpha_{3} \beta_{3},
está presente una subunidad \gamma. Una subunidad \delta se une
a la parte de arriba del anillo \alpha_{3} \beta_{3}; una
subunidad \varepsilon que controla la actividad de hidrólisis de
ATP se une a la subunidad \gamma. Por otra parte, la porción
F_{0} tiene un peso molecular de alrededor de 100.000, y la
composición de aminoácidos contiene en cantidad ácido glutámico y
ácido asparagínico, necesarios para el movimiento del protón. La
composición de la subunidad es
a_{1}b_{2}c_{9-12}, la subunidades "c"
están arregladas como un anillo (el anillo "c") en la
membrana, y al anillo "c" están unidas las subunidades "a"
y dos subunidades "b" que tienen cada una un brazo que sale
lejos fuera de la membrana. Por esto, una
F_{0}F_{1}-ATP sintasa tiene una porción
F_{1} y una porción F_{0} que están unidas una a otra en dos
lugares: \gamma \varepsilon-anillo "c" y
\delta b_{2.} Una característica adicional es el hecho de que
esta molécula de F_{0}F_{1}-ATP sintasa tiene
dos clases de dispositivos que generan torsión. Uno es un
dispositivo del tipo conductor de ATP presente en la porción
F_{1} y el otro es un dispositivo del tipo conductor de protón
presente en la porción F_{0}. Esto es, cuando la porción F_{0}
toma un protón en la membrana celular, el anillo "c" rota en el
sentido de las agujas del reloj; cuando la porción F_{0} descarga
un protón al exterior de la membrana celular, el anillo "c"
rota en el sentido contrario a las agujas del reloj. Por otra parte,
durante la síntesis de ATP, la porción F_{1} rota en el sentido
de las agujas del reloj viendo la subunidad \gamma desde el lado
F_{0}, y la porción F_{1} rota en el sentido contrario a las
agujas del reloj durante la descomposición del ATP. Mediante la
provisión de estas dos clases de dispositivos generadores de
torsión, la torsión generada por la ATP sintasa está en el orden de
decenas de piconewtons x nm, y de esta forma la sintasa tiene una
fuerza conductora suficiente para un motor molecular.
Adicionalmente, una ATP sintasa actúa en un sistema acuoso y es así
lo más adecuado como actuador que trabaje en el cuerpo humano, y
también puede manipular una proteína, azúcar, lípido, o ácido
nucleico en el cuerpo ya que tiene suficiente poder para mover la
actina.
Los inventores de la presente invención
mejoraron esta molécula de F_{0}F_{1}-ATP
sintasa, y tienen ya inventada y solicitada la invención de una
molécula de F_{0}F_{1}-ATP sintasa modificada
capaz de controlar la moción en un amplio intervalo de velocidad de
rotación y su utilización (Solicitud de patente japonesa Nº.
2002-148232; fecha de solicitud: 22 de Mayo de
2002). Además, recientemente, se describió una molécula de motor
rotativo, que está hecha por la incorporación de un lugar de unión
de zinc en una molécula de F_{1}-ATP sintasa y
que es capaz de controlar la iniciación y parada de la rotación por
medio del zinc (Nature Materials 1: 173-177,
2002).
Como se describió anteriormente, varias
moléculas de motor rotativo se proponen como miembros conductores
de una micro máquina, una nano máquina, y semejantes, y las
moléculas cada una tiene características en cuanto al tipo de
rotación, el número de revoluciones, la torsión, el método de
controlar la rotación etc. Según esto, para la fabricación actual
de una micro máquina o nano máquina, se necesita seleccionar una
molécula apropiada entre una variedad de moléculas candidatas
dependiendo de su aplicación y de la construcción de la máquina.
Sin embargo, no se puede decir que las moléculas de motor rotativo
descritas hasta ahora puedan cada una ser adecuadas para todas las
diferentes aplicaciones y construcciones de una micro máquina y una
nano máquina. Por esta razón, en el desarrollo de una micro máquina
o una nano máquina o similares, cada adición de una más a la fila
de las moléculas de motor rotativo se desea grandemente.
De esta manera se intenta que esta solicitud
proporcione una nueva molécula de motor rotativo que es diferente
en sus propiedades de las moléculas convencionales de motor
rotativo.
Además, la solicitud también tiene otro
propósito el de proporcionar una molécula de motor rotativo nueva,
mejorada, que además suaviza el movimiento rotativo y también añade
medios para que la molécula transfiera el movimiento rotativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta solicitud, como invención para resolver el
problema descrito anteriormente, proporciona una variante de una
molécula de motor rotativo V_{1}ATPasa que rota en la presencia de
ATP, V_{1}ATPasa es una molécula compleja que tiene tres
subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D que constituyen
la porción V_{1} de una V_{0}V_{1}-ATPasa,
como se define en la reivindicación 1.
La V_{1}-ATPasa de esta
invención incluye la subunidad A como una porción catalítica y las
subunidades A y B se colocan alternativamente, desde un cilindro de
hexámero como el \alpha_{3} \beta_{3} de una
V_{0}V_{1}-ATPasa. La subunidad D está embebida
en la cavidad central de este cilindro de A_{3}B_{3}, una
subunidad F está preferiblemente unida a la subunidad D, y las
subunidades D y F actúan como un rotor (vara rotativa, eje
rotativo).
La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa es resistente al calor. Se prefiere
que la V_{1}-ATPasa se derive de la bacteria
termófila, Thermus thermophilus.
Preferiblemente la molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa derivada de la termófila Thermus
thermophilus es un complejo que tiene tres péptidos de Nº de
identificación de secuencia 3 que corresponden a la subunidad A,
tres péptidos de Nº de identificación de secuencia 4 que
corresponden a la subunidad B, y un péptido de Nº de identificación
de secuencia 5 que corresponde a la subunidad D, en donde la
molécula de motor rotativo V_{1}-ATPasa tiene
sustituciones del resto Ser en la posición 232 por un resto Ala y
del resto Thr en la posición 235 por un resto Ser en la secuencia
de Nº de identificación 3.
En esta V_{1}-ATPasa mejorada,
la mejora de la subunidad A, la porción catalítica, permite la
desaparición de la inhibición de MgADP y la aceleración de la
actividad de hidrólisis de ATP. La rotación de un tipo silvestre de
V_{1}-ATPasa tiende a ser suprimida debido a la
inhibición de MgADP, y la V_{1}-ATPasa modificada
que previene la inhibición de MgADP exhibe un movimiento rotacional
eficiente.
Además, un modo preferido de la presente
invención es que la molécula V_{1}-ATPasa de
motor rotativo es una molécula mejorada en la que uno o ambas de
las subunidades A y B están fijas sobre un sustrato. En este caso,
un modo preferido es que la molécula esté fijas sobre el sustrato
vía una etiqueta de His unida al N terminal de la subunidad A.
En todavía otro modo preferido de la invención,
la molécula V_{1}-ATPasa de motor rotativo tiene
una junta de unión a la subunidad D. En este caso, el material de
la junta está unido a al menos uno de los restos Cys que sustituye
al resto Glu en la posición 48 y el resto Cys que sustituye al
resto Gln en la posición 55 de la secuencia de Nº de identificación
5, y el caso donde todos los restos de Cys en las subunidades A y B
son reemplazadas por restos que no sean Cys es otro modo
preferido.
La molécula V_{1}-ATPasa de
motor rotativo comprende la porción V_{1} (un complejo que
comprende tres subunidades A, tres subunidades B, una subunidad D)
del tipo V (tipo tonoplasto) ATPasa
(V_{0}V_{1}-ATPasa) presente en los organelos
(vacuolas, lisosoma, vesícula de Golgi, membrana de la célula,
vesícula recubierta, gránulo secretor, etc) de una bacteria o
eucariota. Aunque una V_{0}V_{1}-ATPasa sintasa
se sabe ya que sirve como una molécula de motor rotativo, la
porción V_{1} (V_{1}-ATPasa) de esta V_{0}
V_{1}-ATPasa no se sabía en absoluto que tuviera
movimiento rotativo. La V_{1}-ATPasa de esta
invención está basado en el descubrimiento de que la subunidad D
localizada dentro de un "cuerpo cilíndrico" que comprende tres
subunidades A y tres subunidades B y una subunidad D funciona como
una vara rotativa.
Además, la porción V_{1} de una
V_{1}-ATPasa preferiblemente tiene una subunidad F
unida a la subunidad D. Además, los ejemplos incluyen una variante
dentro de la cual se incorpora una porción reconocedora del zinc,
como se describe en Nature Materials 1: 173-177,
2002 como se indicó anteriormente.
De aquí en adelante, cada invención como se
describió anteriormente será establecida en detalle con las
realizaciones de la invención. Para las realizaciones, una variedad
de técnicas usadas para llevar a cabo esta invención, con la
exclusión de las técnicas en las que particularmente se indican las
fuentes de las mismas, pueden ser fácilmente y exactamente llevadas
a cabo por una persona con conocimientos de la técnica según la
bibliografía o similares. Por ejemplo, pueden usarse como
referencia las descripciones de la ingeniería genética y la
tecnología de biología molecular, tal como Sambrook y Maniatis, en
Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, 1989; y Ausubel, F. M. et al.,
Current John Wiley & Sons, Nueva Cork, N. Y. Protocols in
Molecular Biology, 1995.
La figura 1 es un diagrama esquemático que
indica la rotación observada de la V_{1}-ATPasa.
La flecha indica la dirección de la rotación.
La figura 2 es el resultado del análisis de
western blotting que ha confirmado la biotinilación de una subunidad
D o una subunidad F. El lado izquierdo (caminos 1 a 4) se obtiene
por teñido de CBB y el lado derecho (caminos 5 a 8) se obtienen por
teñido del conjugado fosfatasa
alcalina-estreptavidina. Los caminos 1 a 5 indican
V_{1}-ATPasa en la que la subunidad D estaba
biotinilada, los caminos 2 y 6 indican
V_{1}-ATPasa con una subunidad F biotinilada, los
caminos 3 y 7 indican V_{1}-ATPasa no biotinilada,
y los caminos 4 y 8 indican marcadores de peso molecular.
La figura 3 muestra las medidas de rotación de
las cuentas fijadas sobre las subunidades D a lo largo del tiempo.
"A" muestra la rotación de la cuenta en la presencia de ATP4 mM
y azida sódica 0,5 mM. "B" a "D" muestran los resultados
de las rotaciones de las cuentas en la ausencia de azida sódica,
donde "B" es una solución de ATP 4 mM , "C" es una
solución de ATP 0,5 mM, y "D" es una solución de ATP 0,2 mM
.
La figura 4 indica la medida de la rotación de
la cuenta fijada sobre una subunidad F en solución de ATP 4 mM.
La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de esta invención, es una variante de
la parte V_{1} [V_{1}-ATPasa] de la
V_{0}V_{1}-ATPasa producida a partir de varias
bacterias o eucariotas. La V_{1}-ATPasa puede
producirse por ingeniería genética usando un polinucleótido
(fragmento de ADN, fragmento de ARN, o preferiblemente fragmento de
cADN). De aquí en adelante puede denominarse como "polinucleótido
de V_{1}-ATPasa" que codifica a la
V_{1}-ATPasa. Las secuencias de polinucleótidos
(fragmentos de cADN) que codifican
V_{0}V_{1}-ATPasas se revelan en muchas bases
de datos (por ejemplo, base de datos de Gen Bank: URL: http://www.
ncbi. nlm. nih. gov), y usando la información de la secuencia en un
procedimiento de hibridación de sonda o un procedimiento de PCR,
puede obtenerse fácilmente el polinucleótido (fragmento de cADN) que
codifica una V_{0}V_{1}-ATPasa a partir de
bibliotecas existentes de cADN, o similares.
La expresión de este polinucleótido
V_{1}-ATPasa usando un procedimiento bien conocido
de ingeniería genética puede proporcionar una
V_{1}-ATPasa compleja comprendida de tres
subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D. Por ejemplo,
la recombinación de un polinucleótido V_{1}-ATPasa
en un vector de expresión que tiene un promotor de ARN polimerasa y
a continuación la adición de este vector recombinante a un sistema
de traducción in vitro que incluya la ARN polimerasa
correspondiente del promotor, tal como un lisado de reticulocitos
de conejo o un extracto de embrión de trigo, puede producir
V_{1}-ATPasa con capacidad de rotación in
vitro. Ejemplos de promotor de ARN polimerasa pueden incluir T7,
T3 y SP6. Ejemplos de vectores que contienen estos promotores de
ARN polimerasa incluyen pKAl, pCDM8, pT3/T7 18, pT7/3 19, y
pBluescript II. También, la expresión de un polinucleótido
V_{1}-ATPasa en un sistema de vector hospedante
adecuado puede producir la molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa en una célula procariota tal como
E. coli, o el bacilo del heno, una célula eucariota tal como
una levadura, una célula de un insecto, una célula de mamífero, o
una célula vegetal, o similares. Por ejemplo, cuando se expresa la
V_{1}-ATPasa en un microorganismo tal como E.
coli, El polinicleótido se recombina en un vector de expresión
que tiene un origen replicable en el microorganismo, un promotor,
una parte de unión al ribosoma, una parte de clonado de ADN, un
terminador y similares, a fin de preparar un vector de expresión
que transforme la célula hospedante. El cultivo de este
transformador puede producir las moléculas dianas
V_{1}-ATPasa a partir del cultivo en cantidad.
Ejemplos de vectores de expresión para E. coli incluyen
sistemas pUC, pBluescript 15 II, sistema de expresión pET, y
sistema de expresión pGEX. Además, cuando el polinucleótido se va a
expresar en una célula eucariota, se inserta el polinucleótido en
un vector de expresión para una célula eucariota, vector que tiene
un promotor, una región de corte y empalme, una parte de adición de
poli(A) y similares, produciendo un vector recombinante.
Pueden obtenerse a partir de células eucariotas transfectadas con
este vector las moléculas dianas V_{1}-ATPasa.
Ejemplos de vectores de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG,
pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, el vector
EBV, pRS, y pYES2. Las células eucariotas que pueden usarse
incluyen células de mamíferos de cultivo tales como la línea
celular renal de embrión humano HEK293, la línea celular renal de
mono COS7, la línea celular del ovario del hamster chino CHO, o
células de cultivo primario aisladas de órganos humanos, y
similares. Las células eucariotas que pueden usarse incluyen
también la levadura en ciernes, levadura de fisión, células del
gusano de la seda, y células del huevo de Xenopus. Para que el
vector de expresión se transfeccione en células eucariotas, puede
usarse un método conocido tal como la electroporación, el método del
fosfato cálcico, método del ribosoma, método del dextrano DEAE, y
similares. Para el aislamiento y purificación de la
V_{1}-ATPasa expresada a partir de las células
transformadoras, pueden llevarse a cabo operaciones de separación en
combinación bien conocidas. Ejemplos del aislamiento y purificación
incluyen el tratamiento con un agente modificador tal como la urea
o con un tensioactivo, tratamiento por ultrasonido, digestión
enzimática, método de la precipitación por la adición de sal al
disolvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración
con geles, SDS-PAGE, electroforesis de focalización
isoeléctrica, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía
hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase
inversa, y similares.
Además, para el uso industrial, la molécula de
motor rotativo V_{1}-ATPasa de esta invención es
una variante de una molécula V_{1}-ATPasa
resistente al calor, la V_{1}-ATPasa puede
obtenerse del Thermus thermophilus termófilo, que es capaz
de crecer incluso a 70ºC o más. El polinucleótido de
V_{1}-ATPasa derivado del Thermus
thermophilus tiene la secuencia básica de la secuencia de Nº de
identificación 1. El polinucleótido V_{1}-ATPasa
derivado de Thermus thermophilus codifica un complejo del
polipéptido (subunidad F) que consiste en la secuencia de
aminoácidos de la secuencia de Nº de identificación 2, el
polipéptido (subunidad A) de la secuencia de Nº de identificación
3, el polipéptido (subunidad B) de la secuencia de Nº de
identificación 4, y el polipéptido (subunidad D) de la secuencia de
Nº de identificación 5. Por lo tanto, la expresión de
334-4196 de la secuencia de Nº de identificación 1
por medio de la tecnología de ingeniería genética mencionada
anteriormente puede proporcionar una V_{1}-ATPasa
resistente al calor que comprende tres subunidades A, tres
subunidades B y una subunidad D. Además la expresión de
1-4196 de la secuencia de Nº de identificación 1
puede proporcionar una V_{1}-ATPasa resistente al
calor que tiene una subunidad F unida a la subunidad D de la
misma.
La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de esta invención tiene al resto Ala
en sustitución del resto Ser en la posición 232 y al resto Ser en
sustitución del resto Thr en la posición 235, en la secuencia de Nº
de identificación 3, (de aquí en adelante, una molécula que tiene
ambas sustituciones puede denominarse una "variante TSSA"). En
otras palabras, al contrario que con una V-ATPasa de
una célula eucariota, la reacción de la
V_{1}-ATPasa derivada de una bacteria tal como
T. termophilus tiene tendencia a ser interrumpida durante el
trasiego metabólico del catalizador debido a la llamada inhibición
de MgADP (J Biol Chem 273. 20504-20510, 1998).
Normalmente, esta restricción de ADP aparece en los 5 minutos
después de que se ha añadido ATP como sustrato, y en
aproximadamente 10 minutos la V_{1}-ATPasa detiene
la hidrólisis de ATP. De esta manera, los inventores de esta
solicitud han preparado algunas variantes y han estudiado los
efectos de restricción de ADP. Como resultado, los inventores han
descubierto que la variante TSSA mencionada anteriormente continúa
la actividad de ATP incluso durante una hora después de la adición
de ATP como sustrato.
Todavía otra forma preferida de la molécula de
motor rotativo V_{1}-ATPasa de esta invención es
una molécula modificada donde tanto la subunidad A como la B o
ambas están fijas en un sustrato. La razón es que esta fijación
hace posible transmitir eficientemente la rotación de la subunidad
D. La unión de la subunidad A y/o B de esta manera sobre un
sustrato puede llevarse a cabo por medio de una variedad de métodos,
por ejemplo usando enlaces covalentes, pero preferiblemente se
emplea un método que envuelve la unión de la etiqueta His
(hectahistidina) al N terminal de la subunidad A y después la unión
de esta etiqueta His al portaobjetos Ni-NTA (Nature
386: 299-302. 1997; FEBS Letters 470:
244-248. 2000).
En otra forma preferida de la molécula de motor
rotativo V_{1}-ATPasa de esta invención, la
subunidad D está unida a un material de junta. El término
"material de junta" en este caso significa un material para
transmitir el movimiento rotativo de la subunidad D de la
V_{1}-ATPasa a otro componente (por ejemplo un
engranaje o un eje de una máquina de movimiento, o similares).
Además, este material de junta puede no ser solo para conectar a
otro componente, sino que puede también utilizarse como una
"sonda" o un "propulsor" para observar la rotación de la
V_{1}-ATPasa. Ejemplos de materiales de junta que
pueden utilizarse incluyen una pluralidad de cuentas mencionadas
previamente (microesferas) que están conectadas como se aprecia en
las realizaciones descritas más adelante, y una fibra fina tal como
un filamento de actina (Nature 386: 299-302, 1997).
Este material de junta puede estar unido al resto Cys de la
subunidad D, por ejemplo, por unión con la melimida o unión con
disulfuro o similares. Sin embargo, la subunidad D de la
V_{1}-ATPasa derivada del Thermus
thermophilus, cuya secuencia de aminoácidos se indicó con el Nº
de identificación de secuencia 5, no tiene restos Cys, y por lo
tanto un resto diferente de Cys adecuado debe reemplazarse con un
resto Cys. Por esta razón, en esta invención, un material de junta
está preferiblemente unido al resto Cys que sustituye al resto Glu
en la posición 48 o al resto Cys que sustituye al resto Gln en la
posición 55 (preferiblemente ambos) en la secuencia de Nº de
identificación 5. Además, los restos Cys que no estén en la
subunidad D (un total de nueve restos Cys en la subunidad A, tres
restos Cys en la subunidad B) son preferiblemente reemplazados por
otros restos (por ejemplo, restos Ser) de manera que estos restos
Cys no se unan al material de unión.
Alternativamente, puede hacerse que un material
de unión no se una a la subunidad D, sino a la subunidad F que se
une a la subunidad D. En este caso, por ejemplo, se reemplaza el
resto en posición 28 Ser y/o el resto en posición 35 Ser con el
resto Cys en el aminoácido de la secuencia de número de
identificación 2, y puede unirse a estos restos Cys un material de
junta.
Además, cada una de las
V_{1}-ATPasas descritas anteriormente pueden
obtenerse reemplazando un triplete que codifica el resto del
aminoácido especificado en un polinucleótido de
V_{1}-ATPasa por medio de un método que usa un
kit de mutación o similares, la PCR de mutagénesis, o un método de
síntesis de polinucleótidos (por ejemplo, Nucleic Acid Res. 25:
3440-3444, 1997), y después expresar este
polinucleótido mutado por un procedimiento de ingeniería
genética.
De aquí en adelante, se describirá la presente
invención en términos de ejemplos en más detalle y específicamente;
sin embargo, la invención no está limitada de ninguna manera a los
ejemplos a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La V_{1}-ATPasa se expresó por
medio del BL21-CodonPlus-RP de E.
coli (Stragene) transformado con el plásmido pUCVl que poseía
las secuencias de ADN que codificaban cada una de las subunidades A,
B, D y F de la V_{1}-ATPasa derivada de T.
thermophilus HB8 bajo el control del promotor lac.
Además, las secuencias de ADN que codificaban cada una de las
subunidades A, B, D y F se modificaron para preparar las siguientes
variantes (las posiciones de los aminoácidos corresponden a las
secuencias de Nº de identificación 2 a 5).
\vskip1.000000\baselineskip
I: V1-ATPasa (etiquetas
A-His8
/\DeltaCys/A-S232A/A-T235S/D-E48C/D-Q55C)
(1) Unión de una etiqueta His al N terminal de
la subunidad A (etiquetas A-His8)
(2) Substitución de todos los restos Cys de las
subunidades A y B con restos Ser (\DeltaCys)
(3) Substitución del Ser en la posición 232 de
la subunidad A (A-S232A) con Ala
(4) Substitución del Thr en la posición 235 de
la subunidad A (A-T235S) con Ser
(5) Substitución del Glu en la posición 48 de la
subunidad D (D-E48C) con Cys
(6) Substitución del Gln en la posición 55 de la
subunidad D (D-Q55C) con Cys
\vskip1.000000\baselineskip
II: V_{1}-ATPasa (etiquetas
A-His8
/\DeltaCys/A-S232A/A-T235S/F-S28C/F-S35C)
(1) Unión de una etiqueta His al N terminal de
la subunidad A (etiquetas A-His8)
(2) Substitución de todos los restos Cys de las
subunidades A y B con restos Ser (\DeltaCys)
(3) Substitución del Ser en la posición 232 de
la subunidad A (A-S232A) con Ala
(4) Substitución del Thr en la posición 235 de
la subunidad A (A-T235S) con Ser
(7) Substitución del Ser en la posición 28 de la
subunidad F (S-28C) con Cys
(8) Substitución de Ser en la posición 35 de la
subunidad F (S-35C) con Cys
\vskip1.000000\baselineskip
Después de que las células transformadas se
suspendieran en imidazol/HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 0,3
M, y después de que la suspensión obtenida se calentara a 65ºC
durante 30 minutos, las proteínas inestables al calor se eliminaron
y a continuación el material obtenido se puso en una columna de
afinidad de Ni^{2+} (Amersham) y se eluyó con imidazol/HCl 0,5 M
(pH 8,0) que contenía NaCl 0,3 M. Se añadió un tampón al eluato, y
se sometió la mezcla a ultrafiltración (VIVA-Spin,
VIVA science) y a continuación se puso en una columna RESOURCE Q.
La parte que contenía una V_{1}-ATPasa se puso en
una columna Superdex 200 (Amersham) donde se eliminaron las
proteínas de contaminación. La V_{1}-ATPasa
purificada se sometió a biotinilación con más de dos moles de
6-(N'-[2-(N-maleimido)etil)-N-piperazinilamido]hexil
D-biotinamida
(biotin-PEAC_{5}-maleimida,
Dojindo). La sustancia obtenida se incubó a 25ºC durante 15 minutos
y a continuación se puso la proteína en una columna
PD-10 (Amersham) en donde se eliminaron los
reactivos que no habían reaccionado. La biotinilación de las
subunidades D y F se confirmó por la técnica de Western blotting
usando un conjugado de
estreptavidina-alcalinofosfatasa (Amersham) (Figura
2).
Se fabricó una celda de flujo de 5 \mul a
partir de dos cubre objetos (con un espaciador con un espesor de 50
nm entre ellos). Se recubrió la superficie de cristal de abajo con
ácido Ni^{2+}-nitrilotriacético, y la
V_{1}-ATPasa biotinilada (0,1-1
\muM) contenida en la solución A compuesta de un tampón
(Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM, KCl, 100 mM, MgCl_{2},
5 mM) y 0,5% (p/v) BSA se vertió en la celda de flujo, y etiquetas
His se unieron al cristal, fijando de esta manera la
V_{1}-ATPasa.
La celda de flujo se llenó con una solución de
cuentas (\Phi = 0,56 \mum, Bangs Laboratories inc.) recubiertas
de estreptavidina al 0,1% (p/v), uniendo algunas de las cuentas a
la subunidad D o F por enlace
biotina-estreptavidina. Las cuentas no unidas se
eliminaron con un lavado.
En cuanto a la rotación de la molécula de
V_{1}-ATPasa, la rotación de una cuenta fue en ATP
de concentración especificada (en el sistema de regeneración
creatina kinasa 0,2 mg/ml y creatina fosfato ATP 2,5 mM) observado
con un microscopio de campo brillante (1X70, Olympus, poder de
magnificación 1000). Además, el estado de rotación se grabó con una
cámara CCD. Este sistema de observación de la rotación de
V_{1}-ATPasa es similar al sistema de rotación de
F_{1}-ATPasa (Proc Natl Acad Sci USA 98,
13649-54, 2001). Específicamente, se observó la
rotación alrededor de un enlace inclinado, debido a que las cuentas
están unidas a la subunidad D o F (Figura 2).
Las concentraciones de proteína se determinaron
con medidas de ultravioleta. La actividad hidrolítica de ATP se
determinó por medio de la oxidación de ADNH que une la piruvato
kinasa y la lactato deshidrogenada.
Se observaron las dos variantes; la
V_{1}-ATPasa (etiquetas
A-His8/\DeltaCys/A-S232A/A-T235S/D-E48C/D-Q55C)
y la V_{1}-ATPasa (etiquetas
A-His8/\DeltaCys/A-S232A/A-T235S/F-S28C/F-S35C)
en cuanto a la rotación de las mismas. Las dos variantes mostraron
una cinética que sigue la ecuación de Michelis Menten, teniendo las
dos variantes Km de 0,3 a 0,5 mM y Vmax (velocidad de reacción) de
aproximadamente 10 seg^{-1}. Estos valores son casi los mismos
que los de la sintasa F_{0}F_{1}-ATP de tipo
silvestre (J Biol Chem 273, 20504-1014, 1998).
Cuando se vertió un tampon que contenía ATP en
la celda de flujo, se observó la rotación de una cuenta unida a la
subunidad D de la V_{1}-ATPasa (Figuras 3A a 3D).
Se observaron las rotaciones de 5 a 10 cuentas en la celda de
flujo.
La rotación fue en una dirección, en el caso de
F_{1}-ATPasa la reacción fue siempre en el sentido
contrario a las agujas del reloj vista desde el lado de la membrana
celular. En un tampón que no contenía ATP, no se observó rotación
en una dirección distinguible del movimiento Browniano.
Se sabe que una azida inhibe tanto la actividad
ATPasa como la rotación de la F_{1}-ATPasa (Nature
386, 299-302, 1997), pero que no inhibe la
actividad ATPasa de una V_{1}-ATPasa (J Biol Chem
265, 21946-50, 1990). La rotación de una variante
V_{1}-ATPasa fue igual a la descrita
anteriormente. Esto es porque la azida no afectó la rotación de
V_{1}-ATPasa en la presencia de ATP 4 mM (Figura
3A y 3B) o en la presencia de ATP 0,1 mM.
La media del número de revoluciones en presencia
de ATP 4 mM fue aproximadamente 2,6 rps (revoluciones por segundo)
o menor. La media del número de revoluciones en presencia de ATP 1
mM fue aproximadamente 2,4 rps o menor. Asumiendo que una
revolución consume tres moléculas de ATP, la velocidad de revolución
esta en buen acuerdo con la velocidad de hidrólisis de ATP
observada en la teoría de la reacción enzimática básica (hidrólisis
de alrededor 10 ATPs por segundo). Además, a concentración de ATP
0,5 mM la media del número de revoluciones disminuye a
aproximadamente 2,2 rps (Figura 3C).
Se observó también la rotación en una cuenta
unida a la subunidad F. En condiciones de concentración de ATP 4
mM, se observaron de 1 a 3 cuentas rotatorias (Figura 4). La
dirección de rotación fue siempre en dirección contraria a las
agujas del reloj. La velocidad de revolución fue aproximadamente 2,5
rps que fue casi la misma que la velocidad de revolución de la
cuenta en la subunidad D.
Como se ha descrito en detalle la invención de
esta solicitud proporciona una variante de una
V_{1}-ATPasa como una molécula de motor rotativo
nueva. Esto contribuirá en gran manera a la fabricación de una micro
máquina, una nano máquina, y similares.
<110> Japan Science and Technology
Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Una molécula de motor rotativo
V1-ATPasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03F044PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> JP2002-337212
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-11-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP2003/012983
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-10-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en Ver.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4199
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(318)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (334)..(2067)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2081)..(3514)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3528)..(4196)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Una variante de una molécula de motor
rotativo V_{1}-ATPasa, resistente al calor que es
capaz de continuar la actividad de ATP por al menos una hora
después de la adición de ATP como sustrato, la
V_{1}-ATPasa es una porción V_{1} de una
V_{0}V_{1}-ATPasa obtenible de la bacteria
termófila, Thermus thermophilus, y es una molécula compleja
que tiene tres subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D
que constituyen la porción V_{1} de una
V_{0}V_{1}-ATPasa, en donde, en la variante, las
subunidades A tienen un resto Ala que sustituye al resto Ser en la
posición 232 y un resto Ser que sustituye al resto Thr en la
posición 235 en la secuencia de Nº de identificación 3.
2. La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de la reivindicación 1, en donde al
menos una de las subunidades A y las subunidades B de la misma,
están fijas sobre un sustrato.
3. La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de la reivindicación 2, que está fija
sobre el sustrato por medio de una etiqueta His unida al N terminal
de la subunidad A.
4. La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de la reivindicaciones 1, 2 o 3, a la
que se une una subunidad D con un material de junta.
5. La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de la reivindicación 4, en donde la
junta está unida a al menos un resto Cys que sustituye al resto Glu
en la posición 48 y un resto Cys que sustituye al resto Gln en la
posición 55 en la secuencia de Nº de identificación 5.
6. La molécula de motor rotativo
V_{1}-ATPasa de la reivindicación 5, en donde
todos los restos Cys en la subunidad A y en la subunidad B están
reemplazados por restos que no son Cys.
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