ES2339371T3 - Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transicion solucion/gel seguida de una transicion gel/solucion. - Google Patents

Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transicion solucion/gel seguida de una transicion gel/solucion. Download PDF

Info

Publication number
ES2339371T3
ES2339371T3 ES05822899T ES05822899T ES2339371T3 ES 2339371 T3 ES2339371 T3 ES 2339371T3 ES 05822899 T ES05822899 T ES 05822899T ES 05822899 T ES05822899 T ES 05822899T ES 2339371 T3 ES2339371 T3 ES 2339371T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
monomers
enzyme
gel
biomaterial
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05822899T
Other languages
English (en)
Inventor
Veronique Larreta-Garde
Sebastien Giraudier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Cergy-Pontoise
Original Assignee
Universite de Cergy-Pontoise
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Cergy-Pontoise filed Critical Universite de Cergy-Pontoise
Application granted granted Critical
Publication of ES2339371T3 publication Critical patent/ES2339371T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/733—Alginic acid; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A23J3/06—Gelatine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/275—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of animal origin, e.g. chitin
    • A23L29/281—Proteins, e.g. gelatin or collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/275—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of animal origin, e.g. chitin
    • A23L29/281—Proteins, e.g. gelatin or collagen
    • A23L29/284—Gelatin; Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/04—Dispersions; Emulsions
    • A61K8/042—Gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/645—Proteins of vegetable origin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/731—Cellulose; Quaternized cellulose derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/732—Starch; Amylose; Amylopectin; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/736—Chitin; Chitosan; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24027—Thermolysin (3.4.24.27)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Abstract

Procedimiento de preparación de un biomaterial, que comprende: - al menos un monómero capaz de formar polímeros, o una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros, siendo dicho monómero una proteína escogida entre el grupo que comprende fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y HS), actina, mioglobina, colágeno y sus derivados, proteínas de suero, proteínas de soja y de trigo, proteínas de yema y clara de huevo y/o un sacárido capaz de formar polímeros escogido entre el grupo que comprende carragenanos, alginatos, pectinas, quitosano, celulosa, quitina, glicógeno y almidón; - un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros, siendo escogido dicho primer tipo de enzima que degrada dichos polímeros, en función de la naturaleza proteica o sacárida de dichos polímeros, entre el grupo que comprende enzimas de la familia de las metaloproteinasas, familia de las serinas proteasas, familia de las cisteínas y aspartato proteasas y familia ADAM, carragenasas, pectinas liasas, poligalacturonasas, pectinas esterasas, alginatos liasas y fosforilasas, y - eventualmente, un segundo tiempo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros, presentándose dicho biomaterial en la forma de un gel o bien en la forma de una solución que es susceptible de efectuar sucesivamente una transición solución/gel eventualmente bajo la acción de un segundo tipo de enzima y seguidamente, bajo la acción del primer tipo de enzima, una segunda transición gel/solución, estando caracterizado dicho procedimiento porque comprende la mezcla, en un disolvente apropiado: (i) de al menos un monómero capaz de formar polímeros; (ii) de un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente (iii) de un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros; en cuya mezcla la concentración de monómeros capaces de formar polímeros, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros se escogen de forma que la resolución de las ecuaciones (I), (II), (III) y (IV) siguientes: **(Ver fórmula)** ecuaciones que describen respectivamente la evolución del número de monómeros enlazados (dg) (I), la evolución del número de monómeros en solución (ds) (II) y la evolución del número de monómeros degradados (ds) en función del tiempo (dt) (III), y la ecuación de conservación de la masa (IV), en las cuales: - g corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada, - t corresponde al tiempo, - VP corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar los polímeros expresada en cantidad de monómeros enlazados llevados a su forma libre por dicha enzima y por unidad de tiempo, - KP representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de degradar los polímeros, - s representa la cantidad de monómeros en forma libre, - VT corresponde a la velocidad de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros, expresada en cantidad de monómeros en forma libre enlazados por dicha enzima y por unidad de tiempo, - KT representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros, - VH representa la velocidad de enlace, mediante enlaces de baja energía y por unidad de tiempo, de monómeros en forma libre, en el caso de monómeros capaces de polimerizarse mediante estos enlaces, - V''P corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar monómeros en forma libre, expresada en cantidad de monómeros degradados, los cuales ya no se pueden polimerizar, generados por dicha enzima y por unidad de tiempo, - gt corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada en el tiempo t, - st corresponde a la cantidad de monómeros en forma libre en el tiempo t, - ft corresponde a la cantidad de monómeros degradados que ya no son capaces de formar polímeros en el tiempo t, - S0 corresponde a la cantidad inicial de monómeros, permite obtener un tiempo de gelificación y la duración de gel deseados.

Description

Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición solución/gel seguida de una transición gel/solución.
La presente invención se refiere, dentro del campo de la gelificación, a un biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición controlada de solución/gel seguida de gel/solución y un procedimiento de preparación de este biomaterial.
Los geles son utilizados debido a sus propiedades particulares en numerosos campos, particularmente el alimentario, cosmético o farmacéutico. Un gel está compuesto al menos por dos componentes de los cuales uno, muy altamente mayoritario, corresponde al disolvente líquido y el otro es un componente que se puede calificar de sólido dispersado en el disolvente. A partir de una solución o una dispersión en estado líquido, la formación del gel es el resultado de una agregación parcial de las partículas sólidas. Esta transformación se denomina la transición de solución/gel.
En la técnica anterior son bien conocidas composiciones para obtener geles "físicos". Un gel físico corresponde a un conjunto macromolecular constituido por monómeros unidos entre ellos por enlaces de baja energía (Van der Waals, enlaces de hidrógeno, polares, etc.). La estabilidad de este conjunto está asociada a una cierta gama de condiciones físico-químicas (pH, concentración de monómeros, temperatura, calidad del disolvente, fuerza iónica, etc.). Al salirse de esta gama, el gel se convierte en solución. La transición solución/gel, por tanto, es reversible para los geles físicos. Es decir, la estructura de los geles físicos es muy sensible al entorno físico-químico y un cambio muy débil de la calidad del disolvente puede destruir completamente el conjunto e inducir así una transición gel-solución. Por el contrario, la asociación polímera que conduce al gel se puede hacer mediante un cambio débil de la calidad del disolvente.
Se conocen igualmente en la técnica anterior geles calificados de "químicos". Un gel químico corresponde igualmente a una estructura macromolecular, por lo que los monómeros están asociados mediante enlaces de elevada energía (covalentes). Por tanto, la estabilidad de este conjunto es muy elevada. Además, si estos geles químicos presentan una estabilidad mejorada, el único medio de efectuar una transición gel/solución consiste en destruir los enlaces covalentes del polímero. Este es el motivo por el que la transición gel/solución de este tipo de polímeros se dice que es irreversible.
Una familia de geles químicos corresponde a los geles enzimáticamente catalizados. Este modo de gelificación se observa sobre todo en los grandes procedimientos biológicos. La coagulación sanguínea, cicatrización, la formación de la piel, la agrupación de matrices extracelulares son procedimientos biológicos en los que el paso de las proteínas solubles al estado de gel es indispensable y tienen en común una familia de enzimas: las transglutaminasas (Tgasas), las cuales son indispensables para los procedimientos de gelificación. Esta familia de proteínas es ubicua y se encuentra tanto en las procariotas como en las eucariotas. Así, existen Tgasas diferentes en el hombre. Estas enzimas tienen la propiedad de incorporar grupos aminos en las cadenas laterales glutaminilo de las proteínas. Esta actividad permite unir las proteínas de forma covalente. Las Tgasas catalizan así la polimerización de las proteínas responsables de la formación de los retículos gelificados biológicos. Las Tgasas permiten obtener geles a partir de numerosas proteínas en la industria alimentaria y, particularmente, para la fabricación de sumiri o el endurecimiento de numerosos derivados cárnicos (jamón, alimentos reconstituidos, etc). Se pueden citar como ejemplos proteínas polimerizables, gelatina, fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y 11S), actina, mioglobina, proteínas de suero, particularmente caseínas y lactoglobulina, proteínas de soja, de trigo y particularmente glutenina, la yema y la clara del huevo y particularmente la ovalbúmina.
Uno de los geles proteicos más utilizados es el gel de gelatina. La gelatina se obtiene a partir del colágeno que es una proteína de estructura ubicua. El colágeno se puede encontrar en estado soluble en forma de monómeros o trímeros asociados en hélices triples. Estas hélices triples se pueden asociar en fibrillas que se pueden asociar en fibras. La triple hélice de colágeno es estable a la temperatura corporal. La gelatina se obtiene mediante la desnaturalización del colágeno. Los tejidos que contienen colágeno se someten así a un tratamiento ácido o alcalino, que conduce a la desnaturalización de la triple hélice del colágeno. Se pierde así totalmente la posibilidad de hacer fibras. Un tratamiento ácido conduciría a la formación de gelatina de tipo A y un tratamiento alcalino a una gelatina de tipo B. Por tanto, la solución de gelatina esta compuesta de cadenas aisladas de colágeno (monómeros de colágenos). Al ser múltiples las utilizaciones de la gelatina, a veces es necesario crear geles de gelatina en condiciones en las que no existan geles físicos (temperaturas elevadas, pH extremo o fuerza iónica particular). Para formar un retículo necesario en el gel, las cadenas de gelatina son entonces unidas por puentes de enlaces covalentes de enlaces covalentes y, particularmente, mediante la acción de Tgasas. Los geles así obtenidos son geles químicos.
En la actualidad numerosos campos necesitan la utilización de geles químicos debido a su estabilidad mejorada. Sin embrago, su "irreversibilidad" limitas sus utilizaciones potenciales en los campos cosméticos, alimentarios o incluso farmacéuticos. Por tanto, un mayor control de las propiedades mecánicas de los diferentes geles químicos constituye un aspecto esencial para aumentar su potencialidad.
El análisis de organismos vivos ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas extremadamente dinámicos. En tejidos vivos, las células están en interacción con una estructura denominada matriz extracelular (MEC) que tiene un elevado contenido de proteínas. Esta estructura está ubicada principalmente en las células epiteliales y alrededor de los tejidos conectivos. Las células pueden sintetizar diferentes componentes de la matriz extracelular como el colágeno que interviene en la elasticidad o la fibronectina que interviene en los mecanismos de la adherencia. Paralelamente, la célula produce igualmente proteasas que intervienen en la degradación de la matriz extracelular. Por tanto, la célula interviene simultáneamente en la construcción y la degradación de la matriz extracelular. Por tanto, la estructura de la matriz extracelular no es una estructura irreversible y estática sino que corresponde a un equilibrio dinámico que resulta del balance entre las actividades de construcción y degradación de las proteínas sintetizadas por la
célula.
De la misma forma los coágulos formados en respuesta al mecanismo de coagulación constituyen igualmente sistemas dinámicos. Por tanto, mediante la síntesis de una cascada de factores enzimáticos, se ayuda a la formación de un coágulo insoluble que resulta de la formación de un retículo de proteínas solubles. Este coágulo será seguidamente eliminado en el transcurso de la reacción de cicatrización.
En estos equilibrios dinámicos, los retículos de proteínas se asocian para hacerse insolubles y formar geles, que pueden ser asimilados a transiciones solución/gel. Al mismo tiempo, los retículos proteicos son igualmente destruidos por la acción de proteasas, pudiendo ser asimilado en esta ocasión este tipo de transición a las transiciones gel/solución. Se ayuda así a veces a transiciones sucesivas como en la coagulación en la que el coágulo se forma en primer lugar, seguidamente se degrada para dar lugar a otras reacciones según mecanismos que no son bien comprendidos.
La transición solución/gel en estos procedimientos biológicos está asociada lo más a menudo a la familia de transglutaminasas anteriormente descrita. La transición opuesta, ha saber, gel/solución, esta asociada por su parte a la actividad antagonistas de enzimas de tipo proteolítico.
Una de las familias más estudiadas es el de las metaloproteinasas de matriz (MMP). Forma una familia de endopeptidasas dependientes del zinc, que degradan la mayor parte de las proteínas de la matriz extracelular. Sin embrago, existe un gran número de familias de proteasas diferentes. Se pueden citar, como ejemplos de familias de proteasas, las serinas, proteasas como tripsina, matriptasa, cisteínas y aspartato proteasas como catepsinas B y L y catepsinas D y C, de la familia ADAM.
Un gran número de enzimas que dirigen este tipo de reacción, como las transglutaminasas o incluso las metaloproteasas son caracterizadas por bioquímicos y enzimologistas. Por tanto, la descripción de estas enzimas y particularmente de las diferentes constantes a las que están asociadas, está bastante bien controlada. Además, aunque su comportamiento es conocido en solución de forma aislada, no lo es en medios de tipo gel y en presencia de una actividad antagonista.
El trabajo de modelación de los inventores de otros equipos ha permitido comprender mejor los parámetros que intervienen en este equilibrio dinámico que existe in vivo. Los últimos trabajos de modelación y experimentación realizados por los inventores les ha permitido desarrollar un nuevo modelo de este equilibrio dinámico que integra con mayor exactitud los parámetros implicados en el mismo.
De forma sorprendente, las modelaciones efectuadas por los inventores han puesto de manifiesto que era posible obtener "in vitro" estos equilibrios dinámicos. Los inventores han podido obtener así geles proteicos que son capaces de efectuar sucesivamente una transición solución/gel seguidamente gel/solución en condiciones determinadas y, particularmente, según una cinética determinada.
Consecuentemente, un primer objeto de la invención trata sobre un biomaterial obtenido de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y que compre al menos un monómero capaz de formar polímeros, preferentemente mediante enlaces de baja energía, o una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros y un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros, presentándose dicho biomaterial en la forma de un gel, o bien en forma de una solución y siendo susceptible de efectuar sucesivamente una primera transición solución/gel y seguidamente, bajo la acción del primer tipo de enzima, una segunda transición gel/solución.
Por tanto, este biomaterial permite desarrollar productos que presentan propiedades hasta ahora desconocidas en los campos cosméticos, alimentarios o farmacéuticos.
En el campo cosmético, el biomaterial según la invención permite realizar así nuevos cosméticos como más como máscaras de belleza, que pueden adoptar una textura de un gel durante el tiempo de aplicación necesario, antes de pasar al estado de solución para permitir una eliminación simplificada agradable para el usuario.
En el campo agroalimentario, el biomaterial según la invención puede permitir así realizar nuevos productos de texturas desconocidas como bizcochos o pasteles, en los que el relleno puede adoptar la forma de un gel durante el recubrimiento antes de pasar al estado de solución más o menos viscosa una vez que ha terminado el recubri-
miento.
En el campo farmacéutico o cosmético, el biomaterial según la invención puede permitir igualmente obtener geles, que incluyan en su interior un principio activo, capaces de liberar dicho principio activo pasando al estado de solución con una cinética determinada. La utilización de enzimas capaces de degradar las proteínas (i) polimerizadas en estas condiciones de temperatura, pH, concentraciones iónicas específicas (calcio, magnesio u otro) o en presencia de co-factores determinados puede permitir adaptar esta liberación a un entorno dado (intestino, estomago, etc.).
Las composiciones cosméticas, farmacéuticas o alimentarias pueden contener además otros agentes como agentes activos para las composiciones cosméticas o farmacológicas o agentes de formulación para composiciones 
\hbox{alimentarias.}
El monómero comprendido en el biomaterial de la invención es una proteína o un sacárido, de origen natural o sintético.
El primer tipo de enzima esta presente en el biomaterial en una forma que no inactivada. El primer tipo de enzima capaz de degradar los polímeros puede estar bajo una forma activa en el biomaterial, o bien en una forma activable en condiciones específicas como un pH dado, en presencia de una especie iónica o un co-factor específico, de forma de que se obtenga la transición gel/solución en condiciones específicas, como en un órgano particular (estómago, intestino, cavidad bucal, etc.) o en un entorno particular.
El biomaterial de la invención comprende además un disolvente apropiado para permitir la polimerización del monómero y la degradación del polímero formado por el primer tipo de enzima. Preferentemente, el disolvente utilizado es un disolvente acuoso como agua o soluciones tamponantes al pH deseado (tampón de fosfato o Tris).
Según un primer modo de realización particular del biomaterial de la invención, dicho biomaterial en forma de gel ha sido liofilizado según técnicas conocidas por un experto en la técnica. El biomaterial no comprende entonces un disolvente. La segunda transición gel/solución se efectúa entonces solamente después de que dicho biomaterial haya sido puesto en contacto con un disolvente apropiado. Este modo de realización permite asociar así el tiempo de duración de gel, después de su fabricación, a su presencia en un entorno particular o en un órgano específico (estomago, intestino, cavidad bucal, etc.).
Según un modo de realización preferido de la invención, el biomaterial comprende además al menos un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros, y dicho biomaterial es entonces susceptible de efectuar sucesivamente una primera transición solución/gel bajo la acción del segundo tipo de enzima y seguidamente una segunda transición gel/solución bajo la acción del primer tipo de enzima.
Ventajosamente, los dos tipos de enzimas están presentes simultáneamente en el biomaterial en una forma no inactivada.
Todavía ventajosamente, las enzimas están repartidas de forma homogénea en el biomaterial.
Según un segundo modo de realización particular del biomaterial de la invención, el biomaterial comprende un monómero de naturaleza proteica. La casi totalidad de las proteínas son capaces de formar geles físicos debido a sus propiedades de polielectrolitos. Las proteínas susceptibles de polimerizarse para formar geles físicos y utilizables en el procedimiento según la invención son: colágeno y sus derivados como gelatina, fibrina, gliadiana, miosisna, globulina (7S y 11S), actina, mioglobina, proteínas de suero, particularmente caseínas y lactoglobulina, proteínas de soja, de trigo y particularmente glutenina, yema y clara de huevo y particularmente ovalbúmina. Preferentemente, las proteínas polimerizables utilizadas son escogidas entre fibrina y colágeno y sus derivados como gelatina de tipo A y B. En presencia de enzimas capaces de efectuar enlaces covalentes entre monómeros proteicos, es posible utilizar proteínas que no se polimericen de forma natural.
La concentración de proteínas polimerizables en forma de monómeros o de una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros en el biomaterial, es una función de la naturaleza de la proteína utilizada. Preferentemente, la concentración de proteína polimerizable está comprendida entre 0,1 y 30% en peso con respecto al peso total del biomaterial, preferentemente entre 0,2 y 20%, incluso preferentemente entre 0,5 y 15% y de manera particularmente preferida entre 1 y 10%.
Son conocidas por un experto en la técnica numerosas enzimas capaces de degradar polímeros proteicos (proteasas). Como ejemplo de estas enzimas se pueden citar metaloproteinasas, como las metaloproteinasas de la familia de tipo MMP o metaloproteinasas relacionadas, como termolisinas, serinas proteasas como tripsina y matriptasa, cisteínas y aspartato proteasas como catepsinas B y L y catepsinas D y G y la familia ADAM. Preferentemente, la enzima capaz de degradar polímeros de proteínas es una metaloproteinasa, preferentemente una termolisina, particularmente bacteriana y, de forma particularmente preferida, una termolisina aislada a partir de Bacillus termoproteoliticus rokko.
La concentración de enzima capaz de degradar polímeros proteicos depende del monómero de proteína utilizado y de la concentración de este. Esta concentración de enzima puede ser calculada fácilmente para un tipo de monómero proteico dado y a una concentración dada, según el protocolo descrito en los ejemplos que siguen. Así, en el caso de la termolisina de Bacillus termoproteoliticus rokko y para un gel de gelatina de tipo A al 5%, la concentración de termolisina es superior o igual a 10^{-4} U/ml, preferentemente superior o igual a 10^{-3} U/ml.
Son conocidas por un experto en la técnica numerosas proteínas igualmente capaces de efectuar enlaces covalentes entre proteínas. Como ejemplo de estas proteínas se puede citar la familia de las lisil-oxidasas y la familia de las transglutaminasas como la subunidad A del factor XIII, las Tgasas 1 a 7 de mamíferos o incluso las Tgasas bacterianas. Preferentemente, la enzima capas de efectuar enlaces covalentes entre proteínas es una transglutaminasa, preferentemente una transglutaminasa bacteriana y de forma particularmente preferida una transglutaminasa aislada a partir de estreptoverticillum sp.
Las concentraciones de enzima capaces de efectuar enlaces covalentes entre proteínas y de enzima capaces de degradar polímeros proteicos dependen, por una parte, de la relación de la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre proteínas con respecto a la concentración de enzima capaz de degradar polímeros proteicos y, por otra partes, de la proteína polimerizable utilizada y la concentración de ésta. Estas concentraciones de enzimas pueden ser calculadas fácilmente según el protocolo descrito en los ejemplos.
La relación de concentraciones enzimáticas y las concentraciones enzimáticas utilizadas dependerán igualmente del tiempo de gelificación (transición solución/gel) y el tiempo de duración de gel deseados.
Ventajosamente, la relación de concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre proteínas respecto a la concentración de enzima capas de degradar polímeros proteicos es superior o igual a 1, preferentemente superior o igual a 10 y, de forma particularmente preferida, superior o igual a 20.
Incluso ventajosamente, la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre proteínas es superior a 0,001 U/ml, preferentemente superior a 0,001 U/ml y, de forma particularmente preferida, superior a
0,01 U/ml.
Incluso ventajosamente, y en el caso de una solución de gelatina de tipo A al 5% en presencia de transglutaminasa de streptoverticillium sp y de termolisina de bacillums termoproteoliticus rokko, la relación de la concentración de transglutaminasa en U/ml respecto a la concentración de termolisina en U/ml es superior a 75, preferentemente superior o igual a 80. Además, la concentración de transglutaminasa es superior o igual a 0,1 U/ml, preferentemente superior o igual a 0,1 U/ml y de forma particularmente preferida superior o igual a 0,4 U/ml.
Según un tercer modo de realización particular de la presente invención, el biomaterial según la invención comprende un monómero de naturaleza sacárida. Los sacáridos utilizables para el biomaterial según la invención son: carragenanos, alginatos, pectinas, quitosano, celulosa, quitina, glicógeno o incluso almidón.
La concentración de sacáridos polimerizables, en forma de monómeros o de una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros, en el biomaterial, es función de la naturaleza del sacárido utilizado. Preferentemente, la concentración de sacárido polimerizable esta comprendida entre 0,1 y 30% en peso con respecto al peso total del biomaterial, preferentemente entre 0,2 y 20%, incluso preferentemente entre 0,5 y 15% y de forma particularmente preferida entre 1 y 10%.
Son conocidas por un experto en la técnica numerosas enzimas capaces de degradar polisacáridos. Como ejemplo de estas enzimas se pueden citar las carragenasas para los carragenanos, las pectinas liasas, poligalacturonasas y las pectinas esterasas para las pectinas, los alginatos liasas para los alginatos, las celulasas para la celulosa o incluso la fosforilasa para el glicógeno.
La concentración de enzima capaz de degradar polisacáridos depende del monómero utilizado y de la concentración del mismo. Esta concentración de enzima puede ser calculada fácilmente para un tipo de monómero dado y a una concentración dada, según el protocolo descrito en los ejemplos.
Son conocidas por el experto en la técnica numerosas enzimas capaces de efectuar enlaces covalentes entre sacáridos. Como ejemplo de estas enzimas se puede citar la familia de alginatos epimerasas para los alginatos, sintasas para la celulosa o incluso glicógeno cintaza para el glicógeno.
Las concentraciones de enzima capaces de efectuar enlaces covalentes entre sacáridos y de enzima capaz de degradar polisacáridos depende, por una parte, de la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre sacáridos respecto a la concentración de enzima capaz de degradar polisacáridos y, por otra parte, del sacárido polimerizable utilizado y de la concentración de este. Estas concentraciones de enzimas pueden ser calculadas fácilmente según el protocolo descrito en los ejemplos.
Como anteriormente, la relación de las concentraciones enzimáticas utilizadas dependerán igualmente del tiempo de gelificación (transición solución/gel) y del tiempo de duración de gel deseados.
Ventajosamente, la relación (concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre sacáridos)/(con-
centración de enzima capaz de degradar polisacáridos) es superior o igual a 1, preferentemente superior son igual a 10 y, de forma particularmente preferida, superior o igual a 20.
Incluso ventajosamente, la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre sacáridos es superior a 0,001 U/ml, preferentemente superior a 0,01 U/ml y de forma particularmente preferida superior a 0,1 U/ml.
Según un cuarto modo de realización particular de la invención, el biomaterial según la invención comprende un monómero de naturaleza sacárida y un monómero de naturaleza proteica. Este compuesto permite obtener un gel que presenta propiedades reológicas específicas y, potencialmente, un gel que presenta una textura buscada.
El biomaterial puede comprender igualmente uno o varios componentes adicionales habitualmente utilizados en los campos cosméticos, farmacéuticos o alimentarios.
Un segundo objeto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un biomaterial según la reivindicación 1, presentándose el biomaterial en forma de un gel, o bien en forma de una solución y siendo susceptible de efectuar sucesivamente una transición solución/gel y seguidamente una segunda transición gel/solución, caracterizado por que comprende la mezcla en un disolvente apropiado:
(i) de al menos un monómero capaz de formar polímeros, preferentemente mediante enlaces de baja energía;
(ii) un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de monómeros capaces de formar polímeros, preferentemente mediante enlaces de baja energía y la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros para obtener un biomaterial que presente el tiempo de gelificación y el tiempo de duración de gel deseados se determinan según el protocolo descrito en los ejemplos.
Como ejemplo, un biomaterial que comprende 5% de gelatina de tipo A, como monómero capaz de formar polímeros mediante enlaces de baja energía y termolisina aislada a partir de Bacillus termoproteoliticus rokko y que presenta un tiempo de gelificación de 68 minutos y un tiempo de duración de gel de 254 minutos puede ser obtenido a 27ºC utilizando 0,0085 U/ml de termolisina.
Según un modo de realización preferido, el procedimiento según la invención comprende además la mezcla:
(iii) de un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de monómeros capaces de formar polímeros, opcionalmente mediante enlaces de baja energía, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros, para obtener un biomaterial que presente el tiempo de gelificación y el tiempo de duración deseados, se determinan según el protocolo descrito en los ejemplos.
El procedimiento se realiza a una temperatura a la cual los dos tipos de enzimas son activas. Ventajosamente, el procedimiento se realiza a una temperatura comprendida entre 0 y 100ºC, preferentemente entre 5 y 75ºC, por ejemplo, entre 10 y 50ºC o entre 15 y 45ºC, de forma particular preferida entre 20 y 40ºC.
Ventajosamente, la cantidad de monómeros capaces de formar polímeros esta comprendida 0,1 y 30% en peso con respecto al pero total del biomaterial, preferentemente entre 0,2 y 20%, incluso preferentemente entre 0,5 y 15% y, de forma particularmente preferida, entre 1 y 10%.
Todavía ventajosamente, la relación de la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros respecto a la concentración de enzimas capaces de degradar los polímeros es superior o igual a 1, preferentemente superior o igual 10 y, de forma particularmente preferida, superior o igual a 20.
Preferentemente, la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros es superior a 0,001 U/ml, preferentemente superior a 0,01 U/ml y, de forma particularmente preferida, superior a 0,1 U/ml.
Según el procedimiento de la invención, la concentración de monómeros capaces de formar polímeros, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y, eventualmente, la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros se escoge de forma que la resolución de las ecuaciones (I, (II), (III) y (IV) siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
1
ecuaciones que describen respectivamente la evolución del número de monómeros enlazados (dg) (I), la evolución del número de monómeros en solución (ds) (II) y la evolución del número de monómeros degradados (df) en función del tiempo (dt) (III), y la ecuación de conservación de la masa (IV), en las cuales:
- g corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada,
- t corresponde al tiempo,
- V_{P} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar los polímeros expresada en cantidad de monómeros enlazados llevados a su forma libre por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- K_{P} representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de degradar los polímeros,
- s representa la cantidad de monómeros en forma libre,
- V_{T} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros, expresada en cantidad de monómeros en forma libre enlazados por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- K_{T} representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros,
- V_{H} representa la velocidad de enlace, mediante enlaces de baja energía y por unidad de tiempo, de monómeros en forma libre, en el caso de monómeros capaces de polimerizarse mediante estos enlaces,
- V'_{P} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar monómeros en forma libre, expresada en cantidad de monómeros degradados, los cuales ya no se pueden polimerizar, generados por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- g_{t} corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada en el tiempo t,
- s_{t} corresponde a la cantidad de monómeros en forma libre en el tiempo t,
- f_{t} corresponde a la cantidad de monómeros degradados que ya no son capaces de formar polímeros en el tiempo t,
- S_{0} corresponde a la cantidad inicial de monómeros, permite obtener un tiempo de gelificación y la duración de gel deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han podido demostrar con diferentes tipos de enzimas que era posible obtener biomateriales que presentan una cinética de transición solución/gel y seguidamente gel/solución determinada.
Las constantes para estas diferentes enzimas son bien conocidas por un experto en la técnica. Como ejemplo, se puede citar la base de datos http://www.brenda.uni-koeln.de/ que describe estas constantes enzimáticas. En todo caso, un experto en la técnica podrá determinar fácilmente estas diferentes constantes para enzimas dadas según métodos bien conocidos, como los descritos en http://www.brenda.uni-koeln.de/ y en PRICE y STEVEN, fundamentals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology Catalytic Proteins, Oxford University Press.
En estas ecuaciones, VP y VT son así calculadas según las formulas siguientes:
V_{P} = k_{CAT-P}[P] y V_{T} = k_{CAT-T}[T], en la que [P] y [T] representan, respectivamente, las concentraciones de enzima capaz de degradar los polímeros y de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros y k_{CAT-P} y k_{CAT-T} representan las constantes catalíticas para estas enzimas.
En todo caso, el experto en la técnica podrá determinar fácilmente y sin experimentación excesiva, siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos, las diferentes concentraciones de monómeros y de enzima para obtener un biomaterial que presente las cinéticas de transición sucesivas solución/gel y gel/solución buscadas.
Como ejemplo, un biomaterial que comprende 5% de gelatina de tipo A, como monómero capaz de formar polímeros mediante enlaces de baja energía, termolisina aislada a partir de bacillus termoproteoliticus rokko, transglutaminasa aislada a partir de Streptoverticillium sp y que presenta un tiempo de gelificación de 19 minutos y un tiempo de duración de gel de 743 minutos, puede ser obtenido a 40ºC utilizando 1 U/ml de transglutaminasa y 0,0125 U/ml de termolisina.
Todavía, como ejemplo, un biomaterial que comprende 5% de gelatina de tipo A como monómero capaz de formar polímeros mediante enlaces de baja energía, termolisina aislada a partir de bacillus termoproteoliticus rokko, transglutaminasa aislada a partir de Streptoverticillium sp y que presenta un tiempo de gelificación de 2 minutos y un tiempo de duración de gel superior a 5000 minutos, puede ser obtenido a 27ºC utilizando 1 U/g de transglutaminasa y 0,125 u/ml de termolisina.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención comprende además una etapa de liofilización del biomaterial en forma de gel.
Otras características de la invención aparecerán en los ejemplos que siguen, sin que por ello constituyan ninguna limitación de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Gel químico 1-1 Desarrollo de un modelo teórico
Un estudio del equilibrio dinámico respondiente a la matriz extracelular a permitido establecer a la matriz extracelular un modelo matemático simplificado de este sistema dinámico en el que se llevan a cabo dos reacciones enzimáticas antagonistas. Una está catalizada por una enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros solubles (s) para obtener un retículo de monómeros enlazados (g). La otra esta catalizada por un enzima (p) que hidroliza el retículo de monómeros enlazados (g) en monómeros solubles (s). Finalmente, en ciertos casos, una tercera reacción también catalizada por la enzima (P) consiste en la hidrólisis de monómeros solubles en monómeros degradados (f) de tamaño demasiado pequeño para participar en el retículo o que no pueden servir de sustrato para la enzima que enlaza los monómeros solubles (s) mediante enlaces covalentes (T). Esta última reacción que da lugar a una fuga de monómeros del ciclo es igualmente añadida al modelo. El modelo puede ser fácilmente representado según el esquema de reacciones siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema I
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Este mecanismo de reacciones puede ser fácilmente descrito por la tres ecuaciones diferenciales que siguen, en las que las reacciones enzimáticas son asimiladas reacciones michelianas simples y mediante una cuarta ecuación de conservación de la masa.
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de cadenas de monómeros enlazados (g) en función del tiempo es la siguiente:
3
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros en solución (s) en función del tiempo es la siguiente:
4
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros degradados (f) en función del tiempo es la siguiente:
5
Finalmente, la ecuación de conservación de la masa es la siguiente:
6
En estas ecuaciones diferenciales, V_{P} y V_{T} representan las velocidades máximas para las enzimas P y T, respectivamente, y K_{P} y K_{T} representan las constantes de Michaelis para las enzimas P y T, respectivamente, en estas ecuaciones, V_{P} y V_{T} se calculan según las ecuaciones siguientes:
7
En la transposición de esta ecuación a un sistema in vitro los diferentes valores de [P], [T], V_{P}, V_{T}, K_{P} y K_{T} corresponden a estas constantes.
Las concentraciones de sustratos se calculan para cada enzima en el origen, y se determinan seguidamente en el transcurso de la reacción por medio de las diferentes ecuaciones diferenciales.
\vskip1.000000\baselineskip
1-2 Modelación de la formación de un gel de gelatina en presencia de una transglutaminasa y termolisina
Este modelo teórico ha sido aplicado a la formación de un gel físico de proteína y, más precisamente, de gelatina a 40ºC en presencia de una transglutaminasa bacteriana, que enlaza los monómeros de gelatina mediante enlaces covalentes y una proteasa: termolisina:
La concentración de gelatina utilizada es de 5%, es decir, 50 g.l^{-1}. A partir de la secuencia péptida de la gelatina, es posible determinar fácilmente la concentración de cadenas laterales, a saber, 0,45 mol.l^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Enzimas utilizadas
Las diferentes constantes para la proteasa y la transglutaminasa son conocidas en la bibliografía pueden ser determinadas fácilmente según técnicas bien conocidas por el experto en la técnica (SEGEL, Wiley Classics Library, Enzyme Kinetics, 1993).
1 - Proteasa
1.1 - Fuente: La proteasa utilizada es una metaloproteasa bacteriana, termolisina, comercializada por la empresa SIGMA (REF: P-1512). Esta enzima es una proteasa de tipo X procedente de Bacillus thermoproteoliticus rokko que es una cepa bacteriana termófila. Esta enzima reconoce específicamente los residuos Ile, Leu, Val, Phe, Met y Ala. Siendo muy estable a temperatura ambiente, esta enzima presenta un peso molecular de 34 kDa para 316 aminoácidos.
1.2 - Actividad: Para la termolisina, su constante de Michaelis (de disociación) es conocida para diferentes sus proteicos y péptidos en la bibliografía (MATSUBARA et al., Biochem. Biophys. Res. Común., vol. 21 p: 242-247, 1965). A partir de estos datos, es posible deducir un valor medio de K_{P} igual a 1 mM. La bibliografía describe igualmente los valores de la kcat de la termolisina para diferentes sustratos (LIGNE et al., Biochim. Biophys. Vol 1337. Pag. 143 - 148, 1997). A partir de estos datos, es igualmente posible determinar un valor medio de k_{cat} igual a 1000 min^{-1}. Al ser conocido la especifidad de la termolisina, el análisis de la secuencia de la gelatina permite determinar que, en el sistema estudiado, la concentración inicial del sustrato para la termolisina es por tanto de 0,15 x 0,45 = 0,68 mol.l^{-1} = 0,68 mM es decir, 68 K_{P}. Esta concentración es cercana a una concentración saturada de sustrato, por lo que el sustrato no es limitante en la reacción de la termolisina.
Las diferentes constantes enzimáticas de esta enzima pueden ser igualmente medidas utilizando N-(3-[2-furil]acriloil)-glicina-Leucinamida (SIGMA) como sustrato para la formación de Furil-acroil-glicina y Leucina-amida. La desaparición del sustrato en el transcurso de la hidrólisis da lugar a una disminución de la velocidad óptica medida a 345 nm.
2 - Transglutaminasa 2.1 - Fuente
La transglutaminasa utilizada es producida por la empresa AJINOMOTO bajo la denominación ACTIAVA WN®. Esta enzima bacteriana es producida en el medio de cultivo de estectoberticilium sp. Esta enzima corresponde a una cadena péptida de 3431 aminoácidos para un PM de 38000 Da. El residuo de cisteína en la posición 64 corresponde al sitio activo.
2.2 - Actividad: La enzima reconoce los residuos de glicina reconoce los residuos de glicina y cataliza la formación de la temperatura de 50-55ºC (100 U.g^{-1} a 40ºC) y en un amplio intervalo de pH (actividad de 4,5 a 9 con un óptimo entre 6 y 7.
La actividad de esta enzima es medida a partir de la cantidad de enzima necesaria para catalizar la formación de un micromol de ácido hidroxámico durante un minuto a 40ºC, a partir de N\propto-CBZ-Gin-Gly (SIGMA) y de hidroxilamina. El protocolo que permite determinar la actividad de esta enzima es el siguiente:
8
La actividad se calcula seguidamente mediante la siguiente ecuación:
Actividad (U/ml/min) = [100 x (DO 525/238)] / Vol enzima (ml)
Diferentes reacciones sobre este sustrato han permitido determinar una constante de disociación KT de 8 mM y una k_{cat} de 100 min-1 utilizando gelatina como sustrato. La gelatina contiene solamente 4% de lisina. La concentración inicial de sustrato para transglutaminasa es por tanto de 17 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Modelación
A partir de los diferentes valores anteriormente determinados, es posible seguir el comportamiento de la fracción enlazada en función del tiempo, aplicando el método de Euler de aproximación de ecuaciones diferenciales (BRONSON, ecuaciones diferenciales, Mc Graw-Hill ed, 1994). En esta primera modelación, la redacción de las actividades entre la transglutaminasa y la proteasa es de 10 (con una concentración de transglutaminasa de 1 U/ml). Se establece además que g_{0} = 0 y s_{0} = 68 mM. Los datos de la bibliografía muestran que es obtenido un gel de gelatina mediante la acción de la transglutaminasa cuando se realizan efectivamente un 18% de los enlaces teóricos (FUCHSBAUER et al. Biomaterials, vol. 17, pag. 1481 - 1488, 1999).
Las diferentes modelaciones efectuadas muestran que la variación de V'_{P} con respecto a V_{P} es de poca importancia y que la cinética de adaptación de las proteínas enlazadas muestra un elevado aumento inicial hasta valores próximos a 100%, seguidamente una disminución muy lenta que depende de la velocidad de aparición de pequeños fragmentos. Un ejemplo de modelación de la evolución de la fracción enlazada en función del tiempo, con una redacción V'_{P}/V_{P} de 0,1 se presenta en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
1-3 Formación de un gel de gelatina en presencia de una sola transglutaminasa
Para validar este modelo teórico, los inventores efectuaron para comenzar una primera serie de experimentos en la que se siguió la formación de un gel en presencia de diferentes cantidades de transglutaminasa únicamente.
Proteínas polimerizables utilizadas
La gelatina de tipo A utilizada (G2500) se extrajo a partir de piel de cerdo según un protocolo ácido (SIGMA). Las concentraciones de gelatina en la solución se expresan en porcentaje (peso/volumen). Por tanto, una solución de 1% de gelatina corresponde a una solución de 1 g de gelatina en 100 ml de solución. Las concentraciones de gelatinas utilizadas se hicieron variar en los experimentos entre 2 y 10% y la temperatura de gelificación era de 40ºC.
La transglutaminasa utilizada corresponde a la transglutaminasa anteriormente descrita (véanse los apartados 1-2). Las concentraciones de transglutaminasa utilizadas en estos experimentos se hicieron variar entre 0,1 U/ml y 1 U/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Seguimiento de las transiciones solución/gel y gel/solución
La formación de un gel se siguió por medio de un reómetro AR1000 (TA INSTRUMENT) o RS 150 (THERMORHEO). Estos reómetros se dispusieron con geometrías de tipo conos/plano de 60 mM y 2º de ángulo. Se utilizó un cono de acero sobre AR1000 y se utilizó un cono de titanio sobre RS150.
Estos reómetros permiten efectuar un análisis oscilante o un análisis dinámico, que consiste en someter la muestra a un cizallamiento oscilatorio de un impulso dado \omega. En el transcurso de este movimiento, la contracción y el gradiente de cizallamiento evolucionan de forma sinusoidal en el transcurso de tiempo, con el mismo impulso, pero con un cierto desfase de uno respecto al otro. Los reómetros permiten medir numerosos parámetros que permiten seguir la gelificación. El módulo de cizallamiento (G^{\text{*}}_{(\omega)}) es un número complejo que expresa el componente viscoso y elástico de la muestra y responde a la fórmula siguiente:
9
G' se denomina módulo de conservación (Storage Modulus) y G'' se denomina módulo de pérdida (Loss Modulus). Estos dos módulos se expresan en pascales (Pa). En un líquido newtoniano el módulo de conservación es nulo solo existe el módulo de pérdidas, y este es el motivo por el que el módulo de pérdidas es cualificado igualmente a veces como módulo viscoso. Por el contrario solo existe el módulo de conservación en un sólido elástico, y este es el motivo por el que a veces es cualificado como módulo elástico. Se puede asociar el módulo de cizallamiento con los módulos y conservaciones según las fórmulas siguientes:
10
En las que \delta representa el desfase entre la contracción y la deformación por cizallamiento. A partir de estas fórmulas se puede deducir la relación siguiente:
11
Tg \delta resulta ser así un valor pertinente que permite caracterizar la gelificación de la muestra. Cuando la muestra es líquida, G'' > G' y Tg \delta > 1. Por el contrario, la muestra se gelifica cuando G'' < G' y Tg \delta < 1. El tiempo transcurrido para alcanzar el valor Tg \delta = 1 representa "el tiempo de gelificación". En los diferentes experimentos que siguen la relación de los módulos G''/G' para diferentes soluciones se expresa en función del tiempo, siendo el valor de
G''/G' = 1 el correspondiente al "punto de gelificación".
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
La evolución de las propiedades viscoelásticas, seguidas por medio de un reómetro, de una solución de gelatina al 5% a 40ºC y en presencia de diferentes concentraciones de transglutaminasa (0,1, 0,15, 0,2, 0,5 y 1 U/ml) se presenta en la figura 2. Se observa que, en todas las condiciones ensayadas, la muestra es bastante líquida las comienzo del experimento (G''/G' < 1), seguidamente se forma un gel (G''/G' > 1) y evoluciona en el transcurso del tiempo. Los experimentos muestran además que a partir del punto de gelificación para cualquier concentración de enzima, el módulo G'' alcanza una plataforma a aproximadamente 1 Pa. Los valores del módulo G' por tanto son dependientes de la concentración de enzima. Las variaciones de la relación G''/G' observadas a partir del punto de gelificación reflejan por tanto las variaciones de G'.
La figura 3 representa la velocidad de gelificación (inversa al tiempo de gelificación) de soluciones de gelatina al 5% a 40ºC en función de la concentración de transglutaminasa. Los resultados muestran que la curva de gelificación se ajusta al modelo teórico, incluyendo únicamente la etapa con transglutaminasas, y esto hasta el punto de gelificación en el G''/G' = 1.
La figura 4 representa la velocidad de reacción enzimática en función de la concentración de enzima a 40ºC, a partir del punto de gelificación. Los resultados muestran que más allá del punto de gelificación, la curva de gelificación ya no se adapta al modelo teórico. Se observa entonces que las curvas ya no son extrapolables por regresión lineal, sino que siguen un comportamiento en cuanto a ley de potencia de la ecuación y = 15x^{1,85} (curva de punteada en la figura) con un valor de R^{2} de 0,98. A partir del punto de gelificación, la reacción enzimática está en un régimen limitado por la difusión de la enzima en el gel. El impacto de la difusión se materializa en la ecuación de velocidad mediante un coeficiente 1,85 que afecta a la concentración de transglutaminasa.
La figura 5 muestra la evolución, en función del tiempo, de la cantidad de transglutaminasa activa en el gel teniendo en cuenta la difusión para 1 unidad (\blacksquare) y 0,4 unidades (\blacklozenge) de enzima en solución. Por tanto, estos experimentos han permitido mostrar que a partir de la formación del gel el valor del coeficiente de difusión para la transglutaminasa evoluciona progresivamente hasta alcanzar el valor de 1,85. Esta evolución del coeficiente de difusión puede ser determinada fácilmente a partir de esta curva y en función del tiempo.
Por tanto, parece que la acción enzimática durante la gelificación sigue dos regímenes sucesivos. El primero de estado líquido hasta las proximidades del punto de gelificación, no esta limitado por la difusión y se pueden aplicar las reglas de enzimología clásica. La velocidad de reacción es entonces una función lineal de la concentración de enzima. El segundo, a partir del punto de gelificación es un medio no convencional en el que la velocidad de difusión de la enzima ya no es despreciable y limita la velocidad de reacción aparente.
Unos experimentos efectuados sobre geles de gelatina de 2 y de 10% en presencia de diferentes concentraciones de transglutaminasa han permitido confirmar un comportamiento análogo en el transcurso de la gelificación. En estas condiciones, cada tipo de el favorece un coeficiente de difusión específico que puede ser determinado fácilmente como en lo que antecede.
\vskip1.000000\baselineskip
1-4 Nueva modelación de la formación de un gel de gelatina en presencia de una transglutaminasa y de termolisina
Se modelo un gel de gelatina utilizando los mismos parámetros que los descritos con anterioridad (véase el apartado 1-2) utilizando una relación V_{T}/V_{P} de 10 y una V'_{P}/V_{P} de 0,05. Sin embargo, el efecto de la contracción difusional de un gel de gelatina al 5% sobre la velocidad de reacción de la enzima fue integrado en las ecuaciones diferenciales anteriormente descritas (véase el apartado 1-2). Por tanto, la concentración de transglutaminasa estuvo afectada en un exponente de 1,85 en las ecuaciones, teniendo en cuenta el equilibrio de reacción por cuanto el punto de gelificación es sobre pasado según la fórmula siguiente:
12
Unos estudios anteriormente realizados han permitido mostrar que la difusión controlaba la hidrólisis de los geles únicamente en presencia de una concentración muy baja de enzima a saber inferior a 1 mM (FADDA et al. Biophys. J., vol. 85(5) pag. 2808 - 2817, 2003), pero no ha concentraciones más elevadas (BERRY et al., Biochim. Biophys Acta., vol. 1524, pag. 110-117, 2000; GIRAUDIER et al., Biomacromolecules, vol. 5(5), pag. 1662 - 1666, 2004). Como consecuencia, no se aplicó un coeficiente a la concentración de termolisina en las ecuaciones.
La figura 6 representa el resultado de una modelación de la evolución de la fracción asociada en función del tiempo con una limitación de la difusión y una relación VT/VP de 10 (concentración de transglutaminasa de 1 u/ml). Se observa que a partir de esta modelación, el medio proteico efectúa sucesivamente una transición solución/gel, con un primer paso del punto de gelificación a 80 minutos seguida de una transición gel/solución, con un segundo paso del punto de gelificación a 330 minutos. Según el modelo establecido por los inventores, el medio proteico susceptible de ser obtenido presenta propiedades nuevas, con una capacidad de efectuar sucesivamente una transición solución/gel y seguidamente una transición solución/gel y seguidamente gel/solución, con un estado de gel mantenido durante un período de 250 minutos.
Además ello, el efecto de difusión a sido considerado como todo o nada, a saber, sin limitación, antes de la transición de gelificación con una limitación total más allá de esta transición. Los experimentos anteriormente realizados (véase el apartado 1-3) han permitido mostrar que las restricciones de difusión aumentan a medida que se desarrolla el retículo de enlaces covalentes en el gel. Este efecto progresivo a sido tenido en cuenta en el modelo utilizando la fórmula siguiente:
V_{T} = k_{CAT-T}[T_{0}]^{\alpha} en la que \alpha varía en función del tiempo de forma hiperbólica de 1,1 a 1,85 (véase la figura 5).
La figura 7 representa el resultado de una modelación de la evolución de la fracción enlazada en función del tiempo con una limitación de difusión ofrecida y diferentes relaciones V_{T}/V_{P} (concentración de transglutaminasa de 1 U/ml). Los resultados muestran en ese caso todavía transiciones solución/gel seguidas de gel/solución para las diferentes relaciones V_{T}/V_{P} representadas. Para la relación V_{T}/V_{P} de 10 el medio proteico alcanza el punto de gelificación en 15 minutos y gel efectúa seguidamente una transición gel/solución después 165 minutos. Para la relación V_{T}/V_{P} de 10 el medio proteico alcanza el punto de gelificación en 15 minutos, el gel efectúa seguidamente una transición gel/solución después de 165 minutos. Con respecto a la modelación anterior, el tener en cuenta una limitación de la difusión progresiva predice la obtención de un gel durante 150 minutos, en lugar de los 250 minutos que anteceden.
\vskip1.000000\baselineskip
1-5 Formación de un gel de gelatina en presencia de transglutaminasa y termolisina simultáneamente
Para validar el modelo teórico anteriormente descrito (véase el apartado 1-4) se efectuaron diferentes experimentos utilizando gelatina y transglutaminasa en las mismas condiciones que las anteriormente utilizadas (véase el apartado 1-3). Además, una proteasa, la termolisina, fue igualmente asociada a la solución de partida. La formación de geles fue seguida en función del tiempo y a 40ºC en función de las concentraciones de transglutaminasa y de termolisina utilizadas. Los resultados obtenidos, en comparación con las predicciones del modelo teórico, se representan en la tabla I:
TABLA I
13
Los resultados muestran que, de acuerdo con el modelo teórico desarrollado, es posible obtener experimentalmente a partir de una solución de monómeros polimerizables mediante enlaces covalentes en presencia de dos actividades enzimáticas antagonistas (en este caso una solución de gelatina al 5% en presencia de diferentes concentraciones de transglutaminasa y termolisina) una transición solución/gel y seguidamente una transición gel/solución sucesivamente.
Si este gel es obtenido en todas las simulaciones al cabo de un tiempo que no depende de la actividad de transglutaminasa, los diferentes experimentos muestran que existe una relación V_{T}/V_{P} que constituye un valor umbral para la primera transición solución/gel. En el caso de una solución de gelatina al 55 en presencia de transglutaminasa y termolisina, la relación V_{T}/V_{P} crítica para obtener esta primera transición solución/gel esta comprendida entre 75 y 80.
Los diferentes experimentos confirman además que el tiempo de gelificación y el tiempo de duración de gel dependen de la concentración de transglutaminasa y de termolisina, respectivamente.
La figura 7 muestra la evolución experimental de las propiedades viscoelásticas de soluciones de gelatina al 5% en presencia de diferentes concentraciones de transglutaminasa y termolisina a 40ºC.
Por tanto, con respecto al modelo teórico desarrollado, es posible obtener un biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición solución/gel y seguidamente gel/solución. Por esto, es suficiente con determinar experimentalmente la relación crítica de enzima que enlaza los monómeros/enzima que degrada los monómeros asociados para obtener esta primera transición solución/gel en solución del monómero y de las enzimas utilizadas. El modelo teórico permite adaptar seguidamente al menos los diferentes concentraciones enzimáticas de forma que se obtenga un gel que presente, por una parte, el tiempo de gelificación y, por otra parte, el tiempo de duración deseados.
Se realizaron experimentos complementarios, en los que a la gelatina al 5% se añadió 1% de alginato o de oligoalginato. Se obtiene en este caso todavía una transición solución/gel seguida de gel/solución.
1-6 Formación de un gel de gelatina en presencia, simultáneamente, de transglutaminasa y diferentes proteasas
Para confirmar el modelo desarrollado, se utilizaron diferentes proteasas.
La tripsina, EC 3-4-21-4, es una serina proteasa que hidroliza los enlaces péptidos en dirección ascendente de las lisinas y argininas. La tripsina utilizada es de origen pancreático bovino y es comercializada por la empresa SIGMA (T-1426). La actividad de esta enzima es medida a partir de la cantidad de enzima necesaria para catalizar la hidrólisis del éster p-tosil-arginina-metílico (SIGMA T 4626).
La colagenasa (EC 3.4.24.3) hidroliza específicamente los enlaces peptídicos X-Gly de las secuencias Pro-X-Gly-Pro, que se encuentran particularmente en las cadenas \alpha del colágeno. La colagenasa utilizada es obtenida a partir de Clostridium histoliticum tipo IA y es comercializada por la empresa SIGMA (C-9891). La actividad de esta arginina es medida a partir de la cantidad de enzima necesaria para catalizar la hidrólisis de N-(3-[2-furil]acriloil)-Leu-Gly-pro_Ala o FALGPA (SIGMA F-5135).
Estas actividades enzimáticas son medidas en la hidrólisis de péptidos de síntesis que portan un grupo cromóforo para una mejor comparación, la actividad de la termolisina fue medida en la hidrólisis de N-(3-[2-furil]acriloil)-Gly-Leu-amida (SIGMA F-7383). Esta es la actividad es que es descrita en las tablas con diversas proteasas.
Para los geles, la concentración de gelatina era de 7% y la temperatura de gelificación era de 4ºC. La transglutaminasa utilizada corresponde a la transglutaminasa anteriormente descrita. El seguimiento de los geles en el tiempo se efectúo como en el apartado 1-5. Los resultados obtenidos se representan en la tabla II siguiente:
TABLA II
14
Los resultados, por tanto, muestran que el modelo es generalizable a otras proteasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Gel físico 2-1 Desarrollo de un modelo teórico
Estos modelos tiene en cuenta el equilibrio dinámico observable en el caso de la formulación de un gel físico únicamente y en presencia de una sola actividad enzimática. La gelificación resulta entonces únicamente de la formación de enlaces de baja energía (Van der Waals, enlaces de hidrógeno, hidrófobos, etc; H) entre monómeros en solución (s). En el caso de proteínas por ejemplo, sus propiedades de polielectrolitos hacen que sean casi siempre capaces de formar geles físicos. La degradación de los polímeros corresponde a las cadenas de monómeros enlazados (g) el gel y catalizada por una enzima (P) que los hidroliza en forma de monómeros solubles (s). Finalmente, existe en ciertos casos una tercera reacción también catalizada por la enzima (P) que consiste en las hidrólisis de los monómeros solubles en monómeros degradados (f) de tamaño demasiado pequeño para participar en el retículo o que no pueden formar enlaces con otros monómeros solubles. Esta última reacción que da lugar a una salida de monómeros de ciclo está igualmente ajustada al modelo. El modelo puede ser fácilmente representado según el esquema de reacciones siguiente:
Esquema II
15
En este segundo caso, el mecanismo de reacción puede ser fácilmente descrito por las tres ecuaciones diferenciales que siguen, en las que las reacciones enzimáticas son asimiladas a reacciones michelianas simples y mediante una cuarta ecuación de conservación de la masa.
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de cadenas de monómeros enlazados (g) en función del tiempo es la siguiente:
16
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros en solución (s) en función del tiempo es la siguiente:
17
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros degradados (f) en función del tiempo es la siguiente:
18
Finalmente, la ecuación de conservación de la masa permanece inalterada:
19
En estas ecuaciones diferenciales, V_{P} representa la velocidad máxima para la enzima que degrada los monómeros y K_{P} representa la constante de Michaelis para esta misma enzima.
En estas ecuaciones diferenciales, VP se calcula según la ecuación siguiente:
20
Además, V_{H}, que representa la velocidad de formación de los enlaces de baja energía, depende el monómero utilizado.
En la transposición de esta ecuación a un sistema in vitro, los diferentes valores de [P], V_{P}, V_{H} y K_{P} corresponden a constantes.
Las concentraciones de sustratos se calculan en el origen y seguidamente se determinan en el transcurso de la reacción por medio de diferentes ecuaciones diferenciales.
\vskip1.000000\baselineskip
2-2 Modelación de la formación de un gel físico de gelatina a 27ºC en presencia de termolisina
Este modelo teórico se aplicó a la formación de un gel físico de proteínas y, más precisamente, de gelatina a 27ºC y en presencia de termolisina. A esta temperatura, la gelatina forma un gel mediante asociación parcial de los monómeros en hélices triples. Estas hélices triples, estabilizadas mediante enlaces de hidrógeno, aparecen al disminuir la temperatura.
\vskip1.000000\baselineskip
Gelatina
1 - Descripción: La gelatina se obtiene a partir de colágeno. El colágeno es sintetizado en forma de precursores de tamaño grande: las pro-cadenas \alpha. La formación de precolágeno esta acompañada de un agrupamiento de tres pro-cadenas \alpha mediante enlaces de hidrógeno y la hidroxilación de ciertos residuos prolina y lisina, para formar hidroxiprolina e hidroxilisina, respectivamente. Finalmente, después de la secreción del precolágeno en el medio extracelular, el precolágeneo es madurado por escisión de los propéptidos para formar el colágeno. Este último es entonces susceptible de asociarse con otras moléculas de colágeno para formar fibrillas de colágeno, las cuales se agregan para formar fibras de colágeno. La estabilidad de la hélice triple formada mediante la asociación de las tres pro-cadenas \alpha es función del organismo de la que procede. La temperatura desnaturalización (Tm) es por tanto de 41,5 grados centígrados para ciertos mamíferos hasta 6ºC para ciertos peces que viven en aguas del Ártico. La variación del valor de Tm está correlacionada con la proporción de hidroxiprolina en la molécula (PERSIKOV et al. Biochemistry, vol 39, pag. 14960 - 14967, 2000).
La gelatina es obtenida mediante un tratamiento ácido o alcalino de los tejidos que contienen colágeno, lo que conduce a la desnaturalización de la hélice triple del colágeno (PEZRON, Physical Networks., Londres Elsevier Applied Science, 1990). En este estudio, las gelatinas utilizadas corresponden a gelatinas de tipo A obtenidas mediante un tratamiento ácido.
Cuando la solución de gelatina semi-diluida es enfriada por debajo de la temperatura de desnaturalización de las cadenas de colágeno, se forma un gel. Las cadenas se asocian para formar partes de hélices triples parecidas a las del colágeno nativo. Esta transición conformacional, permite la creación de un retículo tridimensional que atrapa las moléculas de agua presentes. El gel formado es entonces un gel físico, las hélices triples solo son estabilizadas por enlaces de hidrógeno (enlaces débiles). Estos enlaces son desestabilizados al aumentar la temperatura, lo que provoca la disolución del gel: este fenómeno de gelificación es por tanto reversible.
Estudios precedentes han mostrado que la elasticidad de este gel esta asociada únicamente a la concentración de hélices de la muestra (JOLY-DUHAMEL et al., Langmuir, vol. 18 pag. 7158-7166, 2002).
2 - Concentración: La concentración de gelatina utilizada es la misma que la determina en el ejemplo 1.
3 - Velocidad de formación de las hélices: La determinación de la velocidad de formación de las hélices triples (VH) se efectúo siguiendo el cambio de conformación bola/hélice por polarimetría en función del tiempo o la temperatura. En efecto, la ligera torsión que resulta de la formación de la hélice triple supone una ligera rotación de una luz polarizada que atraviese la muestra. Este estudio se efectúo por medio de un polarímetro PERKIN ELMER 341 o un polarímetro JASCO 1100. Las mediciones se efectuaron a 436 nm.
El estudio mediante polarimetría de la cinética de formación de gel de gelatina de tipo A (tipo A o AP1) permitió determinar para cada gelatina, la evolución del porcentaje de hélices en función del tiempo y a 27ºC. La Figura 9 muestra la evolución del porcentaje de hélices de soluciones al 5% de las dos gelatinas de tipo A utilizadas (tipo A y AP1) en función de tiempo y con un enfriamiento de 40ºC a 27ºC a una velocidad de 0,5ºC/minuto.
Los resultados de las cinéticas de aparición son globalmente iguales en las dos muestras. En el momento de la gelificación, el porcentaje de hélices es igual para las dos gelatinas (6,4% a 40 minutos).
La velocidad de formación de las hélices puede ser calculada fácilmente a partir de la figura 9. la figura 10 muestra igualmente la evolución del porcentaje de hélices en función del tiempo de la temperatura para un gel físico sin transglutaminasa (cuadrados negros) y para un gel químico obtenido en presencia de transglutaminasa (círculos blancos). La velocidad de aparición de las hélices se determinó en intervalos de tiempo diferentes y se utilizó en el modelo. Así, para la figura 10 y para el gel físico, V_{H} es 45.10^{-5} M.min^{-1} durante 10 minutos, 21.10^{-5} M.min^{-1} durante 10 minutos, 9.10^{-5} M.min^{-1} durante 20 minutos de 20 minutos y seguidamente 4,5.10^{-5} M.min^{-1} durante los 90 minutos siguientes y finalmente 2,5.10^{-5} M-min^{-1}.
Se realizaron experimentos similares con geles de gelatina de dos a 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Enzimas
La proteasa utilizada corresponde a la termolisina utilizada en ejemplo 1. Los parámetros utilizados son por tanto los mismos que con anterioridad. Sin embargo, se tuvo en cuenta la sensibilidad diferente de las dos enzimas a esta temperatura:
\bullet
Para TL (V_{i40^{o}C} = 1,66V_{i27^{o}C}),
\bullet
Para TG (V_{i40^{o}C} = 2,86V_{i27^{o}C}).
\vskip1.000000\baselineskip
Modelación
A partir de los diferentes valores determinados con anterioridad, es posible seguir el comportamiento de al fracción enlazada en función del tiempo aplicando el método de aproximación de Euler para resolver ecuaciones diferenciales como anteriormente. Se efectuaron varios experimentos de modelación utilizando diferentes concentraciones de termolisina.
La figura 11 presenta algunos ejemplos de modelación de la evolución del porcentaje de cadenas enlazadas en presencias de diferentes concentraciones de termolisina a 27ºC (el umbral de gel corresponde a 6,4% de hélice). Los resultados obtenidos muestran que para ciertos valores V_{P} es posible una transición y que, en cualquier, el escape de pequeños fragmento de sido a la hidrólisis lleva a la degradación del retículo y, por tanto a la solubilización del gel formado.
\vskip1.000000\baselineskip
2-3 formación de un gel físico de gelatina en presencia de termolisina
Para validar este modelo teórico se efectuaron diversos experimentos según el mismo protocolo descrito como anterioridad (véase 2-2) y añadiendo diferente concentraciones de termolisina. Los resultados obtenido, en comparación con las predicciones del el modelo teórico, se representan en la tabla III siguiente:
TABLA III
21
Los resultados muestran que en este caso, según el modelo teórico desarrollado, es posible obtener experimentalmente un transición solución-gel seguida de una transición gel-solución sucesivamente, y esto a partir de una solución de monómeros capaces de polimerizarse mediante la formación de enlaces de baja energía y en presencia de una encina capaz de degradar las cadenas de polímero enlazados (en este caso una solución de gelatina al 5% y a 27ºC en presencia de diferente concentraciones de termolisina).
Se observa que a todas la concentraciones de termolisina ensayadas (de 0,001 a 0,1 U/ml) el gel, si se forma acaba por fundirse, lo que está de acuerdo como el modelo teórico desarrollado.
En el caso de una solución de gelatina al 5% a 27ºC en presencia de termolisina, la concentración de termolisina crítica para obtener una primera transición solución/gel es de 0,001 unidad.
El tiempo de gelificación depende entonces igualmente de la concentración de termolisina utilizada.
La figura 12 muestra la evolución experimental de las propiedades viscoelásticas de una solución de gelatina al 5% en presencia de diferente concentraciones de termolisina y a 27%.
Con respecto al modelo teórico desarrollado, es posible por tanto obtener un biomaterial capas de efectuar sucesivamente una transición solución/gel gel/solución por esto es suficiente como determinar la concentración crítica de enzima capaz de degradar las cadenas de monómeros enlazadas mediante interacciones de baja energía. El modelo teórico permite adaptar seguidamente la concentración en enzimática para obtener un gel que presente, por una parte, el tiempo de gelificación y como, por otra parte, el tiempo de duración deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Gel mixto 3-1 Desarrollo de un modelo teórico
Este modelo integró corresponde al equilibrio dinámico obtenido mediante la formación de un gel mixto (físico y químico) en presencia de dos actividades enzimáticas antagonistas. El modelo puede ser fácilmente representado según el esquema de reacciones siguientes (integrando los datos de los esquemas I y II):
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema III
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
En este tercer caso, el mecanismo de reacción puede ser fácilmente descrito mediante las tres ecuaciones diferenciales que siguen, en las que las reacciones enzimáticas son asimiladas a reacciones michelianas simples y mediante una cuarta ecuación de conservación de la masa.
\newpage
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de cadenas de monómeros enlazados (G) en función del tiempo es la siguiente:
23 
\vskip1.000000\baselineskip
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros en solución (s) en función del tiempo es la siguiente:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
La ecuación diferencial que permite describir la evolución del número de monómeros degradados(s) en función del tiempo es la siguiente:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, la ecuación de conservación de la masa es la siguiente:
26
En estas ecuaciones diferenciales, V_{H} representa la velocidad de formación de enlaces de baja energía y depende del monómero utilizado, V_{P} y V_{T} representan las velocidades máximas para la enzima P y T respectivamente, K_{P} y K_{T} representan las constantes de Michaelis para la enzima P y T, respectivamente.
En la transposición de esta ecuación a un sistema in vitro los diferentes valores de [P], [T], V_{P}, V_{T}, K_{P}, K_{T} corresponden a constantes.
\vskip1.000000\baselineskip
3-2 Modelación de la formación de un gel mixto de gelatina a 27ºC en presencia de transglutaminasa y de termolisina
Este modelo de teórico fue aplicado a la formación de un gel mixto de proteína y, más específicamente, de gelatina a 27ºC y en presencia de transglutaminasa y de termolisina.
\vskip1.000000\baselineskip
Gelatina
La concentración de gelatina utilizada es la misma que en los ejemplos 1 y 2. La velocidad de formación de la hélices de la misma que la determinada en el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Enzima
La proteasa utilizada corresponde a la termolisina utilizada en los ejemplo 1 y 2.
La transglutaminasa es la misma que la utilizada en el ejemplo 1. Los coeficientes de difusión fueron integrados como se describe en el ejemplo 1 para tener en cuenta el efecto de la difusión sobre la actividad de la transglutaminasa.
Los parámetros utilizados para estas dos enzimas son por tanto los mismos que los anteriormente descritos.
\vskip1.000000\baselineskip
Modelación
A partir de los diferentes valore determinados con anterioridad, es posible seguir el comportamiento de la fracción enlazada en función del tiempo, aplicando el método de Euler para resolver ecuaciones diferenciales como anteriormente. Se efectuaron varios experimentos de modelación utilizando diferentes concentraciones de transglutaminasa y de termolisina. Se aplicó un coeficiente de difusión para la transglutaminasa como se describe en el ejemplo 1:
La figura 13 muestra la evolución de la fracción de monómeros enlazados en función del tiempo y para diferentes relaciones V_{P}/V_{T} (con una concentración de transglutaminasa de 1 U/ml).
Los resultados sugieren, por una parte, que la gelificación es más rápida que en los ejemplos precedentes y, por otra parte, que la fracción de monómeros enlazadas y la estabilidad de los geles son más considerables que en los geles físicos y químicos.
\vskip1.000000\baselineskip
3-3 Formación de un gel mixto de gelatina en presencia de termolisina
Para validar el modelo teórico anteriormente descrito, se efectuó un experimento sobre una muestra de gelatina al 5% y a 40ºC, en presencia de las dos enzimas transglutaminasa y termolisina con una relación transglutaminasa/termolisina de 80 y una concentración de transglutaminasa de 1 U/ml. La solución se enfrió de 40ºC a 27ºC a un ritmo de 0,5ºC por minuto. La evolución de la solución de gelatina se siguió simultáneamente por reología y polarimetría como se describió anteriormente. El resultado obtenido, en comparación con las predicciones del modelo teórico, se representa en la tabla IV siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA IV
27 
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestra que, conforme al modelo teórico desarrollado, es posible obtener experimentalmente, a partir de una solución de monómeros polimerizables y mediante enlaces de baja energía y mediante enlaces covalentes, y en presencia de dos actividades enzimáticas antagonistas (en este caso, una solución de gelatina al 5%, a 27ºC y en presencia de diferentes concentraciones de transglutaminasa y termolisina) una transición solución/gel y seguidamente una transición gel/solución sucesivamente.
Conforme al modelo teórico desarrollado, el tiempo de formación del gel es muy corto. Además, la estabilidad y el tiempo de duración de gel "mixto" obtenido es muy considerable con respecto a los geles físicos e igualmente químicos.
La figura 14 muestra la evolución simultánea de las propiedades viscoelásticas y de porcentaje de hélice de una solución de gelatina al 5% en presencia de transglutaminasa y termolisina, con una relación de transglutaminasa/termolisina de 80 y una concentración de transglutaminasa de 1 U/ml y a 27ºC.
Con respecto al modelo teórico desarrollado, que está basado en los dos modelos teóricos precedentes, es posible obtener un biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición de solución/gel seguida de gel/solución. Para esto, es suficiente con determinar experimentalmente la relación crítica de enzima que enlaza los monómeros/enzima que degrada los monómeros enlazados como en el ejemplo 1, para obtener una primera transición solución/gel en función de los monómeros y la enzimas utilizadas. Un modelo teórico permite adaptar seguidamente las diferentes concentraciones enzimáticas de forma que se obtenga un gel que presente, por una parte, el tiempo de gelificación y, por otra parte, el tiempo de duración deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
3-4 Formación de un gel físico de gelatina en presencia de diferentes proteasas
Para confirmar los resultados obtenidos en el apartado 3-3, se efectuaron experimentos sobre muestras de gelatina al 7% y a 40ºC, en presencia de transglutaminasa y de diferentes proteasas, con una concentración de transglutaminasa de 1,5 U/ml. La solución se enfrió de 40ºC a 27ºC a un ritmo de 0,5ºC por minuto. La evolución de la solución de gelatina se siguió simultáneamente por reología y por polarimetría como se describió anteriormente. Los resultados obtenidos se representan en la tabla V siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA V
28
Los resultados muestran que en este caso incluso el modelo desarrollado es generalizable a otras enzimas.

Claims (14)

1. Procedimiento de preparación de un biomaterial, que comprende:
- al menos un monómero capaz de formar polímeros, o una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros, siendo dicho monómero una proteína escogida entre el grupo que comprende fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y HS), actina, mioglobina, colágeno y sus derivados, proteínas de suero, proteínas de soja y de trigo, proteínas de yema y clara de huevo y/o un sacárido capaz de formar polímeros escogido entre el grupo que comprende carragenanos, alginatos, pectinas, quitosano, celulosa, quitina, glicógeno y almidón;
- un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros, siendo escogido dicho primer tipo de enzima que degrada dichos polímeros, en función de la naturaleza proteica o sacárida de dichos polímeros, entre el grupo que comprende enzimas de la familia de las metaloproteinasas, familia de las serinas proteasas, familia de las cisteínas y aspartato proteasas y familia ADAM, carragenasas, pectinas liasas, poligalacturonasas, pectinas esterasas, alginatos liasas y fosforilasas, y
- eventualmente, un segundo tiempo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros,
presentándose dicho biomaterial en la forma de un gel o bien en la forma de una solución que es susceptible de efectuar sucesivamente una transición solución/gel eventualmente bajo la acción de un segundo tipo de enzima y seguidamente, bajo la acción del primer tipo de enzima, una segunda transición gel/solución,
estando caracterizado dicho procedimiento porque comprende la mezcla, en un disolvente apropiado: (i) de al menos un monómero capaz de formar polímeros; (ii) de un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente (iii) de un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros;
en cuya mezcla la concentración de monómeros capaces de formar polímeros, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros se escogen de forma que la resolución de las ecuaciones (I), (II), (III) y (IV) siguientes:
29
ecuaciones que describen respectivamente la evolución del número de monómeros enlazados (dg) (I), la evolución del número de monómeros en solución (ds) (II) y la evolución del número de monómeros degradados (ds) en función del tiempo (dt) (III), y la ecuación de conservación de la masa (IV), en las cuales:
- g corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada,
- t corresponde al tiempo,
- V_{P} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar los polímeros expresada en cantidad de monómeros enlazados llevados a su forma libre por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- K_{P} representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de degradar los polímeros,
- s representa la cantidad de monómeros en forma libre,
- V_{T} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros, expresada en cantidad de monómeros en forma libre enlazados por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- K_{T} representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros,
- V_{H} representa la velocidad de enlace, mediante enlaces de baja energía y por unidad de tiempo, de monómeros en forma libre, en el caso de monómeros capaces de polimerizarse mediante estos enlaces,
- V'_{P} corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar monómeros en forma libre, expresada en cantidad de monómeros degradados, los cuales ya no se pueden polimerizar, generados por dicha enzima y por unidad de tiempo,
- g_{t} corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada en el tiempo t,
- s_{t} corresponde a la cantidad de monómeros en forma libre en el tiempo t,
- f_{t} corresponde a la cantidad de monómeros degradados que ya no son capaces de formar polímeros en el tiempo t,
- S_{0} corresponde a la cantidad inicial de monómeros,
permite obtener un tiempo de gelificación y la duración de gel deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente apropiado es un disolvente acuoso.
3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la cantidad de monómeros capaces de formar polímeros está comprendida entre 0,1 y 30% en peso con respecto al peso total del biomaterial.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la relación de la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros respecto a la concentración de enzimas capaces de degradas los polímeros es superior o igual a 1.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros es superior a 0,001 U/ml.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa de liofilización del biomaterial en forma de gel.
7. Biomaterial, obtenido mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Biomaterial según la reivindicación 7, en el que los dos tipos de enzimas están presentes simultáneamente en forma no inactivada.
9. Biomaterial según la reivindicación 8, en el que la enzima es una metaloproteinasa.
10. Biomaterial según la reivindicación 9, en el que la enzima es una termolisina bacteriana.
11. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho monómero es una proteína capaz de formar polímeros, y el segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros de proteínas es escogido entre el grupo que comprende la familia de las lisil-oxidasas y la familia de las transglutaminasas.
12. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la relación de la concentración del segundo tipo de enzima respecto a la concentración del primer tipo de enzima es superior o igual a 1.
13. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que comprende además un disolvente acuoso.
14. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que se encuentra en forma de un gel liofilizado.
ES05822899T 2004-11-26 2005-11-25 Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transicion solucion/gel seguida de una transicion gel/solucion. Active ES2339371T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0452774A FR2878533B1 (fr) 2004-11-26 2004-11-26 Biomateriau capable d'effectuer successivement une transition solution/gel puis une transition gel/solution
FR0452774 2004-11-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2339371T3 true ES2339371T3 (es) 2010-05-19

Family

ID=34952973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05822899T Active ES2339371T3 (es) 2004-11-26 2005-11-25 Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transicion solucion/gel seguida de una transicion gel/solucion.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US8206945B2 (es)
EP (1) EP1824986B1 (es)
JP (1) JP4941993B2 (es)
AT (1) ATE454462T1 (es)
CA (1) CA2588039C (es)
DE (1) DE602005018820D1 (es)
DK (1) DK1824986T3 (es)
ES (1) ES2339371T3 (es)
FR (1) FR2878533B1 (es)
PL (1) PL1824986T3 (es)
PT (1) PT1824986E (es)
WO (1) WO2006056700A2 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076407A2 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Lifebond Ltd. Gelatin-transglutaminase hemostatic dressings and sealants
EP2219604A2 (fr) * 2007-11-14 2010-08-25 MA.I.A Woundcare Biomateriau permettant la delivrance controlee d'actifs
JP5450612B2 (ja) * 2008-06-18 2014-03-26 ライフボンド リミテッド 改良された架橋組成物
WO2010065908A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Catchmark Jeffrey M Degradable biomolecule compositions
JP5796860B2 (ja) 2009-12-22 2015-10-21 ライフボンド リミテッドＬｉｆｅｂｏｎｄ Ｌｔｄ 架橋マトリックスの特性を調節するための酵素的架橋剤の改変
CA2807012A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Lifebond Ltd. Dry composition wound dressings and adhesives
EP2749633B1 (en) * 2011-08-25 2017-12-13 Amano Enzyme Inc. COMPOSITION HAVING IMPROVED Foam STABILITY AND USE THEREOF
EP2623129B1 (fr) * 2012-02-03 2014-09-17 MA.I.A Woundcare Pansement et procede de fabrication
EP4349899A1 (en) 2013-07-26 2024-04-10 The Penn State Research Foundation Polymer compositions and coatings

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4041533A1 (de) * 1990-12-22 1992-06-25 Roehm Gmbh Backmittel oder backmehl, sowie verfahren zur herstellung von backteigen und backwaren
US5702717A (en) * 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5834232A (en) * 1996-05-01 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Cross-linked gelatin gels and methods of making them

Also Published As

Publication number Publication date
PT1824986E (pt) 2010-04-09
JP2008521393A (ja) 2008-06-26
ATE454462T1 (de) 2010-01-15
DE602005018820D1 (de) 2010-02-25
EP1824986B1 (fr) 2010-01-06
DK1824986T3 (da) 2010-05-17
WO2006056700A2 (fr) 2006-06-01
WO2006056700A3 (fr) 2006-08-31
EP1824986A2 (fr) 2007-08-29
CA2588039C (fr) 2016-04-12
FR2878533A1 (fr) 2006-06-02
PL1824986T3 (pl) 2010-07-30
US20090029411A1 (en) 2009-01-29
JP4941993B2 (ja) 2012-05-30
FR2878533B1 (fr) 2007-04-27
US8206945B2 (en) 2012-06-26
CA2588039A1 (fr) 2006-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2339371T3 (es) Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transicion solucion/gel seguida de una transicion gel/solucion.
Heremans et al. Protein structure and dynamics at high pressure
US8877705B2 (en) Biomaterial for the controlled delivery of ingredients
Venkatesu et al. Osmolyte counteracts urea-induced denaturation of α-chymotrypsin
Cai et al. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides
Bremmer et al. A general method for detecting protease activity via gelation and its application to artificial clotting
Rich et al. Effects of sugars on whey protein isolate gelation
Fitzpatrick et al. Regulation of plasmin activity by annexin II tetramer
Nakamoto et al. Abiotic mimic of endogenous tissue inhibitors of metalloproteinases: engineering synthetic polymer nanoparticles for use as a broad-spectrum metalloproteinase inhibitor
Liggieri et al. Biochemical analysis of a papain-like protease isolated from the latex of Asclepias curassavica L.
Ye et al. l-Arginine inhibits the activity of α-amylase: Rapid kinetics, interaction and functional implications
Castellani et al. Role of disulfide bonds upon the structural stability of an amaranth globulin
Daba et al. Chemical modification of wheat β-amylase by trinitrobenzenesulfonic acid, methoxypolyethylene glycol, and glutaraldehyde to improve its thermal stability and activity
Zarzecka et al. Biochemical properties of the HtrA homolog from bacterium Stenotrophomonas maltophilia
Corich et al. Evaluation of a biomimetic 3D substrate based on the Human Elastin-like Polypeptides (HELPs) model system for elastolytic activity detection
Marx et al. Role of zinc ions in activation and inactivation of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor
Isetti et al. Employing mutants to study thrombin residues responsible for factor XIII activation peptide recognition: a kinetic study
Wang et al. Impacts of citric acid concentration and pH value on mechanism and rheological properties of cold-set whey protein fibrils hydrogels
Akpalo et al. Increase of fibrin gel elasticity by enzymes: a kinetic approach
Kopač et al. Encapsulation of living photosynthetic organisms in alginate-gelatin hydrogels for controlled cell growth and oxygen production
Maity et al. Thermal detoxification of the venom from Daboia russelli russelli of Eastern India with restoration of fibrinolytic activity
Nair Modulating metalloproteinase activity with protein nanofibrils
JP3761925B2 (ja) 安定なプラスミン溶液
Daba Effects of Solvent Engineering and Chemical Modification on the Activity and Stability of Wheat β-Amylase
Roman et al. Evaluation of new L-amino acids triethanolammonium salts usability for controlling protease activity