ES2337751B2 - Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipadodel polimorfismo genetico -250g/a del gen lipc. - Google Patents
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Abstract
Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y
kit para el genotipado del polimorfismo genético -250G/A del
gen LIPC.
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de
polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC mediante la
amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando el conjunto
de cebadores reivindicado, y la detección mediante fluorescencia
usando el conjunto de sondas reivindicado. Las principales ventajas
de la presente invención son: gran rapidez que permite el genotipado
a gran escala ya que la reacción de PCR y la detección de la señal
fluorescente son simultáneas, asignación de genotipos automatizada y
obtenible de forma inmediata al finalizar la reacción, gran
sensibilidad que permite genotipar muestras empleando
concentraciones muy bajas de ADN, y menor riesgo de contaminación al
tratarse de un ensayo homogéneo.
Description
Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y
kit para el genotipado del polimorfismo genético -250G/A del
gen LIPC.
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de
polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC.
Los polimorfismos genéticos de un solo
nucleótido (en inglés "single nucleotide polimorphisms" o
"SNPs") son la forma más frecuente de variación que se puede
encontrar en el genoma humano. El estudio de la variabilidad
genética tiene repercusión biosanitana puesto que el papel que se
atribuye a los SNPs es, junto con distintos factores ambientales, de
moduladores de la susceptibilidad individual a padecer la mayoría de
las enfermedades comunes (hipertensión, diabetes, obesidad,
arteriosclerosis...). De este modo, el desarrollo de las técnicas de
genotipado es un tema en auge actualmente y es el campo en el que se
encuadra la invención.
La implicación del gen LIPC (lipasa
hepática) en el desarrollo de arteriosclerosis así como la del
polimorfismo común -250G/A localizado en la región promotora
(en desequilibrio de ligamiento con -514C/T, -710T/C
y -763A/G) está ampliamente descrita en la literatura (Jansen
H, 2004. Current Atheroscleris Repports: 5). Dada la gran
variedad de procesos en los que el enzima lipasa hepática está
involucrada es posible encontrar estudios que la consideran tanto
pro-aterogénica como lo contrario. Así, se ha
descrito que la presencia de los alelos menos frecuentes de los
polimorfismos citados se asocian con el desarrollo de cardiopatía
isquémica a pesar de estar demostrado que estas variantes se asocian
a una reducción de la actividad del enzima que se traduce en un
ligero aumento de las concentraciones del colesterol de HDL. Por
otra parte Eller y colaboradores (Eller P, Schgoer W, Mueller T,
Tancevski I, Ulmer H, Foeger B, Haltmayer M, Ritsch A, Patsch JR,
2005. Journal of Internal Medicine: 258) han demostrado en
400 sujetos con EAP estudiados en una unidad de angiología y
comparados con 400 sujetos sin EAP que la frecuencia del alelo
-250A del gen LIPC fue mucho mayor en casos que en
controles. Además, nuestro grupo (Valdivielso P, Ariza MJ, de la
Vega-Román C, González-Alegre T,
Rioja J, Ulzurrun E, González-Santos P, 2008,
Journal of Diabetes and its Complications: 22) ha mostrado
recientemente una asociación similar en sujetos con diabetes tipo
2.
El método descrito inicialmente para el
genotipado de este polimorfismo, -250G/A (Su Z, Zhang S,
Nebert DW, Zhang L, Huang D, Hou Y, Liao L, Xiao C, 2002, Journal
of Lipid Research: 43), está basado en el sistema de
PCR-RFLP, o genotipado por PCR y restricción, que es
el que se utiliza de forma más común para el análisis individual de
la mayoría de los SNPs conocidos. En este sistema se amplifican
mediante la reacción en cadena de la polimerasa los fragmentos
polimórficos del gen o genes en estudio, el fragmento amplificado se
digiere, con un enzima de restricción concreto pues el polimorfismo
suele causar la aparición o eliminación de un sitio de restricción y
el perfil de bandas específico de cada genotipo se visualiza
empleando geles de agarosa o acrilamida.
Las principales ventajas de la presente
invención en relación al método convencional
(PCR-RFLP) son: a. una mayor rapidez que permite el
genotipado a mayor escala (mayor número de muestras) ya que la
reacción de PCR y la detección de la señal fluorescente son
simultáneas, la asignación de genotipos está automatizada y se
obtiene inmediatamente al finalizar la reacción, b. mayor
sensibilidad, debido al empleo de una señal fluorescente, por lo
que se pueden genotipar muestras empleando concentraciones muy bajas
de ADN genómico, c. menor riesgo de contaminación, al tratarse de un
ensayo homogéneo, es decir el procedimiento se realiza en una sola
etapa.
Otro método descrito en la literatura (Zacharova
J, Todorova BR, Chiasson JL, Laakso M for the STOP_NIDDM study
group, 2005, Journal of Internal Medicine: 257) para
el genotipado del polimorfismo que se incluye en la invención es el
empleo de un ensayo de genotipado basado en el mismo principio pero
dependiente del uso de los kits y aparatos de la empresa que ha
desarrollado el método (Applied Biosystems). Las secuencias de
cebadores y sondas que se emplean en este sistema, así como el
mareaje por fluorescencia de estas últimas, difieren completamente
de las comprendidas en la presente invención, cuya principal ventaja
en relación a este método es que el kit propuesto puede emplearse en
cualquier máquina de PCR en tiempo real que detecte al menos dos
colores (longitudes de onda) de fluorescencia.
También es posible genotipar los polimorfismos
de interés mediante secuenciación directa, sin embargo este sistema
no se utiliza rutinariamente para el genotipado de un gran número de
muestras sino para la detección de nuevos polimorfismos en los genes
de interés.
El solicitante de la presente patente no tiene
conocimiento de ninguna publicación que haga referencia a otras
soluciones alternativas comparables a las que proporciona la
invención para este polimorfismo.
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Polimorfismo -250G/A: A lo largo de la
descripción este término hace referencia a la variante nucleotídica
del gen LIPC definida por la aparición de un cambio G por A
en la posición -250 de la región promotora (exón 1).
Ensayo: A lo largo de la descripción este
término hace referencia al conjunto de procedimientos que permiten
llevar a cabo el genotipado del polimorfismo.
Sondas lineales fluorogénicas: A lo largo de la
descripción este término hace referencia a las secuencias
nucleotídicas, complementarias de la región polimórfica de la
variante, que llevan acoplado un fluorocromo en el extremo 5' y una
molécula extintora en el extremo 3' de dicha secuencia.
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de
polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC.
El procedimiento, representado esquemáticamente
en la Figura 1, consiste en una única reacción de PCR en la que se
aprovecha la actividad 5' exonucleasa del enzima Taq polimerasa. En
la reacción de PCR están presentes cuatro oligonucleótidos: dos
cebadores específicos que flaquean el polimorfismo de interés y dos
sondas lineales fluorogénicas, específicas de cada alelo. Estas
sondas están marcadas en el extremo 5' con un fluorocromo de
referencia, distinto para cada sonda, y una molécula extintora en el
3'. Cuando las sondas están intactas, la señal emitida por la
excitación del fluorocromo de referencia es captada por la molécula
extintora, debido a la proximidad física entre ambas, y por tanto no
se detecta (figura 1a). La señal fluorescente, diferente para cada
alelo, sí se detecta cuando la sonda híbrida con el alelo totalmente
complementario y se libera el fluorocromo de referencia, por la
actividad 5'\rightarrow3' exonucleasa de la polimerasa, durante
los ciclos de la reacción de PCR (figura 1b y 1c).
De este modo, constituye un primer objeto de la
presente invención un conjunto de cebadores para el genotipado de
polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC, en el cual
al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias
que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 1 y SED
ID NO 2. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer
cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia
comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2.
Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador
es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del
segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.
Constituye un segundo objeto de la presente
invención un conjunto de sondas para el genotipado de polimorfismos
genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo
genético -250G/A del gen LIPC, en el cual al menos dos
de las sondas de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden
a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4.
Preferentemente, dicho conjunto está formado por una primera sonda,
específica del alelo más frecuente (-250G), cuya secuencia comprende
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, y por una
segunda sonda, específica del alelo menos frecuente (-250A), cuya
secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO 4. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos de la
primera sonda es idéntica a la SEQ ID NO 3, y la secuencia de
nucleótidos de la segunda sonda es idéntica a la SEQ ID NO 4. Dicha
primera sonda, específica del alelo más frecuente, se marca por
fluorescencia en el extremo 5' con
6-carboxifluoresceína (Fam) y en el extremo 3' con
carboxitetrametilrodamina (Tamra); y dicha segunda sonda, específica
para el alelo menos frecuente, se marca por fluorescencia en el
extremo 5' con hexaclorofluoresceína (Hex) y en el extremo 3' con
carboxitetrametilrodamina (Tamra).
Constituye un tercer objeto de la presente
invención un procedimiento para el genotipado de polimorfismos
genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo
genético -250G/A del gen LIPC, que comprende la
amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando el conjunto
de cebadores anteriormente referido, y la detección mediante
fluorescencia y genotipado del polimorfismo genético -250G/A
del gen LIPC usando el conjunto de sondas anteriormente
referido.
Constituye un cuarto objeto de la presente
invención un kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más
concretamente para el genotipado del polimorfismo genético
-250G/A del gen LIPC, que comprende al menos un
conjunto de cebadores y un conjunto de sondas tal y como los
anteriormente referidos.
Preferentemente, el kit comprende:
- a.
- dos cebadores con secuencias de nucleótidos idénticas a las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, y
- b.
- dos sondas con secuencias de nucleótidos idénticas a las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4, para la detección del alelo más frecuente y del alelo menos frecuente, respectivamente; y marcadas por fluorescencia en el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (Fam) y con hexaclorofluoresceína (Hex), respectivamente, y en el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Representación gráfica del principio
teórico que soporta la presente la invención. Las sondas en
solución, es decir, sin hibridar con su alelo específico, no se
detectan, pues la fluorescencia que emite el fluorocromo al ser
excitado es captada por el extintor (a). Cuando una de las sondas,
específica de uno de los alelos, híbrida con la secuencia del ADN
molde complementaria, la actividad exonucleasa 5'\rightarrow3'del
enzima Taq polimerasa libera el fluoróforo, que emite una señal
fluorescente detectable (b y c).
Figura 2. Visualización en geles de agarosa al
3% de la reacción de amplificación del fragmento polimórfico de la
variante -250G/A del gen LIPC. Las temperaturas del
gradiente aplicado se indican en la parte de superior de la figura
para cada calle del gel. Los tamaños de las bandas correspondientes
al marcador de peso molecular (PM) y el tamaño de fragmento
esperado, en pares de bases, se indican a la izquierda y a la
derecha, respectivamente.
Figura 3. Curvas de amplificación generadas por
la emisión de fluorescencia de cada una de las sondas diseñadas [(A)
corresponde a la lectura de fluorescencia Fam, y (B) a la lectura de
fluorescencia Hex) en un ensayo realizado a 58ºC. Las curvas
numeradas como (1) corresponden a la mezcla que sólo contiene la
sonda Fam -250G, las numeradas como (2) corresponden a la mezcla
sólo con Hex -250A, las curvas numeradas como (3) a las muestras
ensayadas con la mezcla con las dos sondas. Junto a cada curva se
indica el genotipo de la muestra empleada. (C) Gráfica de
discriminación alélica y la asignación de los genotipos realizada
por la aplicación informática de la máquina de PCR para los umbrales
de fluorescencia seleccionados. Se representan los datos de
fluorescencia obtenidos en el ciclo 38 para dos réplicas de las
muestras de ADN de genotipo conocido ensayadas con la mezcla que
contenía las dos sondas. Las unidades relativas de fluorescencia
correspondientes a la sonda Fam aparecen en el eje X y las de las
sondas Hex en el eje Y. La línea vertical representa el valor umbral
de fluorescencia de la sonda Fam a partir del cual se considera la
presencia del alelo específico, es decir, el más frecuente
("Allele 1"). La línea horizontal es el umbral de fluorescencia
de la sonda Hex y, por tanto, los valores de fluorescencia que
superen dicho umbral indican la presencia del alelo menos frecuente
("Allele 2"). Los símbolos empleados por la aplicación
informática se observan en la parte superior del panel. En la
gráfica mostrada, el círculo corresponde a Homo o "Allele 1",
el triángulo corresponde a Het o "heterozygote", el cuadrado
corresponde al Mut o "Allele 2" y rombo corresponde al blanco
o "none". A la derecha de la gráfica, tabla con la asignación
automática de genotipos realizada por la aplicación informática de
la máquina de PCR para los umbrales de fluorescencia seleccionados.
"ID 1" e "ID 2" indican el genotipo conocido de las
muestras. "Call" indica el genotipo asignado por la aplicación
informática.
Figura 4. (A) Gráfica de discriminación alélica
para las muestras del gradiente de temperatura realizado con un
ensayo -250G/A. Se representan los datos de fluorescencia
obtenidos en el ciclo 38. Las muestras de genotipo conocido (Hornos,
Het y Mut) se representan unidas por líneas para cada temperatura
del gradiente, indicadas al lado de dichas líneas. La asignación
automática de genotipos, considerando los umbrales de fluorescencia
seleccionados, se identifica mediante los símbolos empleados por la
aplicación informática de la máquina de PCR. En la gráfica
mostrada, el círculo corresponde a Homo o "Allele 1", el
triángulo corresponde a Het o "heterozygote", el cuadrado
corresponde al Mut o "Allele 2" y rombo corresponde al blanco
o "none". (B) Tabla con la asignación automática de genotipos
realizada por la aplicación informática de la máquina de PCR para
los umbrales de fluorescencia seleccionados. "ID 1" e "ID
2" indican el genotipo conocido de las muestras. "Call"
indica el genotipo asignado por la aplicación informática. Las
muestras nombradas como B, C, D, E y F corresponden a las
temperaturas del gradiente 61,5; 60; 58; 56 y 54ºC,
respectivamente.
Figura 5. (A) Gráfica de discriminación alélica
para un ensayo -250G/A realizado para un conjunto de 87
muestras de ADN extraído a partir de sangre entera de personas no
emparentadas. Se incluyen réplicas de muestras de ADN de genotipo
conocido: 2 Homo, 2 Het y 2 Mut, y 2 blancos sin ADN. Se representan
los datos de fluorescencia correspondientes al ciclo 35. (B) Vista
parcial de la ventana de asignación automática de genotipos que
realiza la aplicación informática de la máquina de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos sin carácter limitativo y cuyo objeto es
facilitar su mejor comprensión.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la obtención de las secuencias
oligonucleotídicas comprendidas en la presente invención se
realizaron los oportunos estudios bioinformáticos para el análisis
de parámetros claves, relacionados a continuación:
- \bullet
- Se deben seleccionar secuencias que impidan la formación de horquillas estables, dímeros o heterodímeros.
- \bullet
- Los cebadores deben diseñarse para amplificar un fragmento pequeño, entre 60 y 150 pb, y así propiciar que la reacción de PCR sea eficaz.
\newpage
- \bullet
- La temperatura de fusión de los cebadores no debe ser muy alta, recomendándose un rango entre 54 y 60ºC. En el caso de las sondas, debe ser varios grados superior para favorecer que hibriden con su secuencia totalmente homologa antes que los cebadores, ya que el proceso de amplificación es tan rápido que de no ser así no se detectarían dichas secuencias.
- \bullet
- La diferencia de temperatura de fusión entre las dos sondas específicas de cada alelo no debe superar los dos grados.
- \bullet
- Deben evitarse las repeticiones de más de cuatro nucleótidos, especialmente Gs y Cs. Esto favorece la formación de estructuras secundarias y el aumento de las temperaturas de fusión en oligonucleótidos cortos.
- \bullet
- La proporción de Gs y Cs de las sondas no debe superar el 80%.
- \bullet
- Las sondas no pueden tener ninguna G en el extremo 5' ya que esta base dificulta la emisión de fluorescencia. Por el mismo motivo es preferible que las sondas tengan la secuencia de la hebra del ADN molde que contenga la menor proporción de Gs.
- \bullet
- Debe priorizarse la proximidad entre el cebador y la sonda.
- \bullet
- Las sondas no pueden ser muy largas, lo que aumentaría la estabilidad de la hibridación con los alelos no específicos y habría más distancia entre el fluoróforo de referencia y la molécula extintora. Se recomienda un máximo de 33 nucleótidos y el nucleótido polimórfico debe situarse lo más centrado posible.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias nucleotídicas específicas
comprendidas en la presente invención y objeto de una realización
preferida (SEQ ID NO 1-4) aparecen en la tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el proceso de optimización se comprobó,
como se describe a continuación, la especificidad de las secuencias
de cebadores y sondas, se seleccionó la temperatura más adecuada de
la etapa de hibridación/extensión de la reacción de PCR que tiene
lugar en los ensayos, y también la proporción de los cebadores y de
las sondas específicas de cada alelo presentes en la mezcla de
reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer conjunto de análisis llevado a cabo
para la optimización de los ensayos consistió en la realización de
una serie de reacciones de PCR, empleando los cebadores directo y
reverso y las condiciones de reacción necesarias, con objeto de
verificar la obtención de un único producto de amplificación así
como el rango de temperaturas en el que es posible obtenerlo.
Las reacciones se realizaron en placas
multipocillo, en un volumen de 15 \muL con 50 ng de ADN genómico,
además de controles sin ADN, utilizando, diluida a la mitad, la
mezcla de reacción iQ^{TM} SYBR Green Supermix (SYBR Green I y
fluoresceína 20 nM, KCl 100 mM, Tris-HCl 40 mM, pH
8.4, dATP, dCTP, dGTP y dTTP todos 0.4 mM, 50 U/mL de iTaq ADN
polimerasa, MgCl_{2} 6 mM, y estabilizadores) y los cebadores
directo y reverso en una concentración
300 nM.
300 nM.
El protocolo térmico consistió en un paso
inicial de desnaturalización del ADN y activación del enzima iTaq
ADN polimerasa de 5 minutos a 95ºC. A continuación, transcurrieron
42 ciclos con dos pasos, uno de desnaturalización de 30 segundos a
95ºC y otro de 45 segundos de hibridación y extensión en el que se
aplicó un gradiente de temperatura.
Los tamaños e intensidad de los fragmentos
obtenidos para cada temperatura se visualizaron haciendo migrar una
alícuota de la reacción de amplificación en geles de agarosa (figura
2). Los resultados muestran que la amplificación tiene lugar para
todas las temperaturas del gradiente ensayadas obteniéndose un único
fragmento del tamaño esperado.
Una vez comprobada la especificidad y eficacia
de las parejas de cebadores se realizó un primer ensayo con las
sondas fluorogénicas diseñadas para comprobar si era posible
detectar la señal fluorescente emitida durante la reacción de
PCR.
El primer ensayo con las sondas lineales
fluorogénicas se realizó con la misma mezcla de reacción anterior
pero sin SYBR green ni fluoresceína, aplicando un protocolo térmico
consistente en un paso de 5 minutos a 95ºC y 42 ciclos de dos pasos:
30 segundos de desnaturalización a 95ºC y 45 segundos de
hibridación/extensión a la temperatura menos restrictiva del
gradiente del experimento anterior, concretamente a 58ºC.
Se utilizaron como controles muestras de ADN de
sujetos con el genotipo previamente determinado mediante
amplificación por PCR y restricción: homocigotos para los alelos más
frecuentes (Homo), heterocigotos (Het) y homocigotos para los alelos
menos frecuentes o mutantes (Mut).
Se prepararon tres mezclas de reacción
diferentes: una con cada sonda, Fam -250G (100 nM) o Hex -250A (200
nM) por separado, y otra con las dos juntas: Fam -250G a 100 nM y
Hex -250A a 200 nM, en los tres casos con 300 nM de los cebadores
directo y reverso. Cada mezcla se ensayó con 50 ng del ADN de cada
genotipo por duplicado y con blancos sin ADN.
Los datos de fluorescencia generados por la
eliminación del fluoróforo del extremo 5' de las sondas fueron
recogidos durante la etapa de hibridación/extensión. El análisis de
estos datos se llevó a cabo estudiando las curvas de amplificación
(figura 3A y 3B) y, en el caso de la mezcla que contenía las dos
sondas, también mediante la modalidad de discriminación alélica de
la máquina de PCR (figura 3C).
Se comprobó que ambas sondas generan una señal
fluorescente que permite monitorizar la reacción de PCR, tanto
cuando se utilizan individualmente [figura 3A(1) y
3B(2)] como cuando se utilizan las dos a la vez [figura
3A(3) y 3B(3)].
Para optimizar la temperatura de la etapa de
hibridación/extensión de los ensayos se realizaron experimentos en
gradiente con la mezcla de reacción que contiene las parejas de
cebadores y sondas específicas de cada polimorfismo.
Las reacciones de PCR se realizaron empleando 50
ng de muestras de ADN de sujetos con genotipo conocido, por
duplicado, y aplicando un protocolo térmico consistente en un paso
de 5 minutos a 95ºC y 42 ciclos de dos pasos: 30 segundos de
desnaturalización a 95ºC y 45 segundos de hibridación/extensión en
gradiente entre 54 y 61,5ºC.
Se realizó el análisis de los datos mediante la
modalidad de discriminación alélica de la aplicación informática que
controla la máquina de PCR para valorar el comportamiento de las
sondas Fam y Hex simultáneamente.
Como se muestra en la figura 4 se comprueba que
la asignación de genotipos es correcta para las muestras ensayadas a
58 y 60ºC. Del grupo de temperaturas que permiten la asignación
correcta de genotipos para cada polimorfismo se seleccionan como
temperaturas de ensayo aquellas en las se produce la máxima señal
fluorescente en ausencia de fluorescencia inespecífica (ruido de
fondo) y se mantiene la mejor proporcionalidad en la fluorescencia
emitida por cada sonda para los tres genotipos posibles. De esta
forma, se establece en 58ºC la temperatura de ensayo preferida para
el polimorfismo -250G/A.
Se realizaron diversos ensayos empleando
distintas concentraciones de sonda Hex (100, 200 y 300 nM) así como
diferentes concentraciones de cebadores (200, 300 y 500 nM) y la
separación en dos pasos de la etapa de hibridación y extensión
(hibridación a 58ºC 30 segundos más extensión a 72ºC 30 segundos).
En todos los casos fue posible asignar los genotipos de forma
correcta. Se decidió escoger la concentración intermedia de sonda
Hex (200 nM) pues puede garantizar mejor que la de 100 nM la
discriminación de genotipos en muestras de baja concentración de ADN
e implica un coste menor del ensayo que la de 300 nM. Finalmente no
se incluyó una etapa de extensión que alargaría el tiempo de
ensayo.
Se realizaron también diversos ensayos empleando
distintas cantidades de ADN molde (5, 10, 25 y 50 ng de cada
genotipo por duplicado). El análisis de los datos, por grupo de
muestras correspondientes a cada cantidad de ADN, mediante la
modalidad de discriminación alélica, demostró que es posible
distinguir de forma específica los tres genotipos para todas las
cantidades de ADN ensayadas.
En un ejemplo de aplicación del procedimiento
sobre un conjunto de muestras amplio (88 muestras) se distribuyeron
alícuotas de 2.5 \muL del ADN genómico, con un rango de
concentración en ng/\muL de 34,94 ± 12,30, en placas multipocillo.
En cada placa, además de las muestras a genotipar, se incluyeron 50
ng de los correspondientes controles de ADN con genotipo conocido
(Homo, Het y Mut), y un blanco sin ADN. Las condiciones de ensayo
fueron las siguientes:
Mezcla de reacción (15 \muL de volumen
final):
- \bullet
- ADN molde (muestras homogéneas entre 5 y 50 ng)
- \bullet
- KCl 50 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8.4; dATP, dCTP, dGTP y dTTP, todos 0.2 mM; 0.375 U de iTaq ADN polimerasa, MgCl_{2} 3 mM
- \bullet
- Cebadores directo y reverso (SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, respectivamente; tabla 1) 300 nM
- \bullet
- Sonda Fam (SEQ ID NO 3, tabla 1) 100 nM
- \bullet
- Sonda Hex (SEQ ID NO 4, tabla 1) 200 nM
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo térmico:
- \bullet
- 1 ciclo de desnaturalización y activación de la polimerasa de 5 minutos
- \bullet
- 42 ciclos con dos pasos: 30 segundos de desnaturalización a 95ºC y 45 segundos de hibridación/extensión a 58ºC.
Los resultados obtenidos se muestran en la
figura 5. En el ejemplo descrito se obtuvieron 47 muestras -250GG
(homocigotos para el alelo más frecuente), 36 muestras -250GA
(heterocigotas), y 4 muestras -250AA (homocigota para el alelo menos
frecuente). Para todas las muestras de la placa se verificó el
genotipado mediante el método convencional de PCR y restricción,
siendo la concordancia entre los dos métodos del 100%.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Universidad de Málaga
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjunto de cebadores, sondas,
procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético
-250G/A del gen LIPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200802185
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2008-07-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacctttgg cagaatttc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia cebador reverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaggtcag agttccaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sonda específica del alelo
más frecuente o sonda Fam -250G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagtagctt taagttgatt aatttgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sonda específica del alelo
menos frecuente o sonda Hex-250A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagtagctt taaattgatt aatttgga
\hfill28
Claims (19)
1. Conjunto de cebadores para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC
caracterizado porque al menos dos de los cebadores de dicho
conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias
mostradas en las SEQ ID NO1 y SED ID NO 2.
2. Conjunto de cebadores para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto
está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo
cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEQ ID NO 2.
3. Conjunto de cebadores para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la
secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID
NO 2.
4. Conjunto de sondas para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC
caracterizado porque al menos dos de las sondas de dicho
conjunto, una de ellas específica del alelo más frecuente (-250G) y
la otra específica del alelo menos frecuente (-250A), presentan,
respectivamente, secuencias que comprenden a las secuencias
mostradas en las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4.
5. Conjunto de sondas para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto
está formado por una primera sonda, específica del alelo más
frecuente, cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEQ ID NO 3, y por una segunda sonda, específica del
alelo menos frecuente, cuya secuencia comprende la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 4.
6. Conjunto de sondas para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos de la primera sonda es idéntica a la SEQ ID NO 3, y la
secuencia de nucleótidos de la segunda sonda es idéntica a la SEQ ID
NO 4.
7. Conjunto de sondas para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque
tanto la sonda específica del alelo más frecuente como la sonda
específica del alelo menos frecuente están marcadas por fluorocromos
de referencia distintos en el extremo 5' y en el extremo 3' con una
molécula extintora.
8. Conjunto de sondas para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque la sonda
específica del alelo más frecuente está marcada por fluorescencia en
el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (Fam) y en
el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra); y la sonda
específica para el alelo menos frecuente está marcada por
fluorescencia en el extremo 5' con hexaclorofluoresceína (Hex) y en
el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra).
9. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC
caracterizado porque comprende:
- a.
- la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
- b.
- la detección mediante fluorescencia y genotipado usando un conjunto de sondas descrito según la reivindicación 7.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC
caracterizado porque comprende:
- a.
- la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
- b.
- la detección mediante fluorescencia y genotipado usando un conjunto de sondas descrito según la reivindicación 8.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque la detección
mediante fluorescencia y genotipado se realiza usando las sondas
descritas según la reivindicación 8 de forma que, en la mezcla de
reacción, la sonda específica del alelo más frecuente se encuentra a
una concentración de 100 nM, y la sonda específica del alelo menos
frecuente se encuentra a una concentración en el rango de 100 a 300
nM.
12. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque, en la mezcla de
reacción, la sonda específica del alelo menos frecuente se encuentra
a una concentración de 200 nM.
13. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según
cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 caracterizado
porque la amplificación mediante PCR comprende un paso inicial de
desnaturalización del ADN y activación de la polimerasa de 5 minutos
a 95ºC, y 42 ciclos con dos pasos: uno de desnaturalización de 30
segundos a 95ºC, y otro de hibridación y extensión.
14. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque el paso de
hibridación y extensión se realiza 45 segundos a una temperatura
comprendida en el rango de 54 a 61,5ºC.
15. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque el paso de
hibridación y extensión se realiza a una temperatura de 58ºC.
16. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación 14 caracterizado porque el paso de hibridación
y extensión se realiza separadamente: hibridación 30 segundos a una
temperatura comprendida en el rango de 54 a 61,5ºC, y extensión 30
segundos a 72ºC.
17. Procedimiento para el genotipado del
polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC según la
reivindicación anterior caracterizado porque la hibridación
se realiza a una temperatura de 58ºC.
18. Kit para el genotipado del polimorfismo
genético -250G/A del gen LIPC que comprende al menos
un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de
sondas descrito según la reivindicación 7.
19. Kit para el genotipado del polimorfismo
genético -250G/A del gen LIPC que comprende al menos
un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de
sondas descrito según la reivindicación 8.
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-
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Non-Patent Citations (4)
Title |
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LINDI V. et al. The G-250A polymorphism in the hepatic lipase gene promoter is associate with changes in hepatic lipase activity and LDL cholesterol: The KANWU Study. Nutitrion, Metabolism & Cardiovascular Diseases. Febrero 2008, Vol 18(2), páginas 88-95. Especialmente, página 88, resumen; página 90, columna 2, párrafo 3. * |
VALDIVIESO P. et al. Association of the -250G/A promoter polymorphism of the hepatic lipase gene with the risk of peripheral arterial disease in type 2 diabetic patients. Journal of Diabetes and Its Complications. Marzo 2008. Vol 22, páginas 273-277. Especialmente, página 273, página 273, resumen; página 274, columna 2, párrafo 4. * |
ZACHAROVA J et al. The G-250A substitution in the promoter region of the hepatic lipase gene is associated with the conversion from impaired glucose tolerance to type 2 diabetes: the STOP-NIDDM trial. Journal of Internal Medicine. 2005. Vol 257, páginas 185-193. Especialmente, página 185, resumen; página 187, columna 1, párrafo 2. * |
ZHAO S. et al. The -250G/A polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter affects blood lipids in Chinese. Clinica Chimica Acta. 2006, Vol 365, páginas 149-152. Especialmente, página 149, resumen; página 150, apartado 2.2.2. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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