ES2335769T3 - Vap-1 cristalina y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Proteína de adhesión vascular 1 humana cristalina (VAP-1), en la que dicho cristal se define como un cristal del grupo espacial P6522 con dos moléculas en la unidad asimétrica y con dimensiones unitarias de a = b = 225,9 Å c = 218,7 Å a = b = 90º; g = 120º.
Description
VAP-1 cristalina y sus usos.
La presente invención se refiere a la proteína
de adhesión vascular 1 (VAP-1) humana cristalina y,
en particular, al uso de información estructural de la
VAP-1 humana cristalina para la identificación, el
diseño y la producción de ligandos y/o inhibidores, así como para
el análisis de rastreo in silico e in vitro de tales
ligandos y/o inhibidores.
La vigilancia inmune fisiológica depende del
patrullaje continuo de los linfocitos entre la sangre y los
diferentes órganos linfoides. En el tejido no linfoide normal, los
linfocitos están ausentes o sólo se encuentran presentes a un nivel
muy bajo, pero en muchos estados patológicos inflamatorios se pueden
acumular enormes cantidades de linfocitos en diversos tejidos y
órganos afectados. Una de las moléculas importantes que controlan la
salida de los linfocitos de la sangre es la proteína de adhesión
vascular 1 (VAP-1) revelada en la patente
estadounidense n.º 5.580.780. La VAP-1 es una
glucoproteína endotelial de 170-180 kDa
homodimérica. La VAP-1 media la unión de los
linfocitos con las vénulas de secciones de tejido humano. La
VAP-1 está muy glicosilada y los restos de azúcar
son importantes para la función de adhesión (Salmi et al.,
1996). El bloqueo de la función de adhesión de la
VAP-1 reduce el número de células que se infiltran
en tejido inflamado permitiendo que baje la inflamación. La
VAP-1 es, por tanto, una diana para el desarrollo de
fármacos anti-inflamatorios.
La proteína de adhesión vascular 1
(VAP-1) humana es una glicoproteína multifuncional
unida a la membrana con propiedades tanto adhesivas como
enzimáticas. La clonación de la VAP-1 reveló que,
sorprendentemente, pertenece a las
monoamino-oxidasas sensibles a las semicarbazidas
(SSAO; ec 1.4.3.6) (publicación de patente internacional WO
98/53049). La VAP-1 es una proteína integral de
membrana de tipo 2 con un gran dominio extracelular catalíticamente
activo. Por tanto, la VAP-1 es una ectoenzima. No
están bien definidos ni el papel de la actividad SSAO ni sus
sustratos fisiológicos en la interacción
leucocito-endotelio. La VAP-1 fue el
primer miembro de la transmembrana molecularmente definido de este
grupo de enzimas en mamíferos, y representa el 90% de la actividad
SSAO celular. Particularmente, las SSAO se diferencian de las
mono-oxidasas A y B bien caracterizadas con
respecto a la ubicación subcelular, los sustratos, los cofactores,
los inhibidores y la secuencia de proteínas.
Aunque la reacción de las SSAO se conoce desde
los años 50 del siglo XX en términos bioquímicos, la(s)
fun-
ción(es) fisiológica(s) de estas enzimas siguen siendo un enigma. Se desconocen los sustratos fisiológicos de las SSAO. Sin embargo, hay dos posibles candidatas, la metilamina y la aminoacetona, que se forman durante el metabolismo intermedio en seres humanos y que pueden ser desaminadas mediante SSAO in vitro e in vivo.
ción(es) fisiológica(s) de estas enzimas siguen siendo un enigma. Se desconocen los sustratos fisiológicos de las SSAO. Sin embargo, hay dos posibles candidatas, la metilamina y la aminoacetona, que se forman durante el metabolismo intermedio en seres humanos y que pueden ser desaminadas mediante SSAO in vitro e in vivo.
Se ha propuesto que la actividad SSAO de la
VAP-1 está implicada directamente en la ruta de la
adhesión de los leucocitos a las células endoteliales mediante un
nuevo mecanismo que implica la interacción directa con un sustrato
de amina presentado en un ligando de la VAP-1
expresado sobre la superficie de un leucocito (Salmi et al.,
2001). Esta publicación describe la implicación directa de la
actividad SSAO de la VAP-1 en el procedimiento de
adhesión de leucocitos al endotelio. Por tanto, cabría esperar que
los inhibidores de la actividad SSAO de la VAP-1
reduzcan la adhesión de los leucocitos en zonas de inflamación,
reduciendo así el tráfico de leucocitos hacia la región inflamada
y, por tanto, el propio proceso inflamatorio.
En muestras de tejido clínicas humanas, se
induce la expresión de la VAP-1 en zonas de
inflamación. Este aumento del nivel de la VAP-1
puede conducir a una mayor producción de H_{2}O_{2} generada a
partir de la acción del dominio extracelular de SSAO de la
VAP-1 sobre las monoaminas presentes en la sangre.
Esta generación de H_{2}O_{2} en el medio localizado de la
célula endotelial podría inicial otros eventos celulares.
H_{2}O_{2} es una molécula de señalización conocida que puede
sobre-regular otras moléculas de adhesión y esta
mayor expresión de moléculas de adhesión puede conducir a un mayor
tráfico de leucocitos en las zonas en las que se expresa
VAP-1. Otros productos de la reacción SSAO de la
VAP-1 también pueden tener efectos biológicos que
contribuyen al proceso inflamatorio. Por tanto, los productos de la
actividad SSAO de la VAP-1 pueden estar implicados
en una intensificación del proceso inflamatorio, que podría ser
bloqueada por inhibidores específicos de la actividad SSAO.
La SSAO de la VAP-1 puede estar
implicada en un número de otras afecciones patológicas asociadas con
un aumento del nivel de sustratos de amina en circulación de SSAO
de la VAP-1. La desaminación oxidativa de estos
sustratos conduciría a un aumento del nivel de aldehídos tóxicos y
radicales de oxígeno en el medio local la célula endotelial que
podría dañar las células conduciendo a una lesión vascular. Se han
publicado aumentos de los niveles de metilamina y aminoacetona en
pacientes con diabetes de tipo I y de tipo II, y se ha propuesto que
las vasculopatías tales como la retinopatía, la neuropatía y la
nefropatía observadas en estadios tardíos de la diabetes podrían
ser tratadas con inhibidores específicos de la actividad SSAO.
El desarrollo de inhibidores específicos de la
actividad SSAO de la VAP-1 que modulen la actividad
de la VAP-1 serían útiles para el tratamiento de
afecciones o enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, tales
como la artritis crónica, las enfermedades inflamatorias del
intestino y dermatosis cutáneas, así como las enfermedades
relacionadas con el metabolismo de los hidratos de carbono
(incluyendo la diabetes y las complicaciones que resultan de la
diabetes, tales como las vasculopatías). Además, las anomalías en la
diferenciación o la función de adipocitos o en la función de las
células del músculo liso (en concreto, la aterosclerosis) y diversas
enfermedades vasculares pueden ser adecuadas para el tratamiento
con inhibidores de la SSAO de la VAP-1.
La publicación de patente internacional WO
03/006003 da a conocer compuestos de hidrazina carbocíclicos, así
como su uso como inhibidores de las amino-oxidasas
sensibles a semicarbazidas (SSAO), incluyendo la proteína de
adhesión vascular 1 (VAP-1) humana.
Las amino-oxidasas que contienen
cobre (CAO; EC 1.4.3.6) pertenecen a la superfamilia funcionalmente
diversa de amino-oxidasas (Dawkes et al.,
2001). También se conocen como amino-oxidasas
sensibles a semicarbazidas, pues su actividad enzimática puede ser
bloqueada por un compuesto reactivo al carbonilo, la semicarbazida.
Catalizan la desaminación oxidativa de las aminas primarias en los
correspondientes aldehídos en una reacción dependiente del cobre en
la que se consume oxígeno molecular y se libera peróxido de
hidrógeno y amoníaco. Un rasgo característico de todas las CAO es
el uso de 2,4,5- trihidroxifenilalanin-quinona, una
topaquinona (TPQ), como cofactor rédox. Las CAO han sido aisladas
de varios organismos diferentes, incluyendo bacterias, hongos,
plantas y mamíferos. En las plantas, las CAO están implicadas, p.
ej., en la cicatrización de heridas, mientras que en procariotas,
las CAO permiten que el organismo utilice diversas aminas
metabólicamente como fuentes de nitrógeno y carbono. En eucariotas
superiores, se conoce muy poco acerca de la función biológica de
las CAO aparte de su papel en el metabolismo de aminas biogénicas y
otras aminas.
Shepard et al., 2002, comunicaron
sorprendentes diferencias en la selectividad y en las tasas de
desactivación al probar inhibidores frente a seis
amino-oxidasas que contenían cobre.
Se han resuelto las estructuras cristalinas de
las CAO de cuatro especies diferentes: Escherichia coli
(ECAO; p. ej., Banco de Datos de Proteínas, código PDB 1oac)
(Parsons et al., 1995), Pisum sativum (PSAO; código
PDB 1 ksi) (Kumar et al., 1996), Hansenula polymorpha
(HPAO; p.ej., código PDB la2v) (Li et al., 1998) y
Arthobacter globiformis (AGAO; p.ej. código PDB 1av4) (Wilce
et al., 1997). Todas estas estructuras homodiméricas tienen
un plegamiento global similar que se puede dividir en dominios
D1-D4, de los cuales el dominio D1 sólo se
encuentra en E. coli. Los dominios D2 y D3 son de \sim100
aminoácidos cada uno y tienen un plegamiento de tipo
\alpha/\beta, mientras que el mayor, el dominio
C-terminal D4 es de \sim400 aminoácidos de
longitud y tiene un plegamiento en sándwich \beta único que es
necesario para la dimerización. El sitio activo, que está
localizado en el dominio D4, está muy conservado dentro de la
familia de las CAO. Se encuentra profundamente enterrado dentro de
la proteína y sólo es accesible por un canal largo rodeado
principalmente por aminoácidos de los dominios D3 y D4. Los
residuos de aminoácido del dominio D3 están menos conservados que el
sitio activo real, lo que sugiere que la cavidad que conduce al
sitio activo es de gran importancia en la determinación de la
especificidad por el sustrato de las CAO.
Aunque las estructuras de proteínas CAO
conocidas son bastante similares, la identidad secuencial a nivel
de los aminoácidos es sólo del 25-35%. La relación
evolutiva de la VAP-1 con los miembros conocidos
estructuralmente de la familia de las CAO no ha sido caracterizada,
pero la presencia de un dominio transmembrana en el terminal N de
la VAP-1 sugiere una divergencia sustancial con
respecto a las CAO solubles.
La presente invención proporciona la
cristalización y el análisis por rayos X de la VAP-1
humana. Ésta es la primera CAO de mamífero en ser cristalizada.
La presente invención se refiere a la proteína
de adhesión vascular 1 (VAP-1) humana
cristalina.
La presente invención proporciona medios y
procedimientos para cristalizar VAP-1 purificada,
analizar los cristales de la VAP-1 obtenidos,
obtener parámetros de los cristales y datos de difracción de rayos X
según lo definido en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere además a
composiciones que comprenden la VAP-1
cristalina.
La presente invención proporciona además
información estructural sobre la VAP-1 humana
cristalina; más específicamente, información sobre la cavidad del
sitio activo de la VAP-1 humana, teniendo dicha
cavidad una anchura de \sim20 \ring{A} x \sim10 \ring{A} en
la superficie y una profundidad de \sim15 \ring{A}, y los
aminoácidos 86-87, 97, 168-173,
176-177, 180, 184, 205-212, 216,
227, 232-234, 236-239, 344,
388-390, 393-397,
415-419, 421, 421-426,
467-470, 647- 651 y 758-761 de un
monómero, y los aminoácidos 443-449 y 451 del otro
monómero de la VAP-1 humana. Más específicamente,
dicho sitio activo comprende además el aminoácido Leu469 encima de
una cavidad estrecha de \sim4,5 x \sim4,5 situada en la parte
inferior del sitio, que está revestido por los residuos de
aminoácido Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y Tyr473.
La presente invención utiliza un soporte
informático de lectura que tiene almacenados los datos de las
coordenadas atómicas/de difracción de rayos X que definen la
estructura tridimensional de la proteína VAP-1
humana, siendo dicho soporte capaz de mostrar una representación
tridimensional de un cristal de una molécula que comprende un
fragmento de proteína VAP-1 humana, cuando los datos
son leídos por una máquina apropiada y procesados por un programa
informático para determinar estructuras moleculares.
La presente invención proporciona además un
análisis in silico para el diseño de novo de ligandos y/o
inhibidores que comprende (i) identificar los grupos funcionales o
pequeños fragmentos de moléculas que pueden interactuar con los
sitios del sitio activo de la VAP-1 y (ii) unir
éstos en un sólo compuesto.
La presente invención proporciona además un
análisis in silico para rastrear compuestos conocidos y
bancos de compuestos en cuanto a su capacidad para inhibir la
actividad de la VAP-1.
A continuación, se describirá la invención más
detalladamente por medio de las realizaciones preferidas y con
referencia a las figuras anexas, en las que:
la Figura 1, Grupo A, muestra un cristal de la
VAP-1 hexagonal y el Grupo B, un patrón de
difracción típico;
la Figura 2 muestra el dímero de la estructura
cristalina de la VAP-1 humana, en el que las
unidades de azúcar están representadas como modelos de llenado de
espacios, y Tpg471 en ambos monómeros se muestra como una esfera
del dominio D4;
la Figura 3 muestra uno de los monómeros de la
estructura cristalina de la VAP-1 dimérica;
la Figura 4 muestra el modo de unión de un
compuesto inhibidor de la VAP-1 en la estructura de
la VAP-1. El punto de vista es hacia abajo, desde
la superficie hacia el sitio activo.
La presente invención proporciona cristales de
la VAP-1 humana.
Para desarrollar los cristales de la presente
invención, hay que purificar una proteína de longitud completa,
incluyendo la región transmembrana N-terminal, hasta
más del 80% de la proteína total y, más preferiblemente, hasta más
del 90% de la proteína total, siendo lo más preferible hasta más del
95% de la proteína total. A efectos de expresión y de purificación,
se usa la secuencia que codifica VAP-1 de longitud
completa (SEC ID N.º 1). Es importante que el procedimiento de
purificación elegido sea tal que la proteína purificada conserve su
actividad CAO, lo que puede ser determinado usando bencilamina como
sustrato.
Se puede usar un gran número de sistemas de
vector-huésped conocidos en la técnica para la
producción recombinante de la proteína para el procedimiento de
cristalización. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan
a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vectorial debe ser
compatible con la célula huésped usada. Como la
VAP-1 humana está muy glicosilada, se prefieren los
huéspedes eucariotas, tales como los huéspedes de levadura o de
células animales. Las células de Ovario de Hámster Chino (CHO)
constituyen las células huésped más preferidas, siendo éstas
completamente capaces de glicosilarse.
Se puede emplear cualquier técnica de
cristalización conocida por los expertos en la técnica para obtener
los cristales de la presente invención, incluyendo, pero sin
limitarse a, la cristalización por lotes, la difusión de vapor y la
micro-diálisis. Se puede usar el micro- y/o
macro-sembrado estándar de cristales si se
necesitan obtener cristales de calidad para rayos X.
Los cristales de la presente invención se pueden
formar en el grupo espacial P6522 con dos moléculas en la unidad
asimétrica y con dimensiones unitarias de a = b = 225,9 \ring{A},
c = 218,7 \ring{A}, \alpha = \beta = 90º \gamma = 120º
(véase el Ejemplo 2 que figura más adelante). Sin embargo, la
presente invención contempla cristales que se forman en cualquier
grupo espacial incluyendo, pero no limitándose a, P6_{5}22. Los
cristales se difractan hasta una resolución de más de 4 \ring{A},
preferiblemente, de más de 3 \ring{A}, lo más preferible, de más
de 2,8 \ring{A}.
Para recoger los datos de difracción de los
cristales de la presente invención, es posible proteger los
cristales usando crioprotectores, tales como el glicerol, y
congelarlos mediante congelación súbita en una corriente de
nitrógeno. Los datos de difracción de rayos X se pueden procesar con
el programa XDS (Kabsch et al., 1993), pero es posible usar
cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica para
procesar los datos de difracción de rayos X.
Para determinar la estructura atómica de la
VAP-1 humana según la presente invención, se puede
realizar un reemplazo molecular (MR), la construcción de un modelo
y una mejora.
Para determinar la estructura de la
VAP-1, se puede emplear el reemplazo molecular
usando las estructuras conocidas de las CAO conocidas en la técnica
o cualquier otra estructura de CAO que se pueda determinar según lo
descrito anteriormente y más adelante en el Ejemplo 3.
Se puede emplear cualquier procedimiento
conocido por el experto en la técnica para determinar la estructura
tridimensional de la proteína de la presente invención mediante el
reemplazo molecular. Por ejemplo, se puede emplear el programa
AMORE del paquete de programas CCP4i para determinar la estructura
de la VAP-1 humana usando las coordenadas atómicas
derivadas según lo descrito en la presente memoria.
Las coordenadas atómicas pueden ser
proporcionadas por un soporte informático de lectura. Como tal
soporte de almacenamiento, se prefiere una memoria de acceso
aleatorio (RAM), una memoria de sólo lectura (p. ej., un
CD-ROM) o un disquete. El soporte de almacenamiento
puede estar en un ordenador localmente accesible o remotamente
accesible a través de Internet.
Se puede construir un modelo inicial de la
estructura tridimensional usando el programa O (Jones et al.,
1991) y mejorarlo usando p. ej., el programa REFMAC del paquete de
programas CCP4i.
La estructura de la VAP-1
tridimensional mejorada según la presente invención está
representada por las coordenadas atómicas y los datos estadísticos
de la determinación de la estructura que se ofrecen en la Tabla 1.
La estructura de rayos X mejorada del dímero VAP-1
consta de los residuos A55-A761 con los residuos
A1-A54, A202-A204 y
A762-A763 no modelizados en el monómero A, y de los
B57-B761 con los residuos B1-B56,
B203, B742- B746 y B762-B763 no modelizados en el
monómero B. Los residuos A471 y B471 son topaquinonas (Tpq471) que
se forman mediante la modificación posterior a la traducción de un
residuo de tirosina intrínseco, y están implicados en la reacción
catalítica. Ambos monómeros contienen un ión de cobre en los sitios
activos.
La información obtenida de la estructura
tridimensional de la presente invención revela que el sitio activo
de la VAP-1 humana (el sitio de unión con el
sustrato) comprende (1) tres histidinas, His520, His522 y His684,
que coordinan el ión de cobre, (2) una base catalítica, Asp386, así
como (3) Tyr372 y Asn470, que están implicados en la colocación de
Tpq471, y (4) el residuo de la entrada al sitio activo, Tyr384.
Tpq471 está en la configuración (inactiva) "sobre el cobre" de
la estructura de rayos X de la VAP-1. Las
representaciones tridimensionales de la estructura de la
VAP-1 humana se proporcionan en las Figuras 2 y
3.
El sitio activo de la VAP-1 está
enterrado profundamente y Tpq471 se ubica a \sim22 \ring{A} de
la superficie de la molécula. La cavidad del sitio activo tiene una
anchura de \sim20 \ring{A} x \sim10 \ring{A} en la
superficie y una profundidad de \sim15 \ring{A}. En la parte
inferior de la cavidad, Leu469, que está ubicado encima de Tpq471,
bloquea la entrada hacia el sitio activo en la estructura de rayos X
de la VAP-1. Una pared de la cavidad está compuesta
por residuos procedentes de los dominios D2 y D3 más pequeños que
comprenden, p. ej., 86-87, 97,
168-173, 176-177, 180, 184,
205-212, 216, 227, 232-234 y
236-239, y los residuos del brazo largo de la
horquilla \beta que sobresale del otro monómero que comprende
443-449 y 451. La otra pared del canal está
compuesta por residuos del dominio D4 catalítico que comprende, p.
ej., 344, 388-390, 393-397,
415-419, 421, 421-426,
467-470, 647-651,
758-761. En la entrada del canal del sitio activo,
se observa una unidad de azúcar del N-glucano unido
a Asn232 en la estructura de rayos X. Por debajo de Leu469, la
cavidad del sitio activo de \sim7 \ring{A} de longitud es mucho
más estrecha que en la superficie y es casi circular con las
dimensiones de -4,5 x 4,5 \ring{A}. Esta parte del canal está
revestida por los residuos Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y
Tyr473.
La estructura de rayos X de la
VAP-1 revela sorprendentemente una estructura única
de la cavidad del sitio activo. La cavidad está montada sumamente a
lo ancho y abierta en comparación con los canales estrechos del
sitio activo de las estructuras de ECAO, HPAO, PSAO y AGAO. Por lo
tanto, la cavidad del sitio activo de la VAP-1
puede albergar estructuras de ligandos e inhibidores mucho mayores
que las cavidades del sitio activo de ECAO, HPAO, PSAO y AGAO. El
residuo correspondiente a Leu469 de la VAP-1 es
glicina (ECAO, HPAO y AGAO) o alanina (PSAO) y, por tanto, no puede
bloquear el sitio activo en las estructuras de ECAO, HPAO, PSAO y
AGAO. El conocimiento de esta estructura única es necesario para
diseñar un farmacóforo de la VAP-1 humana y
estructuras de ligandos e inhibidores específicas que se adapten a
la cavidad.
Esta información se puede usar para definir un
farmacóforo de la VAP-1 humana, i.e., una colección
de características químicas y limitaciones tridimensionales que
expresan los rasgos específicos necesarios para la actividad
biológica. El farmacóforo incluye preferiblemente características
accesibles desde la superficie, tales como donantes y aceptores de
puentes de hidrógeno, grupos cargados o sitios hidrófobos. Tales
características pueden ser incluidas en un modelo de farmacóforo
basado en su importancia relativa para la actividad biológica.
Los farmacóforos se pueden determinar usando un
programa informático disponible, tal como CATALYST,
CERIUS o usando una modelización manual basada en la configuración conocida de compuestos de plomo. El farmacóforo se puede usar para rastrear bancos de compuestos in silico, usando un programa informático disponible, según lo descrito más detalladamente a continuación.
CERIUS o usando una modelización manual basada en la configuración conocida de compuestos de plomo. El farmacóforo se puede usar para rastrear bancos de compuestos in silico, usando un programa informático disponible, según lo descrito más detalladamente a continuación.
En una realización de la invención, se usan, por
tanto, técnicas de modelización molecular para el diseño de
compuestos de novo. El diseño de compuestos de novo se
refiere a un procedimiento en el que se determinan las superficies
de unión o los sitios activos de macromoléculas diana, tales como la
VAP-1, y se usan como la base para el diseño
racional de compuestos que interactúen con dicha superficie de unión
o sitio activo. Las etapas de modelización molecular según la
presente invención hacen uso de las coordenadas atómicas de la
VAP-1 humana y de modelos del sitio activo. En una
realización preferida, el diseño de fármacos de novo implica
identificar grupos funcionales o pequeños fragmentos moleculares que
puedan interactuar con los sitios activos en la superficie de unión
de la
VAP-1 humana, y unir estos grupos o fragmentos en un sólo compuesto. Una vez identificados los grupos funcionales o pequeños fragmentos moleculares que interactúan con el sitio activo específico de la VAP-1 humana, es posible unirlos en un sólo compuesto usando cualquier fragmento de enlace que tenga un tamaño y una geometría adecuados para adaptarse al sitio activo.
VAP-1 humana, y unir estos grupos o fragmentos en un sólo compuesto. Una vez identificados los grupos funcionales o pequeños fragmentos moleculares que interactúan con el sitio activo específico de la VAP-1 humana, es posible unirlos en un sólo compuesto usando cualquier fragmento de enlace que tenga un tamaño y una geometría adecuados para adaptarse al sitio activo.
Aunque se puede realizar el enlace de los grupos
funcionales y los fragmentos adecuados manualmente, es preferible
usar un programa informático adecuado, tal como QUANTA o SYBYL.
Otros programas informáticos conocidos en la técnica son, p. ej.,
HOOK, que enlaza múltiples grupos funcionales con moldes moleculares
de una base de datos, y CAVEAT, para diseñar unidades de enlace a
moléculas acíclicas limitadas. Otros enfoques basados en la
informática para el diseño de compuestos de novo incluyen
LUDI, SPROUT y LEAPFROG.
La presente invención permite el uso de técnicas
de diseño molecular para diseñar, identificar y sintetizar
entidades y compuesto químicos, incluyendo compuestos inhibidores,
capaces de unirse al sitio activo de la VAP-1
humana. Es posible usar las coordenadas atómicas de la
VAP-1 humana en combinación con la modelización por
ordenador usando un programa de acoplamiento, tal como, p. ej.,
GOLD, GRAM, DOCK, HOOK o AUTODOCK, para identificar posibles
inhibidores de la VAP-1 humana. Este procedimiento
puede incluir el ajuste informático de posibles inhibidores en el
sitio activo de la VAP-1 para determinar cómo la
forma y la estructura química del posible inhibidor complementarán
el sitio activo. Los ejemplos de posibles inhibidores diseñados
mediante modelización con un programa de acoplamiento pueden
configurar la fórmula general (I) descrita más adelante.
La presente invención incluye además un
procedimiento in silico para identificar compuestos que
interactúan con el sitio activo de la VAP-1 humana,
que comprende las etapas de (a) proporcionar las coordenadas
atómicas del dominio de unión a ligandos de la
VAP-1 humana en un soporte de almacenamiento
informático y (b) usar el ordenador para aplicar técnicas de
modelización molecular a las coordenadas.
El modelo estructural anteriormente descrito se
usó además para analizar un banco de moléculas construido y
minimizado energéticamente con Sybyl v.6.9 para evaluar su capacidad
de actuar como inhibidores de la VAP-1. Antes del
rastreo in silico, se modificó la estructura de rayos X de la
VAP-1 para imitar la configuración activa "fuera
del cobre" de las CAO según lo descrito en el Ejemplo 4.
En otra realización más de la presente
invención, el procedimiento in silico se usa para identificar
compuestos que inhiben específicamente la actividad enzimática de
la VAP-1 humana, caracterizado por las siguientes
etapas: proporcionar un compuesto identificado por dichas técnicas
de modelización molecular, poner en contacto dicho compuesto con
VAP-1 humana y detectar la interacción.
La información estructural tridimensional y las
coordenadas atómicas asociadas con dicha información estructural de
la VAP-1 son útiles en el diseño racional de
fármacos proporcionando un procedimiento para identificar
compuestos inhibidores que se unan e inhiban la actividad enzimática
de la VAP-1. Dicho procedimiento para identificar
dicho posible inhibidor para una enzima que tiene actividad SSAO
comprende las etapas de (a) usar una estructura tridimensional de
la VAP-1 basada en sus coordenadas atómicas
enumeradas en la Tabla I; (b) emplear dicha estructura
tridimensional para diseñar o seleccionar dicho posible inhibidor;
(c) sintetizar dicho posible inhibidor; (d) poner en contacto dicho
posible inhibidor con dicha enzima; y (e) determinar la capacidad
de dicho inhibidor para inhibir dicha actividad SSAO.
El presente procedimiento in silico es
útil para identificar compuestos que inhiban la actividad enzimática
de la VAP-1 humana o compuestos que interactúen con
el sitio activo de la VAP-1.
Los ejemplos de los posibles inhibidores de la
VAP-1 identificables mediante el procedimiento de la
presente invención pueden ser representados por la fórmula (1):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la
que:
- \quad
- R^{1} es hidrógeno, alquilo inferior o un grupo fenilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;
- \quad
- R^{2} es hidrógeno o alquilo inferior, o
- \quad
- R^{1} y R^{2} pueden formar, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un anillo heterocíclico saturado;
- \quad
- R^{3}-R^{5} representan cada uno independientemente hidrógeno, alquilo inferior, aralquilo, fenilo opcionalmente sustituido o un grupo heteroarilo, o
- \quad
- R^{2} y R^{3} pueden formar, junto con los átomos a los que están unidos, un anillo heterocíclico saturado, o
- \quad
- R^{3} y R^{5} pueden formar, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, un anillo carbocíclico saturado;
- \quad
- R^{6} es naftilo, fenilo, fenilo sustituido o un grupo heteroarilo;
- \quad
- R^{7} es hidrógeno, alquilo inferior o aralquilo;
- \quad
- n es 1, 2 ó 3; y
- \quad
- X = O, S, SO, SO_{2} o NR_{2}.
Otros tipos de compuestos pueden ser igualmente
bien identificados, usando los procedimientos y los modelos según
la presente invención. Cualquier experto en la técnica puede, en
base a las coordenadas atómicas y al farmacóforo descritos en la
presente memoria, identificar los compuestos que interactúan con el
sitio activo de la proteína VAP-1 humana.
Generalmente, tales posibles compuestos inhibidores pueden ser
caracterizados por un agente reactivo con grupos carbonilo, tal como
una amina o una hidrazina, según lo ejemplificado anteriormente,
pero hay otras estructuras con una parte estrecha que sobresale que
se ajustan a la parte inferior de 4,5 x 4,5 \ring{A} de la cavidad
del sitio activo y que son capaces de unirse a la TPQ en el fondo
del sitio activo, que son igualmente posibles inhibidores. Esta
parte sobresaliente de los compuestos según la presente invención
está conectada con una parte media relativamente hidrófoba de una
longitud de aproximadamente 7 \ring{A} del compuesto, actuando
ambos como un "ligador" que permite el acceso de la parte
sobresaliente al sitio activo e interactúa con los aminoácidos
Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y Tyr473 que revisten la
cavidad. Finalmente, los compuestos según la presente invención
comprenden una parte más voluminosa que llena la cavidad ancha e
interactúa con los aminoácidos ejemplificados 86-87,
97, 168-173, 176-177, 180, 184,
205-212, 216, 227, 232-234,
236-239, 344, 388-390,
393-397, 415-419, 421,
421-426, 467-470,
647-651, 758-761,
443-449 y 451 en las paredes de la cavidad del sitio
activo.
Además, la presente invención proporciona
análisis y medios para verificar la actividad esperada de los
compuestos identificados.
Los compuestos identificados por los presentes
análisis de rastreo se pueden usar para la preparación de
medicamentos para el tratamiento de afecciones o enfermedades
inflamatorias agudas o crónicas, tales como la artritis crónica,
enfermedades inflamatorias del intestino, dermatosis cutáneas y
esclerosis múltiple, así como las enfermedades relacionadas con el
metabolismo de los hidratos de carbono (incluyendo la diabetes y las
complicaciones que resultan de la diabetes, p. ej., las
vasculopatías, tales como la retinopatía, la nefropatía y la
neuropatía). Además, tales inhibidores pueden ser útiles en el
tratamiento de anomalías en la diferenciación o en la función de
los adipositos, y en la función de las células del músculo liso (en
concreto, la aterosclerosis) y diversas enfermedades
vasculares.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención.
Se expresó la proteína de longitud completa con
la región transmembrana N-terminal en células CHO
competentes en la glicosilación, según lo descrito en Smith et
al., 1998. Se lisaron las células cosechadas usando un tampón
de lisis (NaCl 150 mM, base de Tris 10 mM, pH 7,2, MgCl_{2} 1,5
mM, NP_{4}O al 1%). Se usó un lisado celular aclarado para la
purificación de la HVAP-1 basado en una columna de
afinidad de anticuerpos monoclonales y usando el sistema
purificador ÄKTA^{TM} (Amersham Biotech). Se purificó la proteína
hasta la homogeneidad (> 95%) usando una cromatografía de
afinidad y, tras la purificación, se confirmó la presencia de la
proteína VAP-1, las bandas de 90 y
170-180 kD, mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS teñido con plata según lo
descrito por Smith et al., 1998.
La proteína purificada conservaba su actividad
CAO, según lo determinado usando bencilamina como sustrato. La
actividad amino-oxidasa fue medida usando un
procedimiento espectrofotométrico según lo descrito (Holt et
al., 1997), volumen de 200 \mul y bencilamina 1 mM como
sustrato. El cambio de absorbancia fue controlado en un contador de
placas de múltiples marcadores Victor^{TM} a 490 nm (PerkinElmer
Life Sciences).
La secuencia de nucleótidos de la región
codificante de la VAP-1 humana se proporciona en el
listado de secuencias como SEC ID N.º 1 y la correspondiente
secuencia de aminoácidos (763 aa) como SEC ID N.º 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de cristalización iniciales para
la hVAP-1 fueron rastreadas a temperatura ambiente
usando un rastreo de la cristalización en matriz poco densa
aleatoria Wizard I (Emerald BioStructures, Inc., EE.UU.) y el
procedimiento de difusión de vapor. Se obtuvieron pequeños cristales
hexagonales en una condición que contenía tartrato de K/Na 1,0 M,
imidazol 100 mM (pH 8,0) y NaCl 200 mM, tras varios meses de
incubación. Las gotas colgantes contenían 2 \mul de muestra de
proteína (1,0 mg/ml) en tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,2)
y 2 \mul de solución de reservorio. Tras una optimización, los
mejores cristales se obtuvieron usando una solución de reservorio
de tartrato de K/Na 1,0 M, imidazol 100 mM (pH 7,8) y NaCl
150-250 mM como precipitante. Los cristales se
formaron en unos cuantos días y crecieron hasta un tamaño final de
aproximadamente 0,15 x 0,15 x 0,1 mm (Fig. 1).
Se montó un cristal en un capilar y se llevó a
cabo un análisis de rayos X preliminar interno usando una fuente de
radiación de ánodos giratoria (radiación de K\alpha de Cu, 50 kV,
150 mA) y un detector de placas de imágenes MAR345. Sin embargo, el
cristal sólo de difractó hasta una resolución de 8 \ring{A}, no
pudiéndose determinar con exactitud el grupo espacial. El resto de
los análisis de rayos X, así como la recogida de datos, fue llevado
a cabo usando una radiación de sincrotrones en la línea de haces de
luz X11 (EMBUDESY Hamburgo, Alemania) dotada de un detector de CCD
de MAR Research. Para la recogida de datos, se
crio-protegieron los cristales con glicerol al 20%
(v/v) y se congelaron súbitamente en una corriente de nitrógeno de
100 K. Los datos de difracción, recogidos de tres cristales
diferentes, fueron procesados con el programa XDS. Se calcularon el
contenido de disolvente y el coeficiente de Matthews suponiendo un
peso molecular de 90 kDa por monómero y usando el paquete
informático CCP4.
Los cristales hexagonales de mejor aspecto se
obtuvieron usando tatrato de K/Na 1,0 M, imidazol 100 mM (pH 7,8) y
NaCl 150-250 mM como precipitante. Los cristales
crecieron hasta un tamaño típico de 0,15 x 0,15 x 0,1 mm (Fig. 1a)
con una dimensión de la celda unitaria de a, b = 225,9 \ring{A}, c
= 218,7 \ring{A}, \alpha, \beta = 90º y \gamma = 120º.
Según los datos estadísticos de difracción (Tabla 1), el límite de
difracción de los cristales de VAP-1 fue de 3,2
\ring{A}, incluso aunque se observaron reflexiones
correspondientes a una resolución de más de 3,0 \ring{A} en
algunos marcos (Fig. 1b). Los cristales pertenecen al grupo espacial
P6_{5}22. Suponiendo la presencia de un dímero (180 kDa) por
unidad asimétrica, el coeficiente de Matthews es de 4,5
\ring{A}^{3}/Da y el contenido de disolvente del 72%. En la
Tabla 1, se resumen los parámetros y los datos estadísticos de
difracción de los cristales.
La estructura de la VAP-1 fue
resuelta mediante reemplazo molecular usando el programa AMORE
(Navaza, 1994) del paquete de programas CCP4i (Collaborative
Computational Project, 1994). Este procedimiento confirmó que el
grupo espacial de los cristales de la VAP-1 era
P6_{5}22 con una unidad biológica, un dímero por unidad
asimétrica. De las estructuras diméricas de polialanina de CAO de
Escherichia coli (residuos 93-720; código PDB
1OAC), CAO de Pisum sativum (residuos 7-634;
código PDB 1KS1), CAO de Hansenula polymorpha (residuos
22-655; código PDB 1A2V) y CAO de Arthobacter
globiformis (residuos 9-623; código PDB 1AV4)
analizadas en el reemplazo molecular, la estructura de P.
sativum dio el mejor coeficiente de correlación (44,1%) y factor
R (53,4%), y fue usado como modelo de búsqueda.
Se calcularon mapas de densidad de electrones
con FFT del paquete CCP4i, y fueron lo suficientemente predecibles
para rastrear el polipéptido VAP-1, incluso al
comienzo de la construcción, en varios fragmentos. El modelo fue
construido manualmente usando el programa O y mejorado con REFMAC
5.1.24 (Murshudov et al., 1997) del paquete CCP4i hasta una
resolución de 3,2 \ring{A}.
Las cadenas laterales se fueron añadiendo etapa
a etapa a la estructura entre los numerosos ciclos de mejora. En el
modelo final, sólo no se pudieron rastrear los siguientes
aminoácidos, siendo por tanto excluidos de la estructura:
A1-A54, A202-A204,
A762-A763, B1-B56, B203,
B742-B746 y B762-B763. Las
coordenadas del residuo de topaquinona fueron tomadas del Centro de
Información de Hetero-Compuestos, Uppsala (Kleywegt
y Jones, 1998), y se generó un diccionario para ello con el
programa PRODRG (van Aalten et al., 1996). Se evaluó la
calidad estereoquímica del modelo de VAP-1 final
con PROCHECK (Laskowski et al., 1993); de los 1.401
aminoácidos del modelo, el 84,0% se dio en las regiones más
favorecidas de la gráfica de Ramachandran (Ramachandran y
Sasisekharan, 1968) y sólo el 0,5%, en las regiones ampliamente
permitidas o rechazadas. En la Tabla 1, se presenta un resumen de
los datos estadísticos de la determinación de estructuras. Las
coordenadas atómicas (y los factores estructurales) para la
estructura cristalina de VAP-1 humana han sido
depositadas en el PDB con el código de entrada 1 PU4
y 1US1.
y 1US1.
La forma cristalina de la VAP-1
humana es un homodímero, conteniendo cada subunidad los dominios D2,
D3 y D4. En la Figura 2, se muestra una representación esquemática
de la estructura de la VAP-1. Los dominios D2, D3 y
D4 observados en la estructura cristalina constaban de los residuos
\sim55-169, 170-300 y
301-761, respectivamente (SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4
y SEC ID N.º 5, respectivamente). Las principales diferencias en la
estructura de la VAP-1 humana en comparación con el
resto de las estructuras conocidas de las
amino-oxidasas se observan en los dominios D2 y D3,
incluso aunque también hay diferencias en el dominio D4.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra cómo se rastrea in
silico un banco de compuestos de alcohol de hidrazina sustituido
con ariloximetilo mediante el acoplamiento en la cavidad de unión
de la VAP-1 descrita en el Ejemplo 3. Los compuestos
rastreados tienen la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- R^{1} es hidrógeno, alquilo inferior o un grupo fenilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;
- \quad
- R^{2} es hidrógeno o alquilo inferior, o
- \quad
- R^{1} y R^{2} pueden formar, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un anillo heterocíclico saturado;
- \quad
- R^{3}-R^{5} representan cada uno independientemente hidrógeno, alquilo inferior, aralquilo, un fenilo opcionalmente sustituido o un grupo heteroarilo, o
- \quad
- R^{2} y R^{3} pueden formar, junto con los átomos a los que están unidos, un anillo heterocíclico saturado, o
- \quad
- R^{3} y R^{5} pueden formar, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, un anillo carbocíclico saturado;
- \quad
- R^{6} es naftilo, fenilo, fenilo sustituido o un grupo heteroarilo;
- \quad
- R^{7} es hidrógeno, alquilo inferior o aralquilo;
- \quad
- n es 1, 2 ó 3; y
- \quad
- X = O, S, SO, SO_{2} o NR^{2}.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
En la tabla 2, se ofrecen ejemplos de compuestos
sintetizados y/o elaborados y rastreados in silico:
Se modificó la estructura de rayos X de la
VAP-1 para imitar la configuración activa "fuera
del cobre" de las CAO según lo descrito a continuación. En
primer lugar, se modificó la topaquinona a la forma de
imino-quinona activa según la estructura de ECAO
(código PDB 1D6Z (Wilmot et al., 1999)). En segundo lugar, se
modificó la cavidad del sitio activo de la estructura de la
VAP-1 antes de los estudios de acoplamiento
seleccionando rotámeros de cadena secundaria (Phe389, Tyr394,
Asp386 y Leu469) en el paquete de modelización Bodil (http:
//www.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/johnson/bodil.html) que convirtió
a la imino-quinona del sitio activo en más
accesible para los ligandos. Se añadieron átomos de hidrógeno a la
estructura de la VAP-1 usada para rastrear y
acoplar con el programa Reduce v.2.15 sin ningún ajuste de cadenas
laterales (Word et al., 1999).
Se formaron los enantiómeros R y S
de los posibles ligandos y se minimizaron energéticamente con Sybyl
v.6.9 (Tripos Associates, St. Louis, EE.UU.). Se unieron mediante
enlace covalente los ligandos con el residuo de
imino-quinona y se acoplaron manualmente en la
cavidad de unión.
La Figura 4 muestra un ejemplo del ligando
rastreado. En la Figura 3, que se hace usando un paquete de
modelización Bodil, se presenta el modo de unión del enantiómero S
de BTT-2071 (Compuesto 9). Se seleccionó el
enantiómero S de BTT-2071 como un ejemplo de
ligando en la figura, pues en base a las simulaciones de
acoplamiento, es capaz de formar las interacciones más amplias con
la estructura de la VAP-1.
En base a la estructura de la
VAP-1, los ligandos en los que X es un átomo de
azufre en lugar de un átomo de oxígeno interactúan más
favorablemente con VAP-1, pues la superficie de
interacción de la VAP-1 es hidrófoba.
La parte hidrófoba de los ligandos, incluyendo
el átomo de azufre, se empaqueta frente a los residuos hidrófobos
(Leu468, Leu469, Phe389 y Met211). El átomo de oxígeno del grupo
para-metoxilo del ligando está a la distancia del
puente de hidrógeno con respecto al oxígeno de la cadena lateral de
Thr212, mientras que el átomo de oxígeno del grupo
meta-metoxilo del ligando está a la distancia del
puente de hidrógeno con respecto al grupo hidroxilo de la cadena
lateral de Tyr394. Phe389 está ubicado en una posición en la que
puede interactuar fácilmente con el anillo aromático de los
ligandos. Los grupos metilo de los grupos para- y
meta-metoxilo están en contacto con Tyr448 y
Tyr176, respectivamente. El grupo hidroxilo de los enantiómeros S
puede formar un puente de hidrógeno óptimo con Asp386, mientras que
en los enantiómeros R, la distancia del puente de hidrógeno y la
geometría no son óptimas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la actividad SSAO de la
VAP-1 usando el procedimiento colorimétrico acoplado
esencialmente según lo descrito para la
monoamino-oxidasa y enzimas relacionadas. Se usó
SSAO de la VAP-1 humana recombinante expresada en
células de Ovario de Hámster Chino (CHO) como fuente de SSAO de la
VAP-1 para las mediciones de la actividad. Las
células de CHO nativas tienen una actividad SSAO insignificante.
Estas células y su cultivo ya han sido descritas previamente (Smith
D. J. et al., 1998).
Se preparó un lisado celular suspendiendo
aproximadamente 3,6 x 10^{8} células en 25 ml de tampón de lisis
(NaCl 150 mM; base Tris 10 mM, pH 7,2; MgCl_{2} 1,5 mM; NP_{4}O
al 1%) e incubando a 4ºC durante una noche sobre una mesa
giratoria. Se aclaró el lisado mediante centrifugación a 18.000 g
durante 5 minutos a temperatura ambiente y se usó directamente el
sobrenadante en el análisis.
El análisis de SSAO de la VAP-1
fue realizado en placas de microvaloración de 96 pocillos como se
explica a continuación. Se añadió a cada pocillo una cantidad
predeterminada de inhibidor en caso de que fuera necesario. La
cantidad de inhibidor varió en cada análisis, pero en general, fue
de una concentración final de entre 1 nM y 50 \muM. Los controles
carecían de inhibidor. El inhibidor estaba en un volumen total de
20:1 en agua. Se añadieron los siguientes reactivos. Tampón de
fosfato de potasio 0,2 M, pH 7,6, hasta un volumen de reacción
total de 200 \mul, 45 \mul de solución cromogénica recién
preparada que contenía 2,4-diclorofenol 1 mM,
4-aminoantipirina 500 \muM y 4 U/ml de peroxidasa
de rábano picante y una cantidad de lisado celular de CHO que
contenía SSAO de la VAP-1 que provocó un cambio de
0,6 A490 por hora. Esto estaba dentro del intervalo de respuestas
lineales del análisis.
Se incubaron las placas durante 30 min a 37ºC y
se midió la absorbancia de fondo a 490 nm usando un contador de
múltiples marcadores Victor II de Wallac. Para iniciar la reacción
enzimática, se añadieron 20 \mul de bencilamina 10 mM
(concentración final = 1 mM) y se incubó la placa durante 1 h a
37ºC.
El aumento de absorbancia, que reflejaba la
actividad SSAO de la VAP-1, fue medido a 490 nm. La
inhibición fue presentada como el porcentaje de inhibición en
comparación con el control tras corregir la absorbancia de fondo, y
los valores de CI_{50} se calcularon usando GraphPad Prism.
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Se preparó MAO de rata a partir de hígado de
rata aclarando una muestra de 1 g de hígado varias veces en 14 ml
de solución de KCl-EDTA para eliminar toda la
sangre. Luego se homogenizó 1 g de muestra de hígado en 4 ml de
tampón de fosfato de potasio enfriado con hielo (0,1M, pH 7,4) con
un homogenizador Ultra-Turrax (puesto a 11.000 rpm,
4 x 10 s). Tras la centrifugación a 500 g durante 10 min a 4ºC, se
retiró cuidadosamente el sobrenadante y se centrifugó a 12.300 g
durante 15 min a 4ºC. Se descargó el sobrenadante y se volvieron a
suspender las mitocondrias sedimentadas en 4 ml de tampón de fosfato
recién preparado, y se centrifugaron como antes. Se suspendieron
las mitocondrias en 4 ml de tampón de fosfato y se homogenizaron con
un homogenizador Ultra-Turrax (configurado a 11.000
rpm, 2 x 10 s). Se extrajeron alícuotas del preparado mitocondrial y
se almacenaron a -70ºC.
La actividad MAO total fue medida de un modo
similar a la SSAO de la VAP-1, a excepción del
reemplazo de 2,4-diclorofenol por ácido vanílico 1
mM. Se añadió a cada pocillo una cantidad predeterminada de
inhibidor en caso de que fuera necesario. La cantidad de inhibidor
varió en cada análisis, pero en general, fue de una concentración
final de entre 10 nM y 800 mM. Los controles carecían de inhibidor.
El inhibidor estaba en un volumen total de 20:1 en agua. Se
añadieron los siguientes reactivos. Tampón de fosfato de potasio 0,2
M, pH 7,6, para un volumen de reacción total de 300 \mul, 50
\mul de solución cromogénica recién preparada (como la anterior) y
50 \mul de preparación de MAO.
Se incubaron las placas durante 30 min a 37ºC y
se midió la absorbancia de fondo a 490 nm usando un contador de
múltiples marcadores Victor II de Wallac. Para iniciar la reacción
enzimática, se añadieron 20 \mul de tiramina 5 mM (concentración
final = 0,5 mM) y se incubó la placa durante 1 h a 37ºC. El aumento
de absorbancia, que reflejaba la actividad MAO, fue medido a 490
nm. La inhibición fue presentada como el porcentaje de inhibición
en comparación con el control tras corregir la absorbancia de fondo,
y los valores de CI_{50} se calcularon usando GraphPad Prism. Se
añadieron a algunos pocillos clorgilina y pargilina (inhibidores de
MAO-A y -B, respectivamente) a 0,5 \muM como
controles positivos para la inhibición de MAO.
En la tabla 2, se muestra la capacidad de los
compuestos de la Tabla 3 para inhibir la actividad SSAO de la
VAP-1 con especificidad por SSAO de la
VAP-1 frente a la MAO de rata. Los resultados
indican que los compuestos son inhibidores específicos de la
actividad SSAO de la VAP-1 humana. Se espera, por
tanto, que los compuestos tengan una utilidad terapéutica en el
tratamiento de enfermedades y afecciones en las que la actividad
SSAO de la molécula de adhesión humana VAP-1
desempeñe un papel.
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<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2292
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 763
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (16)
1. Proteína de adhesión vascular 1 humana
cristalina (VAP-1), en la que dicho cristal se
define como un cristal del grupo espacial P6522 con dos moléculas
en la unidad asimétrica y con dimensiones unitarias de a = b = 225,9
\ring{A}; c = 218,7 \ring{A}; a = b = 90º; g = 120º.
2. La VAP-1 cristalina según la
reivindicación 1, que comprende dominios D2, D3 y D4, que se
caracteriza por las secuencias de aminoácidos SEC ID N.º 3,
SEC ID N.º 4 y SEC ID N.º 5, respectivamente.
3. La proteína VAP-1 cristalina
según la reivindicación 2, que comprende una cavidad de sitio activo
con una anchura de \sim20 \ring{A} x \sim10 \ring{A} en la
superficie y una profundidad de \sim15 \ring{A}.
4. La proteína VAP-1 cristalina
según la reivindicación 3, en la que dicha cavidad de sitio activo
comprende los aminoácidos 86-87, 97,
168-173, 176-177, 180, 184,
205-212, 216, 227, 232-234,
236-239, 344, 388-390,
393-397, 415-419, 421,
421-426, 467-470,
647-651 y 758-761 de SEC ID N.º 2 de
un monómero, y los aminoácidos 443-449 y 451 de SEC
ID N.º 2 del otro monómero de la VAP-1 humana.
5. La proteína VAP-1 cristalina
según la reivindicación 4, en la que dicho sitio activo comprende
además el aminoácido Leu469 encima de una cavidad estrecha de
\sim4,5 \ring{A} x -4,5 \ring{A} en la parte inferior de dicha
cavidad.
6. La proteína VAP-1 cristalina
según la reivindicación 5, en la que dicha parte inferior de la
cavidad del sitio activo está revestida por los residuos de
aminoácido Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y Tyr473.
7. Una composición que comprende una
VAP-1 cristalina según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
8. Un procedimiento para cristalizar
VAP-1 humana, que comprende las etapas de:
- a)
- proporcionar una solución acuosa de tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,2) que comprenda proteína VAP-1 humana (1 mg/ml);
- b)
- proporcionar una solución de reservorio que comprenda tartrato de K/Na 1,0M y NaCl 150-250 mM como agentes de precipitación en tampón de imidazol 100 mM (pH 7,8);
- c)
- mezclar un volumen de dicha solución acuosa con un volumen de dicha solución de reservorio formando una solución mixta; y
- d)
- cristalizar al menos una parte de dicha solución mixta mediante difusión de vapor.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un procedimiento para identificar un
compuesto que interactúa con la proteína VAP-1
humana, que comprende las etapas de: a) proporcionar coordenadas
atómicas de dicha proteína en un soporte informático de lectura que
tenga almacenado datos de coordenadas atómicas/difracción de rayos X
que definan la estructura tridimensional de la proteína
VAP-1 humana, capaces de mostrar una representación
tridimensional de un cristal de una molécula que comprende un
fragmento de proteína VAP-1 humana cuando son leídas
por una máquina apropiada y procesadas por un programa informático
para determinar estructuras moleculares, definiendo dichos datos la
cavidad del sitio activo de la proteína VAP-1
humana dimérica y teniendo dicha cavidad del sitio activo una
anchura de \sim20 \ring{A} x -10 \ring{A} en la superficie y
una profundidad de \sim15 \ring{A}, y que comprende además el
aminoácido Leu469 encima de una cavidad estrecha de -4,5 x -4,5 en
la parte inferior del sitio y b) usando un ordenador para aplicar
técnicas de modelización molecular a dichas coordenadas.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicha cavidad del sitio activo comprende los aminoácidos
86-87, 97, 168-173,
176-177, 180, 184, 205-212, 216,
227, 232- 234, 236-239, 344,
388-390, 393-397,
415-419, 421, 421-426,
467-470, 647-651 y
758-761 de un monómero, y los aminoácidos
443-449 y 451 del otro monómero de la
VAP-1 humana.
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que dicha parte inferior de la cavidad del sitio activo está
revestida por los residuos de aminoácido Ala370, Tyr384, Asp386,
Asn470, Tpq471 y Tyr473.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 9-11, en el que dichas técnicas de
modelización molecular implican el diseño de compuestos de
novo.
13. El procedimiento según la reivindicación 12,
en el que dicho diseño de compuestos de novo implica (i) la
identificación de grupos funcionales o pequeños fragmentos
moleculares que pueden interactuar con sitios del sitio activo de
la VAP-1 y (ii) la unión de éstos en un sólo
compuesto.
\newpage
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que las técnicas de modelización molecular usan un
farmacóforo de la VAP-1.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que las técnicas de modelización molecular usan algoritmos de
acoplamiento automáticos.
16. El procedimiento según la reivindicación 14
que comprende las etapas adicionales de (c) proporcionar un
compuesto identificado mediante dichas técnicas de modelización
molecular; y (d) poner en contacto dicho compuesto con la
VAP-1 humana y detectar el efecto inhibidor de dicho
compuesto sobre la actividad SSAO de la VAP-1.
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