ES2333595T3 - Un metodo para tratamiento y profilaxis. - Google Patents

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Ian Peter Wicks
Ian Keith Campbell
Andrew Warwick Roberts
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Abstract

Un agente que inhibe la actividad del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF), o el receptor del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSFR) y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica dicho G-CSF o GCSFR para el tratamiento o profilaxis de artritis en un sujeto.

Description

Un método para tratamiento y profilaxis.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona de manera general con un agente para el tratamiento o profilaxis de la artritis o con el uso de un agente en la fabricación de un medicamento para tal un propósito. La presente invención proporciona adicionalmente un método no terapéutico in vivo utilizando un modelo de animal no humano para detectar agentes útiles en el tratamiento o profilaxis de la artritis.
Antecedente de la invención
Al final de la especificación se listan detalles bibliográficos de referencias proporcionadas en la especificación objeto.
La referencia en cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no se debe tomar como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia ya que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.
El factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF, codificado por el gen CSF-3) es un factor de crecimiento hematopoyético que regula la producción de granulocitos (Nicola et al., Nature 314: 625, 1985; Metcalf International Journal of Cancer 25: 225, 1980; Nicola et al., Journal of Biological Chemistry 258: 9017, 1983). El G-CSF media sus afectos a través de la interacción con el receptor del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSFR, codificado por el gen CSFR-3), un miembro de la superfamilia del receptor de citoquinas tipo I (Demetri et al., Blood 78: 2791-2808, 1991). Las acciones biológicas principales de GCSF en humanos y ratones, incluyen incrementar la producción y la liberación de neutrófilos de la médula ósea (Souza et al., Science 232: 61, 1986; Lord et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:9499-9503, 1989), células progenitoras hematopoyéticas mobilizantes de la médula en la sangre periférica (Bungart et al., British Journal of Haematology 22: 1156, 1990; de Haan et al., Blood 86: 2986-2992, 1995; Roberts et al., Blood 89: 2736-2744, 1997), y modular la diferenciación y funciones efectoras de neutrófilos maduros (Yong et al., European Journal of Haematology 49: 251-259, 1992; Colotta et al., Blood 80: 2012-2020, 1992; Rex et al., Transfusion 35: 605-611, 1995; Gericke et al., Journal of Leukocyte Biology 57: 455-461, 1995; Xu et al., British Journal of Haematology 93: 558-568, 1996; Yong, British Journal of Haematology 94: 40-47, 1996; Jacob et al., Blood 92: 353-361, 1998). El G-CSF se utiliza para tratar neutropenia, así como también la movilización de células madre hematopoyéticas (HSC) para trasplante de célula madre autóloga y alogénica (Welte et al., Blood 88: 1907-1929, 1996).
El uso de G-CSF para la movilización de HSC puede originar exacerbaciones de artritis reumatoide (RA) (Snowden et al., Bone Marrow Transplantation 22: 1035-1041, 1998). El G-CSF junto con los factores de estimulación de colonia, GM-CSF y M-CSF se producen mediante fibroblastos sinoviales de humano y condrocitos en respuesta a IL-1 y TNF in vitro (Leizer et al., Blood 76: 1989-1996, 1990; Hamilton et al., Blood 79: 1413-1419, 1992), y se ha encontrado G-CSF en el suero y el fluido sinovial de pacientes RA (Tanabe et al., Rheumatology International 16: 67-76, 1996; Nakamura et al., Clinical and Experimental Rheumatology 18: 713-718, 2000). Se ha mostrado distribución sistémica de G-CSF por exacerbar la artritis inducida por colágeno de murino (CIA) con severidad e incidencia incrementada de la enfermedad en ratones DBA/1 (Campbell et al., Journal of Leukocyte Biology 68: 144-150, 2000), así como también un modelo de transferencia pasiva CIA en ratas (Miyahara et al., Clinical Immunology and Immunopathology 69: 69-76, 1993). Los ratones transgénicos G-CSF han incrementado la resorpción ósea y la formación ósea reducida (Takahashi et al., Laboratory Investigation 74: 827-834, 1996), lo que indica que el G-CSF puede tener un papel en el recambio óseo.
El G-CSF es capaz de expandir un subconjunto de monocito/macrófago e induce citoquinas antiinflamatorias que pueden proteger contra la endotoxemia en ratones (Gorgen et al., Journal of Immunology 149: 918, 1992). También se ha reportado que el G-CSF deteriora las respuestas de célula T alogénica y mitogénica en humanos y ratones (Foster et al., Transplantation 59: 1557, 1995; Pan et al., Blood 86: 4422, 1995), y por originar un cambio del perfil de citoquina de célula T hacia la producción de citoquina Th2, con una reducción correspondiente en la expresión Th1 IFN-\gamma (Pan et al., 1995, supra; Franzke et al., Blood 102: 734-739). En estudios de murino, esta desviación de la producción de citoquina Th2 se ha asociado con protección aguda contra enfermedad anfitrión versus injerto, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y lupus eritematoso sistémico espontáneo (Pan et al., 1995, supra; Zavala et al., Journal of Immunology 163: 5125-5132, 1999; Zavala et al., Journal of Immunology 168: 2011-2019, 2000). Los ratones deficientes en G-CSF se protegen de glomerulonefritis mediada por neutrófilo, pero no glomerulonefritis mediada por célula T/macrófago (Kitching et al., Journal of the American Society of Nephrologh 13: 350-358, 2000).
El G-CSF es, por lo tanto, una molécula pleiotrópica con un rango de funciones. Existe una necesidad para caracterizar más completamente estas funciones y para aclarar si la modulación de estas funciones puede conducir a beneficios en la salud.
Resumen de la invención
A través de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones tal como "que comprende" o "que comprenden", se entenderá que implica la inclusión de un elemento establecido o entero o grupo de elementos o enteros pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.
Se estudia el papel de los neutrófilos en un modelo de artritis de murino. El modelo de murino incluye el uso de anticuerpos para agotar neutrófilos así como también el uso de un ratón knockout G-CSF. Se determina que estos ratones son altamente resistentes a la inducción de artritis aguda, pero este efecto no parece ser explicado por los conteos menores de neutrófilos. Se encuentra de forma similar que el G-CSF puede inducir directamente inflamación de la articulación mediante la administración local y que el GCSF sistémico puede sustituir IL-1 en el modelo de artritis aguda.
La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo autoinmune crónico ampliamente utilizado para investigar la patogenia de la artritis reumatoide (RA) y para la evaluación de terapias prospectivas. Para examinar el requerimiento de G-CSF endógeno en la enfermedad de articulación crónica, se inmunizan ratones G-CSF-/- y tipo intacto (WT) con colágeno de pollo de Tipo II (CII) En Adyuvante Completo de Freund (CFA) para inducir CIA. Existe protección marcada de enfermedad en ratones deficientes en G-CSF, identificando un papel principal para G-CSF en CIA. Las respuestas de célula T a CII son normales en ratones transgénicos G-CSF.
De forma colectiva, esto muestra que el G-CSF endógeno juega un papel importante en la artritis inflamatoria. La actividad G-CSF de descenso, que reduce localmente o sistémicamente los niveles de G-CSF o inhibe o el descenso del receptor G-CSF (G-CSFR), se propone por ser un mecanismo útil para tratar o reducir la severidad de afecciones inflamatorias tal como artritis inflamatoria crónica y artritis reumatoide u otras afecciones de enfermedad inflamatoria crónica inmunocomprometida.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención contempla un uso de un agente que inhibe la actividad de G-CSF o GCSFR y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica dicho G-CSF o G-CSFR en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de artritis en un sujeto.
La eficacia terapéutica de la administración de un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb) para G-CSF se prueba en el modelo de artritis aguda. La inhibición de G-CSF durante la artritis aguda resulta en una reducción dependiente de dosis en células de linaje mieloide en el BM, neutropenia en la sangre periférica y reduce la infiltración celular de la articulación involucrada.
La presente invención proporciona adicionalmente un agente que inhibe la actividad de G- CSF o G-CSFR y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica G-CSF o G-CSFR para el tratamiento o profilaxis de artritis en un sujeto.
La presente invención proporciona adicionalmente un método no terapéutico in vivo utilizando un modelo de animal no humano para identificar agentes capaces de inhibir la actividad de G-CSF y/o inhibir la interacción de G-CSF con G-CSFR. Se proporciona una lista de abreviaturas utilizadas aquí en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1
2
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación gráfica que muestra afectos intraarticulares de G-CSF. A. Los ratones se tratan intraarticularmente con filgrastima (G-CSF; 0.1, 0.5, o 1 mg), IL-1 (25 ng) o solución salina (vehículo) durante tres días consecutivos y se examinan histológicamente en el día 3. * P < 0.05; \dagger P < 0.005 comparado con la solución salina control. B. Se cuantifican las células exudadas de la articulación en G-CSF (0.5, 1.5 mg) o articulaciones inyectadas de IL-1. Existe un exudado prominente de monocito/macrófago en las articulaciones inyectadas de GCSF. n > 12 articulaciones por grupo.
Las Figuras 2A y B son representaciones gráficas que muestran que G-CSF es necesario para inflamación de la articulación inducida por IL-1 local, pero no para la pérdida de proteoglicano inducida por IL-1. Se inyectan ratones B6 y G-CSF-l i.a. con IL-1 (25 ng) en los días 0, 1 y 2, y se evalúan histológicamente en el día 3 para A. La severidad de las características destructivas e inflamatorias y B. pérdida de proteoglicano de cartílago articular. Los resultados son representativos de la media 6 SEM (clasificados de 5). Los datos son de 1 de 2 experimentos; n = 14 articulaciones/grupo; * p < 0.05.
Las Figuras 3A y 3B muestran representaciones gráficas de los efectos sistémicos de filgrastima en vista de IL-1 en el modelo inducido por mBSA/IL-1 agudo. Se inyectan ratones B6 i.a. con mBSA y s.c. en los días 0, 1, 2 con solución salina [barras negras], IL-1 (250 ng) [barras grises] o filgrastima (15 mg) [barras blancas]. Se muestran A. Conteos de sangre periférica en el día 2 y B. el nodo linfático popliteal (LN) y el bazo se pesa en el día 7. Los datos son representativos de 3 experimentos con n > 5 ratones por grupo. * P < 0.05; \dagger P < 0.01 comparado con mBSA/solución salina control grupo.
La Figura 4A y 4B ilustra los efectos de G-CSF sistémico en vista de IL-1 en el modelo de artritis aguda. Los ratones se inyectan i.a. con mBSA y s.c. con vehículo de solución salina, IL-1, o G- CSF y se examinan histológicamente las rodillas infectadas en el día 7. A. Puntajes histológicos totales de media 6 SEM. B La histología representativa ilustra la articulación tratada con mBSA/solución salina con células exudadas mínimas en el espacio de la articulación (100X), ii articulación tratada con mBSA/IL-1 con moderación para marcar el exudado y sinovitis y iii articulación tratada con mBSA/G-CSF con características inflamatorias moderadas (200X). n \geq 10 articulaciones/grupo/experimento; experimento representativo de tres. * p < 0.05 comparado con mBSA/controles de solución salina.
La Figura 5A-C muestra ratones G-CSF-i/- que son relativamente resistentes a artritis inducida por mBSA/IL-1. Los ratones B6 y G-CSF-/- se tratan i.a. con mBSA y s.c. con IL-1 o solución salina y histológicamente se evalúan en el día 7. Los histogramas ilustran A puntajes de severidad histológica total y B pérdida de proteoglicano de cartílago (mediante teñido de safranina O). C Secciones representativas que muestran H&E (panel superior) y secciones de safranina O (panel de fondo) de mBSA/IL-1 tratado (i, iii) B6 y (ii, iv) ratones G-CSF-/-. n > 6 articulaciones/grupo/experimento; representativo de 3 experimentos.
La Figura 6 muestra gráficas FACS representativas de poblaciones de leucocito que infiltran el tejido sinovial de B6 mBSA/solución salina, ratones tratados B6 mBSA/IL-1 y G-CSF-/- mBSA/IL-1 en los días 3 y 7. Se disecta el sinovio en A día 3 y B día 7 de más de 6 articulaciones/grupo, disociado en un cóctel de enzima y luego se tiñe para marcadores específicos. En A & B, se identifican leucocitos infiltrantes totales mediante teñido con CD45.2 (A,B; panel superior). Solo se utiliza la población CD45.2+ para análisis posterior. C el sinovial que se digiere de ratones tratados B6 mBSA/solución salina, B6 mBSA/IL-1 y G-CSF-/- mBSA/IL-1 también se adhiere durante la noche y las células no adheridas se tiñen para la expresión CD4. Los datos son representativos de 2 experimentos.
La Figura 7A y 7B son representaciones gráficas que muestran los efectos de eliminación de neutrófilo en artritis aguda en ratones WT B6 y G-CSF-/-. Los ratones se tratan antes de la inducción de artritis inducida por mBSA/IL-1- con un mAb eliminado y neutrófilos o isotipo de control. A. Análisis de sangre periférica en los días 0, 2 y 7 del modelo de artritis aguda en ratones tratados WT y GCSF-/- con mAb eliminado de neutrófilo o mAb de isotipo de control. B. Clasificaciones histológicas totales de ratones tratados WT y GCSF-/- con anti-mAb de neutrófilo o isotipo de control. n > 5 articulaciones por grupo * P < 0.05 comparado con niveles de neutrófilo de ratones mAB de isotipo de control WT. \dagger P < 0.05 comparado con WT isotipo de control y clasificaciones totales del grupo de control tratado con anti-mAb de neutrófilo.
La Figura 8 representaciones gráficas que muestran CIA deteriorado en ratones G-CSF-l- comparado con ratones B6. Los ratones se inyectan intra-dérmicamente en la base de la cola con CII en CFA y se refuerzan en el día 21. Los ratones se evalúan clínicamente para la enfermedad del día 21 siendo clasificada cada pata de 0 (normal) a tres (severo); clasificación máxima 12 (para detalles ver Ejemplo 8). A. ilustra la incidencia acumulativa de la enfermedad. B. La severidad clínica de CIA en ratones B6 y G-CSF-/-. Se agrupan los datos de 3 experimentos; n > 30 ratones por grupo. * P < 0.001 B6 comparado con G-CSF-/-.
La Figura 9 muestra los resultados de evaluación histológica de CIA en ratones B6 versus G- CSF-/-. Las articulaciones de cuatro de los ratones más severamente afectados clínicamente B6 y G- CSF-/- se clasifican de 0 a 3 para severidad de histopatología. A es una representación gráfica del porcentaje de articulaciones afectadas normal, suave, moderado y severamente. B muestra las secciones representativas H&E de i una articulación no artrítica B6, ii una articulación severamente inflamada B6 CIA y iii una articulación típica G-CSF-/- que no exhibe inflamación.
La Figura 10 son representaciones gráficas que muestran las respuestas de Célula T a CII in vitro en ratones B6 y G-CSF-/-. Se colocan en placas suspensiones inguinales LN y se estimulan con CII desnaturalizado. Las células se pulsan durante las últimas 8 h con [3H] TdR y retoma radioactiva medida por la evaluación de proliferación de Célula T. A. índice de estimulación proliferativa en células B6 y GCSF-/- LN. B. Los sobrenadantes tomados de cultivos se evalúan 64 h para los niveles de (i) IFN-\gamma y (ii) IL-2 por ELISA. n > 6 pozos/muestra.
La Figura 11A y B muestra anti-CII Abs en ratones inmunizados CIA B6 y G-CSF-/-. Se toma suero en A. día 30 y B. día 62 y se analiza por ELISA para anti-CII Abs - total IgG, IgM e isotipos IgG2b, IgG2c, IgG1 y IgG3. Se agrupan los datos de experimentos; n>30 muestras por grupo. * P < 0.05, \dagger P < 0.005.
La Figura 12 muestra la representación gráfica de niveles basales Ig y niveles de IgG no específico total en neófitos y B6 inmunizado con ratones CII/CFA y G-CSF-/-. A. Se desangran ratones neófitos B6 y G-CSF-/- (n=6 ratones/grupo) y se prueban en suero por ELISA para niveles de circulación total IgG, IgM e isotipos (IgG2b, IgG2c, IgG1, IgG3 y IgA). B. Día 62 se analiza el suero de B6 inmunizado con ratones CIA B6 y G-CSF-/- para IgG total no específico. Los ratones de 3 experimentos separados se incluyen; n > 16 ratones/grupo; * P < 0.05.
La Figura 13 muestra las respuestas Ab a antígenos dependientes deT e independientes de T en ratones G-CSF-/- comparado con ratones B6. Se exponen ratones B6 y G-CSF-/- con el Ag NP- KLH dependiente de T precipitado en alum o con el antígeno independiente TEP DNP-Dextrano en PBS y se desangran en los días específicos. El grupo NP-KLH se inocula en el día 42. Se analiza el suero por ELISA para la evaluación de A. Respuesta NP-KLH dependiente de T como se evalúa por los títulos de i NP2 (total) y iiNP20 (alta afinidad)- IgGI específico, iiiNP20 Ig2b y BT- independientes DNP-Dextrano anti-NP IgM. n > 4 ratones por grupo.
La Figura 14 muestra los efectos de neutralización G-CSF en el modelo de artritis aguda. Los ratones B6 se tratan con anti-G-CSF neutralizante (50 y 250 mg) o isotipo de control mAb en los días 0, 1, 2, 3 y 5. Las representaciones gráficas de A. conteos de neutrófilo de sangre periférica en los días 4 y 7 (n=5) B. Clasificación macroscópica clínica media por articulación (fuera de 4) (n=10) C. media de celularidad de tejido sinovial por articulación de ratón (n=3). D. Gráficas Dot que muestran neutrófilos infiltrantes (GR1hi CD11 bhi) y monocito/macrófagos (CD11bhi GR1lo). Los datos son representativos de un único experimento; * P < 0.01.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente invención se predice en parte en la elucidación adicional del papel de las citoquinas inflamatorias en el proceso inflamatorio. Más particularmente, el papel de G-CSF se postula por tener un efecto en las afecciones inflamatorias tal como inflamación inmunocomprometida crónica. De acuerdo con la presente invención, por lo tanto, se propone inhibir la actividad de la citoquina inflamatoria localmente o sistémicamente y/o descender la expresión de un gen que codifica una citoquina inflamatoria por ser útil en el tratamiento o profilaxis de artritis.
De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención contempla un uso de un agente que inhibe la actividad de G-CSF o G-CSFR y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica dicho G-CSF o G-CSFR, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de artritis en un sujeto.
La presente invención se dirige particularmente a G-CSF y sus homólogos y derivados. Con referencia a "GCSF" o su nombre completo "el factor que estimula la colonia de granulocito" incluye sus homólogos y derivados. Un "homólogo" o "derivado" incluye variantes polimórficas de G-CSF.
De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la presente invención proporciona un agente para el tratamiento y/o profilaxis de artritis en un sujeto, dicho agente es un agente que inhibe la actividad de G-CSF o G-CSFR y/o que reduce el nivel de expresión del gen que codifica G-CSF o G-CSFR.
Como se indicó anteriormente, con referencia a "G-CSF" incluye sus homólogos y derivados.
La administración del agente puede ser sistémica o local. La administración local es particularmente útil en el tratamiento de afecciones inflamatorias o localizadas tal como artritis. Sin embargo, como es probable que el G-CSF ejerza efectos en las células hematopoyéticas, la administración sistémica es útil en la modulación del sistema inmune en general. Con referencia a "sistémico" incluye administración intra-articular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea e intratecal así como también administración por vía de las rutas oral, rectal y nasal.
De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, la presente invención contempla un uso de un agente que inhibe la actividad de G-CSF o G-CSFR y/o que reduce el nivel de expresión del gen que codifica G-CSF o G-CSFR en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de artritis en un sujeto.
En una realización, la artritis es artritis inflamatoria, que incluye artritis reumatoide.
Los animales preferidos son mamíferos tal como humanos y otros primates, seres vivos (por ejemplo ovejas, vacas, caballos, burros, cerdos), animales para pruebas de laboratorio (por ejemplo conejos, ratones, hámsteres, conejillos de indias), animales de compañía (por ejemplo perros, gatos) y animales salvajes cautivos. Las especies aviares incluyen aves de corral (por ejemplo pollos, patos, gansos, pavos, gallinetas), aves de juegos (por ejemplo patos, emús, faisanes) y aves enjauladas. Los humanos son los animales más preferidos de los primates. Los caballos son particularmente preferidos entre los animales vivos.
En una realización preferida, por lo tanto, la presente invención proporciona un uso de un agente que inhibe la actividad de G-CSF o G-CSFR y/o que reduce el nivel de expresión del gen que codifica G-CSF o G-CSFR en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de artritis en un humano.
El agente puede ser proteináceo, no proteináceo (por ejemplo entidades químicas) o moléculas de ácido nucleico.
Las moléculas proteináceas y no proteináceas incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas, moléculas químicas pequeñas, grandes o intermedias así como también moléculas identificadas de la detección del producto natural o la detección de las colecciones químicas. La detección de producto natural incluye la detección de extractos o muestras de plantas, microorganismos, lechos de los ríos, coral, ambientes acuáticos y ambientes terrestres para moléculas o grupos de moléculas que tienen un efecto en la actividad G-CSF o el nivel de la expresión de gen G-CSF. Estas moléculas también pueden afectar la interacción G-CSF/GCSFR.
Un ejemplo de un agente está en el anticuerpo para G-CSF o G-CSFR o epítopos de los mismos. Este se puede utilizar sistémicamente o localmente.
Se prefiere particularmente el uso de anticuerpos monoclonales debido a la capacidad para producirlos en grandes cantidades y la homogeneidad del producto. La preparación de estirpes celulares de hibridoma para la producción de anticuerpo monoclonal se deriva al originar una estirpe celular inmortal y linfocitos sensibilizados contra la preparación inmunogénica que se puede hacer mediante técnicas que son bien conocidas por aquellos que son expertos en el arte. (Ver, por ejemplo, Douillard y Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, in Compendium of Immunology Vol. II, ed. by Schwartz, 1981; Kohler y Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; Kohler y Milstein, European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976).
Otro ejemplo de un agente útil es una forma soluble del G-CSFR que compete con la interacción de G-CSF con la membrana asociada G-CSFR.
Alternativamente, se pueden detectar agentes por su capacidad para unir a los materiales genéticos G-CSF o G-CSFR. En una realización, G-CSF- o G-CSFR- que codifica cADN o ADN genómico o mARN transcripto o la porción de los mismos tal como una etiqueta EST o SAGE se inmoviliza en un soporte sólido tal como una nanopartícula o microesfera. Los agentes potenciales luego se ponen en contacto con las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas y la unión detectada por el cambio en la radiación, emisiones, excitación de átomo, masa y/o densidad.
Una vez identificado, el agente se eluye de la molécula de ácido nucleico y se caracteriza en más detalle. Por ejemplo, los agentes que se unen al material genético G-CSF/G-CSFR pueden inhibir la expresión (transcripción y/o traducción).
La presente invención se contempla adicionalmente utilizando análogos químicos de G-CSF o G-CSFR como antagonistas de G-CSF o sus receptores. Como se indicó anteriormente, también se pueden emplear receptores solubles G-CSF.
Los análogos químicos contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados para la síntesis de proteína, péptido o polipéptido y el uso de reticuladores y otros métodos que imponen exigencias conformacionales en la molécula proteinácea o sus análogos.
Ejemplos de modificaciones de cadena lateral contemplados por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tal como mediante alquilación reductiva por la reacción con un aldehido luego de la reacción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato; la acilación con anhídrido acético; la carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido por reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de residuos arginina se puede modificar mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tal como 2,3-butanediona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo se puede modificar mediante la activación de carbodiimida por vía de la formación de O-acilisourea seguido por derivación posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.
Los grupos sulfihidrilo se pueden modificar mediante métodos tal como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; la formación de una mezcla de disulfuros con otros compuestos tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; la formación de derivados mercuriales utilizando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; la carbamoilación con cianato en pH alcalino.
Los residuos triptofan se pueden modificar mediante, por ejemplo, oxidación con N- bromosuccinimida o alquilación del anillo indol con bromuro 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros sulfenilo. Los residuos Tirosina por otra parte, se pueden alterar mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo imidazol de un residuo histidina se puede llevar a cabo mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.
Ejemplos para incorporar aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis del péptido incluyen, pero no se limitan a, uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3- hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, ácido t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, ácido 2-tienil alanina y/o isómeros D de aminoácidos. Una lista de aminoácidos no naturales contemplados aquí se muestra en la Tabla 2.
TABLA 2
3
4
5
Se pueden utilizar reticuladores, por ejemplo, para estabilizar las conformaciones 3D, utilizando reticuladores homo-bifuncionales tal como los ésteres imido bifuncionales de grupos espaciadores (CH_{2})_{n} con n=1 a n=6, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida y reactivos hetero-bifuncionales que contienen usualmente un grupo funcional reactivo amino tal como N-hidroxisuccinimida y otro grupo funcional reactivo específico tal como maleimido o grupo funcional ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Adicionalmente, los péptidos se pueden restringir conformacionalmente mediante, por ejemplo, la incorporación de C\alpha y N\alpha-metilaminoácidos, la introducción de enlaces dobles entre los átomos C\alpha y C\beta de aminoácidos y la formación de péptidos cíclicos o análogos al introducir enlaces covalentes tal como formar un enlace amida entre el terminal N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el terminal N o C.
Las moléculas de ácido nucleico tal como ARN o ADN son particularmente útiles para inducir el silenciamiento génico mediante mecanismos mediados por anticodificantes. El gen mediado codificante también se refiere como co-supresión e involucra un rango de mecanismos que incluyen la inducción de ARNi.
Los términos "ácido nucleicos", "nucleótido" y "polinucleótido" incluyen ARN, cADN, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mezclados, cepas codificantes y anticodificantes, y se pueden modificar químicamente o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótido derivadas o no naturales, como se apreciará fácilmente por aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, substitución de uno o más de los nucleótidos de ocurrencia natural con un análogo (tal como el anillo morfolino), modificaciones internucleótido tal como ligados no cargados (por ejemplo fosfonatos metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), ligados cargado (por ejemplo fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), grupos funcionales pendientes (por ejemplo polipéptidos), intercaladores (por ejemplo acridina, psoralen, etc.), queladores, alquiladores y ligados modificados (por ejemplo ácidos \alpha-anomérico nucleicos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas de polinucleótidos imitadores por su capacidad de unir una secuencia diseñada por vía de la unión de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que las adhesiones de péptido se sustituyen por adhesiones con fosfato en la estructura de la molécula.
Las secuencias de polinucleótido anticodificantes, por ejemplo, son útiles en silenciar transcriptos de la secuencia genética G-CSF o la secuencia genética G-CSFR. Adicionalmente, los vectores de polinucleótido que contienen todo o una porción del locus del gen GCSF se pueden colocar bajo el control de un promotor en la orientación codificante o anticodificante y se introducen en una célula. La expresión de tal una construcción codificante o anticodificante dentro de una célula interfiere con la transcripción y/o traducción objetivo. Adicionalmente, se puede emplear la co- supresión (es decir utilizando supresión codificante) y mecanismos para inducir ARNi o siARN. Alternativamente, las moléculas codificante y anticodificante se pueden administrar directamente. En esta última realización, las moléculas codificante y anticodificante se pueden formular en una composición y luego se administran mediante cualquier número de medios a la célula objetivo.
Una variación en las moléculas codificantes y anticodificantes involucra el uso de morfolinos, que son oligonucleótidos compuestos de derivados de nucleótido morfolino y enlaces fosforodiamidato (por ejemplo, Summerton y Weller, Antisense and Nucleic acid Drug Development 7: 187-195, 1997). Tales compuestos se inyectan en embriones no humanos y se observa el efecto de interferencia con mARN.
En una realización, la presente invención emplea compuestos tal como oligonucleótidos y especies similares para uso en modular la función o efecto de las moléculas de ácido nucleico que codifican G-CSF o G-CSFR, es decir los oligonucleótidos inducen silenciamiento del gen transcripcional o post-transcripcional. Esto se lleva a cabo al proporcionar oligonucleótidos que hibridan específicamente con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el G-CSF o G-CSFR. Se pueden proporcionar oligonucleótidos directamente a una célula o se generan dentro de la célula. Como se utiliza aquí, los términos " ácido nucleico objetivo" y "molécula de ácido nucleico que codifica G-CSF o G-CSFR" se han utilizado por conveniencia para abarcar el ADN, ARN codificado (que incluye pre-mARN y mARN o porciones de los mismos) transcritos de tal ADN, y también cADN derivado de tal ARN. La hibridación de un compuesto de la invención objeto con su ácido nucleico objetivo se refiere generalmente a "anticodificante". De manera consecuente, el mecanismo preferido considerado a ser incluido en la práctica de algunas realizaciones preferidas de la invención se refiere aquí como "inhibición anticodificante." Tal inhibición anticodificante se basa típicamente en la hibridación con base en la unión de hidrógeno de cepas de oligonucleótido o segmentos de tal manera que por lo menos una cepa o segmento se divide, se degrada, o de otra forma se presenta inoperable. A este respecto, se prefiere actualmente las moléculas de ácido nucleico específicas objetivo y sus funciones para tal inhibición anticodificante.
Las funciones de ADN que interfieren pueden incluir replicación y transcripción. La replicación y transcripción, por ejemplo, puede ser de una plantilla celular endógena, un vector, una construcción de plásmido u otro. Las funciones del ARN que interfieren incluyen funciones tal como translocación del ARN en un sitio de traducción de proteína, translocación del ARN a los sitios dentro de la célula que están distantes del sitio de la síntesis de ARN, traducción de la proteína del ARN, corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARN, y actividad catalítica o formación de complejo que involucra el ARN que se pueden enganchar en o facilitar por el ARN.
En el contexto de esta invención, "hibridación" significa la vinculación de cepas complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, el mecanismo preferido de vinculación involucra la unión de hidrógeno, que puede ser unión de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa, entre bases nucleósido o nucleótido complementarias (nucleobases) de las cepas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y timina son nucleobases complementarias que se pueden vincular a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede ocurrir bajo circunstancias que varía.
Un compuesto anticodificante es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto al ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico objetivo para originar una pérdida de actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto anticodificante a las secuencias ácido nucleico no objetivo bajo condiciones en las que se desea la unión específica.
"Complementario" como se utiliza aquí, se refiere a la capacidad para vinculación precisa entre dos nucleobases de un compuesto oligomético. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico), es capaz de unir el hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, dicho ácido nucleico objetivo es una molécula de ADN, ARN, o oligonucleótido, luego la posición de la unión de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo se considera por ser una posición complementaria. El oligonucleótido y la molécula de ADN, ARN, o oligonucleótido adicional son complementarios el uno al otro cuando se ocupa un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula mediante nucleobases que pueden unir a hidrógeno uno con el otro. Así, "específicamente hibridable" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de vinculación precisa o complementariedad sobre un número suficiente de nucleobases de tal manera que ocurre la unión específica y estable entre el oligonucleótido y un ácido nucleico objetivo.
De acuerdo con la presente invención, los compuestos incluyen compuestos oligoméricos anticodificantes, oligonucleótidos anticodificantes, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externos (EGS), cortadores alternos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligoméricos que hibridan a por lo menos una porción del ácido nucleico objetivo. Como tal, estos compuestos se pueden introducir en la forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de hélice y pueden contener elementos estructurales tal como protuberancias o hélices terminales o internas. Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la invención pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la modificación del ácido nucleico objetivo. Un ejemplo no limitante de tal una enzima es ARNsa H, una endonucleasa celular que divide la cepa de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se conoce en la técnica que los compuestos anticodificante monocatenarios que son "como ADN " provocan la ARNsa H. La activación de ARNsA H, por lo tanto, resulta en la división del ARN objetivo, por lo que se mejora grandemente la eficiencia de la expresión de inhibición de gen mediada por oligonucleótido. Papeles similares se han postulado para otras ribonucleasas tal como aquellas en la familia ARNsa III y ribonucleasa L de enzimas.
Aunque la forma preferida de compuesto anticodificante es un oligonucleótido anticodificante monocatenario, en muchas especies de introducción las estructuras bicatenarias, tal como moléculas de ARN bicatenario (dsARN), se han mostrado por inducir reducción mediada anticodificante potente y específica de la función de un gen o sus productos de gen asociados.
En el contexto del objeto de la invención, el término "compuesto oligomérico" se refiere a un polímero u oligómero que comprende una pluralidad de unidades monoméricas. En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o imitadores, quimeras, análogos y homólogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases de ocurrencia natural, azúcares y ligados covalentes internuclósido (estructura) así como también oligonucleótidos que tiene porciones de ocurrencia no natural que funcionan de forma similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos se prefieren frecuentemente sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables tal como, por ejemplo, retoma celular mejorada, afinidad mejorada para un ácido nucleico objetivo y estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas.
Aunque los oligonucleótidos son una forma preferida de los compuestos de esta invención, la presente invención comprende otras familias de compuestos así como también, que incluye pero no se limita a análogos de oligonucleótido e imitadores tal como aquellos descritos aquí.
El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante" que se conoce en la técnica se refiere a la región entre el codón de inicio de traducción y la región de finalización de traducción, es una región que se puede objetivar efectivamente. Dentro del contexto de la presente invención, una región es la región intragénica que abarca el codón de inicio y finalización de traducción del marco de lectura abierta (ORF) de un gen.
Otras regiones efectivas incluyen la región 5' no traducida (5'UTR), conocida a la técnica para referirse a la porción de un mARN en la dirección 5' del codón de inicio de traducción, y así que incluye nucleótidos entre el sitio de casquete 5' y el codón de inicio de traducción de un mARN (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región 3' no traducida (3'UTR), conocido en la técnica para referirse a la porción de un mARN en la dirección 3' del codón de finalización de traducción, y así incluye nucleótidos entre el codón de finalización de traducción y el extremo 3'de un mARN(o nucleótidos correspondientes del gene). El sitio de casquete 5' de un mARN comprende un residuo guanosina metilado N7 unido al mayor residuo 5 del mARN por vía de un ligado de 5'-5' trifosfato. La región de casquete 5' de un mARN se considera que incluye la estructura de casquete 5' en sí misma así como también los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio del casquete. También se prefiere la región de casquete 5' objetivo.
Aunque algunos transcriptos eucarióticos de mARN se trasladan directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se cortan de un transcripto antes de que este se traslade. Las regiones restantes (y, por lo tanto, traducidas) se conocen como "exones" y cortan y empalman para formar una secuencia de mARN continua. Los sitios de corte y empalme objetivo, es decir uniones de intrón-exón o uniones de exón-intrón, también pueden ser particularmente útiles en situaciones donde está implicado el corte y empalme aberrante en la enfermedad, o cuando una sobreproducción de un producto particular de corte y empalme está implicada en la enfermedad. Las uniones de fusión aberrante debidas a las redisposiciones o eliminaciones también son sitios objetivo preferidos. Los transcriptos mARN producidos por vía del proceso de corte y emplame de dos (o más) mARN de diferentes fuentes de gen se conocen como "transcriptos de fusión". También se conoce que los intrones se pueden objetivar efectivamente utilizando compuestos anticodificantes objetivados en, por ejemplo, ADN o pre-mARN.
Como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de azúcar y base. La porción base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al grupo funcional hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. En oligonucleótidos formados, los grupos fosfato se unen covalentemente adyacentes los nucleósidos uno al otro para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de su compuesto polimérico lineal se pueden unir adicionalmente para formar un compuesto circular, sin embargo, se prefieren generalmente los compuestos lineales. Adicionalmente, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de nucleobase interna y pueden, por lo tanto, plegar en una forma para producir compuesto parcialmente o completamente bicatenario. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se refieren comúnmente como formación de estructura internucleósido del oligonucleótido. El ligado normal o la estructura de ARN y ADN es un ligado fosfodiéster 3' a 5'.
Para el suministro tópico de compuestos anticodificantes, estos oligonucleótidos pueden contener estructuras modificadas o ligados internucleósido no naturales. Como se define en esta especificación, los oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo fosforoso en la estructura y aquellos que no tienen un átomo fosforoso en la estructura. Para los propósitos de esta especificación, y como se referencia algunas veces en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura de internucleósido también se pueden considerar por ser oligonucleósidos.
Las estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas que contienen un átomo fosforoso allí incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros fosfonatos alquilo que incluye fosfonatos 3'-alquileno, fosfonatos 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluye 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen ligados normales 3'-5, análogos ligados 2'-5' de estos, y aquellos que tiene polaridad invertida en donde uno o más ligados de internucleótido es un ligado 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un ligado único 3' a 3' en el ligado de nucleótido mayor 3' es decir un residuo de nucleósido invertido único que puede ser abásico (la nucleobase se pierde o tiene un grupo hidroxilo en lugar de este). También se incluyen varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libre.
En una realización alternativa, las construcciones genéticas que incluyen ADN "vacunas" se utilizan para generar las moléculas codificante y anticodificante de células de mamífero. Adicionalmente, muchas de las características preferidas descritas anteriormente sin apropiadas para las moléculas de ácido nucleico codificantes.
Agentes identificados de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en las composiciones farmacéuticas.
Fácilmente concebible por un experto en la técnica en claridad de la descripción anterior será una composición que comprende un modulador de la actividad G-CSF o la interacción entre G-CSF y G-CSFR o un modulador de la expresión de G-CSF/GCSFR, dicho compuesto comprende adicionalmente uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Las formas de composición adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (en donde son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles. Esto puede ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y se puede preservar contra la acción contaminante del microorganismo tal como bacteria y hongo. El portador puede ser un medio disolvente o de dilución que comprende, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Se mantiene la fluidez propia, por ejemplo, mediante el uso de tensoactivos. Las prevenciones de la acción del microorganismo se pueden llevar cerca mediante varios agentes anti-bacterianos y anti-fúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar cerca mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con el ingrediente activo y opcionalmente otro ingrediente activo como se requiera, seguido por esterilización filtrada u otro medio apropiado de esterilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos adecuados de preparación incluyen técnica de secado por vacío y secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicionalmente desea-
do.
Cuando el modulador se protege de manera adecuada, este se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestibleasimilable, o este se puede encerrar en cápsulas de gelatina dura o blanda, o se puede comprimir en comprimidos, o este se puede incorporar directamente con el alimento de la dieta o se administra por vía de leche de mama. Para la administración terapéutica oral, el ingrediente activo se puede incorporar con excipientes y se utiliza en la forma de comprimidos injeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, wafers y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 1% en peso del modulador. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad del modulador en tales composiciones terapéuticamente útiles es de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan ya que una forma de dosificación unitaria oral contiene entre aproximadamente 0.1 mg y 200 mg del modulador. Las cantidades de dosificación alternativas incluyen de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg y de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg. Estas dosificaciones pueden ser por individuo o por kg de peso corporal. La administración puede ser por hora, día, semana, mes o año.
Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas, cremas y similares también pueden contener los componentes como se lista adelante. Un aglutinante tal como goma, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tal como difosfato de calcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente endulzante tal como sacarosa, lactosa o sacarina se puede agregar o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria o sabor a cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, esta puede contener, adicionalmente materiales del tipo anterior, un portador líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o de otra forma para modificar la forma física de la dosificación unitaria. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas se pueden recubrir con shellac, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente endulzante, metilo y propilparabenos como conservantes, un tinte y saborizante tal como sabor a cereza o naranja. Por su puesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Adicionalmente, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.
Los portadores farmacéuticamente aceptables y/o diluyentes incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica y salvo en la medida como cualquier medio convencional o agente es incompatible con el modulador, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.
Aunque la administración puede ser por cualquier medio, se prefiere particularmente la administración intra-articular o subcutánea para el tratamiento de artritis.
Un experto en la técnica puede en claridad de lo anterior prever que tal una composición puede también comprender moléculas genéticas tal como un vector capaz de transfectar la célula objetivo cuando el vector lleva una molécula de ácido nucleico capaz de codificar un modulador, cuando el modulador es una molécula proteinácea. El vector puede, por ejemplo, ser un vector vírico. A este respecto, uno puede concebir un rango de terapias de gen que incluyen aislar ciertas células, manipular genéticamente y regresar la célula al mismo sujeto o sujeto similar o relacionado genéticamente.
La presente invención proporciona adicionalmente un método no terapéutico in vivo que utiliza un modelo de animal no humano para detectar agentes capaces de inhibir la actividad de G- CSF y/o inhibir la interacción de G-CSF con G-CSFR, dicho método comprende administrar un agente inhibidor putativo a un animal no humano genéticamente modificado que se ha modificado para producir bajos niveles de G-CSF o G-CSFR con relación a un animal no modificado genéticamente de la misma especie, en donde dicho agente se identifica por tener interactividad con G-CSF o G-CSFR mediante el agente que tiene un efecto fisiológico detectable en un animal tipo intacto de la misma especie, pero un efecto reducido en un animal que exhibe expresión reducida de G-CSF y/o G-CSFR. Adicionalmente, en animales con niveles reducidos de G-CSF, otras citoquinas o moléculas endógenas pueden emerger para compensar la ausencia de G-CSF. Esto luego llega a objetivar las moléculas terapéuticas adicionales.
Para uso en este aspecto, se puede construir un animal modificado genéticamente en donde dicho animal produce cantidades bajas de G-CSF o G-CSFR. El animal no humano modificado genéticamente puede ser un ratón, rata, conejillo de indias, conejo, cerdo, oveja o cabra.
En conexión con tal un animal no humano modificado genéticamente, un experto en la técnica puede en claridad de la descripción anterior prever un vector objetivo útil para inactivar un gen que codifica G-CSF o G-CSFR, dicho vector objetivo comprende dos segmentos de material genético que codifica dicho G-CSF o G-CSFR que flanquea un marcador seleccionable positivo en donde dicho vector efectivo se puede transfectar en células madre embriónicas no humanas (ES) y el marcador se selecciona para generar una célula ES no humana en la que el gene que codifica dicho G-CSF o G- CSFR se inactiva mediante recombinación homóloga.
Tales células ES no humanas pueden ser de ratones, ratas, conejillos de indias, cerdos, ovejas o cabras.
Tal un vector objetivo se puede utilizar en la fabricación de un animal no humano modificado genéticamente sustancialmente incapaz de producir G-CSF o G-CSFR.
El vector puede ser ADN. Un marcador seleccionable en el vector objetivo permitiría la selección de células objetivo que se han incorporado establemente al ADN objetivo. Esto es especialmente útil cuando se emplean técnicas de transformación relativamente bajas en eficiencia tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio y fusión de liposoma en donde típicamente menos de 1 en 1000 células ha incorporado establemente el ADN exógeno. Utilizando métodos altamente eficientes, tal como microinyección en el núcleo, típicamente de 5-25% de las células se incorporará al ADN objetivo; y esto es, por lo tanto, factible para detectar las células objetivo directamente sin la necesidad de seleccionar primero la integración estable de un marcador seleccionable. Se puede emplear ADN isogénico o no isogénico.
Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los compuestos tal como antibióticos, genes que confieren la necesidad de hacer crecer sustratos seleccionados, genes que codifican proteínas que producen señales detectables tal como luminiscencia. Una amplia variedad de tales marcadores se conocen y están disponibles, que incluye, por ejemplo, genes resistentes a antibiótico genes tal como gen resistente a la neomicina (neo) y el gen resistente a la higromicina (hyg). Marcadores seleccionables también incluyen genes que confieren la capacidad de hacer crecer en cierto medio sustratos tal como el gen tk (quinasa timidina) o el gen hprt (fosforibosiltransferasa hipoxantina) que confiere la capacidad de hacer crecer en medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina); y el gen bacteriano gpt (guanina/xantina fosforibosiltransferasa) que permite crecer en medio MAX (ácido micofenólico, adenina y xantina). Otros marcadores seleccionables para uso en células de mamífero y plásmidos que llevan una variedad de marcadores seleccionables como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York, USA, 1990.
La ubicación preferida del gen marcador en la construcción objetivo dependería de la ayuda del gen objetivo. Por ejemplo, si la ayuda es la interrupción de la expresión del gen objetivo, luego el marcador seleccionable se puede clonar en ADN objetivo que corresponde a la secuencia codificante en el ADN objetivo. Alternativamente, si la ayuda es expresar un producto alterado del gen objetivo, tal como una proteína con una sustitución de aminoácido, entonces la secuencia codificante se puede modificar para codificar la sustitución, y el marcador seleccionable se puede poner fuera de la región codificante, por ejemplo, en un intrón cercano.
El marcador seleccionable puede depender de su propio promotor para expresión y el gen marcador se puede derivar de un organismo muy diferente al organismo que es objetivo (por ejemplo genes marcadores procarióticos utilizados en células de mamífero objetivo). Sin embargo, sería preferible reemplazar el promotor original con maquinaria transcripcional conocida por funcionar en la receptora. Un gran número de regiones de inicio transcripcional están disponibles para todos los propósitos que incluyen, por ejemplo, promotores metalotioneina, promotores quinasa timidina, promotores \beta-actina, promotores inmunoglobulina, promotores SV40 y citomegalovirus humanos. Un ejemplo ampliamente utilizado es el neoplásmido pSV2 que tiene gen fosfotransferasa neomicina bajo el control del promotor temprano SV40 y confiere en las células de mamífero resistencia a G418 (un antibiótico relacionado a la neomicina). Un número de otras variaciones se puede emplear para mejorar la expresión de los marcadores seleccionables en células de animal, tal como la adición de una secuencia poli (A) y la adición de las secuencias de inicio de traducción sintéticas. Se pueden utilizar promotores constitutivos e inducibles.
El ADN se puede modificar mediante recombinación homóloga. El ADN objetivo puede estar en cualquier organelo de la célula de animal que incluye el núcleo y la mitocondria y puede ser un gen intacto, un exón o intrón, una secuencia reguladora o cualquier región entre genes.
El ADN homólogo es una secuencia de a ADN que es por lo menos 70% idéntica con una secuencia de ADN de referencia. Una indicación que dos secuencias son homólogas es que ellas hibridarán con una con la otra bajo condiciones exigentes (Sambrook et al., 1990, supra).
La presente invención contempla adicionalmente la co-supresión (es decir, supresión codificante) y supresión anticodificante para subregular la expresión de G-CSF o G-CSFR en el contexto del uso de un agente mencionado anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de artritis, o para el tratamiento o profilaxis de artritis. Esto también puede ocurrir en un animal no humano objetivo tal como para generar un modelo de enfermedad, en cuyo caso los animales no humanos genéticamente modificados también pueden producir grandes cantidades de G-CSF o G-CSFR. Por ejemplo, la sobreexpresión de G-CSF o G-CSFR normal puede producir efectos negativos dominantes y puede llegar a ser útil en modelos de enfermedad.
De acuerdo con lo anterior, un experto en la técnica puede contemplar un animal no humano genéticamente modificado que sobreexpresa una secuencia genética que codifica G-CSF o G-CSFR.
Un animal no humano genéticamente modificado incluye un animal transgénico, o un animal "knock-out" o "knock-in".
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos no limitantes. Se obtienen ratones C57BL/6 (B6; tipo natural, [WT]) de Suministros animales del Walter and Eliza Hall Institute (WEHI) (Victoria, Australia). Se obtienen ratones deficientes de G-CSF (G- CSF-/-) del Ludwig Institute for Cancer Research, Victoria, Australia y se producen mediante interrupción objetivo del gen Cysf3 en células madre embriónicas 129/OLA (ES), que se inyectan en blastocitos B6 (Lieschke et al., Blood 84: 1737-1746, 1994). Los ratones se cruzaron nuevamente más de veinte generaciones en el B6 antecedente. Todos los ratones tienen \geq 8 semanas de edad al momento del experimento, se alimentan con concentrado para roedor estándar y agua ad libitum y se alojan (\leq 6 ratones/jaulas) en jaulas recubiertas con serrín. Se aprueban todos los procedimientos de animal por el Comité de Ética Institucional.
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Ejemplo 2 Inducción de artritis inducida por mBSA/IL-1 (artritis aguda)
El procedimiento se basa en lo descrito previamente (Lawlor et al., Arthritis and Rheumatism 44: 442-450, 2001). Se anestesian ratones y se inyectan intra-articularmente en la articulación de la rodilla con 10 ml de 20 mg/ml mBSA (Sigma, St Louis, MO). Las articulaciones de control reciben el mismo volumen de vehículo (solución salina normal). Los ratones luego se inyectan subcutáneamente (s.c.) en la almohadilla de la pata trasera con 20 ml de 12.5 mg/ml IL-1\beta humano recombinante (Actividad Específica 5 x 10^{8} U/mg; Amgen, Thousand Oaks, CA) en solución salina normal/0.5% (v/v) suero normal de ratón (vehículo) y la inyección se repite en los siguientes 2 días.
Se sacrifican los ratones en el día 7 (o en puntos de tiempo indicados), se cortan las articulaciones de la rodilla y se fijan en 10% (v/v) de formalina amortiguada neutra durante por lo menos 2 días, se descalcifican y se procesan con parafina. Se cortan las secciones de tejido frontales (4 mm) en 4 profundidades aproximadamente 100 mm aparte y se tiñen con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la patología de la articulación.
Se desarrolla evaluación de artritis cegada a los grupos experimentales. Se evalúan en cinco componentes de artritis, es decir exudado de espacio de articulación, sinovitis, formación de pannus, degradación ósea y de cartílago. Estos se gradúan para severidad de 0 (normal) a 5 (severo). Con base en las clasificaciones histológicas, se clasifican las articulaciones como lo demuestra la artritis inflamatoria si existe una clasificación de exudad de 1 o más y clasificación de sinovitis de 2 o más. Se clasifica la artritis destructiva como una clasificación de 2 o más para pannus y 1 o para degradación ósea y/o de cartílago. También se calcula la clasificación de severidad histológica media general, con una clasificación posible máxima por articulación de of25 (Lawlor et al., 2001, supra). Se preparan secciones teñidas con Safranina O y se evalúan en forma cegada para la pérdida de proteoglicano de cartílago.
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Ejemplo 3 Inducción de artritis inducida por colágeno (CIA)
Se emulsifica colágenode pollo tipo II (CII; Sigma) disuelto en 10 mM de ácido acético durante la noche a 4ºC en una concentración de 2 mg/ml, en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA), preparado a 5 mg/ml al agregar tuberculosis Micobacterium muerta por calor (cepa H37 Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) al adyuvante incompleto de Freund (Difco). Los ratones se inyectan intra-dérmicamente (i.d.) en varios sitios en la base de la cola con 100 ml de la emulsión y esto se repite 21 días después.
Los animales se monitorean para eritema e hinchamiento de los miembros y una clasificación clínica dada a cada ratón 3 veces a la semana durante hasta 40 días. El sistema de clasificación es como se describió previamente (Campbell et al., European Journal of Immunology 30: 1568-1575), donde 0 = normal, 1 = ligera hinchazón, 2 = hinchazón extensa y 3 = distorsión de la articulación y/o rigidez y la clasificación máxima por ratón es 12. Se completan las evaluaciones clínicas mediante dos investigaciones independientes cegadas a los grupos experimentales. En el sacrificio, se remueven las patas, se fijan, se descalcifican y se procesan por parafina embebida como se describió anteriormente. Se evalúan las secciones teñidas con H&E (5 mm) de las patas delantera y trasera de cuatro ratones con las clasificaciones clínicas más altas como se describió previamente (Campbell et al., 2000, supra). En el día 30 y el día del sacrificio (día 62), se toma sangre para la determinación de suero anti-CII Ab.
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Ejemplo 4 Administración de G-CSF G-CSF y IL-1 Intra-articular
Los ratones reciben diariamente inyección i.a. de 10 ml de IL-1 (25 ng) o G-CSF humano recombinante (rHuG-CSF; 0.1, 0.5, 1 y 1.5 mg) o vehículo (solución salina; normal solución salina/0.5% (v/v) suero normal de ratón (vehículo) en los días 0, 1 y 2. Los ratones se sacrifican en el día 3 y las articulaciones se evalúan histológicamente en secciones teñidas con H&E.
G-CSF subcutáneo en vista de IL-1\beta en artritis aguda
Los ratones se inyectan i.a. con mBSA y se tratan s.c. en la almohadilla de la pata en los días 0-2 con IL-1 (250 ng) o rHuGCSF [filgrastima] (15 mg) o vehículo de control. Los ratones se sacrifican en el día 7 como se describió anteriormente.
Eliminación de neutrófilos en ratones WT y G-CSF-/-
Se tratan ratones WT (B6) y G-CSF-/- intra-peritonealmente 2 días antes de inducción de la enfermedad y en los días 0 a 2 con 0.6 mg anticuerpo monoclonal eliminado de neutrófilo (mAb), RB6.8C5 o isotipo de control mAb GL121. Los ratones luego se tratan diariamente en los días 3 a 6 con 0.5 mg de mAb. La sangre periférica se analiza por conteos de neutrófilo en los días 0, 2 y 7 mediante análisis de conteo celular diferencial.
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Ejemplo 6 Ensayo de proliferación de célula T
Se cosechan ganglios linfáticos inguinales (LN) de ratones (n > 5 ratones/experimento) inmunizados para CIA, 52-62 días después de la inyección primaria. Se preparan suspensiones celulares únicas en RPMI que contiene 2-mercaptoetanol (50 mM) y 5% (vol/vol) suero bovino fetal (FCS). Se colocan en placas células LN (2 x 10^{5} células) en 200 ml en una placa de 96 pozos de fondo redondo (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, New Jersey, USA) y se estimulan con 0-100 mg/ml de CII desnaturalizado (hervido en 10 minutos). Se incuban células durante 72 horas a 37ºC (5% CO_{2}), los sobrenadantes se toman en 20 y 48 horas, y se pulsan para las 8 h finales con 1 mCi [^{3}H] timidina. Se cosechan células con un Cosechador Celular Inotech (Inotech) y la incorporación de [^{3}H] timidina se mide como una medición de proliferación de Célula T utilizando un contador de centelleo de microplaca (Canberra Packard, Victoria, Australia). Se toman alícuotas de los sobrenadantes celulares a 20 y 48 horas.
Análisis de citometría de flujo de leucocitos infiltrantes
Se cortan tejidos blandos adheridos y rítula de ratones B6 tratados con mBSA/solución salina y ratones B6 y G-CSF-/- tratados con mBSA/IL-1- en los días 3 y 7. Se descargan los fragmentos de músculo, grasa y hueso, el sinovio se picó en piezas de 2-mm y se digieren en una suspensión celular única utilizando 2.4 mg/ml dispasa II (Boehringer, Mannheim, Alemania), 1 mg/ml de colagenasa tipo II (Sigma), y 100 mg/ml ADNsa I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) en RPMI 1640. La suspensión se agita gentilmente a 37ºC durante 45 min y luego se lava a través de un teñido celular de 70 mM nylon r (Falcon) con 10% [v/v] FCS en RPMI. Se desarrollan conteos celulares antes del teñido de la célula. Se bloquea el teñido no específico utilizando Fc\gammaRIIb/III antiratón de rata (CD16/CD32; clon 2.4G2; American Tipo Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, USA). Se tiñen los leucocitos utilizando CD45.2 antiratón de rata biotinilado (PharMingen, San Diego, California, USA) y estreptavidina tricolor fluorocromo (SA-TRI) (Caltag) y combinaciones de Ab listado adelante en el Ejemplo 12. Las células digeridas sinoviales también se adhieren durante la noche a 37ºC, 5% de CO_{2} para recuperar la expresión de los marcadores tal como CD4 que se dividen mediante dispasa. Se recolectan células no adheridas en 2% v/v FCS en PBS y se tiñen para clasificación de la célula activada por fluorescencia (FACS).
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Ejemplo 7 Ensayos de citoquina y cuantificación morfológica de leucocito
Se miden IFN-\gamma, IL-4 y IL-2 en sobrenadantes de Célula T mediante captura ELISA utilizando anticuerpos monoclonales vinculados, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmingen).
Cuantificación morfológica de leucocito exudado de articulación
Se analizan secciones de articulación teñidas con H&E (n = 2 profundidad de de sección por articulación) para la composición exudada al cuantificar leucocitos polimorfonucleares, monocito/macrófagos y linfocitos en áreas de 5 rejillas de exudado de espacio de articulación focal en alta magnificación (1000x).
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Ejemplo 8 Determinación de suero de anticuerpos anti-CII (Ab)
Se desarrollan ELISA para detectar Abs a CII como se describió previamente (Campbell et al., 2000, supra). Se utilizan antisuero de IgG antiratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Sigma Chemical Co.), IgG2b, IgG2c, IgG1, IgG3 o IgM (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA) como detección de Abs. Se construyen curvas estándar de suero agrupado de ratones DBA/1 hiperinmunizados utilizando unidades arbitrarias.
Determinación de los niveles Ig de suero
El suero Abs de sangre del seno orbital de neófitos y ratones inmunizados CII/CFA se capturan con Abs relevante para IgG, IgM, IgG2c, IgG2b, IgG1, IgG3 y IgA total y se detectan utilizando Abs conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA).
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Ejemplo 9 Conteos de leucocito de sangre periférica
La sangre periférica se obtiene de ratones mediante venisección de plexo retro-orbital en los días 0, 3 y 7 del modelo de artritis aguda, y se recolecta en tubos recubiertos con EDTA. El BM se lava de un fémur por ratón en 3% [v/v] suero de becerro fetal (FCS)/solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Se desarrollan conteos de leucocito total y análisis diferencia utilizando un Sistema de Hematología Advia 120 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York, USA). También se hacen conteos manuales BM en citospinas (1x10^{5} células centrifugadas en un portaobjetos para microscopio a 1200 rpm durante 7 min).
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Ejemplo 10 Inflamación de la articulación desarrollada en respuesta a administración intra-articular directa de G-CSF
Primero se investiga si el factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF) tiene propiedades pro-inflamatorias en las articulaciones mediante inyección intra-articular de rHuG-CSF (0.1, 0.5, & 1 mg) en la articulación de la rodilla de ratones tipo intacto (WT) C57BL/6 durante tres días consecutivos. Los controles incluyen inyección intra-articular de IL-1 (IL-1; 25 ng) y vehículo (0.5% [v/v] suero normal de ratón en solución salina normal). En el día 3 las articulaciones se toman para evaluación histológica. Se encuentra que la inflamación inducida por G-CSF es una forma dependiente de dosis (Figura 1), aunque la respuesta es menos significativa que la inducida con IL-1. Este resultado muestra que el G-CSF exógeno tiene efectos pro-inflamatorios dentro de la articulación normal.
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Ejemplo 11 Ratones deficientes de G-CSF desarrollan menos inflamación de la articulación inducida por IL-1
Para investigar el involucramiento de G-CSF en modular los efectos inflamatorios locales inducidos por IL-1, ratones deficientes en G-CSF (G-CSF-/-) y ratones B6 se inyectan i.a. con IL-1. La inflamación de la articulación inducida IL-1 en ratones G-CSF-/-, pero en un nivel reducido comparado con ratones B6 normales (Figura 2A), que demuestra que G-CSF es un mediador en la dirección 3' de IL-1 en el compartimiento de la articulación. A pesar de esta reducción en características inflamatorias en ratones G-CSF-/-, no existe diferencia en pérdida de proteoglicano de cartílago articular (Figura 2B), lo que sugiere que el IL-1 puede dañar directamente el cartílago.
Sangre periférica, BM y análisis infiltrado sinovial
Para examinar los efectos de deficiencia de G-CSF en la respuesta inflamatoria inducida por mBSA y IL-1, la sangre periférica, BM y sinovio se toman de ratones B6 y G-CSF-/- tratados i.a. con mBSA y s.c. con IL-1 o vehículo de solución salina, en los días 0, 3 y 7 de este modelo. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y 3, y en la Figura 6. La deficiencia de G-CSF resulta en una respuesta de neutrófilo romo para mBSA/IL-1. La celularidad BM en ratones B6 y G-CSF-/- se reduce por la administración de IL-1 (Tabla 2), que reflejan la movilización de células BM en la sangre. Cuando se compara con ratones B6, los ratones GCSF-/- tienen números significativamente reducidos de metamielocitos y polimorfos, así como también pocos promielocitos y mielocitos en el compartimiento BM (Tabla 2) basalmente y en respuesta a IL-1. Los resultados B6 desarrollan un neutrófilo periférico marcado durante el curso de artritis aguda. En contraste brillante, los ratones G- CSF-/- exhiben una neutropenia significativa durante el curso del modelo (Tabla 3), lo que indica que el neutrófilo que se induce por IL-1 es dependiente de G-CSF.
La investigación de la composición celular del sinovio inflamado de ratones G-CSF-/- tratados con mBSA/IL-1 también revela una reducción en la infiltración de leucocitos en el día 3 y 7 (Figura 6A-C). Los conteos celulares de tejido sinovial digerido revela aproximadamente 2-veces de reducción en la celularidad total en el día 7 en tejido sinovial de articulación G-CSF-/- tratado con mBSA/IL-1, comparado con tejido sinovial tratado con mBSA/IL-1 de ratones B6 (1.87 \pm 0.07 x 10^{5 }células/ articulación B6 mBSA/solución salina versus 3.13 \pm 0.10 x 10^{5} células/ articulación B6 mBSA/IL-1 versus 1.66 \pm 0.05 x 10^{5} células/ articulación G-CSF-/- mBSA/IL-1). En particular, existen reducciones significativas en los porcentajes y números de neutrófilos (GR1hi CD11bhi) en ambos puntos de tiempo, así como también reducciones en el porcentaje y número de macrófago/monolitos infiltrantes (GR11o CD11bhi). Otros cambios fenotípicos incluyen porcentajes inferiores de células M-CSFR+ CD16/CD32+ y CD44+ en los tejidos sinoviales de ratones G-CSF-/- con artritis aguda, lo que sugiere que se puede requerir G-CSF para la inducción completa de estos marcadores de activación en las células sinoviales.
El teñido de leucocitos no adherentes después de cultivo durante la noche también revela una reducción en la infiltración de linfocito CD4+ en el día 7, lo que sugiere que se requiere G-CSF para traficar no solo los neutrófilos y macrófagos en la articulación sino también los linfocitos CD4+ T (Figura 6C).
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Ejemplo 12 Eliminación de neutrófilos en ratones G-CSP-/- y WT en artritis inflamatoria aguda
Para investigar si la reducción en artritis inducida por mBSA/IL-1 en ratones G-CSF-/- es simplemente un resultado de neutropenia (Lieschke et al., 1994, supra), se eliminan neutrófilos utilizando el anticuerpo monoclonal (mAb), RB6.8C5. Ratones WT y G-CSF-/- se inyectan intra-peritonealmente (i.p.) con anti-neutrófilo mAb (RB6.8C5) o isotipo de control mAb (GL121). La sangre periférica se analiza para niveles de neutrófilo en los días 0, 2 y 7 mediante análisis de conteo celular diferencial (Figura 7A). En animales WT tratados con anti-neutrófilo mAb, se observa eliminación >90% en todos los tiempos comparado con isotipo control de animales tratados con mAb (que desarrolla un neutrófilo marcado). La eliminación de neutrófilo de ratones WT no abroga el desarrollo de artritis (Figura 7B), aunque no reduce significativamente el exudado de espacio de articulación. En contraste, los ratones G-CSF-/- son relativamente resistentes a enfermedad y eliminación de neutrófilo adicional no reduce significativamente la severidad de la enfermedad. Esto indica que la reducción en neutrófilos en los ratones G-CSF-/- no es únicamente responsable para la protección de artritis inducida por mBSA/IL-1-.
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Ejemplo 13 G-CSF exógeno puede sustituir parcialmente el IL-1 en artritis inflamatoria aguda
Las articulaciones de ratones tratados con mBSA y G-CSF (mBSA/G-CSF) desarrollan artritis destructiva e inflamatoria, aunque esto es menos severo que los animales tratados con mBSA/IL-1- (Figura 4A-B). Las principales células que infiltran las articulaciones de los animales tratados con mBSA/G-CSF- son monocito/macrófagos, comparado con el infiltrado predominantemente granulocítico en artritis inducida por mBSA/IL-1. Estos resultados muestran que la administración sistémica de G-CSF exógeno puede por lo menos sustituir parcialmente para IL-1 sistémico en la conducción de este modelo de artritis aguda y que G-CSF conduce a reclutamiento de monocitos/macrófagos en la articulación.
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Ejemplo 14 Artritis inducida por colágeno que deteriora la eficiencia de G-CSF (CIA) Ratones deficientes de G-CSF han reducido la artritis inflamatoria aguda
En vista de los efectos pro-inflamatorios de la inyección i.a. y filgrastima sistémica en enfermedad de articulación, se pretende determinar la dependencia absoluta del modelo de artritis aguda en G-CSF, utilizando ratones G-CSF-/-. Los ratones G-CSF-/- y B6 se inyectan i.a. con mBSA (día 0) y s.c. en la almohadilla de la pata con IL-1 en los días 0, 1 y 2. La evaluación histológica de la enfermedad en el día 7 revela una reducción significativa en las características destructivas e inflamatorias (Figura 5A & B). El teñido de Safranina O para el contenido de proteoglicano de cartílago revela una reducción principal en pérdida de proteoglicano de cartílago en ratones G-CSF-/- comparado con ratones B6 (Figura 5C). Por lo tanto, el G-CSF endógeno es un mediador importante de inflamación y destrucción en este modelo de artritis aguda.
Deficiencia de G-CSF reduce la incidencia y severidad de CIA
La CIA es una artritis autoinmune crónica que se utiliza ampliamente para estudiar ARN. Para examinar la contribución de G-CSF a CIA, se inmunizan ratones B6 WT y G-CSF-/- con CII en CFA, seguido por una inyección inoculada 21 días después (Lieschke et al., Blood 84:1737-46, 1994), e incidencia de enfermedad y severidad comparada. El inicio de CIA en ratones G-CSF-/- se retrasa y los ratones desarrollan enfermedad en una incidencia marcadamente reducida y severidad comparado con ratones WT (Figura 8A & B). La reducción de la incidencia de la enfermedad y severidad en ratones G-CSF-/- sugiere un papel de pivote para el G-CSF endógeno en artritis autoinmune crónica.
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Ejemplo 15 Análisis histológico de CIA en ratones G-CSF-/-
Se desarrolla evaluación histológica de secciones teñidas de H&E de patas para cuatro ratones B6 y G-CSF-1- con la clasificación clínica mayor durante CIA. Se clasifican las articulaciones individuales de 0 normal a 3 (ver Ejemplo 18) y se determina el porcentaje de articulaciones artríticas y normales. Existe un porcentaje significativamente mayor de articulaciones normales en ratones GCSF-/- comparado con ratones WT (Figura 9A), y del número pequeño de patas afectadas en los ratones G-CSF-/-, ninguno es severo (Figura 9B). En contraste, las articulaciones de ratones WT tienen un rango de características histológicas indicadoras de artritis moderada a severa (Figura 9A & B). Estas observaciones histológicas son concordantes con la evaluación clínica destacada aquí.
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Ejemplo 16 Proliferación de célula T In vitro & producción de citoquina para CII
Para evaluar la respuesta inmune celular para CII, las respuestas proliferativas de célula T in vitro y la producción de citoquina de célula T (IFN\gamma y IL-2) se mide en ratones G-CSF-/- y comparado con WT. Las suspensiones celulares únicas se preparan a partir de ratones LN inguinales inmunizados con CII en CFA y se estimulan durante 72 h in vitro con 0-100 mg/ml de CII desnaturalizado. Las respuestas de célula T se miden al tritiar la retoma de TdR en las últimas 8 h del cultivo. La Figura 10A describe la estimulación que indica lo observado en ratones G-CSF-/- y WT, que son comparables. La producción de citoquinas de célula T IFN-\gamma y IL-2 mediante células G-CSF-/- LN parecen relativamente normal (Figura 10B).
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Ejemplo 17 Cambio de isotipo anti-CII deteriorado de IgM a IgG en ratones G-CSF-/-
La inducción de CIA es dependiente de respuestas inmunes celulares y humorales para CII (Campbell et al., 2000, supra). Se examina si la deficiencia de G-CSF altera los niveles de suero de la producción anti-CII Ab durante CIA (día 30 y 62). A pesar de los niveles comparables de anti-CII IgM en ratones WT y G-CSF-/- en los días 30 y 62, existe una reducción en el nivel de anti-CII IgG total (Figura 11). El análisis de isotipos anti-CII IgG revela la producción reducida de todos los isotipos - IgG2b, IgG2c, IgG3 y IgG1. Esto sugiere que existe un defecto en cambio de isotipo en ratones G-CSF-/- que puede contribuir a protección contra CIA. Esta observación sugiere que el G-CSF endógeno juega un papel en la producción Ab mediante células B, por lo menos en respuesta a la inmunización con antígeno en CFA.
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Ejemplo 18 Los niveles basales incrementados de Ig en ratones G-CSF-/- neófitos y se incrementa IgG total en ratones inmunizados CII/CFA
La investigación de la respuesta inmune humoral a CII revela que los ratones G-CSF-/- tienen cambios defectuosos de una respuesta de IgM a IgG. Para determinar si este defecto refleja defectos preexistentes en el Ab circulante, los sueros de ratones neófitos se analizan para isotipos totales IgG, IgM y IgG. El análisis de los niveles de suero Ab revela producción significativamente mayor de IgG total e isotipos IgG2b y IgG2c en ratones neófitos G-CSF-/- comparado con ratones neófitos B6 y producción de línea base normal de IgM, IgG1, IgG3 y IgA (Figura 12A). Adicionalmente, en ratones G-CSF-/- inmunizados con CII/CFA, los niveles de IgG total no específicos se mejoran marcadamente (Figura 12B). Estas observaciones sugieren que el G-CSF juega un papel en la maduración de célula B, la producción de anticuerpo y cambio de isotipo, por lo menos en respuesta a inmunización con antígeno en CFA.
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Ejemplo 19 Respuestas de célula B Ag independiente de T y dependiente de T normal en ratones G-CSF-/-
Para determinar si el deterioro de la producción Ab en respuesta a CII/CFA es debido a un defecto en las respuestas Ag dependientes de T o independientes de de T, se exponen ratones B6 y G- CSF-/- con el antígeno dependiente de T NPKLH en alum, o con el antígeno independiente de T, DNP-Dextrano en PBS. Los ratones G-CSF-/- desarrollan una respuesta normal a Ag dependiente de T e independiente de T (Figura 13), demuestra que la respuesta deteriorada de célula B en CIA es específica a la exposición con CII en CFA.
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Ejemplo 20 Eliminación de G-CSF origina neutropenia de sangre periférica y reduce la inflamación en artritis aguda (mBSA/IL-1)
Para evaluar la aplicación terapéutica de G-CSF bloqueo en ratones WT, los ratones B6 se inyectan antes de la inducción de artritis aguda (día 0) con 50 o 250 mg de mAb anti-G-CSF de rata (clon 67604; R&D systems, Minneapolis, Minnesota, USA) o isotipo de control (GL113) mAb. También se administra mAb en los días 1, 2, 3 y 5. La sangre periférica se toma en los días 4 y 7 y se somete a análisis diferencial (Figura 14A). Los ratones que reciben altas dosis (250 mg) de mAb anti-G-CSF tienen una reducción significativa en los neutrófilos de sangre periférica comparado con el isotipo de control mAb de ratones tratados con mBSA/IL-1 en ambos días. Los ratones que reciben la dosis menor de mAb anti-G-CSF tienen una reducción significativa en los neutrófilos en el día 7 solamente. El análisis de las poblaciones BM también muestra una reducción significativa en células de línea mieloide en ratones tratados con mBSA/IL-1 eliminadas de G-CSF (datos no mostrados). La evaluación macroscópica de articulaciones artríticas de ratones tratados con mAb anti-G-CSF o isotipo de control revela una reducción en la enfermedad en ratones tratados con mAb anti-G-CSF (250 mg) (Figura 14B). Existe celularidad de tejido sinovial reducido (Figura 14C), y un porcentaje reducido de leucocitos infiltrantes, especialmente neutrófilos (GR1hi CD11bhi; Figura 14D), en ratones que reciben la dosis más alta de mAb anti-G-CSF. Estos resultados muestran una reducción dependiente de dosis en las características de la enfermedad de artritis aguda en respuesta a la inhibición G-CSF en ratones tipo natural.
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6
TABLA 3 Análisis de sangre periférica de ratones G-GSF-/- durante artritis inducida por mBS4/IL-1 
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Claims (15)

1. Un agente que inhibe la actividad del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF), o el receptor del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSFR) y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica dicho G-CSF o GCSFR para el tratamiento o profilaxis de artritis en un sujeto.
2. El agente de la reivindicación 1, en donde la artritis es artritis inflamatoria crónica o artritis reumatoide (RA) o artritis inducida por colágeno (CIA).
3. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2, en donde el sujeto es un animal o especie aviar.
4. El agente de la reivindicación 3, en donde el animal es un mamífero.
5. El agente de la reivindicación 4, en donde el mamífero es un primate o roedor.
6. El agente de la reivindicación 5, en donde el primate es un humano o el roedor es un ratón.
7. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente es in anticuerpo para G-CSF o G-CSFR o un epítopo del mismo.
8. El agente de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
9. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente es una forma soluble deG-CSFR.
10. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente es un análogo químico de G-CSF o un análogo químico de G-CSFR, y en donde dichos análogos químicos son antagonistas de G-CSF o G-CSFR.
11. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 9 o 10, en donde el agente es una proteína.
12. El agente de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente es un ácido nucleico.
13. El agente de la reivindicación 12, en donde el ácido nucleico es ADN o ARN y que comprende una secuencia de polinucleótido codificante y anticodificante o una secuencia genética que codifica G-CSF o G-CSFR.
14. Uso de un agente que inhibe la actividad del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF), o el receptor del factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSFR) y/o que reduce el nivel de expresión de un gen que codifica dicho G-CSF o G-CSFR, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de artritis en un sujeto, en donde dicha artritis, sujeto y agente son como se define en una o más de las Reivindicaciones 1 a 13.
15. Un método no terapéutico in vivo para identificar agentes capaces de inhibir la actividad de G-CSF y/o inhibir la interacción de G-CSF con G-CSFR, dicho método comprende administrar un agente inhibidor putativo a un animal no humano genéticamente modificado que se ha modificado para producir cantidades bajas de G-CSF o G-CSFR con relación a un animal no modificado genéticamente de la misma especie, en donde dicho agente se identifica por tener interactividad con G-CSF o G-CSFR por el agente que tiene un efecto fisiológico detectable en un animal tipo intacto de la misma especie, pero un efecto reducido en un animal que exhibe expresión reducida de G-CSF y/o G-CSFR.
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