ES2332632B2 - Uso de inhibidores de enos en regeneracion nerviosa. - Google Patents
Uso de inhibidores de enos en regeneracion nerviosa. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de inhibidores de eNOS en regeneración
nerviosa.
La presente invención se refiere al empleo de
inhibidores de la actividad y/o expresión de la isoforma endotelial
de la enzima NO sintasa (eNOS) en la preparación de un medicamento
para aumentar la velocidad de regeneración de nervios periféricos
lesionados en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.
Asimismo, contempla el empleo de vectores que
dirigen la expresión de los inhibidores de eNOS en la fabricación
de dichos medicamentos, lo que permite acelerar la recuperación de
la comunicación neuromuscular tras la lesión mediante una sola
aplicación por inyección intraneural.
Description
Uso de inhibidores de eNOS en regeneración
nerviosa.
La presente invención tiene su campo de
aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel
relacionado con lesiones nerviosas. En concreto está dirigida al
empleo de inhibidores de la actividad y/o expresión de la isoforma
endotelial de la enzima NO sintasa (eNOS) para acelerar la
regeneración de nervios periféricos lesionados.
El sistema nervioso se divide tradicionalmente
en sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico
(SNP). El SNC está compuesto por el encéfalo, encerrado en el
cráneo y su continuación inferior, la médula espinal, ubicada en el
conducto raquídeo. La sustancia gris está formada fundamentalmente
por los somas neuronales y células gliales, mientras que la
sustancia blanca recibe su nombre por las fibras nerviosas
mielínicas que la conforman. Los cuerpos neuronales, dentro de la
sustancia blanca, están agrupados en núcleos y sus prolongaciones,
organizadas histológicamente en fibras nerviosas, transcurren entre
regiones del SNC formando fascículos o cordones nerviosos.
El SNP comprende todo el tejido nervioso
existente fuera del encéfalo y médula espinal y está constituido
por cuerpos neuronales organizados en ganglios, entrecruzamientos
de fibras nerviosas o plexos y haces de fibras nerviosas de
recorrido paralelo organizado en nervios. Los nervios periféricos
son las vías de comunicación entre los centros cerebrales y
medulares y el resto del cuerpo. Pueden ser sensitivos (aferentes),
motores (eferentes) o mixtos.
Ante una lesión, las fibras nerviosas del
sistema periférico nervioso mantienen la capacidad de regeneración,
incluso de largas distancias, en mamíferos adultos. Esta es una de
las características más reseñables que diferencian al sistema
periférico nervioso del central.
Para que se lleve a cabo el
re-crecimiento de las fibras nerviosas proximales
hacia el extremo distal y la subsiguiente regeneración, debe
producirse la degeneración Walleriana del extremo distal del
nervio. Durante ese periodo tiene lugar la fragmentación y
disolución de la mielina, la desdiferenciación de células de
Schwann en células reactivadas con capacidad de formar cadenas
celulares que expresan neurotropinas, neurotrofinas y moléculas de
adhesión, y la activación de las neuronas dañadas (Ide C.
(1996). Peripheral nerve regeneration. Neurosci Res
25(2):101-121). La composición molecular
del microambiente local modificado en respuesta a la lesión
determina la movilidad del cono de crecimiento y la orientación y
el crecimiento axonal. La lesión del nervio también activa las
células fagocíticas, como los macrófagos y las células de Schwann,
que eliminan los restos de axones y mielina y producen citoquinas,
las cuales potencian el crecimiento axonal y desencadenan la
proliferación de células endoteliales, aumentando la angiogénesis
(Ide C (1996); González-Hernández T. et al.
(1999). Expression of three forms of nitric oxide synthase in
peripheral nerve regeneration. J Neurosci Res
55(2):198-207).
Seddon (1943) clasifica las lesiones en nervios
periféricos en tres grandes grupos: neuroapraxia, axonotmesis y
neurotmesis.
Neuroapraxia: se define por un bloqueo de
conducción local, con parálisis, en ausencia de degeneración
Walleriana distal presentando una recuperación funcional completa
(días o semanas). Macroscópicamente el nervio no presenta lesiones,
histológicamente aparecen segmentos desmielinizados. Al no existir
lesión axonal no existe regeneración y con ello tampoco existe
signo de Tinel a nivel de la lesión.
Axonotmesis: se define por una discontinuidad
axonal y una degeneración Walleriana distal y una regeneración
axonal proximal. Tanto el peri como el endoneuro permanecen
intactos. La recuperación nerviosa es de 1,5 mm por día.
Neurotmesis: es la lesión nerviosa más severa,
equivalente a una disrupción fisiológica del nervio completa,
pudiendo o no existir una sección nerviosa en el momento.
Tras la lesión, la función nerviosa degenera de
forma secuencial: motora, sensibilidad propioceptiva, tacto,
temperatura, dolor y componente simpático. La recuperación nerviosa
se refleja en sentido inverso.
Sunderland (1951) amplió la clasificación sobre
la base de que la axonotmesis presenta un pronóstico muy variado.
Subdividió la axonotmesis de Seddon en tres grados, dependiendo del
grado de lesión del componente conectivo del nervio.
Tipo I: equivalente a la neuroapraxia. La
recuperación funcional es completa al cabo de semanas o meses.
Tipo II: el endoneuro y el perineuro se hallan
intactos, pero los axones están fisiológicamente interrumpidos.
Dado que el endoneuro está íntegro, la regeneración axonal está
dirigida a lo largo de su recorrido original y por ello se puede
esperar una recuperación funcional completa. El tiempo de
recuperación depende del nivel de la lesión (generalmente meses),
dado que los axones deben regenerarse distalmente hasta el órgano
diana.
Tipo III: el endoneuro está interrumpido,
quedando íntegro el perineuro. La recuperación funcional es
incompleta por una serie de razones: la primera es una lesión
retrógrada de los cuerpos celulares de mayor grado, que puede llegar
a destruir la neurona o retrasar su recuperación. En segundo lugar
aparece fibrosis interfascicular por presentar una lesión del
endoneuro, lo que interfiere en la regeneración axonal. La tercera
es el resultado de un mayor lapso de tiempo para inervar al órgano
diana que ha podido sufrir cambios secundarios a la denervación que
impidan una recuperación completa.
Tipo IV: la integridad del nervio se debe a un
tejido cicatricial que contiene los fascículos nerviosos
interrumpidos. La degeneración retrógrada y la fibrosis
interfascicular son más acusadas, por lo que la recuperación es
mínima. Presenta un signo de Tinel a nivel de la lesión que no
progresa hacia distal, se espera un lapso de tres meses previa
cirugía. Éste grado precisa la resección del segmento lesionado y
la reparación quirúrgica o la reconstrucción nerviosa.
Tipo V: equivalente a la neurotmesis. Dado que
se da en lesiones abiertas siempre está indicada una exploración
quirúrgica. La recuperación funcional espontánea no existe.
La clasificación de Sunderland presenta una
descripción anatómica de la lesión nerviosa, estando su utilidad
clínica en debate. La mayoría de las lesiones no se pueden
clasificar en un sólo grado dado que las lesiones mixtas son
frecuentes a nivel de los nervios periféricos. Por ello Mackinnon
describió un VI grado de lesión nerviosa que representa distintos
grados de Sunderland en un mismo segmento nervioso lesionado. La
subclasificación de la axonotmesis es improbable
preoperatoriamente, siendo sólo realizable mediante un estudio
histológico del nervio lesionado.
Se han sugerido en el estado de la técnica
diferentes tipos de tratamientos para acelerar la regeneración de
nervios periféricos, la mayoría de ellos invasivos y de aplicación
crónica. Así, se han descrito tratamientos condicionantes y
manipulaciones extrínsecas para acelerar la recuperación, como la
administración de factores de crecimiento (Boyd JG, Gordon T. A
dose dependent facilitation and inhibition of peripheral nerve
regeneration by brain-derived neurotrophic factor.
(2002) Eur J Neurosci 15 (4):613-626),
estimulación eléctrica (Al-Majed et al. Brief
electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor
axonal regeneration (2000) J Neurosci
20(7):2602-2608; Brushart et al. Electrical
stimulation promotes motoneuron regeneration without increasing its
speed or conditioning the neuron. (2002) J Neurosci
22(15):6631-6638), campos
electromagnéticos (Sisken et al. Stimulation of rat sciatic nerve
regeneration with pulsed eectromagnetic fields (1989) Brain Res
485(2):309-316; Greenebaum et al. Effects of
pulsed magnetic fields on neurite outgrowth from chick embryo dorsal
root ganglia (1996) Bioelectromagnetics
17(4):293-302; Longo et al. Electromagnetic
fields influence NGF activity and levels following sciatic nerve
transaction (1999) J Neurosci Res
55(2):230-237) y el tratamiento con
oxígeno hiperbárico (Bajrovic et al. The effect of hyperbaric
oxygen treatment on early regeneration of sensory axons after nerve
crush in the rat (2002) J. Peripher Nerv Syst
7(3):141-148; Haapaniemi et al. Functional
evaluation after rat sciatic nerve injury followed by hyperbaric
oxygen treatment (2002) J Peripher Nerv Syst
7(3):149-154). Sin embargo, ninguna de
estas técnicas se emplea actualmente en la práctica clínica.
Debido a que el éxito de la regeneración depende
de la interrelación de todos los procesos degenerativos y
regenerativos, la identificación de sustratos moleculares que
regulen estos procesos es un paso básico hacia el desarrollo de
nuevas estrategias para acelerar la recuperación funcional y
morfológica del nervio lesionado.
El óxido nítrico (NO) podría estar implicado en
la regulación de estos procesos degenerativos y regenerativos tras
la lesión de nervios periféricos, dado que se ha demostrado que
colapsa los conos de crecimiento neuronal (Yamada RX. et al.
(2006). Nitric oxide/cyclic guanosine
monophosphate-mediated growth cone collapse of
dentate granule cells. Neuroreport
17(6):661-665; Hess DT. et al. (1993).
Neuronal growth cone collapse and inhibition of protein fatty
acylation by ntric oxide. Nature 366:562-565) y
que inhibe el restablecimiento de la cobertura sináptica a nivel
central tras la lesión del nervio (Sunico CR. et al. (2005).
Nitric-oxide-directed synaptic
remodeling in the adult mammal CNS. J Neurosci
25(6):1448-1458). El NO, un gas altamente
reactivo de vida corta, se produce durante la conversión de la
L-arginina a L-citrulina por acción
de la NO sintasa (NOS). Se han identificado tres isoformas de NOS:
la isoforma neuronal (nNOS, NOS-I), expresada
constitutivamente en poblaciones neuronales discretas; la isoforma
inducible (iNOS, NOS-II), expresada en varios tipos
celulares incluyendo macrófagos activados, y la isoforma endotelial
(eNOS, NOS-III), presente en células endoteliales
de vasos sanguíneos.
El NO producido a bajas concentraciones por las
isoformas nNOS y eNOS, actúa como una molécula mensajera en
diferentes mecanismos de transducción de señales, mientras que el
NO producido a altas concentraciones por la isoforma iNOS presenta
efectos citotóxicos (Moreno-López B. et al.
(2006). Nitric oxide and synaptic dynamics in the adult brain:
physiopathological aspects. Rev Neurosci
17(3):309-357). Tras la ligadura del
nervio, la nNOS se sobre-expresa en el ganglio de
la raíz dorsal (González-Hernández T. et al
(1999)) y en neuronas motoras (Sunico CR. et al.
(2005)). Esta proteína es transportada centrífugamente y se
acumula en los axones en crecimiento. Al mismo tiempo, la iNOS es
inducida en los macrófagos reclutados y en las células de Schwann
fagocíticas y la eNOS se sobre-expresa en los vasos
sanguíneos (vasa nervorum) del muñón distal del nervio y
alrededor de la ligadura (González-Hernández T.
et al. (1999); Zochodne DW. et al. (2005). Nitric oxide in damage,
disease and repair of the peripheral nervous system. Cell Mol Biol
(Noisy-le-grand)
51(3):255-267).
Los niveles de expresión de la isoforma eNOS
aumentan por la acción del Factor de Crecimiento del Endotelio
Vascular (VEGF) (Bouloumié A. et al. "Vascular endotelial
growth factor up-regulates nitric oxide synthase
expression in endotelial cells". Cardiovascular Research 41
(1999) 773-780). Por otra parte, la
fosforilación de eNOS, mediada por los receptores del VEGF
(VEGF1/Flt-1 y/o VGFR2/Flk-1/KDR)
con actividad tirosina-kinasa, aumenta su actividad
(Ben-Quan Shen, et al. "Vascular Endotelial
growth factor governs endotelial nitric-oxide
synthase expression via a KDR/Flk-1 receptor and a
protein kinase C signaling pathway". Journal of biological
chemistry. Vol 274(46) (1999)
33507-33063). Asimismo, el transportador de
aminoácidos catiónicos (CAT-1) actúa como
transportador específico de L-Arginina para la
eNOS, potenciando su actividad (Chunying Li et al.
"Interaction of the endotelial nitric oxide synthase with the
CAT-1 arginine transporter enhances NO release by a
mechanism not involving arginine transport". Biochem. J. (2005),
386, 567-574).
En estudios realizados en ratones knockout de
nNOS e iNOS, se ha comprobado que, tras la lesión del nervio, la
ausencia de estas isoformas produce un retraso en la degeneración
Walleriana y en la recuperación periférica (Zochodne DW. et al.
(2005); Keilhoff G. et al. (2002). Differences in peripheral nerve
degeneration/regeneration between wild-type and
neuronal nitric oxide synthase knockout mice. J Neurosci Res
68(4):432-441). En estudios realizados
con inhibidores específicos de nNOS y/o iNOS, se ha visto que su
empleo no es efectivo a corto plazo en la recuperación de la
función muscular o en la tasa de crecimiento axonal, aunque se
utilizaron a unas dosis que fueron efectivas para otro tipo de
procesos fisiopatológicos (Moreno-López B. et al.
(2004). Nitric oxide is a physiological inhibitor of neurogenesis
in the adult mouse subventricular zone and olfactory bulb. J
Neurosci 24(1):85-95; Sunico CR. et al.
(2005); Jiang W. et al. (2004). Effects of nitric oxide on dentate
gyrus cell proliferation after seizures induced by pentylenetrazol
in the adult rat brain. Neurosci Lett
367(3):344-348). En relación con la
eNOS, la síntesis de NO por esta isoforma favorece la hiperemia en
el extremo proximal del nervio (Zochodne D. W. et al. "Evidence
for nitric oxide and nitric oxide synthase activity in proximal
stumps of transacted peripheral nerves". Neuroscience Vol 91, nº
4, pp. 1515-1527, 1999). La hiperemia es un
proceso por el cual aumenta el aporte sanguíneo al sitio de la
lesión, lo cual, podría tener efectos beneficiosos en los procesos
regenerativos. Según estas afirmaciones, la inhibición de eNOS
sería contraproducente en la regeneración de nervios periféricos.
Así, en ensayos realizados con ratones knockout de eNOS, la
ausencia de esta isoforma retarda la revascularización nerviosa, lo
cual, sin embargo, no se ha visto que afecte a la capacidad
regenerativa del nervio (Hari Shanker Sharma et al.
"Neuroprotective effects of nitric oxide synthase inhibitors in
spinal cord injury-induced pathophysiology and motor
functions. An Experimental Study in the rat" Ann. N. Y. Acad.
Sci. (2005) 1053: 422-434). No hay por tanto
datos disponibles que demuestren la acción regulatoria del NO
endógeno procedente de diferentes fuentes en la reparación total
del nervio.
Ante la falta de datos concluyentes, los autores
de la presente invención han desarrollado una importante labor de
investigación acerca del papel del NO sintetizado por los
diferentes subtipos de NOS en la recuperación total de la función
neuromuscular y la tasa de regeneración axonal tras la lesión de un
nervio motor.
Por primera vez, y en contra de los prejuicios
establecidos en el estado de la técnica, han identificado la
isofoma eNOS como la mayor fuente de NO con efectos negativos en la
recuperación del potencial muscular tras la lesión de nervios
periféricos, demostrando su utilidad como diana terapéutica en el
tratamiento de estas lesiones.
Así, han demostrado la utilidad de la inhibición
de la actividad y/o expresión de la óxido nítrico sintasa de origen
endotelial (eNOS), por medio de herramientas farmacológicas y/o
moleculares, en la recuperación de la función neuromuscular y en la
regeneración axonal.
Particularmente, han demostrado que la
inhibición de eNOS mediada por un vector viral que dirige la
expresión de una proteína inhibidora de la expresión y/o actividad
de eNOS acelera la recuperación de la comunicación neuromuscular
tras la lesión mediante una sola aplicación por inyección
intraneural, actuando como una estrategia viable en terapia génica
aplicada a lesiones nerviosas.
Figura 1. Modelo experimental de lesión del
nervio del XII par craneal por aplastamiento (crush) en la rata
adulta. (A) Con el fin de evaluar el curso temporal de la
recuperación de la comunicación neuromuscular, se registró el
potencial de acción muscular compuesto (PAMC), evocado por
estimulación eléctrica (St) del nervio XII usando electrodos
implantados en el músculo geniogloso. Los registros se realizaron
en animales control y a diferentes puntos temporales tras el
aplastamiento del nervio (Cr: crush). NH: núcleo hipogloso. (B) El
índice de crecimiento axonal se analizó cuantificando el número de
neuronas motoras marcadas de forma retrógrada con FluoroGold (FG)
tras el aplastamiento del nervio (Cr: crush) a 10 mm en posición
proximal a la bifurcación. T+FG: Transección (T) del nervio XII y
aplicación de FG. Tras la aplicación de FG se dejó que los animales
sobrevivieran durante 7 días para permitir el transporte retrógrado
del marcador. Inserto: Microfotografía de alta amplificación de
neuronas motoras del hipogloso marcadas con FG. Barra de
calibración: 50 \mum.
Figura 2. Curso temporal de la recuperación
de la función neuromuscular tras la lesión por aplastamiento del
nervio del XII par craneal. PAMC evocados en el músculo
geniogloso mediante un único estímulo eléctrico (las puntas de
flecha señalan los artefactos de los estímulos) del nervio XII en
animales controles (A) y a los 7 (B), 15 (C), 22 (D), 30 (E) y 45
(F) días tras la lesión. Por comparación, se ilustran los PAMC
evocados por estimulación del nervio XII izquierdo (l, lado
intacto) y derecho (D, lado lesionado). Cada trazo representa una
media de diez trazados individuales. Los trazados de color gris en
C representan las respuestas obtenidas en el mismo animal tras la
inyección del bloqueante de la transmisión neuromuscular
trietioduro de galamina (GT) en el músculo geniogloso. Obsérvese la
completa ausencia al 7º día de PAMC y los primeros signos de
re-inervación muscular 15 días después de la
lesión.
Figura 3. Estudio del efecto de la inhibición
crónica de la NOS en el curso temporal de la recuperación de la
función neuromuscular tras la lesión por aplastamiento del nervio
del XII par craneal. (A) Ejemplos de respuestas evocadas en el
músculo geniogloso mediante estimulación eléctrica del nervio XII
derecho (D)/lesionado en los tiempos indicados en animales tratados
con solución salina (salino) o el inhibidor de amplio espectro de
la NOS, L-NAME. (B,C) Curso temporal de los cambios
en el ratio de áreas (B) y diferencias en la latencia de los PAMC
(C) evocados mediante estimulación eléctrica del nervio XII derecho
(lesionado) frente al izquierdo (intacto) en animales tratados
crónicamente con solución salina o L-NAME. El valor
medio en los animales control se tomó como el 100%. *, #
p<0,05; prueba no paramétrica de la U de
Mann-Whitney, en relación con el control o los
grupos control y tratados con solución salina, respectivamente.
Figura 4. Estudio del efecto de
L-NAME en la actividad de disparo basal de las
neuronas motoras del hipogloso tras la lesión por aplastamiento del
nervio del XII par craneal. (A) Ejemplos representativos que
muestran la actividad de descarga de neuronas motoras del hipogloso
registradas a una concentración de CO2 al final de la espiración
basal en el ET_{CO2} BASAL (4,8-5,2%) en los
controles y 7 días después del aplastamiento del nervio XII
homolateral en animales no tratados y tratados con
L-NAME. Los trazos son las señales originales de la
actividad de potenciales de acción registradas extracelularmente
(parte superior) y el histograma de la tasa de disparo instantáneo
(parte inferior; FR; en potencial/es de acción). La línea
discontinua horizontal ilustra la FR media (mFR) de un brote. (B,
C) Curso temporal de las alteraciones en el número de potenciales de
acción (SB) (B) y el mFR (C) por brote tras la lesión del nervio
XII. * p<0,05; ANOVA de una vía; método post hoc
de Dunnett, en relación con la condición control.
Figura 5. Efecto de los inhibidores de la NOS
específicos de isoforma sobre el inicio de la recuperación de la
función neuromuscular. (A) Respuestas PAMC típicas evocadas en
el músculo geniogloso mediante estimulación eléctrica del nervio
XII dañado 7 días después de la lesión en animales tratados y no
tratados. (B) La proporción entre las áreas de los PAMC medidos en
los lados derecho (lesionado) e izquierdo (intacto) en animales
tratados con L-NAME y L-NIO (C).
Diferencias en la latencia de los PAMC evocados mediante
estimulación del nervio derecho (lesionado) y el izquierdo
(intacto). # p<0,05; prueba no paramétrica de la U
de Mann-Whitney.
Figura 6. Estudio del efecto de la inhibición
crónica de la NOS en el índice de crecimiento axonal.
(A-F) Microfotografías de secciones coronales del NH
derecho que muestran neuronas motoras que contienen el marcador
retrógrado FG. El muñón del nervio XII proximal se sumergió en una
solución con FG en animales control (A), justo después del
aplastamiento del nervio (B), dos días después de la lesión por
aplastamiento del nervio en animales tratados diariamente con
solución salina (C) o L-NAME (D) y una semana
después de la lesión por aplastamiento en animales que reciben
estos mismos tratamientos (E,F). Todos los animales fueron
perfundidos 7 días después de la aplicación de FG. Barra de
calibración: 100 \mum. (G) Número de neuronas motoras (MN)
marcadas con FG en animales control (c) y a diferentes puntos de
tiempo tras la lesión por aplastamiento del nervio XII tratados con
solución salina o L-NAME. (H) Número de neuronas
motoras marcadas (MN) cuando la aplicación de FG se realizó dos
días después de la lesión por aplastamiento en animales que estaban
recibiendo los tratamientos indicados. La barra gris horizontal
representa la media \pm S.E.M en ratas control. *, #
p<0,05; prueba no paramétrica de la U de
Mann-Whitney, en relación con el control o los
grupos control y tratado con solución salina/D-NAME,
respectivamente.
Figura 7. Estudio del efecto de la inhibición
intraneural crónica de la eNOS usando un vector adenoviral en la
recuperación de la función neuromuscular y el índice de crecimiento
axonal. (A-C) PAMC evocados en el músculo
geniogloso mediante estimulación eléctrica (las puntas de flecha
señalan los artefactos del estímulo) del nervio XII a 7 (A), 22 (B)
o 62 (C) días después de la inyección intraneural de
Ad-eGFP o Ad-TeNOS. Para propósitos
comparativos, se ilustran los registros obtenidos mediante
estimulación del nervio XII izquierdo (intacto) y derecho
(lesionado). Cada trazo representa el promedio de diez respuestas
individuales. (D) La razón entre el área del PAMC evocado mediante
estimulación eléctrica del nervio derecho frente al izquierdo a
diferentes puntos de tiempo. La barra gris horizontal representa la
media \pm E.S. en ratas control. (E) Diferencias en la latencia
de los PAMC evocados mediante estimulación de los nervios derecho e
izquierdo. (F,G) Microfotografías de secciones coronales del NH
derecho que muestran neuronas motoras marcadas con FG en animales a
los que se ha inyectado Ad-eGFP (F) o
Ad-TeNOS (G) el día de la lesión. FG se aplicó dos
días tras la lesión y los animales fueron perfundidos 7 días después
de la aplicación del FG. Barra de calibración: 100 \mum. (H)
Número de neuronas motoras (MN) marcadas con FG identificadas en
animales tratados con Ad-eGFP o
Ad-TeNOS. \NAK, #, *, p<0,05; prueba no
paramétrica de la U de Mann-Whitney en
relación con el control o los grupos control y tratado con
Ad-eGFP o los grupos tratados con
Ad-eGFP, respectivamente.
La presente invención tiene como principal
objetivo el empleo de un inhibidor de la actividad y/o expresión de
eNOS en la preparación de un medicamento para aumentar la velocidad
de regeneración de nervios periféricos lesionados en un sujeto en
necesidad de dicho tratamiento.
Además, contempla un vector de expresión que
codifica un inhibidor de la actividad y/o expresión de eNOS, en la
preparación de dicho medicamento.
Finalmente, es objeto de la presente invención
un método para identificar agentes aceleradores de la regeneración
en nervios periféricos.
Debido a la ausencia en el estado de la técnica
de un tratamiento efectivo para acelerar la regeneración de nervios
periféricos, los autores de la presente invención han llevado a
cabo un importante trabajo de investigación centrado en el estudio
de la participación de las diferentes isoformas de NOS en los
procesos de regeneración de nervios periféricos lesionados. Así,
han demostrado la utilidad de la inhibición de la actividad y/o
expresión de la óxido nítrico sintasa de origen endotelial (eNOS),
por medio de herramientas farmacológicas y/o moleculares, en la
recuperación de la función neuromuscular y en la regeneración
axonal.
En un aspecto principal de la invención se
contempla el uso de un inhibidor de la actividad y/o expresión de
eNOS en la preparación de un medicamento para aumentar la velocidad
de regeneración de nervios periféricos (sensitivos, motores o
mixtos) lesionados en un sujeto en necesidad de dicho
tratamiento.
En la presente invención, se entiende por lesión
de un nervio periférico aquella ocasionada por agentes térmicos
(altas o bajas temperaturas), irradiación (altas dosis de
radiaciones ionizantes), o cualquier tipo de lesión traumática que
de lugar a una lesión con interrupción de la función nerviosa.
Según el grado de lesión se denomina neurapraxia (interrupción de la
conducción nerviosa con conservación morfológica de los componentes
de la fibra, incluyendo el axón), axonotmesis (rotura del axón y de
su vaina de mielina, con preservación de los tubos endoneurales,
que pueden estar distorsionados, pero no interrumpidos; por ejemplo
el crush o aplastamiento) y neurotmesis (destrucción de todos
los elementos del nervio; transección). Las lesiones de nervios
periféricos también pueden ser generadas por enfermedades
autoinmunes que atacan generalmente a la cubierta de mielina (ej.
enfermedad de Guillain-Barré). También lesiones de
tipo irritativo, que se manifiestan por movimientos o sensaciones
anormales como fasciculaciones y espasmos musculares, parestesias,
dolor espontáneo y trastornos vasomotores y de la sudoración.
Por inhibidor de eNOS se entiende cualquier
herramienta farmacológica y/o molecular (oligonucleótidos,
péptidos, anticuerpos, antagonistas, etc) capaz de inhibir la
actividad y/o expresión de esta enzima.
La actividad y/o expresión de eNOS puede
inhibirse de forma directa o indirecta a tres niveles: 1) actuando
directamente sobre la expresión y/o actividad de eNOS, disminuyendo
su capacidad funcional, 2) actuando sobre el VEGF o sus receptores
(VEGF1/Flt-1 y/o VGFR2/Flk-1/KDR),
con el fin de reducir la expresión de eNOS y/o su activación por
fosforilación, y 3) actuando sobre el transportador del sustrato de
la eNOS, CAT-1, con el fin de reducir la
disponibilidad del sustrato de la eNOS, disminuyendo así la
producción de NO de origen endotelial.
Así, en una realización preferida el inhibidor
de eNOS actúa directamente sobre la expresión y/o actividad de eNOS
o, indirectamente, inhibiendo la expresión y/o actividad de VEGF,
VEF1/Flt-1, VGFR2/Flk-1 y/o
CAT-1.
Estas posibilidades de inhibición de la
actividad y/o expresión de eNOS pueden utilizarse de forma
independiente o combinada.
En una realización particular, el inhibidor se
selecciona de entre
L-N(5)-(1-iminoetil)ornitina
(L-NIO) (inhibidor específico de eNOS),
SU-5416 (bloqueante de los receptores de VEGF),
L-lisina (inhibidor de CAT-1) y
combinaciones de los mismos.
En otra realización particular, el inhibidor es
una molécula de ARN interferente dirigida contra el ARNm que
codifica para una proteína seleccionada entre eNOS, VEGF,
VEGF1/Flt-1, VGFR2/Flk-1/KDR y/o
CAT-1. De forma preferida, la molécula de ARN
interferente empleada está dirigida contra la secuencia de ARNm,
concretamente contra el sintetizado a partir de la secuencia de ADN
del gen, ilustrada en SEQ ID NO 1, que codifica para la isoforma
eNOS. En este caso, el ARN interferente puede ser cualquier
secuencia de 21-23 nucleótidos complementaria a
cualquier región del ARNm sintetizado a partir de la secuencia de
ADNc que codifica para el ARNm que da lugar a la proteína eNOS (SEQ
ID NO 2). De forma particular, se emplea un ARN interferente de
secuencia SEQ ID NO 3.
En otra realización particular, el inhibidor
comprende una molécula de ADN, que codifica para una forma truncada
mutante dominante negativo de una proteína seleccionada de entre
eNOS, VEGF, VEGF1/Flt-1,
VGFR2/Flk-1/KDR y/o CAT-1, inserta
en un sistema de expresión heterólogo. Una forma truncada mutante
dominante negativo de una proteína se define como cualquier
fragmento de la proteína nativa que se una a la misma inhibiendo su
función, siempre y cuando sean capaces de formar dímeros. De forma
preferida, el inhibidor es una forma truncada mutante dominante
negativo de la proteína eNOS. Más preferiblemente, la secuencia de
ADN que codifica dicha proteína mutada tiene una secuencia
seleccionada de entre SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5.
Para el uso directo de los inhibidores de la
actividad y/o expresión de eNOS, la presente invención contempla su
introducción en las células del nervio, donde se requiere el efecto
inhibitorio. Para ello, se contempla el empleo de sistemas
específicos empleados habitualmente en el estado de la técnica. De
forma particular, se contempla el empleo de vectores de
expresión.
Así, en otra realización principal, la invención
se refiere al empleo de un vector de expresión que codifica un
inhibidor de la actividad y/o expresión de eNOS, en la preparación
de un medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de
nervios periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho
tratamiento. De forma particular, el vector puede ser plasmídico
y/o vírico (lentiviral, adenoviral, etc).
De forma particular, y tal y como se ha definido
anteriormente, el inhibidor de la actividad y/o expresión de eNOS
codificado por el vector puede ser una molécula de ARN interferente
dirigida contra el ARNm que codifica para una proteína seleccionada
entre eNOS, VEGF, VEGF1/Flt-1,
VGFR2/Flk-1/KDR y CAT-1 y/o una
forma truncada mutante dominante negativo de una proteína
seleccionada de entre eNOS, VEGF, VEGF1/Flt-1,
VGFR2/Flk-1/KDR y/o CAT-1.
El medicamento que comprende los inhibidores de
la actividad y/o expresión de eNOS, se administra preferiblemente
de forma local. Esta vía de administración presenta ventajas puesto
que evita el efecto hipertensivo que pudiera producir un
medicamento de administración sistémica.
De forma particular, cuando el medicamento
comprende inhibidores específicos de eNOS, de VEGF, de sus
receptores y/o de CAT-1, tales como
L-NIO, SU-5416 ó
L-lisina, la administración local es crónica y
tópica (ej. pomadas), sistemas de perfusión local continuada o
vehículos similares.
Cuando el medicamento comprende una secuencia
nucleotídica, bien ARN o bien ADN, cuya expresión está mediada o no
por un vector, la administración se realiza directamente en el
nervio, mediante inyección intraneural, para que el tratamiento sea
más efectivo, aunque no se descarta la aplicación tópica de tales
agentes.
De forma particular, la presente invención
contempla la administración, el mismo día de la lesión, de un
vector adenoviral recombinante que comprende una molécula de ADN
que codifica para una forma truncada de la proteína eNOS, mediante
una única inyección intraneural, lo que adelanta el proceso de
regeneración nerviosa en, al menos, una semana. La vida
relativamente corta de la expresión genética proporcionada por este
tipo de vectores es un factor beneficioso en la regeneración
nerviosa, ya que la inhibición de eNOS durante largos periodos de
tiempo podría presentar el efecto contrario. El efecto beneficioso
de la aplicación intraneural de este tipo de vectores se refleja en
la aceleración de la reinervación del músculo, y en el incremento
de la tasa de regeneración axonal observándose, una semana después
de la transducción, características similares a las que se observan
tras el tratamiento sistémico crónico con inhibidores específicos de
eNOS.
Los medicamentos contemplados en la presente
invención pueden comprender además vehículos, excipientes y otros
ingredientes conocidos y empleados habitualmente en el estado de la
técnica, en función de la forma de administración (local o
sistémica; inyección o tópica, etc.).
La dosis de medicamento empleada dependerá
también de la forma de administración, del peso corporal del
paciente y otros factores, y en cualquier caso será determinada por
el médico responsable del tratamiento.
Finalmente, en otra realización principal, se
contempla un método para identificar agentes aceleradores de la
regeneración en nervios periféricos que comprende: a) poner en
contacto el agente a ensayar con la isoforma eNOS y b) determinar si
el agente a ensayar inhibe la actividad y/o expresión de eNOS.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
pero no limitar la presente invención.
En este estudio se utilizaron ratas Wistar macho
adultas de 250-400 g de peso obtenidas de un
suministrador autorizado (Servicios de Experimentación y Producción
Animal, Universidad de Cádiz, España). Los animales se estabularon
de forma individual en jaulas con agua y pequeñas bolas de alimento
ad libitum en condiciones de temperatura controlada a 21
\pm 1ºC, con un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Los
experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del
Consejo de la Unión Europea (86/609/UE) y la legislación española
(BOE 67/8509-12; BOE 1201/2005) sobre el uso de
animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité local de
Ética y Atención a los Animales. Todos los procedimientos
quirúrgicos se llevaron a cabo en condiciones asépticas. Como
anestesia se usó hidrato de cloral (0,5 g/kg; i.p.). Se estudiaron
al menos tres animales por grupo experimental. Todos los valores de
los datos se presentan como la media \pm E.S.
Bajo anestesia, se aisló del tejido adyacente,
el XII par craneal derecho y se aplastó, de forma severa, con
pinzas de microdisección aplicadas durante 30 s. La lesión se
inflingió en lugares diferentes según el diseño experimental (Fig.
1). En los experimentos en los que debía evaluarse la función
neuromuscular, la lesión por aplastamiento se realizó justo en
posición proximal a la bifurcación del nervio en las ramas lateral
y medial (Fig. 1A). Cuando se debían estudiar los efectos de los
fármacos sobre el índice de crecimiento axonal, el nervio se aplastó
a aproximadamente 10 mm proximal a la bifurcación (Fig. 1B). La
incisión se suturó y limpió con una solución antiséptica (povidona
yodada). Todos los animales recibieron tras la intervención una
inyección de penicilina (20.000 Ul/kg; im) con el fin de evitar
infecciones. Tras despertar se administró pirazolona (0,1 mg/kg; im)
para conseguir analgesia posquirúrgica.
Para estudiar el efecto de la lesión nerviosa
sobre el potencial de acción muscular compuesto (PAMC) se anestesió
a los animales experimentales tal y como se ha indicado antes, se
diseccionaron los dos nervios XII y se colocaron electrodos
bipolares de plata aislados con teflón 3-4 mm
proximal a las bifurcaciones nerviosas. Los electrodos se aislaron
eléctricamente del tejido adyacente con vaselina y parafina. El PAMC
se registró usando dos electrodos de gancho de acero inoxidable
recubiertos con teflón insertados en el músculo geniogloso. Se
estimuló el par craneal XII y se registró el potencial de campo
ortodrómico provocado en el músculo (Fig. 1A), se amplificó y se
pasó a través de filtros de paso bajo a 3 kHz. Los estímulos fueron
pulsos cuadrados catódicos únicos de 50 \mus a 1 Hz y la
intensidad de corriente aplicada fue tres veces la corriente umbral
para la detección del PAMC. Las señales se visualizaron,
transfirieron y guardaron en un ordenador. Para estudiar el curso
de tiempo de la re-inervación muscular se analizaron
los PAMC evocados por la estimulación del nervio XII a diferentes
tiempos tras la lesión por aplastamiento. Se midió la latencia al
pico y el área del PAMC en relación con el estímulo artefacto y la
línea base, respectivamente. Se realizó la media de diez PAMC
consecutivos y se expresaron en relación con el lado de control
contralateral. En ninguno de los animales analizados a 1, 3 y 7
días se pudo determinar el umbral, en cuyo caso se analizaron las
intensidades de estimulación cinco veces superiores al umbral
medido en el lado control (< 0,1 mA).
Los animales se prepararon para los registros
extracelulares como se ha descrito anteriormente
(González-Forero D. et al. (2004). Nerve injury
reduces responses of hypoglossal motoneurones to baseline and
chemoreceptor-modulated inspiratory drive in the
adult rat. J Physiol 557.3:991-1011; Sunico et al.,
2005). De manera resumida, se anestesió a las ratas (como se ha
indicado antes) y se les inyectó i.m. atropina (0,2 mg/kg) y
dexametasona fosfato sódico (0,8 mg/kg). Alrededor de los nervios
XII derechos se fijaron electrodos bipolares de plata aislados con
teflón. Se introdujo una cánula en la tráquea, la vejiga urinaria y
la arteria y la vena femoral. Posteriormente se sometió a los
animales a vagotomización, descerebración y parálisis con
trietioduro de galamina (20 mg/kg, iv, inicialmente; 4 mg/kg iv,
según fuera necesario) y se procedió a su ventilación mecánica. El
CO_{2} y el O_{2} espirados se monitorizaron de forma
continuada (Eliza duo; Gambro Engström, Bromma, Suecia). Durante el
experimento la concentración de CO_{2} al final de la espiración
(ETCO_{2}) se mantuvo estable (4,8-5,2%) ajustando
el volumen corriente y/o la frecuencia del respirador. La presión
sanguínea arterial femoral (95 \pm 15 mmHg) y la temperatura
rectal (37 \pm 1ºC) se monitorizaron de forma continuada y se
mantuvieron estables. Se utilizaron micropipetas de vidrio
(1-3 M\Omega) cargadas con NaCl 2M y se colocaron
mediante guía visual y se desplazaron a través del tronco
encefálico hacia el núcleo hipogloso (NH). La posición correcta de
la micropipeta se confirmó mediante registro del patrón
inspiratorio característico y la presencia del potencial de campo
antidrómico provocado por la estimulación eléctrica del nervio XII
homolateral. Las neuronas motoras del hipogloso (NMH) se
identificaron mediante su activación antidrómica del nervio XII y
mediante la prueba de colisión (González-Forero
et al., 2004; Sunico et al., 2005). Las señales
eléctricas se amplificaron y filtraron a un ancho de banda de 10
Hz-10 kHz para su visualización y digitalización.
Las NMH se registraron en condiciones basales (ET_{CO2}=
4,8-5,2%). Los registros electromiográficos,
actividad de descarga unitaria, porcentajes de CO_{2} y O_{2}
espirado y la presión arterial se amplificaron, filtraron y
guardaron en un ordenador usando la interfaz PowerLab/8SP A/D
(ADInstruments, Castle Hill, Australia) para el análisis
off-line.
El nervio XII derecho se expuso y transeccionó
en la bifurcación en ratas control o con lesiones homolaterales
anestesiada (como se ha indicado anteriormente, Fig. 1B). El muñón
proximal del nervio se sumergió primero en agua destilada durante
10 min y después en 5 \mul de una solución con 4% del marcador
retrógrado metanosulfonato de aminoestilbamidina (FluoroGold (FG);
Molecular Probes, Eugene, OR) en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) durante 90 min. Por último, el muñón del nervio se
lavó abundantemente con solución salina. La incisión se suturó y
limpió como se ha indicado anteriormente. Una semana después de la
cirugía, se anestesió a las ratas, se les inyectó heparina
intraventricularmente y se perfundió por vía transcardíaca primero
con PBS y después con una solución de paraformaldehído al 4% en
tampón fosfato 0,1M (PB), a pH 7,4 y a 4ºC. Se extrajeron los
cerebros y se fijaron posteriormente durante 2 h en la misma
solución de fijación y se crioprotegieron mediante inmersión
durante toda la noche en sacarosa al 30% en PB a 4ºC. Se obtuvieron
tres series de secciones coronales (de 30 \mum de espesor) del
tronco encefálico usando un criostato y se almacenaron a -20ºC en
una solución crioprotectora (glicerol:PBS, pH 7,4, 1:1 en volumen).
Como último punto, las secciones se lavaron con PBS y se montaron
en portas con una solución con galato de propilo (0,1 mM en
PBS:glicerol 1:9). Las secciones de tejido se analizaron usando un
microscopio BX60 (Olympus) y las imágenes se adquirieron usando una
cámara digital (DP10, Olympus). Las tres series por animal se
analizaron para obtener el número de neuronas positivas a FG por
serie. Como valor representativo para cada animal se tomó el valor
medio de las tres series.
Para estudiar el impacto del NO producido por
diferentes fuentes enzimáticas sobre la recuperación del nervio se
administró (i.p) diariamente a las ratas lesionadas el inhibidor de
amplio espectro de la NOS, éster metílico de
N^{\omega}-nitro-L-arginina
(L-NAME, 90 mg/kg/d, Sigma), el estereoisómero
inactivo D-NAME (90 mg/kg/d, Sigma), los
inhibidores relativamente específicos de la nNOS,
7-nitroindazol (7-NI, 30 mg/kg/d,
Sigma), para iNOS, aminoguanidina (AG, 100 mg/kg/d, Sigma), para
eNOS, L-N
(5)-(l-iminoetil)ornitina
(L-NIO, 20 mg/kg/d, Tocris) o
7-NI+AG, comenzando el día en que tuvo lugar el
aplastamiento del nervio. La dosis inyectada de
L-NAME produjo un incremento transitorio de la
presión sanguínea arterial que retornó a los valores control 6 h
después de la inyección. Los niveles de nNOS y eNOS cerebrales,
medidos mediante western blotting, permanecieron como en los
animales control tras el tratamiento crónico con
L-NAME (Moreno-López et al.,
2004). Las perfusiones y sesiones de registros se llevaron a cabo al
menos 18 h tras la última inyección de los fármacos.
Se aplicó un vector adenoviral recombinante que
dirige la expresión de una forma mutante truncada de eNOS (TeNOS)
(de SEQ ID NO 4) en el nervio XII para inhibir crónicamente la
actividad de la eNOS endógena (Lee CM. et al. (1995).
Oligomerization of endothelial nitric oxide synthase. Evidence for a
dominant negative effect of truncation mutants. J Biol Chem
270(46):27403-27406; Kantor DB. et al.
(1996). A role for endothelial NO synthase in LTP revealed by
adenovirus- mediated inhibition and rescue. Science
274:1744-1748; Paton JFR et al. (2001).
Adenoviral vector demonstrates that angiotensín
II-induced depression of the cardiac baroreflex is
mediated by endothelial nitric oxide synthase in the nucleus
tractus solitarii of the rat. J Physiol (Lond)
531:445-458; 2002; Waki H. et al. (2003). Chronic
inhibition of endothelial nitric oxide synthase activity in nucleus
tractus solitarii enhances baroreceptor reflex in conscious rats. J
Physiol (Lond) 546.1:233-242; Waki H. et al. (2006).
Endothelial NO synthase activity in nucleus tractus solitarii
contributes to hypertension in spontaneously hypertensive rats.
Hypertension 48(4):644-650).
Ad-TeNOS (2,2 x 10^{10} ufp/ml) es un vector
adenoviral que carece de capacidad de replicación, que expresa
TeNOS bajo el control del promotor del citomegalovirus humano
(hCMV). TeNOS carece de actividad catalítica y actúa como inhibidor
dominante negativo de la actividad eNOS normal mediante
heterodimerización con la proteína nativa (Lee et al., 1995).
Como control de los efectos virales no específicos se utilizó el
vector Ad-eGFP (4.56 x 10^{10} ufp/ml) que dirige
la expresión de la proteína fluorescente verde potenciada (eGFP)
bajo el control del hCMV.
Para la inyección intraneural, las ratas fueron
anestesiadas y se expuso quirúrgicamente el nervio XII derecho.
Micropipetas de vidrio con extremos rotos de alrededor de 50 \mum
se cargaron con una solución de 3 \mul con uno de los dos
vectores. Las micropipetas se desplazaron a través del perineurio a
lo largo del eje del nervio con un micromanipulador a
2-4 mm en posición proximal al punto de
ramificación. La microinyección intraneural de la solución se
realizó lentamente durante un periodo de 5 min guiada por un
sistema de tubos cargados de aceite conectados a una jeringa
Hamilton. Durante la inyección se aplicó al nervio una suave
contratracción. A continuación, en la misma sesión quirúrgica el
nervio fue aplastado en la bifurcación o a 10 mm en posición
proximal a la misma. A diferentes puntos de tiempo tras la
microinyección del adenovirus y el aplastamiento del nervio se
utilizaron los animales para el registro de los PAMC o los
protocolos de seguimiento con FG.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En primer lugar se caracterizó la eficacia del
procedimiento de aplastamiento del nervio por medio de los
registros electromiográficos de los PAMC evocados en el músculo
geniogloso mediante estimulación eléctrica del nervio XII. El área y
la latencia de la onda evocada se tomaron como índices de la
eficacia de la transmisión neuromuscular. En los animales control,
los PAMC evocados mediante estimulación de los nervios derecho o
izquierdo, fueron bifásicos, con una gran onda negativa (latencia:
2,5 \pm 0,04 ms) seguida por una onda pequeña positiva (Fig. 2A).
En todos los registros realizados una semana después de la lesión
por aplastamiento del nervio no se pudieron evocar los PAMC, ni
usando estimulación supramáxima (<0,1 mA) del nervio dañado
(Fig. 2B). Al mismo tiempo, la respuesta ortodrómica evocada por
estimulación del nervio XII izquierdo intacto no fue diferente a la
de los animales control (Fig. 2B). Estos resultados indican que el
método empleado de lesión del nervio desensambló de un modo eficaz
la mayoría de las unidades motoras. El día 15, se pusieron de
manifiesto signos sutiles del reestablecimiento de la conexión
neuromuscular, registrándose PAMC de menor amplitud y mayor
latencia (\Deltalatencia: 4,7\pm0,6 ms) mediante estimulación
del nervio dañado en comparación con el evocado por estimulación
del nervio intacto (Fig. 2C). Los potenciales registrados fueron
postsinápticos y no estaban contaminados por la señal de descarga
aferente, ya que pudieron eliminarse por completo mediante
inyección intramuscular de un bloqueante de los receptores de
acetilcolina (trietioduro de galamina; 3 mg/kg, im; trazos de color
gris en la Fig. 2C). Además, los PMAC registrados a los 15 y 22
días de la lesión fueron polifásicos con un número variable de
picos negativos (Fig. 2C, D), que podrían ser principalmente una
consecuencia de la llegada asíncrona de potenciales de acción
presinápticos a través de los axones con velocidades de conducción
irregulares. A tiempos posteriores se observó una lenta y
progresiva recuperación de los PAMC hacia los valores control (Fig.
2E, F). Un mes después de la lesión, la recuperación de los PAMC
era casi completa aunque todavía era evidente una leve diferencia en
la latencia de la respuesta (Fig. 2E), que también permaneció en el
último punto de tiempo analizado (45 días después de la lesión.
Fig. 2F). De estos experimentos se concluyó que en este modelo de
lesión por aplastamiento del nervio XII existe un periodo de al
menos una semana durante la cual se alcanza una interrupción
completa de la conectividad neuromuscular. Durante la
re-inervación, la mayoría de los parámetros de PAMC
se recuperaron progresivamente en paralelo con el estrechamiento
del intervalo de velocidades de conducción axonal. El tiempo
relativamente corto requerido para la recuperación completa de la
función neuromuscular tras el aplastamiento del nervio hace que
este modelo sea particularmente adecuado para estudiar
acontecimientos moleculares que subyacen a los procesos
degenerativos y regenerativos tras la lesión del nervio
periférico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Dado que varias fuentes enzimáticas de NO se
sobre-expresan en el nervio una vez que este ha
sido dañado (González-Hernández et al. 1999)
se abordó la hipótesis de que el NO puede estar afectando a los
procesos de restauración que se producen en los nervios de
mamíferos adultos tras el daño de un nervio periférico. En este
punto, estudiamos el curso temporal de la recuperación de los PAMC
tras la administración diaria crónica del inhibidor de la NOS de
amplio espectro L-NAME, comenzando el mismo día de
la lesión por aplastamiento del nervio. En todos los experimentos
realizados 1 y 3 días después de la lesión, los PAMC estaban
completamente ausentes, incluso después de la estimulación
supramáxima del nervio lesionado en ambos grupos, el tratado con
solución salina y el tratado con L-NAME. No
obstante, una semana después el tratamiento con el inhibidor de la
NOS se evocaron potenciales polifásicos de larga latencia mediante
estimulación del nervio (Fig. 3A). El área de PAMC representó el
26,1 \pm 0,89% en relación con la de los animales control
(intactos) (100 \pm 17,5%, Fig. 3B). Asimismo, la primera onda
negativa apareció a una latencia más prolongada en comparación con
la evocada mediante estimulación del nervio contralateral intacto
(\Deltalatencia D: 6,72 \pm 0,57 ms; comparado con el
\Deltalatencia: 0,03 \pm 0,08 ms en animales intactos; Fig. 3C).
No obstante, a pesar de la aceleración de la
re-inervación muscular mediante
L-NAME, no condujo a una mejora en la recuperación
del área de los PMAC en los puntos de tiempo posteriores estudiados
(Fig. 2A, B). El área y la latencia de los PMAC 15 días después de
la lesión no presentaron una diferencia significativa entre los
grupos tratados con solución salina (área: 19,2 \pm 1,3%;
\Deltalatencia: 4,3 \pm 0,6 ms) y tratados con
L-NAME (área: 34.6 \pm 15.4%; \Deltalatencia:
3,2 \pm 0,6 ms; Fig. 3B, C). El perfil bifásico característico
del PMAC se recuperó por completo 30 y 45 días después del
aplastamiento del nervio en ambos grupos (Fig. 3A), pero el área del
potencial muscular ortodrómico (22,7 \pm 9,1% y 13,4 \pm 6,1%,
respectivamente) permaneció significativamente reducido en el grupo
tratado con L-NAME en comparación con el grupo
tratado con solución salina (54,5 \pm 8,9% y 91,6 \pm 38,8%;
Fig. 3B). En resumen, aunque la inhibición crónica de la síntesis de
NO aceleró el comienzo de la re-inervación muscular
tras la lesión del nervio, la inhibición prolongada de la NOS
deterioró el reestablecimiento o la eficacia de las unidades
motoras establecidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Como se ha descrito previamente, la acción
crónica del NO incrementa la excitabilidad de las NMH
(González-Forero et al., 2007), mientras que
se sabe que la estimulación eléctrica de los axones lesionados
acelera el índice de crecimiento axonal Al-Majed
et al., 2000; Brushart et al., 2002). Por tanto, se
analizó si la inhibición crónica de la NOS podría acelerar la
re-inervación muscular mediante un incremento en el
índice de descarga de las neuronas motoras. Las características de
disparo unitario de las NMH se registraron en condiciones basales
(ET_{CO2}=4,8-5,2%) en animales descerebrados y
vagotomizados bajo bloqueo neuromuscular. La mayoría de las NMH
generan brotes de potenciales de acción que coinciden con la
inspiración (Hwang JC. et al. (1983). Characterization of
respiratory-modulated activities of hypoglossal
motoneurons. J Appl Physiol 55:793-798), incluso
tras la descerebración, la vagotomía y la administración de un
bloqueante neuromuscular (González-Forero et
al., 2004; Fig. 4A). Se midieron el número de potenciales de
acción (SB) y la frecuencia media de disparo (mFR) por borte y se
obtuvo la media usando un mínimo de 30 brotes por neurona motora
para caracterizar la actividad basal del NH a diferentes puntos de
tiempo tras la lesión. En los controles, la mFR fue 35,2 \pm 2,9
pa/s (n=41) y la media de SB fue de 14,7 \pm 1,4 pa/brotes (Fig.
4B, C).
En el punto de tiempo más temprano estudiado, 3
días después de la lesión del nervio, los parámetros de descarga se
redujeron de forma significativa; este efecto persistió también
tras 7 y 15 días (Fig. 4). Este cambio en la actividad neuronal no
se puedo evitar mediante el tratamiento crónico con
L-NAME (Fig. 4). En consecuencia, la actividad
basal de las NMH tras el aplastamiento del nervio permaneció
significativamente reducida en el grupo tratado con
L-NAME en relación con la situación control a los 3
(SB: 59,2 \pm 4,1%; mFR: 74,1 \pm 5,4%; n=32), 7 (SB: 57,1
\pm 6,8%; mFR: 51,4 \pm 5,1%; n=36) y 15 (SB: 46,3 \pm 4,8%;
mFR: 39,2 \pm 3,1%; n=34) días desde la lesión. Se produjeron
cambios similares en animales lesionados sin tratar (Fig. 4). Se
concluyó que el efecto del L-NAME sobre la
re-inervación muscular es independiente de una mayor
actividad de disparo, a largo plazo del conjunto de
motoneuronas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Como se ha demostrado antes, la administración
crónica del inhibidor de amplio espectro de la NOS,
L-NAME, aceleró el comienzo de la recuperación de la
función neuromuscular y tuvo como resultado un PAMC evidente a los
7 días de la lesión. Sin embargo, tras la administración del
estereoisómero inactivo D-NAME no se registró un
PAMC en el músculo geniogloso 7 días después de la agresión al
nervio (Fig. 5A). Se observó un resultado similar cuando se
administraron diariamente inhibidores relativamente específicos de
la nNOS (7-NI) o iNOS (AG; Fig. 5A), lo que indica
que los efectos positivos de L-NAME no se debieron a
la inhibición de la síntesis de NO por neuronas motoras (nNOS) o
macrófagos (iNOS), al menos en cuanto a lo que se refiere al
comienzo de la re-inervación muscular. Por el
contrario, la administración crónica del inhibidor relativamente
específico de la eNOS, L-NIO, tuvo como resultado
una recuperación parcial en el área (24,8 \pm 7,3%; Fig. 5B) y la
latencia (\Deltalatencia: 2,2 \pm 0,02 ms; Fig. 5C) del PAMC
evocado. Además, el PAMC registrado tras L-NIO
mostró un perfil correspondiente a una onda bifásica (Fig. 5A). En
conjunto, estos resultados indican que el NO sintetizado
principalmente por la isoforma endotelial de la NOS retrasa la
re-inervación muscular.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La acción negativa del NO endógeno sobre la
re-inervación muscular funcional podría ser la
consecuencia de un crecimiento axonal más lento, del deterioro en el
reestablecimiento y/o en la maduración de nuevos contactos
neuromusculares. Para analizar un posible control negativo mediado
por el NO sobre el índice de regeneración axonal tras la lesión del
nervio, se cuantificó el número de NMH que extendieron sus axones a
una distancia de 10 mm dentro de un determinado intervalo temporal
(Fig. 1B). Para ello se procedió a la transección (T) del nervio XII
y su inmersión en una solución que contenía el marcador retrógrado
de FG. En estas condiciones, sólo se identificaron como positivas
para FG las neuronas motoras cuyos axones hubieran alcanzado la
bifurcación (10 mm distal al punto de la lesión; Fig. 1B). En los
animales control (no lesionadas previamente), las neuronas motoras
marcadas con FG aparecieron ampliamente distribuidas por todo el NH
(Fig. 6A). El número de NMH identificadas fue de 1435,7 \pm 68,6
(Fig. 6G). Cuando se realizó la aplicación del FG el mismo día de
la lesión por aplastamiento no se detectaron neuronas positivas
para FG, lo que ilustra la eficacia del aplastamiento del nervio
(Fig. 6B, G). Un día después de la lesión sólo unos pocos axones
cubrieron la distancia en los animales tratados con solución salina
(29,4 \pm 12,1 NMH; Fig. 6G). El número de neuronas marcadas
aumentó sustancialmente 2 días después (Fig. 6C, G) y no fue
significativamente diferente en comparación con el control 3 días
después de la lesión (1179,9 \pm 58,6 NMH; Fig. 6G). El número de
NMH marcadas de forma retrógrada cuando se administró FG 7 días
después del aplastamiento del nervio no fue diferente al observado
en los controles (1363,1 \pm 43,8 NMH; Fig. 6E, G). Por tanto,
este tipo de lesión no indujo una muerte significativa de neuronas
motoras.
A continuación, se estudió el efecto del
tratamiento crónico con L-NAME sobre la
recuperación axonal. Aunque un día después de la lesión la cantidad
de neuronas marcadas de forma retrógrada no se vio
significativamente alterada por la administración del inhibidor de
la NOS (112,5 \pm 37,3 NMH), al segundo día el número de unidades
positivas para FG fue \sim2,3 veces superior en las ratas tratadas
con L-NAME (1241,7 \pm 58,6 NMH) en relación con
el grupo tratado con solución salina (545,2 \pm 87,3 NMH; Fig.
6D, G). Las diferencias disminuyeron a los 3 días de la lesión,
coincidiendo con la recuperación en el grupo tratado con solución
salina y al 7º día los recuentos en ambos grupos fueron muy
cercanos, lo que indica que la administración crónica de
L-NAME no comprometía la viabilidad de las NMH. A
continuación, se aplicaron inhibidores de la NOS específicos de
isoforma y, según los resultados previos, se evaluaron los efectos
dos días después de la lesión del nervio, cuando el efecto del
L-NAME era más importante (Fig. 6G). El
estereoisómero inactivo D-NAME no afectó al índice
de regeneración axonal y el número de neuronas marcadas fue similar
al observado en el grupo tratado con solución salina (Fig. 6H). De
igual forma, la administración de los inhibidores de la nNOS
(7-NI) o iNOS (AG) no tuvieron ningún efecto
estadísticamente significativo comparado con lo observado en el
grupo tratado con solución salina (Fig. 6H). A continuación, se
analizó la combinación de 7-NI y AG, pero también se
comprobó que era ineficaz (Fig. 6H). Por otro lado, la inhibición
de la eNOS por L-NIO aumentó de forma significativa
la cantidad de neuronas marcadas con FG (1031,6 \pm 35,3 NMH;
Fig. 6H). En conjunto, estos resultados demostraron que el NO
sintetizado de forma endógena de origen endotelial retrasa la
regeneración axonal después de la lesión del nervio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Dado que la administración sistémica de fármacos
podría inducir efectos secundarios generalizados e indeseados que
complicarían la interpretación de los resultados y limitarían su
uso como herramientas terapéuticas, a continuación se utilizó un
vector adenoviral para inhibir la actividad local de la eNOS dentro
del nervio dañado. El día de la lesión se aplicó una única
inyección intraneural de 3 \mul de una suspensión vira) de
Ad-eGFP o Ad-TeNOS. Tras varios
intervalos de tiempo ninguna NMH expresó eGFP en su soma, lo que
indica que el adenovirus permanecía en el nervio y no se había
transportado retrógradamente. Esto excluyó la posibilidad de una
acción central de la proteína expresada en el vector.
La inhibición de la eNOS por
Ad-TeNOS aceleró el comienzo de la
re-inervación neuromuscular. Siete días después de
la lesión por aplastamiento y la transducción viral, las
propiedades del PAMC registrado fueron similares a las obtenidas
tras la administración de L-NIO, es decir estaban
representadas por un potencial bifásico de latencia prolongada
(Fig. 7, D, E; compárese con la Fig. 5A). A los 15 días de la
lesión, también se observó cierto grado de recuperación de PAMC tras
la administración de Ad-eGFP (área: 3,9 \pm 0,6%;
\Deltalatencia: 7,1 \pm 1,1 ms). No obstante, el área de PAMC y
la latencia tras el tratamiento con Ad-TeNOS mejoró
significativamente, lo que indica una aceleración de la reconexión
neuromuscular (área: 28,8 \pm 1,9%; \Deltalatencia: 2,6 \pm
0,9 ms; Fig. 7C, D). Es importante el hecho de que 22 días después
del aplastamiento del nervio, el área del PAMC alcanzó valores
similares a los observados en los animales control (Fig. 7B, D). Por
lo tanto, se alcanzó la recuperación funcional una semana antes que
en los animales dañados tratados con solución salina (Fig. 3B),
aunque la latencia de la onda fue mayor (\Deltalatencia: 1,9
\pm 0,4 ms) que en el grupo control. La estabilidad de la
recuperación se confirmó con los resultados obtenidos de animales
estudiados 62 días después de la lesión del nervio y la
administración de Ad-TeNOS (área: 95,2 \pm 17,3%;
\Deltalatencia: 0,3 \pm 0,2 ms). Estos resultados demostraron
que una única inyección intraneural de Ad-TeNOS
acelera de forma eficaz la recuperación funcional de la unión
neuromuscular tras una lesión nerviosa.
Además, el índice de regeneración axonal también
aumentó con la administración de Ad-TeNOS en
comparación con el grupo tratado con Ad-eGFP (Fig. 7
F-H). Esto se puso de manifiesto por el hecho de
que el número de neuronas motoras marcadas de forma retrógrada tras
el marcaje con FG dos días después del aplastamiento del nervio y
la inyección intraneural de Ad-eGFP (797.3\pm20.6
NMH) fue significativamente menor que el observado después del
tratamiento con Ad-TeNOS (1120,0 \pm 69,9 NMH). El
número de NMH marcadas de forma retrógrada 7 días después de la
lesión en ratas a las que se inyectó Ad-TeNOS fue
similar al observado en los controles (1584,0 \pm 31,6), lo que
ilustra que la administración adenoviral no afectó a la viabilidad
de las neuronas motoras. En consecuencia, se concluyó que la
inhibición de la eNOS local con Ad-TeNOS acelera la
recuperación de la función neuromuscular, que se acompaña por la
aceleración de la regeneración axonal.
<110> Universidad de Cádiz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE INHIBIDORES DE eNOS EN
REGENERACIÓN NERVIOSA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 029/08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos del gen que
codifica para la isoforma eNOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cDNA que codifica para
el mRNA que da lugar a la proteína eNOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> siRNA de eNOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de DNA que expresa para
una proteína truncada con función dominante negativa de la eNOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 2076
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de DNA que expresa para
una proteína truncada con función dominante negativa de la eNOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
Claims (10)
1. Uso de un inhibidor de la actividad y/o
expresión de eNOS seleccionado entre i) una molécula de ARN
interferente dirigida contra el ARNm que codifica para la proteína
eNOS y ii) una molécula de ADN, que codifica para una forma
truncada mutante dominante negativo de la proteína eNOS, inserta en
un sistema de expresión heterólogo, en la preparación de un
medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de nervios
periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho
tratamiento.
2. Uso de un inhibidor, según la reivindicación
1, donde la molécula de ARN interferente (i) tiene la secuencia SEQ
ID NO 3.
3. Uso de un inhibidor, según la reivindicación
1, donde la molécula de ADN (ii) se selecciona entre SEQ ID NO 4 y
SEQ ID NO 5.
4. Uso de un inhibidor, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde el medicamento se
administra mediante inyección intraneural.
5. Uso de un vector de expresión que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica para un inhibidor de la
actividad y/o expresión de eNOS, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la preparación de un
medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de nervios
periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho
tratamiento.
6. Uso de un vector, según la reivindicación 5,
donde el vector es plasmídico y/o vírico.
7. Uso de un vector, según la reivindicación 6,
donde el vector es lentiviral o adenoviral.
8. Uso de un vector, según la reivindicación 7,
donde dicho vector es un vector recombinante adenoviral que
comprende una molécula de ADN que codifica para una forma truncada
mutante dominante negativa de la proteína eNOS.
9. Uso de un vector, según la reivindicación 8,
donde el medicamento se administra mediante una única inyección
intraneural.
10. Método para identificar agentes aceleradores
de la regeneración en nervios periféricos que comprende: a) poner
en contacto el agente a ensayar con eNOS y b) determinar si el
agente a ensayar inhibe la actividad y/o expresión de eNOS.
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US20020077283A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-06-20 | Sessa William C. | Caveolin peptides and their use as therapeutics |
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2009
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