ES2332181T3

ES2332181T3 - Promotor de metalotioneina 2 de maiz y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2332181T3
Application number: ES04815482T
Authority: ES
Inventors: Scott Diehn; Albert Lu; Kim Ward
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2010-01-28
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: WO2005063998A2; EP1697516A2; ATE478954T1; DE602004023229D1; EP1699931B1; AR047348A1; EP1697516B1; AR047166A1; WO2005063997A3; BRPI0418019A; WO2005063997A2; CA2551023A1; US7214854B2; WO2005063998A3; BRPI0418025A; EP1699931A2; US20050177898A1; DE602004028864D1; CA2551024A1; ATE443149T1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia promotora vegetal del plásmido depositado como Depósito de Patente Núm. NRRL B-30793; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; y, d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta.

Description

Promotor de metalotioneína 2 de maíz y métodos de uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más concretamente a la regulación de la expresión génica en plantas.

Antecedentes de la invención

La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un anfitrión vegetal depende de la presencia de un promotor conectado operablemente que es funcional dentro del anfitrión vegetal. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde se expresa la secuencia de ADN heteróloga dentro del organismo. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se pueden utilizar los promotores preferidos por el tejido. Cuando se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. En contraste, cuando se desea la expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas abajo de la secuencia promotora núcleo en los constructos de expresión de los vectores de transformación para ocasionar niveles de expresión variables de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.

Frecuentemente es deseable expresar una secuencia de ADN en tejidos u órganos concretos de una planta. Por ejemplo, se podría lograr un aumento de la resistencia de una planta a la infección por patógenos contenidos por el suelo y el aire por medio de la manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un promotor preferido por el tejido conectado operablemente a un gen de resistencia al patógeno heterólogo de manera que se produzcan proteínas de resistencia al patógeno en el tejido vegetal deseado.

Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa en un tejido de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, semejante inhibición se podría lograr con la transformación de la planta para que comprenda un promotor preferido del tejido conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de manera que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcrito de ARN que interfiera en la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa.

Hasta ahora, la regulación de la expresión génica en las raíces de las plantas no se ha estudiado adecuadamente a pesar de la importancia de la raíz para el desarrollo de la planta. Hasta cierto punto esto es atribuible a la escasez de funciones bioquímicas específicas de la raíz, fácilmente asequibles cuyos genes puedan ser clonados, estudiados, y manipulados. Alterar genéticamente las plantas por medio del uso de técnicas de ingeniería genética y producir de este modo una planta con rasgos útiles requiere la disponibilidad de una variedad de promotores. Una acumulación de promotores permitiría al investigador diseñar moléculas de ADN recombinante que sean susceptibles de ser expresadas a niveles y en localizaciones celulares deseados. Por lo tanto, una colección de promotores preferidos por el tejido permitiría expresar un nuevo rasgo en el tejido deseado. Diversos genes han sido descritos por Takahashi et al. (1991) Plant J. 1:327-332; Takahashi et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8013-8016; Hertig et al. (1991) Plant Mol Biol. 16:171-174; Xu et al. (1995) Plant Mol Biol. 27:237-248; Capone et al. (1994) Plant Mol Biol. 25:681-691; Masuda et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40(11):1177-81; Luschnig et al. (1998) Genes Dev. 12(14):2175-87; Goddemeier et al. (1998) Plant Mol Biol. 36(5):799-802; and Yamamoto et al. (1991) Plant Cell. 3(4):371-82 que se expresan preferentemente en tejidos de raíces de plantas.

Las metalotioneínas (MT) son proteínas o polipéptidos que se unen y secuestran formas iónicas de ciertos metales en tejidos de plantas y animales. Los ejemplos de tales metales incluyen cobre, zinc, cadmio, mercurio, oro, plata, cobalto, níquel y bismuto. Los metales específicos secuestrados por las MT varían para las proteínas/polipéptidos estructuralmente distintos que existen en los diferentes organismos. Las plantas parecen contener una diversidad de MT de unión a metales con el potencial de representar papeles distintos en el metabolismo de diferentes iones metálicos. En las plantas, se sugiere que las MT tienen papeles en la acumulación de metales, la intoxicación por metales, y la embriogénesis (Thomas et al. (2003) Biotechnol. Prog. 19:273-280; Dong y Dunstan (1996) Planta 199:459-466; Kawashima et al. (1992) Eur. J. Biochem. 209:971-976).

Típicamente, las MT y las proteínas de tipo MT son proteínas ricas en Cys que se caracterizan por la presencia de motivos Cys-Xaa-Cys que sugieren una capacidad de unión a iones metálicos. Se han propuesto categorías adicionales de proteína de tipo MT basándose en las localizaciones pronosticadas de los restos Cys y se han denominado tipo 1 y 2. En el tipo 1 existen exclusivamente motivos Cys-Xaa-Cys, mientras en el tipo 2 existe Cys-Cys y un par Cys-Xaa-Xaa-Cys en el dominio N terminal. El motivo de tipo 1 ha sido implicado en la unión y secuestro de cobre. (Murphy et al. (1997) Plant Physiol. 113:1293-1301 and Carr et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:31237-31242).

Se han aislado diferentes genes de tipo metalotioneína, incluyendo los de guisante, maíz, cebada, Mimulus (mímulo), soja, higuera del diablo y Arabidopsis. Véase Robinson et al. (1993) Biochem J. 295: 1-10. Se ha informado de que se han aislado secuencias expresadas en raíces de guisante, como describen Evans et al. (1990) FEBS Lett 262:29-32. Se ha descrito un gen de MT de raíz de maíz en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.466.785; aunque esta secuencia también es expresada en hojas, corteza blanca y semillas, como describe de Framond (1991) FEBS Lett 290:103-106.

De este modo, el aislamiento y la caracterización de promotores preferidos por los tejidos, concretamente preferidos por la raíz, que pueden servir como regiones reguladoras para la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas de interés de una manera preferida por el tejido, son necesarios para la manipulación genética de las plantas.

Compendio de la invención

Se proporcionan las composiciones y métodos para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés en una planta o célula vegetal. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para promotores que inician la transcripción. Las realizaciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 o uno de sus complementos, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia del promotor vegetal del plásmido depositado como Núm. de Depósito de Patente NRRL B-30793 o uno de sus complementos, una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal, y una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en la célula de la raíz de la planta.

Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta o célula vegetal. El método comprende introducir en una planta o una célula vegetal una casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés conectada operablemente a uno de los promotores de la presente invención. De esta manera, las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente. En métodos específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa de una manera preferida por la raíz.

Adicionalmente se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés de una manera preferida por la raíz en una planta. El método comprende introducir en una célula vegetal una casete de expresión que comprende un promotor de la invención conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.

La expresión de la secuencia de nucleótidos de interés puede proporcionar la modificación del fenotipo de la planta. Semejante modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en cuanto a la cantidad, la distribución relativa, o similar, o la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una función o producto novedosos en la planta. En métodos y composiciones específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, y/o alteración de la tolerancia a la sal, el frío, o la sequía.

Se proporcionan las casetes de expresión que comprenden las secuencias promotoras de la invención conectadas operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Adicionalmente se proporcionan células vegetales transformadas, tejidos vegetales, semillas, y plantas.

Descripción detallada de la invención

La invención hace referencia a composiciones y métodos dirigidos a promotores vegetales y los métodos para su uso. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos para la región promotora del gen de la metalotioneína (MT). Las composiciones comprenden adicionalmente constructos de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos para la región promotora del gen de la metalotioneína 1 (MT2) conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden: (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1; (b) la secuencia promotora vegetal depositada en anfitriones bacterianos como Depósito de Patente Núm. NRRL B-30793, el 1 de Diciembre de 2004; (c) un fragmento de al menos 900 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; o (d) una secuencia variante que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta.

Los plásmidos que contenían las secuencias de nucleótidos promotoras vegetales de la invención fueron depositados el 1 de Diciembre de 2004 en el Depósito de Patente de la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola del Centro Nacional para la Investigación de la Utilización Agrícola, en 1815 N. University Street, Peoria, IL, 61604, y se les asignó el Núm. de Depósito de Patente NRRL B-30793. Este depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento de Patentes. Este depósito se realizó simplemente por conveniencia para los expertos en la técnica y no se reconoce que se requiera un depósito en 35 U.S.C. \NAK112. El depósito estará disponible al público irrevocablemente y sin restricción o condiciones tras la presentación de la patente. No obstante, se debe entender que la disponibilidad del depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención sujeto en derogación de los derechos de patente garantizados por la acción del gobierno.

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Las secuencias promotoras de la MT2 de la presente invención incluyen constructos nucleotídicos que permiten el inicio de la transcripción en una planta. En realizaciones específicas, la secuencia promotora de MT2 permite el inicio de la transcripción de una manera preferida por un tejido, más concretamente preferida por la raíz. Tales constructos de la invención comprenden regiones de inicio de la transcripción reguladas asociadas con la regulación evolutiva de la planta. De este modo, las composiciones de la presente invención incluyen constructos de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos de interés conectada operablemente a un promotor vegetal, concretamente secuencias promotoras preferidas por la raíz para el gen de la MT2, más concretamente una secuencia promotora de la MT2 de maíz. La secuencia para la región promotora de la MT2 de maíz se muestra en el SEQ ID NO: 1.

Las composiciones de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos para el promotor de la MT2 nativa y sus fragmentos y variantes. Las secuencias promotoras de la invención son útiles para expresar secuencias. En realizaciones específicas, las secuencias promotoras de la invención son útiles para expresar secuencias de interés de una manera preferida por un tejido, concretamente preferida por la raíz. Las secuencias de nucleótidos de la invención también encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la posterior expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta de interés o como sondas para el aislamiento de otros promotores de tipo MT2.

Las secuencias promotoras de la metalotioneína relacionadas se describen en la Solicitud de los Estados Unidos Núm. 09/520.268 y en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/531.793 presentada el 22 de Diciembre de 2003, cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria como referencia. En particular, la presente invención proporciona constructos de ADN aislados que comprenden la secuencia de nucleótidos del promotor de la MT2 mostrada en el SEQ ID NO: 1 conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés.

La invención abarca composiciones de ácido nucleico esencialmente aisladas o purificadas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o una de sus porciones biológicamente activas, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de recombinación, o esencialmente libre de precursores químicos cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (óptimamente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modificaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. Las secuencias promotoras de la MT2 de la invención se pueden aislar de la región no traducida 5' que flanquea sus respectivos sitios de inicio de la transcripción.

Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos del promotor descrito también están incluidos en la presente invención. En particular, se pueden utilizar fragmentos y variantes de la secuencia del promotor de MT2 de SEQ ID NO: 1 en los constructos de la invención. Según se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento" hace referencia a una porción de la secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos de una secuencia del promotor de MT2 conservan la actividad biológica de inicio de la transcripción, más concretamente conducir la transcripción de una manera preferida por la raíz. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que pueden ser útiles como sondas de hibridación pueden no conservar necesariamente la actividad biológica.

Se puede preparar una porción biológicamente activa de un promotor de MT2 mediante aislamiento de una porción de la secuencia del promotor de MT2 de la invención, y evaluación de la actividad promotora de la porción. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos del promotor de MT2 comprenden al menos aproximadamente 900, 1000, 1100, 1200, 1300 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia del promotor de MT2 completo descrita en la presente memoria (por ejemplo, 1347 nucleótidos para el SEQ ID NO: 1).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "variantes" representa secuencias esencialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes de origen natural se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación esbozadas en la presente memoria.

Para las secuencias de nucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Según se utiliza en la presente memoria, una secuencia de nucleótidos "nativa" comprende una secuencia de nucleótidos de origen natural. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes de origen natural pueden ser identificadas mediante el uso de técnicas de la biología molecular bien conocidas, como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación esbozadas más abajo. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos obtenidas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes de una secuencia de nucleótidos concreta de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95% 96%, 97%, 98%, 99% o más con la secuencia de nucleótidos concreta determinada por los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otra parte de la presente memoria. Una variante biológicamente activa de una secuencia de nucleótidos de la invención puede diferir de esa secuencia en tan pocos como 1-15 restos de ácido nucleico, tan pocos como 1-10, por ejemplo 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 resto de ácido nucleico.

Las secuencias de nucleótidos variantes abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el barajado de ADN. Con semejante procedimiento, se pueden manipular una o más secuencias de nucleótidos de MT2 diferentes para el promotor para crear un nuevo promotor de MT2. De esta manera, se generan genotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia esencial y pueden ser recombinados homólogamente in vitro o in vivo. Las estrategias para semejante barajado de ADN son conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar las correspondientes secuencias de otros organismos, concretamente otras plantas, más concretamente otras monocotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación, y similares para identificar tales secuencias basadas en su homología de secuencia con las secuencias mostradas en la presente memoria. Las secuencias aisladas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias de MT2 completas mostradas en la presente memoria o con sus fragmentos están incluidas en la presente invención.

En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para su uso en reacciones de PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir de ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR son generalmente conocidos en la técnica y son descritos por Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York), en adelante Sambrook. Véanse también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no están limitados a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente desemparejados, y similares.

En las técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida se utiliza como sonda que hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonados de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como P^{32} o cualquier otro marcador detectable. De este modo, por ejemplo, se pueden elaborar sondas para la hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias del promotor de MT2 de la invención. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de genotecas genómicas son generalmente conocidos en la técnica y los describe Sambrook.

Por ejemplo, se puede utilizar la secuencia promotora de MT2 completa descrita en la presente memoria, o una o más de sus porciones, como sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias del promotor de MT2 y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias del promotor de MT2 y tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar las correspondientes secuencias del promotor de MT2 de una planta seleccionada mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado, o como análisis de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el escrutinio de hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placa (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York.).

La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo en condiciones restrictivas. Se pretende que el término "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" represente condiciones en las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (p. ej., al menos dos veces sobre el fondo). Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondeo de homólogos). Alternativamente, las condiciones de restricción se pueden ajustar para permitir cierto emparejamiento erróneo en las secuencias de manera que se detecten grados inferiores de similitud (sondeo de heterólogos). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, óptimamente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal es una concentración de ión Na menor de aproximadamente 1,5 M, típicamente una concentración de ión sodio de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otra sal) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para las sondas cortas (p. ej., 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (p. ej., mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones poco restrictivas ilustrativas incluyen hibridación con una solución tampón de formamida de 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37ºC, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55ºC. Las condiciones moderadamente restrictivas incluyen hibridación en formamida de 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55 a 60ºC. Las condiciones altamente restrictivas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado final en 0,1X SSC de 60 a 65ºC durante al menos 30 minutos. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será al menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la T_{m} (punto de fusión térmico) puede ser aproximada a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal Biochem. 138:267-284: T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina del ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T_{m} es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH definidos) a la cual el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La T_{m} se reduce aproximadamente 1ºC por cada 1% de emparejamiento erróneo; de este modo, la T_{m}, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca una identidad de \geq90%, la T_{m} se puede hacer disminuir 10ºC. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC más bajas que la T_{m} para una secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, en las condiciones severamente restrictivas se puede utilizar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3, o 4ºC menos que la T_{m}; en condiciones moderadamente restrictivas se pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9, o 10ºC menos que la T_{m}; en condiciones poco restrictivas se puede utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20ºC menos que la T_{m}. Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la T_{m} deseada, los expertos en la técnica comprenderán que las variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado de emparejamiento erróneo deseado da como resultado una T_{m} de menos de 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que se pueda utilizar una temperatura superior. Se encuentra una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase también Sambrook.

De este modo, las secuencias aisladas que tienen actividad promotora preferida por la raíz y que hibridan en condiciones restrictivas con las secuencias del promotor de MT2 descritas en la presente memoria, o con sus fragmentos, están incluidas en la presente invención.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial".

(a): Según se utiliza en la presente memoria, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como segmento de un ADNc o una secuencia génica completos, o el ADNc o secuencia génica completos.

(b): Según se utiliza en la presente memoria, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una elevada similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos se introduce típicamente una penalización de espacios y se resta del número de emparejamientos.

: Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. De este modo, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de alineamiento local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

: Las implementaciones por ordenador de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (asequible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA del Paquete de Soporte Lógico de GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (asequible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Los alineamientos que utilizan estos programas se pueden realizar empleando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL es descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede utilizar una tabla de restos por pesos PAM120, una penalización de la longitud del espacio de 12, y una penalización del espacio de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos con espacios con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como describen Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterativa que detecte las relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también se puede realizar manualmente mediante inspección.

: A menos que se establezca de otro modo, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente memoria hacen referencia al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 empleando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso de Espacio de 50 y un Peso de la Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un Peso de Espacio de 8 y un Peso de la Longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquiera de sus programas equivalentes. Por "programa equivalente" se quiere significar cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera un alineamiento que tiene emparejamientos de nucleótidos o restos aminoácido idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP Versión 10.

: GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de espacios y crea el alineamiento con el mayor número de bases emparejadas y los mínimos espacios. Esto permite la provisión de una penalización de creación de espacio y una penalización de extensión del espacio en unidades de bases emparejadas. GAP debe sacar provecho del número de penalización de creación de espacios de los emparejamientos para cada espacio que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión del espacio mayor de cero, GAP debe, además, sacar provecho para cada espacio insertado de la longitud de las veces del espacio la penalización de la extensión del espacio. Los valores de penalización de la creación de espacios por defecto y los valores de penalización de la extensión del espacio en la Versión 10 del Paquete de Soporte Lógico GCG Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalización de creación de espacios por defecto es 50 mientras la penalización de la extensión de espacios por defecto es 3. Las penalizaciones de creación de espacios y extensión de espacios se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste en 0 a 200. De este modo, por ejemplo, las penalizaciones de creación de espacio y extensión del espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayores.

: GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una calidad mejor. GAP presenta cuatro figuras de mérito para los alineamientos: Calidad, Proporción, Identidad, y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La proporción es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente se emparejan. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que hay al otro lado de los espacios se ignoran. Una similitud se puntúa cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación utilizada en la Versión 10 del Paquete de Soporte Lógico GCG Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

(c): Según se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos hace referencia a los restos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando se utiliza el porcentaje de identidad de la secuencia en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los restos aminoácido son sustituidos por otros restos aminoácido con propiedades químicas similares (p. ej., carga o carácter hidrófobo) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de la secuencia se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren en tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de completo, incrementando de ese modo el porcentaje de identidad de la secuencia. De este modo, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a la sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, p. ej., como un implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

(d): Según se utiliza en la presente memoria, "porcentaje de identidad de secuencia" representa el valor determinado comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales aparece la base de ácido nucleico o el resto aminoácido idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia.

(e): El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos representa un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, óptimamente al menos 80%, más óptimamente al menos 90%, y muy óptimamente al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineamiento descritos empleando parámetros convencionales.

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Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores a la T_{m} para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones restrictivas incluyen temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 20ºC más bajas que la T_{m}, dependiendo del grado de restricción deseado como se califica de otro modo en la presente memoria.

Según se utiliza en la presente memoria, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, agrupaciones vegetales, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, almendras, espigas, mazorcas, chalas, tallos, raíces, puntas de raíz, anteras, y similares. Se pretende que grano haga referencia a la semilla madura producida por los criadores comerciales con fines distintos del crecimiento o la reproducción de las especies. Progenie, variantes, y mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos
introducidos.

La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitadas a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de las especies de plantas incluyen maíz (Zea mays), Brassica sp. (p. ej., B. napus, B. rapa, B. juncea), concretamente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor; Sorghum vulgare), mijo (p. ej., mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), moha (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, hortalizas, ornamentales, y coníferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (p. ej., Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías de lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis), y melón (C. melo). Las ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo.

Las coníferas que se pueden emplear en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino Taeda (Pinus taeda), pino Elioti brasileño (Pinus elliotii), pino Ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta), y pino de Monterrey (Pinus radiata); pino de Oregón (Pseudotsuga menziesii); falso abeto del Canadá (Tsuga canadensis); abeto blanco (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como el abeto plateado (Abies amabilis) y el abeto balsámico (Abies balsamea); y los cedros tales como la tuya gigante (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras realizaciones, las plantas de maíz y soja son óptimas, y en otras realizaciones más las plantas de maíz son óptimas.

Otras plantas de interés incluyen plantas con grano que proporcionan semillas de interés, plantas con semillas oleosas, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas con semillas oleosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarroba, fenogreco, soja, judías, caupí, judía mung, judía de lima, haba, lentejas, garbanzos, etc.

Las secuencias codificantes heterólogas expresadas por los promotores de MT2 de la invención pueden ser utilizadas para variar el fenotipo de una planta. Los diversos cambios en el fenotipo son interesantes incluyendo la modificación de la expresión de un gen en una raíz de una planta, la alteración del mecanismo de defensa frente a patógenos o insectos de una planta, el aumento de la tolerancia de las plantas a herbicidas en una planta, la alteración del desarrollo de la raíz para responder al estrés medioambiental, la modulación de la respuesta de la planta a la sal, la temperatura (calor y frío), la sequía, y similares. Estos resultados se pueden lograr mediante la expresión de una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés que comprende un producto génico apropiado. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es una secuencia de una planta endógena cuyo nivel de expresión es incrementado en la planta o una parte de la planta. Alternativamente, los resultados se pueden lograr proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos génicos endógenos, concretamente enzimas, transportadores, o cofactores, o afectando a la absorción de nutrientes en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Las categorías generales de las secuencias de nucleótidos de interés para la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos genes implicados en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos implicados en la comunicación, tales como las quinasas, y aquellos implicados en el mantenimiento de la estructura (housekeeping), tales como las proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes en ingeniería agronómica, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, y resistencia al estrés medioambiental (alteración de la tolerancia al frío, la sal, la sequía, etc.). Se reconoce que cualquier gen de interés puede ser conectado operablemente al promotor de la invención y ser expresado en la planta.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que suponen un gran lastre para el rendimiento tal como el gusano de la raíz, agrotis, barrenador del maíz Europeo, y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de la proteína tóxica de Bacillus thuringiensis (Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); y similares.

Los genes que codifican rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de destoxificación, tales como los que destoxifican la fumonisina (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.792.931); los genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y similares.

Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (p. ej., el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a semejante resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (p. ej., el gen bar), glifosato (p. ej., el gen EPSPS y el gen GAT; véanse, por ejemplo, la Publicación de los Estados Unidos Núm. 20040082770 y el documento WO 03/092360) u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptII codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y los mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfuron.

La resistencia al glifosato es conferida por los genes de la 5-enoilpiruvil-3-fosfiquimato sintasa (EPSP) y aroA mutantes. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.940.835 de Shah et al., que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia al glifosato. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.627.061 de Barry et al. también se describen genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E; y 5.491.288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, que se incorporan en la presente memoria como referencia para este fin. La resistencia a glifosato también es conferida a plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxido-reductasa como se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.776.760 y 5.463.175, que se incorporan en la presente memoria como referencia para este fin. Además la resistencia al glifosato puede ser conferida a plantas mediante la expresión en exceso de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véase, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Núms. de Serie: 10/004,357; y 10/427,692.

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos de plantas así como aquellos de otras fuentes incluyendo procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares.

Los ejemplos de otros genes aplicables y su fenotipo asociado incluyen el gen que codifica la proteína de la envoltura y/o ARN viral, u otros genes virales o de plantas que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia fúngica; genes que promueven la mejora del rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como frío, deshidratación resultante de sequía, calor y salinidad, metales tóxicos o elementos vestigiales, o similares.

Como se observa, la secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente a los promotores de MT2 descritos en la presente memoria puede ser una secuencia antisentido para un gen elegido como diana. De este modo las secuencias promotoras descritas en la presente memoria pueden ser conectadas operablemente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la raíz de la planta.

"ARNi" hace referencia a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (Véase por ejemplo la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.506.559). Ahora se piensa que técnicas más antiguas referidas por otros nombres se basan en el mismo mecanismo, pero se les ha dado nombres diferentes en las publicaciones. Estas incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana, y "co-supresión" o "supresión efectora", que hacen referencia a transcritos de ARN efectores capaces de suprimir la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o esencialmente similares (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.231.020, incorporada en la presente memoria como referencia). Tales técnicas se basan en el uso de constructos dando como resultado la acumulación de ARN de doble hebra con una hebra complementaria al gen diana que se va a silenciar. Los promotores de MT2 de las realizaciones se pueden utilizar para conducir la expresión de constructos que dará como resultado el ARN de interferencia incluyendo los microARN y los siARN.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "promotor" o "región de inicio de la transcripción" representan una región reguladora del ADN que comprende normalmente una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II al inicio de la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante concreta. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento situadas generalmente aguas arriba o 5' con respecto a la caja TATA, referidos como elementos promotores aguas arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se reconoce que al haber identificado las secuencias de nucleótidos para las regiones promotoras descritas en la presente memoria, se encuentra en el estado de la técnica aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la región no traducida 5' aguas arriba de las regiones promotoras concretas identificadas en la presente memoria. Adicionalmente, se pueden proporcionar promotores quiméricos. Tales quimeras incluyen porciones de la secuencia promotora fusionadas a fragmentos y/o variantes de las regiones reguladoras transcripcionales heterólogas. De este modo, las regiones promotoras descritas en la presente memoria pueden comprender elementos reguladores aguas arriba tales como, aquellos responsables de la expresión en tejidos y temporal de la secuencia codificante, intensificadores y similares. De la misma manera, los elementos promotores, que permiten la expresión en el tejido deseado tal como la raíz, pueden ser identificados, aislados y utilizados con otros promotores núcleo para conferir una expresión preferida por la raíz. En este aspecto de la invención, se pretende que "promotor núcleo" represente un promotor sin elementos promotores.

En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" también hace referencia a ADN, normalmente, pero no siempre, aguas arriba (5') con respecto a la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que se inicie la transcripción en un sitio concreto. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio concreto es un elemento promotor. Un elemento promotor comprende un elemento promotor núcleo, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se comenta en otra parte en esta solicitud) que modifica la expresión del gen. Se debe entender que las secuencias de nucleótidos, localizadas dentro de intrones, o 3' con respecto a la secuencia de la región codificante también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de los intrones adecuados incluyen, pero no están limitados a, el intrón IVS6 de maíz, o el intrón de la actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos localizados aguas abajo (3') con respecto al sitio de inicio de la transcripción, o en regiones transcritas, o ambos. En el contexto de la presente invención un elemento regulador post-transcripcional puede incluir elementos que son activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo intensificadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, y determinantes de la estabilidad del ARNm.

Los elementos reguladores, o sus variantes o fragmentos, de la presente invención pueden estar asociados operativamente con elementos reguladores heterólogos o promotores con el fin de modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Semejante modulación incluye intensificar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo, modular los eventos post-transcripcionales, o intensificar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo y modular los eventos post-transcripcionales. Por ejemplo, se pueden asociar operativamente uno o más elementos reguladores, o sus fragmentos, de la presente invención con promotores constitutivos, inducibles, o específicos del tejido o uno de sus fragmentos, para modular la actividad de tales promotores en los tejidos deseados en las células de la planta.

Las secuencias reguladoras de la presente invención, o sus variantes o fragmentos, cuando están conectados operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés pueden conducir la expresión preferida por la raíz de la secuencia de nucleótidos heteróloga en la raíz (o una parte de la raíz) de la planta que expresa este constructo. El término "preferido por la raíz" significa que la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga es muy abundante en la raíz o una parte de la raíz, incluyendo, por ejemplo, la pilorriza, el meristemo apical, el protodermo, el meristemo fundamental, procambium, endodermis, córtex, córtex vascular, epidermis, y similares. Si bien se puede producir cierto nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga en otros tipos de tejidos de la planta, la expresión se produce más abundantemente en la raíz o una parte de la raíz, incluyendo las raíces primarias, laterales y
adventicias.

Una "secuencia de nucleótidos heteróloga" es una secuencia que no existe en la naturaleza con la secuencia promotora de la invención. Si bien esta secuencia de nucleótidos es heteróloga con respecto a la secuencia del promotor, puede ser homóloga, o nativa, o heteróloga, o foránea, con respecto al anfitrión vegetal.

Las secuencias promotoras aisladas de la presente invención pueden ser modificadas para proporcionar una gama de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. De este modo, se puede utilizar una región promotora incompleta y conservar la capacidad para conducir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés. Se admite que se pueden alterar los niveles de expresión del ARNm de diferentes maneras con deleciones de porciones de las secuencias promotoras. Los niveles de expresión del ARNm se pueden hacer disminuir, o alternativamente, se puede incrementar la expresión como resultado de deleciones en el promotor si, por ejemplo, existe un elemento regulador negativo (para un represor) que se separa durante el procedimiento de truncamiento. Generalmente, se utilizarán al menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia promotora aislada para conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos.

Se admite que para incrementar los niveles de transcripción, se pueden utilizar intensificadores combinados con las regiones promotoras de la invención. Los intensificadores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región promotora. Los intensificadores son conocidos en la técnica e incluyen la región intensificadora de SV40, el elemento intensificador 35S, y similares. También se sabe que algunos intensificadores alteran los patrones normales de expresión del promotor, por ejemplo, haciendo que un promotor sea expresado constitutivamente, cuando sin el intensificador, el mismo promotor es expresado solamente en un tejido específico o unos pocos tejidos específicos.

Las modificaciones de las secuencias promotoras aisladas de la presente invención pueden proporcionar un intervalo de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. De este modo, se pueden modificar para que sean promotores débiles o promotores fuertes. Generalmente, un "promotor débil" representa un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificante a un bajo nivel. Se pretende que un "bajo nivel" de expresión represente una expresión a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. Por el contrario, un promotor fuerte conduce la expresión de una secuencia codificante a un nivel elevado, o de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos.

Se admite que los promotores de la invención se pueden utilizar con sus secuencias codificantes de MT2 nativas para incrementar o disminuir la expresión, dando como resultado de ese modo un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Este cambio fenotípico podría afectar adicionalmente al incremento o disminución de los niveles de iones metálicos en tejidos de la planta transformada.

Las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención, así como sus variantes y fragmentos, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta. Las secuencias del promotor de MT2 son útiles en este aspecto cuando están conectadas operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión va a ser controlada para lograr una respuesta fenotípica deseada. El término "conectada operablemente" significa que la transcripción o traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. De esta manera, las secuencias de nucleótidos para los promotores de la invención pueden ser proporcionadas en casetes de expresión junto con las secuencias de nucleótidos heterólogas de interés para la expresión en la planta de interés, más concretamente para la expresión en la raíz de la planta.

Tales casetes de expresión comprenderán una región de inicio de la transcripción que comprende una de las secuencias de nucleótidos del promotor de la presente invención, o sus variantes o fragmentos, conectadas operablemente a la secuencia de nucleótidos heteróloga. Semejante casete de expresión puede ser proporcionada con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. La casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables así como regiones de terminación 3'.

La casete de expresión puede incluir, en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción (esto es, un promotor, o una de sus variantes o fragmentos, de la invención), una región de inicio de la traducción, una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo anfitrión. Las regiones reguladoras (esto es, promotores, regiones reguladoras de la transcripción, y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser nativos/análogos con respecto a la célula anfitriona o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser heterólogos con respecto a la célula anfitriona o entre sí. Según se utiliza en la presente memoria, "heteróloga" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, está esencialmente modificada a partir de su forma nativa en composición y/o locus genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor conectado operablemente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual derivaba el polinucleótido, o, si es de la misma/análoga especie, uno o ambos están esencialmente modificados a partir de su forma original y/o locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido conectado
operablemente.

Si bien puede ser preferible expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga utilizando los promotores de la invención, se pueden expresar las secuencias nativas. Tales constructos cambiarían los niveles de expresión de la proteína MT2 en la planta o célula vegetal. De este modo, el fenotipo de la planta o célula vegetal resulta alterado.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés conectada operablemente, puede ser nativa con el anfitrión vegetal, o puede derivar de otra fuente (esto es, foránea o heteróloga con respecto al promotor, siendo expresada la secuencia de ADN, el anfitrión vegetal, o cualquiera de sus combinaciones). Las regiones de terminación convenientes son asequibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa. Véanse también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res.
15:9627-9639.

La casete de expresión que comprende las secuencias de la presente invención también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen que va a ser co-transformado en el organismo. Alternativamente, se pueden proporcionar secuencias adicionales en la casete de expresión.

Cuando sea apropiado, las secuencias de nucleótidos cuya expresión va a estar bajo el control de la secuencia promotora preferida por la raíz de la presente invención y cualquiera de las secuencias de nucleótidos adicionales pueden ser optimizadas para aumentar la expresión en la planta transformada. Esto es, estas secuencias de nucleótidos pueden ser sintetizadas utilizando codones preferidos por la planta para una expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un estudio del uso codónico preferido por el anfitrión. En la técnica se encuentran disponibles los métodos para sintetizar genes preferidos por las plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.380.831, 5.436.391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente memoria como referencia.

Se sabe que las modificaciones adicionales de la secuencia intensifican la expresión génica en un anfitrión celular. Estas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales del sitio de empalme exón-intrón, repeticiones de tipo transposón, y otras secuencias semejantes bien caracterizadas que pueden resultar perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia de nucleótidos heteróloga se puede ajustar a niveles medios para un anfitrión celular dado, calculados mediante la referencia a genes conocidos expresados en la célula anfitriona. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla pronosticadas.

Las casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5'. Tales secuencias líder pueden actuar intensificando la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder de EMCV (región no codificante 5' de Encephalomyocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); los líderes de potyvirus, por ejemplo, el líder TEV (Virus del Grabado del Tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); el líder MDMV (Virus del Mosaico Enanizante del Maíz); la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); el líder no traducido del ARNm de la proteína de la envoltura del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); el líder del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256); y el líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veáse también Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. También se pueden utilizar métodos conocidos para intensificar la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la Ubiquitina de maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) o el intrón de AdhI de maíz (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), y similares.

En la preparación de la casete de expresión, se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN, con el fin de proporcionar secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, separación del ADN superfluo, separación de sitios de restricción, o similares. Para este fin, se pueden implicar la mutagénesis in vitro, la reparación de cebadores, la restricción, la hibridación, las re-sustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Se pueden incluir genes informadores o genes marcadores seleccionables en las casetes de expresión. Los ejemplos de los genes informadores adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar, por ejemplo, en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), págs. 1-33, Jefferson et al. (1991); Mol. Cell. Biol. 7:725-737, DeWet et al. (1987); EMBO J. 9:2517-2522, Goff et al. (1990); BioTechniques 19:650-655, Kain et al. (1995); y Current Biology 6:325-330, Chiu et al. (1996).

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Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de los genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; y Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; y Solicitudes de los Estados Unidos Núms. de Serie 10/004.357; y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Otros genes que podrían resultar útiles en la recuperación de eventos transgénicos pero no se requerirían en el producto final incluirían, pero no estarían limitados a, ejemplos tales como GUS (beta-glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína fluorescente verde; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115 y Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397-414) y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).

La casete de expresión que comprende el promotor de MT2 de la presente invención conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés se puede utilizar para transformar cualquier planta. De esta manera, se pueden obtener plantas, células vegetales, tejidos vegetales, semillas, raíces, y similares modificados genéticamente.

Los métodos de la invención implican la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. Se pretende que "introducción" represente la presentación a la planta de un polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia consiga acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método concreto para introducir una secuencia en una planta, solamente de que el polinucleótido o los polipéptidos consigan acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir el polinucleótido o los polipéptidos en las plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus. Se pretende que "trasformación estable" signifique que el constructo nucleotídico introducido en una planta se integre en el genoma de la planta y sea susceptible de ser heredado por su progenie. Se pretende que "transformación transitoria" signifique que un polinucleótido sea introducido en la planta y no se integre en el genoma de la planta o que un polipéptido sea introducido en una planta.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, esto es, monocotiledónea o dicotiledónea, elegido como diana para la transformación. Los métodos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y su posterior inserción en el genoma de la planta incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), la electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), la transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.563.055 y Zhao et al., 5.981.840), la transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y la aceleración de partículas balísticas (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación con Lec1 (Documento WO 00/28058). Véanse también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Techology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras cortas monocristalinas (whisker)); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens); todos los cuales se incorporan en la presente memoria como referencia.

En realizaciones específicas, los constructos de ADN que comprenden las secuencias promotoras de la invención pueden ser proporcionados a una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transitoria. Tales métodos de transformación transitoria incluyen, pero no están limitados a, sistemas de vectores virales y precipitación del polinucleótido de manera que se excluya la posterior liberación del ADN. De este modo, se puede producir la transcripción a partir del ADN unido a la partícula, pero la frecuencia con la cual se libera para integrarse al genoma se reduce enormemente. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma Núm. P3143).

En otras realizaciones, el polinucleótido de la invención puede ser introducido en plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos implican incorporar un constructo nucleotídico de la invención a una molécula de ADN o ARN viral. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en ellos, que implican moléculas de ADN o ARN viral, son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931, y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporados en la presente memoria como referencia.

Se conocen en la técnica métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una localización específica en el genoma de una planta. En otra realización, se logra la inserción del polinucleótido en una localización genómica deseada utilizando un sistema de recombinación específica del sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, y WO99/25853, todos los cuales se incorporan en la presente memoria como referencia. En resumen, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en una casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. La casete de transferencia se introduce en una planta que tiene incorporado establemente en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios de la casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y la casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés es integrado de ese modo en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.

Las células que han sido transformadas se pueden hacer crecer a plantas de la manera convencional. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden hacer crecer después, y polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada puede ser identificado. Se pueden hacer crecer dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda establemente y después se cosechan las semillas para asegurarse de que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también referidas como "semillas transgénicas") que tiene un constructo nucleotídico de la invención, por ejemplo, una casete de expresión de la invención, incorporado establemente en su genoma.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a uno o más de uno (esto es, al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" representa uno o más elementos.

En toda la memoria se entenderá que la expresión "que comprende," o variaciones tales como "comprende" o "que comprenden", implican la inclusión de un elemento, número entero, o etapa establecidos, o un grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa, o grupos de elementos, números enteros o etapas.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

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Experimentos Ejemplo 1 Aislamiento de Secuencias Aguas Arriba del Gen de la Metalotioneína 2 (MT2) de Raíz de Maíz

Se utilizó la base de datos Genome Survey Sequence (GSS) para aislar la secuencia correspondiente al promotor del gen de la metalotioneína 2 (MT2) de raíz. Se utilizó una secuencia EST de metalotioneína de raíz completa para buscar en la base de datos GSS la secuencia genómica asequible que solapaba con el extremo 5' de la EST y se amplió aguas arriba de la EST. Las búsquedas en la base de datos se realizaron utilizando BLASTN. Solamente se consideraron significativas aquellas secuencias que presentaban una identidad de más de 99% con el gen MT2 de la raíz en la región de solapamiento. La secuencia más larga disponible de las búsquedas se utilizó para investigar la base de datos GSS en busca de secuencias solapantes adicionales. Este procedimiento se repitió hasta que no hubo ninguna secuencia solapante más. El resultado de semejante serie de búsquedas reiterativas fue una región de 1,4 kb aguas arriba del gen MT2 de raíz (SEQ ID NO: 1).

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Ejemplo 2 Aislamiento mediante PCR del Promotor de la Metalotioneína 2 de Raíz

Se utilizaron clones BAC de maíz que contenían homólogos de metalotioneína de raíz como moldes para amplificar mediante PCR y asilar aproximadamente 1,4 kb de la secuencia correspondiente a la secuencia obtenida por medio de las búsquedas en la base de datos Genome Survey Sequence.

Se utilizaron pares de cebadores de PCR individualmente con un grupo de clones BAC de maíz que se sabía previamente que contenían homólogos de metalotioneína de raíz por medio de búsqueda in silicio. Los cebadores de PCR utilizados en las reacciones de PCR fueron Rootmetpro2a (SEQ ID NO: 2) y Rootmetprolb (SEQ ID NO: 3).

Se añadió un sitio BamHI al extremo 5' del cebador Rootmetpro2a y se añadió un sitio XhoI al extremo 3' del cebador Rootmetpro1b para facilitar la subclonación del fragmento promotor completo. Las condiciones de PCR para las reacciones de amplificación fueron las siguientes: 95ºC durante 15 mins, 25 ciclos de 94ºC durante 30 seg, 55ºC durante 90 seg, 72ºC durante 3 min, y 72ºC durante 10 min. Se observó un producto de PCR de 1,4 kb con un subgrupo de los clones BAC. El producto de la PCR de 1,4 Kb resultante se purificó en gel y se clonó en pCR®4-TOPO® y se confirmó la secuencia, dando como resultado pBAC11-2.

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Ejemplo 3 Datos de Expresión Utilizando las Secuencias Promotoras de la Invención

Se colocaron semillas B73 a lo largo del borde de un papel de crecimiento empapado en una solución de sacarosa al 7%. Un trozo adicional de papel de crecimiento de un tamaño idéntico al primero también se empapó en sacarosa al 7% y se superpuso sobre las semillas. El sándwich de papel de crecimiento - semillas - papel de crecimiento se enrolló con posterioridad con el borde de semillas en la parte superior del rollo. El rollo se colocó direccionalmente en un vaso de precipitados de solución de sacarosa al 7% con las semillas en la parte superior para permitir el desarrollo directo de la raíz. Las semillas se dejaron germinar y se desarrollaron durante 2-3 días en la oscuridad a 27-28ºC. Antes del bombardeo la capa externa de piel del cotiledón se separó y las plántulas se colocaron en una placa de petri estéril (60 mm) sobre un papel de filtro Whatman Núm. 1 humedecido con 1 mL de H_{2}O. Se dispusieron dos plántulas por placa en orientaciones opuestas y se anclaron al papel de filtro con una solución de agarosa al 0,5%. También se extirparon secciones de 2-3 cm de la punta de la raíz de las plántulas y se dispusieron longitudinalmente en las placas para el bombardeo.

Se prepararon mezclas de ADN/partículas de oro para el bombardeo mediante el siguiente método. Se pre-lavaron 60 mg de partículas de oro de 0,6 - 1,0 micras con etanol, se enjuagaron con H_{2}O destilada estéril, y se resuspendieron en un total de 1 mL de H_{2}O estéril. Se almacenaron alícuotas de 50 \muL de suspensión de partículas de oro en tubos Eppendorf siliconizados a la temperatura ambiente. Se hizo precipitar ADN sobre la superficie de las partículas de oro combinando, por orden, alícuotas de 50 \muL de partículas de oro 0,6 \muM pre-lavadas, 5-10 \mug de ADN de ensayo, 50 \muL de CaCl_{2} 2,5 M y 25 \muL de espermidina 0,1 M. La solución se sometió a vórtice inmediatamente durante 3 minutos y se centrifugó brevemente para sedimentar las partículas de ADN/oro. El ADN/oro se lavó una vez con 500 \muL de etanol del 100% y se suspendió en un volumen final de 50 \muL de etanol del 100%. La solución de ADN/oro se incubó a -20ºC durante al menos 60 minutos antes de añadir alícuotas de 6 \muL de la mezcla de ADN/oro sobre cada macroportador Mylar®.

Las plántulas preparadas como se ha indicado antes y las puntas de raíz escindidas se bombardearon dos veces utilizando la pistola PDS-1000/He a 0,068-6,8 atm. a un vacío 685,8-711,2 mm de Hg. La distancia entre el macroportador y la pantalla de parada estuvo entre 6-8 cm. Las placas se incubaron en recipientes sellados durante 24 horas en la oscuridad a 27-28ºC después del bombardeo.

Después de 18-24 horas de incubación las plántulas y las puntas de raíz bombardeadas se analizaron en cuanto a la expresión transitoria de GUS. Las plántulas y las raíces escindidas se sumergieron en 10 - 15 mL de tampón de análisis que contenía NaH_{2}PO_{4}-H_{2}O 100 mM (pH 7,0), EDTA 10 mM, K_{4}Fe(CN)_{6}-3H_{2}O 0,5 mM, Triton X-100 al 0,1% y 5-bromo-4-cloro-3-indoil glucurónido 2 mM. Los tejidos se incubaron en la oscuridad durante 24 horas a 37ºC. La sustitución de la solución de tinción GUS por etanol del 100% detuvo el análisis. La expresión/tinción de GUS se visualizó al microscopio.

La Tabla 1 muestra los resultados del bombardeo transitorio para el constructo promotor:GUS de MT2 de raíz de 1,4 kb, así como para un constructo promotor:GUS de ubiquitina de control, en tejido foliar, raíz escindida, y plántula. La expresión de GUS conducida por el promotor de la MT2 de raíz se observó en las raíces y plántulas pero no en el tejido foliar. La expresión de GUS conducida por el constructo de control de ubiquitina se observó en todos los tejidos.

TABLA 1 Expresión de MT2 de Raíz en Tejidos Bombardeados

1

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Ejemplo 4 Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas

Se bombardearon embriones de maíz inmaduros de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contenía un gen de interés conectado operablemente a un promotor de MT2 de la invención, o un plásmido que comprendía las secuencias codificantes de MT2 de la invención conectadas operablemente a un promotor deseado (p. ej. un promotor de ubiquitina), más un plásmido que contenía el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) que confiere resistencia al herbicida Bialafos. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios siguen más abajo.

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Preparación de Tejido Diana

Las espigas se esterilizaron en superficie en blanqueante Chlorox al 30% más detergente Micro al 0,5% durante 20 minutos, y se enjuagaron dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se escindieron y se colocaron con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y después se alinearon con la zona diana de 2,5 cm como preparación para el bombardeo.

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Preparación de ADN

Se elabora un vector plasmídico que comprende un gen de interés conectado operablemente a un promotor de MT de la invención. Este ADN plasmídico más el ADN plasmídico que contiene un marcador seleccionable PAT se hace precipitar sobre bolitas de tungsteno de 1,1 \mum (diámetro medio) utilizando un procedimiento de precipitación con CaCl_{2} como sigue:

100 \muL de partículas de tungsteno preparadas en agua

10 \muL (1 \mug) de ADN en tampón TrisEDTA (1 \mug total)

100 \muL de CaCl_{2} 2,5 M

10 \muL de espermidina 0,1 M

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Cada reactivo se añade sucesivamente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el aparato de vórtice multitubo. La mezcla final se somete a sonicación brevemente y se incuba a un vórtice constante durante 10 minutos. Tras el período de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se separa el líquido, se lavan con 500 mL de etanol del 100%, y se centrifugan durante 30 segundos. De nuevo se separa el líquido, y se añaden 105 \muL de etanol del 100% al sedimento de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo con la pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se someten a sonicación brevemente y se aplican 10 \muL sobre el centro de cada macroportador y se deja que se sequen aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

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Tratamiento con Pistola de Partículas

Las placas de muestra se bombardean al nivel núm. 4 de la pistola de partículas núm. HE34-1 o núm. HE34-2. Todas las muestras reciben un único disparo a 44,23 atm, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparadas.

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Tratamiento Posterior

Después del bombardeo, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren a medio de selección 560R que contiene 3 mg/L de Bialafos, y se subcultiva cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, se transfieren los clones de callo resistente a la selección a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas), se transfieren embriones somáticos bien desarrollados al medio para la germinación y se transfieren a una cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días después, se transfieren las plántulas en desarrollo a medio sin hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Después las plantas se transfieren a insertos en superficies planas (equivalente a un tiesto de 6,35 cm) que contienen tierra para tiestos y se hacen crecer durante 1 semana en una cámara de crecimiento, con posterioridad se hacen crecer 1-2 semanas más en un invernadero, luego se transfieren a tiestos 600 clásicos (5,67 litros) y se hacen crecer hasta la madurez. Las plantas se controlan y se puntúan en cuanto a la actividad del gen de interés preferido por la raíz, o en cuanto a los niveles alterados de iones metálicos.

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Bombardeo y Medio de Cultivo

El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/L de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/L de sacarosa, 1,0 mg/L de 2,4-D, y 2,88 g/L de L-prolina (llevado a su volumen con H_{2}O D-I después de ajustar a un pH de 5,8 con KOH); 2,0 g/L de Gelrite (añadido después de llevarlo a su volumen con H_{2}O D-I); y 8,5 mg/L de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a la temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/L de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarosa, y 2,0 mg/L de 2,4-D (llevado a su volumen con H_{2}O D-I después de ajustar a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/L de Gelrite (añadido después de llevarlo a su volumen con H_{2}O D-I); y 0,85 mg/L de nitrato de plata y 3,0 mg/L de bialafos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar a la temperatura
ambiente).

El medio de regeneración de las plantas (288J) comprende 4,3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solución de partida de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, y 0,40 g/L de glicina llevados a su volumen con H_{2}O D-I purificada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarosa, y 1,0 mL/L de ácido abscísico 0,1 mM (llevado a su volumen con H_{2}O D-I purificada después de ajustar a pH 5,6); 3,0 g/L de Gelrite (añadido después de llevarlo a su volumen con H_{2}O D-I); y 1,0 mg/L de ácido indolacético y 3,0 mg/L de bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a 60ºC).

El medio sin hormona (272V) comprende 4,3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solución de partida de vitaminas MS (0,100 g/L de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, y 0,40 g/L de glicina llevada a su volumen con H_{2}O D-I purificada), 0,1 g/L de mio-inositol, y 40,0 g/L de sacarosa (llevada a su volumen con H_{2}O D-I purificada después de ajustar a pH 5,6); y 6 g/L de bacto-agar (añadido después de llevar a su volumen con H_{2}O D-I purificada), se esteriliza y se enfría a 60ºC.

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Ejemplo 5 Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas Utilizando la transformación mediada por Agrobacterium

Para la transformación mediada por Agrobacterium de maíz con una secuencia promotora de MT2 de las realizaciones, se empleó el método de Zhao (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.981.840, (en adelante patente '840) y la publicación de patente PCT WO98/32326; cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia).

Se hizo crecer Agrobacterium sobre una placa maestra de medio 800 y se cultivó a 28ºC en la oscuridad durante 3 días, y después de eso se almacenó a 4ºC hasta durante un mes. Las placas de trabajo de Agrobacterium se hicieron crecer sobre placas de medio 810 y se incubaron en la oscuridad a 28ºC durante uno a dos días.

En resumen, se diseccionaron los embriones de espigas de maíz esterilizadas, frescas y se mantuvieron en medio 561Q hasta que todos los embriones requeridos fueron recolectados. Después los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium preparada a partir de la placa de trabajo, en la que Agrobacterium contiene un plásmido que comprende la secuencia promotora de las realizaciones. Los embriones se cultivaron simultáneamente con Agrobacterium sobre las placas 562P, con los embriones colocados con el eje hacia abajo sobre las placas, como en el protocolo de la patente '840.

Después de una semana en medio 562P, se transfirieron los embriones a medio 5630. Los embriones se subcultivaron sobre medio 5630 fresco a intervalos de 2 semanas y la incubación continuó en las mismas condiciones. Los eventos de callos comenzaron a aparecer después de 6 a 8 semanas de la selección.

Una vez que los callos hubieron alcanzado el tamaño apropiado, se cultivaron los callos en medio de regeneración (288W) y se mantuvieron en la oscuridad durante 2-3 semanas para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático, los embriones bien desarrollados se transfirieron a medio para germinación (272V) y se transfirieron a una cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días más tarde, las plántulas en desarrollo se transfirieron a medio sin hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estuvieron bien establecidas. Luego se transfirieron las plantas a insertos en superficies planas (equivalentes a tiestos de 6,35 cm) que contenían tierra para tiestos y se hicieron crecer durante 1 semana en una cámara de crecimiento, con posterioridad se hicieron crecer 1-2 semanas más en el invernadero, luego se transfirieron a tiestos 600 clásicos (6,05 litros) y se hicieron crecer hasta la madurez.

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Medios utilizados en la transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración de plantas de maíz transgénicas

El medio 561Q comprende 4,0 g/L de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 68,5 g/L de sacarosa, 36,0 g/L de glucosa, 1,5 mg/L de 2,4-D, y 0,69 g/L de L-prolina (llevada a su volumen con H_{2}O dI después de ajustar a pH 5,2 con KOH); 2,0 g/L de Gelrite® (añadido después de llevar a su volumen con H_{2}O dI); y 8,5 mg/L de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio a la temperatura ambiente).

El medio 800 comprende 50,0 mL/L de solución de partida A y 850 mL de H_{2}O dI, y se lleva a su volumen menos 100 mL/L con H_{2}O dI, después de lo cual se añaden 9,0 g de Phytagar. Después de esterilizar y enfriar, se añaden 50,0 mL/L de solución de partida B, junto con 5,0 g de glucosa y 2,0 mL de una solución de partida de 50 mg/mL de espectinomicina. La solución de partida A comprende 60,0 g de K_{2}HPO_{4} dibásico y 20,0 g de fostato de sodio monobásico, disuelto en 950 mL de agua, ajustado a pH 7,0 con KOH, y se lleva a un volumen de 1,0 L con H_{2}O dI. La solución de partida B comprende 20,0 g de NH_{4}Cl, 6,0 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3,0 g de cloruro de potasio, 0,2 g de CaCl_{2}, y 0,05 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, todos llevados a su volumen con H_{2}O dI, esterilizados, y enfriados.

El medio 810 comprende 5,0 g de levadura (Difco), 10,0 g de peptona (Difco), 5,0 g de NaCl, disuelto en H_{2}O dI, y se lleva a su volumen después de ajustar a un pH de 6,8. Luego se añaden 15,0 g de bacto-agar, la solución se esteriliza y se enfría, y se añaden 1,0 mL de una solución de partida de 50 mg/mL de espectinomicina.

El medio 562P comprende 4,0 g/L de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarosa, y 2,0 mg/L de 2,4-D (llevado a su volumen con H_{2}O dI después de ajustar a un pH de 5,8 con KOH); 3,0 g/L de Gelrite® (añadido después de llevar a su volumen con H_{2}O dI); y 0,85 mg/L de nitrato de plata y 1,0 mL de una solución de partida de acetosiringona 100 mM (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar a la temperatura ambiente).

El medio 5630 comprende 4,0 g/L de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarosa, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0,69 g de L-prolina, y 0,5 g de tampón MES (llevado a su volumen con H_{2}O dI después de ajustar a pH 5,8 con KOH). Luego, se añaden 6,0 g/L de agar-agar Ultrapure® (EM Science) y el medio se esteriliza y se enfría. Con posterioridad, se añaden 0,85 mg/L de nitrato de plata, 3,0 mL de una solución de partida de 1 mg/mL de Bialafos, y 2,0 mL de una solución de partida de 50 mg/mL de carbenicilina.

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288 W comprende 4,3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solución de partida de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, y 0,40 g/L de Glicina llevada a su volumen con H_{2}O D-I purificada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, y 60 g/L de sacarosa, que después se lleva a su volumen con H_{2}O D-I purificada después de ajustar a pH 5,6. Luego, se añaden 6,0 g/L de agar-agar Ultrapure® (EM Science) y el medio se esteriliza y se enfría. Con posterioridad, se añaden 1,0 mL/L de ácido abscísico 0,1 mM; 1,0 mg/L de ácido indolacético y 3,0 mg/L de Bialafos, junto con 2,0 mL de solución de partida de 50 mg/mL de carbenicilina.

En el Ejemplo 4 se proporciona una receta para 272V.

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Ejemplo 6 Expresión de MT2 en Plantas Transgénicas

Se crearon plantas transformadas estables utilizando protocolos de transformación con Agrobacterium como para el Ejemplo 5, para permitir una caracterización más detallada de la actividad promotora.

Para empezar, se tomaron muestras de tejido de hoja y raíz de plantas regeneradas que crecían sobre agar nutriente transformadas establemente con una casete de expresión que contenía el promotor de MT2 de 1347 pb (SEQ ID NO: 1), conectado operablemente al gen GUS (abreviado como MT2:GUS), para someter a ensayo la presencia de actividad GUS. El análisis histoquímico demostró que GUS se expresaba en aproximadamente un 60% de los eventos generados (13 de 22 eventos). En el grupo de plantas de expresión, aproximadamente 62% (8 plantas) tenía expresión solamente en las raíces. No se detectó expresión en hojas en estas 8 plantas. Para los 5 eventos restantes, 3 tenían expresión en hojas y raíces y 2 eventos tenían una expresión muy débil en hojas solamente.

Para caracterizar adicionalmente el promotor de MT2, se enviaron quince plantas transgénicas al invernadero donde se evaluaron en condiciones de crecimiento normales. Siete de las quince plantas enviadas eran negativas para la expresión de GUS mientras las otras 8 plantas procedían de los eventos específicos de la raíz descritos antes. Se tomaron muestras de tejido de hoja y raíz de estas plantas en la fase de desarrollo, V5 (5 hojas con collar). Catorce de las 15 plantas mostraron expresión en las raíces nodales. Se estimó que once de estas plantas tenían un nivel de tinción que era comparable con las plantas con expresión de ubi:GUS. Se obtuvieron resultados similares para las raíces laterales. Catorce plantas expresaron GUS y 9 de ellas tuvieron niveles de tinción con GUS comparables a las plantas ubi:GUS. Se considera que el promotor de ubiquitina es un promotor fuerte (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) y se generaron plantas que expresaban ubi:GUS como control positivo para la evaluación de los eventos de MT2.

No se observó expresión de GUS en las hojas. Se tiñeron histoquímicamente secciones abaxiales de las hojas en V5 para GUS y ninguno de los 15 eventos tuvo una tinción de GUS observable. Estos resultados se correspondían bien con la expresión nativa del gen rootmet2 utilizando la tecnología Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) (Brenner S. et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634, Brenner S. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:1665-1670). MPSS implica la generación de etiquetas características de 17 bases a partir de muestras de ARNm que habían sido sometidas a transcripción inversa. Las etiquetas fueron secuenciadas simultáneamente y asignadas a genes o EST. La abundancia de estas etiquetas viene dada por un valor numérico que es normalizado a partes por millón (PPM) que después permite comparar la expresión de la etiqueta, o abundancia de la etiqueta, a través de diferentes tejidos. De este modo, se puede utilizar la plataforma MPSS para determinar el patrón de expresión de un gen concreto y su nivel de expresión en diferentes tejidos. La expresión del gen rootmet2 nativo en hojas de plantas de maíz, determinada mediante MPSS, fue de 5 PPM (como promedio), que es esencialmente el nivel del fondo. La expresión del gen en raíces fue de aproximadamente 6820 PPM (como promedio).

Se dejó que las plantas MT2 maduraran hasta la fase R1 (fase de floración femenina) en la que también se examinó la expresión de GUS en los penachos y el polen. No se observó tinción histoquímica en el polen y solamente 1 de los 15 eventos tuvo tinción de GUS en el penacho. De nuevo, esto se correspondía bien con los datos de MPSS donde la expresión del gen rootmet2 fue de 0 PPM en polen y 23 PPM en los penachos. La presencia del intensificador de 35S alteró el patrón de expresión ligeramente de manera que se detectó GUS en los penachos, y en las hojas; no obstante, no hubo expresión en el polen. También hubo un ligero efecto en los estigmas donde 3 de 14 plantas sometidas a ensayo mostraron bajos niveles de tinción GUS. Sin el intensificador de 35S en el plásmido, ninguna de las plantas MT2 (0 de 14) tuvo estigmas teñidos para GUS. Una nueva inspección de las raíces nodales demostró que el promotor de MT2 estaba todavía activo. De hecho la tinción en las raíces fue tan intensa, si no más intensa, como la tinción observada en la fase V5.

Tomados juntos, estos datos indican que el promotor de MT2 es un elemento genético funcional capaz de dirigir la expresión en plantas de maíz. La carencia de expresión en hojas, polen, penachos, y estigmas indica que es funcionalmente un promotor preferido por la raíz y será útil en los casos en los que se desee una expresión preferida por la raíz.

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El artículo "un" y "una" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a uno o más de uno (esto es, al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" representa uno o más elementos.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la memoria son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente memoria como referencia hasta el mismo punto que si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera incorporada como referencia.

Aunque la invención precedente ha sido descrita con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para una claridad de la comprensión, resultará obvio que se pueden poner en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.

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E. I. DuPont de Nemours & Co.

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<120> Promotor de Metalotioneína 2 de Maíz y Métodos de Uso

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<130> 1756-PCT

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<150> 60/532,180

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<151> 2003-12-23

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<150> 60/531,793

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<151> 2003-12-22

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<160> 3

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1347

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccttaa tatttgttta aactttttac taaatt

\hfill

36

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<210> 3

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagcctc gacctctttc gtttgctttg gaa

\hfill

33

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a): una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1;

b): una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia promotora vegetal del plásmido depositado como Depósito de Patente Núm. NRRL B-30793;

c): una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; y,

d): una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta.

2. Una casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.

3. Un vector que comprende la casete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una célula vegetal o planta que comprende la casete de expresión de la reivindicación 2.

5. La célula vegetal o la planta de la reivindicación 4, donde dicha casete de expresión es incorporada establemente al genoma de la célula vegetal.

6. La célula vegetal o planta de la reivindicación 4 o 5, donde dicha célula vegetal es de una monocotiledónea, o una dicotiledónea.

7. La célula vegetal o planta de la reivindicación 6, donde dicha monocotiledónea es el maíz.

8. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 5, donde la semilla comprende la casete de expresión.

9. La planta o semilla de la reivindicación 4, 5, 6, 7 u 8, donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a la sal, al frío, a la sequía, a patógenos, o resistencia a insectos.

10. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta, comprendiendo dicho método introducir en la planta una casete de expresión, comprendiendo dicha casete de expresión un promotor conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es expresada en la raíz de dicha planta.

12. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en la célula vegetal una casete de expresión que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1.

13. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés de una manera preferida por una planta, comprendiendo dicho método introducir en una célula vegetal una casete de expresión y regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal, teniendo incorporada establemente dicha planta en su genoma la casete de expresión, comprendiendo dicha casete un promotor conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1, y donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta.

14. El método de la reivindicación 13, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés altera el fenotipo de dicha planta.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde la planta o la célula vegetal es monocotiledónea, o dicotiledónea.

16. El método de la reivindicación 15, donde la planta monocotiledónea o célula vegetal monocotiledónea es el maíz.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a la sal, al frío, a la sequía, a patógenos, o resistencia a insectos.