ES2331388T3 - Marcador especifico para el cancer de prostata. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido no presente en la naturaleza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:
Description
Marcador específico para el cáncer de
próstata.
Esta solicitud reivindica el privilegio de la
fecha de prioridad de la solicitud de patente provisional de
Estados Unidos 60/041.246, presentada el 7 de marzo de 1997, y la
solicitud de patente provisional 60/047.811, presentada el 15 de
mayo de 1997.
La presente invención proporciona
polinucleótidos que codifican un cDNA específico del cáncer de
próstata, proteínas codificadas por los polinucleótidos y métodos
para usar estos materiales.
La próstata es casi invariablemente una zona de
cambios proliferativos benignos y malignos en los varones ancianos.
La hipertrofia prostática benigna (BPH) es la anormalidad
proliferativa no maligna más común de los órganos internos. Un alto
porcentaje de estos trastornos del crecimiento relacionados con la
edad se desarrolla en enfermedades malignas. Como resultado de
esto, el adenocarcinoma de próstata representa la enfermedad maligna
más común en varones americanos y es la segunda causa más
importante de muerte por cáncer en hombres.
Un método útil en la diagnosis del cáncer de
próstata es determinar el nivel de antígeno específico de la
próstata (PSA) en la sangre. El PSA es una glicoproteína secretada
por la glándula prostática. Sin embargo, la prueba del PSA tiene
limitaciones de sensibilidad y selectividad:
- En general, niveles de 4 ng/ml son sugestivos de cáncer y niveles por encima de 10 ng/ml son altamente sugestivos. Sin embargo, muchos individuos con niveles elevados no tienen cáncer de próstata, sino que exhiben hipertrofia prostática benigna. A la inversa, muchas personas con cáncer de próstata tienen niveles de PSA normales en el momento de la diagnosis. Por lo tanto, marcadores para el cáncer de próstata con mayor sensibilidad y selectividad para el cáncer de próstata serían útiles, entre otras cosas, para la diagnosis del cáncer de próstata.
Se ha clonado un cDNA que codifica un marcador
específico del cáncer de próstata, llamado
Repro-PC-1.0, y se ha determinado
su secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del cDNA y
la secuencia de aminoácidos deducida de
Repro-PC-1.0 se presentan como Nº ID
SEC:1 y Nº ID SEC:2, respectivamente.
Repro-PC-1.0 se expresa en células
de cáncer de próstata y es útil como un marcador en la detección del
cáncer de próstata. La inhibición de la expresión de
Repro-PC-1.0 es útil en el
tratamiento profiláctico y terapéutico del cáncer de próstata.
También se ha encontrado que la expresión de
Repro-PC-1.0 depende del ambiente -
las células procedentes de la línea celular de adenocarcinoma de
próstata, LNCaP, sobreexpresan
Repro-PC-1.0 cuando se propagan en
ratones desnudos macho, pero no cuando se propagan en ratones
desnudos hembra. Repro-PC-1.0 tiene
un nivel significativo de identidad de la secuencia de aminoácidos
con las sinaptotagminas. Por lo tanto, se cree que
Repro-PC-1.0 funciona en reacciones
de fusión de membranas y gemación de membranas.
De acuerdo con esto, la invención proporciona
moléculas polinucleotídicas no presentes en la naturaleza
(recombinantes) que comprenden una secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido de
Repro-PC-1.0 o
Repro-PC-1.0. Péptidos de
Repro-PC-1.0 incluyen
Repro-PC-1.0 natural (Nº ID SEC:2) y
variantes alélicas de él. Análogos de
Repro-PC-1.0 incluyen análogos
activos, que tienen la actividad biológica de
Repro-PC-1.0, análogos inactivos,
útiles como señuelos, y análogos inmunogénicos, que, cuando se usan
como un inmunógeno, provocan una respuesta inmunitaria contra
Repro-PC-1.0 o células que lo
expresan. En una realización, el polinucleótido no presente en la
naturaleza comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC:2. En otra realización, la molécula polinucleotídica no
presente en la naturaleza (recombinante) comprende una secuencia de
nucleótidos que encierra al menos 100 aminoácidos consecutivos de
polipéptido de Repro-PC-1.0 (Nº ID
SEC:2). En otra realización, la secuencia de nucleótidos es
sustancialmente idéntica o idéntica a la secuencia de nucleótidos de
Repro-PC-1.0 (Nº ID
SEC:1).
SEC:1).
En un aspecto, esta invención proporciona
vectores de expresión que comprenden secuencias de control de la
expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína de
Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona
sondas y cebadores polinucleotídicos de al menos 15 nucleótidos que
se hibridan específicamente a una secuencia seleccionada de cDNA de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC: 1) o su
complemento, en donde la sonda o el cebador no es la secuencia de
SYT4 mostrada en la Figura 5.
En otro aspecto, esta invención proporciona
vectores de expresión que comprenden secuencias de control de la
expresión conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos
que codifica polipéptido de
Repro-PC-1.0, una sonda, un cebador
o un polinucleótido inhibidor de
Repro-PC-1.0 de esta invención.
En otro aspecto, esta invención proporciona
células recombinantes en las que se ha introducido un vector de
expresión que comprende secuencias de control de la expresión
conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido de
Repro-PC-1.0.
También se describe en la presente memoria un
método para la expresión de mRNA de
Repro-PC-1.0 en una célula que
tiene una secuencia de nucleótidos que codifica
Repro-PC- 1.0, que comprende conectar operativamente
una secuencia de control de la expresión a la secuencia de
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo,
una secuencia dentro del DNA genómico de un animal.
También se describen en la presente memoria
métodos para producir un polipéptido de
Repro-PC-1.0 o un análogo de
Repro-PC-1.0, que comprenden
cultivar una célula recombinante que comprende un polinucleótido
recombinante que comprende secuencias de control de la expresión
conectadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido de
Repro-PC-1.0 o análogo de
Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos para detectar un cDNA de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:1) o su
complemento en una muestra, que comprende las etapas de (a) poner en
contacto la muestra con una sonda o cebador polinucleotídico que
comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos que se hibrida
específicamente a la secuencia de nucleótidos, en donde la sonda no
es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5, y (b) detectar si
el polinucleótido se ha hibridado específicamente al polinucleótido.
La hibridación específica proporciona una detección del
polinucleótido en la muestra.
En otro aspecto, esta invención proporciona
proteína de Repro-PC-1.0
recombinante purificada, por ej. una proteína cuya secuencia de
aminoácidos es idéntica a la secuencia de Nº ID SEC:2 o cuya
secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2.
La invención también proporciona polipéptido de
Repro-PC-1.0 cuya secuencia de
aminoácidos no está presente en la naturaleza y que comprende una
secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de
la secuencia de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2) y tiene
al menos 95% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2. Tales
polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen la actividad
biológica de Repro-PC-1.0, así como
polipéptidos capaces de provocar la producción de anticuerpos que
reconocen Repro-PC-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona
anticuerpos que se unen específicamente a polipéptido de
Repro-PCT-1.0.
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos para detectar un polipéptido de
Repro-PC-1.0 o una variante del
mismo que tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2 en una
muestra, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la
muestra con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido
de Repro-PC-1.0 o la variante del
mismo y (b) detectar la unión específica entre el anticuerpo y el
polipéptido de Repro-PC-1.0 o la
variante del mismo. La unión específica proporciona una detección de
Repro-PC-1.0 en la muestra.
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos para el uso en la diagnosis, la verificación o la
realización de una prognosis para el cáncer de próstata en un
sujeto. Los métodos implican detectar mRNA o polipéptido de
Repro-PC-1.0 o una variante que
tiene al menos 95% de identidad con mRNA de
Repro-PC-1.0 o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en una muestra
procedente del sujeto. En el método diagnóstico, se determina una
cantidad diagnóstica de mRNA de
Repro-PC-1.0 o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en una muestra
procedente del sujeto y la cantidad diagnóstica se compara con un
intervalo normal de mRNA de
Repro-PC-1.0 o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en una muestra de
control no cancerosa. Una cantidad diagnóstica por encima del
intervalo normal proporciona una indicación positiva en la
diagnosis del cáncer de próstata. La detección de una cantidad de
mRNA o polipéptido de Repro-PC-1.0
a un nivel de pronóstico particular proporciona una prognosis para
el sujeto. Métodos para verificar el avance del cáncer de próstata
implican detectar la cantidad de mRNA de
Repro-PC-1.0 o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en el sujeto en un
primer y un segundo momento, y comparar las cantidades. Un cambio en
la cantidad indica un cambio en el curso de la enfermedad,
indicando una cantidad decreciente la remisión del cáncer de
próstata e indicando un incremento el avance del cáncer de próstata.
Una realización de estos métodos implica la obtención diagnóstica
de imágenes de Repro-PC-1.0 en el
cuerpo usando sondas, cebadores o anticuerpos etiquetados
detectablemente. Métodos para realizar una prognosis para el cáncer
de próstata en un sujeto implican determinar la cantidad de
polinucleótido o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en una muestra de un
sujeto y comparar esa cantidad con una cantidad de pronóstico. Una
cantidad determinada en una cantidad de pronóstico particular
proporciona una prognosis para el sujeto.
En otro aspecto, esta invención proporciona un
método in vitro para detectar una traslocación cromosómica
de un gen de Repro-PC-1.0, que
comprende las etapas de hibridar una sonda etiquetada de la
invención a una extensión cromosómica procedente de una muestra
celular para determinar el patrón de hibridación y determinar si el
patrón de hibridación difiere de un patrón normal.
En otro aspecto, esta invención proporciona una
inmunotoxina que se une específicamente a polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de
identidad con el Nº ID SEC:2, para el uso en un método para el
tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de próstata en un
sujeto. También se describe en la presente memoria otro método que
implica alterar el ambiente hormonal de las células cancerosas para
suprimir la expresión de
Repro-PC-1.0.
También se describen en la presente memoria
composiciones farmacéuticas que comprenden un portador
farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacológicamente
eficaz de un polinucleótido inhibidor de la invención o un
anticuerpo de la invención conjugado a toxina.
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos de rastreo in vitro para determinar si un compuesto
modula (inhibe o promueve) la expresión de
Repro-PC-1.0 o una variante alélica
del mismo en una célula. Los métodos implican poner en contacto la
célula con el compuesto y la respuesta inmunitaria mediada por
células dependiente implica proporcionar al sujeto células
transfectadas con un vector de expresión que codifica polipéptido de
Repro-PC-1.0, o polipéptidos de
Repro-PC-1.0 de al menos 100
aminoácidos consecutivos de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:2, que comprende motivos de aminoácido reconocidos por
moléculas de Clase I del MHC.
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos de rastreo in vitro para determinar se un compuesto
modula (inhibe o promueve) la expresión de
Repro-PC-1.0 o una variante alélica
del mismo en una célula. Los métodos implican poner en contacto la
célula con el compuesto y determinar si la producción de mRNA o
polipéptido de Repro-PC-1.0 se
altera (se incrementa, se disminuye o permanece sin cambio) de un
modo estadísticamente significativa (p < 0,05).
En otro aspecto, esta invención proporciona
métodos in vitro para detectar formas polimorfas de
Repro-PC-1.0, que comprenden
comparar la identidad de un nucleótido o aminoácido en una posición
seleccionada a partir de la secuencia de un gen o polipéptido de
Repro-PC-1.0 de prueba con la
identidad del nucleótido o aminoácido en la posición
correspondiente de Repro-PC-1.0
natural (Nº ID SEC:1 ó 2). Una diferencia en la identidad indica
que el polinucleótido de prueba es una forma polimorfa de
Repro-PC-1.0.
También se describe en la presente invención un
animal no humano transgénico, preferiblemente un mamífero, cuyas
células germinales comprenden un polinucleótido recombinante de esta
invención.
Las Figs. 1A-1B son fotografías
de células LNCaP en ratones macho (1A) y hembra (1B).
Las Figs. 2A-2B son fotografías
de un análisis Northern. La Fig. 2A muestra RNA procedente de
células LNCaP y se hibrida con una sonda específica para
Repro-PC-1.0. La Fig. 2B muestra la
rehibridación de la misma transferencia con sondas para tubulina y
actina. Macho = tumores desarrollados en machos. Hembra = tumores
desarrollados en hembras. C = células LNCaP. P = células PC3.
La Fig. 3 muestra el alineamiento de clones
solapados que, juntos, producen el cDNA de
Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1.
La Fig. 4 presenta una comparación de la
organización de polipéptidos de PKC,
Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina.
La Fig. 5 muestra el alineamiento de las
secuencias de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina 4 de
rata ("SYT4").
La Fig. 6 muestra el alineamiento de las
repeticiones internas de PKC-C2, la repetición
"B" de Repro-PC-1.0, la
repetición "B" de sinaptotagmina, la repetición "A" de
sinaptotagmina y la repetición "A" de
Repro-PC-1.0.
A no ser que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria
tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la
especialidad a la que pertenece esta invención. Las siguientes
referencias proporcionan a un experto una definición general de
muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et
al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed.
1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker
ed., 1988); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of
Biology (1991). Aunque pueden usarse cualesquiera métodos y
materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente
memoria en la práctica o las pruebas de la presente invención, se
describen métodos y materiales preferidos. Según se usa en la
presente memoria, los siguientes términos tienen los significados
asignados a ellos a no ser que se especifique otra cosa.
"Polinucleótido" se refiere a un polímero
compuesto por unidades nucleotídicas (ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos, variantes estructurales presentes en la
naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza
sintéticos de los mismos) conectadas a través de enlaces
fosfodiéster, variantes estructurales presentes en la naturaleza
relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza sintéticos de
los mismos. Así, el término incluye polímeros nucleotídicos en los
que los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos
sintéticos no presentes en la naturaleza, tales como, por ejemplo y
sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos,
metilfosfonatos quirales,
2-O-metilrribonucleótidos, ácidos
nucleicos peptídicos (PNAs), y similares. Tales polinucleótidos
pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de DNA
automatizado. El término "ácido nucleico" se refiere
típicamente a polinucleótidos grandes. El término
"oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos
cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos.
Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está
representada por una secuencia de DNA (es decir, A, T, G, C), esta
también incluye una secuencia de RNA (es decir, A, U, G, C) en la
que "U" reemplaza a "T."
En la presente memoria se usa la notación
convencional para describir secuencias polinucleotídicas: el extremo
izquierdo de una secuencia polinucleotídica de una sola hebra es el
extremo 5'; la dirección a izquierdas de una secuencia
polinucleotídica de doble hebra se denomina la dirección 5'. La
dirección de adición 5' a 3' de nucleótidos a transcritos de RNA
nacientes se denomina la dirección de transcripción. La hebra de DNA
que tiene la misma secuencia que un mRNA se denomina la "hebra
codificante"; las secuencias en la hebra de DNA que tienen la
misma secuencia que un mRNA transcrito a partir de ese DNA y que
están situadas 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de RNA
se denominan "secuencias aguas arriba"; las secuencias en la
hebra de DNA que tienen la misma secuencia que el RNA y que son 3'
con respecto al extremo 3' del transcrito de RNA codificante se
denominan "secuencias aguas abajo".
"Polipéptido" se refiere a un polímero
compuestos por residuos de aminoácido, variantes estructurales
presentes en la naturaleza relacionadas y análogos no presentes en
la naturaleza sintéticos de los mismos conectados a través de
enlaces peptídicos, variantes estructurales presentes en la
naturaleza relacionadas y análogos no presentes en la naturaleza
sintéticos de los mismos. Los polipéptidos sintéticos pueden
sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos
automatizado. El término "proteína" se refiere típicamente a
polipéptidos grandes. El término "péptido" se refiere
típicamente a polipéptidos cortos.
"Presente en la naturaleza", cuando se
aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede
encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia
polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo
(incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza
y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el
laboratorio está presente en la naturaleza.
En la presente memoria se usa la notación
convencional para representar secuencias polipeptídicas: el extremo
izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino; el
extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo
carboxilo.
Términos usados para describir relaciones de
secuencias entre dos o más secuencias de nucleótidos o secuencias
de aminoácidos incluyen "secuencia de referencia",
"seleccionada de", "intervalo de comparación",
"idéntica", "porcentaje de identidad de secuencia",
"sustancialmente idéntica", "complementaria" y
"sustancialmente complementaria."
Una "secuencia de referencia" es una
secuencia definida usada como una base para una comparación de
secuencias y puede ser un subgrupo de una secuencia mayor, por ej.
una secuencia de cDNA, proteínica o génica completa.
Debido a que dos polinucleótidos o polipéptidos
pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una
porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica completa)
que es similar entre los dos polinucleótidos, o (2) una secuencia
que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones
de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se
realizan típicamente comparando secuencias de los dos
polinucleótidos a lo largo de un "intervalo de comparación"
para identificar y comparar regiones locales de similitud de
secuencia.
Un "intervalo de comparación" se refiere a
un segmento conceptual típicamente de al menos 12 residuos de
nucleótido consecutivos o 4 de aminoácidos consecutivos que se
compara con una secuencia de referencia. El intervalo de
comparación tiene frecuentemente una longitud de al menos 15 o al
menos 25 nucleótidos o al menos 5 o al menos 8 aminoácidos. El
intervalo de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es
decir, huecos) de aproximadamente 20 por ciento o menos en
comparación con la secuencia de referencia (que no comprende
adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos
secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear un
intervalo de comparación puede efectuarse mediante ejecuciones
computarizadas de algoritmos (AAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the
Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección, y se
selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado
el porcentaje más alto de homología a lo largo del intervalo de
comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos.
Una secuencia de nucleótidos o una secuencia de
aminoácidos en cuestión es "idéntica" a una secuencia de
referencia si las dos secuencias son iguales cuando están alineadas
para una correspondencia máxima a lo largo de la longitud de la
secuencia de nucleótidos o aminoácidos.
El "porcentaje de identidad de secuencia"
entre dos secuencias se calcula comparando dos secuencias
óptimamente alineadas a lo largo de un intervalo de comparación,
determinando el número de posiciones en las que el nucleótido o
aminoácido idéntico está presente en ambas secuencias para dar el
número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de
posiciones coincidentes por el número total de posiciones del
intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y
multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de
identidad de secuencia. A no ser que se especifique otra cosa, el
intervalo de comparación usado para comparar dos secuencias es la
longitud de la secuencia más corta.
Alternativamente, cuando se usa el porcentaje de
identidad de secuencia en referencia a polipéptidos, se sabe que
las posiciones de residuos que no son idénticas a menudo difieren
por sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que los
residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de
aminoácido con propiedades químicas similares (por ej., carga o
hidrofobia) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de
la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones
conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede
ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de
la sustitución. Medios para realizar este ajuste son bien conocidos
por los expertos en la especialidad. Típicamente, esto implica
puntuar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia
parcial en vez de total, incrementando de ese modo el porcentaje de
identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando a un aminoácido
idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no
conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución
conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación
de las sustituciones conservativas se calcula, por ej., de acuerdo
con un algoritmo conocido. Véanse, por ej., Meyers & Miller,
Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988); Smith
& Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman &
Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); Pearson & Lipman, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); Higgins & Sharp Gene, 73:
237-244 (1988); Higgins & Sharp, CABIOS 5:
151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids
Research 16: 10881-90 (1988); Huang et al.,
Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65
(1992); y Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:
307-31 (1994). El alineamiento también se realiza a
menudo mediante inspección y alineamiento manual.
Una secuencia de nucleótidos o una secuencia de
aminoácidos en cuestión es "sustancialmente idéntica" a una
secuencia de referencia si la secuencia de aminoácidos o secuencia
de nucleótidos en cuestión tiene al menos 90% de identidad de
secuencia a lo largo de un intervalo de comparación. Así, las
secuencias que tienen al menos 95% de identidad de secuencia, al
menos 98% de identidad de secuencia o al menos 99% de identidad de
secuencia con la secuencia de referencia también son
"sustancialmente idénticas". Dos secuencias que son idénticas
entre sí, por supuesto, también son "sustancialmente
idénticas".
"Complementario" se refiere a la
compatibilidad o coincidencia topológica entre sí de superficies
interactivas de dos polinucleótidos. Así, las dos moléculas pueden
describirse como complementarias y, por otra parte, las
características de la superficie de contacto son complementarias
entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo
polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer
polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del socio
de unión polinucleotídico del segundo polinucleótido. Así, el
polinucleótido cuya secuencia es
5'-TATAC-3' es complementario a un
polinucleótido cuya secuencia es
5'-GTATA-3'.
Una secuencia de nucleótidos es
"sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos
de referencia si la secuencia complementaria a la secuencia de
nucleótidos en cuestión es sustancialmente idéntica a la secuencia
de nucleótidos de referencia.
"Codificar" se refiere a la propiedad
inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un
polinucleótido, tal como un gen, un cDNA o un mRNA, para servir
como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas
en procesos biológicos que tienen bien una secuencia definida de
nucleótidos (es decir, rRNA, tRNA y mRNA) o bien una secuencia
definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de
los mismos. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y
la traducción de mRNA producido por ese gen producen la proteína en
una célula u otro sistema biológico. Puede hacerse referencia a que
tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es
idéntica a la secuencia de mRNA y es proporcionada habitualmente en
listados se secuencia, como la hebra no codificante, usada como la
plantilla para la transcripción, de un gen o cDNA codifican la
proteína u otro producto de ese gen o cDNA. A no ser que se
especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica
una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de
nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican
la misma secuencia de aminoácidos. Secuencias de nucleótidos que
codifican proteínas y RNA pueden incluir
intrones.
intrones.
"Secuencia de control de la expresión" se
refiere a una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido que
regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia
de nucleótidos conectada operativamente a la misma. "Conectada
operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos
partes en la que la actividad de una parte (por ej., la capacidad
para regular la transcripción) da como resultado una acción sobre la
otra parte (por ej., transcripción de la secuencia). Secuencias de
control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin
limitación, secuencias de promotores (por ej., inducibles o
constitutivas), potenciadores, terminadores de la transcripción, un
codón de iniciación (es decir, ATG), señales de corte y empalme para
intrones, y codones de parada.
"Vector de expresión" se refiere a un
vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende
secuencias de control de la expresión conectadas operativamente a
una secuencia de nucleótidos que ha de expresarse. Un vector de
expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la
expresión; otros elementos para la expresión pueden ser
suministrados por la célula huésped o el sistema de expresión in
vitro. Vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la
especialidad, tales como cósmidos, plásmidos (por ej., desnudos o
contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido
recombinante.
"Sustitución conservativa" se refiere a la
sustitución en un polipéptido de un aminoácido por un aminoácido
funcionalmente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada
uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),
Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano
(W).
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"Variante alélica" se refiere a
cualesquiera de dos o más formas polimorfas de un gen que ocupa el
mismo locus genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente
a través de mutación y pueden dar como resultado polimorfismo
genotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden
ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden
codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos
alteradas. "Variantes alélicas" también se refiere a cDNAs
derivados de transcritos de mRNA de variantes alélicas genéticas,
así como a las proteínas codificadas por ellos.
"Polinucleótido recombinante" se refiere a
un polinucleótido que tiene secuencias que naturalmente no están
empalmadas entre sí. Un polinucleótido recombinante amplificado o
ensamblado puede incluirse en un vector adecuado, y el vector puede
usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula
huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina
una "célula huésped recombinante". El gen se expresa entonces
en la célula huésped recombinante para producir, por ej., un
"polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante
puede servir asimismo para una función no codificante (por ej.,
promotor, origen de replicación, sitio de unión al ribosoma,
etc.).
"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido
sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de
inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, que específicamente se
unen a y reconocen un analito (antígeno). Los genes de
inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones
constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así
como la miríada de genes de regiones variables de inmunoglobulina.
Los anticuerpos existen, por ej., como inmunoglobulinas intactas o
como un número de fragmentos bien caracterizados producidos
mediante digestión con diversas peptidasas. Esto incluye, por ej.,
fragmentos Fab' y F(ab)'_{2}. El término
"anticuerpo", según se usa en la presente memoria, también
incluye fragmentos de anticuerpo bien producidos mediante la
modificación de anticuerpos enteros o bien los sintetizados de
novo usando metodologías de DNA recombinante.
"Inmunoensayo" se refiere a un ensayo que
utiliza un anticuerpo que se une específicamente a un analito. El
inmunoensayo se caracteriza por el uso de las propiedades de unión
específica de un anticuerpo particular para aislar, elegir como
diana y/o cuantificar el analito.
"Vacuna" se refiere a un agente o una
composición que contiene un agente eficaz para conferir un grado
terapéutico de inmunidad en un organismo mientras que solamente
provoca niveles muy bajos de morbidez o mortalidad. Por supuesto,
los métodos para elaborar vacunas son útiles en el estudio del
sistema inmunitario y para prevenir y tratar una enfermedad en
animales o seres humanos.
Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad
eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
"Hibridarse específicamente a" o
"hibridación específica" o "hibridarse selectivamente a"
se refiere a la unión, la formación de un dúplex o la hibridación
de una molécula de ácido nucleico preferentemente a una secuencia
de nucleótidos particular bajo condiciones restrictivas cuando esa
secuencia está presente en una mezcla compleja de DNA o RNA (por
ej., celular total).
El término "condiciones restrictivas" se
refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará
preferentemente a su subsecuencia diana, y en una extensión menor
a, o en absoluto a, otras secuencias. La "hibridación
restrictiva" y las "condiciones de lavado con hibridación
restrictiva" en el contexto de los experimentos de hibridación
de ácidos nucleicos tales como hibridaciones Southern y Northern son
dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo parámetros
ambientales diferentes. Una guía extensiva de la hibridación de
ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,
parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and
the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva
York. Generalmente, se selecciona que las condiciones de hibridación
y lavado altamente restrictivas son aproximadamente 5ºC inferiores
que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a
una intensidad iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura
(bajo intensidad iónica y pH definidos) a la que 50% de la
secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Se
selecciona que las condiciones muy restrictivas son iguales a la Tm
para una sonda particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación
restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios
que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en
una transferencia Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg
de heparina a 42º C, llevándose a cabo la hibridación durante la
noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente restrictivas
es NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un
ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2 X
SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase Sambrook et al. para
una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado de alta
restricción está precedido de un lavado de baja restricción para
retirar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de
restricción media para un dúplex de, por ej., más de 100
nucleótidos, es 1 x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de
lavado de baja restricción para un dúplex de, por ej., más de 100
nucleótidos, es 4-6 x SSC a 40ºC durante 15
minutos. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o más) la
observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación
particular indica la detección de una hibridación específica.
Un anticuerpo "se une específicamente a" o
"es específicamente inmunorreactivo con" una proteína cuando el
anticuerpo funciona en una reacción de unión que es determinante de
la presencia de la proteína en presencia de una población
heteróloga de proteínas y otros materiales biológicos. Así, bajo
condiciones de inmunoensayo señaladas, los anticuerpos
especificados se unen preferentemente a una proteína particular y no
se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes
en la muestra. La unión específica a una proteína bajo tales
condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su
especificidad para una proteína particular. Puede usarse una
variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos
específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por
ejemplo, se usan habitualmente inmunoensayos de ELISA en fase sólida
para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente
inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlot y Lane (1988)
Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications,
Nueva York, para una descripción de formatos y condiciones de
inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad
específica.
Una primera secuencia es una "secuencia
antisentido" con respecto a una segunda secuencia si un
polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se hibrida
específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda
secuencia.
"Sustancialmente pura" significa que una
especie elegida como objetivo es la especie predominante presente
(es decir, sobre una base molar, más abundante que cualquier otra
especie macromolecular individual en la composición), y una
fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la
especie elegida como objetivo comprende al menos aproximadamente
50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares
presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura
significa que de aproximadamente 80% a 90% o más de la especie
macromolecular presente en la composición es la especie purificada
de interés. La especie elegida como objetivo se purifica hasta
homogeneidad esencial (la especie contaminante no puede detectarse
en la composición mediante métodos de detección convencionales) si
la composición consiste esencialmente en una sola especie
macromolecular. Especies de disolventes, moléculas pequeñas (<
500 daltons), estabilizantes (por ej., BSA) y especies iónicas
elementales no se consideran especies macromoleculares para los
propósitos de esta definición.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido
que es capaz de hibridarse específicamente a una plantilla
polinucleotídica señalada y proporcionar un punto de iniciación
para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis
se produce cuando el cebador polinucleotídico se sitúa bajo
condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en
presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica
complementaria y un agente para la polimerización tal como DNA
polimerasa. Un cebador es típicamente de una sola hebra, pero puede
ser de doble hebra. Los cebadores son típicamente ácidos
desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores
sintéticos y presentes en la naturaleza son útiles para muchas
aplicaciones. Un cebador es complementario a la plantilla a la que
está señalado que se hibride para servir como un sitio para la
iniciación de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia
exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica del
cebador a la plantilla depende de la restricción de las condiciones
de hibridación. Los cebadores pueden etiquetarse con, por ej.,
restos cromogénicos, radiactivos o fluorescentes y usarse como
restos detectables.
"Sonda" se refiere a un polinucleótido que
es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia señalada de
otro polinucleótido. Una sonda se hibrida específicamente a un
polinucleótido complementario diana, pero no necesita reflejar la
secuencia complementaria exacta de la plantilla. En tal caso, la
hibridación específica de la sonda a la diana depende de la
restricción de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden
etiquetarse con, por ej., restos cromogénicos, radiactivos o
fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Detectar" se refiere a determinar la
presencia, la ausencia o la cantidad de un analito en una muestra, y
puede incluir cuantificar la cantidad del analito en una muestra o
por célula en una muestra.
Un "resto detectable" o una "etiqueta"
se refieren a una composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o
químicos. Por ejemplo, etiquetas útiles incluyen ^{32}P, ^{35}S,
colorantes fluorescentes, reactivos electrónicamente densos,
enzimas (por ej., como las usadas comúnmente en un ELISA),
biotina-estreptavidina, dioxigenina, haptenos y
proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos
monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia
complementaria a una diana. El resto detectable genera a menudo una
señal medible, tal como una señal radiactiva, cromogénica o
fluorescente, que puede usarse para cuantificar la cantidad de
resto detectable unido en una muestra. El resto detectable puede
estar incorporado en o ligado a un cebador o una sonda bien
covalentemente o bien a través de enlaces iónicos, de van der Waals
o de hidrógeno, por ej., incorporación de nucleótidos radiactivos, o
nucleótidos biotinilados que son reconocidos por estreptavadina. El
resto detectable puede ser detectable directamente o
indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de un
segundo resto detectable directamente o indirectamente al resto
detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser el ligando de
un socio de unión, tal como biotina, que es un socio de unión para
estreptavadina, o una secuencia de nucleótidos, que es el socio de
unión para una secuencia complementaria, a la que puede hibridarse
específicamente. El socio de unión puede ser por sí mismo
directamente detectable, por ejemplo, un anticuerpo puede
etiquetarse con una molécula fluorescente. El socio de unión
también puede ser detectable indirectamente, por ejemplo, un ácido
nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede
ser parte de una molécula de DNA ramificada que es detectable a su
vez a través de hibridación con otras moléculas de ácido nucleico
etiquetadas. (Véase, por ej., PD. Fahrlander y A. Klausner,
Bio/Technology (1988) 6:1165.) La cuantificación de la señal se
alcanza, por ej., mediante conteo por centelleo, densitometría o
citometría de flujo.
"Conector" se refiere a una molécula que
empalma dos moléculas distintas, bien covalentemente o bien a través
de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ej., una
molécula de ácido nucleico que se hibrida a una secuencia
complementaria en el extremo 5' y a otra secuencia complementaria en
el extremo 3', empalmando así dos secuencias no
complementarias.
"Amplificación" se refiere a cualquier
medio por el que una secuencia polinucleotídica se copia y así se
expande en un número mayor de moléculas de polinucleótido, por ej.,
mediante transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa
y reacción en cadena de la ligasa.
"Valor de pronóstico" se refiere a una
cantidad de un analito en una muestra en cuestión que está de
acuerdo con una prognosis particular para una enfermedad señalada.
La cantidad (incluyendo una cantidad cero) del analito detectado en
una muestra se compara con el valor de pronóstico para la muestra de
modo que la comparación relativa de los valores indica el resultado
probable del avance de la enfermedad.
"Valor diagnóstico" se refiere a un valor
que se determina para un analito en una muestra en cuestión, que se
compara a continuación con una escala normal del analito (por ej.,
procedente de un individuo sano) de modo que la comparación
relativa de los valores proporcione un valor de referencia para
diagnosticar una enfermedad señalada. Dependiendo del método de
detección, el valor diagnóstico puede ser una determinación de la
cantidad del analito, pero no es necesariamente una cantidad. El
valor diagnóstico también puede ser un valor relativo, tal como una
puntuación positiva o negativa, y también incluye un valor que
indica la presencia o ausencia del analito en una muestra.
"Composición farmacéutica" se refiere a una
composición adecuada para uso farmacéutico en un mamífero. Una
composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente
eficaz de un agente activo y un portador farmacéuticamente
aceptable. "Cantidad farmacológicamente eficaz" se refiere a la
cantidad de un agente eficaz par producir el resultado
farmacológico pretendido. "Portador farmacéuticamente
aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores, tampones y
excipientes farmacéuticos estándar, tales como una solución salina
tamponada con fosfato, solución acuosa al 5% de dextrosa y
emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y
diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Portadores
farmacéuticos y formulaciones adecuados se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing Co., Easton,
1995). Los portadores farmacéuticos preferidos dependen del modo de
administración pretendido del agente activo. Modos de administración
típicos incluyen enteral (por ej., oral) o parenteral (por ej.,
inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa;
o administración tópica, transdérmica o transmucosal).
Un "sujeto" de diagnóstico o tratamiento es
un animal, tal como un mamífero, incluyendo un ser humano. Animales
no humanos sujetos del tratamiento incluyen, por ejemplo, peces,
aves y mamíferos tales como primates, vacas, ovejas, cerdos,
caballos, perros y gatos.
Un tratamiento "profiláctico" es un
tratamiento administrado a un sujeto que no exhibe signos de una
enfermedad o sólo exhibe signos iniciales con el propósito de
rebajar el riesgo de desarrollar patología.
Un tratamiento "terapéutico" es un
tratamiento administrado a un sujeto que exhibe signos de patología
con el propósito de disminuir o eliminar esos signos.
Se ha aislado una molécula de cDNA que codifica
un marcador específico del cáncer de próstata, llamada
Repro-PC-1.0. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de la molécula de
ácido nucleico se presentan en Nº ID SEC:1 y Nº ID SEC:2,
respectivamente. Esta secuencia de nucleótidos de 3891 bases
contiene un marco de lectura abierto de 1275 bases que codifica
Repro-PC-1.0 desde el nucleótido 151
hasta el nucleótido 1425. La secuencia de aminoácidos deducida de
Repro-PC-1.0 tiene 425
aminoácidos.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
deducida de Repro-PC-1.0 muestra 90%
de identidad con sinaptotagmina IV de rata. Los residuos de
aminoácido 15-37 tienen suficiente longitud e
hidrofobia para constituir un dominio de transmembrana que presenta
los límites de transmembrana inusuales de otras sinaptotagminas.
Repro-PC-1.0 también tiene dos
copias de una repetición directa de 116 aminoácidos (aminoácidos
150-252 y 276-396) que tienen 34%
de identidad entre sí. Estas repeticiones son homólogas al dominio
regulador C2 de isoformas dependientes del calcio de proteína
quinasa C (PKC) y otras isoformas de las sinaptotagminas.
Las sinaptotagminas son proteínas vesiculares
sinápticas que se propone que representan un papel para regular la
traslocación vesicular sináptica hacia el sitio de liberación
presináptica de la membrana plasmática (atraque) y/o la fusión de
estas dos membranas. Por lo tanto, sin querer limitarse por una
teoría, se cree que Repro-PC-1.0
funciona en rutas de exocitosis y endocitosis.
De acuerdo con esto, esta invención proporciona
polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican proteínas de
Repro-PC-1.0, polipéptidos que
tienen menos de 95% de identidad con
Repro-PC-1.0 o fragmentos de ellos,
según se describe en la presente memoria. Análogos incluyen
"análogos activos" que tienen la actividad biológica de
Repro-PC-1.0, "análogos
inactivos" útiles, por ej., como señuelos, y "análogos
inmunogénicos", que, cuando se presentan como un inmunógeno,
provocan la producción de un anticuerpo que se une específicamente
a Repro-PC-1.0. Los polinucleótidos
son útiles para expresar el mRNA o polipéptidos que codifican y en
la preparación de sondas o cebadores, entre otras cosas.
En una realización, la molécula de
polinucleótido recombinante comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una secuencia de al menos 100 aminoácidos seleccionada
de la secuencia de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2). La
secuencia de nucleótidos puede codificar una secuencia de al menos
100 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos del Nº ID SEC: 2. En una
realización, la secuencia de nucleótidos codifica polipéptido de
Repro-PC-1.0 natural de longitud
total.
La secuencia de nucleótidos puede ser idéntica a
una secuencia procedente de cDNA de
Repro-PC-1.0 o su complemento, o
puede incluir codones degenerados. En una realización de una
secuencia de nucleótidos que codifica
Repro-PC-1.0 de longitud completa,
la secuencia es idéntica a la secuencia codificante de
Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1. En
otra realización, la secuencia de nucleótidos codifica un
polipéptido de Repro-PC-1.0 cuya
secuencia de aminoácidos es sustancialmente idéntica a la secuencia
de aminoácidos de polipéptido de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2).
En otra realización, el polinucleótido codifica
una proteína de fusión entre polipéptido de
Repro-PC-1.0 o polipéptido que
tiene al menos 95% de identidad con secuencias de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 y una segunda
secuencia de aminoácidos.
Los polinucleótidos de la presente invención se
clonan o amplifican mediante métodos in vitro, tales como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de
la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la
transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencias
autosostenido (3SR) y el sistema de amplificación de Q\beta
\betareplicasa (QB). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica
la proteína puede aislarse mediante la reacción en cadena de la
polimerasa de cDNA de células de cáncer de próstata usando
cebadores basados en la secuencia de DNA de
Repro-PC-1.0 de Nº ID SEC:1. Un par
de cebadores útiles para amplificar DNA de
Repro-PC-1.0, incluyendo variantes
alélicas, es:
5' oligo (109):
Cebador Superior, 21-mero,
posición 109:
- 5' CAG TTT TCC CTT CAG CAC CTC 3'
- (Nº ID SEC:3)
\vskip1.000000\baselineskip
3' oligo (3489):
Cebador Inferior, 30-mero,
posición 3489:
- 5' TTC CTT TGT TGT TTC TTT TCT CTT TTC TGA 3'
- (Nº ID SEC:4)
Una amplia variedad de metodologías de clonación
y amplificación in vitro es bien conocida para los expertos.
Métodos de PCR se describen, por ejemplo, en la Pat. de EE. UU. Nº
4.683.195; Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 51:263; y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press,
NY, 1989). Los polinucleótidos también pueden aislarse rastreando
bibliotecas genómicas o de cDNA con sondas seleccionadas de las
secuencias de Nº ID SEC: 1 bajo condiciones de hibridación
restrictivas.
Versiones mutantes de las proteínas pueden
elaborarse mediante mutagénesis específica para el sitio de otros
polinucleótidos que codifican las proteínas, o mediante mutagénesis
aleatoria provocada al incrementar el grado de error de la PCR del
polinucleótido original con MnCl_{2} 0,1 mM y concentraciones de
nucleótido desequilibradas.
Esta invención también proporciona vectores de
expresión, por ej., moléculas de polinucleótido recombinante que
comprenden secuencias de control de la expresión conectadas
operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido diana. Los vectores de expresión pueden adaptarse para
funcionar en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de
promotores, secuencias de replicación, marcadores, etc. apropiados,
para la transcripción y traducción de mRNA. La construcción de
vectores de expresión y la expresión de genes en células
transfectadas implica el uso de técnicas de clonación molecular
también muy conocidas en la especialidad. Sambrook et al.,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) y Current Protocols in
Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., (Current
Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates,
Inc. y John Wiley & Sons, Inc.). Promotores útiles para tales
propósitos incluyen un promotor de metalotioneína, un promotor
tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV
inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de
polIII de MRP, un promotor de MPSV constitutivo, un promotor de CMV
inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV
inmediato-temprano de ser humano) y un promotor de
CMV constitutivo. Un plásmido útil para la terapia génica puede
comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores
seleccionables, regiones de identificación y otros genes. Plásmidos
de expresión de DNA recombinante también pueden usarse para preparar
los polinucleótidos de la invención para el aporte por otros medios
distintos a la terapia génica, aunque puede ser más económico
elaborar oligonucleótidos cortos mediante síntesis química in
vitro.
Métodos para transfectar genes en células de
mamífero y obtener su expresión para el uso in vitro o para
terapia génica son bien conocidos en la especialidad. Véanse, por
ej., Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San
Diego, CA (D.V. Goeddel, ed.) (1990) o M. Krieger, Gene Transfer and
Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY,
(1990).
Vectores de expresión útiles en esta invención
dependen de su uso pretendido. Por supuesto, tales vectores de
expresión deben contener señales de expresión y replicación
compatibles con la célula huésped. Vectores de expresión útiles
para expresar la proteína de esta invención incluyen vectores
virales tales como virus alfa, retrovirus, adenovirus y virus
adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos, liposomas y
similares. Se prefieren vectores virales y plasmídicos para
transfectar células de mamífero. El vector de expresión pcDNA1
(Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la
expresión comprende el promotor de CMV, proporciona buenos grados
de transfección y expresión. Los vectores virales adenoasociados son
útiles en los métodos de terapia génica de esta invención.
El constructo también puede contener un rótulo
para simplificar el aislamiento de la proteína. Por ejemplo, un
rótulo de polihistidina de, por ej., seis residuos de histidina,
puede incorporarse en el extremo aminoterminal de la proteína. El
rótulo de polihistidina permite el aislamiento conveniente de la
proteína en una sola etapa mediante cromatografía con quelato de
níquel.
En otra realización, genes endógenos se
transcriben conectándolos operativamente a secuencias de control de
la expresión suministradas endógenamente que se recombinan con DNA
genómico. En un método, se provee a la célula de un polinucleótido
recombinante que contiene una secuencia de elección como diana, que
permite la recombinación homóloga en el genoma aguas arriba del
sitio de inicio de la transcripción del gen diana; las secuencias
de control de la expresión; un exón del gen diana y un sitio donante
de corte y empalme desapareado que se aparea con un aceptor de
corte y empalme en el gen diana. Tales métodos se analizan en Treco
et al., WO 94/12650; Treco et al., WO 95/31560 y
Treco et al., WO 96/29411.
La invención también proporciona células
recombinantes que comprenden un vector de expresión para la
expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido de esta invención. Las células huésped pueden
seleccionarse con respecto a altos niveles de expresión para
purificar la proteína. Se prefieren células de mamífero para este
propósito, pero también son útiles células procarióticas, tales como
E. coli. La célula puede ser, por ej., una célula
recombinante en cultivo o una célula in vivo.
Esta invención proporciona sondas y cebadores
polinucleotídicos que se hibridan específicamente a una subsecuencia
de cDNA de Repro-PC-1.0 o su
complemento bajo condiciones de hibridación restrictivas pero no son
la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5. Las sondas y los
cebadores de esta invención son polinucleótidos de al menos 15
nucleótidos, al menos 20 nucleótidos o al menos 25 nucleótidos. En
una realización, la secuencia polinucleotídica es una secuencia
contigua del Nº ID SEC:1 o su complemento. Cualquier región adecuada
del gen de Repro-PC-1.0 puede
elegirse como una diana para la hibridación de polinucleótidos.
Sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos pueden
incorporarse en los polinucleótidos con tal de que se retenga la
capacidad característica para hibridarse específicamente a la
secuencia diana o su complemento. La variación en la secuencia de
nucleótidos puede resultar de polimorfismos de secuencia de
diversos alelos, errores de secuenciación menores y similares.
Las sondas y los cebadores de la invención son
útiles como sodas en ensayos de hibridación, tales como
transferencias Southern y Northern, para identificar
polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica
un polipéptido de Repro-PC-1.0, y
como cebadores para procedimientos de amplificación. Las sondas y
los cebadores de la invención también son útiles para detectar la
presencia, la ausencia o la cantidad de
Repro-PC-1.0 en biopsias tisulares
y secciones histológicas en las que el método de detección se lleva
a cabo in situ, típicamente después de la amplificación de
secuencias de Repro-PC-1.0 usando un
grupo de cebadores.
Las sondas y los cebadores de esta invención son
útiles para identificar formas alélicas de
Repro-PC-1.0 y genes cognados
animales. Las sondas y los cebadores pueden usarse para rastrear
bibliotecas de DNA genómico o cDNA de seres humanos o animales
bajo, por ej., condiciones restrictivas. Las moléculas de DNA que se
hibridan específicamente a la sonda se examinan a continuación
adicionalmente para determinar si son variantes alélicas o cognados
animales de Repro-PC-1.0.
Las sondas también son útiles en series
oligonucleotídicas. Tales series se usan en ensayos de hibridación
para comprobar la identidad de bases en un polinucleótido diana. En
esencia, cuando una diana se hibrida perfectamente a una sonda en
la serie, la diana contiene la secuencia de nucleótidos de la sonda.
Cuando la diana se hibrida peor, o no se hibrida en absoluto,
entonces la diana y la sonda difieren en la secuencia en uno o más
nucleótidos. Mediante la selección apropiada de sondas, pueden
comprobarse bases en una molécula diana. Véase, por ej., Chee et
al., WO 95/11995. El uso de la secuencia de
Repro-PC-1.0 en la genómica se
describe más adelante.
En una realización, el polinucleótido comprende
además una etiqueta. Se usa subsiguientemente un resto detectable
unido bien a un cebador oligonucleotídico o bien a una sonda para
detectar la hibridación de un cebador oligonucleotídico al
componente de RNA. La detección de material etiquetado unido a un
polinucleótido de Repro-PC-1.0 en
una muestra proporciona un medio para determinar un valor
diagnóstico o de pronóstico.
Aunque los cebadores y las sondas pueden diferir
en secuencia y longitud, el principal factor diferenciador es uno
de función: los cebadores sirven como un punto de iniciación de la
síntesis de DNA de un polinucleótido diana, como en reacciones de
RT y PCR, mientras que las sondas se usan típicamente para la
hibridación a y la detección de un polinucleótido diana. Longitudes
típicas de los cebadores y las sondas pueden variar de
7-50 nucleótidos, preferiblemente de
10-40 nucleótidos y lo más preferiblemente de
15-35 nucleótidos. Un cebador o una sonda también
puede etiquetarse con un resto detectable para la detección de la
hibridación del cebador o la sonda al polinucleótido diana.
En general, los expertos en la especialidad
saben que los polinucleótidos usados en la invención incluyen
moléculas tanto de DNA como de RNA y modificaciones presentes en la
naturaleza de las mismas, así como análogos sintéticos no presentes
en la naturaleza de los mismos, y heteropolímeros, de
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o análogos de
cualquiera. La composición particular de un polinucleótido o análogo
de polinucleótido dependerá del propósito para el que se use el
material y el ambiente en el que esté situado el material. Se han
diseñado nucleótidos sintéticos no presentes en la naturaleza para
servir a una variedad de propósitos y para permanecer estables en
una variedad de ambientes, tales como aquellos en los que están
presentes las nucleasas.
Los oligonucleótidos se sintetizan
preferiblemente, por ej., en un Applied BioSystems u otro
sintetizador de oligonucleótidos disponible comercialmente de
acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el fabricante.
Los oligonucleótidos pueden prepararse usando cualquier método
adecuado, tal como los métodos del fosfotriéster y el fosfodiéster,
o realizaciones automatizadas de los mismos. En una de tales
realizaciones automatizadas, se usan dietilfosforamidatos como
materiales de partida y pueden sintetizarse como se describe por
Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22: 1859 (1981), y la
Patente de EE. UU. Nº 4.458.066.
Los polinucleótidos, por ej., las sondas,
también pueden producirse recombinantemente a través del uso de
plásmidos u otros vectores.
Las sondas y los cebadores de esta invención son
útiles, entre otras cosas, para detectar polinucleótidos de
Repro-PC-1.0 en una muestra. Un
método para detectar la presencia, la ausencia o la cantidad de un
polinucleótido de Repro-PC-1.0 en
una muestra implica dos etapas: (1) hibridar específicamente una
sonda o cebador polinucleotídico a un polinucleótido de
Repro-PC-1.0, y (2) detectar la
hibridación específica.
Para la primera etapa del método, el
polinucleótido usado para la hibridación específica se elige para
hibridarse a cualquier región adecuada de
Repro-PC-1.0.
Sin embargo, la sonda o el cebador no se hibrida
a la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5. El polinucleótido
puede ser una molécula de DNA o RNA, así como un análogo sintético
no presente en la naturaleza del mismo. Los polinucleótidos en esta
etapa son cebadores polinucleotídicos y sondas polinucleotídicas
descritos en la presente memoria.
Para la segunda etapa de la reacción, puede
usarse cualquier método adecuado para detectar la hibridación
específica de un polinucleótido a
Repro-PC-1.0. Tales métodos
incluyen, por ej., amplificación mediante extensión de un cebador
hibridado usando transcriptasa inversa (RT); extensión de un cebador
hibridado usando RT-PCR u otros métodos de
amplificación; y en la detección in situ de un cebador
hibridado. En la hibridación in situ, una muestra de tejido o
células se fija sobre un portaobjetos de vidrio y se permeabiliza
suficientemente para el uso con técnicas de hibridación in
situ. Restos detectables usados en estos métodos incluyen, por
ej., sondas polinucleotídicas etiquetadas; la incorporación directa
de una etiqueta en reacciones de amplificación o RT, y cebadores
polinucleotídicos
etiquetados.
etiquetados.
A menudo, los extractos celulares o las muestras
tisulares usados en los métodos para determinar la cantidad de un
polinucleótido en una muestra contendrán cantidades variables de
células o materiales extraños de la matriz extracelular. Así, un
método para determinar el número de células en una muestra es
importante para determinar la cantidad relativa por célula de un
polinucleótido de prueba tal como
Repro-PC-1.0. Un control para el
número de células y la eficacia de amplificación es útil para
determinar valores diagnósticos para una muestra de un cáncer
potencial, y un control es particularmente útil para comparar la
cantidad de polinucleótido de prueba, tal como
Repro-PC-1.0, en una muestra con un
valor de pronóstico para el cáncer de próstata. Una realización
preferida del RNA de control es rRNA de 28S expresado endógenamente.
(Véase, por ej., Khan et al., Neurosci. Lett. 147:
114-117 (1992) que usaba rRNA de 28S como un
control, diluyendo rRNA de 28S transcrito inversamente y
añadiéndolo a la reacción de amplificación).
Se describen en la presente memoria
polinucleótidos inhibidores dirigidos contra polinucleótidos de
Repro-PC-1.0 que inhiben la
expresión de Repro-pc-1.0 y, por lo
tanto, inhiben su actividad en una célula. Los polinucleótidos
inhibidores pueden inhibir la actividad de
Repro-PC-1.0 de un número de modos.
De acuerdo con un mecanismo, el polinucleótido evita la
transcripción del gen de
Repro-PC-1.0 (por ejemplo, mediante
la formación de una triple hélice). En otro mecanismo, el
polinucleótido desestabiliza el
Repro-PC-1.0 y reduce su semivida.
En otro mecanismo, el polinucleótido inhibe el ensamblaje del
componente de RNA en el Repro-PC-1.0
mediante unión a Repro-PC-1.0.
Un polinucleótido inhibidor es un polinucleótido
que es capaz de hibridarse específicamente con un polinucleótido
diana y que interfiere con la transcripción, el procesamiento, la
traducción u otra actividad del polinucleótido diana. Los
polinucleótidos inhibidores son generalmente de una sola hebra y
tienen una secuencia de al menos 7, 8, 9, 10 u 11 nucleótidos
capaces de hibridarse específicamente a la secuencia diana. Las
secuencias de RNA requieren generalmente una secuencia de al menos
10 nucleótidos para la hibridación específica. Polinucleótidos
inhibidores incluyen, sin limitación, moléculas antisentido,
ribozimas, moléculas de sentido y moléculas que forman tríplex. En
una realización, el polinucleótido inhibidor tiene una longitud de
no más de aproximadamente 50 nucleótidos.
Aunque sin querer limitarse por una teoría, se
cree que los polinucleótidos inhibidores inhiben la función de una
diana, en parte, uniéndose a la secuencia diana apropiada. Un
polinucleótido inhibidor puede inhibir la replicación de DNA o la
transcripción de DNA, por ejemplo, interfiriendo con la ligazón de
DNA o RNA polimerasa al promotor uniéndose a un sitio de iniciación
de la transcripción o una plantilla. Puede interferir con el
procesamiento de mRNA, la adición de poli(A) a mRNA o la
traducción de mRNA, por ejemplo, uniéndose a regiones del
transcrito de RNA tales como el sitio de unión al ribosoma. Puede
promover mecanismos inhibidores de las células, tales como promover
la degradación de RNA a través de la acción de RNasa. El
polinucleótido inhibidor puede unirse a la ranura principal del DNA
dúplex para formar una estructura de triple hélice o "tríplex".
Métodos de inhibición que usan polinucleótidos inhibidores abarcan
por lo tanto un número de diferentes sistemas para alterar la
expresión de genes específicos que operan mediante diferentes
mecanismos. Estos tipos diferentes de tecnología de polinucleótidos
inhibidores se describen en C. Helene y J. Toulme, (1990) Biochim.
Biophys. Acta., 1049:99-125.
Polinucleótidos antisentido pueden incluir
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Pueden modificarse
químicamente a fin de mejorar la estabilidad en el cuerpo. Las
propiedades del polinucleótido pueden manipularse para impartir
estabilidad (por ej., resistencia a nucleasas), una unión más
estrecha o la Tm deseada. Véase, por ej., la publicación de patente
internacional Nº 94/12633.
El sistema general para construir diversos
polinucleótidos útiles en la terapia con polinucleótidos inhibidores
ha sido revisado por A.R. Vander Krol et al. (1988),
Biotechniques 6:958-976, y por C. A. Stein et
al., (1988) Cancer Res. (1988) 48:2659-2668.
Véanse además Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene
Expresión, Cohen, J.S., editor, MacMillan Press, London, páginas
79-196 (1989), y Antisense RNA and DNA, (1988), D.A.
Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos inhibidores
comprenden un sustituyente derivado que sustancialmente no es
interferente con respecto a la hibridación del polinucleótido
inhibidor al polinucleótido diana.
Se describen en la presente memoria
polinucleótidos antisentido capaces de hibridarse específicamente a
una secuencia diana de
Repro-PC-1.0. Los polinucleótidos
antisentido son útiles in vitro o in vivo para inhibir
la actividad de Repro-PC-1.0.
Los polinucleótidos antisentido comprenden una
secuencia antisentido de al menos 7 nucleótidos que se hibrida
específicamente a una secuencia procedente de
Repro-PC-1.0 y, más particularmente,
Repro-PC-1.0 de mamífero y
Repro-PC-1.0 de ser humano.
La secuencia antisentido puede estar entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos o entre
aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos. En otras
realizaciones, los polinucleótidos antisentido son polinucleótidos
de menos de aproximadamente 100 nucleótidos o menos de
aproximadamente 200 nucleótidos. De acuerdo con esto, una secuencia
del polinucleótido antisentido puede hibridarse específicamente a la
totalidad o parte del Repro-PC-1.0,
tal como polinucleótidos antisentido para el gen de
Repro-PC-1.0 o su RNA transcrito. En
una realización, la secuencia del polinucleótido contiene dentro de
ella la secuencia antisentido. En este caso, la secuencia
antisentido está contenida dentro de un polinucleótido de secuencia
más larga. En otra realización, la secuencia del polinucleótido
consiste esencialmente en, o es, la secuencia antisentido. Así, por
ejemplo, el polinucleótido antisentido puede ser un polinucleótido
de menos de aproximadamente 50 nucleótidos en una secuencia que se
hibrida específicamente a la secuencia diana.
Generalmente, para asegurar la hibridación
específica, la secuencia antisentido es sustancialmente
complementaria a la secuencia diana en
Repro-PC-1.0. En ciertas
realizaciones, la secuencia antisentido es exactamente
complementaria a la secuencia diana. Los polinucleótidos
antisentido pueden incluir sustituciones, adiciones, deleciones o
transposiciones de nucleótidos, con tal de que la unión específica a
la secuencia diana pertinente correspondiente a mRNA de
Repro-PC-1.0 o su gen se retenga
como una propiedad funcional del polinucleótido.
El polinucleótido antisentido debe ser
suficientemente largo para formar un dúplex estable pero
suficientemente corto, dependiendo del modo de aporte, para
administrarse in vivo, si se desea. La longitud mínima de un
polinucleótido requerido para la hibridación específica a una
secuencia diana depende de varios factores, tales como el contenido
de G/C, el posicionamiento de las bases no coincidentes (si las
hay), el grado de univocidad de la secuencia en comparación con la
población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química del
polinucleótido (por ej., cadena principal de metilfosfonato,
poliamida-ácido nucleico, fosforotioato, etc.), entre otros.
Para métodos generales relativos a
polinucleótidos antisentido, véase Antisense RNA and DNA, (1988),
D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY). Para una revisión de la terapia antisentido, véase,
por ej., Uhlmann et al., Chem. Reviews,
90:543-584 (1990).
\vskip1.000000\baselineskip
La segmentación de
Repro-PC-1.0 puede inducirse
mediante el uso de ribozimas o RNA catalítico. En este sistema, la
ribozima debe contener bien RNA presente en la naturaleza
(ribozimas) o bien ácidos nucleicos sintéticos con actividad
catalítica. Bratty et al., (1992) Biochim. Biophys. Acta.,
1216:345-59 (1993) y Denhardt, (1992) Ann. N. Y.
Acad. Sci., 660:70-76 describen métodos para
elaborar ribozimas.
A diferencia de los polinucleótidos antisentido
y otros descritos anteriormente, que se unen a un RNA o un DNA, una
ribozima no solo se une a sino que también disocia específicamente y
de ese modo inactiva potencialmente un RNA diana. Tal ribozima
puede comprender secuencias terminales 5' y 3' complementarias al
RNA de Repro-PC-1.0.
Sitios diana óptimos para la inhibición mediada
por ribozimas de la actividad pueden determinarse como se describe
por Sullivan et al., publicación de patente PCT Nº 94/02595 y
Draper et al., publicación de patente PCT Nº 93/23569. Según
se describe por Hu et al., publicación de patente PCT Nº
94/03596, las funciones antisentido y de ribozima pueden combinarse
en un solo polinucleótido. Al revisar la secuencia de RNA de
Repro-PC-1.0, los expertos en la
especialidad apreciarán que varios sitios diana de ribozima útiles
están presentes y son susceptibles de segmentación por, por
ejemplo, una ribozima con motivo de cabeza de martillo.
Tales ribozimas manipuladas pueden expresarse en
células o pueden transferirse mediante una variedad de medios (por
ej., liposomas, inmunoliposomas, biolística, captación directa en
células, etc.). Otras formas de ribozimas (ribozimas intrónicas del
grupo I (Cech (1995) Biotechnology 13; 323); ribozimas de cabeza de
martillo (Edgington (1992) Biotechnology 10: 256) pueden
manipularse sobre la base de la información de secuencia de
Repro-PC-1.0 descrita, para
catalizar la segmentación de RNA de
Repro-PC-1.0. Por otra parte, las
ribozimas pueden comprender uno o más nucleótidos modificados o
conexiones modificadas entre nucleótidos, según se describe
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los polinucleótidos inhibidores
antisentido y de ribozima, pueden construirse polinucleótidos que
se unirán a ácido nucleico dúplex bien en el componente de RNA
plegado o bien en el gen para el componente de RNA, formando un
ácido nucleico que contiene una triple hélice o tríplex para inhibir
la actividad de Repro-PC-1.0. Tales
polinucleótidos de la invención se construyen usando las reglas de
apareamiento de bases de la formación de la triple hélice y la
secuencia de nucleótidos del componente de RNA (Cheng et al.
(1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin y
Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas
et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel et
al. (1991) Science 254: 1639; Hsieh et al. (1990)
op.cit.; Rigas et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
83: 9591. Tales polinucleótidos pueden bloquear la actividad de
Repro-PC-1.0 de un número de modos,
incluyendo evitando la transcripción del gen de
Repro-PC-1.0.
Típicamente, y dependiendo del modo de acción,
los polinucleótidos que forman tríplex de la invención comprenden
una secuencia suficientemente larga para formar una triple hélice
estable pero suficientemente pequeña, dependiendo del modo de
aporte, para administrar in vivo.
Los polinucleótidos inhibidores pueden
elaborarse químicamente o recombinantemente.
Polinucleótidos inhibidores pequeños para el
aporte directo pueden elaborarse mediante síntesis química. Los
polinucleótidos químicamente sintetizados pueden ser DNA o RNA, o
pueden incluir análogos nucleotídicos o cadenas principales que no
se limitan a conexiones fosfodiéster.
Para el aporte dentro de células o para métodos
de terapia génica, es particularmente útil la producción
recombinante de polinucleótidos inhibidores a través del uso de
vectores de expresión. De acuerdo con esto, esta invención también
proporciona vectores de expresión, por ej., moléculas de
polinucleótido recombinante que comprenden secuencias de control de
la expresión conectadas operativamente a la secuencia de nucleótidos
que codifica el polinucleótido inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención también proporciona polipéptido
de Repro-PC-1.0 recombinante
purificado y polipéptido de
Repro-PC-1.0 que comprende una
secuencia de al menos 100 aminoácidos consecutivos procedente de la
secuencia de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 y tiene al menos 95% de
identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2. El polipéptido de
Repro-PC-1.0 recombinante incluye
el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se presenta en el Nº ID
SEC:2, así como polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos es al
menos 95% idéntica al Nº ID SEC:2. Análogos de
Repro-PC-1.0 incluyen análogos de
Repro-PC-1.0 activos, análogos
inactivos y análogos de Repro-PC-1.0
inmunogénicos.
Polipéptido de
Repro-PC-1.0 se refiere a
Repro-PC-1.0 natural, el polipéptido
cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de Nº
ID SEC:2, y a polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos es al menos
95% idéntica al Nº ID SEC:2. Moléculas polinucleotídicas que
codifican variantes alélicas de
Repro-PC-1.0 pueden aislare de DNA
o DNA genómico de células de cáncer de próstata y típicamente se
hibridan bajo condiciones restrictivas a la secuencia de
nucleótidos que codifica
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:1). Pueden
obtenerse mediante amplificación usando, por ej., cebadores de PCR
tomados de la secuencia de
Repro-PC-1.0 descrita en la presente
memoria.
Los polipéptidos de
Repro-PC-1.0 son útiles como
inmunógenos para provocar la producción de anticuerpos
anti-Repro-PC-1.0,
como moléculas de captura por afinidad para aislar tales anticuerpos
de una mezcla, como controles en métodos diagnósticos destinados a
detectar Repro-PC-1.0 en una
muestra.
Un análogo de
Repro-PC-1.0 es un polipéptido cuya
secuencia no está presente en la naturaleza pero es sustancialmente
idéntica a lo largo de su secuencia a una secuencia de
Repro-PC-1.0 natural. Análogos de
Repro-PC-1.0 incluyen análogos de
Repro-PC-1.0 activos, análogos de
Repro-PC-1.0 inactivos y análogos de
Repro-PC-1.0 inmunogénicos.
Análogos de Repro-PC-1.0 incluyen
proteínas de fusión, es decir, polipéptidos que tienen un resto
Repro-PC-1.0/análogo de
Repro-PC-1.0 fusionado con otro
resto polipeptídico como su extremo amino- o
carboxi-terminal.
Los análogos de
Repro-PC-1.0 activos tienen la
actividad biológica de Repro-PC-1.0.
Se cree que Repro-PC-1.0 funciona
en las rutas de exocitosis y endocitosis. Generalmente, los análogos
de Repro-PC-1.0 activos tienen al
menos 95% de identidad de secuencia con
Repro-PC-1.0 natural. Los análogos
de Repro-PC-1.0 activos pueden
producirse, por ejemplo, introduciendo sustituciones de aminoácidos
conservativas en la secuencia de
Repro-PC-1.0 natural. Los más
propensos a ser tolerados son los cambios en la secuencia de
aminoácidos fuera de las secuencias de repetición directa o fuera
de los aminoácidos 40-140. Los aminoácidos alrededor
de 1-15, 268-275 y
397-425 probablemente son altamente mutables. Los
aminoácidos en la región de transmembrana, por ej., los aminoácidos
15-37 (Nº ID SEC:2), no deben sustituirse con
aminoácidos hidrófilos. Fragmentos activos de
Repro-PC-1.0 pueden identificarse
empíricamente truncando la proteína bien desde el extremo amino o
bien desde el extremo carboxi para generar fragmentos, y probando
los fragmentos resultantes con respecto a la actividad de
Repro-PC-1.0. Más específicamente,
se espera que las siguientes sustituciones en
Repro-PC-1.0 den análogos que tengan
actividad de Repro-PC-1.0: N79S (es
decir sustituir N en la posición 79 por S); V87L; S133A; E268D y
V421M). Estas sustituciones se producen en áreas que no son parte
de los siguientes motivos principales que comparten identidad con
sinaptotagmina IV de rata: sitios de fosforilación de PKA, sitios
de fosforilación de CK2, sitios de fosforilación de PKC, sitios de
N-miristoilación, dominio C2 de PKC y el dominio de
transmembrana.
Polipéptidos de análogos de
Repro-PC-1.0 inactivos de al menos 5
aminoácidos de Repro-PC-1.0 natural
se describen en la presente memoria. Análogos de
Repro-PC-1.0 inactivos incluyen, por
ejemplo, polipéptidos que codifican fragmentos de
Repro-PC-1.0. Fragmentos útiles de
Repro-PC-1.0 incluyen polipéptidos
que comprenden la secuencia de una o ambas de las repeticiones
directas de 116 aminoácidos de
Repro-PC-1.0. Otro fragmento útil de
Repro-PC-1.0 es uno que carece de
las regiones de transmembrana y, por lo tanto, no se ancla a la
membrana celular. Estos análogos inactivos son útiles como mímicos
o señuelos de polipéptidos inhibidores. Cuando se expresan en una
célula, compiten con polipéptidos de
Repro-PC-1.0 con respecto a la
interacción con moléculas que interactúan naturalmente con
Repro-PC-1.0. En algunas
realizaciones, los polipéptidos de
Repro-PC-1.0 comprenden al menos
100 aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de
Repro-PC-1.0.
Análogos de
Repro-PC-1.0 inmunogénicos son
polipéptidos que tienen una secuencia de al menos 100 aminoácidos
consecutivos procedentes de
Repro-PC-1.0 natural y que, cuando
se presentan a un animal como un inmunógeno, provocan una respuesta
humoral o mediada por células. Esto incluye polipéptidos que
comprenden una secuencia de aminoácidos que es un epítopo
procedente de Repro-PC-1.0, tales
como fragmentos inmunogénicos de
Repro-PC-1.0. Los análogos
proteínicos de Repro-PC-1.0 están
opcionalmente en forma aislada.
Repro-PC-1.0 y
análogos se producen lo más fácilmente recombinantemente, según se
describe en la presente memoria.
Repro-PC-1.0 recombinante puede
purificarse mediante purificación por afinidad. En un método,
análogos de Repro-PC-1.0
recombinantes comprenden un rótulo de polihistidina. La proteína se
purifica sobre una matriz de afinidad de quelato de níquel. En otro
método, Repro-PC-1.0 se purifica
usando una matriz de afinidad que soporta anticuerpos
anti-Repro PC-1.0.
En un aspecto, esta invención proporciona una
composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente
a polipéptidos de Repro-PC-1.0. Los
anticuerpos tienen preferiblemente una afinidad de al menos 10^{6}
M^{-1}, 10^{7} M^{-1}, 10^{8} M^{-1} o 10^{9} M^{-1}.
Esta invención contempla composiciones de anticuerpos tanto
policlonales como monoclonales.
En una realización, esta invención proporciona
inmunotoxinas contra células que expresan
Repro-PC-1.0. Las inmunotoxinas son
anticuerpos y similares como los descritos en la presente memoria
acoplados a un compuesto, por ej., una toxina, que es tóxico para
una célula diana. Las toxinas pueden incluir, por ejemplo, isótopos
radiactivos, ricina, cisplatino, moléculas antisentido, toxina
diftérica, exotoxina A de Pseudomonas o antígeno protector de
Bacillus anthracis. Las inmunotoxinas se unen a células cancerosas
que expresan Repro-PC-1.0 y las
destruyen. Son útiles en los métodos terapéuticos de esta invención.
Los anticuerpos de la invención tienen muchos usos. Por ejemplo,
tales anticuerpos son útiles para detectar polipéptidos de
Repro-PC-1.0 en inmunoensayos. Los
anticuerpos también pueden usarse para rastrear bibliotecas de
expresión para productos de expresión particulares tales como
Repro-PC-1.0 de mamífero. Estos son
útiles para detectar o diagnosticar estados patológicos
relacionados con la presencia de los antígenos respectivos.
Habitualmente, los anticuerpos en tal procedimiento se etiquetan
con un resto que permite la detección fácil de la presencia de
antígeno mediante unión a anticuerpo. Los anticuerpos producidos
contra Repro-PC-1.0 también pueden
usarse para generar anticuerpos antiidiotípicos.
Se usa un número de inmunógenos para producir
anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de
Repro-PC-1.0.
Repro-PC-1.0 de longitud completa es
un inmunógeno adecuado. Típicamente, el inmunógeno de interés es un
péptido de al menos aproximadamente 3 aminoácidos, más típicamente
el péptido tiene una longitud de 5 aminoácidos, preferiblemente el
fragmento tiene una longitud de 10 aminoácidos y más preferiblemente
el fragmento tiene una longitud de 15 aminoácidos o más. Los
péptidos pueden acoplarse a una proteína portadora (por ej., como
una proteína de fusión), o se expresan recombinantemente en un
vector de inmunización. Los determinantes antigénicos sobre
péptidos a los que se unen anticuerpos tienen típicamente una
longitud de 3 a 10. Polipéptidos presentes en la naturaleza también
se usan en forma bien pura o bien impura.
Los polipéptidos recombinantes se expresan en
células eucarióticas y procarióticas y se purifican usando técnicas
estándar. El polipéptido, o una versión sintética del mismo, se
inyecta a continuación en un animal capaz de producir anticuerpos.
Pueden generarse anticuerpos bien monoclonales o bien policlonales
para el uso subsiguiente en inmunoensayos para medir la presencia y
la cantidad del polipéptido.
Métodos para producir anticuerpos policlonales
son conocidos por los expertos en la especialidad. En resumen, un
inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado, un
polipéptido acoplado a un portador apropiado (por ej., GST,
hemocianina de lapa de ojo de cerradura, etc.), o un polipéptido
incorporado en un vector de inmunización tal como un virus vacunal
recombinante (véase la Patente de EE. UU. Nº 4.722.848), se mezcla
con un adyuvante y los animales se inmunizan con la mezcla. La
respuesta inmunitaria del animal a la preparación de inmunógeno se
verifica tomando sangrados de prueba y determinando la valoración de
la reactividad con el polipéptido de interés. Cuando se obtienen
valoraciones apropiadamente altas de anticuerpo para el inmunógeno,
se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Cuando se
desea, se realiza fraccionación adicional del antisuero para
enriquecer con respecto a anticuerpos reactivos hacia el
polipéptido. Véanse, por ej., Coligan (1991) Current Protocols in
Immunology Wiley/Greene. NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY.
Anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y
versiones recombinantes monocatenarias de los mismos, contra
fragmentos predeterminados de proteína de
Repro-PC-1.0 son generados
inmunizando a los animales, por ej., con conjugados de los
fragmentos con proteínas portadoras según se describe
anteriormente.
Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de
células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se
rastrean con respecto a la unión a polipéptidos normales o
modificados, o se rastrean con respecto a la actividad agonista o
antagonista, por ej., actividad mediada a través de
Repro-PC-1.0. En algunos casos, es
deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos
huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres
humanos, etc. Descripciones de técnicas para preparar tales
anticuerpos monoclonales se encuentran, por ej., en Stites et
al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical
Publications, Los Altos, CA, y las referencias citad allí; Harlow y
Lane, Supra; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y
Milstein (1975) Nature 256: 495-497.
Otras técnicas adecuadas implican la selección
de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fágicos o
similares. Véanse Huse et al. (1989) Science 246:
1275-1281; y Ward et al. (1989) Nature 341:
544-546.
Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos
se etiquetarán empalmándose, bien covalentemente o bien no
covalentemente, a una sustancia que proporciona una señal
detectable. Se conoce una amplia variedad de etiquetas y técnicas
de conjugación y se presentan extensamente en la bibliografía tanto
científica como de patentes. Además. pueden producirse
inmunoglobulinas recombinantes. Véase Cabilly, Patente de EE. UU. Nº
4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
86: 10029-10033.
Los anticuerpos de esta invención también se
usan para cromatografía de afinidad al aislar proteínas de
Repro-PC-1.0. Las columnas se
preparan, por ej., con los anticuerpos conectados a un soporte
sólido, por ej. partículas, tales como agarosa, Sephadex o
similares, donde un lisado celular se hace pasar a través de la
columna, se lava y se trata con concentraciones crecientes de un
desnaturalizante suave, con lo que se liberan polipéptidos de
Repro-PC-1.0 purificados.
Un sistema alternativo es la generación de
inmunoglobulinas humanizadas conectando las regiones CDR de
anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante
técnicas de DNA recombinante. Véase Queen et al., patente de
Estados Unidos 5.585.089.
Un sistema adicional para aislar secuencias de
DNA que codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de
unión del mismo es rastreando una biblioteca de DNA procedente de
células B humanas de acuerdo con el protocolo general esbozado por
Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) y a
continuación clonando y amplificando las secuencias que codifican
el anticuerpo (o el fragmento de unión) de la especificidad deseada.
El protocolo descrito por Huse se hace más eficaz en combinación
con la tecnología de presentación en fagos. Véase, por ej., Dower
et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047.
La tecnología de presentación en fagos también puede usarse para
mutagenizar regiones CDR de anticuerpos que previamente se mostraba
que tenían afinidad para receptores de proteína de
Repro-PC-1.0 o sus ligandos. Se
seleccionan anticuerpos que tienen afinidad de unión mejorada.
En otra realización de la invención, se
proporcionan fragmentos de anticuerpos contra proteína de
Repro-PC-1.0. Típicamente, estos
fragmentos exhiben unión específica al receptor de proteína de
Repro-PC-1.0 similar a la de una
inmunoglobulina completa. Los fragmentos de anticuerpo incluyen
cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab',
F(ab')_{2} and Fv. Los fragmentos se producen mediante
técnicas de DNA recombinante, o mediante separación enzimática o
química de inmunoglobulinas intactas.
Los polipéptidos de
Repro-PC-1.0 pueden identificarse
mediante cualesquiera métodos conocidos en la especialidad. En una
realización, los métodos implican detectar el polipéptido con un
ligando que reconoce específicamente el polipéptido. Los
anticuerpos de la invención son particularmente útiles para la
detección específica de polipéptidos de
Repro-PC-1.0. Se conoce en la
especialidad una variedad de métodos de detección basados en
anticuerpos. Estos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo,
inmunoensayos tipo sándwich (incluyendo ELISA), transferencia
Western, aislamiento sobre anticuerpos unidos a una fase sólida y
detección in situ con anticuerpos etiquetados. Otro método
para detectar polipéptidos de
Repro-PC-1.0 implica identificar el
polipéptido de acuerdo con su masa a través de, por ejemplo,
electroforesis en gel, espectrometría de masas o HPLC. Las muestras
en cuestión pueden tomarse de cualquier número de fuentes
apropiadas, tales como sangre, orina, biopsia tisular (por ej.,
tejido de nódulos linfáticos), etc.
Repro-PC-1.0 se
ha encontrado en todo el tejido de adenocarcinoma de próstata
probado. Además, es virtualmente indetectable en células distintas
a las células de cáncer de próstata. Por lo tanto,
Repro-PC-1.0 es un marcador tanto
altamente selectivo como altamente específico para el cáncer de
próstata. De acuerdo con esto, los métodos descritos en la presente
memoria para detectar polinucleótidos de
Repro-PC-1.0 o polipéptidos de
Repro-PC-1.0 en una muestra son
útiles en métodos para diagnosticar el cáncer de próstata, verificar
su avance o tratamiento y determinar el pronóstico del paciente.
Los métodos de la presente invención permiten detectar estados
cancerosos con una confianza incrementada y en una fase temprana,
antes de que las células se detecten como cancerosas basándose en
las características patológicas. Por supuesto, se entiende por los
expertos en diagnóstico que las pruebas diagnósticas se miden por
su grado de especificidad y sensibilidad. Sin embargo, las pruebas
que no son perfectamente específicas o sensibles son útiles en la
diagnosis debido a que proporcionan información útil que, en
combinación con otra evidencia, puede proporcionar una diagnosis
definitiva o indicar el curso del tratamiento.
Métodos para la diagnosis implican determinar
una cantidad diagnóstica de
Repro-PC-1.0 (por ej., mRNA, cDNA o
polipéptido) en una muestra de un paciente y comparar esa cantidad
con un intervalo normal que se espera encontrar en la muestra. No
se ha detectado mRNA o polipéptido de
Repro-PC-1.0 en tejido prostático
normal, y el intervalo normal no es superior que la detección de
fondo. Por lo tanto, cualquier cantidad diagnóstica positiva
detectada por encima del fondo es un signo positivo de cáncer de
próstata. Las muestras usadas para determinar el intervalo normal
de Repro-PC-1.0 pueden ser muestras
normales procedentes del individuo que va a probarse o muestras
normales procedentes de otros individuos que no sufren el estado de
enfermedad.
En una realización, los métodos para
diagnosticar el cáncer de próstata implican detectar
Repro-PC-1.0 sobre la superficie de
células de cáncer de próstata. Las células que expresan la proteína
presentan la sección aminoterminal de
Repro-PC-1.0 sobre sus superficies.
Por lo tanto, los anticuerpos que reconocen el extremo amino de
Repro-PC-1.0 son particularmente
útiles para este propósito. Tales anticuerpos pueden elaborarse,
por ejemplo, inmunizando a un animal con un fragmento de
Repro-PC-1.0 que contiene los
aminoácidos de 1 a aproximadamente 15 del Nº ID SEC:2. En este
caso, las células de prueba se exponen a un anticuerpo etiquetado.
La unión específica del anticuerpo a la célula indica que la célula
expresa Repro-PC-1.0 y es una
indicación positiva de que la célula es una célula de cáncer de
próstata.
Las células de cáncer de próstata pueden
metastasizarse incluso antes de que el cáncer sea detectable a
través de histopatología. Las pruebas diagnósticas de esta
invención permiten detectar células metastáticas en, por ejemplo,
los nódulos linfáticos o la sangre, detectando
Repro-PC-1.0.
Puede usarse una variedad de muestras de
pacientes en los métodos de la invención. Por ejemplo, extractos
celulares, células cultivadas o muestras de tejidos proporcionan
muestras convenientes para el uso con los métodos de la invención.
Los métodos de la invención pueden usar muestras bien en solución o
bien extractos, por ejemplo, con RT-PCR, o muestras
tales como secciones tisulares para métodos de detección in
situ. También pueden obtenerse muestras de fuentes tales como
células recogidas de fluidos y residuos corporales, por ej., orina,
esputo y sangre; lavados, por ej., vejiga y pulmón; y biopsias con
agujas finas, por ej., de próstata; materiales celulares; células
enteras; extractos tisulares y celulares; RNA extraído de tejido y
células; y secciones histológicas de tejido.
Métodos para verificar el curso del cáncer de
próstata implican determinar la cantidad de
Repro-PC-1.0 en una muestra en un
primer y un segundo momento. Los momentos pueden ser durante
exámenes físicos habituales o durante el transcurso del tratamiento
para el cáncer de próstata. Cuando el cáncer de próstata aparece y/o
avanza, se espera que la cantidad de
Repro-PC-1.0 en una muestra se
incremente. La regresión o la cura del cáncer de próstata están
acompañadas por una disminución o eliminación de
Repro-PC-1.0 en una muestra.
El estadio de un tumor es una indicación del
pronóstico del paciente. Se ha encontrado que los tumores de cáncer
de próstata, según se determina por tinción de Gleason, expresan
niveles superiores de Repro-PC-1.0.
Por lo tanto, comparando una cantidad medida de
Repro-PC-1.0 en una muestra de un
sujeto con cantidades de
Repro-PC-1.0 asociadas con diversos
estadios del tumor, puede proporcionarse una prognosis para el
sujeto. Tal valor de pronóstico es útil para planificar el curso
del tratamiento para el sujeto.
Los métodos diagnósticos y de pronóstico también
pueden llevarse a cabo junto con otras pruebas diagnósticas o de
pronóstico. En algunos casos, tales pruebas de combinación pueden
proporcionar información relativa al avance de una enfermedad,
aunque los presentes métodos para probar
Repro-PC-1.0 proporcionan mucha
información útil a este respecto.
Otro método diagnóstico de la invención implica
la administración a un sujeto de una composición etiquetada que se
une específicamente a células que tienen
Repro-PC-1.0, tales como anticuerpos
etiquetados. A continuación, la localización de la etiqueta se
determina mediante cualquiera de los métodos radiológicos conocidos.
Puede usarse cualquier método convencional para visualizar la
obtención diagnóstica de imágenes. Habitualmente, se usan
radioisótopos que emiten partículas gamma y positrones para
obtención de imágenes con cámara y se usan isótopos paramagnéticos
para MRI.
El gen de
Repro-PC-1.0 está situado sobre el
cromosoma 18. Una traslocación en este sitio puede dar como
resultado una alteración de la actividad de
Repro-PC-1.0, tal como una
transcripción activada o una función cambiada. Las traslocaciones
cromosómicas en la vecindad del gen de
Repro-PC-1.0 pueden detectarse
hibridando una sonda etiquetada de esta invención a una extensión
cromosómica. Una traslocación, duplicación o deleción puede
identificarse mediante patrones de hibridación aberrantes en
comparación con los normales. Tales pruebas son útiles para
detectar anormalidades genéticas tales como una disposición familiar
al cáncer de próstata, o el comienzo temprano de la enfermedad. Un
método para la hibridación in situ fluorescente de cromosomas
se proporciona en los
Ejemplos.
Ejemplos.
La presente invención también proporciona
estuches para realizar el método diagnóstico y de pronóstico de la
invención. Tales estuches incluyen una sonda o cebador
polinucleotídico o un anticuerpo específico para
Repro-PC-1.0 e instrucciones para
usar los reactivos para detectar
Repro-PC-1.0 en una muestra de un
paciente.
Inhibir la expresión o la actividad de
Repro-PC-1.0 cambia un cáncer de
próstata de metastático a no metastático. Inhibir la expresión o la
actividad de Repro-PC-1.0 es útil
in vivo en el tratamiento terapéutico y profiláctico del
cáncer de próstata u otros estados que implican expresión de
Repro-PC-1.0. De acuerdo con esto,
los productos de esta invención pueden usarse en métodos para
inhibir la expresión o la actividad de
Repro-PC-1.0. Los métodos implican
poner en contacto una célula de cáncer de próstata, in vitro
o in vivo, con un polinucleótido inhibidor, una inmunotoxina
u otro compuesto que inhiba la expresión o la actividad de
Repro-PC-1.0.
Se contempla una variedad de medios para aportar
un polinucleótido inhibidor a un sujeto incluyendo, por ejemplo,
captación directa de la molécula por una células desde una solución,
captación facilitada a través de lipofección (por ej., liposomas o
inmunoliposomas), transfección mediada por partículas y expresión
intracelular a partir de un casete de expresión que tiene una
secuencia de control de la expresión conectada operativamente a una
secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor.
Métodos útiles para el aporte de polinucleótidos con propósitos
terapéuticos se describen en Inouye et al., Patente de EE.
UU. 5.272.065.
Los agentes, tales como polinucleótidos
inhibidores, inmunotoxinas u otros compuestos que inhiben la
expresión o la actividad de
Repro-PC-1.0, se aportan
preferiblemente en composiciones farmacéuticas que comprenden el
agente y un portador farmacéuticamente eficaz. El agente puede
administrarse mediante cualquier ruta que le dé acceso a células
que expresan Repro-PC-1.0, por
ejemplo, células de tumor de próstata. Esto incluye, por ejemplo,
soluciones acuosas para administración enteral, parenteral o
transmucosal, por ej., para administración intravenosa, como
tónicos, y administración a membranas mucosas y otras como, por
ejemplo, gotas nasales u oculares; composiciones sólidas y otras no
acuosas para aporte enteral o transdérmico, por ej., como píldoras,
comprimidos, polvos o cápsulas; sistemas de aporte transdérmico o
transmucosal para administración tópica, y aerosoles o
nebulizaciones para el aporte mediante inhalación. Una ventaja del
aporte por un modo que sea fácil de administrar, por ej., enteral o
mediante inyección intravenosa o intramuscular, es que tañes modos
imitan posibles modos de aporte cuando el agente se formula como un
producto farmacéutico.
En un caso, la formulación farmacéutica está en
la forma de una dosis unitaria que contiene una cantidad
farmacológicamente eficaz del compuesto inhibidor de
Repro-PC-1.0. La dosis unitaria,
tomada como parte de un régimen terapéutico, da como resultado la
inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata. Así,
las composiciones farmacéuticas, cualquiera que sea su forma, se
administran al sujeto en una cantidad farmacológicamente eficaz.
La cantidad de la formulación farmacéutica
aportada, el modo de administración y el curso temporal del
tratamiento están a discreción del médico asistente. Los
tratamientos profilácticos están indicados para personas con un
riesgo mayor que el promedio de contraer cáncer de próstata, por
ejemplo, personas con niveles elevados de PSA, PAP (fosfatasa ácida
prostática) o PSP (proteína específica de la próstata). Los
tratamientos terapéuticos están indicados para personas
diagnosticadas de cáncer de próstata.
Los presentes inventores han mostrado que los
tumores de próstata desarrollados en machos se vuelven malignos,
mientras que los desarrollados en hembras siguen siendo benignos.
Aunque sin querer limitarse por una teoría, se cree que esta
diferencia se debe al ambiente hormonal. Se cree que la regulación
al alza de la expresión de
Repro-PC-1.0 está directamente o
indirectamente controlada por un elemento de respuesta hormonal que
es sensible a andrógenos, tales como testosterona, pero no a
estrógenos. Sin embargo, independientemente del papel exacto que
represente la expresión de
Repro-PC-1.0 en el cáncer de
próstata, los experimentos presentados en la presente memoria
muestran que alterar el ambiente hormonal cambia el carácter de las
células prostáticas.
Por lo tanto, un método para tratar el cáncer de
próstata implica inhibir el contacto entre la célula de cáncer de
próstata y una hormona que active elementos de respuesta hormonal
que regulan el estado maligno. En una realización, el cáncer de
próstata se trata mediante una disminución de la cantidad de
testosterona en el sistema del sujeto, o incrementando la cantidad
de estrógeno. Métodos para alterar el perfil hormonal de los
sujetos son bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, pueden
administrarse estrógenos para incrementar su cantidad en la sangre,
y se sabe que compuestos tales como flutamida, antagonistas de
hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y acetato de
ciproterona disminuyen la cantidad de andrógenos en el sistema.
También se describen en la presente memoria
vacunas contra células que expresan
Repro-PC-1.0 y métodos para
usarlas.
Se describen en la presente memoria métodos para
provocar una respuesta inmunitaria humoral contra
Repro-PC-1.0. El método implica
inmunizar a un sujeto con una vacuna que comprende una cantidad
inmunogénica de polipéptido de
Repro-PC-1.0 o un análogo de
Repro-PC-1.0 inmunogénico. Tales
vacunas provocan anticuerpos contra
Repro-PC-1.0.
También se describen en la presente memoria
métodos para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de MHC
Clase II contra células que expresan
Repro-PC-1.0. Las moléculas del MHC
Clase II se unen a péptidos que tienen motivos de aminoácido
particulares bien conocidas en la especialidad. La respuesta
dependiente del MHC Clase II implica la captación de un antígeno
por células que presentan antígeno (APC's), su procesamiento y la
presentación sobre la superficie celular como parte de un complejo
de MHC Clase II/péptido antigénico. Alternativamente, las moléculas
del MHC Clase II sobre la superficie celular pueden unirse a
péptidos que tienen el motivo
apropiado.
apropiado.
Las células que presentan antígeno interactúan
con células auxiliares T positivas a CD4, activando de ese modo las
células auxiliares T. Las células auxiliares T activadas estimulan
linfocitos B para producir anticuerpos contra el antígeno. Los
anticuerpos marcan células que tienen el antígeno sobre su
superficie. Las células marcadas se someten a citotoxicidad mediada
por células dependiente de anticuerpos, en la que células NK o
macrófagos, que tienen receptores de Fc, atacan a las células
marcadas.
Métodos para provocan una respuesta inmunitaria
dependiente del MHC Clase II implican administrar a un sujeto una
vacuna que incluye una cantidad inmunogénica de polipéptido de
Repro-PC-1.0 o un análogo de
Repro-PC-1.0 inmunogénico que
incluye un motivo de aminoácido reconocidos por moléculas del MHC
Clase II del sujeto. Alternativamente, células que presentan
antígeno pueden cultivarse con tales péptidos para permitir la
unión, y las células pueden administrarse al sujeto.
Preferiblemente, las células son singeneicas con el sujeto.
También se describen en la presente memoria
métodos para provocar una respuesta inmunitaria mediada por células
dependiente de MHC Clase II contra células que expresan
Repro-PC-1.0 en un sujeto. Moléculas
del MHC Clase I también se unen a péptidos que tienen motivos de
aminoácido particulares bien conocidos en la especialidad. Las
proteínas expresadas en una célula se digieren hasta péptidos, se
asocian con moléculas del MHC Clase I y se presentan sobre la
superficie celular. Allí, son reconocidas por linfocitos positivos a
CD8, generando una respuesta de linfocitos T citotóxicos contra
células que expresan los epítopos en asociación con moléculas del
MHC Clase I. Debido a que las células de cáncer de próstata expresan
Repro-PC-1.0, la generación de
linfocitos T citotóxicos que atacan a tales células es útil en el
tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de próstata.
Un motivo de unión a HLA-A 1
incluye un primer residuo conservado de T, S o M, un segundo residuo
conservado de D o E y un tercer residuo conservado de Y. Otros
segundos residuos conservados son A, S o T. Los residuos
conservados primero y segundo son adyacentes y preferiblemente están
separados del tercer residuo conservado por de 6 a 7 residuos. Un
segundo motivo consiste en un primer residuo conservado de E o D y
un segundo residuo conservado de Y donde los residuos conservados
primero y segundo están separados por de 5 a 6 residuos. El motivo
de unión a HLA-A3.2 incluye un primer residuo
conservado de L, M, I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo
residuo conservado de K, R o Y en el extremo
C-terminal. Otros primeros residuos conservados son
C, G o D y alternativamente E. Otros segundos residuos conservados
son H o F. Los residuos conservados primero y segundo están
separados preferiblemente por de 6 a 7 residuos. El motivo de unión
a HLA-A 11 incluye un primer residuo conservado de
T o V en la posición 2 y un residuo conservado
C-terminal de K. Los residuos conservados primero y
segundo están separados preferiblemente por 6 ó 7 residuos. El
motivo de unión a HLA-A24.1 incluye un primer
residuo conservado de Y, F o W en la posición 2 y un residuo
conservado C-terminal de F, I, W, M o L. Los
residuos conservados primero y segundo están separados
preferiblemente por de 6 a 7
residuos.
residuos.
Un modo metódico de identificar péptidos que
pueden activar una respuesta de células T citotóxicas es preparar
un grupo de fragmentos solapados del polipéptido de aproximadamente
9 a 15 aminoácidos, y probarlos con respecto a la capacidad para
estimular células T. Por ejemplo, el grupo podría incluir fragmentos
que abarcan los aminoácidos 1-15,
2-16, 3-17, etc. Tales fragmentos
pueden prepararse habitualmente mediante un sintetizador de péptidos
y pueden probarse en lotes para disminuir la cantidad de
experimentación necesaria. Por ejemplo, el grupo de 25 fragmentos
solapados que incluye del fragmento 1-15 al
fragmento 25-39 puede probarse en comparación con
un grupo que incluye del fragmento 26-40 al
51-65. Si sólo un grupo muestra actividad, ese grupo
puede dividirse en dos grupos más pequeños y probarse de nuevo,
hasta que se identifiquen péptidos inmunogénicos individuales.
Otro método implica transfectar células ex
vivo con tales vectores de expresión, y administrar las células
al sujeto. Preferiblemente, las células son singeneicas para el
sujeto.
Los métodos para provocar una respuesta
inmunitaria contra Repro-PC-1.0 en
un sujeto son útiles en métodos profilácticos para prevenir el
cáncer de próstata cuando la vacuna se administra a un sujeto que ya
no sufre cáncer de próstata.
Se describe en la presente memoria un método
para activar linfocitos T citotóxicos contra células que expresan
un Repro-PC-1.0, que comprende poner
en contacto linfocitos T ex vivo con un péptido inmunogénico
que comprende un epítopo lineal derivado del
Repro-PC-1.0, el péptido capaz de
inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al
MHC Clase I contra células que expresan el
Repro-PC-1.0.
Se describe en la presente memoria un método
para determinar si una célula expresa polipéptido de
Repro-PC-1.0, que implica las
etapas de poner en contacto la célula con un linfocito T citotóxico
activado contra células que expresan un
Repro-PC-1.0 y determinar si el
linfocito T citotóxico ataca a la célula.
Se describe en la presente memoria un péptido
inmunogénico que comprende un epítopo lineal derivado del
Repro-PC-1.0, el péptido capaz de
inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al MHC
Clase I contra células que expresan
Repro-PC-1.0. En ciertos casos, el
péptido inmunogénico tiene entre 8 y 12 aminoácidos y el epítopo
lineal tiene un motivo de unión a moléculas del MHC Clase I. En otro
caso, el péptido inmunogénico comprende además un epítopo de
células auxiliares T.
El siguiente diagrama proporciona porciones de
la secuencia de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 (Nº ID SEC:2). Se
indican los números de aminoácidos. Las barras entre corchetes sobre
la secuencia de aminoácidos indican motivos de unión a MHC Clase I
o MHC Clase II. Se indican los números de aminoácidos. Péptidos de
aproximadamente 8-15 aminoácidos de longitud que
incluyen estos motivos, incluyendo péptidos cuya secuencia de
aminoácidos total se selecciona de la secuencia de
Repro-PC-1.0, se unen a moléculas
del MHC y pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria
mediada por células o humoral contra
Repro-PC-1.0.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe en la presente memoria una
composición farmacéutica que es capaz de provocar una respuesta
inmunitaria contra Repro-PC-1.0
(por ej., una vacuna) y comprende un portador farmacéuticamente
aceptable y una cantidad inmunogénica de un compuesto seleccionado
de Repro-PC-1.0, un fragmento de
Repro-PC-1.0, un péptido
inmunogénico que comprende un epítopo lineal derivado de
Repro-PC-1.0, el péptido capaz de
inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida al
MHC Clase I o una respuesta inmunitaria restringida al MHC Clase II
contra células que expresan
Repro-PC-1.0.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en la presente memoria
mamíferos no humanos transgénicos para
Repro-PC-1.0. Según se usa en la
presente memoria, "animal transgénico para
Repro-PC-1.0" se refiere a un
animal, en particular un mamífero, cuyas células germinales (es
decir, oocitos o esperma) al menos, comprenden una molécula de ácido
nucleico recombinante que comprende secuencias de control de la
expresión conectadas operativamente a una secuencia de ácido
nucleico que codifica Repro-PC-1.0.
Tales animales son útiles, por ejemplo, como modelos en el estudio
del cáncer de próstata.
En un caso, las secuencias de control de la
expresión no se encuentran naturalmente operativamente conectadas a
Repro-PC-1.0. En un caso, el ácido
nucleico recombinante comprende una secuencia codificante de
Repro-PC-1.0 no natural, es decir,
una secuencia de Repro-PC-1.0 que la
especie no produce en la naturaleza. En un caso, el
Repro-PC-1.0 es un
Repro-PC-1.0 humano. En otro caso,
las secuencias de control de la expresión son secuencias de control
de la expresión no naturales introducidas en las células germinales
a fin de que se recombinen con el gen presente en la naturaleza y
controlen su expresión. Mamíferos transgénicos particularmente
útiles incluyen conejos y roedores tales como ratones.
Los animales transgénicos se producen, por
ejemplo, introduciendo la molécula de ácido nucleico recombinante
en un huevo fertilizado o una célula pluripotencial embrionaria
(ES), típicamente mediante microinyección, electroporación,
lipofección o transferencia génica mediada por partículas. Los
animales transgénicos expresan la secuencia de nucleótidos
heteróloga en tejidos dependiendo de si el promotor es inducible por
una señal para la célula o es constitutivo. Los animales
transgénicos pueden cruzarse con animales no transgénicos para
producir animales transgénicos con características mixtas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos que regulan la expresión o la
actividad de Repro-PC-1.0 son
candidatos como agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer
de próstata. Esta invención proporciona métodos para determinar si
un compuesto regula (por ej., activa o inhibe) la expresión o la
actividad de Repro-PC-1.0.
Métodos para determinar si un compuesto regula
la expresión de Repro-PC-1.0
implican administrar el compuesto a una célula o un animal de
prueba que tiene un gen de
Repro-PC-1.0 expresable, y
determinar si se altera la expresión de
Repro-PC-1.0. En una realización,
los métodos implican administrar el compuesto a un cultivo que
comprende la célula o a un animal de prueba que tiene células que
expresan Repro-PC-1.0, medir la
cantidad del polinucleótido o los polipéptidos de
Repro-PC-1.0 en una muestra
procedente del cultivo o el animal, y determinar si la cantidad
medida es diferente de la cantidad en una muestra procedente del
cultivo o el animal bajo condiciones de control (por ej., a los que
no se ha administrado compuesto). Las diferencias estadísticamente
significativas (p < 0,05) entre la cantidad medida a partir de la
muestra de prueba y a partir de la muestra de control se registran
e indican que el compuesto altera la cantidad de
Repro-pc-1.0 producida por la
célula.
Métodos para determinar si un compuesto regula
la actividad biológica de
Repro-PC-1.0 implican poner en
contacto una célula que expresa
Repro-PC-1.0 con el compuesto y
determinar si se altera la actividad de
Repro-PC-1.0.
Repro-PC-1.0 tiene un nivel
significativo de identidad de secuencia de aminoácidos con las
sinaptotagminas; por lo tanto, se cree que
Repro-PC-1.0 funciona en las
reacciones de fusión de membranas y gemación de membranas en la
exocitosis. La exocitosis es el proceso por el cual una vesícula
intracelular se fusiona con el plasmalema. Como resultado, el
contenido de la vesícula se libera en el medio extracelular
(secreción) y los componentes de la membrana vesicular pasan a
formar parte del plasmalema. Algunas vesículas se fusionan con el
plasmalema constitutivamente, mientras que otras se acumulan bajo
el plasmalema y se fusionan solo después de un estímulo apropiado.
La exocitosis constitutiva es usada por las células para la
secreción de proteínas no regulada y para la inserción en el
plasmalema de componentes proteínicos recientemente sintetizados. La
exocitosis regulada es característica de gránulos secretores
derivados del complejo de Golgi, que almacenan productos secretores
concentrados, y de vesículas especializadas tales como vesículas
sinápticas, que almacenan neurotransmisores.
Los ensayos de actividad incluyen detectar
cambios en los niveles de las secreciones al medio o cambios en la
capacitancia de la membrana después de la introducción de
inhibidores potenciales de
Repro-PC-1.0 tales como nucleótidos
antisentido, anticuerpos
anti-Repro-PC-1.0.,
fragmentos peptídicos de
Repro-PC-1.0 u otras moléculas en
bibliotecas combinatorias. Se usan métodos inmunológicos para
detectar cambios en los niveles de moléculas liberadas, tales como,
pero no limitadas a, PSA, PAP, PSP, al medio, con, por ej., estuches
de ensayo disponibles comercialmente (J. Steroid Biochem. Molec.
Biol., 37:849 (1990)). La liberación de neurotransmisor o ATP puede
detectarse mediante HPLC o mediante ensayos de
luciferina-luciferasa, respectivamente (Science,
256:1820 (1992)). Alternativamente, las células pueden
radioetiquetarse y la liberación del contenido de los gránulos
secretores podría medirse mediante escintigrafía (Cell, 70:765
(1992)). La exocitosis incrementada también puede detectarse
verificando incrementos en la capacitancia de la membrana. En este
caso, la corriente de transmembrana se mide usando métodos
convencionales de pinzamiento zonal
("patch-clamp") en células enteras (Neuron,
10:21 (1993); Nature, 364:540 (1993)).
El compuesto que ha de probarse puede
seleccionarse de un número de fuentes. Por ejemplo, bibliotecas
combinatorias de moléculas están disponibles para experimentos de
rastreo. Usando tales bibliotecas, pueden rastrearse miles de
moléculas con respecto a la actividad reguladora. En una realización
preferida, métodos de rastreo de alto rendimiento implican
proporcionar una biblioteca que contiene un gran número de
compuestos terapéuticos potenciales (compuestos "candidatos").
Tales "bibliotecas químicas combinatorias" se rastrean a
continuación en uno o más ensayos, según se describe en la presente
memoria, para identifican aquellos miembros de la biblioteca
(especies químicas particulares o subclases) que presentan una
actividad característica deseada. Los compuestos así identificados
pueden servir como "compuestos de partida" o pueden usarse por
sí mismos como agentes terapéuticos potenciales o
reales.
reales.
La preparación y el rastreo de bibliotecas
químicas combinatorias son bien conocidos para los expertos en la
especialidad. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen,
pero no se limitan a, bibliotecas de péptidos (véanse, por ej., la
Patente de EE. UU. 5.010.175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res.,
37: 487-493, Houghton et al. (1991) Nature,
354: 84-88): La síntesis de péptidos no es en
absoluto en único sistema ideado y pretendido para el uso con la
presente invención. También pueden usarse otras sustancias químicas
para generar bibliotecas con diversidad química. Tales sustancias
químicas incluyen, pero no se limitan a: peptoides (Publicación PCT
Nº WO 91/19735, 26 dic. 1991), péptidos codificados (Publicación PCT
WO 93/20242, 14 oct. 1993), biooligómeros aleatorios (Publicación
PCT WO 92/00091, 9 en. 1992), benzodiazepinas (Pat. EE. UU. Nº
5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y
dipéptidos (Hobbs et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA
90: 6909-691.3), polipéptidos vinílogos (Hagihara
et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568),
peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de
beta-D-glucosa (Hirschmann et
al., (1992) J. Amer. Chew. Soc, 114: 9217-9218),
síntesis orgánica análoga de bibliotecas de compuestos pequeños
(Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661),
oligocarbamatos (Cho, et al., (1993) Science 261:1303), y/o
peptidilfosfonatos (Campbell et al., (1994) J. Org. Chem.
59: 658). Véase, generalmente, Gordon et al., (1994) J. Med.
Chem. 37:1385, bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de
ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ej., la Patente de EE. UU.
5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ej., Vaughn
et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3):
309-314), y PCT/US96/10287), bibliotecas de
carbohidratos (véanse, por ej., Liang et al. (1996) Science,
274: 1520-1522, y la Patente de EE. UU. 5.593.853)
y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas, (véanse, por ej.,
benzodiazepinas, Baum (1993) C&EN, 18 enero, página 33,
isoprenoides, Patente de EE. UU. 5.569.588, tiazolidinonas y
metatiazanonas, Patente de EE. UU. 5.549.974, pirrolidinas, Patente
de EE. UU. 5.525.735 y 5.519.134, morfolinocompuestos, Patente de
EE. UU. 5.506.337, benzodiazepinas, 5.288.514, y
similares).
similares).
Dispositivos para la preparación de bibliotecas
combinatorias están disponibles comercialmente (véanse, por ej.,
357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony,
Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050
Plus, Millipore, Bedford, MA).
Compuestos inhibidores que inhiben la expresión
de Repro-PC-1.0 se identifican o son
identificables mediante los métodos de rastreo de esta
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La identificación de formas cognadas o
polimorfas del gen de Repro-PC-1.0 y
el seguimiento de esos polimorfismos en individuos y familias son
importantes en el rastreo genético. De acuerdo con esto, esta
invención proporciona métodos útiles para detectar formas
polimorfas del gen de Repro-PC-1.0.
Los métodos implican comparar la identidad de un nucleótido o
aminoácido en una posición seleccionada de la secuencia de un gen de
Repro-PC-1.0 de prueba con el
nucleótido o aminoácido en la posición correspondiente de la
secuencia de Repro-PC-1.0 natural
(Nº ID SEC:1). La comparación puede llevarse a cabo mediante
cualesquiera métodos conocidos en la especialidad, incluyendo la
comparación directa de secuencias mediante secuenciación de
nucleótidos, comparación de secuencias o determinación mediante
hibridación o identificación de RFLPs.
En una realización, el método implica
secuenciación de nucleótidos o aminoácidos de todo el polinucleótido
o polipéptido de prueba, o una subsecuencia de él, y comparar esa
secuencia con la secuencia de
Repro-PC-1.0 natural. En otra
realización, el método implica identificar fragmentos de restricción
producidos durante la digestión con enzimas de restricción del
polinucleótido de prueba y comparar esos fragmentos con fragmentos
producidos mediante digestión con enzimas de restricción de gen de
Repro-PC-1.0 natural. Los fragmentos
de restricción procedentes del gen natural pueden identificarse
mediante análisis de la secuencia para identificar sitios de
restricción. Otra realización implica el uso de series
oligonucleotídicas. (Véase, por ej., Fodor et al., patente
de Estados Unidos 5.445.934.). El método implica proporcionar una
serie oligonucleotídica que comprende un grupo de sondas
oligonucleotídicas que definen secuencias seleccionadas de la
secuencia de Repro-PC-1.0 natural,
generar datos de hibridación realizando una reacción de hibridación
entre las moléculas polinucleotídicas diana y las sondas del grupo
y detectar la hibridación entre las moléculas diana y cada una de
las sondas del grupo y procesar los datos de hibridación para
determinar las posiciones de nucleótidos en las que la identidad de
la molécula diana difiere de la de
Repro-PC-1.0 natural. La comparación
puede realizarse manualmente, pero se realiza más convenientemente
mediante un ordenador digital
programable.
programable.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando un sistema modélico de células tumorales
de próstata humanas LNCaP, se originaron tumores en ratones
atímicos tanto macho como hembra. Los tumores, que típicamente
tardaban al menos 2-3 meses en desarrollarse en
masas palpables, mostraban rasgos notablemente diferentes
dependiendo de si se propagaban en un ambiente femenino o
masculino. Los tumores que se desarrollaban en ratones macho
(LNCaP-macho) mostraban una vascularización y una
destrucción morfológica intensivas en comparación con la composición
altamente regular y homogénea de los tumores originados en hembras
(LNCaP-hembra) (Figura 1). Adicionalmente, los
tumores originados en huéspedes macho habían ganado potencial
metastático, mientras que nunca de detectaban metástasis en ratones
hembra. Las diferencias morfológicas de estos tumores sugerían la
posibilidad de que secuencias específicas implicadas en la
progresión metastática y/o la angiogénesis se hayan inducido en el
ambiente masculino.
La expresión aberrante de un número de oncogenes
y factores de crecimiento (regulación al alza) así como los genes
supresores de tumores (regulación a la baja) se han relacionado con
un número de tumores humanos y con el avance del cáncer en general.
Por lo tanto, los presentes inventores examinaron la expresión de un
conjunto representativo de secuencias para investigar si la
apariencia diferente de los tumores LNCaP derivados de macho era el
resultado de una regulación al alza o a la baja conducida por
andrógenos de un factor previamente caracterizado. RNA aislado de
LNCaPs-macho, LNCaPs-hembra, células
LNCaP, células PC-3 (una línea celular prostática
humana no sensible a andrógenos), tejido de bazo humano normal y
tejido de hígado humano normal se sometió a hibridación Northern
usando una variedad de sondas de oncogenes, factores de crecimiento
y supresores de tumores previamente caracterizados. Como puede
observarse en la Tabla 1, no existía diferencia en el patrón de
expresión detectado en tumores LNCaP-macho en
comparación con tumores LNCaP-hembra o con células
LNCaP desarrolladas in vitro, indicando que el estado
diferenciado de los tumores LNCaP-macho no se debía
a la diferente expresión de cualquiera de estos factores más
comunes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar secuencias que se sobreexpresan en
tumores LNCaP-macho y que podrían elucidar el
mecanismo o los mecanismos responsables de las diferencias
morfológicas drásticas, los presentes inventores generaron una
sonda específica de LNCaP-macho mediante tres rondas
de hibridación sustractiva con cDNA de tumor de
LNCaP-hembra. Esta sonda específica de
LNCaP-macho se usó a continuación para realizar un
rastreo primario de una biblioteca de cDNA de tumor
lambda-ZAP-LNCaP-macho.
Las calvas positivas se sometieron a un rastreo secundario doble,
usando la sonda específica de LNCaP-macho y cDNA de
tumor LNCaP-hembra total. Los clones se consideraban
positivos si se hibridaban fuertemente a la sonda "específica
para macho" y débilmente a la sonda de hembra.
Los positivos resultantes se sometieron a un
rastreo terciario en el que los clones se "rescataban" y su DNA
plasmídico se sometía a hibridaciones Southern duplicadas usando
cDNA de LNCaP-macho total o
LNCaP-hembra total. El DNA procedente de los clones
que se hibridan más fuertemente a secuencias de
LNCaP-macho se sometió a continuación a análisis
Northern. El DNA procedente de un clon,
Repro-PC-1.0, cuando se hibridaba a
cantidades equivalentes de RNA procedente de tumores
LNCaP-macho, tumores de LNCaP-hembra
o células LNCaP, mostraba una amplificación de ~10X de un solo mRNA
de 4,4 kb en tumores LNCaP-macho (Figura 2a). La
rehibridación de la misma transferencia con sondas para actina y
tubulina mostraba que la señal amplificada detectada por
Repro-PC-1.0 en tumores
LNCaP-macho no se debía a un nivel incrementado de
RNA en ese carril (Figura 2b).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de secuencias inicial del clon
Repro-PC-1.0 no revelaba marcos de
lectura abiertos (ORFs) significativos en ninguna dirección.
Subsiguientemente, un clon solapado (PS5-1) se aisló
de la biblioteca de tumores LNCaP-macho mediante
hibridación con una sonda oligonucleotídica que codifica secuencias
5' contenidas dentro del inserto de
Repro-PC-1.0. La direccionalidad del
clon Repro-PC-1.0 se infería de la
presencia de una cola de poli-A putativa. La región
codificante completa se determinó sometiendo a secuenciación
PSS-1 y un clon de cDNA del extremo 5' derivado por
RACE-PCR. El alineamiento de estos clones se muestra
en la Figura 3. Los análisis Northern de los 2 clones solapados a
conjuntos de RNA aislado de tumores LNCaP-macho,
tumores LNCaP-hembra, células LNCaP y células
PC-3 revelaban el mismo patrón de hibridación que se
observaba originalmente con
Repro-PC-1.0.
El análisis de secuencia de los clones solapados
revelaba un solo ORF de 1275 pb que codifica 425 aminoácidos,
seguido por una región no traducida 3' de 2466 pb a la que se añadía
una cola de poliadenilato (Nº ID SEC: 1). La secuencia obtenida
para la región no traducida 5' de
Repro-PC-1.0 era mucho más corta que
los aproximadamente 750 pb de la secuencia predicha, basándose en
el tamaño del mensaje de 4,4 kb que se observaba mediante
hibridaciones por transferencia de RNA, y por lo tanto
probablemente esté incompleta. Se calculó que el Mr y el pI eran
48.070 y 8,83, respectivamente.
La identidad y la similitud de secuencia se
determinaron usando el programa FASTDB, Bionet suite, Oxford
Molecular Group, Campbell, CA o BLASTX, NCBI.
La secuencia de aminoácidos predicha de la
región C-terminal de Repro-PC- 1.0
contenía dos copias de una repetición directa de 116 aminoácidos
que tenían 34% de identidad (41% de similitud) entre sí. Estas
repeticiones se situaban desde el aminoácido 150 hasta el 252 y
desde el aminoácido 276 hasta el 396. Se encontró que las
repeticiones eran homólogas al dominio regulador C2 de isoformas
dependientes de calcio de proteína quinasa C (PKC) y a isoformas de
sinaptotagmina (Figura 4).
La sinaptotagmina es realmente una familia de
proteínas vesiculares sinápticas abundantes altamente conservadas
que se ha propuesto que representan un papel en la traslocación de
vesículas sinápticas al sitio de liberación presináptico de la
membrana plasmática (atraque) y/o la fusión de estas dos membranas.
Estructuralmente, las isoformas de sinaptotagmina pueden dividirse
en varios dominios que incluyen: un dominio aminoterminal
intravesicular; un solo dominio de transmembrana; y un dominio
carboxiloterminal citoplásmico que consiste en dos repeticiones
homólogas al dominio regulador C2 de PKC denominadas A y B (Figura
4). Los homólogos de sinaptotagmina han mostrado mayor conservación
de identidad y similitud de secuencia en el dominio citoplásmico que
contiene las dos repeticiones homólogas a C2 de PKC que en los
dominios intravesiculares N-terminal o de
transmembrana.
La Figura 5 muestra el alineamiento de las
secuencias de aminoácidos para
Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina IV de
rata. Repro-PC-1.0 muestra 90% de
identidad global con sinaptotagmina IV de rata. Como las otras
isoformas de sinaptotagmina,
Repro-PC-1.0 era el más similar a
estas secuencias en la región C-terminal de la
repetición C2 de PKC (91% de identidad). Las dos repeticiones
internas de Repro-PC-1.0 son
aproximadamente tan homólogas entre sí (34% de identidad) como la
región correspondiente de PKC (identidad entre 35% y 43% dependiendo
de la isoforma). Como en las otras formas de sinaptotagmina, los
residuos de aminoácido que son idénticos entre las dos repeticiones
internas de Repro-PC-1.0 también se
conservan entre Repro-PC-1.0 y PKC,
revelando una secuencia de consenso central de SDPYV/IK seguida por
un tramo de residuos básicos (Figura 6).
Las representaciones de la hidrofobia de la
secuencia de aminoácidos de
Repro-PC-1.0 revelaba un solo
segmento, desde los residuos 15-37, de longitud e
hidrofobia suficientes para constituir un dominio de transmembrana.
Aunque este dominio no se alinea colinealmente con el dominio
correspondiente de las otras sinaptotagminas, también presenta los
límites de transmembrana inusuales encontrados para otras
sinaptotagminas. El límite N-terminal del dominio
de transmembrana putativo está flanqueado por una prolina, el
extremo C del dominio está flanqueado por residuos de cisteína
seguidos por una región altamente cargada positivamente.
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Los análisis por transferencia Southern de la
hibridación de Repro-PC-1.0 a DNA
genómico humano revelaban un patrón no complejo que indicaba una
secuencia de una sola copia. El análisis de la hibridación de
Repro-PC-1.0 a DNAs genómicos
procedentes de un conjunto de especies filogenéticamente distintas
mostraba que las secuencias que codifican
Repro-PC-1.0 estaban altamente
conservadas, hibridándose a DNA de levadura incluso bajo condiciones
de alta restricción. Un solo gen de
Repro-PC-1.0 evolutivamente
conservado se localiza en el cromosoma 18.
Para comparar la expresión de
Repro-PC-1.0 en próstata normal con
adenocarcinomas prostáticos e hiperplasias benignas, secuencias de
Repro-PC-1.0 se amplificaron
específicamente a partir de RNA aislado de un número de fuentes
tisulares bien caracterizadas mediante RT-PCR. Estos
productos se fraccionaron, se transfirieron y se hibridaron con una
sonda de Repro-PC-1.0 y el nivel de
expresión se graduó mediante la intensidad de señal relativa de las
bandas específicas de Repro-PC-1.0
(Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las secuencias de
Repro-PC-1.0 solo estaban presentes
en los RNAs aislados de muestras de adenocarcinoma de próstata y no
eran detectables en muestras que representan hiperplasias benignas.
La señal marginal detectada en tejido prostático normal puede
reflejar el principio de un cáncer de próstata no diagnosticado, ya
que la fuente del tejido era un hombre mayor. Para asegurar que las
secuencias amplificadas no se debían a contaminantes de DNA
genómico, se realizaron reacciones de control, añadiendo RNasa o
DNasa antes de la etapa de síntesis de la 1ª hebra. Según se
muestra en la Tabla 2, la adición de DNasa no tenía el efecto del
nivel de señal detectado en muestras de adenocarcinoma de próstata,
mientras que el tratamiento con RNasa erradicaba la señal,
indicando que la señal de hibridación a
Repro-PC-1.0 detectada en las
muestras de adenocarcinoma se debía a secuencias de RNA de
Repro-PC-1.0 y no se debía a
secuencias genómicas contaminantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de
Repro-PC-1.0 en carcinomas y tejidos
adicionales se investigó mediante análisis por transferencia de
RNA. La Tabla 3 lista las líneas celulares de carcinoma y los
tejidos humanos diferentes que se rastreaban con respecto a la
expresión de Repro-PC-1.0. No se
detectaba expresión de Repro-PC-1.0
en ninguna otra línea celular de carcinoma prostático o no
prostático además de la línea LNCaP, ni se detectó en ningún otro
tejido normal excepto para el cerebro. De forma interesante, este
es precisamente el tejido en el que se expresa la familia de las
sinaptotagminas, sugiriendo que las células LNCaP están expresando
aberrantemente un gen que codifica una proteína implicada en la
ruta secretora regulada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar si
Repro-PC-1.0 podría representar o no
una isoforma de sinaptotagmina humana que se expresaba
diferencialmente en células tumorales LNCaP, los presentes
inventores compararon la expresión de
Repro-PC-1.0 y sinaptotagmina
humana en células LNCaP, tejido cerebral, células PC12 (línea
celular medular adrenal de rata) y en una línea celular de
carcinoma humano que expresa
Repro-PC-1.0 o sinaptotagmina,
RL95-2. RNA aislado de cada una de estas fuentes se
hibridó a sondas bien específicas para
Repro-PC-1.0 o bien específicas para
sinaptotagmina humana. Ambas formas son detectables en RNA aislado
de cerebro humano normal, pero sólo
Repro-PC-1.0, y no sinaptotagmina
humana, se expresa en células LNCaP. De forma interesante, solo las
secuencias de Repro-PC- 1.0 son detectables en
células PC12 que normalmente expresan sinaptotagmina I cerebral de
raya. La sinaptotagmina I cerebral de rata no habría sido
detectable con las sondas bien específicas para sinaptotagmina
humana o bien específicas para
Repro-PC-1.0. La hibridación cruzada
de Repro-PC-1.0 a RNA de PC12
sugiere que un homólogo de rata de
Repro-PC-1.0 también podría
expresarse en células PC12 y puede participar en la secreción
regulada. Así, la expresión de
Repro-PC-1.0 está regulada al alza
específicamente y diferencialmente en células tumorales LNCaP,
representando una nueva isoforma de sinaptotagmina cerebral humana
que se hibrida cruzadamente con un homólogo de rata, distinta de la
sinaptotagmina I cerebral de rata, normalmente expresada en células
PC 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas específicas para tumores permiten
adquirir una nueva percepción de los mecanismos que contribuyen al
avance hasta una enfermedad maligna. La línea celular LNCaP
proporciona un modelo útil de cáncer de próstata que ha resultado
valioso para comprender el cáncer de próstata. Estas células se
usaron para originar xenoinjertos de tumor de próstata humano en
ratones atímicos tanto macho como hembra. Las observaciones
iniciales de los presentes inventores de diferencias histológicas y
morfológicas dependientes del sexo del huésped en la producción de
tumores les movieron a investigar estas dos formas de tumor como una
fuente potencial de RNA para desarrollar un rastreo sustractivo
para identificar proteínas expresadas unívocamente en un tumor que
ha avanzado a través de vascularización (angiogénesis) y ha ganado
carácter metastático.
La tumorigénesis a menudo se asocia bien con una
activación de un oncogén o bien con la desactivación de un gen
supresor de tumor (antioncogén). Los presentes inventores compararon
el nivel de expresión de un número de oncogenes, genes supresores
de tumores, factores de crecimiento y el receptor de andrógeno entre
los tumores LNCaP irregulares en un ambiente masculino, con tumores
LNCaP desarrollados en un ambiente femenino, con células LNCaP
desarrolladas in vitro, con otra línea celular de cáncer de
próstata humano no sensible a andrógenos y con tejido humano
normal. Debido a que los tumores desarrollados en huéspedes macho
mostraban un perfil que era similar a tumores desarrollados en
hembras y a células LNCaP desarrolladas in vitro, los
presentes inventores consideraron los dos tumores morfológicamente
distintos como una fuente adecuada de mensaje potencial.
\vskip1.000000\baselineskip
Células linfoblásticas cultivadas se incuban con
BrdU y nacadozol durante de 3 a 5 horas antes de recoger con
tripsina y reunir mediante centrifugación. Las células se
resuspenden en KCl y se fijan en suspensión con metanol/ácido
acético sobre hielo durante 30 min. La suspensión celular se pone
sobre portaobjetos de microscopio y se seca lentamente a 70ºC, 80%
de humedad. Una sonda de cDNA biotinilada, complementaria a
Repro-PC-1.0, se genera usando
protocolos estándar (Labeling and colorimetric detection of
non-isotopic probes. En "Current Protocols in
Molecular Biology", F.M. Ausubel, et al., Eds., pp. 3, 18,
1-3,18.7, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York).
La sonda biotinilada se diluye hasta 3 ng/\mul en un tampón de
hibridación que contiene formamida al 50%, dextrano al 10%, 2 X
SSC, 50 \mug/ml de DNA de Cot-1 y se incuba
durante la noche a 37ºC con la extensión de células fijada que se
ha preincubado con tampón de hibridación. Los portaobjetos se lavan
dos veces con 0,5 X SSC a 70ºC, una vez con 4X SSC a temperatura
ambiente, una vez con diluyente para anticuerpos (BSA al 1%, 4X
SSC) a temperatura ambiente durante 5 min. y se incuban durante 20
min. a 37ºC con avidina conjugada a FITC diluida (10 \mug/ml) en
diluyente para anticuerpos. Los portaobjetos se lavan tres veces
con un tampón que contiene 4X SSC, a continuación con un tampón que
contiene 4X SSC, Tween 20 al 0,05%, a continuación con un tampón
que contiene 4X SSC seguido por tinción por contraste durante 2 min
con DAPI (200 ng/ml en 4X SSC) y lavado con 4X SSC. El fluido en
exceso se seca con papel y los portaobjetos se montan con un
reactivo estabilizante de FITC que contiene dihidrocloruro de
p-fenilendiamina en glicerol al 90%. El perfil de
hibridación se determina usando un microscopio
fluorescente.
fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente protocolo es útil para amplificar
Repro-PC-1.0 a partir de una muestra
de células.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se extirpa la próstata del paciente
- 2.
- Menos de 15-30 minutos después de que se haya extirpado la próstata del paciente, identifíquense áreas normales y cancerosas y retírense aproximadamente 100-300 mg de tejido (aproximadamente 1 cm X 0,5 cm X 0,4 cm) de cada área.
- 3.
- Si el RNA va a extraerse en un momento posterior, entonces colóquese cada bloque de tejido en un trozo etiquetado previamente de papel de aluminio de gran resistencia e introdúzcase inmediatamente en nitrógeno líquido.
- 4.
- Almacénense los tejidos en el congelador a -70ºC.
- 5.
- Las porciones embebidas se seccionan y se le dan al patólogo para la determinación.
- 6.
- El resto de la próstata se fija en formaldehído.
- 7.
- Cuando esté listo para usar, extráigase el RNA como sigue:
- 8.
- Déjese caer el tejido congelado en 3 ml de Trizol (GIBCOBRL, número de catálogo 15596-018) y homogenéicese usando un homogeneizador de tejidos Politron, Tissumizer u otro adecuado.
- 9.
- Incúbese la muestra homogeneizada durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- 10.
- Añádanse 600 \mul de cloroformo (200 \mul de cloroformo por ml de Trizol).
- 11.
- Mézclense durante 15 segundos y déjense asentar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
- 12.
- Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
- 13.
- Retírese cuidadosamente la capa acuosa incolora superior.
- 14.
- Precipítese el RNA usando un volumen igual de isopropanol.
- 15.
- Déjese que las muestras se asienten a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- 16.
- Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
- 17.
- Retírese el sobrenadante y lávese la pella, rompiendo la pella y pipeteando hacia arriba y hacia abajo, con etanol al 75% enfriado con hielo en agua libre de RNasa.
- 18.
- Centrifúguese a 12000 X g durante 15 minutos a 4ºC.
- 19.
- Retírese el sobrenadante y séquese la pella en Speed-Vac durante 2-3 minutos.
- 20.
- Resuspéndase el RNA en agua libre de RNasa e incúbese a 65ºC durante 10 minutos.
- 21.
- Tómense lecturas de DO a 260 y 280 nm (para muestras concentradas, debe usarse una dilución 1:125 de la muestra para leer los valores de DO. El factor de conversión sería así la A_{260} de la muestra multiplicada por el factor de dilución de 125 multiplicado por 40 \mug/ml (Muestra A_{260} X 125 X 40 \mug/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de RNA deben tratarse con DNAsa I
(GIBCOBRL, número de catálogo 18068-015) antes de
usar en la síntesis de cDNA y la PCR para suprimir cualquier DNA
genómico contaminante. Trátense las muestras con DNasa como
sigue:
- 1.
- Añádanse a un tubo de microcentrífuga:
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Incúbense los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- 3.
- Inactívese la DNasa I añadiendo 1 \mul de EDTA 25 mM.
- 4.
- Caliéntese durante 10 minutos a 65ºC.
Transcríbase inversamente el RNA como sigue:
- 1.
- En un tubo de microcentrífuga, mézclese lo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Incúbese a 70ºC durante 10 minutos y enfríese bruscamente con hielo durante 2 minutos.
- 3.
- En un tubo de microcentrífuga, prepárese la siguiente mezcla de reacción en el orden indicado:
\vskip1.000000\baselineskip
- 4.
- Añádanse 7 \mul de la mezcla anterior a cada una de las mezclas de RNA/hexámeros aleatorios.
- 5.
- Mézclese y centrifúguese brevemente.
- 6.
- Incúbese a temperatura ambiente durante 5 minutos
- 7.
- Añádase 1 \mul (200 unidades) de SUPERSCRIPT II RT (GIBCOBRL, número de catalogo 18064-014), mézclense e incúbense a temperatura ambiente durante 10 minutos (no añadir RT al tubo de control Sin RT).
- 8.
- Transfiéranse los tubos hasta 42ºC e incúbense durante 50 minutos.
- 9.
- Termínense las reacciones incubando a 70ºC durante 15 minutos.
- 10.
- Enfríese sobre hielo durante 2 minutos y centrifúguese brevemente.
- 11.
- Añádase 1 \mul de RNasa H (GIBCOBRL, número de catálogo 18021-022) e incúbese durante 20 minutos a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Realícese la serie de dilución de mímico como
sigue:
- 1.
- Etiquétense ocho tubos de microcentrífuga de 0,5 ml 1-8.
- 2.
- Prepárese una reserva de 100 attomol/\mul para cada uno de los mímicos. Todas las diluciones deben realizarse en solución de dilución de mímico (es decir TE que contiene 10 \mug/ml de glicógeno de calidad para ácidos nucleicos):
- Prepárense 20 \mul de una dilución 1:10 de la reserva de 100 attomol/\mul y etiquétese este tubo como 10 attomol/\mul.
- Añádanse 18 \mul se solución de dilución de mímico al tubo 1 y añádanse 2 \mul desde el tubo de 10 attomol/\mul. Para elaborar la serie duplicada, prepárense 20 \mul de una dilución 1:10 de la reserva de 10 attomol/\mul y etiquétese este tubo como "1".
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- Prepárense el resto de las soluciones de reserva de mímico como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En la tabla posterior se resumen las
concentraciones molares y másicas para la serie de dilución de G3PDH
(gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa) y PC1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Establézcase la PCR como sigue:
- 1.
- Numérense los pocillos de una placa de PCR o los tubos de PCR 1-8.
- 2.
- Añádase 1 \mul del mímico correspondiente al número del tubo (por ej., el tubo Nº 1 da 1 \mul de mímico Nº 1, etc.). Manténgase la placa o el tubo sobre hielo.
- 3.
- Fórmese la siguiente mezcla (elabórese suficiente mezcla para n+1 reacciones, es decir 9 reacciones). Manténgase el tubo de mezcla sobre hielo:
- 4.
- Añádanse 24 \mul a cada uno de los pocillos o al tubo a los que ya se ha añadido el mímico en la etapa 2 anterior. Manténgase la placa o el tubo sobre hielo mientras se añade la mezcla.
- 5.
- Realícese PCR usando el siguiente ciclo:
- 6.
- Háganse pasar 10 \mul del producto sobre un gel de agarosa en TAE al 2% con una escalera de 1 kb como marcador.
La presente invención proporciona nuevos
polinucleótidos que codifican un marcador específico para tumores
de próstata, Repro-PC- 1.0, la proteína codificada
por él y métodos para usar estos materiales. Aunque se han
proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es
ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la invención se
harán evidentes para los expertos en la especialidad al revisar esta
memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invención debe
determinarse sin referencia a la descripción anterior, pero en
cambio debe determinarse con referencia a las reivindicaciones
adjuntas en conjunto con su alcance completo de equivalentes.
Todas las publicaciones y los documentos de
patente citados en esta solicitud se incorporan mediante referencia
en su totalidad para todos los propósitos en la misma extensión que
si cada publicación o documento de patente individual se apuntara
así individualmente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: French, Cynthia K.
\hskip1.5cmSchneider, Patrick A.
\hskip1.5cmYamamoto, Karen K.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Marcador Específico para el Cáncer de Próstata
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: TOWNSEND and TOWNSEND and CREW LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Embarcadero Center, 8th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU. de A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: (pendiente de asignar)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: (junto con la presente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dow, Karen B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29.684
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 018002-000210US
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-576-0200
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFÁX: 415-576-0300
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 151..1425
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 425 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:2:
Claims (27)
1. Un polinucleótido no presente en la
naturaleza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes de polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC:2.
2. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica
polipéptido de Repro-PC-1.0 natural
que se muestra en el Nº ID SEC:2.
3. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un
polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC:2.
4. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica
al menos 100 aminoácidos consecutivos procedentes del polipéptido
de Repro-PC-1.0 es idéntica a una
secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC:1.
5. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica
a los nucleótidos 151-1425 del Nº ID SEC:1.
6. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un
polipéptido de Repro-PC-1.0
inmunogénico de al menos 100 aminoácidos consecutivos de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:2.
7. Una sonda o un cebador polinucleotídico de al
menos 15 nucleótidos que se hibrida específicamente a una secuencia
de nucleótidos seleccionada de cDNA de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC:1 y su complemento, en donde la sonda o el cebador no es la
secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5.
8. La sonda o el cebador polinucleotídico de
acuerdo con la reivindicación 7, cuya secuencia es idéntica o
complementaria a una secuencia de nucleótidos seleccionada de cDNA
de Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:1.
9. La sonda polinucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, que comprende además una etiqueta.
10. Un polinucleótido no presente en la
naturaleza que comprende una secuencia de control de la expresión
conectada operativamente a un polinucleótido como el definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Una célula no presente en la naturaleza que
comprende un polinucleótido recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10.
12. Un método para detectar un polinucleótido
que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de cDNA de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC: 1 o su complemento en una muestra, que comprende las etapas
de:
- (a)
- poner en contacto la muestra con una sonda o cebador polinucleotídico que comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos que se hibrida específicamente a la secuencia de nucleótidos, en donde la sonda o el cebador no es la secuencia de SYT4 mostrada en la Figura 5; y
- (b)
- detectar si el polinucleótido se ha hibridado específicamente al polinucleótido,
con lo que la hibridación específica proporciona
una detección del polinucleótido en la muestra.
13. Un polipéptido de
Repro-PC-1.0 recombinante purificado
cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la del Nº ID SEC: 2, o
cuya secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica al Nº ID
SEC:2.
14. Un polipéptido de
Repro-PC-1.0 que no está presente en
la naturaleza, que comprende una secuencia de al menos 100
aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia de aminoácidos
del polipéptido de Repro-PC-1.0 que
se muestra en el Nº ID SEC:2 y tiene al menos 95% de identidad de
secuencia con el Nº ID SEC:2.
15. Una composición que comprende un anticuerpo
que se une específicamente a polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:2.
16. La composición de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales.
17. La composición de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que los anticuerpos son anticuerpos
policlonales.
18. Un método para detectar un polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº
ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al menos 95% de
identidad con el Nº ID SEC:2 en una muestra, que comprende las
etapas de
- (a)
- poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o la variante del mismo; y
- (b)
- detectar la unión específica entre el anticuerpo y el polipéptido de Repro-PC-1.0 que se muestra en el Nº ID SEC:2 o la variante del mismo,
con lo que la unión específica proporciona una
detección del polipéptido de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:2 o la variante del mismo en la muestra.
19. Un método in vitro para el uso en la
diagnosis del cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las
etapas de:
- (a)
- detectar una cantidad diagnóstica de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra procedente del sujeto; y
- (b)
- comparar la cantidad diagnóstica con un intervalo normal de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en una muestra de control no cancerosa,
con lo que una cantidad diagnóstica por encima
del intervalo normal proporciona una indicación positiva de la
diagnosis del cáncer de próstata; en donde el mRNA de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia del
Nº ID SEC:1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y
en donde el polipéptido de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de
Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID
SEC:2.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, en el que la muestra es sangre, orina, tejido de nódulo
linfático o tejido de próstata.
21. Un compuesto que comprende un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 15, 16 ó 17 acoplado a una etiqueta,
para el uso en un método para detectar células de cáncer de próstata
en un sujeto, que comprende las etapas de:
- (a)
- administrar el compuesto al sujeto, y
- (b)
- detectar la localización del compuesto en el sujeto.
22. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que la etiqueta es (1) una etiqueta
radiactiva y la etapa de detección comprende detectar la etiqueta
mediante obtención de imágenes con cámara, o (2) una etiqueta
isotópica y la etapa de detección comprende detectar la etiqueta
mediante obtención de imágenes por resonancia
magnética.
magnética.
23. Un método in vitro para seguir el
avance del cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las
etapas
de:
de:
- (a)
- detectar cantidades primera y segunda de mRNA de Repro-PC-1.0 o polipéptido de Repro-PC-1.0 en muestras procedentes del sujeto en un primer y un segundo momento; y
- (b)
- comparar las cantidades primera y segunda,
con lo que un incremento entre las cantidades
primera y segunda indica avance del cáncer de próstata y una
disminución entre las cantidades primera y segunda indica remisión
del cáncer de próstata; en donde el mRNA de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de
Nº ID SEC:1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y
en donde el polipéptido de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de
Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID
SEC:2.
24. Una inmunotoxina que se une específicamente
al polipéptido de Repro-PC-1.0 que
se muestra en el Nº ID SEC:2 o una variante del mismo que tiene al
menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:2, para el uso en un método
para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de
próstata en un sujeto.
25. Un método de rastreo in vitro para
determinar si un compuesto modula la expresión de
Repro-PC-1.0 en una célula, que
comprende poner en contacto la célula con el compuesto y determinar
si la producción de mRNA o polipéptido de
Repro-PC-1.0 se incrementa o se
disminuye; en donde el mRNA de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de
Nº ID SEC: 1 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID SEC:1 y
en donde el polipéptido de
Repro-PC-1.0 tiene la secuencia de
Nº ID SEC:2 o tiene al menos 95% de identidad con el Nº ID
SEC:2.
26. Un método de rastreo in vitro para
detectar una traslocación cromosómica de un gen de
Repro-PC-1.0 que se muestra en el
Nº ID SEC:1, que comprende las etapas de:
- (a)
- hibridar una sonda etiquetada de acuerdo con la reivindicación 9 a una extensión cromosómica procedente de una muestra celular para determinar el patrón de hibridación, y
- (b)
- determinar si el patrón de hibridación difiere de un patrón normal.
\newpage
27. Un método in vitro para detectar
formas polimorfas de Repro-PC-1.0
que comprende comparar la identidad de un nucleótido o aminoácido
en una posición seleccionada de la secuencia de un gen o polipéptido
de Repro-PC-1.0 de prueba con la
identidad del nucleótido o aminoácido en la posición correspondiente
de Repro-PC-1.0 natural que se
muestra en el Nº ID SEC:1 ó 2, con lo que una diferencia en la
identidad indica que el polinucleótido de prueba es una forma
polimorfa de de Repro-PC-1.0.
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