ES2330733T3 - Modulacion de la expresion de genes dependientes de stat-1. - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido de señuelo, en el que una hebra de ácido nucleico presenta una secuencia según SEQ ID NO: 19 ó 20.

Description

Modulación de la expresión de genes dependientes de STAT-1.
La presente invención se refiere a un oligonucleótido de señuelo con la secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 19 ó 20, así como a su uso como fármaco.
Un objetivo esencial del desciframiento del genoma humano es identificar genes patológicos (debido al modo de acción de sus productos) o cambios patológicos en la estructura de estos genes (polimorfismos) y asignarlos a un cuadro clínico. Con esto parece que se aproxima una terapia causal de la mayoría de las enfermedades cuando se acepta que éstas están producidas por un número definido de productos génicos expresados demasiado fuerte, demasiado débil o deficientemente. De hecho, para toda una serie de enfermedades hereditarias (por ejemplo, mucoviscidosis) ya se conoce el defecto génico generalmente singular (enfermedad monogenética), mientras que la situación para otras enfermedades (por ejemplo, hipertensión) se presenta esencialmente más compleja. Éstas no son evidentemente el resultado de un único defecto génico, sino de múltiples (enfermedad poligenética), que predestina a las personas afectadas a desarrollar la enfermedad al coincidir con determinados factores medioambientales. A pesar de esta limitación, la intervención específica en la expresión de uno o varios genes ofrece la posibilidad de una terapia basada en las causas y no sólo en los síntomas.
Los factores de transcripción son proteínas que se unen al ADN que se añaden al núcleo celular en la región promotora de uno o varios genes y de esta manera controlan su expresión, es decir, la regeneración de las proteínas para las que codifican estos genes. Además de los controles fisiológicamente importantes de los procesos de desarrollo y diferenciación en el cuerpo humano, los factores de transcripción tienen, sobre todo cuando activan la expresión génica en el momento erróneo, un alto potencial de enfermedad. Adicionalmente, (posiblemente los mismos) factores de transcripción pueden bloquear genes con función protectora y actuar de forma predispuesta para la formación de una enfermedad. A este respecto, el principio de terapia con un factor anti-transcripción descrito a continuación aspira a inhibir genes patológicos, pero a activar genes protectores.
La inflamación es una reacción de defensa del organismo y su tejido contra estímulos perjudiciales con el objetivo de remediar los daños o al menos limitarlos localmente, así como eliminar las causas del daño (por ejemplo, bacterias invadidas o sustancias extrañas). Los desencadenantes de una inflamación pueden ser microorganismos (bacterias, virus, hongos o parásitos), sustancias extrañas (polen, cristales de asbesto o silicato), destrucción de tejidos mediante daño mecánico, noxas químicas e influencias físicas, así como mediante desencadenantes endógenos (células tumorales que colapsan, sangre extravasal, reacciones autoinmunitarias) o cristales de sustancias precipitadas en el cuerpo (ácido úrico, oxalato y fosfato de calcio, colesterol).
La rápida activación de mastocitos (en el tejido) o de granulocitos basófilos en la sangre es un ejemplo del desencadenamiento de una reacción inflamatoria aguda muy fuerte y es característico de reacciones de hipersensibilidad inmunológica de tipo inmediato (tipo I de alergia humoral). Si el organismo ya se había puesto previamente en contacto con un antígeno (o alérgeno en el caso de hipersensibilidad), los linfocitos B se han sensibilizado a éste como reacción, que en cooperación con células T auxiliares de tipo 2 positivas para CD4 previamente también sensibilizadas (células Th2) se convierten en plasmocitos y forman anticuerpos de tipo IgE contra el antígeno. En el caso de este proceso de diferenciación es de importancia decisiva la coestimulación de los linfocitos B mediante el receptor CD40 por las células Th2 que expresan los ligandos correspondientes (CD154). Si los anticuerpos IgE cargados de antígeno se unen a receptores correspondientes (tipo Fc_{\varepsilon}) en los mastocitos, entonces éstos liberan distintos mediadores inflamatorios, especialmente histamina, interleucina 8, leucotrieno y factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha). La consecuencia es una atracción de células inflamatorias profesionales, especialmente de granulocitos, así como monocitos, eosinófilos y neutrófilos, pero también de linfocitos T, al sitio del acontecimiento (quimiotaxia). Al mismo tiempo se produce sobre todo una vasodilatación y aumento de la permeabilidad dependientes de histamina de las células endoteliales que revisten las paredes vasculares. Debido a la dilatación vascular, la velocidad de flujo disminuye, lo que facilita el contacto físico de los leucocitos atraídos con las células endoteliales. Estas células endoteliales ya activadas mediante la exposición a citocinas (por ejemplo, TNF\alpha) expresan fuertemente selectinas en su superficie luminal (por ejemplo, E-selectina) que producen un enrollamiento a lo largo de los leucocitos en las células endoteliales y con ello la activación de otras moléculas de adhesión (integrinas; por ejemplo, molécula de adhesión intercelular 1 ("intercellular adhesion molecule-1") [ICAM-1] o molécula de adhesión de células vasculares 1 ("vascular cell adhesion molecule-1") [VCAM-1]. Los leucocitos ya pueden adherirse a la pared vascular (marginación) y el aumento de la permeabilidad debido a la histamina (aflojamiento de la unión de células endoteliales) favorece su posterior migración al espacio extravasal (diapédesis). Al mismo tiempo llegan cantidades crecientes de líquido enriquecido en proteínas (exudado inflamatorio) al intersticio, se forma un edema. Las terminaciones nerviosas circundantes se irritan por la creciente presión en el tejido y por otros mediadores formados por las células inflamatorias, que producen dolores y por tanto conciencian del daño del tejido.
Los granulocitos migrados al sitio de inflamación y los monocitos rediferenciados a macrófagos intentan eliminar el causante de la inflamación mediante fagocitosis o lisis, en este caso se liberan, entre otros, enzimas proteolíticas y radicales de oxígeno que también pueden dañar el tejido sano circundante. Especialmente la activación de los macrófagos puede contribuir de muchas formas (por ejemplo, liberación de otras citocinas como interleucina 1\beta o interleucina 6) a que la reacción inflamatoria local del principio implique al organismo completo en forma de una respuesta de fase aguda. Las características típicas de una respuesta de fase aguda son fatiga, lasitud y fiebre, un aumento de la liberación de leucocitos de la médula ósea (leucocitosis), la detección de proteínas de la fase agua en la sangre (por ejemplo, proteína C reactiva), la estimulación del sistema inmunitario, así como la pérdida de peso debido a un cambio en el estado del metabolismo.
Si la causa de la inflamación puede eliminarse, entonces se conecta el proceso de cicatrización en el que se repara el tejido destruido. En el caso más favorable se produce un restablecimiento completo (restitutio ad integrum), en el caso de lesiones mayores o la producción en exceso de tejido conjuntivo (especialmente colágeno) resulta la formación de una cicatriz que, dependiendo del tejido afectado, está posiblemente asociada a considerables disfunciones. Si la causa no puede eliminarse inmediatamente (sustancias extrañas o infección de la herida), la cicatrización se retrasa con una intensificación simultánea de la inmigración y la actividad de los fagocitos con la consecuencia de la destrucción del tejido (necrosis) hasta la formación de cavidades (absceso). El resultado es casi siempre una reestructuración del tejido con cicatrices con la correspondiente pérdida de función. Si no se consigue limitar localmente esta inflamación producida por gérmenes patógenos, se extiende por el sistema linfático por todo el organismo, la consecuencia es una septicemia con un desenlace posiblemente mortal (choque séptico).
También se produce una alteración de la cicatrización cuando se equilibran el proceso de inflamación y el de curación. El resultado es una inflamación crónica que puede ser fibrosa (síntesis excesiva de colágeno) o granulomatosa (organización de células inflamatorias en un tejido de granulación), y generalmente tiene como consecuencia un destrucción continua o limitación creciente de la función del tejido afectado.
Además de la reacción inflamatoria descrita en general que puede degenerar crónicamente, hay enfermedades inflamatorias que presentan similitudes, pero también diferencias distintas, en cuanto a la patogénesis subyacente. Dos de tales enfermedades inflamatorias son, por ejemplo, las complicaciones después de intervenciones cardioquirúrgicas y las reacciones de incompatibilidad inmunológica a las cuales se les dedica más espacio en la descripción debido a su enorme importancia clínica y variabilidad.
La dilatación mecánica basada en catéteres con globo (angioplastia percutánea) o la derivación de arterias arterioscleróticamente estrechadas con ayuda de derivaciones venosas representan en pacientes con trastornos circulatorios coronarios o periféricos al igual que antes las terapias de elección para la protección de un infarto inminente o fallo orgánico. No obstante, la velocidad de reoclusión (reestenosis) de las arterias mecánicamente dilatadas y provistas (en la mayoría de los casos) de un soporte vascular metálico (prótesis endovascular) es inaceptablemente alta con el 20-50% en el plazo de 6 meses. La velocidad de reoclusión de derivaciones venosas aortocoronarias o periféricas con el 50-70% después de 5 años también es más que insatisfactoria, especialmente en un momento de riesgo de procedimiento o posoperatorio para los pacientes tratados. Probablemente, debido al daño mecánico de la pared vascular (en este caso están afectadas en igual medida células endoteliales y células de músculo vascular liso), la reestenosis después de angioplastia muestra especialmente en el estadio temprano un componente de inflamación marcado que se caracteriza, entre otras cosas, por la infiltración de células inflamatorias profesionales (sobre todo monocitos y linfocitos T) en la pared vascular. La formación de estenosis fibroproliferativas (hiperplasia de la íntima) de derivaciones venosas aortocoronarias o periféricas también parece que se basa en una reacción inflamatoria que especialmente está provocada por noxas mecánicas y físicas. También se conoce desde hace tiempo que en el caso de las denominadas isquemias/daños por reperfusión en el marco de intervenciones quirúrgicas o trasplantes de órganos se produce un daño de tejido debido a la inflamación en el que especialmente la interacción de células endoteliales con células inflamatorias profesionales (sobre todo granulocitos, pero también monocitos y células T) desempeña una función completamente decisiva, así como la liberación sustancias que dañan el tejido (radicales de oxígeno, citocinas).
En relación con las complicaciones cardiovasculares mencionadas es importante que haya mecanismos de protección, sobre todo en las células endoteliales y de músculo liso de la pared vascular, que ayudan a limitar la magnitud de la reacción inflamatoria y la posterior reestructuración adaptativa del tejido. A esto pertenece, por ejemplo, la síntesis de monóxido de nitrógeno (NO) mediante la NO-sintasa en las células endoteliales. El NO, probablemente en su propiedad como antagonista endógeno del radical de oxígeno superóxido, inhibe, entre otras cosas, la expresión de quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, proteína quimioatrayente de monocitos 1 ("monocyte chemoattractant protein-1") MCP-1 y moléculas de adhesión (por ejemplo, ICAM-1) en células endoteliales, la expresión de receptores para factores de crecimiento en células de músculo liso (por ejemplo, receptor B de endotelina), así como la liberación de factores de crecimiento de leucocitos. A este respecto, es fácil comprender que un daño mecánico, igualmente que uno funcional, del endotelio (por ejemplo, por una reducción inducida por citocinas de la expresión de la NO-sintasa en estas células) contrarresta los procesos de inflamación subyacentes a las complicaciones cardiovasculares mencionadas y la posterior reestructuración de la pared vascular fibroproliferativa.
Todos los experimentos hasta la fecha para frenar medicamentosamente las reestenosis después de angioplastia no han logrado la acción deseada en la mayoría de los pacientes. Actualmente se favorecen dos principios locales de terapia: la braquiterapia vascular ya autorizada, un procedimiento para frenar el crecimiento celular mediante irradiación radiactiva momentánea de la sección de vaso dilatada, y las prótesis endovasculares que liberan fármacos ("drug-eluting stents") que todavía se encuentran en el ensayo clínico. En este procedimiento se utilizan prótesis endovasculares recubiertas de polímero que están "impregnadas" con medicamentos inhibidores del crecimiento (citostáticos, inmunosupresores) y éstos se liberan lentamente durante un periodo de tiempo de varias semanas. Los últimos estudios clínicos prueban que ambas aproximaciones de terapia, a pesar de los resultados inicialmente alentadores, no están libres de problemas de en parte graves (por ejemplo, trombosis en la prótesis endovascular con el riesgo de un infarto).
Además de la reacción de incompatibilidad inmunológica ya expuesta de tipo I, fundamentalmente hay cuatro otras formas de alergia o trastornos de la regulación inmunitaria. La propia reacción de tipo I puede clasificarse fundamentalmente en dos fases después de realizarse la alergización: la rápida liberación y regeneración de mediadores inflamatorios vascularmente activos a partir de mastocitos ocupados por IgE y la reacción posterior mediada por los granulocitos eosinófilos y neutrófilos atraídos. La reacción de tipo I completa puede transcurrir local o generalizadamente en función de la exposición al alérgeno. Los alérgenos en el aire respiratorio provocan reacciones en las vías respiratorias, normalmente con edema de la mucosa e hipersecreción (rinopatía alérgica, fiebre del heno), así como broncoespasmo (asma), mientras que los alérgenos alimentarios en primer lugar síntomas gastrointestinales como náuseas, vómitos y diarrea. La piel reacciona a los alérgenos con picor, inflamación y urticaria, así como dermatitis atópica (neurodermatitis). Si, por el contrario, el alérgeno llega directamente a la circulación sanguínea (por ejemplo, infusión de hemoderivados, medicamentos) o la exposición al alérgeno es especialmente fuerte, resulta un reacción sistémica inmediata que posiblemente lleve consigo una disminución de la tensión arterial potencialmente mortal (choque anafiláctico).
En el caso de la reacción de tipo II, el centro son las células antigénicamente activas (por ejemplo, glóbulos sanguíneos exógenos) o proteínas extracelulares (por ejemplo, cambio inducido por medicamentos de la superficie de una célula endógena). Después de la alergización, en el segundo contacto se producen anticuerpos específicos para el alérgeno de tipo IgG e IgM que se unen en un gran número a la superficie de la célula alergénica (opsonización). De esta manera se activa el sistema de complemento (formación de un complejo de ataque a la membrana) y una subpoblación de linfocitos especial, las células citolíticas espontáneas ("natural killer cells") (células NK). El resultado es una destrucción de la célula alergénica mediante citólisis. Se produce una reacción similar cuando los autoanticuerpos se unen a estructuras endógenas como, por ejemplo, la membrana basal de los capilares glomerulares y de esta manera se produce una glomerulonefritis rápidamente progresiva con insuficiencia renal inminente. Además de las células T auxiliares de tipo 1 (células Th1, véase más adelante), las células NK activadas son los principales productores de interferón \gamma, una citocina que intensifica masivamente la reacción inflamatoria, especialmente mediante la activación de macrófagos.
La reacción de tipo III se caracteriza por la formación y deposición de inmunocomplejos (complejos antígeno-anticuerpo) con la posterior activación del sistema de complemento y de fagocitos (granulocitos, macrófagos). Circulan en la sangre y se depositan sucesivamente sobre todo en los capilares de los glomérulos renales, pero también en las articulaciones o en la piel. La reacción inflamatoria producida de esta manera puede tener como consecuencia, entre otras cosas, una glomerulonefritis (inmunocompleja), dolores de articulaciones, así como urticaria. Una reacción sistémica de tipo III también puede producir infecciones cuando el sistema inmunitario no consigue eliminar completamente los gérmenes patógenos (por ejemplo, estreptococos). Las reacciones de tipo III locales típicas son la denominada reacción de Arthus después de vacunación en la piel o la alveolitis alérgica exógena en el caso de deposición de complejos de antígeno-anticuerpo en el pulmón (por ejemplo, neumopatía de los avicultores). El lupus eritematoso sistémico también es una reacción de tipo III, pero en el sentido de una enfermedad autoinmunitaria debida a la formación de autoanticuerpos.
La reacción de tipo IV no es, a diferencia de las reacciones de hipersensibilidad previamente mencionadas, humoral sino que está ligada a la célula y alcanza su máximo generalmente en primer lugar después varios días (tipo de reacción retardada o delayed type hypersensitivity). Los desencadenantes son, sobre todo, proteínas de organismos extraños invadidos (bacterias, virus, hongos y parásitos), otras proteínas extrañas (por ejemplo, gliadina del trigo en celiaquía), así como haptenos (medicamentos, metales [por ejemplo, níquel en el caso de dermatitis de contacto], cosméticos y constituyentes vegetales). El rechazo primario de órganos trasplantados también es una reacción de tipo IV. El antígeno es fagocitado por macrófagos (de tejido), se procesa y se presenta a células T auxiliares indiferenciadas (positivas para CD4); la sensibilización de las células T auxiliares dura varios días. En el segundo contacto, las células T auxiliares así sensibilizadas se convierten en células Th1; en este caso, la coestimulación mediada por CD154 de la célula presentadora de antígeno (ésta expresa el receptor CD40) desempeña una función importante ya que mediante esta ruta de señalización se produce la liberación de interleucina 12 de los macrófagos. La interleucina 12 induce la diferenciación y la proliferación de células T auxiliares. Por su parte, las células Th1 excitan la formación de monocitos en la médula ósea mediante determinados factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF), reclutan a éstos con ayuda de determinadas quimiocinas (por ejemplo, MIF) y los activan mediante la liberación de IFN\gamma. La reacción inflamatoria muy fuerte resultante de esto puede destruir a gran escala tejido endógeno (por ejemplo, tuberculosis) o trasplantado. En el rechazo de trasplante participan además células T citotóxicas positivas para CD8 (citólisis) que, al igual que las células Th1 positivas para CD4, sólo pueden reconocer su diana (la superficie celular extraña) mediante una previa presentación de antígeno y "armarse" correspondientemente.
Una reacción de tipo IV similar al trastorno de la regulación inmunitaria se basa, por ejemplo, en la artritis reumatoide o la esclerosis múltiple (células Th1 autorreactivas), así como en la diabetes mellitus (células T citotóxicas autorreactivas). Además de una predisposición genética correspondiente (proteínas de MHC, desequilibrio de Th1/Th2), en estas enfermedades autoinmunitarias, además de los superantígenos bacterianos (por ejemplo, gérmenes patógenos de Tbc), las células T dirigidas contra determinados antígenos patógenos (por ejemplo, estreptococos) que reaccionan de forma cruzada con autoantígenos (endógenos) (mimetismo molecular) también desempeñan posiblemente una función. Por el contrario, las reacciones de tipo V son provocadas, entre otras cosas, por autoanticuerpos activadores o de bloqueo de receptores de hormonas (por ejemplo, tireotropina en la enfermedad de Basedow) o de neurotransmisores (por ejemplo, acetilcolina en el caso de miastenia grave).
Comparable con el rechazo de trasplante, pero en sentido inverso, es la enfermedad de injerto frente a huésped ("graft versus host disease") (GVHD) que se produce en el transcurso de trasplantes de médula ósea alógena (entre individuos genéticamente no idénticos) en aproximadamente el 40% de los receptores. En la fase aguda de hasta tres meses, las células T del donante transfundidas con las células madre atacan el organismo del receptor, la reacción inflamatoria posiblemente grave resultante se manifiesta preferiblemente en la piel, en el tracto gastrointestinal y en el hígado.
Para el tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas normalmente se utilizan localmente, en función de la supuesta causa, antiflogísticos no esteroideos (AINE, entre otros inhibición de la síntesis de prostaglandinas) y/o antiinfecciosos (eliminación de bacterias, hongos o parásitos) o agentes quimioterapéuticos antivirales, eventualmente también glucocorticoides (inhibición general de la expresión génica). En el caso de enfermedades inflamatorias recurrentes graves o crónicas se administran sistémicamente glucocorticoides o inmunodepresores (inhibición de la activación de células T) o citostáticos como metotrexato. Esto también es válido para el trasplante de órganos o médula ósea. A pesar de su indiscutible acción terapéutica, la administración sistémica del fármaco mencionado puede provocar efectos secundarios graves, especialmente durante la utilización a largo plazo. Así, por ejemplo, hasta el 25% de los pacientes que tomaron metotrexato durante 2 o más años desarrollaron una cirrosis hepática grave. Los principios activos más nuevos utilizados especialmente en enfermedades inflamatorias recurrentes crónicas bloquean la acción proinflamatoria de TNF\alpha: anticuerpos contra la propia citocina o su receptor, antagonistas de receptores de bajo peso molecular, así como una proteína de receptor soluble preparada por recombinación que atrapa la citocina. No obstante, aumentan las indicaciones de una aparición reforzada de enfermedades infecciosas durante la terapia con la proteína de receptor (entre otras tuberculosis) y parece que aproximadamente el 40% de los pacientes no responden en absoluto a la terapia (paciente que no responde al tratamiento ("non-responder")). Para los anticuerpos de TNF\alpha humanizados autorizados también hay indicaciones de aviso correspondientes de la aparición de infecciones hasta de septicemia 2-4 años después del inicio de la terapia. Además, ambos principios activos están contraindicados en el caso de un episodio de inflamación aguda. Además, están autorizados los agonistas de receptores de bajo peso molecular para leucotrieno que se usan sobre todo en la terapia del asma, así como sustancias inhibidoras de la ciclooxigenasa 2, un grupo nuevo de antiflogísticos no esteroideos (AINE) con efectos secundarios gastrointestinales considerablemente reducidos en comparación con los AINE clásicos. Además, hay una serie de otros anticuerpos generalmente humanizados o aproximaciones basadas en oligonucleótidos antisentido contra moléculas de adhesión de leucocitos o células endoteliales, receptores de citocinas de células T auxiliares o anticuerpos IgE que se encuentran en distintas fases del ensayo clínico. Si se prescinde de los glucocorticoides y los antiinfecciosos como grupo, entonces los fármacos mencionados tienen en común que se dirigen específicamente contra una molécula diana relevante para terapia.
Por tanto, el objetivo de la presente invención se basa en poner a disposición un agente para una prevención o terapia de reacciones inflamatorias excesivas y las consecuencias asociadas a ellas de morbilidad y mortalidad de los pacientes afectados.
El objetivo se alcanza mediante el objeto definido en las reivindicaciones.
La invención se explica más detalladamente mediante las siguientes figuras:
La Figura 1 muestra la inhibición de la expresión estimulada por citocinas de CD40 (a, c, d y e), E-selectina y MCP-1 (a) y la inducción del ligando de CD40 de la expresión de interleucina 12p40 (b) en células endoteliales humanas cultivadas mediante neutralización del factor de transcripción STAT-1 con ayuda de un señuelo de elementos Cis correspondiente (SEQ ID NO: 33). (a) Análisis de RT-PCR representativo de la E-selectina, MCP-1 y expresión de ARNm de CD40 (además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control estimulado y referida al patrón interno EF-1) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33) o NF-\kappaB (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma. (b) Análisis de RT-PCR representativo de la expresión de ARNm de interleucina 12p40 (además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control estimulado y referida al patrón interno rp132) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un señuelo de elementos Cis de STAT-1 (10 \muM; SEQ ID NO: 33) y a continuación se incubaron 12 horas con aproximadamente 670000 células de P3xTB.A7/ml (estas células de mieloma de ratón expresan establemente los ligandos de CD40 humanos, CD154) y 1000 U/ml de interferón \gamma. (c) Análisis de RT-PCR representativo de la expresión de ARNm de CD40 (además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control estimulado y referida al patrón interno EF-1) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33) o el oligonucleótido de control correspondiente (STAT-1-25mut) (concentración 10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma. (d) Resumen estadístico de 5 experimentos independientes para la acción del señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33) en la expresión de ARNm de CD40 estimulada por citocinas en las células endoteliales cultivadas (*P<0,05 frente a las células de control estimuladas). (e) Análisis de transferencia de Western representativo (además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control estimulado y referida al patrón interno \beta-actina) de la acción del señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33) en la expresión de proteínas de CD40 estimuladas por citocinas en las células endoteliales cultivadas después de 24 h. En otros experimentos se lograron resultados comparables.
La Figura 2 muestra la inhibición de la expresión inducida por citocinas del gen CD40 en células endoteliales cultivadas humanas por la regulación por disminución basada en el oligonucleótido antisentido de la expresión del factor de transcripción STAT-1. (a) Expresión de la proteína CD40 o STAT-1 en condiciones en reposo y después de incubación de 14 horas de las células con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma. La mitad izquierda de la imagen muestra el resumen estadístico de 2-4 experimentos con diferentes cargas de células, la mitad derecha de la imagen muestra respectivamente un análisis de transferencia de Western representativo, además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control sin estimular y referida al patrón interno \beta-actina (*P<0,05 frente a las células sin estimular). (b) Inhibición comparable de la expresión de proteínas de CD40 y STAT-1 en células endoteliales estimuladas mediante un pretratamiento de 24 horas con un oligonucleótido antisentido de STAT-1 (1 \muM; SEQ ID NO: 33). Resumen de 2 experimentos (mitad izquierda de la imagen; *P<0,05 frente a las células de control estimuladas) y análisis de transferencia de Western representativo (mitad derecha de la imagen).
La Figura 3 muestra la inhibición de la expresión del factor de transcripción IRF-1 en la línea celular de monocitos THP-1 (a) así como la isoforma inducible de la NO-sintasa en células de músculo liso humanas cultivadas (b) mediante neutralización del factor de transcripción STAT-1 con ayuda de un señuelo de elementos Cis correspondiente (SEQ ID NO: 33). (a) Análisis de transferencia de Western representativo, además de la evaluación densitométrica ("intensidad") especificada en % del control estimulado y referida al patrón interno \beta-actina. Las células THP-1 cultivadas se preincubaron durante 4 horas con el señuelo de elementos Cis (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 3 horas con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma. (b) Mitad izquierda de la imagen: resumen estadístico de 3 experimentos con diferentes cargas de células de músculo liso humanas cultivadas que se preincubaron durante 4 horas con un señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33), NF-\kappaB o GATA-2 (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 1000 U/ml de interferón \gamma, 60 U/ml de interleucina 1\beta, 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1 \mug/ml de lipopolisacárido bacteriano. Los análisis de RT-PCR de la expresión de ARNm para la isoforma inducible de la NO-sintasa (*P<0,05 frente a las células estimuladas = 100%). Mitad derecha de la imagen: resumen estadístico de 3 experimentos con diferentes cargas de células y análisis de transferencia de Western representativo de la inhibición de la expresión estimulada por citocinas de la proteína NO-sintasa (después de 20 horas de exposición) mediante preincubación con el señuelo de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 33) o NF-\kappaB (*P<0,05 frente a las células estimuladas = 100%).
La Figura 4 muestra la neutralización de STAT-1 endógeno en extractos de núcleos celulares de la línea celular de monocitos THP1 mediante distintos señuelos de elementos Cis (SEQ ID NO:17, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y el oligonucleótido de control mutado STAT-1-19mut y STAT-1-25mut). Análisis de EMSA representativo. Las células THP-1 cultivadas se incubaron durante 3 horas con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma y a continuación se usaron para la preparación de extractos nucleares. El extracto de núcleos celulares se incubó junto con el oligonucleótido SIE bicatenario marcado con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania) y los señuelos de elementos Cis respectivos u oligonucleótidos de control durante 20 minutos a temperatura ambiente y a continuación se sometieron al análisis de cambio de movilidad electroforética.
La Figura 5 muestra el efecto de los señuelos de elementos Cis de STAT-1 (SEQ ID NO: 17, 31, 35, 37) seleccionados sobre la expresión de E-selectina y ARNm de MCP-1 en células de músculo liso humanas a partir de la vena tímica. Las células cultivadas (pasada 2) se preincubaron durante 4 horas con los señuelos de elementos Cis correspondientes (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma. Análisis de RT-PCR representativos, en otros experimentos se obtuvieron resultados comparables.
La Figura 6 muestra esquemáticamente la estructura del vector de expresión antisentido pCI/Statl AS de STAT-1 en forma de un mapa génico.
La Figura 7 muestra el resultado de la neutralización de STAT-1 en células endoteliales cultivadas humanas mediante distintos señuelos de elementos Cis (SEQ ID NO: 17, 19, 27, 33 y 39). Análisis de EMSA representativo, además de la evaluación densitométrica ("intensidad"). Las células endoteliales cultivadas se incubaron durante 4 horas con los oligonucleótidos de señuelo (10 \mumol/l) y a continuación se estimularon con 100 U/ml de factor de necrosis tumoral \alpha y 1000 U/ml de interferón \gamma durante 30 min. Para el análisis EMSA se usaron los extractos de núcleos de las células estimuladas y el oligonucleótido SIE bicatenario marcado con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania).
La Figura 8 muestra la evaluación histológica de la acción de un oligonucleótido de señuelo de STAT-1 (STAT-1 cons, 10 nmol, SEQ ID NO: 19), pero no de un oligonucleótido de control mutado (STAT-1 mut, 10 nmol, SEQ ID NO: 61) en la dermatitis de contacto inducida por DNCB en cobayas macho (original x400, resultado típico de un total de 17 cobayas estudiadas).
Los inventores han caracterizado los factores de transcripción que participan en el aumento mediado por citocinas de la expresión de productos génicos proinflamatorios (CD40, E-selectina, isoforma inducible de la NO-sintasa, interleucina 12 [p40], MCP-1) en células endoteliales y de músculo liso humanas, así como en monocitos. En este caso se mostró que en la estimulación de células endoteliales cultivadas con TNF\alpha o CD154 en combinación con IFN\gamma se produce una sinergia entre los factores de transcripción factor nuclear \kappaB ("nuclear factor \kappaB") (NF-\kappaB) y transductor de señales y activador de la transcripción 1 ("signal transducer and activator of transcription-1") (STAT-1). Será lo mismo con las cultivadas células de músculo liso o monocitos.
\newpage
El IFN\gamma solo podía aumentar la expresión de CD40 en las células endoteliales humanas, pero no la de E-selectina o interleucina 12. Para la expresión de estos dos productos génicos apenas o no expresados constitutivamente por las células endoteliales es esencial una estimulación simultánea de las células con TNF\alpha (E-selectina) o CD154 (interleucina 12). Además, para el aumento mediado por IFN\gamma de la expresión de CD40, pero no de E-selectina, en las células endoteliales y monocitos es necesaria la expresión de novo de otro factor de transcripción, el factor regulador de interferón 1 ("interferon regulatory factor-1") (IRF-1). En el marco de estas investigaciones se mostró que la expresión de la proteína IRF-1 durante la monoestimulación de las células con IFN\gamma y especialmente con TNF\alpha es esencialmente más débil que en presencia de ambas citocinas. En consecuencia, los factores de transcripción NF-\kappaB y STAT-1 también actúan sinérgicamente en la transcripción del gen de IRF-1 (Ohmori y col., J. Biol. Chem., (1997), 272, 14899).
STAT-1 (número de registro de GenBank NM007315 y XM010893 o http://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/
getEntry.pl?t0149) pertenece a un grupo de factores de transcripción que comprende al menos 6 miembros. El producto del gen STAT-1 se expresa constitutivamente en la mayoría de las células, pero generalmente se encuentra como proteína monómera inactiva (91 kDa de tamaño) en el citoplasma. La fosforilación de la tirosina de esta subunidad p91 y la posterior asociación (dimerización) de dos subunidades p91 tales (llamado STAT-1\alpha) hace posible el transporte del factor de transcripción ahora activo al núcleo celular. También es posible una heterodimerización con la subunidad p84 de STAT-1\beta (producto diferentemente cortado y empalmado del mismo gen). La fosforilación de las subunidades constitutivamente presentes se realiza mediante cinasas Janus citoplasmáticas en función del estímulo. Así, ambas cinasas Janus (Jak1 y Jak2) se estimulan por IFN\alpha (se recluta mejor en el receptor de interferón); por el contrario, el estímulo (pato) fisiológico más importante para la activación de STAT-1, IFN\gamma, sólo estimula Jak2. Distintos factores de crecimiento y hormonas peptídicas (por ejemplo, angiotensina II) también activan STAT-1; además de las tirosina cinasas intrínsecas del receptor (de factores de crecimiento), en este caso también desempeña una función una proteína cinasa activada por mitógeno (cinasa MAP). A diferencia de STAT-1\alpha, STAT-1\beta no tiene actividad transactivadora, es decir, estimuladora de la expresión génica.
STAT-1 participa en la expresión de una serie de productos génicos potencialmente proinflamatorios en leucocitos, células endoteliales y células de músculo liso, realizándose generalmente la activación del factor de transcripción de una forma de pendiente de IFN\gamma. La excepción es especialmente la expresión dependiente de STAT-1 de interleucina 6 en células de músculo vascular liso estimuladas por angiotensina II (Schieffer y col., Circ Res, (2000), 87, 1195). Las proteínas, a las que también pertenece STAT-1, pueden inhibirse en su actividad en formas muy diferentes. Así, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-STAT-1, así como sustancias naturales o sintéticas que reducen la interacción de STAT-1 con el ADN, es decir, la actividad de transactivación. Además, podrían inhibirse las rutas de señalización que conducen a la activación de STAT-1 (Jak1, Jak2, tirosina cinasas del receptor, cinasas MAP). Los procedimientos preferidos para la inhibición específica de la actividad de STAT-1 son:
1.
La neutralización (silenciamiento) del factor de transcripción activado por un oligonucleótido de señuelo,
2.
la inhibición de la expresión de la proteína STAT-1 con ayuda de un oligonucleótido antisentido, y
3.
la inhibición de la expresión de la proteína STAT-1 con ayuda de un vector de expresión antisentido.
El término "oligonucleótido de señuelo" o "señuelo de elementos Cis" usado en este documento designa una molécula de ADN bicatenario o un oligonucleótido de ADN bicatenario. Las dos hebras de ADN presentan una secuencia complementaria. En la presente invención, el señuelo de elementos Cis presenta una secuencia que se corresponde con o es similar a la secuencia de unión al núcleo de STAT-1 natural en el genoma y se une al factor de transcripción STAT-1 en la célula. Entonces, el señuelo de elementos Cis actúa como molécula para la inhibición competitiva (mejor neutralización) de STAT- 1.
Un aspecto de la presente invención consiste en proporcionar un oligonucleótido de ADN bicatenario que puede unirse de una forma específica para secuencias al factor de transcripción STAT-1 y presenta una secuencia según SEQ NO: 19 representándose en este caso sólo respectivamente una hebra del oligonucleótido de ADN bicatenario y estando también comprendida la hebra complementaria. A continuación se enumeran otros oligonucleótidos de ADN a modo de ejemplo:
5''NTTNCBGDAAN-3' (SEQ ID NO:1),
5''ATTACCGGAAG-3' (SEQ ID NO:3),
5'-ATTCCGGTAAG-3' (SEQ ID NO:5),
5'-ATTCCTGGAAG-3' (SEQ ID NO:7),
5'-ATTCCTGTAAG-3' (SEQ ID NO:9),
5'-GTTCCAGGAAC-3' (SEQ ID NO:11),
5'-GTTCCCGGAAG-3' (SEQ ID NO:13),
5'-GTTCCGGGAAC-3' (SEQ ID NO:15),
5'-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3' (SEQ ID NO:17),
5'-TGTGAATTACCGGAAGTG-3' (SEQ ID NO:19),
5'-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3' (SEQ ID NO:21),
5'-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3' (SEQ ID NO:23),
5'-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3' (SEQ ID NO:25),
5'-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3' (SEQ ID NO:27),
5'-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3' (SEQ ID NO:29),
5'-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3' (SEQ ID NO:31),
5'-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3' (SEQ ID NO:33),
5'-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3' (SEQ ID NO:35),
5'-TGCATATTCCTGTAAGTG-3' (SEQ ID NO:37),
5'-ATATTCCTGTAAGTG-3' (SEQ ID NO:39).
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Si el oligonucleótido de señuelo según la invención se usa contra STAT-1, pero no un oligonucleótido de control correspondiente en células endoteliales humanas, la expresión de CD40 inducida por citocinas (tanto en la monoestimulación con IFN\gamma como en la combinación de IFN\gamma y TNF\alpha) se inhibe claramente más del 50%. Esto también es válido para la expresión de E-selectina y MCP-1 o interleucina 12 (p40) cuando la estimulación de las células se realiza con IFN\gamma y TNF\alpha o CD154. Por tanto, una eliminación de la actividad de STAT-1 tiene como consecuencia una inhibición muy significativa de la expresión de un grupo de productos génicos proinflamatorios en las células endoteliales humanas. A este respecto, en esta aproximación de terapia se cuenta con una clara atenuación de la interacción de endotelio-leucocitos (E-selectina, MCP-1), pero también de la interacción de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, macrófagos y linfocitos B) con linfocitos T (CD40, interleucina 12) en el marco de enfermedades inflamatorias. Análogamente, esto también es válido para la atenuación mostrada de la expresión de IRF-1 inducida por citocinas en los monocitos THP-1 (y, por tanto, la expresión aguas debajo de los genes dependientes de IRF-1), así como la expresión inducida por citocinas de los productos génicos mencionados, incluida la NO-sintasa inducible en las células de músculo liso humanas.
Por tanto, un procedimiento preferido para la inhibición específica de la actividad de STAT-1 es el uso del oligonucleótido de ADN bicatenario según la invención, también llamado señuelo de elementos Cis u oligonucleótido de señuelo, que contiene un sitio de unión para STAT-1. El aporte exógeno de un gran número de sitios de unión del factor de transcripción a una célula, especialmente en un número mucho mayor al existente en el genoma, produce una situación en la que la mayoría de un determinado factor de transcripción se une específicamente al señuelo de elementos Cis respectivo y no a su sitio de unión diana endógeno. Esta aproximación a la inhibición de la unión de factores de transcripción en su sitio de unión endógeno también se denomina silenciamiento. El silenciamiento (o también neutralización) de factores de transcripción usando señuelos de elementos Cis se utilizó satisfactoriamente para inhibir el crecimiento celular. En este caso se usaron fragmentos de ADN que contenían sitios de unión específicos de factores de transcripción del factor de transcripción E2F (Morishita y col., PNAS, (1995) 92, 5855).
La secuencia de un ácido nucleico que se usa para evitar la unión del factor de transcripción STAT-1 es, por ejemplo, la secuencia a la que STAT-1 se une naturalmente en la célula. STAT-1 se une específicamente al motivo con la secuencia 5'-NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3' en la que significan N = A, T, C o G y S = C o G. Una unión efectiva de STAT-1 depende de la coincidencia exacta con las bases subrayadas y la distancia entre estas bases. Por tanto, el señuelo de elementos Cis según la invención puede presentar la siguiente secuencia consenso de unión al núcleo 11-mérica: 5'-NTTNCBGDAAN-3' (SEQ ID NO:1) en la que significan B = C, G o T, D = A, G o T y N = A, T, C o G. El señuelo de elementos Cis puede ser además mayor que la secuencia de unión al núcleo 11-mérica y alargarse en el extremo 5' y/o en el extremo 3'. Las mutaciones correspondientes en el intervalo de la secuencia de unión al núcleo conducen a la pérdida de la unión de STAT-1 al oligonucleótido de señuelo.
Como el señuelo de elementos Cis es un ácido nucleico bicatenario, el oligonucleótido de ADN según la invención comprende respectivamente no sólo la secuencia sentido o directa, sino también la secuencia antisentido o inversa complementaria. Los oligonucleótidos de ADN pueden presentar una secuencia de unión al núcleo 11-mérica para STAT-1, como está contenida en SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO: 16.
\newpage
Sin embargo, el señuelo de elementos Cis también puede presentar una secuencia diferente de la secuencia anterior y ser más largo que un 11-mero, por ejemplo, las secuencias que están contenidas en SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:40. Estos señuelos de elementos Cis contienen respectivamente 2 sitios de unión para STAT-1.
La observación "2 sitios de unión" se refiere en este caso a la hebra sentido y antisentido. Esta lista de secuencias preferidas no es concluyente. Para el experto es evidente que puede usarse una pluralidad de secuencias como inhibidor para STAT-1, siempre y cuando presenten las condiciones anteriormente citadas de la secuencia consenso de unión al núcleo 11-mérica y una afinidad por STAT-1.
La afinidad de la unión de una secuencia de ácidos nucleico a STAT-1 puede determinarse mediante el uso del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191). Este sistema de ensayo es adecuado para el control de calidad de ácidos nucleicos que están pensados para el uso en el procedimiento de la presente invención o las determinaciones de la longitud óptima de un sitio de unión. También es adecuado para la identificación de otras secuencias que están unidas por STAT-1. Para un EMSA pensado para el aislamiento de nuevos sitios de unión, lo más adecuado son versiones purificadas o expresadas en recombinación de STAT-1 que se utilizan en varias rondas alternas de amplificación por PCR y selección mediante EMSA (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18, 3203).
Los genes de los que se sabe que contienen sitios de unión a STAT-1 en su promotor o sus regiones potenciadoras o en los que ya hay una detección funcional del significado de STAT-1 en su expresión, y por tanto las supuestas dianas son para el silenciamiento específico mediante el procedimiento de la presente invención, son además del gen CD40, E-selectina, NO-sintasa inducible, interleucina 12 (p40) y MCP-1, otros genes proinflamatorios, por ejemplo, el propio IFN\gamma, la citocina interleucina 6, las moléculas de adhesión ICAM-1, PECAM-1 (molécula de adhesión de células endoteliales a plaquetas 1 ("platelet endothelial cell adhesion molecule-1")), RANTES (regulada con la activación, expresada en células T normales, supuestamente secretada ("regulated upon activation, normal T-cell expressed, presumed secreted"); secretada de manera soluble por linfocitos T) y VCAM-1, la quimiocina interleucina 8, IP-10 (proteína inducible por interferón 10 ("interferon-inducible protein-10")) y Mig (monocina inducida por interferón gamma ("monokine induced by gamma-interferon")), así como las proteínas de MHC I y II. En este caso no desempeña ninguna función si la expresión de estos genes se regula directa o indirectamente (por ejemplo, por la expresión de IRF-1 dependiente de STAT-1) por STAT-1.
El procedimiento de la presente invención modula la transcripción de un gen o de genes en una forma tal que el gen o los genes, por ejemplo, E-selectina, no se expresan o se expresan menos. La expresión reducida o suprimida en el marco de la presente invención significa que la velocidad de transcripción está reducida en comparación con células que no se tratan con un oligonucleótido de ADN bicatenario según la invención. Una reducción tal puede determinarse, por ejemplo, por transferencia de Northern (Sambrook y col., 1989) o RT-PCR (Sambrook y col., 1989). Normalmente, una reducción tal es una reducción de al menos 2 veces, en especial de al menos 5 veces, especialmente de al menos 10 veces. La pérdida de activación puede conseguirse, por ejemplo, cuando el STAT-1 actúa en un determinado gen como activador de la transcripción y por tanto el silenciamiento del activador conduce a la pérdida de la expresión del gen diana.
Además, el procedimiento de la presente invención hace posible la desinhibición de la expresión de un gen, siempre y cuando ésta se bloquee por un factor de transcripción constitutivamente activo o activado (después de una estimulación correspondiente de la célula). Un ejemplo de esto es la desinhibición de la expresión del gen de la prepro-endotelina 1 en células endoteliales nativas de V. jugularis de conejo mediante un señuelo de elementos Cis contra el factor de transcripción CCAAT/proteína de unión al potenciador ("enhancer binding protein") (Lauth y col., J. Mol. Med., (2000), 78, 441). De esta forma puede desinhibirse la expresión de genes cuyos productos desempeñan una acción protectora, por ejemplo, contra enfermedades inflamatorias. Así, por ejemplo, la isoforma endotelial de NO-sintasa, cuyo producto NO desempeña una función decisiva en la supresión de la expresión de moléculas de adhesión proinflamatorias y quimiocinas en células endoteliales, se regula por disminución por IFN\gamma (Rosenkranz-Weiss y col. (1994) J. Clin. Invest. 93, 1875). Un señuelo de elementos Cis contra STAT-1 puede anular este efecto no deseado impidiendo la unión de STAT-1 al sitio de unión correspondiente en el promotor del gen NO-sintasa endotelial.
Generalmente, los oligonucleótidos se degradan rápidamente en la célula por endo y exonucleasas, especialmente DNasas y RNasas. Por tanto, los oligonucleótidos de ADN pueden modificarse para estabilizarse contra la degradación de manera que se mantenga una alta concentración de los oligonucleótidos en la célula durante un periodo de tiempo más largo. Normalmente, una estabilización tal puede obtenerse mediante la introducción de uno o varios enlaces internucleotídicos modificados.
Un oligonucleótido de ADN satisfactoriamente estabilizado no contiene necesariamente una modificación en cada enlace internucleotídico. Preferiblemente, los enlaces internucleotídicos están modificados en los extremos respectivos de ambos oligonucleótidos del señuelo de elementos Cis. En este caso pueden estar modificados los últimos seis, cinco, cuatro, tres, dos o el último o uno o varios enlaces internucleotídicos dentro de los últimos seis enlaces internucleotídicos. Además, pueden introducirse distintas modificaciones de los enlaces internucleotídicos en el ácido nucleico y los oligonucleótidos de ADN bicatenario formados de esto probarse para la unión específica a secuencias a STAT-1 usando el sistema de ensayo EMSA rutinario. Este sistema de ensayo permite la determinación de las constantes de unión del señuelo de elementos Cis y por tanto la determinación de si la afinidad se modificó por la modificación. Los señuelos de elementos Cis modificados que todavía muestran una unión suficiente pueden seleccionarse significando una unión suficiente al menos aproximadamente el 50% o al menos aproximadamente el 75%, y con especial preferencia aproximadamente el 100% de la unión del ácido nucleico sin modificar.
En los señuelos de elementos Cis con enlace internucleotídico modificado que todavía muestran una unión suficiente puede comprobarse si son más estables en la célula que los señuelos de elementos Cis sin modificar. Las células "transfectadas" con señuelos de elementos Cis se estudian en momentos distintos para la cantidad de señuelos de elementos Cis todavía presentes. En este caso se utiliza preferiblemente un señuelo de elementos Cis marcado con un colorante fluorescente (por ejemplo, rojo de Texas) o un señuelo de elementos Cis marcado radiactivamente (por ejemplo, ^{32}P) con posterior microscopía fluorescente digital o autorradiografía o escintigrafía. Un señuelo de elementos Cis satisfactoriamente modificado tiene una semivida en la célula que es superior a la de un señuelo de elementos Cis sin modificar, preferiblemente de al menos aproximadamente 48 horas, más preferiblemente de al menos aproximadamente 4 días, lo más preferido de al menos aproximadamente 7 días.
Los enlaces internucleotídicos modificados adecuados se resumen en Uhlmann y Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544). Los restos de internucleótido-fosfato modificados y/o los puentes sin fósforo en un ácido nucleico que pueden utilizarse en un procedimiento de la presente invención contienen, por ejemplo, fosfonato de metilo, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, éster de fosfato, mientras que los análogos de internucleótido sin fósforo contienen, por ejemplo, puentes de siloxano, puentes de carbonato, puentes de éster carboximetílico, puentes de acetamidato y/o puentes de tioéter. En el uso de enlaces internucleotídicos modificados con fosforotioato, éstos no deberán encontrarse preferiblemente entre las bases citosina y guanina ya que esto puede conducir a una activación de las células diana del señuelo de elementos Cis.
Además, se describe la estabilización de ácidos nucleicos mediante la introducción de características estructurales en el ácido nucleico que aumentan la semivida del ácido nucleico. Tales estructuras que contienen el ADN de horquilla y de campana se dan a conocer en el documento US 5.683.985. Al mismo tiempo pueden introducirse restos de internucleótido-fosfato modificados y/o puentes sin fósforo junto con las estructuras mencionadas. Los ácidos nucleicos que resultan de esto pueden comprobarse en el sistema de ensayo anteriormente descrito para la unión y la estabilidad.
La secuencia de unión al núcleo puede presentarse no sólo en un señuelo de elementos Cis, sino también en un vector. El vector puede ser un vector de plásmido, especialmente un vector de plásmido que puede replicarse autosómicamente, por medio de lo cual se aumenta la estabilidad del ácido nucleico bicatenario introducido.
El señuelo de elementos Cis de la presente invención es rápidamente captado por la célula. Una captación suficiente se caracteriza por la modulación de la expresión de uno o varios genes que están sometidos a un control por STAT-1. El señuelo de elementos Cis de la presente invención modula preferiblemente la transcripción de un gen o genes después de aproximadamente 4 horas de contacto con la célula, más preferiblemente después de aproximadamente 2 horas, después de aproximadamente 1 hora, después de aproximadamente 30 minutos y lo más preferido después de aproximadamente 10 minutos. Una mezcla típica que se utiliza en un experimento tal contiene 10 \mumol/l de señuelo de elementos Cis.
La presente invención se refiere además al uso del señuelo de elementos Cis según la invención para la preparación de un fármaco. Además, la presente invención se refiere al uso del señuelo de elementos Cis según la invención para la preparación de un fármaco para la prevención o terapia de complicaciones cardiovasculares (por ejemplo, reestenosis después de angioplastia percutánea, formación de estenosis de derivaciones vasculares), de rechazo de trasplante, de enfermedad de injerto frente a huésped ("graft versus host disease") (GVHD), de isquemia/daños por reperfusión en operaciones quirúrgicas, de reacciones de hipersensibilidad inmunológica (tipo I a V), enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, diabetes mellitus, esclerosis múltiple, artritis reumatoide), así como todas las otras formas de enfermedades inflamatorias agudas, subagudas y crónicas, especialmente de las articulaciones (por ejemplo, artritis), de los órganos respiratorios (por ejemplo, asma bronquial, bronquitis crónica), de la piel (por ejemplo, psoriasis, neurodermatitis) y del tracto gastrointestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), incluyendo el choque séptico.
Además, se da a conocer un procedimiento para la modulación de la transcripción de al menos un gen en células, especialmente en células endoteliales, células epiteliales, leucocitos, células de músculo liso, queratinocitos o fibroblastos comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto las células mencionadas con una mezcla que contiene uno o varios ácidos nucleicos bicatenarios según la invención que pueden unirse específicamente a secuencias al factor de transcripción STAT-1. Un procedimiento preferido es, por ejemplo, el tratamiento ex vivo de una donación de médula ósea que contiene linfocitos T antes de introducirla en el cuerpo del receptor.
El señuelo de elementos Cis según la invención puede administrarse además en una composición al paciente o usarse en el procedimiento dado a conocer. La composición (a continuación llamada mezcla) que contiene los señuelos de elementos Cis según la invención se pone en contacto con las células diana (por ejemplo, células endoteliales, células epiteliales, leucocitos, células de músculo liso, queratinocitos o fibroblastos). El objetivo de este contacto es la transferencia de los señuelos de elementos Cis que forman STAT-1 a la célula diana (es decir, las células que expresan productos génicos inflamatorios dependientes de STAT-1). Por tanto, la modificación de ácidos nucleicos y/o aditivos o coadyuvantes, de los que se sabe que aumentan la penetración de la membrana, puede usarse en el marco de la presente invención (Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).
Una mezcla sólo puede contener ácido nucleico y tampón. Una concentración adecuada del señuelo de elementos Cis se encuentra en el intervalo de al menos 0,1 a 100 \muM, preferiblemente a 10 \muM, añadiéndose uno o varios tampones adecuados. Un ejemplo de un tampón tal es la disolución de Ringer que contiene 145 mmol/l de Na^{+}, 5 mmol/l de K^{+}, 156 mmol/l de Cl^{-}, 2 mmol/l de Ca^{2+}, 1 mmol/l de Mg^{2+}, 10 mmol/l de Hepes, 10 mmol/l de D-glucosa, pH 7,4.
La mezcla puede contener adicionalmente al menos un aditivo y/o coadyuvante. Los aditivos y/o coadyuvantes como lípido, lípidos catiónicos, polímeros, liposomas, nanopartículas, aptámeros de ácido nucleico, péptidos y proteínas que están unidos al ADN o moléculas sintéticas de péptido-ADN se proponen, por ejemplo, para aumentar la introducción de ácidos nucleicos en la célula, para dirigir la mezcla a sólo un subgrupo de células, para evitar la degradación del ácido nucleico en la célula, para facilitar el almacenamiento de la mezcla de ácido nucleico antes de uso. Ejemplos de péptidos y proteínas o moléculas sintéticas de péptido-ADN son, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ligandos, moléculas de adhesión, que pueden estar todos modificados o sin modificar.
Los aditivos que estabilizan señuelos de elementos Cis en la célula son, por ejemplo, sustancias condensadoras de ácido nucleico como polímeros catiónicos, poli-L-lisina o polietilenimina.
La mezcla que se utiliza en el procedimiento descrito se aplica preferiblemente localmente mediante inyección, catéter, supositorio ("óvulo"), aerosoles (spray nasal o bucal, inhalación), trócares, proyectiles, geles plurónicos, polímeros que liberan continuamente medicamentos, o cualquier otro dispositivo que haga posible el acceso local. La aplicación ex vivo de la mezcla usada en el procedimiento dado a conocer también permite un acceso local.
Las siguientes figuras y ejemplos sólo sirven para explicar y no limitar en modo alguno el alcance de la invención.
1. Cultivo celular
Se aislaron células endoteliales humanas de venas del cordón umbilical mediante tratamiento con 1,6 U/ml de dispasa en disolución de disolución de Tyrode modificada con Hepes durante 30 min a 37ºC y se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas con gelatina (2 mg/ml de gelatina en HCl 0,1 M durante 30 min a temperatura ambiente) en 1,5 ml de medio M199 (Gibco Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) que contenía 20% de suero bovino fetal, 50 U/ml penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 10 U/ml de nistatina, HEPES 5 mM y TES 5 mM, 1 \mug/ml de heparina y 40 \mug/ml de factor de crecimiento endotelial. Se identificaron por su morfología de adoquín típica, inmunotinción positiva para el factor de Willebrandt (vWF) y detección fluorimétrica (FACS) de PECAM-1 (CD31), así como inmunotinción negativa para \alpha-actina de músculo liso (Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191). La línea celular de monocitos humana THP-1 (ATCC TIB 202) se cultivó en medio RPMI 1640 (Life Technologies) que contenía 10% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 10 U/ml de nistatina. Las células de músculo liso humanas se aislaron de venas tímicas preparadas con ayuda de la técnica de explantes (Krzesz y col., (1999) FEBS Lett. 453,191) y se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas con gelatina (véase anteriormente) en 1,5 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 15% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 10 U/ml de nistatina. Se identificaron mediante tinción positiva para \alpha-actina de músculo liso.
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2. Análisis de RT-PCR
El ARN total endotelial se aisló con el kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania), a continuación se realizó una síntesis de ADNc con un máximo de 3 \mug de ARN y 200 U de transcriptasa inversa Superscript^{TM} II (Life Technologies) en un volumen total de 20 \mul correspondientemente al protocolo del fabricante. Para el ajuste de la carga de ADNc se usaron 5 \mul (aproximadamente 75 ng de ADNc) de la disolución de ADNc resultante y el par de cebadores (Gibco) para la PCR del factor de alargamiento 1 (EF-1) con 1 U de Taq ADN-polimerasa (Gibco) en un volumen total de 50 \mul. El EF-1 sirvió de patrón interno para la PCR. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 1,5% que contenían 0,1% de bromuro de etidio y la intensidad de las bandas se determinó densitométricamente con un sistema de cámara CCD y el software para el análisis del gel One-Dscan de Scanalytics (Billerica, MA, EE.UU.) para adaptar el volumen del ADNc en los siguientes análisis de PCR.
Todas las reacciones de PCR se realizaron por separado para cada par de cebadores en un termociclador Hybaid OmnE (AWG; Heidelberg, Alemania). Las condiciones de PCR por separado para el ADNc de células endoteliales humanas de cordón umbilical fueron del siguiente modo: CD40 (tamaño de producto 381 pb, 25 ciclos, temperatura de hibridación 60ºC, (cebador directo) 5'-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3' (SEQ ID NO:44), (cebador inverso) 5'-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3' (SEQ ID NO:45)); E-selectina (tamaño de producto 304 pb, 33 ciclos, temperatura de hibridación 60ºC, (cebador directo) 5'-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3' (SEQ IN NO:46), (cebador inverso) 5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3' (SEQ NO:47)); EF-1 (tamaño de producto 220 pb, 22 ciclos, temperatura de hibridación 55ºC, (cebador directo) 5'-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3' (SEQ ID NO:48), (cebador inverso) 5'-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3' (SEQ ID NO:49)); IL-12p40 (tamaño de producto 281 pb, 30 ciclos, temperatura de hibridación 62ºC, (cebador directo) 5'-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3'(SEQ ID NO:50), (cebador inverso) 5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3'(SEQ ID NO:51)); rp132 (tamaño de producto 368 pb, 20 ciclos, temperatura de hibridación 60ºC, (cebador directo) 5'-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3' (SEQ ID NO:52), (cebador inverso) 5'-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3' (SEQ ID NO:53); MCP-1 (tamaño de producto 330 pb, 22 ciclos, temperatura de hibridación 63ºC, (cebador directo) 5'-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3' (SEQ ID NO:54), (cebador inverso) 5'-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3' (SEQ ID NO:55).
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3. Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
Los extractos nucleares y los oligonucleótidos consenso bicatenarios marcados con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania), la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, autorradiografía y el análisis de superdesplazamiento se realizaron como se describe por Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191. En este caso se usó un oligonucleótido de ADN bicatenario con la siguiente secuencia monocatenaria (la secuencia de unión al núcleo está subrayada): SIE, 5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3' (SEQ ID NO:56). Para el análisis del desplazamiento de STAT-1 endógeno en extractos de núcleos de células THP-1 estimuladas con citocina (línea celular humana de premonocitos) por los distintos señuelos de elementos Cis se eligió en la preparación de unión para EMSA una relación de 30:1 (señuelo de elementos Cis STAT-1: oligonucleótido SIE marcado con [^{32}-P] (11 fmol)).
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4. Técnica de oligonucleótidos de señuelo
Los oligonucleótidos de señuelo bicatenarios se prepararon a partir de los oligonucleótidos monocatenarios complementarios unidos a fosforotioato (Eurogentec, Colonia, Alemania) como se describe por Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191. Las células endoteliales humanas cultivadas se preincubaron durante 4 horas a una concentración de 10 \muM del oligonucleótido de señuelo respectivo. Estas eran las condiciones que ya se habían optimizado anteriormente debido a EMSA y el análisis RT-PCR. Después, generalmente el medio que contenía el oligonucleótido de señuelo se sustituyó por medio fresco. Las secuencias monocatenarias de los oligonucleótidos fueron del siguiente modo (las letras subrayadas designan bases unidas a fosforotioato, todas en la dirección 5' - 3'):
GATA-2, CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT (SEQ ID NO:57)
NF-\kappaB, AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (SEQ ID NO:58);
STAT-1, CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG (SEQ ID NO:33);
STAT-1-19mut, GACAGTGCAGTGAACTGTC (SEQ ID NO:59);
STAT-1-25mut, CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG (SEQ ID NO:60).
5. Técnica del oligonucleótido antisentido (ODN)
Para una preparación antisentido se mezclaron 100 \mul ml de medio de cultivo OPTI-MEM®I con 15 \mul de lipofectina (Gibco Life Technologie, Karlsruhe, Alemania) y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (TA) (disolución A). A continuación de esto se añadió el ODN antisentido (Eurogentec, Colonia, Alemania) en una concentración final de 0,5 \muM a 100 \mul de medio de cultivo OPTI-MEM®I (disolución B). Después de reunirse las disoluciones A y B siguió otra incubación de 15 minutos (TA). Al principio del experimento se añadieron 0,8 ml del medio de cultivo convencional para el cultivo de células endoteliales (sin heparina y factor de crecimiento endotelial) al tubo de Eppendorf que contenía los complejos de lipofectina-ODN antisentido y el medio de cultivo celular del cultivo de células endoteliales se sustituyó por el medio de lipofectina antisentido. Después de 4 horas se eliminó el medio de lipofectina antisentido y se sustituyó por medio de cultivo celular fresco (con heparina y factor de crecimiento endotelial). La secuencia del ODN antisentido de STAT-1 era 5'-T*A*CCA*C*T*G*A*G-*A*C*A*T*CC*T*G-CC*A*C-3' (* base modificada con fosforotioato; SEQ ID NO:41).
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6. Análisis de transferencia de Western
Las células endoteliales humanas de cordón umbilical y las células de músculo liso de la vena tímica se desintegraron mediante congelación en nitrógeno líquido y descongelación a 37ºC (termobloque, Kleinfelden) cinco veces seguidas. Los extractos de proteínas se prepararon como se describe por Hecker y col. (1994) Biochem J. 299, 247. Se separaron 20-30 \mug de proteína con ayuda de una electroforesis en gel de acrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS según el protocolo estándar y se transfirieron a una membrana de transferencia de poli(fluoruro de vinilideno) BioTrace^{TM} (Pall Corporation, Rossdorf, Alemania). Para la detección inmunológica de las proteínas se usaron los siguientes anticuerpos primarios: proteína CD40 (policlonal, dilución 1:2000, Research Diagnostics Inc., Flanders NJ, EE.UU.), proteína STAT-1 (monoclonal, dilución 1:5000, BD Transduction Laboratories, Heidelberg, Alemania), proteína IRF-1 (policlonal, dilución 1:2000, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), proteína iNOS (policlonal, dilución 1:3000, BD Transduction Laboratories, Heidelberg, Alemania). Las bandas de proteína se detectaron después de añadir una anti-IgG de conejo acoplada a peroxidasa o usando el anticuerpo primario monoclonal mediante una anti-IgG de ratón correspondiente (1:3000, Sigma, Deisenhofen, Alemania) con ayuda del procedimiento de quimioluminiscencia (SuperSignal Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.) y posterior autorradiografía (Hyperfilm^{TM} MP, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra). La aplicación y la transferencia de las mismas cantidades de proteína se mostró después de "mojar" la membrana de transferencia (5 minutos en NaOH 0,2 N, a continuación lavado 3 x 10 minutos con H_{2}O) mediante detección de las mismas bandas de proteína de \beta-actina con un anticuerpo primario monoclonal y una anti-IgG de ratón acoplada a peroxidasa (ambos de Sigma-Aldrich, dilución 1:3000).
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7. Análisis estadístico
Si no se indica lo contrario, todos los datos en las figuras y el texto se especifican como valor medio \pm EEM de n experimentos. La evaluación estadística se realizó con la prueba de la t de Student para datos independientes con un valor de P <0,05, que se consideró como estadísticamente significativo.
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8. Detección experimental en animales de la acción del oligonucleótido de señuelo 8.1 Ratón
Para detectar la eficacia de la aproximación de terapia basada en el oligonucleótido de señuelo desarrollado en la presente solicitud, para la indicación artritis inducida por antígeno se realizó un estudio preliminar de eficacia ("proof-of-concept") experimental en animales en el ratón con 8-10 animales por grupo (modelo véase Henzgen y col., Exp. Toxicol. Pathol., (1996), 48, 255). La aplicación única de 0,25 nmol del oligonucleótido de señuelo de STAT-1- (SEQ ID NO: 33) directamente en la articulación (inyección intraarticular) redujo muy significativamente la hinchazón de la articulación inducida por antígeno (en un 35%) durante un periodo de tiempo de 3-14 días, la intensidad de la reacción inflamatoria (en un 70%), la destrucción de la articulación (en un 80%), la puntuación total de artritis (en un 70%) y la concentración de citocinas proinflamatorias en suero (por ejemplo, interleucina 6 en un 80%). Por el contrario, el oligonucleótido de control correspondiente no tuvo efecto terapéutico.
Además, en este estudio era notable que la dermatitis de contacto producida en la piel 14 días después de la inducción de artritis (reacción de tipo IV) - en este caso el antígeno se inyecta subcutáneamente a los animales una vez más - también se inhibió muy significativamente en los ratones tratados con el oligonucleótido de señuelo (en un 35%).
8.2 Cobaya
Después de sensibilizar dos veces las cobayas (Hartley, macho, 350 g de peso corporal) durante un periodo de tiempo de 7 días (en el día 1 en una oreja, en el día 2 en la otra oreja con respectivamente 50 \mul de una disolución de DNCB al 10% en 50% de acetona/50% de aceite de oliva; en el día 7 refuerzo en la piel de la nuca con 15 \mul de una disolución de DNCB al 2% en 95% de acetona/5% de aceite de oliva), la dermatitis de contacto se produce en el día 13 mediante la aplicación repetida de 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB; 10 \mul de una disolución al 0,5% de DNCB en 95% de acetona/5% de aceite de oliva) sobre una o varias áreas de aproximadamente 1 cm^{2} sobre la espalda rasurada de los animales y 24 horas después se evalúa macroscópica e histológicamente. La dermatitis de contacto así inducida se caracteriza histológicamente (tinción de Giemsa) por una pronunciada formación de edemas y espongiosis en la zona de la epidermis, un aumento de células apoptóticas, así como una infiltración masiva de leucocitos (Figura 8). La aplicación intradérmica de un oligonucleótido de señuelo de STAT-1 (SEQ ID NO: 19), pero no un oligonucleótido de control mutado (5'-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3',SEQ ID NO: 61), 1 hora antes de la exposición final a DNCB condujo a una clara reducción de los parámetros histológicos mencionados, es decir, en total a una atenuación significativa de la reacción inflamatoria.
<110> Avontec GmbH
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<120> Modulación de la expresión de genes dependientes de STAT-1
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<130> HEC-003 PCT
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<140> desconocido
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<141> 2002-10-02
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<150> DE 101 48 828.9
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<151> 04-10-2001
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<160> 61
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttcctggaa c 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> artificial
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gttcccggaa g 
\hfill
11 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 14
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cttccgggaa c 
\hfill
11 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> artificial
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gttccgggaa c 
\hfill
11 
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<212> ADN
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<213> artificial
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gttcccggaa c 
\hfill
11 
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<212> ADN
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<213> artificial
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tgtgaattac cggaagtgag a 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcacttcc ggtaattcac a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtgaattac cggaagtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttccggt aattcaca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtcagttcc aggaactgac t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtcagttcc tggaactgac t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtgagttc ccggaagtga act 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttcacttc cgggaactca cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagttccgg gaactgtc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacagttccc ggaactga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacagttccg ggaactgtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacagttccc ggaactgtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtattccg gtaagtga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacttaccg gaatacac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttatgtgaat tcctggaagt g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttccagg aattcacata a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgttatgc atattcctgt aagtg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttacagg aatatgcata acatg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtgaattcc tgtaagtgag a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcacttac aggaattcac a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatattcc tgtaagtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttacagg aatatgca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atattcctgt aagtg 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttacagg aatat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taccactgag acatcctgcc ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacatcattg gcacgcag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgaacctgc tccag 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagttcac tgaaacggaa tgcc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcctgcctg ttgcacaacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcaaggcat gatgttaacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcattcctct cttccagagc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcttaatcag tggtggaag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttggtcaag ttgtttcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 50
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtactccaca ttcctacttc tc 
\hfill
22 
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<210> 51
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 51
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tttgggtcta ttccgttgtg tc 
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22 
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<210> 52
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 52
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttcatccgg caccagtcag 
\hfill
20 
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<210> 53
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 53
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acgtgcacat gagctgccta c 
\hfill
21 
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<210> 54
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<400> 54
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gcggatcccc tccagcatga aagtctct 
\hfill
28 
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<210> 55
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 55
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgaattctt cttgggttgt ggagtgag 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 56
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gtgcatttcc cgtaaatctt gtc 
\hfill
23 
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<210> 57
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<400> 57
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\hskip-.1em\dddseqskip
cacttgataa cagaaagtga taactct 
\hfill
27 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 58
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttgagggg actttcccag gc 
\hfill
22 
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<210> 59
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<211> 19
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<400> 59
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gacagtgcag tgaactgtc 
\hfill
19 
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<210> 60
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<211> 25
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<213> artificial
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<400> 60
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\hskip-.1em\dddseqskip
catgttatgc agaccgtagt aagtg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 61
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 61
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgtggaccgt aggaagtg 
\hfill
18

Claims (3)

1. Oligonucleótido de señuelo, en el que una hebra de ácido nucleico presenta una secuencia según SEQ ID NO: 19 ó 20.
2. Oligonucleótido de señuelo según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido de señuelo presenta enlaces internucleotídicos modificados.
3. Oligonucleótido de señuelo según la reivindicación 1 ó 2 como fármaco.
4 Uso del oligonucleótido de señuelo según la reivindicación 1 ó 2 como fármaco para la prevención y/o terapia de complicaciones cardiovasculares, especialmente reestenosis después de angioplastia percutánea y formación de estenosis de derivaciones vasculares, de rechazo de trasplante, de enfermedad de injerto frente a huésped ("graft versus host disease") (GVHD), de isquemia/daños por reperfusión en operaciones quirúrgicas, de reacciones de hipersensibilidad inmunológica (tipo I a V), enfermedades autoinmunitarias, especialmente diabetes mellitus, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, todas las formas de enfermedades inflamatorias agudas, subagudas y crónicas, especialmente de las articulaciones, especialmente artritis, de los órganos respiratorios, especialmente asma bronquial y bronquitis crónica, de la piel, especialmente psoriasis y neurodermatitis y del tracto gastrointestinal, especialmente colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, así como de choque séptico.
ES02800540T 2001-10-04 2002-10-02 Modulacion de la expresion de genes dependientes de stat-1. Expired - Lifetime ES2330733T3 (es)

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