ES2330438T3 - Procedimiento de generacion de celulas beta de islotes de langerhans a partir de celulas pancreaticas exocrinas. - Google Patents

Abstract

Método in vitro para generar células beta productoras de insulina a partir de una población que comprende células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas de un primer mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: a) proporcionar una población que comprende células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en un medio de cultivo, b) añadir uno o más ligandos del receptor gp130 de un segundo mamífero y/o añadir uno o más ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de un tercer mamífero a dicho medio de cultivo, c) incubar dichas células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en dicho medio de cultivo que comprende dichos uno o más ligandos del receptor gp130 y/o dichos uno o más ligandos del receptor de EGF, donde dichos uno o más ligandos del receptor de EGF se seleccionan entre EGF, Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina o Factor de Crecimiento de Poxvirus, y donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina.

Description

Procedimiento de generación de células beta de islotes de Langerhans a partir de células pancreáticas exocrinas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para diferenciar células pancreáticas.

Antecedentes de la invención

La comprensión de la regulación de la neogénesis de las células beta en el páncreas podría conducir a aplicaciones en el campo de las terapias de reemplazo o regeneración de células para la diabetes [Yamaoka T. en Biochem Biophys Res Commum. (2002) 296, 1039-43]. Por ejemplo, el trasplante de islotes puede restaurar la masa de células beta funcionales en pacientes con diabetes [Shapiro et al. in N Engl J Med. (2000) 343, 230-238], pero esta técnica se ve gravemente obstaculizada por la escasez de tejido donante. Este problema podría solucionarse encontrando formas para generar más células de islotes a partir del tejido pancrático disponible, por medio del proceso de neogénesis [Bouwens & Kloppel in Virchows Arch. (1996) 427, 553-560]. A pesar del gran progreso en la comprensión del desarrollo del páncreas durante la última década, siguen sin conocerse los factores extracelulares que especifican la diferenciación de las células de los islotes en el embrión [Edlund en Nat Rev Genet. (2002) 3, 524-532]. En mamíferos adultos, el páncreas endocrino puede expandirse o regenerarse en ciertas condiciones experimentales, principalmente como resultado de la neogénesis de las células de los islotes a partir de células progenitoras [Bouwens & Kloppel, citado anteriormente]. Sigue sin conocerse la naturaleza exacta de esto último, aunque se ha sugerido que las células ductales, las células acinares o las células intraislote tienen capacidad progenitora [Bouwens & Kloppel en Virchows Arch. (1996) 427, 553-560; Edlund en Nat Rev Genet. (2002) 3, 524-532; Bouwens en Microscopy Research and Technique (1998) 43, 332-336; Guz et al. en Endocrinology. (2001) 142, 4956-4968; Bonner-Weir et al. en Proc Natl Acad Sci USA. (2000) 97, 7999-8004; Ramiya VK et al. Nat Med. (2000) 6, 278-282].

Es difícil extraer conclusiones sólidas a partir de estudios de páncreas entero tanto con respecto a la derivación de las células como con respecto a los factores reguladores específicos. Por lo tanto, se prefieren modelos in vitro para estudiar la neogénesis de los islotes a partir de preparaciones de células definidas aisladas del páncreas. Muy pocos estudios in vitro han podido demostrar la posibilidad de inducir la neogénesis de islotes a partir de tejido adulto. Ya se ha notificado que podrían generarse células de islotes adicionales a partir de cultivos en monocapa de tejido pancreático adulto. Aún no se dispone de la confirmación de estos descubrimientos, para desenmarañar la naturaleza de las células progenitoras y de los factores reguladores, y para mejorar la eficacia de la generación de células de los islotes.

Los cultivos celulares derivados de páncreas humano que se trataron con KGF (factor de crecimiento de queratinocitos) y nicotinamida produjeron aumentos en el contenido de insulina después de 3 a 4 semanas. Además, se produjeron estructuras quísticas que contenían células de islotes a partir de la monocapa bajo la influencia de la matriz extracelular [Bonner-Weir et al., citado anteriormente]. Los precursores responsables de esta neogénesis se caracterizaron como células que expresaban el marcador ductal citoqueratina-19 [Gao et al., citado anteriormente]. En otro estudio, se obtuvieron cultivos a largo plazo a partir de páncreas de ratón NOD diabético en condiciones sin glucosa, y pudieron estimularse para generar estructuras parecidas a islotes en presencia de glucosa [Ramiya VK et al. en Nat Med. (2000) 6, 278-282]. Estas células no alcanzaron la madurez funcional in vitro. En el momento actual no está claro si estas últimas observaciones pueden deberse a células madre "pasajeras" procedentes de la circulación sanguínea, que se han descubierto recientemente en ratones NOD [Kodama et al. en Science (2003) 302, 1223-1227].

Las células exocrinas diferenciadas pueden revertir a un estado parcialmente desdiferenciado con lo que vuelven a adquirir plasticidad embrionaria [Bouwens & Kloppel en Virchows Arch. (1996) 427, 553-560; Rooman et al. en Diabetologia 43, 907-914 (2000); Roman et al. en Gastroenterology 121, 940-949 (2001); Rooman et al. en Diabetes 51, 686-690, (2002)]. Esto indicó que las células exocrinas, la inmensa mayoría de las células de este órgano, pueden llevarse a una transdiferenciación en células endocrinas en las condiciones apropiadas.

Las células acinares exocrinas pueden transdiferenciarse en células beta endocrinas [Bouwens en Microscopy Research and Technique (1998) 43, 332-336] y ha habido indicaciones de estudios in vivo de la existencia de células de transición entre acinares y de islotes [Gu et al. en Pancreas (1997) 15, 246-2501; Bertelli E, Bendayan M en Am J Physiol (1997) 273, C1641-C1649]. Como las células acinares pueden perder amilasa y conseguir características ductales [Rooman et al. (2000) & (2001), citado anteriormente], la aparición de células transicionales que coexpresan marcadores ductales tales como citoqueratina e insulina [Wang et al. en Diabetologia. (1995) 38, 1405-1411] también podría representar células derivadas inicialmente de células acinares. Se ha demostrado que la línea celular que secreta amilasa AR42J, derivada de un tumor acinar, puede transdiferenciarse en el fenotipo de células beta in vitro [Mashima et al. en J Clin Invest. (1996) 97, 1647-1654]. La presente invención informa sobre la transdiferenciación in vitro de células acinares en células beta en un modelo de cultivo primario con una combinación específica de factores de crecimiento.

El LIF (Factor Inhibidor de Leucemia) es una citoquina pleiotrópica para la que no se ha descrito hasta ahora una función en el desarrollo pancreático. Es un regulador bien conocido de la proliferación y diferenciación de células madre y se usa ampliamente para impedir la diferenciación de células madre embrionarias. Recientemente se notificó que estimulaba la proliferación de células progenitoras adultas multipotentes (sin diferenciación de las células) en combinación con EGF y PDGF [Jiang et al. en Nature (200) 418, 41-49].

El EGF (Factor de Crecimiento Epidérmico) y otros miembros de la familia del EGF se han implicado en la regulación del desarrollo embrionario así como en la regeneración del páncreas endocrino. El EGF estimula la proliferación de las células precursoras pancreáticas indiferenciadas in vitro [Cras-Meneur et al. en Diabetes. (2001) 50, 1571-1579]. En ratones transgénicos que carecen de receptores de EGF funcionales, la morfogénesis de los islotes está obstaculizada y se retrasa la diferenciación de células beta [Miettinen et al. en Development. (2000) 127, 2617-2627]. Se descubrió que la betacelulina, un factor de crecimiento que también funciona a través del receptor de EGF, promueve la regeneración de los islotes en ratas pancreatectomizadas subtotalmente (25li) y en ratones con diabetes inducida por aloxano [Yamamoto et al. en Diabetes. (2000) 49, 2021-2027]. También se ha demostrado que Glp-1, otro factor que estimula la neogénesis de células beta (Drucker en Mol Endocrinol. (2003) 17, 161-171], transactiva el receptor de EGF [Buteau et al. en Diabetes. (2003) 52, 124-132]. En combinación con la hormona gastrina, se demostró que el EGF estimula la regeneración de células beta en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina [Brand et al. en Pharmacol Toxicol. (2002) 91, 414-420].

Se ha notificado que LIF y EGF actúan sinérgicamente como señales que regulan la diferenciación de las neuronas y las células gliales en embriones [Viti et al. en J. Neurosci. (2003) 15, 3385-3393]. En progenitores de astrocitos, el EGF aumenta la competencia para interpretar LIF como una señal inductora de astrocitos por medio del aumento de la fosforilación de STAT3. LIF también se considera una señal clave para la neurogénesis inducida por lesiones en el adulto [Bauer et al. en J. Neurosci. (2003) 23, 1792-1803].

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para generar células beta productoras de insulina a partir de una población que comprende o consiste en células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas de un primer mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: a) proporcionar dicha población de células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en un medio de cultivo, b) añadir uno o más ligandos del receptor gp130 de un segundo mamífero y/o añadir ligandos del receptor de EGF de un tercer mamífero a dicho medio de cultivo, c) incubar dichas células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en dicho medio de cultivo que comprende dichos uno o más ligandos del receptor gp130 y/o dichos uno o más ligandos del receptor de EGF, donde dichos uno o más ligandos del receptor de EGF se seleccionan entre EGF, Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina o Factor de Crecimiento de Poxvirus, y donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de Granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina.

En una realización, el método se realiza añadiendo en la etapa b) uno o más ligandos del receptor gp130 de un segundo mamífero sin añadir uno o más ligandos del receptor de EGF de un tercer mamífero a dicho medio de cultivo. En una realización particular, el método se realiza tanto añadiendo en la etapa b) uno o más ligandos del receptor gp130 de un segundo mamífero como añadiendo uno o más ligandos del receptor de EGF de un tercer mamífero a dicho medio de cultivo. De acuerdo con una realización, el ligando de dicho receptor gp130 es LIF, tal como LIF humano o humanizado. De acuerdo con una realización, LIF se añade al medio de cultivo en una concentración comprendida entre 10 y 100 ng/ml, o entre 10 y 25 ng/ml o entre 100 y 500 ng/ml. De acuerdo con una realización, el ligando de dicho receptor de EGF es un ligando humano o humanizado de dicho receptor de EGF. De acuerdo con otra realización, el ligando de dicho receptor de EGF es EGF tal como EGF humano o humanizado. De acuerdo con una realización, EGF se añade al medio de cultivo en una concentración comprendida entre 10 y 100 ng/ml o entre 10 y 25 ng/ml o entre 100 y 500 ng/ml. Generalmente, dichos uno o más ligandos del receptor gp130 y/o uno o más de los ligandos del receptor de EGF se añaden al medio de cultivo en una concentración comprendida entre 1 y 10.000 ng/ml. De acuerdo con una realización particular, el método comprende además la etapa de añadir bFGF (factores de crecimiento de fibroblastos básicos) a dicho medio de cultivo durante la etapa b. De acuerdo con una realización particular, el medio carece de KGF (factor de crecimiento de queratinocitos) o un ligando de receptores de gastrina/CCK. En realizaciones particulares, la etapa de incubación en el presente método se realiza durante 7, 6, 5 o incluso menos de 5 días, particularmente 4 ó 3 días. La población de células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas que pueden usarse para el método de la invención, de acuerdo con una realización, se selecciona entre el grupo que consiste en células ductales, células acinares y células de islotes. En la presente invención también pueden usarse mezclas de estos tipos de células, o también poblaciones celulares que comprenden una cierta relación de uno o más de los tipos celulares que consisten en el grupo consistente en células ductales, células acinares y células de islotes. De acuerdo con otra realización, se realiza una etapa adicional antes de la etapa a) en la que se reduce la cantidad de células beta. De acuerdo con otra realización, para reducir el crecimiento de fibroblastos, se realiza desdiferenciación y rediferenciación en presencia de genitimicina. Las células que pueden usarse de acuerdo con los métodos de la presente invención son todos los tipos de células de mamífero incluyendo células de roedor, porcinas, de mono y humanas. En una realización particular, las células de mamífero son células de rata, dichos uno o más ligandos de dicho receptor de EGF comprenden EGF humano, y dichos uno o más ligandos del receptor gp130 comprenden LIF murino.

La presente solicitud describe una población de células pancreáticas de mamífero que comprende células beta productoras de insulina de mamífero que pueden obtenerse por cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en este documento del método de la presente invención. En una realización, esta población de células pancreáticas de mamífero comprende de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 15 por ciento de células positivas para insulina. En otra realización, esta población de células pancreáticas de mamífero, después de la exposición a condiciones tales como glucosa 20 mM durante 4 horas a 37ºC en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% muestra un aumento mayor de 2 veces en la secreción de insulina en comparación con la secreción de insulina antes de dicha exposición a glucosa. En otra realización, esta población de células pancreáticas de mamífero puede proporcionar una secreción de insulina de al menos 10 ng/ml después de la exposición de dicha población a condiciones tales como glucosa 20 mM durante 4 horas a 37ºC en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%.

La solicitud describe una población de células que comprende células beta productoras de insulina de mamífero, donde dicha población de células comprende células que tienen al menos una característica de una célula beta diferenciada y al menos una característica de una célula beta indiferenciada en la misma célula individual. Una característica de una célula beta diferenciada puede ser, por ejemplo, secreción de insulina y una característica de una célula beta indiferenciada puede ser la expresión de CK20 y/o binuclearidad. Dicha población de células pancreáticas de mamífero se puede obtener por cualquiera de las realizaciones del método de rediferenciación descrito anteriormente.

La solicitud además describe una población de células pancreáticas de mamífero que comprende células beta secretoras de insulina de mamífero, donde dicha población de células comprende una primera subpoblación de células que tienen marcadores de células indiferenciadas o desdiferenciadas y comprende una segunda subpoblación de células que tienen marcadores de células diferenciadas. Son marcadores de células diferenciadas, por ejemplo, C-péptido-I, Pdx-1, Glut-2 o insulina. Son marcadores de células desdiferenciadas o indiferenciadas, por ejemplo, citoqueratina 7, citoqueratina 19, citoqueratina 20, receptor CCKB para gastrina, PGP9.5 o receptor notch-1. Dicha población de células pancreáticas de mamífero se puede obtener por cualquiera de las realizaciones del método de rediferenciación descrito anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una combinación de un ligando humano o humanizado de un receptor de EGF, y un ligando humano o humanizado del receptor gp130 para la preparación de un medicamento, donde dichos uno o más ligandos del receptor de EGF se seleccionan entre EGF, Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina o Factor de Crecimiento de Poxvirus, y donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de Granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina. En una realización, el medicamento se usa para el tratamiento de diabetes de tipo 1 o de tipo 2. En una realización particular, el ligando humano o humanizado de un receptor de EGF es EGF humano y el ligando humano o humanizado del receptor gp130 humano es LIF humano.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un ligando humano o humanizado del receptor gp130 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes de tipo 1 o de tipo 2, donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de Granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina. En una realización, el ligando humano o humanizado del receptor gp130 es LIF.

La presente invención se refiere a un método para generar células beta de mamífero productoras de insulina in vitro a partir de células pancreáticas desdiferenciadas. En una realización, esto se realiza incubando dichas células pancreáticas desdiferenciadas en un medio que comprende un ligando del receptor de EGF, por ejemplo EGF o TGF-alfa. Opcionalmente, el medio comprende además un ligando del receptor gp130 tal como LIF. Como alternativa, el medio opcionalmente comprende bFGF. Las células pancreáticas desdiferenciadas usadas en este método son, por ejemplo, células ductales, células acinares o células de islotes. Estas células desdiferenciadas pueden separarse de las células beta antes de la incubación en este medio. Las células pancreáticas desdiferenciadas son células de mamífero obtenidas, por ejemplo, a partir de roedores (rata, ratón), vacas, cerdos y primates, incluyendo seres humanos.

La solicitud describe una población de células productoras de insulina que puede obtenerse a partir de células pancreáticas desdiferenciadas por el método descrito anteriormente. Esta población de células productoras de insulina muestra preferiblemente un aumento de al menos dos veces en la secreción de insulina cuando se expone a glucosa (por ejemplo, glucosa 20 mM durante 4 horas). La población de células puede caracterizarse adicionalmente por su inmunorreactividad para marcadores tales como C-péptido-I y Pdx-1 y también puede caracterizarse adicionalmente por la presencia de menos de un 10% de células positivas para citoqueratina y/o menos de un 7% de células
binucleares.

Una población celular de células productoras de insulina que puede obtenerse a partir de células pancreáticas desdiferenciadas por el método de la presente invención puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2.

En un aspecto, la invención se refiere al uso de un ligando del receptor de EGF (por ejemplo EGF) o un ligando del receptor gp130 donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina. En una realización, el ligando humano o humanizado del receptor gp130 es LIF para la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes, para aumentar in vivo la cantidad de población de células beta secretoras de insulina.

Como se ha indicado anteriormente, la aplicación del trasplante de islotes como tratamiento de la diabetes se ve obstaculizada por un suministro inadecuado de células productoras de insulina. En la presente invención, las células beta productoras de insulina se generan a partir de células exocrinas, que representan la inmensa mayoría de las células pancreáticas, por ejemplo en seres humanos y otros mamíferos.

La presente invención proporciona un método en el que puede inducirse la neogénesis de células beta a partir de células exocrinas por la combinación de dos factores solubles en el medio, particularmente EGF y LIF. La invención proporciona un avance importante en el tratamiento de la diabetes por el trasplante de islotes, proporcionado una forma de solucionar el problema de la cantidad insuficiente de células beta donantes.

Cuando se aplica a células humanas, la presente invención proporciona un avance importante en el tratamiento de la diabetes por trasplante de islotes, proporcionando una manera de solucionar el problema de la cantidad insuficiente de células beta donantes.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra, de acuerdo con una realización de la invención, un aumento en el ADN (A), en el % de células positivas para insulina (B), en el número de células beta (C) y en el contenido de insulina celular (D) de cultivos desarrollados en presencia de EGF y LIF en comparación con cultivos sin estos factores de crecimiento (* = p<0,05; ** = p<0,01). Las células se mantienen durante 5 días en el medio (izquierda) antes de un periodo de tres días sin (centro) o con EGF+LIF (derecha).

La figura 2 muestra, de acuerdo con una realización de la invención, el aumento de células beta positivas para insulina en un medio de control frente a cultivos tratados con EGF y LIF, después del pretratamiento con aloxano (A) (n = 4), y el número de células beta positivas para insulina marcadas con BrdU en presencia de EGF y LIF durante el pulso y el periodo de rastreo (B) (n = 4). (** = p<0,01).

La figura 3 muestra, de acuerdo con una realización de la invención, un modelo de ratón diabético in vivo usando células rediferenciadas con EGF+LIF de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

"añadido", "añadir" o "adición" en la presente invención se refiere a compuestos ligandos del receptor de EGF y del receptor gp130, tales como LIF y EGF, que se suplementan por separado al medio. No se refiere a niveles desconocidos de compuestos que están presentes en el medio debido a la secreción por las células. Tampoco se refiere a las bajas cantidades de compuestos que están presentes en el suero que se añade al medio de crecimiento basal. Las concentraciones de compuestos añadidos en el medio están en el intervalo de ng/ml y pueden variar de aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 250 o 500, hasta 1000 ng/ml. En una realización específica, la concentración de compuestos añadidos para cada compuesto varía por separado entre 10 y 100 ng/ml. En otra realización específica, la concentración de compuestos añadidos para cada compuesto varía por separado entre 20 y 100 ng/ml.

"Células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas" se refiere a las células que están desdiferenciadas en una menor o mayor medida y tienen plasticidad embrionaria readquirida. Las características típicas de las células diferenciadas que se han perdido por las células diferenciadas son la expresión de amilasa y otros zimógenos, tales como tripsinógeno pancreático, tripsina y lipasa, el factor de transcripción de transactivación de insulina Pdx-1, el transportador de glucosa específico de las células beta Glut-2, y el componente C-péptido-I de la proinsulina no procesada. Las características típicas de la plasticidad embrionaria que se han adquirido por las células desdiferenciadas son la expresión de citoqueratinas 7, 19 y/o 20. Además, puede haber expresión de los receptores de colecistoquinina B CCKB para gastrina, los marcadores neuroendocrinos PGP9.5 (ubiquitina c-terminal hidrolasa específica de neuronas) y el receptor Notch-1. Son tipos de células pancreáticas típicos que pueden desdiferenciarse de acuerdo con la presente invención células acinares, células ductales y células de islotes no endocrinas.

Las "células beta" generalmente se conocen como células especializadas encontradas en grupos (islotes) en el páncreas. Las células beta regulan los niveles de glucosa en la corriente sanguínea fabricando insulina, controlando los niveles de glucosa y secretando insulina en respuesta a la elevación de los niveles de glucosa. Junto con las células alfa secretoras de glucagón, constituyen la mayor parte de la población de células endocrinas del páncreas.

Los islotes o el islote de Langerhans son grupos especiales de células en el páncreas. Fabrican y secretan hormonas que ayudan al cuerpo a degradar y usar los alimentos. Estas células se establecen en grupos en el páncreas. Hay cinco tipos de células en un islote: células beta, células alfa, células delta, que fabrican somatostatina, células PP y células D1.

La presente invención hace uso de la fracción exocrina que normalmente se desecha después del aislamiento de los islotes de Langerhans del páncreas de seres humanos y otros mamíferos. En ciertas realizaciones, las células exocrinas pancreáticas proceden de páncreas adulto, postnatal o prenatal. Las células pancreáticas endocrinas rediferenciadas pueden usarse para el trasplante en una especie diferente. Como alternativa, las células endocrinas rediferenciadas pueden usarse para el trasplante en un individuo diferente de la misma especie. Opcionalmente, las células pancreáticas exocrinas pueden obtenerse a partir de un individuo y las células endocrinas rediferenciadas pueden usarse para el trasplante en el mismo individuo. Las células desdiferenciadas pueden mantenerse en cultivo durante periodos de mayor duración de hasta 14 días. Como alternativa, las células desdiferenciadas se congelan y almacenan.

La presente invención se refiere al uso de EGF (factor de crecimiento epidérmico) que se une al receptor de EGF (EGFR) y activa una ruta aguas abajo. Por consiguiente, las versiones truncadas o mutadas de EGF que retienen la actividad de unión y activación del receptor de EGF pueden usarse como alternativa para los métodos de la presente invención. Dentro del mismo contexto, pueden usarse ligandos tales como EGF de otras especies animales distintas de las especies a partir de las cuales se aíslan las células pancreáticas si se unen y activan al receptor. Para estos fines, la secuencia de dicho ligando de una especie puede modificarse para adquirir las propiedades deseadas de unión y activación en la población celular obtenida a partir de otra especie. Para los fines in vivo, un ligando de un mamífero no humano puede "humanizarse" para adquirir actividad dentro de un humano y evitar una respuesta inmune por el sistema inmune del ser humano. Igualmente, para los métodos de la presente invención pueden usarse otras proteínas naturales o modificadas que son un ligando para EGFR. Los ejemplos son el Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina y Factor de Crecimiento de Poxvirus).

La presente invención se refiere al uso de LIF (factor inhibidor de leucemia) que se une al receptor gp130 y activa una ruta aguas abajo. LIF es una citoquina pleiotrópica para la que no se ha descrito hasta ahora una función en el desarrollo pancreático. Es un regulador bien conocido de la proliferación y diferenciación de células madre y se usa ampliamente para prevenir la diferenciación de células madre embrionarias. Las versiones truncadas o mutadas de ILF que retienen la actividad de unión y activación del receptor gp130 pueden usarse como alternativa para los métodos de la presente invención. Igualmente, para los métodos de la presente invención pueden usarse otras proteínas naturales o modificadas que son un ligando para gp130 y activan la ruta aguas abajo. Éstas son IL-6, IL-11 OSM (oncostatina M), CNTF (Factor Neurotrófico Ciliar), G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos), CT-1 (cardiotrofina-1), IL-12 y Leptina.

Se ha descrito una diferencia en el comportamiento de células de roedor (ratón, rata) y primate (humano, mono) en relación con el LIF para células ES humanas y células MAPC [Jiang et al., citado anteriormente]. De acuerdo con una realización, se incuban células pancreáticas desdiferenciadas humanas en una composición que comprende un ligando para el receptor de EGF (por ejemplo EGF) y un ligando para el receptor gp130 (por ejemplo LIF). En una realización específica en la que se usan células humanas, LIF es opcional.

EGF, LIF y otros compuestos usados en los métodos de la presente invención para la rediferenciación pueden proceder de la misma especie, pero también pueden proceder de otra especie siempre que el compuesto pueda unirse y activar su receptor. De esta manera, en general, la invención rota a la diferenciación de células de un primer mamífero por la adición de un ligando de la ruta del receptor gp130 de un segundo mamífero y/o un ligando de la ruta del receptor de EGF de un tercer mamífero, seleccionándose cada uno del primer, segundo y tercer mamíferos independientemente entre el grupo de mamíferos que comprenden, pero sin limitación, seres humanos, primates y monos no primates, roedores tales como hámster y rata, conejos, ovejas, vacas y otros bóvidos, perros y cerdos.

Simplemente con fines ilustrativos, la aplicación describe la determinación de propiedades en células individuales o en poblaciones celulares que son características de células productoras de insulina maduras o características de células inmaduras, desdiferenciadas o embrionarias. Previamente se demostró que las células acinares exocrinas cambian su fenotipo profundamente sólo en 4 días de cultivo en suspensión (Rooman et al. (2000) & (2001), citado anteriormente). Pierden amilasa y otros zimógenos, tales como tripsinógeno pancreático, tripsina y lipasa, y empiezan a expresar el marcador ductal CK20. En la matriz Matrigel forman estructuras quísticas que se parecen a conductos, pero cuando permanecen en cultivo en suspensión tienden a desdiferenciarse y expresar marcadores embrionarios tales como la combinación de factores de transcripción Pdx-1 y Ptf1-p48, el marcador neuroendocrino PGP9.5 y el receptor de gastrina CCKB [Rooman et al. (2000) & (2001), citado anteriormente]. Aparte de estos marcadores, se sabe que el especialista en la técnica conoce otros marcadores de células diferenciadas y desdiferenciadas y pueden usarse para evaluar el grado de diferenciación de las células o poblaciones celulares.

Las poblaciones de células o las células individuales rediferenciadas tienen ciertas propiedades que son típicas para las células desdiferenciadas o embrionarias. Algunas de las células rediferenciadas que son productoras de insulina retienen en la misma célula propiedades tales como la aparición de dos núcleos (binuclearidad) e inmunorreactividad con CK20. De esta manera, se describen marcadores y métodos para distinguir entre, por una parte, células rediferenciadas y poblaciones de células que comprenden células rediferenciadas y, por otra parte, células maduras y poblaciones celulares que comprenden células maduras.

Las células desdiferenciadas pueden cultivarse como monocapas unidas a plástico, en presencia de una baja concentración de suero (FBS al 1%). Pueden preverse muchas condiciones alternativas para el cultivo de células desdiferenciadas de mamíferos, tales como el uso de cultivos en suspensión, el uso de suero de otros animales aparte del suero bovino, el uso de medios alternativas distintos de RPMI-1640 y concentraciones variables de glucosa.

La solicitud describe un modelo de cultivo a corto plazo en el que puede inducirse la neogénesis de células beta en ciertos animales tales como roedores, especialmente ratas, por la combinación de dos factores solubles en el medio, particularmente EGF y LIF. Éste es el primer estudio in vitro de transdiferenciación acinoinsular, que documenta el cambio fenotípico de células exocrinas normales a células endocrinas.

La presente invención muestra la rediferenciación in vitro de células exocrinas desdiferenciadas en presencia de compuestos tales como LIF. En realizaciones alternativas, se prevé que la rediferenciación de células tenga lugar dentro del individuo a tratar. Como ejemplo, las células desdiferenciadas se incluyen dentro de una matriz biodegradable que comprende, por ejemplo, LIF y EGF, que permite la diferenciación in vivo de células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas. Después de la degradación de las matrices, se liberan las células diferenciadas. En una realización particular, las células primero se tratan con factores de crecimiento de diferenciación durante un tiempo limitado in vitro.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitarla.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación experimental

Animales: Para el aislamiento de células del páncreas se usaron ratas Wistar macho de 10-12 semanas de edad (Janvier, Le Genest-St-Isle, France) que pesaban 250-300 g. Como receptores del trasplante se usaron ratones desnudos BALB/cAnNCrl-nuBR macho de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA) que pesaban 22-24 g. Toda la experimentación animal se aprobó por el Comité de Ética de la Universidad Libre de Bruselas.

Aislamiento de tejido exocrino: Se disociaron parcialmente páncreas con colagenasa y se purificaron acinos exocrinos por elutriación centrífuga como se ha publicado anteriormente (Rooman et al. (2000) & (2001), mencionado anteriormente).

Procedimiento de cultivo: Se precultivaron células exocrinas durante 4 días en placas petri bacteriológicas (Nunc, Naperville, III., USA) en cultivo en suspensión en medio RPMI-1640 Glutamax-I suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco BRL, Paisley, Scotland), penicilina (75 mg/l) (Continental Pharma, Brussels, Belgium) y estreptomicina (100 mg/l) (Sigma, St Louis, Mo., USA) y se usó Sulfato de Geneticina (50 pg/ml) (Sigma) para excluir los fibroblastos del cultivo. Durante este periodo de precultivo el medio se reemplazó diariamente. El cuarto día después del aislamiento, las células se distribuyeron en alícuotas de 1000 \mul sobre placas de 24 pocillos (Falcon, BD Biosciences, Erembodegem, Belgium). Este procedimiento se estandarizó para obtener aproximadamente 75 ng de ADN por pocillo. Para algunos experimentos, las células se trataron con aloxano 10 mM durante 10 minutos antes del cultivo en placas. Después del cultivo durante una noche, se retiraron por lavado las células no adherentes y se añadió medio de control o medio que contenía factor de crecimiento a los pocillos. El medio de control consistía en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 1% y antibióticos (estreptomicina a 0,1 g/l y penicilina a 0,075 g/l). El medio de factor de crecimiento consistía en medio de control suplementado con 50 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) recombinante humano (Sigma, St. Louis, MO) y 40 ng/ml de factor inhibidor de leucemia (LIF) de ratón recombinante (Sigma). Las monocapas de células se analizaron después de un periodo de cultivo de 3 días en este último medio.

Inmunocitoquímica y medición del ADN: La cantidad de células por pocillo se midió por un ensayo fluorimétrico de ADN basado en la unión del colorante Hoechst 33258 [Loontiens et al. en Biochemistry (1990) 29, 9029-9039]. Se usaron al menos 6 pocillos por condición experimental, de forma que pudieron usarse cultivos por triplicado para la extracción del ADN y, en paralelo, para el análisis inmunocitoquímico de la composición celular. La tinción inmunocitoquímica de las monocapas se realizó directamente en las placas de 24 pocillos. Para este fin, las monocapas de células se fijaron durante 10 min con formaldehído tamponado al 4% seguido de 20 minutos con metanol (-20ºC) para la permeabilización de las células. Para las tinciones individuales de sólo un antígeno, se usó el método de estreptavidina-biotina peroxidasa [Bouwens et al. en Diabetes. (1994) 43, 1279-1283; Bouwens & De Blay en J Histochem Cytochem. (1996) 44, 947-951]. Para la tinción doble, se usó el método indirecto con anticuerpos secundarios marcados con FITC y TRITC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Los anticuerpos primarios usados en este estudio son anticuerpos policlonales anti-insulina (C. Van Schravendijk, VUB, Brussels) [Bouwens et al. (1994), citado anteriormente; Bouwens & De Blay, citado anteriormente], anticuerpos policlonales anti-C-péptido-I de rata (O.D. Madsen, Hagedorn Research Institute, Gentofte, Denmark [Blume et al. en Mol Endocrinol (1992) 6, 299-307], anticuerpos policlonales anti-Pdx1 (O.D. Madsen) [Rooman et al. (2000), citado anteriormente], anticuerpos policlonales anti-Glut-2 (Wak-Chemie Bad Soden, Germany), anticuerpos monoclonales anti-citoqueratina-20 (CK20) (Novocastra, Newcastle-upon-Tyhe, UK) (Bouwens et al. (1994), citado anteriormente; Bouwens & De Blay, citado anteriormente), anticuerpos policlonales anti-alfa-amilasa (Sigma) y anticuerpos monoclonales de ratón anti-Br-dU (ICN, Irvine, CA, USA). Para evaluar la incorporación de 5'-bromodesoxiuridina (BrdU) por células proliferativas, se añadió BrdU 10 \muM (Sigma) al medio de cultivo una hora antes de la fijación (Rooman et al. (2001), citado anteriormente). Para el marcaje de pulsos de BrdU-rastreo, se añadió BrdU al medio de cultivo el primer día de cultivo de células adherentes y se retiró 24 horas después. Las células se analizaron 24 horas después del pulso o en el día 3 del cultivo celular, es decir, después del rastreo de 48 horas en ausencia de BrdU. Se consiguió incorporación de BrdU tanto en células que expresaban insulina como en células que expresaban citoqueratina.

Análisis de RT-PCR: Se extrajo ARN total a partir del cultivo en monocapa de células pancreáticas de rata usando el método de aislamiento de ARN con Trizol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Para el análisis semicuantitativo de transcritos que codifican notch-1 y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, el ARN total se transcribió de forma inversa y se amplificó como se describe por el fabricante (Invitrogen Life Technologies): los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5-2,5% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los análisis se realizaron al menos tres veces.

Morfometría: Para medir el área de monocapas en placas de 24 pocillos se usó morfometría asistida por ordenador [Bouwens et al. (1994) citado anteriormente].

Mediciones de insulina: Se midieron el contenido de insulina celular y la insulina liberada en el medio por medio de un radioinmunoensayo [Pipeleers et al. citado anteriormente]. Para estudiar la liberación de insulina estimulada por glucosa, se midió la insulina en el medio de cultivo después de una incubación de 4 horas en medio basal que contenía glucosa 2,5 mM, seguido de una incubación de 4 horas en glucosa 20 mM (medio HAM-10 sin suero y sin glutamina, Gibco) [Lobner et al. en Diabetes (2002) 51, 2982-2988].

Trasplante: Para trasplantar las células de la monocapa, se cultivaron en colágeno S procedente de piel de ternero (tipo I; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) y se separaron con colagenasa P (Roche Molecular Biochemicals). Los sedimentos celulares se implantaron debajo de la cápsula renal (17) de ratones desnudos en los que se habían inyectado por vía intravenosa 70 mg/kg de aloxano 3 horas antes del trasplante. Los niveles de glucosa sanguínea se controlaron cada dos días en muestras obtenidas a partir de la vena de la cola de ratones alimentados, usando tiras Glucocard Memory (A. Menarini Diagnostics Benelux, Zaventem, Belgium).

Estadística: Se usó un ensayo t de Student de dos colas para muestras relacionadas y se consideró el significado estadístico a un intervalo de confianza <0,05. Se proporciona los valores medios \pm SEM. Las repeticiones de experimentos independientes indican como n = x (siendo x el número de repeticiones), siendo cada preparación de células un conjunto de un total de 5 ratas.

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Ejemplo 2

Generación y composición de monocapas de células exocrinas

Se obtuvieron agregados de células acinares exocrinas aisladas y precultivadas como se ha descrito anteriormente (Rooman, et al. (2000) & (2001), citado anteriormente) y posteriormente se dejó que estas células formaran monocapas en plástico. Más del 90% de las células fueron inmunorreactivas para el marcador ductal CK20 y habían perdido el marcador amilasa de las células acinares. De estas células, - 79,0 \pm 0,4% (m = 7) eran binucleadas, una característica de parte de las células acinares. Estos cultivos se contaminaron inicialmente con un 3,7 \pm 0,46% (n = 7) de células positivas para insulina. Cuando las preparaciones celulares se habían pretratado con aloxano antes de la formación de la monocapa, las monocapas contenían menos de un 0,5% de células positivas para insulina. Cuando se usó geniticina durante el cultivo, se inhibió el crecimiento de células fibroblásticas.

Los datos publicados demostraron que las células acinares exocrinas pierden sus características diferenciadas tales como amilasa y otros zimógenos antes de que hayan transcurrido 4 días de cultivo en suspensión y empiezan a expresar características ductales y embrionarias tales como CK20, la combinación de factores de transcripción Pdx-1 y Ptf1-p48, los marcadores neuroendocrinos PGP9.5 y el receptor de gastrina CCKB (Rooman et al. (2000) & (2001), citado anteriormente; Lardon et al. (2004) Virchows Arch. 444, 61-65). En presencia de dexametasona, se demostró que estas células pueden transdiferenciarse en células parecidas a hepatocitos [Lardon et al. (2004) en Hepatology 39, 1499-1507)]. Para el presente estudio, estas células se cultivaron como monocapas unidas a plástico, en presencia de una baja concentración sérica (FBS al 1%) y se ensayaron con respecto al efecto de la combinación de LIF y EGF. Se sabe que estos factores controlan la diferenciación de células madre neurales adultas y embrionarias (Viti et al. (2003) en J. Neurosci. 15, 3385-3393).

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Ejemplo 3

Efecto de factores de crecimiento sobre el número de células y la frecuencia de células beta

Cuando se trataron cultivos de monocapa con LIF y EGF durante 3 días, se detectó un aumento significativo en el contenido de ADN en comparación con el principio del cultivo y en comparación con los cultivos que carecían de los dos factores de crecimiento (Fig. 1A). La superficie total cubierta con células que se midió por morfometría mostró un aumento comparable.

El tratamiento con LIF y EGF también indujo un aumento significativo en la frecuencia de células positivas para insulina expresada como un porcentaje de todas las células (Fig. 1B). Cuando se multiplicó la frecuencia de las células positivas para insulina por el contenido de ADN total para tener una medida del número absoluto de células beta, se observó un aumento de 11 veces en el número de células beta en presencia de LIF y EGF durante el período de cultivo de 3 días (Fig. 1C). El análisis del contenido total de insulina celular por radioinmunoensayo mostró un aumento de 6 veces en cultivos tratados con LIF y EGF en comparación con cultivos de control (Fig. 1D).

En presencia de LIF o EGF solos también hubo un aumento significativo en el número de células beta, respectivamente 6 y 5 veces en comparación con el material inicial, pero estos aumentos fueron significativamente menores que en presencia de los dos factores juntos.

En cultivos pretratados con aloxano de los que se habían eliminado células beta contaminantes, y después de 3 días de cultivo en presencia de LIF y EGF, se encontró un 9,2 \pm 1,5% de células positivas para insulina (n = 4). En ausencia de factores de crecimiento hubo un 0,4 \pm 0,1% de células positivas para insulina. La regulación positiva de las células positivas para insulina que se observó con la combinación de los dos factores no se observó cuando se administró sólo EGF o LIF.

Las poblaciones de células que se obtienen de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden enriquecerse adicionalmente en células secretoras de insulina por métodos tales como clasificación FACS, fraccionamiento por tamaños y elutriación como se explica, por ejemplo, en el documento EP1146117.

In vitro, EGF o LIF solos también tuvieron un efecto sobre el número de células beta. Esto puede explicarse por la observación de que estos factores también se producen por las células cultivadas y pueden funcionar de una manera paracrina o autocrina (observaciones no publicadas). En la presente invención se demostró que LIF se produce por las células beta, sugiriendo de esta manera que las células beta pueden estimular su propia regeneración a partir de las células precursoras. Las células beta también producen otros factores que pueden regular la neogénesis de los islotes, por ejemplo, netrina [De Breuck et al. en Diabetologia (2003) 46, 926-933] y el factor de crecimiento del endotelio vascular [Rooman et al. en Lab Invest 76, 225-232]. Estas observaciones pueden explicar por qué la regeneración de islotes "espontánea" después de una lesión tóxica o autoinmune es limitada.

En el presente modelo de células exocrinas desdiferenciadas, se descubrió que la combinación de LIF y EGF estimulaba la proliferación celular como se demuestra por un aumento significativo en el ADN total y una mayor área ocupada por las monocapas. La combinación de LIF y EGF también produjo un aumento de aproximadamente seis veces en el porcentaje de células positivas para insulina. Junto con el aumento observado en el ADN, esto proporciona un aumento de más de diez veces en el número de células que contienen insulina.

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Ejemplo 4

Análisis fenotípico

El análisis por tinción de inmunofluorescencia doble demostró que la mayoría de estas células positivas para insulina también expresaban otros marcadores de células beta, incluyendo el C-péptido-I de proinsulina, el factor de transcripción Pdx-1 y el transportador de glucosa Glut-2. La inmunorreactividad para el C-péptido excluye la posibilidad de la captación de insulina del medio como explicación de la mayor frecuencia de células inmunorreactivas con insulina (no se añadió insulina al medio).

En los cultivos tratados con EGF+LIF, aproximadamente un 10% de las células positivas para insulina eran inmunorreactivas para CK20, con una intensidad de tinción algo menor en comparación con las células negativas para insulina. La coexpresión de insulina y CK20 raramente se observaba en cultivos de control en los que no se habían añadido factores de crecimiento y no se observó en el material de partida. Esta coexpresión sugiere una transición fenotípica de células exocrinas a células positivas para insulina. De forma sorprendente, las células doblemente positivas para insulina y CK20, según se observó, eran binucleares. Las células positivas para insulina binucleares raramente se vieron en los cultivos de control y estaban ausentes al principio, pero se observaron frecuentemente en los cultivos tratados con EGF+LIF donde constituían un 6,2 \pm 0,47% (n= 7) de todas las células positivas para insulina. En las monocapas derivadas de células exocrinas de la presente invención, casi un 80% de las células eran binucleares. Como la binuclearidad es una característica de la mayoría de las células exocrinas acinares [Ramiya et al., citado anteriormente], estas observaciones son otra indicación de una transición de células exocrinas a células positivas para insulina. Las células rediferenciadas que se obtuvieron usando el método de la presente invención tienen la característica sorprendente de que la población en conjunto, pero también algunas células individuales, retiene las características de las células completamente diferenciadas pero también de células embrionarias diferenciadas incompletamente o células precursoras adultas. Estas características se ejemplifican en este ejemplo y en los siguientes. Esta propiedad de llevar los dos marcadores de células diferenciadas y no diferenciadas permite la distinción entre células obtenidas por el presente método y células aisladas recientemente de un páncreas, especialmente del páncreas de un adulto.

La mayoría de estas células que contienen insulina pueden considerarse células beta maduras, ya que expresaban otras características fenotípicas de las células beta, tales como el factor de transcripción de transactivación de insulina Pdx-1, el transportador de glucosa específico de células beta Glut-2, y el componente C-péptido-I de la proinsulina no procesada. Había muy pocas células beta marcadas con BrdU, de forma que el aumento observado en su número dentro de un periodo de 3 días debe atribuirse a la diferenciación de células precursoras o a la neogénesis. Hubo dos indicaciones de que las células exocrinas servían como células precursoras de las células beta formadas recientemente. En primer lugar, se detectó inmunorreactividad de CK20 en parte de las células positivas para insulina. Antes se había demostrado que las células beta que contienen CK20 sólo se encuentran en el páncreas fetal [Bouwens & De Blay, citado anteriormente] y de recién nacido [Bouwens et al. (1994), citado anteriormente], y en el páncreas adulto cuando se ha inducido la neogénesis por ligamiento ductal [Wang et al., citado anteriormente]. De esta manera, la expresión de CK20 es una buena indicación de una transición de las células exocrinas positivas para CK20 a células beta. En segundo lugar, se detectó binuclearidad en parte de las células positivas para insulina. La binuclearidad es una característica de las células exocrinas acinares y no se observa en las células beta de rata normales [Rooman et al. (2000), citado anteriormente]. Ésta es otra indicación de una transición de las células exocrinas a células beta. Es poco probable que las células beta binucleares representen células en división bloqueadas antes de la citocinesis, ya que hubo muy poco actividad mitótica de células beta (incorporación de BrdU). No puede excluirse completamente la fusión celular entre células beta, aunque más bien conduciría a una reducción en el número de células beta en lugar de al aumento observado. Las observaciones no publicadas con mitomicina C y citocalasina B predicen que las células positivas para insulina también podrían producirse a partir de células binucleadas (exocrinas) por un tipo de citocinesis retrasada o proceso de escisión. Se ha demostrado indirectamente la escisión de células somáticas o la reducción-división a partir de células híbridas tetraploides, pero aún no se ha caracterizado el mecanismo [Wang et al. en Nature (2003) 422, 897-901].

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Ejemplo 5

Proliferación

El análisis de la incorporación de BrdU en células positivas para insulina demostró que menos de un 0,1% de las células positivas para insulina estaban marcadas con BrdU después de un pulso de una hora. Esto hace que sea muy poco probable que la binuclearidad de estas células se haya producido como resultado de una detención de la división nuclear en células beta mitóticas, o que el aumento en el número de células beta se haya producido como resultado de la proliferación de células beta contaminantes. Aproximadamente un 1,5% de las células exocrinas estaban marcadas con BrdU.

Un experimento de pulso-rastreo con BrdU durante un periodo de 72 horas (un periodo de pulso de 24 horas y un rastreo de 48 horas) reveló un aumento significativo en las células beta marcadas con BrdU en presencia de EGF y LIF durante el periodo de rastreo (Fig. 2B). Este aumento sólo puede explicarse por la diferenciación de células exocrinas en proliferación en células beta no proliferativas.

Los datos con mitomicina-C (inhibidor de la proliferación) y citocalasina-B (inhibidor de la citocinesis) indican que las células binucleadas podían dividirse en células mononucleadas (que expresan insulina) sin pasar a través del ciclo celular, lo que sugiere la existencia de un tipo de fenómeno de citocinesis retrasada o de escisión.

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Ejemplo 6

Análisis por PCR de marcadores maduros y embrionarios

El análisis por RT-PCR reveló que la expresión Notch estaba ausente en las monocapas cultivadas en medio de control (día 8) y que Notch estaba regulado positivamente en las monocapas en presencia de EGF y LIF. Notch está ausente en los islotes de rata.

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Ejemplo 7

Secreción de insulina

Se realizaron estudios de secreción de insulina durante 4 horas en las condiciones de cultivo celular mencionadas anteriormente. En comparación con su secreción basal en glucosa 2,5 mM, la estimulación por glucosa 20 mM proporcionó un aumento de 4 veces en la insulina secretada, particularmente de 2,3 a 9,5 ng/ml.

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Ejemplo 8

Trasplante

Se trasplantaron monocapas separadas de células pancreáticas de rata desdiferenciadas tratadas con LIF y EGF y se observaron en ratones desnudos tratados con aloxano. Los ratones tratados con 70 mg/kg de aloxano permanecen con hiperglucemia permanente o mueren en el transcurso de una semana [Wang et al. en Diabetologia. (1995) 38, 1405-141]. El injerto produjo normalización de la glucemia sanguínea que se mantuvo durante un período de 14 días, pero revirtió rápidamente a hiperglucemia cuando se retiró el riñón que llevaba el injerto (Figura 3). Esto demuestra que las células beta rediferenciadas obtenidas in vitro con LIF y EGF, de acuerdo con la presente invención, pueden controlar la glucemia sanguínea in vivo.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

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Claims (10)

1. Método in vitro para generar células beta productoras de insulina a partir de una población que comprende células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas de un primer mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

proporcionar una población que comprende células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en un medio de cultivo,

b)

añadir uno o más ligandos del receptor gp130 de un segundo mamífero y/o añadir uno o más ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de un tercer mamífero a dicho medio de cultivo,

c)

incubar dichas células pancreáticas exocrinas desdiferenciadas en dicho medio de cultivo que comprende dichos uno o más ligandos del receptor gp130 y/o dichos uno o más ligandos del receptor de EGF,

donde dichos uno o más ligandos del receptor de EGF se seleccionan entre EGF, Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina o Factor de Crecimiento de Poxvirus, y

donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se seleccionan entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método comprende además la etapa de añadir bFGF a dicho medio de cultivo durante la etapa b).

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho medio carece de KGF o un ligando del receptor de gastrina/CCK.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además, antes de la etapa a), una etapa preliminar de reducir la cantidad de células beta de dicha población.

5. Uso de una combinación de un ligando humano o humanizado de un receptor de EGF y un ligando humano o humanizado del receptor gp130 para la preparación de un medicamento donde dicho uno o más ligandos del receptor de EGF se selecciona entre EGF, Factor de Crecimiento de Transformación-alfa, anfirregulina, betacelulina o Factor de Crecimiento de Poxvirus, y donde dichos uno o más ligandos del receptor gp130 se selecciona entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicho medicamento se usa para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2.

7. Uso de un ligando humano o humanizado del receptor gp130 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2, donde dicho uno o más ligandos del receptor gp130 se selecciona entre Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), IL-6, IL-11, OSM oncostatina M (OSM), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), IL-12 o Leptina.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende añadir uno o más ligandos del receptor gp130 y añadir uno o más ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a dicho medio de cultivo.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, donde uno de dichos uno o más ligandos del receptor de EGF es EGF.

10. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, donde uno de dichos uno o más ligandos del receptor de EGF es EGF.