ES2329681T3 - Celulas madre mesenquimales como vehiculos para la transferencia de canales canajes ionicos en estructuras sincitiales. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una célula madre mesenquimal en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica un canal de HCN en una cantidad suficiente para crear un canal iónico en la célula madre mesenquimal.

Description

Células madre mesenquimales como vehículos para la transferencia de canales iónicos en estructuras sincitiales.

Esta solicitud reivindica la prioridad de la U. S. Nº de Serie 10/342.506, depositada el 15 de enero de 2003.

Declaración relativa a la investigación o desarrollo esponsorizados

La invención aquí descrita se llevó a cabo con el apoyo del gobierno con los Nº de subvención del NIH HL-28958 y HL-20558 del National Institute of Health. De acuerdo con esto, el gobierno estadounidense tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con células madre mesenquimales como vehículo para la transferencia de canales iónicos en estructuras sincitiales.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones mediante números. Las citas completas se pueden encontrar al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones.

La corriente del marcapasos, I_{f}, está presente tanto en las regiones automática (1) y no automática (2-6) del corazón. Además, el umbral del voltaje de activación varía ampliamente entre las regiones cardíacas, siendo menos negativas en el nodo del seno (por ejemplo, en el nodo del seno en conejos es de -40 mV (7)) y más negativo en el ventrículo (-108 mV o más negativo, dependiendo de las especies (5, 8, 9)). Curiosamente, la corriente activa a voltajes menos negativos en el ventrículo del recién nacido (aproximadamente -70 mV en ratas (8, 10)) y el ventrículo adulto enfermo (aproximadamente -70 mV umbral en ratas viejas hipertensivas (11), -55 mV en el ventrículo humano defectuoso (12)). Las bases moleculares y celulares para la variabilidad regional de los voltajes de activación en el corazón normal adulto y la regulación del voltaje de activación ventricular por el desarrollo y la enfermedad continúa sin estar determinado, pero este entendimiento es crítico para cualquier futura aplicación terapéutica de la corriente expresada en el miocardio.

En la actualidad, sólo los marcapasos electrónicos y los fármacos cardioactivos se utilizan para reparar la función cardiaca. Existe una necesidad para un marcapasos biológico en el corazón que utilice componentes nativos para el propio corazón, como las subunidades alfa y beta de los genes del canal del marcapasos. (57, 58, 59). La presente invención está dirigida hacia el perfeccionamiento del sistema de entrega de estos genes que no necesitan la implantación de dispositivos electrónicos, como un marcapasos electrónico, ni la administración de sustancias potencialmente tóxicas, como los fármacos cardioactivos.

Resumen de la invención

La presente invención implica la utilización de células madre mesenquimales como vehículos para la entrega de genes a estructuras sincitiales. Las células madre mesenquimales, incorporadas con genes, se administran a estructuras sincitiales, en las que las células madre se acoplan con el sincitio, permitiendo la expresión génica dentro de estructura sincitial. Por ejemplo, los genes de canal iónico liberados a través de células madre a la región cardíaca pueden alterar la actividad del marcapasos cardíaco.

Adicionalmente, las células madre mesenquimales pueden también utilizarse de forma similar para liberar pequeñas moléculas en sincitios funcionales.

La presente invención proporciona una composición que comprende una célula madre mesenquimal en la que un ácido nucleico que codifica un canal de HCN ha sido introducido en una cantidad suficiente para crear un canal iónico en la célula.

Esta invención también proporciona el uso de la composición que comprende una célula madre mesenquimal en la que un ácido nucleico que codifica un canal de HCN ha sido introducido en una cantidad suficiente para crear un canal iónico en la célula en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno cardíaco. El tratamiento puede comprender poner en contacto una célula del corazón del sujeto con la composición, en una cantidad suficiente para aumentar la expresión de corriente de la célula, tratando así la condición cardiaca del
sujeto.

El tratamiento puede comprender inducir una corriente en el corazón en un sujeto que comprende poner en contacto una célula del corazón de un sujeto con la composición, en una cantidad suficiente para inducir una corriente en la célula del corazón del sujeto, induciendo así una corriente en la célula del corazón del sujeto.

El tratamiento puede comprender aumentar la frecuencia cardiaca en un sujeto que comprende poner en contacto una célula del corazón de un sujeto con la composición, en una cantidad suficiente para disminuir la constante de tiempo de activación de la célula del corazón, aumentando así la frecuencia cardiaca en el sujeto.

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El tratamiento puede comprender inducir una corriente en una célula que comprende poner en contacto una célula con la composición, en una cantidad suficiente para inducir una corriente en la célula, induciendo así una corriente en la célula.

El tratamiento puede comprender provocar una contracción de una célula que comprende poner en contacto la célula con la composición, en una cantidad suficiente para inducir una corriente necesaria para provocar una contracción de la célula, provocando así una contracción de la célula.

El tratamiento puede comprender acortar el tiempo necesario para activar una célula que comprende poner en contacto una célula con la composición, en una cantidad suficiente para disminuir la constante de tiempo de activación de la célula, acortando así el tiempo necesario para activar la célula.

El tratamiento puede comprender cambiar el potencial de membrana de una célula que comprende poner en contacto una célula con la composición, en una cantidad suficiente para cambiar el potencial de membrana de la célula, cambiando así el potencial de membrana de la célula.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A-B: células madre cargadas con colorante amarillo Lucifer mediante electroporación. A: imagen al microscopio óptico de las células madre. B: imagen con fluorescencia de las mismas células madre. Nótese que la concentración de carga fue de 2 mM amarillo Lucifer en el medio.

Figura 2A-B: transferencia del colorante amarillo Lucifer de un célula madre a un célula HeLa transfectada con Cx43. A: imagen al microscopio de célula madre cargada con Amarillo Lucifer mediante electrodo, con posterior transferencia a la célula HeLa Cx43. B: imagen por fluorescencia de la misma célula madre. Nótese que la transferencia del colorante presumiblemente ocurre mediante difusión a través de uniones comunicantes.

Figura 3A-C: acoplamiento y transferencia iónica y de colorante entre las células madre y entre una célula madre y un cardiomiocito canino (ventrículo). A: imágenes de microscopio óptico y por fluorescencia de la transferencia de colorante entre células madre. B: imágenes de microscopio óptico y por fluorescencia de la transferencia de colorante entre una célula madre y un cardiomiocito canino. C: gráfica que representa la transferencia iónica entre una célula madre y un cardiomiocito canino.

Figura 4A-B: célula madre acoplada a célula HeLa transfectada con Cx43. A: fotografía al microscopio óptico y por fluorescencia de transferencia de colorante de la célula madre a la célula HeLa. B: gráfica de la transferencia iónica entre la célula madre y la célula HeLa.

Figura 5: relación I-V de una célula madre mesenquimal humana aislada de un cuerpo embrionario. A: imagen al microscopio óptico de la célula madre aislada de un cuerpo embrionario. B: gráfica que muestra la rectificación interna que sugiere el inicio de una diferenciación de tipo cardíaco para la relación I-V.

Figura 6: tasa de supervivencia en la aguja de las células madre transfectadas in vitro.

Figura 7: células madre mesenquimales humanas transfectadas transitoriamente con mH2-EGFP.

Figura 8A-B: HCN2 incorporado a las células madre puede generar una corriente de marcapasos. A: protocolo de rampa de células madre que expresan HCN2. La rampa comienza en +50 hasta -100 y de nuevo a 0 mV. B: protocolo de pasos de células madre que expresan HCN2. Los pasos están entre 0 y -100 mV. Nótese que el experimento se realizó a temperatura ambiente, 20ºC. Por lo tanto, la cinética será aproximadamente 15x más rápida y la amplitud será 2x mayor a temperatura fisiológica.

Figura 9A-B: HCN2 incorporado en una célula madre que no puede generar corriente de marcapasos. A: protocolo de rampa de células madre que no pueden expresar HCN2. La rampa comienza en +50 hasta -100 y de nuevo a 0 mV. B: HCN2 mutante incorporado a una célula madre que no puede expresar y generar una corriente. Los pasos son de 0 a -100 mV. Nótese que el experimento se realizó a temperatura ambiente, 20ºC. Por lo tanto, la cinética será aproximadamente 15x más rápida y la amplitud será 2x mayor a temperatura fisiológica.

Figura 10A-E: Expresión de la función marcapasos en ventrículo canino in situ como resultado de la implantación de células madre mesenquimales humanas con el gen marcapasos HCN2. Un perro se anestesió y se implantaron las células madre que incorporan el gen HCN2 mediante una aguja de calibre 21 en la pared ventricular izquierda anterior del perro. A: registros de ECG que demuestran ritmo sinusal y una taquicardia ventricular de una configuración específica basada en la estimulación por la inserción de la aguja. B: la estimulación vagal del perro resultó en la detención del ritmo sinusal. C: la estimulación vagal continuada provocó el inicio de un ritmo idioventricular estable tras la detención del ritmo sinusal. Este ritmo mostró la misma configuración en el ECG de derivación II que el ritmo que aparece en el primer día de implantación (Fig. 10A) como resultado de la estimulación en el lugar de implantación. La causa más probable del ritmo idioventricular sería la iniciación de impulsos cardíacos espontáneos por la corriente de marcapasos en las células madre. D: tras la finalización de la estimulación vagal, el perro retorna a un ritmo sinusal. E: se extrajo el corazón del perro y se sometió a un estudio histológico. La figura muestra la estructura de tipo nodular de las células madre mesenquimales a lo largo del recorrido de la aguja en el lugar de implantación.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una composición de acuerdo con la reivindicación 1.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN es HCN1.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN es HCN2.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN es HCN4.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN es un canal HCN mutado.

En una realización preferible de la composición inmediatamente precedente, el canal de HCN mutado es E324A-HCN2.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN mutado es Y331A-HCN2.

En una realización preferible de la composición anterior, el canal de HCN mutado es Y331A, E324A-HCN2.

En una realización preferible de la composición anterior, el ácido nucleico introducido también codifica para MiRP1.

La presente invención proporciona además la utilización de una composición de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del ritmo cardíaco en un mamífero, en el que el trastorno del ritmo cardíaco se selecciona de entre el grupo que consiste en bloqueo de la conducción, bloqueo atrioventricular completo, bloqueo atrioventricular incompleto y disfunción del nodo sinusal, en el que el medicamento se introduce en el corazón de los mamíferos en una cantidad suficiente para aumentar la corriente de marcapasos en el corazón.

En una realización preferible de la utilización anteriormente descrita, el paso de introducción se selecciona de entre el grupo que consiste en administración sistémica en la estructura e inyección.

En una realización preferible de la utilización inmediatamente precedente, la introducción para su administración se selecciona de entre el grupo que comprende la aplicación tópica en las células del corazón, microinyección y cateterización.

La presente invención proporciona además una utilización o composición de acuerdo con la invención en la que el medicamento o composición causa uno o más de los siguientes efectos: induce una corriente de marcapasos en el corazón; causa una contracción de una célula del corazón; acorta el tiempo necesario para activar una célula del corazón; y cambia el potencial de membrana de una célula del corazón.

Como se utiliza aquí, el término "estructura sincitial" significa una estructura con comunicación mediada por uniones comunicantes entre sus células.

Como se utiliza aquí, el término "célula de un corazón" significa a célula derivada del corazón, ya sea aislada o en cultivo.

Como se utiliza aquí, el término "miocitos cardiacos" se refiere a miocitos derivados del músculo o del tejido conductivo del corazón, ya sean aislados o en cultivo, y capaces de iniciar una corriente.

Como se utiliza aquí, el término "potencial de membrana de la célula" significa el potencial transmembranal a o largo de la membrana plasmática de la célula.

Como se utiliza aquí, el término "inducir una corriente" significa provocar que una célula produzca una corriente eléctrica.

Como se utiliza aquí, el término "tiempo necesario para activar una célula" significa el periodo de tiempo necesario para la activación de la célula.

Como se utiliza aquí, el término "moléculas pequeñas" se refiere a moléculas de hasta 1200 Dalton y/o con diámetros pequeños de hasta 1,2 nanómetros.

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Los métodos que ilustran la anterior descripción detallada se indican a continuación.

Fase 1

Expresión, regulación y función de los genes canal marcapasos

La evaluación inicial de la función del canal expresado puede realizarse mediante una transfección en miocitos ventriculares neonatales en cultivo. Las construcciones candidatas pueden transfectarse en células madre (Fase 2) en las que se analizará su capacidad de acoplarse y marcar el ritmo de los miocitos cardiacos en cultivo (Fase 3). Además, las construcciones candidatas pueden obtenerse como un adenovirus que expresa el gen de interés y su función puede caracterizarse in vitro (en cultivos de miocitos ventriculares neonatales y adultos) e in vivo (en diferentes regiones cardiacas). Los estudios in vivo pueden realizarse durante la Fase 5. La función principal incorpora la preparación de construcciones adenovirales con un marcador fluorescente y los genes HCN, MiRP y mutantes.

Las metas u objetivos específicos de la Fase 1 son:

1. Expresión y caracterización de las isoformas nativas de HCN (subunidades alfa del canal marcapasos). HCN1, HCN2 y HCN4 pueden estar sobreexpresadas en miocitos neonatales y se caracterizan en términos de cinética, dependencia del voltaje y modulación autonómica con isoproterenol (beta-adrenérgico) y carbacol (muscarínico) así como directamente con cAMP. Estos estudios pueden realizarse mediante transfección o infección con adenovirus.

2. Impacto funcional de la sobreexpresión de la isoforma nativa de HCN. El efecto de la sobreexpresión sobre el automatismo de los cultivos neonatales puede determinarse para cada isoforma, así como la susceptibilidad de la frecuencia a la modulación autonómica. Estos estudios pueden realizarse mediante una infección con adenovirus ya que requieren una eficiencia de expresión elevada. El efecto de cada isoforma sobre la frecuencia puede correlacionarse con el nivel de infección (es decir con la multiplicidad de infección (m.o.i.) utilizada) y la correspondiente densidad de corriente medio para esta m.o.i. (como se ha medido en el objetivo o meta 1).

3. Modulación de la subunidad beta de la función y frecuencia del canal marcapasos. Los experimentos de las metas u objetivos 1 y 2 pueden repetirse (utilizando infección por adenovirus) con un rango de m.o.i. de HCN con y sin co-infección con la subunidad beta de HCN MiRP1 (KCNE2). Esto determinará si puede conseguirse el mismo efecto con una carga viral global inferior mediante la utilización de KCNE2 para aumentar la eficiencia de expresión de HCN en la membrana de la célula. Además, se determinará si la infección sólo con KCNE2 da lugar a una regulación positiva suficiente de la proteína HCN endógena para aumentar de forma significativa la corriente marcapasos y la frecuencia espontánea. Si es así, se determinará de nuevo la modulación autonómica de la frecuencia.

4. Optimización de los genes marcapasos. Los genes HCN mutados pueden analizarse en cultivos neonatales ventriculares para identificar aquellos con características mejoradas respecto a la cinética, dependencia del voltaje y sensibilidad autonómica, y se determinará el efecto de estos genes mutados en la frecuencia. Las mutaciones que modifican el voltaje umbral a positivo y aumentan la velocidad de cinética probablemente serán los más
adecuados.

5. Impacto funcional de la expresión génica en miocitos adultos. Los productos génicos de las metas u objetivos 1-4 que parezcan más prometedores en términos de características biofísicas y en su efecto sobre la frecuencia espontánea pueden infectarse en células ventriculares adultas y/o células de Purkinje en cultivo y se determinarán las características biofísicas (que probablemente serán diferentes de las del tipo celular en el que se expresa el gen) y la capacidad de generar una actividad marcapasos.

6. Regulación de la expresión. Aquellos productos génicos (metas u objetivos 1-5) que parezcan más prometedores se analizarán en las Fases 2 y 3 en células madre, y en la Fase 5 in vivo. Al mismo tiempo, estos se transferirán también a nuevos plásmidos bajo el control de un promotor regulable (por ejemplo inducible por ecdisona). Las construcciones regulables se reanalizarán in vitro para evaluar la relación entre niveles de expresión e inducción de automatismo. También se determinará el patrón temporal de la regulación (es decir el tiempo hasta la regulación positiva y negativa de la expresión del canal) (se realizará junto con la Fase 2).

7. Caracterización de la corriente tras la expresión in vivo. Junto con la Fase 5, tras la infección con adenovirus de los productos génicos en corazón de perro y la caracterización con ECG, los animales se sacrificarán, se aislarán las células de la región infectada, y se determinarán las características de la corriente de marcapasos.

8. interacción entre las células madre y los miocitos. Junto con la Fase 2 examinar la densidad necesaria de células madre transfectadas para inducir una frecuencia de marcapasos superior en cultivos de miocitos neonatales.

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Fase 2

Creación de un marcapasos biológico utilizando células madre mesenquimales adultas

El objetivo es optimizar un gen (o genes) marcapasos y un sistema de liberación (células madre) para crear un marcapasos regulable permanente en una región cardiaca determinada:

Las metas u objetivos específicos de la Fase 2 son:

1. Estudiar las propiedades de la membrana de las células madre mesenquimales de adulto.

2. Optimizar un gen o genes marcapasos para su transfección.

3. Transfectar las células madre con el gen marcapasos escogido bajo el control de un promotor constitutivamente activo utilizando un vector de expresión bicistrónico, lo que permite que un gen de interés y la EGFP se traduzcan desde un único RNA (casi un 100% de las células que muestran fluorescencia también expresan el gen de interés). Los vectores que se utilizan son el vector pCMS-EGFP para la expresión de los genes HCN, el pHygEGFP como vector marcador de cotransfección, el vector pEGFP-C1 para la expresión de los genes HCN como proteínas de fusión con EGFP y el vector pEGFP-1 para la monitorización de la transcripción de EGFP desde un promotor específico de músculo.

4. Utilizar los marcadores de selección de antibióticos para seleccionar los clones transfectados de forma estable.

5. Estudiar las propiedades de membrana, y la corriente marcapasos expresada de las células madre transfectadas.

6. Estudiar la supervivencia en la aguja de las células madre transfectadas in vitro, y comparar estos resultados con los estudios de supervivencia post-inyección en perros realizados en la Fase 5.

7. Proporcionar células madre transfectadas en la Fase 3 para los estudios de acoplamiento.

8. Estudiar las propiedades de membrana de las células de corazón adulto (atriales, de Purkinje y ventriculares) en ausencia y en presencia de acoplamiento a las células madre, para determinar si el acoplamiento induce el ritmo.

9. Junto con la Fase 1, examinar la densidad necesaria de células madre transfectadas para inducir una frecuencia de marcapasos superior en cultivos de miocitos neonatales.

10. Junto con la Fase 5, tras la implantación de una célula madre marcapasos en un corazón de perro, los animales se sacrifican a diferentes intervalos de tiempo tras la implantación. Las células de la Fase 2 pueden disociarse y estudiar sus propiedades de membrana, y también utilizar marcadores bioquímicos para investigar su nivel de diferenciación en tipos de célula cardiaca.

11. Transfectar células madre utilizando un promotor regulable (por ejemplo el sistema de la ecdisona)

12. Seleccionar las transfecciones estables mediante la resistencia a antibióticos.

13. Analizar la relación dosis-respuesta entre el inductor y el nivel de corriente marcapasos expresada. También, determinar el periodo de tiempo de espera entre la exposición al inductor y la expresión del gen marcapasos, y determinar el periodo de tiempo de espera entre la finalización de la exposición al inductor y la disminución de la expresión del gen marcapasos.

14. Proporcionar la construcción para su utilización en las Fases 1 y 5 para realizar estudios similares como en las metas u objetivos 9 y 10.

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Fase 3

Integración de los miocitos y las células madre

Para crear un marcapasos biológico a partir de células madre o reparar un miocardio dañado con una línea celular cardiogénica derivada de una célula madre, las nuevas células deben integrarse en el sincitio cardiaco. Este proceso utiliza la formación de uniones comunicantes y la capacidad de pasar de célula a célula 1) iones para iniciar y propagar potenciales de acción y 2) mensajeros secundarios relevantes para sostener la función fisiológica normal. Las uniones comunicantes cardiacas están compuestas de determinada combinación de tres subunidades proteicas: conexina 43 (Cx43) y/o Cx40, y/o Cx45. Los objetivos principales de esta fase son determinar los tipos de conexinas que se expresan y son funcionales en las células madre transfectadas con los genes marcapasos para el marcapasos biológico, y las líneas celulares cardiogénicas derivadas de células madre que se utilizarán para la reparación cardiaca. También puede determinarse la capacidad de estos tipos celulares de formar uniones comunicantes con miocitos cardiacos adultos normales nodales, atriales, de Purkinje y de miocardio ventricular. En caso de ser necesario o deseable, puede investigarse la transfección de una preparación con genes conexina relevantes. Ya que tanto la permeabilidad iónica (analizada midiendo la conductancia de las uniones comunicantes) como la permeabilidad a mensajeros secundarios fisiológicos (analizada mediante permeación de colorantes fluorescentes de mayor peso molecular) son importantes, se realizarán ambas medidas en nuestro protocolo experimental.

Las metas u objetivos específicos de la Fase 3 son:

1. Determinar la extensión del acoplamiento de las células madre a las células (HeLa) transfectadas con conexinas cardiacas (40, 43 y 45) (véase la Figura 4A-B).

2. Determinar la capacidad de las células madre de acoplarse a los miocitos cardiacos adultos de regiones nodales, el atrio, fibras de Purkinje y del miocardio ventricular.

3. Utilizar la inmunolocalización para determinar la distribución y locación de Cx43, Cx40 y Cx45 en cultivos confluentes de células madre y cocultivos con cardiomiocitos.

4. Para las células madre transfectadas con genes marcapasos se repiten las metas u objetivos 1-3.

5. Tras la implantación de las células madre transfectadas en el miocardio en los periodos de tiempo fijados tras la iniciación de un marcapasos biológico los animales se sacrificarán. En estos animales, se puede determinar 1) cuales conexinas se expresan en las células madre mesenquimales y 2) el acoplamiento funcional en pares de células aisladas del célula madre a célula madre, y de célula madre a miocito cardiaco.

6. Determinar la extensión del acoplamiento entre la(s) línea(s) celular(es) cardiogénica(s) a las células (HeLa) en cultivo que expresan las conexinas cardiacas (40,43,45).

7. Determinar la capacidad de la(s) línea(s) celular(es) cardiogénica(s) de acoplarse a miocitos cardiacos adultos de las mismas regiones utilizadas en el objetivo 2.

8. Tras la implantación de las células de la(s) línea(s) celular(es) cardiogénica(s) en perros para la reparación cardiaca, se sacrificarán los animales en los periodos de tiempo fijados. A partir de estos animales puede determinarse 1) la expresión de las conexinas en la línea celular de reparadora y 2) el acoplamiento funcional de los pares de líneas celulares cardiogénicas, o pares entre células cardiacas adultas y células de la línea celular cardiogénica.

9. Expresar las conexinas en células madre, células madre transfectadas con genes marcapaso, o línea(s) celular(es)
cardiogénica(s) derivada(s) de células madre según sea necesario o deseable. Puede determinarse si aparece un acoplamiento funcional mejorado.

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Fase 4

Optimización de las células madre para la reparación cardiaca

Los objetivos de la Fase 4 son (1) hacer crecer células madre para su transformación en una línea celular cardiaca, (2) seleccionar el(los) linaje(s) de células cardiacas, (3) para luego inducir la diferenciación en las células de tipo cardiaco en tipos celulares ventriculares o nodales, y (4) transfectar cada uno de los tipos celulares individuales con los genes apropiados para optimizar su funcionamiento y supervivencia en cardiacas regiones particulares.

Las metas u objetivo específicos de la Fase 4 son:

1. Transfectar células madre con un promotor específico de músculo o músculo cardiaco y la proteína verde fluorescente para ayudar en la selección de células que generan un linaje cardiaco.

2. Seleccionar las transfecciones estables.

3. Analizar las aproximaciones disponibles para la inducción de diferenciación cardiaca (lo que incluye los cuerpos embrioides o la exposición a 5-azacitidina).

4. Seleccionar las células que se han diferenciado en una línea celular cardiogénica.

5. Realizar una fijación de membrana (o "patch clamp") de las células en busca de un potencial de acción de tipo cardiaco y la relación cardiaca I-V, y corrientes de membrana cardiaca específicas.

6. Estudiar los marcadores bioquímicos de la diferenciación cardiaca.

7. Investigar si los factores tróficos o el cocultivo pueden inducir una mayor diferenciación específicamente al tipo nodal, músculo atrial, endocardio ventricular o epicardio. De nuevo, analizar mediante fijación de membrana en busca de potencial de acción de membrana patrón o corrientes de membrana.

8. Proporcionar células para la Fase 3 para los análisis de acoplamiento a miocitos adultos de la región cardiaca deseada.

9. Analizar la supervivencia en la aguja de cada tipo celular.

10. Proporcionar células para la Fase 5 para los análisis de eficacia en un modelo cardiaco de perro de fallo cardiaco. Pueden recuperarse células tras el periodo de tiempo experimental in vivo para estudiar sus propiedades.

11. Añadir nuevos genes para optimizar la supervivencia de las células, lo que incluye un aumento de un rectificador o gen interno para inducir una mayor angiogénesis (como VEGF u otros factores de crecimiento).

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Fase 5

Expresión de la función marcapasos en un animal intacto y en tejidos aislados

Los objetivos generales de la Fase 5 son: (1) determinar la extensión con la que las construcciones marcapasos específicas se expresan in vivo mediante las aproximaciones de la terapia génica y con la que la implantación de células madre puede afectar a la frecuencia cardiaca y ritmo, y (2) determinar la extensión con la que las líneas celulares obtenidas pueden ser efectivas en la reparación del miocardio y el reemplazo nodal AV.

Cuando la célula donante se proporciona con un gen o compuesto de liberación, será necesario liberar las células donante y liberar las obtenidas en la diana biológica. Si es posible una inyección directa en la diana, se utilizará este método. Alternativamente, si la diana está irrigada por una arteria específica, entonces pueden liberarse las células donantes obtenidas en dicha arteria y en el torrente sanguíneo para su llegada a la diana biológica.

Las hipótesis generales son (1) que los canales marcapasos expresados o implantados en regiones específicas del corazón desarrollarán ritmos regulares, de respuesta autónoma que dan lugar al efecto de fijación o "clamping" de IK1 en fibras conductoras especializadas, en el atrio, y posiblemente en el ventrículo, y (2) que las líneas celulares obtenidas pueden reemplazar al miocardio no funcional o el nodo AV.

Existen tres metas u objetivos:

1. Investigar la función de las construcciones específicas de las subunidades HCN \alpha y \beta como marcapasos funcionales en el corazón in situ y en tejidos aislados, incluyendo el análisis de las siguientes subhipótesis:

a:

La inyección de construcciones adenovirales portadoras de HCN_{2} o HCN_{4} en el miocardio ventricular canino in vivo puede provocar una corriente de marcapasos con las características de I_{f}. Aunque existe una prueba conceptual de que funcionará, esta intervención no conduce al ventrículo debido a la gran I_{K1} y los potenciales de membrana altamente negativos en los que el HCN_{2} expresado se active de forma probable.

b:

La inyección de construcciones adenovirales portadoras de HCN_{2} o HCN_{4} en las ramas caninas o el atrio in vivo provocará una corriente de marcapasos de respuesta autónoma con las características de I_{f}, y -a la luz de la inferior I_{K1} presente y la activación más positiva de HCN expresado- capaz de dirigir el corazón.

c:

La inyección de una construcción adenoviral portadora de MiRP1 en los tejidos anteriores en ausencia de isoformas de HCN adicionales puede regular positivamente de forma significativa la I_{f} endógena y posiblemente acelerar la cinética de activación asimismo, ofreciendo así un medio alternativo para alterar la función del marcapasos.

d:

La inyección de una construcción adenoviral de genes mutantes (desarrollados en las Fases 1 y 2) proporcionará un marcapasos funcional alternativo y puede que superior.

2. Investigar la función de las construcciones específicas de las subunidades HCN \alpha y \beta insertadas en las líneas celulares mesenquimales humanas para proporcionar un marcapasos funcional al corazón in situ y en tejidos aislados. Las subhipótesis están modificadas respecto a las anteriores, como sigue:

a:

La inyección de células madre portadoras de HCN_{2} o HCN_{4} en el miocardio ventricular canino in vivo puede provocar una corriente de marcapasos con las características de I_{f} y capaz de dirigir el corazón. La implantación de células madre hacen posible implantar un nodo de dimensión suficiente para superar los efectos de I_{K1}.

b:

La inyección de células madre portadoras de HCN_{2} o HCN_{4} en en las ramas caninas o el atrio in vivo provocará una corriente de marcapasos de respuesta autónoma con las características de I_{f}, y -a la luz de la inferior I_{K1} presente y la activación más positiva de HCN expresado- capaz de dirigir el corazón.

c:

La inyección de células madre portadoras de MiRP1 en ausencia de isoformas de HCN adicionales puede regular positivamente de forma significativa la I_{f} miocárdica endógena y posiblemente acelerar la cinética de activación asimismo, ofreciendo así un medio alternativo para alterar la función del marcapasos.

d:

La inyección de células madre portadoras de construcciones de genes mutantes (desarrollados en las Fases 1 y 2) proporcionará un marcapasos funcional alternativo y puede que superior.

3. Investigar la utilidad de la implantación de líneas celulares cardiacas diseñadas para efectuar una reparación miocárdica. Esto incluye la sustitución del miocardio y del nodo AV. Las subhipótesis son:

a:

En corazones caninos en los que el infarto de miocardio ha inducido solamente aneurisma ventricular y in corazones con fallo congestivo, las líneas celulares diseñadas en la Fase 4 crecerán en el miocardio proporcionando un sustrato que es funcional tal como se ha estudiado hemodinámicamente y por medio de imágenes, mientras que no genera arritmias. El resultado mejorará la función cardiaca y el bombeo.

b:

En corazones caninos en los que se ha inducido el bloqueo AV mediante inyección con formalina o ablación de RF, las líneas celulares diseñadas en la Fase 4 proporcionarán tramos de derivación que poseen la misma función que el nodo AV en el corazón in situ y en tejidos aislados.

Aislamiento de células madre y cultivos celulares

Se pueden aislar y hacer crecer células madre mesenquimales (humanas o caninas) a partir de aspirados de médula ósea humanos/caninos.

Por ejemplo, se recogió 10 ml de aspirado de médula en una jeringa con 6000 unidades de heparina para prevenir la coagulación, se lavó dos veces en solución de tampón fosfato (PBS), se añadió a 20 ml de medio control (DMEM que contiene FBS al 10%), y después se centrifugó hasta obtener un botón de células y se eliminó la grasa. El botón celular se resuspendió en medio control y se fraccionó a 1100g durante 30 min en un gradiente de densidad generado mediante centrifugación de una solución de percoll al 70% a 13000 g durante 20 minutos. La fracción de baja densidad enriquecida con células madre mesenquimales, se recogió, se enjuagó con medio control y se plaqueó a una densidad de 10^{7} células nucleadas por placa de 60 mm^{2}. Las células madre mesenquimales se cultivaron en medio control a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene CO_{2} al 5%.

1) Aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales

Se puede aislar hMSC y cMSC de donantes. Las ventajas de utilizar células madre mesenquimales son que no necesitan un endodermo para su diferenciación, son fáciles de cultivar, no requieren un suplemento de citoquinas caro y presentan una mínima inmunogenicidad. También se puede analizar la pureza de las células diana mediante citometría de flujo y la capacidad de diferenciarse hMSC/cMSC en linajes osteogénicos, condrogénicos, adipogénicos y cardiogénicos.

Por ejemplo, se trasplantaron hMSC en un feto de oveja en estadio temprano de gestación, antes y después del desarrollo esperado de competencia inmunológica. Las hMSC se injertaron y persistieron en múltiples tejidos durante al menos 13 meses tras el trasplante. Las células humanas trasplantadas sufrieron una diferenciación especifica de sitio en condrocitos, adipocitos; miocitos y cardiomiocitos, células estromales de médula ósea y estroma tímico. De forma inesperada, se lograron injertos a largo plazo incluso cuando las células se trasplantaron después del desarrollo esperado de inmunocompetencia. Una posible razón puede ser debido a que las hMSC expresan el antígeno leucocitario humano de clase I pero no el de clase II, que puede limitar el reconocimiento inmunitario.

En el músculo cardiaco, se combinó la tinción de b-2 microglobulina (humana) o hibridación in situ para las secuencias ALU humanas con doble tinción con anticuerpos frente a ATPasa-2 de retículo endoplasmático liso (SERCA- 2), una proteína citoplasmática específica para el músculo liso o esquelético.

Los cardiomiocitos también se han generado a partir de células estromales de médula murina. Las células estromales de médula ósea murina se trataron con 5-azacitidina 3 \muM. Tras 1 semana, algunas células aumentaron gradualmente de tamaño para tomar un aspecto similar a una pelota o de un bastón. Tras 2 semanas, las células comenzaron a latir de forma espontánea y las células conforma similar a una pelota o bastón se conectaron con células contiguas para formar estructuras similares a miotubos. Tras 3 semanas, la mayoría de células latentes de forma simultánea se conectaron y formaron estructuras similares a miotubos y se formó una línea celular cardiomiogénica.

Adicionalmente, las hMSC pueden inducirse para diferenciarse in vitro exclusivamente en un linaje osteogénico con dexametasona, b-glicerol fosfato, ascorbato y FBS al 10%. Puede inducirse un linaje condrogénico exclusivamente sin suero, pero con factor de crecimiento transformante b3 (en una micromasa centrifugada) y hMSC. Finalmente, puede inducirse un linaje adipogénico exclusivamente con 1-metil 1-3-isobutilxantina, dexametasona, insulina, yodometacina y hMSC.

Demostración in vivo de la formación de músculo cardíaco a partir de células de la médula ósea circulantes

Ratones hembra normales y distróficos (mdx) recibieron un trasplante de médula ósea (TMO) de donantes macho normales. Tras 70 días, se analizaron secciones histológicas de las regiones atrial y ventricular de ratones TMO para buscar cromosomas Y derivados de donantes. Se encontraron cardiomiocitos únicos en ratones TMO-mdx que contenían cromosomas Y derivados de médula ósea.

2) Cultivo Tisular/ Celular

Se puede preparar medio para hMSC/ cMSC y otros tipos de células que se van a utilizar a lo largo del proyecto con almacenamiento de células, crecimiento y mantenimiento de células en cultivo.

3) Morfometría

Se puede utilizar microscopio óptico, fluorescente, y confocal para monitorizar los tipos de células y líneas celulares cardiogénicas. El núcleo puede también soportar todos los estudios histoquímicos y de inmunolocalización.

4) Extracción de RNA y análisis RT-PCR.

Se puede monitorizar los niveles de expresión de todos los genes transfectados en células madre o líneas celulares cardiogénicas.

Terapia de trasplante para fallo cardíaco a partir de hMSC

La terapia de trasplante es también posible mediante el uso de hMSC. Tras la diferenciación de hMSC en miocitos cardíacos, se seleccionan cultivos puros mediante supervivencia celular o selección de células (por ejemplo, promotor específico de músculo o corazón que dirige un gen de resistencia a antibióticos o GFP). Entonces, se analiza in vitro el acoplamiento eléctrico de los miocitos diferenciados en miocitos adultos y también para las propiedades bioquímicas, inmunohistológicas y electrofisiológicas. Tras completar estos análisis, se puede utilizar un modelo canino para evaluar la integración de los miocitos diferenciados en el tejido huésped y mejorar el rendimiento contráctil. El modelo canino también se utiliza para examinar la ausencia de formación de tumores o transmisión de agentes infecciosos. Entonces, se analizan los métodos para prevenir el rechazo. Debe notarse, que si el receptor y el donante es el mismo, no existe peligro de rechazo. Finalmente, se inician los ensayos en humanos.

Sistema de liberación intercelular para moléculas pequeñas

La liberación de solutos específicos en el compartimento intracelular de sincitios funcionales puede lograrse sembrando tejidos diana (células) con células madre que han sido precargadas con un soluto específico. Alternativamente, puede introducirse un gen que produce un pequeño soluto en las células madre tal como se ha descrito previamente. La transferencia de soluto desde las células madre a las células diana es mediante difusión a través de uniones comunicantes. El sistema es capaz de liberar segundos mensajeros hidrofílicos, fármacos y sus metabolitos, e iones inorgánicos.

A) Carga de células madre:

La carga de solutos específicos en células madre puede lograrse mediante electroporación o mediante perfusión de células madre con medio que contiene formas de éster permeables a la membrana. La Figura 1a es una fotografía al microscopio óptico de células madre mientras que la Figura 1b es una fotografía de las mismas células con microscopio de fluorescencia que muestra la presencia de Amarillo Lucifer (LY). El colorante se cargó mediante electroporación.

B) Transferencia de soluto cargado desde células madre a células diana: Demostración utilizando células en cultivo. La Figura 2 muestra la transferencia de colorante desde una célula madre a una célula HeLa. El LY se liberó a la célula HeLa, presumiblemente mediante difusión a través de uniones comunicantes.

Parámetros relevantes para la transferencia:

1) Las células madre forman uniones comunicantes con otras células b que contienen una o más de las siguientes conexinas: Cx43, Cx45, Cx40, Cx32 y Cx26.

2) Los solutos cargados negativamente con diámetros inferiores a \sim1,0 nm son todos capaces de traspasar los anteriores canales de las uniones comunicantes (homotípico Cx43, Cx40, Cx45, heterotípico Cx43-Cx40 y mezclado o heteromérico Cx43-Cx40)(63,64) y Cx32 y Cx26 (65).

La proporción de selectividad para el Amarillo Lucifer en relación al K+ es de 0,025 para Cx43 y 0,0028 para Cx40. El tipo de uniones comunicantes y el número total de canales determinan la proporción de tránsito de un soluto específico entre una célula madre y una célula diana.

El alcance de la invención está determinado por medio de las reivindicaciones anexadas.

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Claims (23)

1. Una composición que comprende una célula madre mesenquimal en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica un canal de HCN en una cantidad suficiente para crear un canal iónico en la célula madre mesen-
quimal.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 para liberar en una célula de corazón de mamífero una célula que expresa al menos un canal iónico de marcapasos, en el que al menos un canal iónico de marcapasos es un canal de HCN.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que el ácido nucleico introducido también codifica un canal MiRP1.

4. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que el canal de HCN es HCN1.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el canal de HCN es HCN2.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el canal de HCN es HCN4.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el canal de HCN es a un canal de HCN mutado.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el canal de HCN mutado es E324A-HCN2.

9. La composición de la reivindicación 7, en la que el canal de HCN mutado es Y331A-HCN2.

10. La composición de la reivindicación 7, en la que el canal de HCN mutado es Y331A, E324A-HCN2.

11. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para su uso como medicamento.

12. El uso de una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la preparación de un medicamento para utilizar en el tratamiento de un trastorno cardíaco.

13. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para el tratamiento de un trastorno cardíaco.

14. El uso de la reivindicación 12 o la composición de la reivindicación 13 en la que el medicamento o composición es para la introducción en un corazón de mamífero.

15. El uso o composición de la reivindicación 14 en el que tras la administración a un corazón de mamífero, las células madre mesenquimales forman una o más uniones comunicantes con una o más células del corazón de mamífero.

16. El uso o composición de la reivindicación 14 o 15 en la que el medicamento o composición es para la introducción en el corazón en una cantidad suficiente para inducir o aumentar una corriente de marcapasos en el corazón.

17. El uso o composición de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en la que el medicamento o composición es para aumentar la frecuencia cardiaca en un sujeto.

18. El uso o composición de la reivindicación 17 en la que el medicamento o composición es para la administración por contacto con una célula del corazón de un sujeto en una cantidad suficiente para disminuir la constante de tiempo de activación de la célula del corazón, aumentando así la frecuencia cardiaca en un sujeto.

19. El uso o composición de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en la que el medicamento o composición es para uno o más de las siguientes: inducir una corriente de marcapasos en una célula del corazón; provocar una contracción de una célula del corazón; acortar el tiempo necesario para activar una célula del corazón; y cambiar el potencial de membrana de una célula del corazón.

20. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en el ritmo cardiaco en un mamífero, en el que el trastorno es al menos uno de bloqueo de la conducción, bloqueo atrioventricular completo, bloqueo atrioventricular incompleto y disfunción del nodo sinusal, en el que el medicamento se introduce en el corazón de los mamíferos en una cantidad suficiente para aumentar la corriente de marcapasos en el corazón.

21. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el tratamiento de un trastorno en el ritmo cardiaco en un mamífero, en el que el trastorno es al menos uno de bloqueo de la conducción, bloqueo atrioventricular completo, bloqueo atrioventricular incompleto y disfunción del nodo sinusal, en el que el medicamento se introduce en el corazón de los mamíferos en una cantidad suficiente para aumentar la corriente de marcapasos en el corazón.

22. El uso de la reivindicación 20 o la composición de la reivindicación 21 en la que el medicamento es para la administración sistémica o inyección.

23. El uso de la reivindicación 20 o la composición de la reivindicación 21 en la que el medicamento o composición es para introducir en células del corazón mediante la aplicación tópica a las células del corazón, inyección, o cateterización.