ES2329636A1 - Uso del factor pedf para inducir la auto-renovacion de celulas madre. - Google Patents
Uso del factor pedf para inducir la auto-renovacion de celulas madre. Download PDFInfo
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Abstract
Uso del factor PEDF para inducir la auto-renovación de células madre. La presente invención se refiere al uso especifico de la molécula PEDF (Factor Derivado del Epitelio Pigmentado) en la inducción y/o potenciación de la auto-renovación de células madre en cultivo. La presente invención también se refiere al uso de esta molécula para la activación de células madre en distintos tejidos mediante la administración exógena de PEDF a dichos tejidos. Se contempla además el uso del PEDF para fabricar composiciones farmacéuticas para auto-renovación celular que al menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Description
Uso del factor PEDF para inducir la
auto-renovación de células madre.
Esta invención está dentro del campo de la
Bioquímica y la Biología Celular. En particular, la invención se
refiere al uso específico de la molécula PEDF (Factor Derivado del
Epitelio Pigmentado) en la inducción y/o potenciación de la
auto-renovación de células madre en cultivo. La
presente invención también se refiere al uso de esta molécula para
la activación de células madre en distintos tejidos mediante la
administración exógena de PEDF a dichos tejidos. Se contempla
además el uso de composiciones farmacéuticas para
auto-renovación celular caracterizadas por contener
al menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de factor PEDF y al
menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
El factor PEDF (Factor Derivado del Epitelio
Pigmentado) es un miembro de la superfamilia de las serpinas
(inhibidores de la proteasa de serina), aunque carece de la
actividad inhibidora de proteasas. El PEDF humano consta de 418
aminoácidos, un péptido señal para secreción y está
N-glicosilado en Asn285. El producto secretado tiene
un peso molecular aparente de 50 kDa. Se han descrito en la
molécula PEDF dos regiones:
- 1)
- Asp44-Asn77 (34 aminoácidos), con actividad anti-angiogénica,
- 2)
- VaI78-Thrl21 (44 aminoácidos), con actividad neurotrófica.
El factor PEDF es una proteína multifuncional y
anteriormente en el estado de la técnica se ha demostrado su
eficacia como:
- a)
- Estimulador de diferenciación neuronal, en células de neuroblastoma.
- b)
- Factor que produce disminución de fenotipo maligno, en células tumorales de próstata.
- a)
- Estimulador de crecimiento neurítico, en neuronas motoras.
- b)
- Neuroprotector frente a estímulos que inducen muerte neuronal apoptótica, en neuronas de la retina, granulares del cerebelo, hipocampales, y neuronas motoras.
- c)
- Factor bloqueante de proliferación, en células de microglía.
- d)
- Factor inductor de apoptosis, en células tumorales.
- e)
- Factor inductor de apoptosis, en células endoteliales.
- f)
- Factor bloqueante de migración celular, en células endoteliales.
- g)
- Factor anti-angiogénico y anti-vasculogénico, en células endoteliales.
Por lo tanto, en relación con el uso del factor
PEDF, anteriormente en el estado de la técnica se ha propuesto como
un factor potencialmente útil en el desarrollo, mantenimiento, y
función de la retina y para el tratamiento de degeneración
retiniana, especialmente de la mácula, inducida por luz, edad,
diabetes, glaucoma o enfermedades genéticas como la retinitis
pigmentosa, en las que la neovascularización es un agravante
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Por otro lado, también es conocido que el factor
PEDF es un factor potencialmente útil para la neuroprotección de
neuronas en procesos neurodegenerativos o de daño neuronal
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El factor PEDF también se ha descrito como un
factor anti-tumoral por su efecto diferenciador en
células tumorales y por su efecto de inhibición de la angiogénesis
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También se conoce su función diagnóstica de
ciertas patologías neurodegenerativas, como la esclerosis lateral
amiotrófica, por el aumento de sus niveles en el líquido
cefalorraquídeo, y de prognosis tumoral por su disminución en
tumores [US050222031; Sidle DM, Maddalozzo J, Meier JD, Cornwell
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Sin embargo, el factor PEDF nunca ha sido
descrito en bibliografía anterior como un factor relacionado con el
comportamiento de células madre de ningún tipo y, por tanto, su
utilización como inductor de la auto-renovación de
células madre es un aspecto novedoso y por tanto, objeto de la
presente invención. Es necesario puntualizar que, el efecto que en
la presente invención se reivindica del factor PEDF como factor
inductor de la auto-renovación de células madre, no
guarda ninguna relación con los efectos previamente descritos en el
estado de técnica para el PEDF en otros tipos celulares, como son la
diferenciación celular, la supervivencia celular o la apoptosis.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un uso nuevo o
aplicación del factor PEDF como un factor inductor de la
auto-renovación de células madre.
La presente invención ofrece un método de
potenciar la auto-renovación de células madre en
cultivo aplicando exógenamente PEDF. La adición de PEDF a medios
definidos favorece el mantenimiento en el cultivo de las células
madre mediante su acción estimuladora de la división celular de
tipo auto-renovante frente a la división celular
diferenciativa, que conlleva la desaparición de las células madre
del cultivo y su transformación en progenitores comprometidos a
fenotipos celulares específicos. Esto conduce a la expansión de las
células madre acompañada del mantenimiento del potencial de estas
células.
La presente invención incluye el uso de la
molécula "factor derivado de epitelio pigmentario" (PEDF) y/o
cualquier derivado suyo para promover la
auto-renovación en poblaciones de células madre,
somáticas o embrionarias, de cualquier especie. Esta acción consiste
en favorecer la replicación de células madre mediante división
celular renovadora así como de la inducción de la expresión de
moléculas que suelen estar aumentadas en células con fenotipo
indiferenciado y multipotente. La invención incluye el uso de PEDF
en células madre naturales así como en células madre modificadas
genética o epigenéticamente. La invención también proporciona un
método de estimular la activación de células madre somáticas
endógenas, para producción de progenie diferenciada, mediante el uso
de composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad
farmacéuticamente eficaz de factor PEDF.
La expansión homogénea de una población de
células madre en medios definidos ex vivo no es eficiente
porque se observa que la propagación de estas células va acompañada
de su derivación hacia células que tienen capacidad proliferativa
expansiva pero que carecen de las propiedades de
auto-renovación ilimitada y de multipotencia,
propiedades inherentes al concepto de célula madre. El hecho de que
la propagación de células madre cuando están en cultivo
invariablemente se acompañe de diferenciación ha sido interpretado
como una tendencia natural de estas células hacia la división de
tipo diferenciativo en lugar de la división de tipo
auto-renovante. Dado que en los nichos naturales en
los que las células madre específicas de tejido se encuentran,
éstas persisten durante toda la vida del individuo, la progresiva
diferenciación de estas células durante su expansión ex vivo
puede ser un reflejo de que las condiciones del cultivo no
reproducen adecuadamente la situación del microambiente endógeno
natural.
El PEDF, es un factor que se encuentra en nichos
neurogénicos. Es, además, una molécula secretada y soluble, que
puede ser adicionada a medios de cultivo. Por esta razón, el factor
PEDF es capaz de inducir auto-renovación en
poblaciones de células madre obtenidas de cerebros adultos de
ratón, por ejemplo, ya que promueve la división no diferenciativa de
dichas células madre y la expresión de moléculas que se asocian con
el estado más indiferenciado y multipotente de estas células, como
es el factor de transcripción Sox2 y efectores de la vía de
señalización de Notch. Es por ello que, cuando se administra PEDF a
cultivos de neuroesferas, que son los agregados clonales en forma de
esfera formados por la progenie de cada célula madre neural, éste
factor aumenta el número de células capaces de formar nuevas
esferas cuando se resiembran las células tratadas a una densidad de
2,5 células/microlitro (ensayo de auto-renovación).
Además, en las células tratadas con PEDF aumenta la expresión del
factor de transcripción Sox2, relacionado con indiferenciación. Por
tanto, la invención proporciona también un método de ensayo en el
que medir auto-renovación de células madre neurales
con la adición exógena de PEDF y en el que ensayar inhibidores de
este proceso y/o antagonistas del factor PEDF y por tanto, la
presente invención proporciona un uso nuevo del factor PEDF como
producto capaz de estimular la auto-renovación de
células madre permitiendo identificar y/o ensayar diferentes
compuestos inhibidores de la auto-renovación y/o
antagonistas del factor PEDF.
Aparte de poder proporcionar condiciones de
cultivo para la expansión más adecuada de estas células, el factor
PEDF administrado directamente en el cerebro de ratones causa la
activación de las células madre neurales endógenas, activación que
conduce a una mayor actividad neurogénica, de producción de nuevas
neuronas, en la zona subventricular de cerebro adulto. Por ello, el
PEDF puede ser un factor facilitador de procesos de producción de
nuevas células a partir de células madre presentes en los tejidos.
Por tanto, la presente invención se refiere también al uso de la
molécula PEDF en la preparación de composiciones farmacéuticas para
auto-renovación de células madre
endógenas.
endógenas.
En la presente invención, se reivindica el uso
del factor PEDF para inducir la auto-renovación de
células madre de cualquier tipo, sin especificar el origen del
factor PEDF, ya que éste podría generarse a partir de cualquier
procedimiento de síntesis u obtención o bien utilizarse factor PEDF
natural. Es decir, en la presente invención se reivindica el uso del
factor PEDF, ya sea natural o sintético, como inductor de la
auto-renovación de células madre.
Según un primer aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF en su versión completa
o fragmentado en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre de cualquier
origen.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF en la preparación de
una composición que induce la auto-renovación de
células madre que está combinado de forma adicional con moléculas
seleccionadas del grupo formado por aminoácidos, lípidos, hidratos
de carbono y metales.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF en la preparación de
una composición que induce la auto-renovación de
células madre en sistemas de expresión procariotas o eucariotas y
que induce la auto-renovación de células madre
somáticas.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF en la preparación de
una composición que induce la auto-renovación de
células madre endógenas o exógenas.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF en la preparación de
una composición que induce la auto-renovación de
células madre en el que la composición está en una forma
seleccionada de polvo, gránulos, comprimidos, cápsulas, trociscos,
solución, suspensión, emulsión y jarabe.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF para la fabricación de
un medicamento para activar procesos seleccionados del grupo formado
por procesos de regeneración tisular de la piel, procesos de
cicatrización, procesos de regeneración neural en casos de
accidente cerebrovascular.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del factor PEDF para la fabricación de
un medicamento para terapia celular, preferentemente para
regeneración cardiaca, neural y/o hematopoyética.
Según un segundo aspecto importante la presente
invención proporciona una composición farmacéutica para inducir la
auto-renovación de células madre que comprende en un
medio farmacéuticamente aceptable una cantidad farmacéuticamente
eficaz de:
- a)
- la secuencia total o parcial del factor PEDF,
- b)
- una variante biológica natural, como una variante alélica, del factor PEDF,
- c)
- un equivalente funcional del factor PEDF que contenga sustitución(es), adición(es), inserción(es) y/o deleción(es) únicas o múltiples en la secuencia de la proteína tipo salvaje y/o sustituciones de aminoácidos modificados químicamente que no afecten la función biológica autorenovadora de células madre,
- d)
- un fragmento activo del factor PEDF en el que "fragmento activo" designa a un secuencia de PEDF que mantiene la función biológica de auto-renovación de células madre,
- e)
- una proteína fusionada que comprende el factor PEDF fusionado a un péptido o a otra proteína,
- f)
- Un derivado de PEDF,
- g)
- Un análogo estructural de PEDF
- h)
- y/o un homólogo de PEDF.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de la secuencia total o
parcial del factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de una variante
biológica natural de factor PEDF y al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de un equivalente
funcional de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de un fragmento activo
de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de una proteína
fusionada de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de un derivado de
factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un análogo
estructural de factor PEDF y al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al
menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un homólogo
de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica en la que la
cantidad de factor PEDF es de al menos 20 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan aquí sirven para ilustrar la naturaleza de la presente
invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines
ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la
invención que aquí se reivindica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las formas de PEDF que se han utilizado para las
realizaciones son las que se muestran en la Figura 1. En esta
figura se muestra el esquema del polipéptido PEDF humano y una
forma truncada que contiene el dominio
anti-angiogénico pero no el neurotrófico y que
comprende desde el aminoácido 195 al 400 (que denominamos
C-ter PEDF). El PEDF completo (aquí denominado
PEDF) modula la auto-renovación de células madre
pero el fragmento C-ter PEDF no lo hace por lo que
se ha utilizado como control negativo en los experimentos. También,
y como se verá más adelante, el C-ter PEDF se ha
utilizado como competidor del PEDF completo.
Hemos demostrado mediante este ensayo de
realización que la proteína PEDF promueve la
auto-renovación de células madre neurales de la zona
subventricular del cerebro de ratones adultos in vitro.
Cuando se administra PEDF a cultivos de neuroesferas, que son los
agregados clonales en forma de esfera formados por la progenie de
cada célula madre neural, éste factor aumenta el número de células
capaces de formar nuevas esferas/clones cuando se resiembran las
células tratadas a una densidad de 2,5 células/microlitro (ensayo
de auto-renovación) (ver Figura 2). En la Figura 2
se muestra como la administración de PEDF a un cultivo de células
madre neurales de la zona subventricular conlleva la formación de
más clones (neuroesferas) en presencia solamente de medio de
crecimiento habitual para estas células (medio completo). Sin
embargo, la adición de PEDF no aumenta el tamaño de cada clon (ver
diámetros medios de las esferas), ni la incorporación del marcador
de proliferación bromo-desoxiuridina (BrdU) (ver
porcentajes de incorporación), indicando por tanto que no es un
mitógeno. En la figura 2: Eje de las Y corresponde con neuroesferas,
A corresponde a Control, B corresponde a PEDF, C corresponde a
C-ter PEDF, 1 corresponde a Fase, 2 corresponde a
BdrU.
Para realizar los cultivos de células madre
neurales adultas (NSC) se sacrificaron por dislocación cervical
animales de 2 a 4 meses de edad, se extrajeron los cerebros y se
pusieron en PBS estéril y frío. Se realizaron los cortes coronales
necesarios para la disección de la zona subventricular (SVZ)
excluyendo restos de estriado y plexos coroideos. Las piezas de
tejido diseccionadas se incubaron en la solución enzimática durante
30 minutos a 37ºC y se disgregaron cuidadosamente con una pipeta de
vidrio pulida. Una vez conseguida una suspensión celular homogénea
se sembraron en medio completo (medio de cultivo definido con 20
ng/mL EGF y 20 ng/mL FGFb) [Medio control: DMEM/F12
suplementado con 0,6% de Glucosa, 0,1% de NaHCO_{3}, 5 mM de
HEPES, 2 mM de L-glutamina (Invitrogen), 50
unidades/ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen), 0,08 mg/ml
de apo-t-transferrina (Sigma), 0,02
mg/ml de insulina (Sigma), 9 \mug/ml de Putrescina (Sigma), 16
nM de progesterona (Sigma) y 24 nM de Na_{2}SeO_{3} (Sigma).
Medio completo: medio control suplementado con 4 mg/ml de
BSA (Albúmina de suero bovino, Sigma), 0,7 unidades/ml de heparina
(Sigma), 20 ng/ml de EGF (factor de crecimiento epidérmico;
Invitrogen), y 10 ng/ml de FGF2 (factor de crecimiento
fibroblástico, Sigma)] y se crecieron a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} del 5%, hasta que el tamaño de las neuroesferas fue
adecuado, aproximadamente tras 6 días in vitro (DIV), momento
en el cual se las disocia y resiembra (pase) como células
individuales en el mismo medio completo para iniciar el crecimiento
de nuevos clones/neuroesferas. Los cultivos realizados de esta forma
pueden expandirse realizando sucesivos pases durante un tiempo
prácticamente ilimitado. Para el análisis del ensayo de
auto-renovación las células procedentes de
neuroesfera se pasan y la siembra se realiza a una densidad de 2,5
células/microlitro. En algunos de estos cultivos a baja densidad
(dilución límite) se añadió PEDF o C-ter PEDF a una
concentración de 20 ng/mL. Tras 4-6 DIV se
determina el número de esferas formadas en cada condición y se
miden los diámetros de las esferas. Para los ensayos de
incorporación de
bromo-desoxi-uridina (BrdU), las
esferas formadas tras 48 hr se trataron 5 min con Brdu (2 \muM),
se engancharon sobre cubreobjetos tratados con
poly-D-lisine (10 \mug/ml; Sigma)
y se fijaron con paraformaldehido (PFA) al 4% durante 20 min. Tras
varios lavados en PB 0.1 M, se procedió a la detección
immunocitoquímica de la BrdU incorporada mediante anticuerpos
específicos.
Las esferas tratadas con PEDF contienen un mayor
número de células capaces de dar lugar a más neuroesferas/clones a
baja densidad, una propiedad asociada con las células madre
neurales con más potencial (Figura 3). Como se observa en la Figura
3 se muestra un ensayo por el cual clones/esferas que han sido
tratados con PEDF (forma truncada de PEDF,C-ter
PEDF, es, de nuevo, el control sin efecto) cuando son disociados y
re-sembrados en ausencia de PEDF, en distintas
combinaciones mitogénicas. En esta figura A está definido por el
control, B está definido por el ensayo con pretratamiento con PEDF y
C está definido por el ensayo con el tratamiento con
C-ter PEDF. La formación de un mayor número de
nuevos clones (capacidad formadora de esferas incrementada) indica
que el tratamiento con PEDF indujo la división
auto-renovante de las células madre cuando estaba
presente. Esto indica que el PEDF en la esfera promueve la
generación de nuevas células formadoras de clones mediante división
auto-renovante. En la figura 3, 1 corresponde a EGF
+ FGF, 2 corresponde a EGF, 3 corresponde a FGF, Eje de las X
corresponde a condiciones de mitogénesis.
Para determinar que el aumento en la capacidad
formadora de nuevas esferas (esferas secundarias) se relaciona con
la presencia de más células madre multipotenciales en los cultivos
con PEDF también se ha determinado que en dichos cultivos existen
más células que expresan un antígeno de superficie (LeX) que ha
sido asociado a la fracción más multipotente de las células madre
neurales (ver Figura 4 en la que A está definido por el control, B
está definido por el ensayo con pretratamiento con PEDF y C está
definido por el ensayo con el tratamiento con C-ter
PEDF). En esta Figura 4 se muestra como el tratamiento con PEDF
aumenta el número de células en las neuroesferas que expresan un
antígeno de superficie (LeX) que co-segrega con la
población más multipotente de las células madre neurales. Para
realizar esta determinación se recogieron por centrifugación las
neuroesferas tras 6 DIV, y se disgregaron mecánicamente hasta tener
una suspensión celular homogénea. A continuación se resuspendieron
en medio control (sin mitógenos) conteniendo una dilución 1:20 de
anticuerpo monoclonal
anti-LeX/SSEA-1 procedente del
Developmental Studies Hybridoma Bank (University of lowa, USA)
durante 15 min a 37ºC. Posteriormente, las células fueron fijadas
con 4% PFA durante 10 min a 4ºC, lavadas, e incubadas con
anti-IgM de ratón biotiniladas (1:200) seguido de
estreptoavidina marcada con Cy3 (1:1000; Jackson Laboratories). Se
analizaron por citometría al menos 20.000 células por cultivo y se
determinó el porcentaje de células inmunopositivas para LeX. Los
análisis se hicieron con un analizador BECKMAN COULTER EPICS dotado
con un láser de argón a 488nm como fuente de luz. En la figura 4,
Eje de las Y corresponde a % de LeX+células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El aumento del número de células formadoras de
nuevos clones promovido por PEDF va acompañado de cambios
moleculares en los niveles de factores que han sido asociados en
las células madre neurales, así como en otras poblaciones celulares,
a un estado más indiferenciado, propiedad necesaria para el
mantenimiento de la multipotencia. Algunas de estas moléculas se
han visto afectadas por el tratamiento con PEDF. Así, por ejemplo,
el tratamiento con PEDF induce la expresión de moléculas efectoras
de la vía de Notch, que cuando se encuentran aumentadas inhiben a
factores que promueven la diferenciación celular, en este caso la
diferenciación hacia neuronas. Estos efectores de la vía de Notch
que encontramos aumentados en los cultivos tratados con PEDF son
Hes1 y Hes5. De la misma manera, se encuentra aumentado un factor
cuya expresión va asociada a los estados más indiferenciados de los
progenitores neurales. Esto se muestra en la figura 5. En la Figura
5 se muestran los cambios en los niveles de marcadores de
indiferenciación inducidos por PEDF. Para estos experimentos se
extrajeron los RNA totales mediante el Kit de extracción Rneasy
Mini Kit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se
recolectaron aproximadamente 1x10^{6} de células crecidas en medio
completo con o sin PEDF y los RNA totales se guardaron a -80ºC
hasta su uso. Los análisis por RT-PCR que se
realizaron para evaluar la expresión de distintos genes se iniciaron
a partir de 1 \mug de RNA que fue retrotranscrito en DNA
complementario (cDNA) usando hexanucleótidos al azar (3
\mug/\muL, Invitrogen Life Technologies, USA) y 200 U de la
transcriptasa reversa SuperScript II RT (Invitrogen Life
Technologies), en un volumen de reacción de 40 \muL y en presencia
de tampón first strand (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl,
3 mM Mg_{2}Cl), 5 mM DTT y 0.25 mM de cada dNTPs (Amersham
Pharmacia). Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador
Eppendorf. Se usó como molde 1 \mul de cDNA en un volumen de
reacción de 20 \mul conteniendo 4 mM Tris-HCl, 20
mM KCl, 20 \muM EDTA, 200 \muM DTT, 0.25 mM dNTP_{s}
(Amersham Pharmacia), 0.25 \muM de los cebadores
(Sigma-Genosys) y 1 U de ADN Taq polimerasa
(Eppendorf, Hamburg, Alemania). Después de una desnaturalización
inicial a 94ºC durante 2 min, se efectuaron los ciclos de
amplificación correspondientes a cada pareja de cebadores y una
extensión final de 10 min a 72ºC. El tamaño de cada producto de
amplificación se resolvió mediante electroforesis en un gel de
agarosa al 2% (p/v) preparado en tampón TBE (89 mM Tris, pH 8.0, 89
mM ácido bórico, 2 mM EDTA) con 10 \mug/ml de bromuro de etidio.
Como tampón de carga 6x, se utilizó 50% de glicerol, 0.05% azul de
bromofenol, 0.05% cianol de xileno, 100 mM EDTA. La cuantificación
se realizó por densitometría comparando la intensidad de cada banda
con la del producto de la amplificación del gen de la
beta-actina. Los cebadores utilizados fueron:
[mHes1 (CGGTCTACACCAGCAACAGT;CACATGGAGTCCGAAGTGAG), mHes5
(GCAGCATA
GAGCAGCTGAAG;GAAGGCTTTGCTGTGTTCA), mSox2 (ATGCACAACTCGGAGATCAG;TATAATCCGGG
TGCTCCTTC), m\beta-actin (CCGGGACCTGACAGACTACCT;GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA). Tal y como se muestra en la figura 5, dado que en las células tratadas con PEDF aumenta la expresión del factor de transcripción Sox2, relacionado con indiferenciación, la invención proporciona también un método de ensayo en el que medir auto-renovación de células madre neurales con la adición exógena de PEDF y en el que ensayar inhibidores de este proceso. En la figura 5, A corresponde a PEDF, 1 corresponde a Hest, 2 corresponde a Hes5, 3 corresponde a Mash1, 4 corresponde a b-actina, 5 corresponde a SoX2, 6 corresponde a b-actina.
GAGCAGCTGAAG;GAAGGCTTTGCTGTGTTCA), mSox2 (ATGCACAACTCGGAGATCAG;TATAATCCGGG
TGCTCCTTC), m\beta-actin (CCGGGACCTGACAGACTACCT;GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA). Tal y como se muestra en la figura 5, dado que en las células tratadas con PEDF aumenta la expresión del factor de transcripción Sox2, relacionado con indiferenciación, la invención proporciona también un método de ensayo en el que medir auto-renovación de células madre neurales con la adición exógena de PEDF y en el que ensayar inhibidores de este proceso. En la figura 5, A corresponde a PEDF, 1 corresponde a Hest, 2 corresponde a Hes5, 3 corresponde a Mash1, 4 corresponde a b-actina, 5 corresponde a SoX2, 6 corresponde a b-actina.
La auto-renovación en células
madre está asociada a moléculas que regulan el ciclo celular
también. En particular la expresión de la molécula p21waf1,
perteneciente a la familia Cip/kip de inhibidores de quinasas
dependiente de ciclinas, es necesaria para la persistencia a largo
plazo de las células madre somáticas y para su
auto-renovación ilimitada. En la figura 6 se
muestra como PEDF aumenta la expresión de p21, determinada mediante
análisis por western blot con anticuerpos específicos
anti-p21. Este aumento en los niveles de p21 es
necesario para el efecto de PEDF ya que en células obtenidas de la
zona subventricular de ratones mutantes nulos para p21, el PEDF no
tiene efecto en el número de neuroesferas, como se muestra en la
figura 6. Los ratones mutantes nulos para la proteína p21
procedieron del laboratorio de Philip Leder (Department of Genetics,
Harvard Medical School, Boston, Massachusetts) y se generaron en
una cepa con fondo genético mixto C57BL61129 y los de fenotipo
salvaje se obtuvieron de los laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME).
La colonia mutante se mantuvo en homocigosis. El genotipo de los
animales se determinó mediante el análisis por PCR del DNA genómico
extraído de una fragmento de cola. Los tejidos se digirieron en
tampón de tisis (100 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 2% SDS, 5 mM
EDTA, 200 \mug/ml proteinasa K) durante 12 hr a 55ºC. Tras la
digestión se centrifugaron los lisados celulares a 14.000 rpm, 10
minutos, y los sobrenadantes se transfirieron a eppendorfs limpios.
A continuación se añadieron 200 \mul de cloroformo (Sigma) y 0,2
volúmenes de acetato potásico (Panreac) 8 M, se agitaron y se
incubaron a -80ºC durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo se dejó
descongelar a temperatura ambiente y se centrifugó a 14.000 rpm
durante 15 min, para facilitar la separación entre las fases acuosa
y orgánica. Se transfirieron 200 pi de la fase acuosa a un
eppendorf limpio y se precipitó el DNA genómico con 1 ml de etanol
absoluto (EtOH 100º). A continuación se centrifugaron las muestras
a 14.000 rpm durante 10 min, y los precipitados de ADN generados se
lavaron con etanol al 70% (EtOH 70º), se dejaron secar y se
resuspendieron en 100 \mul de H_{2}OmQ durante toda la noche a
4ºC. Los cebadores utilizados para las amplificaciones fueron:
p21+116F (AAGCCTTGATTCTGATGTGGGC),
p21-135(TGACGAAGTCAAAGTTCCACCG) y
p21-Neo19+(GCTATCAGGACATAGCGTTGGC) este último
correspondiente a la secuencias neo. Las condiciones de
amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94ºC
durante 50 seg., anillamiento a 55ºC durante 30 seg. y extensión a
72ºC 2 min. Después de una reacción de 40 ciclos el alelo salvaje
corrió mediante electroforesis a 0,7 Kilobase y el alelo mutante a
0,5 kilobases. 6 corresponde a PEDF, 1 corresponde a p21, 2
corresponde a b-actina.
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Ejemplo
3
Que el PEDF promueve indiferenciación se
comprueba en el hecho de que cuando células madre neurales
previamente tratadas con PEDF se ponen a diferenciar sembrándolas
en un sustrato adhesivo en ausencia de mitógenos muestran un
fenotipo más indiferenciado, en el caso de las células madre
neurales aumenta el número de células que expresan el marcador de
indiferenciación nestina durante más tiempo (Figura 7). En la
Figura 7 se muestra como el tratamiento con PEDF aumenta el número
de células que expresan marcadores de indiferenciación (nestina) en
los cultivos sin afectar a su proliferación. Para la inducción de
la diferenciación poblacional se recogieron células crecidas
durante 5 DIV en presencia o ausencia de PEDF en el medio de
crecimiento completo por centrifugación y se lavaron varias veces en
medio control, para eliminar las trazas de mitógenos y de PEDF. A
continuación se realizó la siembra en placas pretratadas durante 2
horas con matrigel (15 mg/mL solución stock diluida 1:100 en medio
control; Becton Dickinson, Bedford, MA), a una densidad de 1x104
células/mL, en un medio de diferenciación que contenía medio
control, suplementado con FGF (20 ng/mL), factor de crecimiento que
favorecía la supervivencia celular en los pasos iniciales de la
diferenciación. A los 2 DIV las células se trataron 5 min con Brdu
(2 \muM) y se fijaron con paraformaldehido (PFA) al 4% durante 20
min. Tras varios lavados en PB 0.1 M, se procedió a la detección
immunocitoquímica de la BrdU incorporada y del marcador de
progenitores neurales nestina mediante anticuerpos específicos. Para
ello, se procedió al bloqueo de uniones inespecíficas con un tampón
bloqueo que contenía 10% suero de cabra (invitrogen), 10% (p/v)
glicina, y 0,25% (v/v) Tritón X-100 como detergente
no iónico para la permeabilización de las células. Las células se
incubaron toda la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal
anti-nestina del DSHB (University of Iowa, USA) y
un anticuerpo policlonal anti-BrdU (Dakko) diluidos
en el mismo tampón de bloqueo. Posteriormente las células se
lavaron 3 veces con PB 0.1 M y se incubaron con los anticuerpos
secundarios fluorescentes: Alexa 350 cabra
anti-conejo (1:200), Cy3 cabra
anti-ratón(1:2000) seguido de una
contratinción nuclear con bisbencimida. En esta figura 7, A se
refiere a expansión y B se refiere a diferenciación. En la figura 7,
7 DIV; EGF; FGF corresponde con 7, 2 DIV; FGF corresponde a 2, 5
DIV corresponde a 5, 1 corresponde a control, 2 corresponde
a
PEDF.
PEDF.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Aun así, el tratamiento con PEDF durante la fase
de expansión no impide la diferenciación terminal de estas células
a neuronas. De hecho, como se muestra en la Figura 8 se potencia la
neurogénesis en los cultivos tratados con PEDF. En la Figura 8 se
muestra como el aumento de marcadores de indiferenciación no impide
la diferenciación terminal de los cultivos, pasado el tiempo
habitual al que se culmina la diferenciación final del cultivo. Más
aun, se observa como el tratamiento previo con PEDF mejora la
capacidad neurogénica, favoreciendo la diferenciación de un número
mayor de neuronas (Tuji-positivas). A los 2 DIV
después de sembrar las NSCs en sustrato adherente como se comenta
en el párrafo anterior se sustituyó el medio por medio control
suplementado con 2% suero bovino fetal (Invitrogen) durante 5 DIV
más, lo que favorece la maduración de las neuronas y de la glía. A
los 7 DIV las células se fijaron con PFA al 4% en PB 0.1M, durante
20 min a temperatura ambiente y se examinaron por immunocitoquímica
para la detección de marcadores específicos de neuronas y células
gliales, determinándose las proporciones de cada fenotipo. La
diferenciación neuronal y glial se definió por un marcaje
immunocitoquímico triple usando un anticuerpo primario
anti-Tuj1 (neuronas), anti-GFAP
(astrocitos) y anti-MBP (oligodendrocitos). Tras la
fijación de las células se realizaron varios lavados en PB 0.1 M y
se procedió al bloqueo de uniones inespecíficas con un tampón
bloqueo que contenía 10% suero de cabra (Invitrogen), 10% (p/v)
glicina, y 0,25% (v/v) Tritón X-100 como detergente
no iónico para la permeabilización de las células. Las células se
incubaron toda la noche a 4ºC con los siguientes anticuerpos
primarios diluidos en el mismo tampón de bloqueo:
anti-\betaIII-Tubulina (Tuj1)
monoclonal de ratón (IgG) (1:300; Covance);
anti-proteína fibrilar acídica glial (GFAP)
policlonal de conejo (IgG) (1:300; Dako);
anti-proteína básica de la mielina (MBP) monoclonal
de rata (IgG) (1:300, Chemicon). Posteriormente las células se
lavaron 3 veces con PB 0.1M y se incubaron con los siguientes
anticuerpos secundarios fluorescentes: Alexa 350 cabra
anti-conejo (1:200), Cy3 cabra
anti-ratón(1:2000), Biotinilado goat
anti-rata (1:300), Cy2 conjugado con
estreptoavidina (1:200) seguido de una tinción nuclear con
bisbencimida (DAPI). Las diferenciaciones poblacionales se
utilizaron para determinar la capacidad neurogénica de los
diferentes cultivos, para lo cual se montaron los cubres de vidrio
sobre un portaobjetos con líquido de montaje permanente protector
de fluorescencia (Fluorsave, Calbiochem, La Jolla, CA) y se
determinó el número de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos
contando el número de neuronas y astrocitos, o de oligodendrocitos
con respecto al total de núcleos teñidos con DAPI en al menos 25
campos aleatorios. La fluorescencia fue visualizada con un
microscopio invertido Nikon diaphon, o vertical (E400) y se
capturaron imágenes con una cámara digital Nikon. En la figura 8, 1
corresponde al control y 2 corresponde a PEDF.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La forma truncada conteniendo la mitad
C-terminal del polipéptido PEDF antagoniza la
acción del PEDF completo en el ensayo de
auto-renovación de células madre constituyéndose en
una herramienta útil para determinar la especificidad de la acción
de la forma completa (Figura 9, en la que la parte de la gráfica
punteada con el símbolo \sqbullet representa la prueba control y
la parte de la gráfica punteada con el símbolo \bullet representa
el ensayo con 0,4 nM de PEDF). Por tanto, la presente invención
también proporciona un método para analizar la especificidad de los
efectos de la molécula PEDF sobre el proceso de
auto-renovación. Para la realización de el ensayo
que se muestra en la figura 8 se sembraron NSCs disociadas en medio
completo con 20 ng/ml PEDF (equivalente a una concentración 0.4 nM)
y en presencia de concentraciones crecientes del fragmento
C-ter PEDF. Al cabo de 4 DIV, el número de
neuroesferas formado en cada condición fue determinado. Como se
muestra en la figura concentraciones crecientes de
C-ter PEDF antagonizan el efecto del PEDF
proporcionando un ensayo de especificidad. El receptor del PEDF es
todavía desconocido pero se ha descrito la interacción del PEDF con
una molécula de membrana de unos 80 kDa. (Alberdi, E., Aymerich,
M.S., Becerra, S.P. (1999) Binding of pigment
epithelium-derived factor (PEDF) to retinoblastoma
cells and cerebellar granule neurons. Evidence for a PEDF receptor.
J. Biol. Chem. 274, 31605-31612). Este tipo
de ensayo sugiere que la forma completa y truncada podrían estar
compitiendo a nivel de su unión al receptor de membrana. En la
figura 9, A corresponde al control y B a 0.4 nM PEDF.
Para determinar si la forma truncada era capaz
de antagonizar el efecto de un PEDF producido por células de
mamífero se realizó un ensayo en el que se transfectaron células
COS, que no poseen niveles significativos de PEDF, con un cDNA que
codifica para PEDF humano. Para ello, se obtuvo el cDNA del Pedf
humano mediante RT-PCR y fue clonado en el vector
pcDNA3.1 (Invitrogen). Las células fueron
co-transfectadas con dicho plásmido y uno
conteniendo una construcción para GFP como marcador de transfección,
mediante Lipofectamine, en DMEM. Tras 8 hr las células fueron
transferidas a DMEM con FBS al 10% durante 12 horas. La expresión y
secreción de Pedf en las células transfectadas con vector vacío o
con pcDNA-hPedf se analizó, respectivamente,
mediante RT-PCR y por inmunoblot de medio
condicionado como se explica en los párrafos siguientes. Las células
trasfectadas fueron cambiadas a medio completo de NSCs, se colocó
se colocó un inserto (transwell de Millipore de 12 mm y 0.4 \mum
diámetro de poro) 2 horas más tarde y en él se sembraron células
madre neurales disociadas a baja densidad. Estos cultivos se
realizaron en presencia o ausencia de C-ter PEDF a
una concentración de 15 nM. A los 4 DIV se contó el número de
neuroesferas formadas en cada cultivo. En el caso de los
co-cultivos de NSCs con células COS transfectadas
con Pedf, se observó un aumento en el número de neuroesferas que
era antagonizado por el fragmento C-ter, tal como se
observa en la figura 10. En la figura 10 se muestra como células
COS transfectadas con una construcción conteniendo la secuencia del
PEDF humano expresan y secretan PEDF. Este PEDF es activo en un
ensayo de auto-renovación en células madre neurales
(panel de la derecha) y el efecto es bloqueable por el fragmento
C-ter. En la figura 10, A está definido por el medio
de crecimiento. En la figura 10, A corresponde a Pedf, B
corresponde a b-actina, C corresponde a PEDF, 1
corresponde a COS7+pcDNA, 2 corresponde a
COS7+pcDNA-Pedf 3 corresponde a A, 4 corresponde a
D+C-ter PEDF, F corresponde a COS7+pcDNA, G
corresponde a COS7+pcDNA-Pedf.
La forma truncada C-ter PEDF
permite, por tanto, identificar la participación del PEDF a partir
de un sistema celular que lo exprese mediante su antagonismo
específico con la forma truncada, como se muestra en el experimento
siguiente en el cual se antagoniza con C-ter PEDF
el efecto sobre auto-renovación que tienen tipos
celulares que, de forma natural, producen y secretan PEDF. Así, por
ejemplo, en la figura 11 se muestran tipos celulares que expresan
PEDF y, de entre ellos, aquellos que secretan cantidades detectables
de proteína PEDF. Estos tipos celulares son productores naturales
del factor, como las células endoteliales o las células
ependimarias. En la figura 11 se muestra como células endoteliales
y ependimarias expresan y secretan PEDF de forma natural y A
corresponde a Pedf, B corresponde a b-actina, C
corresponde a PEDF, D corresponde a b-tubulin, E
corresponde a PEDF, 3 corresponde a ependima, 4 corresponde a
astrositos, 5 corresponde a granule células, F corresponde a WB, G
corresponde a RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estos experimentos se analizaron distintos
tipos de células:
- -
- células endoteliales primarias de tipo arterial procedentes de cordón umbilical humano (células HUAEC): obtenidas de AdvanceCell y mantenidas con los medios que sugiere el distribuidor.
- -
- células endoteliales primarias de tipo venoso procedentes de cordón umbilical humano (células HUVEC): obtenidas de AdvanceCell y mantenidas con los medios que sugiere el distribuidor.
- -
- células ependimarias obtenidas mediante extracción de la capa ependimaria de los ventrículos laterales de cerebros de ratones adultos y mantenidas en medio completo de neuroesferas.
- -
- células astrocitarias obtenidas mediante la diferenciación de células madre neurales en ensayos de diferenciación o mediante cultivos de astrocitos a partir de cerebros de ratones neonatales
- -
- neuronas granulares aisladas a partir de cerebelos de ratones de siete días postnatales y sembradas sobre poli-D-lisina en DMEM-F12, 10% FBS y 25 mM de cloruro potásico.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos tipos celulares fueron cultivados o en sus
medios correspondientes o en medio completo de neuroesferas. Para
analizar la expresión a nivel de RNAm se extrajeron los RNA totales
mediante el Kit de extracción Rneasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las
recomendaciones del fabricante. A partir de 1 \mug de RNA se
realizó una retro-transcripción usando
hexanucleótidos al azar (3 \mug/\muL, Invitrogen Life
Technologies, USA) y 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript
II RT (Invitrogen Life Technologies), en un volumen de reacción de
40 \muL y en presencia de tampón first strand (50 mM
Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM Mg2Cl), 5 mM DTT y 0.25
mM de cada dNTPs (Amersham Pharmacia). Las reacciones de PCR se
realizaron en un termociclador Eppendorf. Se usó como molde 1 \mul
de cDNA en un volumen de reacción de 20 \mul conteniendo 4 mM
Tris-HCl, 20 mM KCl, 20 \muM EDTA, 200 \muM
DTT, 0.25 mM dNTPs (Amersham Pharmacia), 0.25 \muM de los
cebadores (Sigma-Genosys) y 1 U de ADN Taq
polimerasa (Eppendorf). Después de una desnaturalización inicial a
94ºC durante 2 min, se efectuaron los ciclos de amplificación
correspondientes a cada pareja de cebadores y una extensión final
de 10 min a 72ºC. El tamaño de cada producto de amplificación se
resolvió mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% (p/v)
preparado en tampón TBE (89 mM Tris, pH 8.0, 89 mM ácido bórico, 2
mM EDTA) con 10 \mug/ml de bromuro de etidio. Como tampón de
carga 6x, se utilizó 50% de glicerol, 0.05% azul de bromofenol,
0.05% cianol de xileno, 100 mM EDTA. La cuantificación se realizó
por densitometría comparando la intensidad de cada banda con la del
producto de la amplificación del gen de la
beta-actina. Los cebadores utilizados fueron: hPEDF
(forward: CTGAAGCT
GAGTTATGAAGGCG; reverse: GGTTAAGGTGATAGTCCAGCGC), h\beta-actin (GCATGGAGTCCTGTGGCATC
CACG;GGGTGTAACGCAACTAAGTCATAG), mPEDF (GAGCTACATCTTCTTCCTGCC;CCAGTAATCTTGC
TGAAGTCGG), m\beta-actin (CCGGGACCTGACAGACTACCT;GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA). Para las determinaciones proteicas se recogieron o bien las células o bien el medio condicionado por ellas. Las células se homogeneizaron en tampón de tisis RIPA (20 mM Tampón fosfato sódico, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) suplementado con inhibidores de fosfatasas y proteasas (1 mM ortovanadato sódico, 1 mM fluoruro sódico, 1 mM PMSF, 10 \mug/ml aprotinina y 10 \mug/ml leupeptina). La concentración de la proteína extraída se determinó por el método de Bradford modificado (DC Protein assay; Bio-Rad) usando la albúmina bovina del suero (BSA) como estándar. La misma cantidad de proteína (50-100 \mug) fue resuspendida en un tampón disolvente de muestras (625 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS, 4% (v/v) \beta-mercaptoetanol, 0.025% (p/v) azul de bromofenol), desnaturalizada por ebullición durante 5 minutos y resuelta mediante electroforesis de SDS-PAGE en geles de 10-13%. Los geles se electrotransfirieron (100 V, 1 hora) a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences), utilizando tampón de transferencia (25 mM Tris, pH 8.3, 20% (v/v) metanol, 192 mM glicina) en un sistema Mini Trans-blot (Bio-Rad). Las membranas fueron bloqueadas en leche desnatada en polvo al 5% (p/v) en tris borato salino-Tween-20 (Sigma) al 0.1%(v/v) (TBS-T) (0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.9% (p/v) NaCl) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Posteriormente se incubaron las membranas con lo anticuerpos primarios anti-PEDF (Chemicon, 1:1000) y anti-beta-actina (Sigma; 1:5000) en TBS-T, durante toda la noche a 4ºC y en agitación. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces en TBS-T, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios adecuados unidos a peroxidasa y se revelaron mediante quimioluminiscencia (Roche Lumi-light ECL kit)), exponiendo las membranas en papel fotográfico (Konica) hasta la detección óptima de la señal. Las intensidades de las bandas individuales se cuantificaron mediante un densitómetro de imágenes (Scion Image). Los niveles de expresión de la proteína analizada en nuestros estudios se normalizaron con respecto a la \beta-actina de estas mismas muestras.
GAGTTATGAAGGCG; reverse: GGTTAAGGTGATAGTCCAGCGC), h\beta-actin (GCATGGAGTCCTGTGGCATC
CACG;GGGTGTAACGCAACTAAGTCATAG), mPEDF (GAGCTACATCTTCTTCCTGCC;CCAGTAATCTTGC
TGAAGTCGG), m\beta-actin (CCGGGACCTGACAGACTACCT;GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA). Para las determinaciones proteicas se recogieron o bien las células o bien el medio condicionado por ellas. Las células se homogeneizaron en tampón de tisis RIPA (20 mM Tampón fosfato sódico, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) suplementado con inhibidores de fosfatasas y proteasas (1 mM ortovanadato sódico, 1 mM fluoruro sódico, 1 mM PMSF, 10 \mug/ml aprotinina y 10 \mug/ml leupeptina). La concentración de la proteína extraída se determinó por el método de Bradford modificado (DC Protein assay; Bio-Rad) usando la albúmina bovina del suero (BSA) como estándar. La misma cantidad de proteína (50-100 \mug) fue resuspendida en un tampón disolvente de muestras (625 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS, 4% (v/v) \beta-mercaptoetanol, 0.025% (p/v) azul de bromofenol), desnaturalizada por ebullición durante 5 minutos y resuelta mediante electroforesis de SDS-PAGE en geles de 10-13%. Los geles se electrotransfirieron (100 V, 1 hora) a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences), utilizando tampón de transferencia (25 mM Tris, pH 8.3, 20% (v/v) metanol, 192 mM glicina) en un sistema Mini Trans-blot (Bio-Rad). Las membranas fueron bloqueadas en leche desnatada en polvo al 5% (p/v) en tris borato salino-Tween-20 (Sigma) al 0.1%(v/v) (TBS-T) (0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.9% (p/v) NaCl) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Posteriormente se incubaron las membranas con lo anticuerpos primarios anti-PEDF (Chemicon, 1:1000) y anti-beta-actina (Sigma; 1:5000) en TBS-T, durante toda la noche a 4ºC y en agitación. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces en TBS-T, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios adecuados unidos a peroxidasa y se revelaron mediante quimioluminiscencia (Roche Lumi-light ECL kit)), exponiendo las membranas en papel fotográfico (Konica) hasta la detección óptima de la señal. Las intensidades de las bandas individuales se cuantificaron mediante un densitómetro de imágenes (Scion Image). Los niveles de expresión de la proteína analizada en nuestros estudios se normalizaron con respecto a la \beta-actina de estas mismas muestras.
El fragmento C-ter es capaz de
competir el efecto inductor de las células endoteliales y
ependimarias en el ensayo de auto-renovación de
células madre neurales, como se muestra en la figura 12. Este
bloqueo está de acuerdo con la observación de que estos tipos de
células secretan PEDF y demuestra que el PEDF producido de forma
natural por ciertos tipos de células puede ser antagonizado por el
fragmento C-ter en el proceso de
auto-renovación. Esto se muestra en la figura 12. En
la figura 12 se muestra cómo células endoteliales y ependimarias,
que expresan y secretan PEDF de forma natural (ver figura 11),
inducen formación de esferas y que este efecto inductor es
bloqueable por 15 nM C-ter PEDF. En la figura 12, A
está definido por el ensayo control. Para la realización de estos
experimentos, se sembraron los distintos tipos de células en placas
de 24 pocillos en medio completo de NSCs, se colocó un inserto
(transwell de Millipore de 12 mm y 0.4 pm diámetro de poro) 2 hr
más tarde y en él se sembraron células madre neurales disociadas a
baja densidad. Estos cultivos se realizaron en presencia o ausencia
de C-ter PEDF a una concentración de 15 nM. A los 4
DIV se contó el número de neuroesferas formadas en cada cultivo. En
el caso de los co-cultivos de NSCs con células
endoteliales y ependimarias, se observó un aumento en el número de
neuroesferas que era antagonizado por el fragmento
C-ter. En el caso de los astrocitos, había un efecto
inductor en la formación de esferas no mediado por PEDF ya que no
era antagonizado por el fragmento (de acuerdo con la falta de
secreción de PEDF) y en el caso de las neuronas no había ningún
efecto. Todo esto indica que fuentes celulares naturales de PEDF
pueden activar la auto-renovación y que el
fragmento C-ter puede ser utilizado para demostrar
la especificidad del efecto. En la figura 12, A corresponde a A, 1
corresponde a HUVEC, 2 corresponde a HUAEC, 3 corresponde a
apendima, 4 corresponde a astrositos, 5 corresponde a granule
cells.
Para demostrar de forma paralela que las células
endoteliales favorecían la auto-renovación de
células madre neurales porque producen PEDF, silenciamos la
expresión de PEDF endógena en estas células mediante técnicas de
RNA interferentes, observando que el efecto inductor de las células
HUVEC sobre la formación de esferas se veía reducido cuando la
expresión y secreción del PEDF endógeno disminuía. Esto se muestra
en la figura 13. En la figura 13 por tanto se muestra como células
HUVEC en las que se ha silenciado parcialmente la expresión de PEDF
mediante un siRNA específico secretan menos PEDF al medio e inducen
la formación de un número menor de neuroesferas que las HUVEC
tratadas con un siRNA control. Para realizar este experimento,
obtuvimos de PROLIGO 21-bp siRNAs específicos
(siPedf 5'-CGAGUUCAUUCAUGACAUAGA-3'.
sicontrol (luciferasa)
5'-AACGUACGCGGAAUACAACGA-3') que
fueron introducidos en las células mediante dos rondas de
transfección con Lipofectamine (Invitrogen). La determinación de los
niveles de PEDF en el medio de cultivo se realizó mediante
inmunoblot y la determinación del número de esferas se hizo
mediante co-cultivo, tal como se ha contado
anteriormente. En la figura 13, A corresponde a PEDF, B corresponde
a b-actin, 1 corresponde a SIRNA control, 2
corresponde a SIRNA Pedf.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemblo
6
El PEDF también activa la división
auto-renovante de células madre neurales presentes
en los nichos neurogénicos endógenos aumentando su número y su
capacidad de dar lugar a progenie pero manteniendo su estado de
célula madre (auto-renovación), como se demuestra
cuando se administra PEDF intracerebralmente mediante bombas
mini-osmóticas en cerebros de ratón (Figuras 14 y
15). En la figura 14 se muestra que cuando el factor PEDF es
administrado intracerebralmente conduce a un mayor número de células
madre neurales (que retienen BrdU largos periodos, una indicación
de su relativa quiescencia, y que son positivas para el marcador
GFAP). El bloqueo del PEDF endógeno que se produce en el nicho
neurogéncio de la zona subventricular en condiciones normales no
causa cambios, lo que sugiere que el PEDF no actúa como factor de
supervivencia para estas células. Por tanto, la figura 14 muestra
cómo el PEDF administrado intracerebralmente conduce a un mayor
número de células madre neurales (que retienen BrdU largos periodos,
una indicación de su relativa quiescencia, y que son positivas para
el marcador GFAP). El bloqueo del PEDF endógeno que se produce en
el nicho neurogéncio de la zona subventricular en condiciones
normales no causa cambios, lo que sugiere que el PEDF no actúa como
factor de supervivencia para estas células. En la figura 14, 1
corresponde a salino, 2 corresponde a PEDF, 3 corresponde a
C-ter PEDF, 4 corresponde a BrdUUGFAP A corresponde
a BrdL.
En la figura 15, A corresponde a GFAP/BrdUS, 1
corresponde a PEDF, 2 corresponde a C-ter PEDF y la
Figura 15 muestra el efecto del PEDF administrado a ratones a nivel
de la zona subventricular es activar la división de las células
madre neurales, como se observa en el hecho de que incorporan más
BrdU, indicación de que están proliferando en presencia de PEDF
exógeno. Para la realización de estos experimentos se implantaron
mini-bombas osmóticas Alzet (modelo 1007D)
acopladas a cánulas de 28 \mum de diámetro que se insertaron
intracerebralmente en ratones adultas con coordenadas
estereotáxicas: 0.0 anteroposterior a Bregma, 0.7 mediolateral y
1.7 dorsoventral y fueron fijadas al cráneo con Histoacryl
(B/Braun). Se infundió solución salina (vehículo), PEDF (20 ng/ml) o
C-ter PEDF (100 ng/mI) durante 7 días a una tasa de
flujo de 0.5 \mul/h. Para analizar las distintas poblaciones de
células con capacidad proliferativa en la zona subventricular,
incluyendo las células madre, se utilizó la técnica de
incorporación de BrdU. La Brdu es un análogo estructural del
nucleótido timidina, y se incorpora al ADN de las células que se
encuentran en fase S en el momento del pulso. Posteriormente
podemos detectar las células que han quedado marcadas mediante el
uso de un anticuerpo específico en cortes histológicos. Para los
marcajes con Brdu de las células proliferantes en el cerebro adulto,
los ratones se sometieron a dos tipos de régimen de administración
distinto en función de las células que se deseaba marcar:
- -
- una tanda de ratones recibieron el último día del periodo de infusión intraventricular 7 inyecciones intraperitoneales de Brdu (Sigma), (50 \mug/g de peso) cada dos horas (Nowakowski et al., 1988), y fueron sacrificados una hora después de la última inyección. Esta estrategia marca las células que en el último día de infusión están proliferando.
- -
- Otra tanda de ratones recibieron un mes antes del inicio del periodo de infusión, 6 inyecciones de BrdU en un periodo de dos días (3x2) y fueron sacrificados al final del periodo de infusión. Esta estrategia marca las células madre neurales, relativamente quiescentes y que, por tanto, mantienen la marca asociada a la incorporación de la BrdU durante un mes, y que expresan GFAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los animales fueron anestesiados con
pentobarbital sódico (13 mg/gr de animal) y sacrificados mediante
perfusión intracardíaca con paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) en
tampón fosfato 0.1M, pH 7.4 Tras la postfijación durante toda la
noche (o/n), se extrajeron los cerebros y se lavaron en PB durante
2 horas. A continuación, se procedió a la deshidratación del
tejido, e inclusión en parafina. Cortes seriados de 7 \mum de
grosor fueron incubados en HCl 2N a 37ºC durante 20 minutos y
neutralizados con tampón borato 0,1 M pH 8,5. El bloqueo de uniones
inespecíficas se llevó a cabo incubando los cortes con una solución
de bloqueo (0,2% triton X-100, 10% suero de cabra en
PB 0,1 M) durante 1 hora a temperatura ambiente. En esa misma
solución de bloqueo se incubaron los cortes con un anticuerpo
primario anti-Brdu (DAKO, 1:200) durante 12 horas,
seguido de anticuerpos secundarios específicos marcados con
fluorocromos. Esta detección inmunocitoquímica se combinó con la
detección inmunocitoquímica de marcadores específicos de NSCs, como
es la GFAP (proteína glial acídica fibrilar), y de neuroblastos,
como es la forma polisializada de la molécula de adhesión neural
(PSA-NCAM).
El PEDF hace que el nicho sea más eficiente en
la producción de progenie neuronal (Figura 10). En la Figura 16 se
observa que cuando el factor PEDF es administrado exógenamente
conduce a una mayor producción de neuronas en la zona subventricular
(positivas para el antígeno PSA-NCAM) y a una mayor
actividad proliferativa de la zona (incorporación de BrdU). Lo
contrario se obtiene cuando se bloquea el PEDF endógeno mediante el
fragmento no activo C-ter PEDF. Por tanto la figura
16 muestra cómo el PEDF administrado exógenamente conduce a una
mayor producción de neuronas en la zona subventricular (positivas
para el antígeno PSA-NCAM) y a una mayor actividad
proliferativa de la zona (incorporación de BrdU). Lo contrario se
obtiene cuando se bloquea el PEDF endógeno mediante el fragmento no
activo C-ter PEDF. Además, la administración de PEDF
conduce a la obtención de cultivos con mayor capacidad de generar
neuroesferas (Figura 17). En la Figura 17 se muestra cómo cuando el
PEDF es administrado exógenamente a cerebros conduce a una mayor
producción de neuroesferas a partir del tejido disociado de estos
cerebros. Esto indica que la activación de células madre somáticas
por PEDF favorece la producción de progenie celular y, por tanto,
puede contribuir a procesos regenerativos y de reparación tisular.
En la figura 16, A corresponde a PSA-NCAM/BrdUS, B
corresponde a BrdS, C corresponde a PSA-NCAM, 1
corresponde a salino, 2 corresponde a PEDF, 3 corresponde a
C-ter PEDF.
En la figura 17, 1 corresponde a salino, 2
corresponde a PEDF, 3 corresponde a C-ter PEDF, P
corresponde a Primario, S corresponde a Secundario, Eje de las Y
corresponde a número de neuroesferas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se incluyen cuatro ejemplos de producción de
PEDF, para demostrar que el objeto de la presente invención se
centra fundamentalmente en el nuevo uso del factor PEDF como
inductor de la auto-renovación de células madre,
independientemente de la forma en la que haya sido obtenido el
PEDF:
- -
- A partir de células que expresan y secretan PEDF de forma natural, como por ejemplo, células endoteliales (por ejemplo, de cordón umbilical) o células de naturaleza ependimaria (ver Figura 11). Estas células basta con cultivarlas tanto en su medio de cultivo habitual como en medio de cultivo de células madre neurales para que secreten PEDF. Estas células pueden ser de cultivos primarios o bien líneas celulares de origen endotelial o ependimario, cedidas o adquiridas a empresas. Para usarlas como fuente de PEDF para la auto-renovación pueden ser co-cultivas con las células madre mediante sistemas de co-cultivo con insertos de membranas porosas que no permiten el contacto entre las células de las dos procedencias, tal y como se explica para los ensayos contenidos en el ejemplo 5.
- -
- A partir de células en las que se expresa de forma heteróloga la secuencia de PEDF, como por ejemplo células COS. Para ello, se puede expresar PEDF en cualquier línea celular que no exprese o que exprese niveles bajos de PEDF mediante la introducción de un cDNA para Pedf utilizando transfección, como se explica por ejemplo en los ensayos que se incluyen en el ejemplo de realización 5.
- -
- Como recombinante en bacterias (E. coli). Hemos comprobado que producido en bacterias también tiene efecto en la auto-renovación de células madre neurales: 41 \pm 1% más neuroesferas en cultivos tratados con PEDF, n = 3; P < 0.01, Student's t-test. Este PEDF fue obtenido de la compañía Bioproducts MD.
- -
- Producido en Pichia pastoris: a partir de la secuencia humana obtenida por PCR y clonada en el vector pPICZ\alphaA a la que se añade la secuencia para el péptido señal de Saccharomyces cerevisiae y una cola de histidinas. Una vez producida en Pichia, se purifica mediante cromatografía y se comprueba la obtención y pureza por electroforesis en SDS-PAGE y western blot con anticuerpos específicos anti-PEDF (ver Figura 18). Estas moléculas fueron obtenidas del laboratorio de Julio Escribano en la Universidad de Castilla La Mancha, que las cedió para los análisis mostrados en los ejemplos de realización. En la figura 18 se muestra Formas purificadas por cromatografía de PEDF completo y la mitad C-terminal del PEDF humano a partir del medio obtenido de Pichia modificadas genéticamente para la expresión de estas formas. La electroforesis en SDS-PAGE muestra la pureza de la separación y el peso molecular aparente del PEDF (47 kDa) y del C-ter PEDF (26 kDa) y la inmunodetección con anticuerpos anti-PEDF muestra la especificidad de los dos productos. En la figura 18, 1 corresponde a PEDF, 2 corresponde a C-ter PEDF, A corresponde a SDS-PAGE, B corresponde a WB.
En el contexto de la presente invención, el uso
de PEDF biológicamente activo en el proceso de
auto-renovación de células madre incluye al PEDF y a
cualquier derivado de PEDF con acción en renovación celular. El
PEDF puede ser purificado a partir de fuentes naturales, como el
humor vítreo. La invención no se restringe al uso de la molécula
completa de PEDF ni a la de su secuencia precisa ni en su
procedencia de humanos ni de otras especies. Una secuencia
codificadora para PEDF puede incluir variaciones alélicas
poblacionales o mutaciones puntuales, así como variantes por
inserción, deleción o sustitución, sobre polipéptidos de PEDF que
se encuentran en la naturaleza. El polipéptido PEDF puede contener
otros dominios, como epítopos especiales para la purificación (como,
por ejemplo, colas de histidinas, myc) o para el seguimiento (como,
por ejemplo, GFP). Puede tratarse además de variantes de
modificaciones post-traduccionales, como
glicosilación o fosforilación. El PEDF puede ser utilizado en su
forma completa o en forma de fragmentos que retengan la actividad
sobre renovación celular. Todas estas formas pueden ser
suministradas a cultivos de células madre directamente para su
activación y mantenimiento. También pueden ser aplicadas sistémica
o localmente mediante el uso de composiciones farmacéuticas para
auto-renovación celular caracterizadas por contener
al menos una cantidad farmacéuticamente eficaz de factor PEDF y al
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En este sentido,
el PEDF no es tóxico y los efectos sobre
auto-renovación, al menos en células madre neurales
de ratón tanto en experimentos en cultivo como administrándolo
directamente en el cerebro de los ratones, los hemos encontrado con
concentraciones de tan sólo 0.4 nM.
El PEDF puede ser utilizado en forma de
construcción conteniendo una secuencia de ácido nucleico que
codifica para cualquiera de las formas de PEDF contempladas en el
párrafo anterior. En este caso, estas secuencias pueden ser
introducidas en sistemas celulares usando tecnología de DNA
recombinante. El PEDF puede ser introducido de esta forma en
sistemas celulares (mediante transfección, infección,
electroporación, microinyección, etc.), que luego puedan ser
puestos en co-cultivo con células madre, o bien
introducidos en tejidos en los que sea necesario activar células
madre endógenas, o puede ser introducido directamente en los
tejidos mediante infección con vectores virales utilizados en
terapia génica. También, estas secuencias pueden ser utilizadas
para la expresión masiva de la forma de PEDF activo en renovación
celular en sistemas de expresión procariotas o eucariotas. En todos
estos casos, las construcciones deberán contener promotores capaces
de dirigir la expresión de la molécula en las células de
interés.
En todos los casos anteriores, el PEDF puede ser
suministrado sólo o en combinación con otros factores inductores de
la auto-renovación. En el contexto de la presente
invención también proponemos el uso de fragmentos
C-terminales de la molécula de PEDF como estrategia
para el bloqueo de los efectos de PEDF completo sobre la
auto-renovación celular.
El polipéptido PEDF activa la división
auto-renovante de células madre somáticas, como las
neurales, en nichos naturales y con ello, la producción de progenie
diferenciada. La presente invención proporciona un método para
activar células madre presentes en los tejidos que requieren una
mayor actividad de sus células madre para renovación tisular e,
incluso, regeneración, como por ejemplo, regeneración de piel,
hematopoyética, neural tras accidente cerebrovascular, cardiaca,
etc.
Claims (19)
1. Uso del factor PEDF en su versión completa o
fragmentado en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre de cualquier
origen.
2. Uso del factor PEDF según la reivindicación 1
en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre combinado de forma
adicional con moléculas seleccionadas del grupo formado por
aminoácidos, lípidos, hidratos de carbono y metales.
3. Uso del factor PEDF según la reivindicación 1
en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre en sistemas de
expresión procariotas o eucariotas.
4. Uso del factor PEDF según la reivindicación 1
en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre somáticas.
5. Uso del factor PEDF según la reivindicación 1
en la preparación de una composición que induce la
auto-renovación de células madre endógenas o
exógenas.
6. Uso del factor PEDF según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición que
induce la auto-renovación de células madre en el que
la composición está en una forma seleccionada de polvo, gránulos,
comprimidos, cápsulas, trociscos, solución, suspensión, emulsión y
jarabe.
7. Uso de factor PEDF según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para
activar procesos seleccionados del grupo formado por procesos de
regeneración tisular de la piel, procesos de cicatrización, procesos
de regeneración neural en casos de accidente cerebrovascular.
8. Uso del factor PEDF según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para
terapia celular.
9. Uso de factor PEDF según la reivindicación 8
para la fabricación de un medicamento para terapia celular
preferentemente para regeneración cardiaca, neural y/o
hematopoyética.
10. Composición farmacéutica para inducir la
auto-renovación de células madre
caracterizada porque comprende en un medio farmacéuticamente
aceptable una cantidad farmacéuticamente eficaz de:
- i)
- la secuencia total o parcial del factor PEDF,
- j)
- una variante biológica natural, como una variante alélica, del factor PEDF,
- k)
- un equivalente funcional del factor PEDF que contenga sustitución(es), adición(es), inserción(es) y/o deleción(es) únicas o múltiples en la secuencia de la proteína tipo salvaje y/o sustituciones de aminoácidos modificados químicamente que no afecten la función biológica autorenovadora de células madre,
- l)
- un fragmento activo del factor PEDF en el que "fragmento activo" designa a un secuencia de PEDF que mantiene la función biológica de auto-renovación de células madre,
- m)
- una proteína fusionada que comprende el factor PEDF fusionado a un péptido o a otra proteína,
- n)
- Un derivado de PEDF,
- o)
- Un análogo estructural de PEDF
- p)
- y/o un homólogo de PEDF.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de la secuencia total o parcial
del factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
12. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de una variante biológica natural
de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un equivalente funcional de
factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
\newpage
14. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un fragmento activo de factor
PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de una proteína fusionada de
factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
16. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un derivado de factor PEDF y al
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un análogo estructural
de factor PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
18. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque contiene al menos una
cantidad farmacéuticamente eficaz al menos un homólogo de factor
PEDF y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
19. Composición farmacéutica para inducir la
auto-renovación de células madre según la
reivindicación 10 caracterizada porque la cantidad de factor
PEDF es de al menos 20 ng/ml.
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