ES2329269T3 - Modulacion del numero de celulas de una planta. - Google Patents
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Abstract
El uso de un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende SEQ ID Nº:2, o un fragmento funcional de la misma, que tiene actividad de ubiquitina proteína ligasa E3 unido de manera operable a un promotor adecuado para la expresión en plantas para incrementar la biomasa en las hojas.
Description
Modulación del número de células de una
planta.
La presente invención se refiere al uso del gen
ANG4 para modular el número de células de una hoja. Dicha modulación
se puede usar para incrementar la biomasa de la hoja.
La arquitectura vegetal, especialmente la
morfología de las hojas y raíces, es un factor importante en la
determinación de la productividad vegetal. Por lo tanto, el estudio
de los genes implicados en la arquitectura vegetal y su regulación
ha atraído mucha atención de varios grupos de investigación.
El aislamiento, la identificación, la
caracterización y la manipulación de genes que son candidatos para
el control del desarrollo de las hojas es clave en la comprensión de
cómo se construyen las hojas de los vegetales.
Se han usado varios métodos para estudiar los
genes y las funciones que regulan el desarrollo de las hojas, tales
como las técnicas de genética directa o inversa. Durante los
procesos de desarrollo de las hojas, hay al menos dos factores que
afectan al fenotipo de las hojas, en primer lugar la división
celular, que da como resultado un número de células dado, y en
segundo lugar la expansión celular, que es necesaria para el
establecimiento del tamaño y la forma de las células. La longitud y
la anchura de las hojas están reguladas por la división celular y
la expansión celular según un gradiente (Pyke et al., 1991;
Van Lijsebettens y Clarke, 1998). Además, las hojas están moduladas
también por factores ambientales tales como el agua, los nutrientes,
la luz, y la concentración de CO_{2}. Berna et al. (1999)
proporciona una visión de conjunto de las mutaciones y las clases
fenotípicas que influyen en la morfología de las hojas en
Arabidopsis. Algunas de estas mutaciones se han caracterizado a
nivel genético. Los genes que regulan el número de células a lo
largo del eje transversal son los genes DRL1 y SWP1, que actúan
principalmente sobre el crecimiento lateral de la lámina (Nelissen
et al., 2003 y Autran et al 2002).
Aunque estos genes se podrían usar para modular
la biomasa vegetal, todavía existe la necesidad adicional de genes
que controlen la arquitectura vegetal, especialmente de genes
capaces de controlar el número de células en órganos vegetales
específicos.
Se estudió un mutante con hojas estrechas,
angusta4, de la colección de semillas de Berna et al.
(1999), y se identificó el gen causal, que se denominó ANG4.
El mutante se creó en un principio mediante el método EMS (Figura
1A). El análisis molecular demostró sorprendentemente que el gen
causal de la mutación angusta4, que está localizado en el
cromosoma 2, es una proteína con dedos de zinc de tipo RING (Anami,
2004; Stone et al., 2005) con actividad de ligasa E3. Esta
actividad está relacionada con la degradación de proteínas, pero
nunca se ha asociado a una morfología alterada de las hojas. La
anchura y la longitud de las láminas de angusta4 se
compararon con las de tipo natural (Landsberg erecta) (Figura
1A). Los datos demostraron que la longitud total de la lámina en
las hojas de angusta4 está significativamente reducida en
comparación con Ler. angusta 4 tuvo una primera hoja
estrecha y peciolos más cortos que Landsberg. El área de células
epidérmicas y en empalizada en angusta4 (11 mm^{2}) también
es más pequeña que la de tipo natural (19 mm^{2}). De forma aún
más sorprendente, se descubrió que el fenotipo de la hoja se debe a
una reducción drástica en el número de células en empalizada.
Además, se descubrió que la misma mutación tiene también un efecto
drástico sobre el crecimiento de las raíces, lo que hace que el gen
sea una herramienta interesante para la modulación de la
biomasa.
La invención se refiere al uso de un ácido
nucleico que codifica una proteína que comprende SEQ ID Nº 2
(TAIR_At2g44950, Figura 10), o un fragmento funcional de la misma,
para modular el número de células de una hoja, o una parte de la
misma. Preferiblemente, dicho ácido nucleico codifica una proteína
que consiste en SEQ ID Nº 2. Ácido nucleico, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a la secuencia codificante, que puede
estar unida a su propio promotor, pero que preferiblemente está
unida de manera operable a un promotor que no es el suyo. Dicho
promotor puede ser cualquier promotor adecuado para la expresión en
vegetales. Preferiblemente, dicho promotor es un promotor fuerte
tal como, pero sin limitación, el promotor 35S. "Ácido
nucleico" se refiere tanto a la secuencia genómica (que incluye
posibles intrones) como al cADN derivado del ARN mensajero sometido
a corte y empalme, unido de manera operable a una secuencia
promotora. La secuencia codificante es una secuencia
nucleotídica que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un
polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias
reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante
están determinados mediante un codón de inicio de la traducción en
el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo
3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación,
ARNm, cADN, secuencias nucleotídicas recombinantes o ADN genómico,
aunque también puede haber presentes intrones en ciertas
circunstancias.
Unido de manera operable se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una
relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una
secuencia promotora "unida de manera operable" a una secuencia
codificante está ligada de tal manera que la expresión de la
secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la
secuencia promotora.
Las partes de una hoja son, como ejemplo no
limitante, las células en empalizada de las hojas. Un fragmento
funcional, tal como se usa en el presente documento, es cualquier
fragmento que todavía tiene la actividad de
ubiquitina-proteína ligasa E3.
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Otro aspecto de la invención es el uso de un
ácido nucleico que codifica una proteína que comprende SEQ ID Nº2, o
un fragmento funcional de la misma, para incrementar la biomasa de
una hoja. Dicho incremento de la biomasa se obtiene mediante la
sobreexpresión de dicho ácido nucleico o fragmento funcional.
Fig. 1: Fenotipo de las hojas de angusta4
y de tipo natural. A: Estado in vivo, rosetas completamente
desarrolladas de Ler y angusta4. B: Hojas juveniles y adultas
completamente expandidas de Ler. C: Hojas juveniles y adultas
completamente expandidas de angusta4.
Fig. 2: Fenotipo de las hojas in vitro de
plantas de tipo natural y mutante angusta4 (26 días tras la
germinación).
Fig. 3: Fenotipo de las hojas de
angusta4.
A: Secciones transversales en la localización
más ancha de la lámina expandida de primeras hojas de tipo natural
(Ler)-(parte superior) y angusta4 (parte inferior). B: Valor
medio del número de células en empalizada en primeras hojas de
angusta4 y de tipo natural (el asterisco indica una
diferencia estadísticamente significativa). C: Corte transversal del
tipo natural en la vena central (la superficie adaxial está en la
parte superior). D: Primer plano de tejido vascular de tipo natural.
E: Corte transversal de angusta4 en la vena central (la
superficie adaxial está en la parte superior). F: Primer plano de
tejido vascular de angusta4. (V: haz vascular; P: célula en
empalizada; x: xilema; ph: floema; I: espacio intercelular). G, H,
I: Datos morfológicos de hojas expandidas de mutante
ang4-1 (A, B, C). Las barras representan los
valores medios y la desviación estándar. *** significa una
diferencia estadística de p<0,001 de la prueba t. Observaciones
histológicas de hojas expandidas del mutante ang4 y Ler.
Fig. 4: A: Crecimiento de raíces in vitro
a los 15 días de la germinación.
B: Biomasa de los mutantes
ang4-1, ang4-2,
ang4-3, Ler y Col en tierra. Media de
2 ensayos, 4 bloques por ensayo y 8 plantas por bloque. Las barras
corresponden a la desviación estándar.
Fig. 5: A: Cinética del crecimiento de las
raíces de angusta4 en comparación con el tipo natural (Ler).
B y C: Secciones longitudinales mediante microscopía confocal a
través del meristemo apical en la punta de la raíz en el tipo
natural y en los mutantes de angusta4).
Fig. 6: Cartografía precisa del gen ANG4:
La Figura indica la estrategia de clonación basada en la
cartografía, en la que se aplicó un grupo de ocho combinaciones de
cebadores de AFLP a 20 mutantes individuales F2, que indicó que la
mutación de ANG4 estaba localizada en el cromosoma 2 (patrón
azul y blanco).
La aplicación posterior de los marcadores AFLP
SM33_202 y SM26_495 redujo el intervalo de ANG4 a 293 kb.
Finalmente, los marcadores InDel y SNP se usaron en un total de 1062
recombinantes, lo que delimitó el área de ANG4 a 27 kb en la
parte inferior del cromosoma 2, flanqueado por los marcadores SNP
CER458218 y CER458367. La región de 27 kb contuvo 4 genes, uno de
los cuales fue el gen candidato de ANG4.
Fig. 7: Separación de los productos de PCR del
gen At2g44960 tras la amplificación con dos grupos de cebadores. El
carril 1 contiene un marcador de peso molecular de 1 kb. Los
carriles 2-7 contienen los productos de PCR del gen
At2g44960 de Ler, mientras los carriles 8-13
contienen los productos de PCR del gen At2g44960 de ANG4. Los
productos de PCR de los carriles 2, 3, 4, 8, 9, y 10 se amplificaron
con las combinaciones de cebadores Defle 12 y Defle 13, mientras los
productos de PCR de los carriles 5, 6, 7, 11, 12 y 13 se
amplificaron con la combinación de cebadores: Defle 14 y Defle
15.
Fig. 8: Ejemplo de una alineación llevada a cabo
mediante CLUSTALW 1.8. Esta alineación es entre la parte de 2652 pb
y 3873 pb del gen At2g44950 que se amplificó mediante la combinación
de cebadores 5'CTCGCC
CATTGTTGTTTCAG3' y 5'AATTGCGGAAACCATGTTCC3'. Esto demuestra claramente la mutación puntual inducida mediante EMS, ya que una C se cambió por una T, lo que generó un codón de parada UAG.
CATTGTTGTTTCAG3' y 5'AATTGCGGAAACCATGTTCC3'. Esto demuestra claramente la mutación puntual inducida mediante EMS, ya que una C se cambió por una T, lo que generó un codón de parada UAG.
Fig. 9: Estructura del gen ANG4. Se
muestran los genes candidatos de ANG4 que cubren una región
de 27 kb en el cromosoma 2 y que están unidos mediante los
marcadores SNP CER458218 y CER458367. El ARNm sin corte y empalme de
ANG4 tiene 19 exones y 18 intrones que cubren una región de
6298 pb, mientras el cADN de tamaño completo cubre una región de
2637 pb. La mutagenización mediante EMS provocó que una C se
cambiase por una T, lo que generó un codón de parada al final del
exón 16, y por lo tanto se truncó la proteína de 878 aminoácidos a
844 aminoácidos (exones en los recuadros azules, e intrones en los
recuadros naranjas). Figura dibujada a escala; para la estructura de
los genes candidatos, 1 cm = 2 kb, y para el ARNm sin corte y
empalme y para el ARNm con corte y empalme, 1 cm = 1 kb.
Fig. 10: Una alineación de los homólogos de ANG4
en diferentes especies. La secuencia subrayada en naranja indica el
motivo de dedos de zinc de tipo RING conservado. Los residuos
conservados de cisteína y de histidina están coloreados con los
colores rojo y azul, respectivamente. At2g44950 es la secuencia de
ANG4 con 878 residuos de aminoácidos. At1g55250 es el homólogo de
ANG4 en el cromosoma 1 en Arabidopsis con 899 aminoácidos. NP_55586
y AAK58539 son los homólogos de ANG4 en el genoma humano con 1001 y
975 aminoácidos, respectivamente. CAD41603 y NP922769 son los
homólogos de ANG4 en Oryza sativa con 883 y 789 aminoácidos,
respectivamente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Fig. 11: Análisis mediante
RT-PCR de la expresión del gen ANG4 en
diferentes órganos de Ler. El patrón de expresión se
visualizó en un gel de acrilamida. Se cargaron muestras de 4 \mul
en un gel de acrilamida en tampón Tris-ácido
bórico-EDTA 1X y se sometieron a electroforesis a
3000 V. Se marcaron los cebadores Defle 44 y syana_01 con ^{33}P.
Los números en el gel indican los diferentes órganos de Ler,
como sigue: 1- ápice de Ler, 2- ápice de brote de Ler, 3- raíces de
Ler, 4-cotiledones de Ler, 5- hojas jóvenes de Ler,
6- hojas expandidas de Ler, 7- flores de Ler y 8- agua como muestra
de control.
Fig. 12: Resumen de los genes de Arabidopsis con
una expresión alterada de ARNm en ang4 y otros dos mutantes del
desarrollo de las hojas, elo2 y
drl1-2. Se extrajo ARN del ápice de los
brotes de plantas jóvenes, y se midió la expresión mediante el uso
del método de micromatrices ATH1 (Affymetrix) por triplicado.
Se hicieron comparaciones del nivel de expresión
entre cada mutante y el Ler de tipo natural siguiendo la
prueba Bayesiana de modelo lineal, llevada a cabo con los programas
Bioconductor. Los valores sin paréntesis son el número de genes DE
expresados igualmente en los diferentes mutantes, y los valores
entre paréntesis, el número de genes DE estimulados en un mutante e
inhibidos en otro.
Fig. 13: Análisis cinemático del crecimiento del
primer par de hojas de Ler de tipo natural y del mutante
ang4-1. (A) área de la hoja, (B) número de
células epidérmicas en el lado abaxial de la hoja, (C) velocidad
relativa de expansión de la hoja, (D) velocidades medias de división
celular de las células epidérmicas en el lado abaxial de la hoja,
(E) tamaño medio de las células epidérmicas en el lado abaxial de la
hoja, (F) índice estomático en el lado abaxial de la hoja. Las
barras de error corresponden a la desviación estándar (n=5).
Fig. 14: Análisis mediante citometría de flujo
del contenido de ADN nuclear de Ler (A) y del mutante
ang4-1 (B).
Fig. 15: Plantas Ler de tipo natural y
OE-ANG4 (T1) dos semanas después de la transferencia
a tierra.
Las semillas de Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh. Landsberg erecta (Ler) y del mutante
ang4-2 (SALK_122512) se obtuvieron del
Nottingham Arabidopsis Stock Centre. El mutante homocigoto de
ang4-1 fue suministrado por J.L. Micol
(Universidad Miguel Hernández, Alicante, España) (Berna et
al., 1999). La línea de inserción de T-DNA de
ang4-3 (GABI_276D08) fue suministrada por
GABI-Kat.
Las plantas de tipo natural de Landsberg
erecta (Ler) y angusta4 (ang4) se cultivaron en
condiciones in vitro con las siguientes condiciones: 16/8
horas (d/n) con luz blanca (tubos de neón, blanco frío), 100
\muEm ^{2}h-1 PAR y 20ºC. El medio fue 2,15 g/l
de sales MS (micro y macro elementos), 1 g/l de sacarosa, 0,5 g/l
de MES, pH 6,0, 6 g/l de agar de cultivo de tejidos vegetales. Las
semillas se sembraron en placas redondas de 150 x 25 mm, y se
sellaron con cinta Urgopore. Se sembraron sesenta semillas por
placa. El período de vernalización fue de 3 días tras la
siembra.
Para el experimento de crecimiento de las
raíces, se sembró un carril de 5 plantas en una placa cuadrada en
posición vertical. Los carriles de ang4-2 y
ang4-3 homocigotos se seleccionaron en medio
in vitro que contenía 25 mg/l de kanamicina para el
ang4-2 o 11,25 mg/l de sulfadiazina para el
carril de ang4-3. El fenotipo de las líneas
de inserción de T-DNA se determinó en condiciones de
cultivo en tierra.
Se recogen de ocho a doce primeras y terceras
hojas expandidas de plantas Ler y ang4 cultivadas in
vitro de 30 y 40 días, se tratan con metanol del 100% durante
la noche, se aclaran con ácido láctico del 90% durante
2-3 días durante la noche y se ponen sobre un
portaobjetos para el análisis de las imágenes. Se mide la longitud
del peciolo, de la lámina y de la hoja, el grosor de la lámina y el
área de las primeras y terceras hojas con el soporte informático
Scion Image (versión \beta-3b; Scion Corp.,
Frederick, MD) a partir de fotografías digitales tomadas
directamente de observaciones con un microscopio binocular.
Se analizó la significación estadística de las
diferencias medias (p\leq0,05) mediante la prueba t con el uso del
soporte informático SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences, versión 10.0.5, SPSS, Inc.; Chicago, IL) sobre datos
distribuidos normalmente.
Se sembraron 15 semillas de cada línea de
angusta4 (solas o en una fila por placa) en placas cuadradas
con medio GM que contenía vitaminas. Las placas se orientaron en una
posición vertical. Mediante el uso de un escalpelo, se marcaron las
raíces de estas líneas cada dos días hasta los 14 días.
Se han usado las primeras y terceras hojas de
Ler y ang4 aclaradas preparadas para el análisis de imágenes
para llevar a cabo un análisis óptico DIC (contraste de
interferencia diferencial). Esta técnica permite contar el número
de células de una capa de tejido histológico determinado, y, lo que
es más importante, permite medir el área celular del lado adaxial
mediante el uso de Scion Image.
Se recogieron primeras y terceras hojas
completamente expandidas de 26 días de plantas Ler y angusta4
y se fijaron inmediatamente en FAA (90% de EtOH, 5% de ácido
acético, 5% de formaldehído) a 4ºC durante la noche. El proceso de
deshidratación se realizó mediante concentraciones crecientes de
EtOH como sigue: 2 x 30 min con EtOH del 50%, 2 h con EtOH del 50%,
2 h con EtOH del 70%, 2 h con EtOH del 80%, durante la noche con
EtOH del 80%, 2 x 2 h con EtOH del 90% y finalmente durante la noche
con EtOH del 95%. La infiltración del tejido se realizó en una
impregnación gradual con Historesin, y se llevó a cabo poniendo
primero las hojas durante 4 h en una mezcla del 50% de EtOH y del
50% de Historesin, seguido por otra mezcla del 30% de EtOH y del
70% de Historesin durante 4 h, y finalmente en un 100% de Historesin
durante 4 h. Durante ese tiempo, las muestras se mantuvieron siempre
durante 30 min en vacío.
Durante la última etapa, las hojas se agitaron a
temperatura ambiente durante 3 días. Después se sumergieron las
hojas en una nueva disolución de resina básica que contenía un 1% de
activador sensible a la temperatura, y se dejaron con agitación
durante la noche. Las hojas se orientaron finalmente en lechos
rellenos hasta la mitad con la disolución de resina, se cubrieron
con resina nueva y se dejaron polimerizando a 45ºC durante al menos
2 h. El análisis histológico se llevó a cabo con cortes de 5 \mum
recogidos sobre portaobjetos de vidrio mediante el uso de un
micrótomo Ultracut de Reichert Jung con el uso de cuchillas de
vidrio hechas en el laboratorio. Los bloques que contenían las
hojas con Historesin obtenidos tras la polimerización se orientaron
en un cubo de plástico y se fijaron con Super-Glue.
Los cubos de plástico se sujetaron mediante abrazaderas para
microcubos.
El citoplasma se tiñó en cada corte con azul de
toluidina siguiendo el siguiente proceso: Los portaobjetos de
vidrio tratados se tiñeron durante 8 min con azul de toluidina del
0,05% y tampón fosfato 0,1 M, pH 6,8 durante 10 minutos. Después de
dos lavados (5 a 10 minutos cada uno) en agua esterilizada, se
secaron los portaobjetos y se montaron con DePex. Se tomaron
fotografías mediante el uso de una cámara digital Olympus CAMEDIA
C-3040 con zoom de 3,3 megapíxeles al mismo aumento,
y las imágenes de las fotografías se realizaron mediante el programa
Adobe Photoshop 6.0.
Se hicieron cortes transversales de 5 \mum de
primeras y terceras hojas completamente expandidas de Ler y
ang4 de 28 días con un micrótomo Ultracut de Reichert Jung
para determinar, con la ayuda de un microscopio binocular, el
número de células en empalizada (PCN) presentes en la parte más
ancha de la lámina. Este parámetro es un indicador del crecimiento
lateral de la hoja (Tsuge et al., 1996). Se cortaron
completamente varias hojas desde la punta hasta el peciolo: un
corte de cada diez se recogió y se puso sobre un portaobjetos de
vidrio. Los portaobjetos de vidrio se tiñeron posteriormente con
azul de toluidina y se montaron con DePex.
Se tiñeron plántulas de 7 días de
angusta4 con una disolución de yoduro de propidio de 100
ng/ml durante 3 minutos y se lavaron 3 veces con agua esterilizada.
La raíz teñida se observó con un microscopio confocal MRC600 de
Biorad mediante el uso de luz 560 LB con excitación a 543 nm.
Se llevó a cabo el análisis de citometría de
flujo como describió De Veylder et al. (2001). Las dos
primeras hojas se trituraron con una cuchilla en 300 \mul de
tampón (MgCl_{2} 45 mM, citrato sódico 30 mM, ácido
3-[N-morfolino]propanosulfónico 20 mM, pH 7,
y 1% de Triton X-100) (Galbraight et al.,
1991). Se añadió al sobrenadante, que se había filtrado a través de
una malla de 30 \mum, 1 \mul de
4,6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) de una reserva de 1 mg/mL. Los núcleos se analizaron con el
citómetro de flujo BRYTE HS, mediante el uso del soporte
informático Win-Bryte (Bio-Rad,
Hercules, CA). De cada punto de tiempo, se tomaron dos réplicas
biológicas y tres técnicas.
Se analizó el crecimiento de las hojas
cinemáticamente de 5 a 28 días después de la siembra tal como se
describió (De Veylder et al., 2001). Se hicieron germinar y
se cultivaron las plantas de tipo natural y ang4-1
en condiciones in vitro en medio GM+V. Se determinaron los
siguientes parámetros: área total de todas las células en el
dibujo, número total de células, y número de células de guarda. A
partir de estos datos se calculó el área celular media y se estimó
el número total de células por hoja dividiendo el área de la hoja
por el área celular media (calculada entre las posiciones apical y
basal). Finalmente, se determinaron las velocidades medias de
división celular para la hoja completa como la pendiente del número
de células por hoja transformado mediante el log_{2}, que se
realizó mediante el uso de fórmulas de diferenciación de cinco
puntos (Erickson, 1976).
La extracción del ADN, el análisis de AFLP, de
inserción/deleción (InDel) y de polimorfismos de nucleótido único
(SNP) se realizaron según (Peters et al., 2004) y (Cnops
et al., 2004). Se analizó un grupo estándar de 8 marcadores
AFLP en 20 mutantes F_{2} y se identificó la mutación en un
intervalo de 493 kb en el cromosoma 2. La cartografía precisa del
locus de ANG4 se realizó mediante el uso de los marcadores
InDel y SNP descritos en la Tabla S1. Se usaron recombinantes para
la cartografía precisa, y delimitaron el locus a regiones de 97 y
27 kb flanqueadas por marcadores SNP. El último intervalo cubrió una
región de 27 kb entre los marcadores SNP CER458218 y CER458367 y
contuvo 4 genes que se secuenciaron.
Los genes candidatos identificados en el último
intervalo de cartografía se amplificaron a partir de ADN y cADN, y
se secuenciaron completamente en al menos 3 réplicas para
identificar el intercambio de bases en el mutante
ang4-1 en comparación con Ler.
Los órganos estudiados, el ápice de los brotes
de plantas (que comprenden el meristemo del ápice del brote, el
primer y segundo primordios de las hojas de las rosetas en la etapa
sin peciolo), se recogieron extrayendo los cotiledones y los
hipocótilos. La recogida se realizó en condiciones de laboratorio
con luz adicional y a 20ºC entre las 11 am y las 6 pm. La edad de
las plantas en el momento de la etapa de recogida fue entre 8 y 15
días tras la germinación, dependiendo del retraso del desarrollo del
mutante. El ARN se extrajo con el reactivo TRIzol (Life
Technologies, Breda, Países Bajos). El diseño experimental
comprendió 3 réplicas de Ler y ang4, en las que una réplica
correspondía a una extracción de ARN y alrededor de 150 ápices.
El experimento con micromatrices se realizó en
el laboratorio del Servicio de Micromatrices del VIB (Paul van
Hummelen, Lovaina, Bélgica; http://www.microarrays.be/) mediante el
uso de chips ATH1 de Affymetrix de 23.800 conjuntos de sondas para
Arabidopsis thaliana. Los datos en bruto se normalizaron y se
resumieron mediante el uso del método Robust
Multi-Array Average del paquete Affy de programas
estadísticos R/BioConductor (Wu e Irizarry, 2004). Los genes se
clasificaron por orden de señales de expresión diferencial (DE)
entre el mutante y el tipo natural mediante el uso de un método de
Bayes empírico realizado con el paquete Limma de BioConductor. Este
método consiste en combinar a nivel genético las medias y la
desviación estándar de las 3 réplicas para formar un B estadístico
que es la probabilidad posterior de Bayes de que cada gen sea DE
(Lonnstedt y Speed, 2002; Smyth et al. 2003). El valor de p
calculado a partir de los datos B se corrigió mediante el método de
Holm, y el valor de corte de p fue 0,01.
Se estudiaron los mutantes
ang4-2 y ang4-3 con
inserción de T-DNA en el exón 6 y el exón 19,
respectivamente, del gen ANG4 (http://www.arabidopsis.org).
La inserción de T-DNA se comprobó mediante PCR en
plantas F2 mediante el uso de cebadores diseñados antes (P1) y
después (P3) de la posición putativa del T-DNA y un
cebador específico del límite izquierdo del T-DNA
(P2). Una amplificación positiva entre P1 y P2 valida la posición
de la inserción del T-DNA. Una amplificación
positiva o negativa coincidente mediante el uso de P1 y P3 demuestra
que la línea es heterocigota u homocigota, respectivamente.
Para obtener líneas de sobreexpresión de ANG4,
se amplificó el marco de lectura abierto (lo que incluye el codón
ATG y el codón de parada) de ANG4 (2637 pb) mediante la Pfu
polimerasa y se clonó en el vector pDONRT221 mediante el uso de la
estrategia de recombinación GATEWAY (Invitrogen) para obtener clones
ENTRY. El clon ENTRY se recombinó con el vector pK7WG2 (Karimi
et al., 2002) para obtener un vector DESTINATION con el ORF
bajo el control de un promotor 35S. Esta construcción se introdujo
en Agrobacterium tumefaciens, y posteriormente se
transformaron las plantas Ler o ang4-1
con la suspensión de Agrobacterium tumefaciens por medio de
inmersión floral. Las semillas T_{0} se cultivaron con una
densidad elevada en un medio de cultivo que contenía Kanamicina (50
\mug/ml), Nistatina (50 \mug/ml) y Carbenicilina (250 \mug/ml)
para seleccionar los transformantes. Estos transformantes T_{1} se
transfirieron a tierra para obtener semillas T_{2}.
Se llevó a cabo un análisis anatómico en la
primera hoja mediante el uso de microscopía óptica para identificar
las funciones fenotípicas del gen ANGUSTA 4. El objetivo era
centrarse en el número de células en empalizada, la estructura del
tejido vascular de la hoja así como el desarrollo de raíces
primarias de las plantas mutantes en comparación con las de tipo
natural.
Se observó la anatomía de las hojas de
angusta4 para determinar si se vio afectada la división
celular o la expansión celular, y para comprobar la polaridad, y se
estudió la cinética del crecimiento de las raíces como medida de la
actividad del meristemo apical de las raíces en los mutantes. En las
plantas, la expansión celular y la división celular son parámetros
claves en la determinación de la forma de los órganos.
El rasgo principal de la clase angusta de
mutantes es una lámina de hoja estrecha (Berna et al., 1999;
Figura 1). El tamaño reducido de las hojas en el mutante
ang4-1 se confirmó mediante medidas
morfológicas de las hojas expandidas. Las medidas mostraron una
disminución significativa de la longitud y la anchura de la lámina,
la longitud del peciolo y la longitud total de la lámina y el
peciolo (Figura 3G). El área de la lámina de primeras y segundas
hojas expandidas de ang4-1 fue 10,7 \pm 2,4
mm^{2}, es decir, el 55% del área de la lámina de Ler, que
fue 19,3 \pm 2,5 mm^{2} (Figura 3H). La proporción
longitud/anchura de la lámina se incrementó significativamente en
el mutante ang4-1, lo que muestra una
modificación de las proporciones de la lámina hasta una forma más
estrecha (Figura 3I). El peso fresco de las hojas de la roseta en
la etapa de aparición de las flores durante el desarrollo se redujo
significativamente en los mutantes ang4: la biomasa de
ang4-1 fue un 40% de la biomasa de
Ler, y los pesos frescos de ang4-2 y
ang4-3 fueron respectivamente un 51% y un 55%
en comparación con Col (Figura 4B). El peso seco también se vio
intensamente afectado por la mutación en ANG4, con un 39% para las
plantas ang4-1 en comparación con
Ler, y un 45% y un 49%, respectivamente, para las plantas
ang4-2 y ang4-3 en
comparación con Col.
Se tomaron cortes en serie por medio de primeras
hojas expandidas incrustadas en Historesin (plántulas de 26 días)
(Figura 3A). Se contó el número de células en empalizada en varios
cortes en serie en la anchura mayor de la hoja para usarlo como
medida del crecimiento lateral de la lámina de la hoja (Tsuge et
al., 1996). El número de células en empalizada de
angusta4 fue menor que en el tipo natural. Los datos
demostraron que el número de células en empalizada es 30 en
angusta4, y alrededor de 66 células en Ler (Figura 3B). Así,
las células en empalizada se redujeron alrededor de un 50% en
angusta4 en comparación con el tipo natural. La estructura
de las células en empalizada fue mayor, y con una distribución más
irregular que en Landsberg (Figura 3C y E).
También se visualizó al microscopio el tejido
vascular de Ler de tipo natural y de los mutantes angusta4.
La polaridad fue correcta en el mutante: xilema en el lado dorsal y
floema en el lado ventral. Se muestra la vena media del tipo
natural y del mutante (Figura 3D - F). En los mutantes
angusta4, las células que rodean el xilema y el floema
fueron mayores que en Ler. El número de células es superior también
en el haz vascular en la vena media de angusta4 (Figuras 3 E
y F). Estos datos demuestran que el gen ANGUSTA4 está implicado en
la regulación del número de células durante el crecimiento de la
hoja; no tiene función en la polaridad de la hoja.
Para investigar con más detalle la función del
gen ANGUSTA4, se estudió el crecimiento de la raíz primaria. Se
hicieron germinar 60 plántulas de angusta4 y Ler en placas
cuadradas, y se mantuvieron en posición vertical en la sala de
cultivo de tejidos. La punta de la raíz se marcó cada 2 días con la
hoja de un escalpelo. Se calculó el valor medio para cada punto de
tiempo. Se muestra una representación gráfica de estos valores
medios en la Figura 5A. Después de 15 días, la longitud de
angusta4 alcanzó 1 cm, que es mucho más corta que los 5 cm
de la línea Ler. Además, las raíces de angusta4 comenzaron a
formar raíces adventicias después de cuatro días de germinación;
cada planta angusta4 tuvo de 2 a 3 raíces adventicias.
Además, se visualizaron cortes apicales de
raíces de Arabidopsis in planta (plántula de 7 días y n=20)
en un microscopio confocal para investigar la estructura del
meristemo apical de las raíces. Las Figuras 5B y C muestran la zona
del meristemo de la raíz primaria en angusta4 y el tipo
natural. El corte longitudinal de la región del meristemo de la
raíz de angusta4 no mostró diferencias en la división celular
y en la expansión celular. Esto indica que no hay una actividad
defectuosa del meristemo de la raíz.
La organización floral se altera también por la
mutación de ANG4. Los diagramas florales de
ang4-1 mostraron una posición asimétrica de
los pétalos y antera o carpelo ausentes. La flor de las plantas
ang4-2 y ang4-3 no se
modificó, pero el tallo de inflorescencia pareció más fino en
comparación con Col. Para verificar si la mutación de ang4
afectaba solamente a los órganos aéreos, se analizó la velocidad de
crecimiento de las raíces y se comparó con los alelos de Col y los
tipos naturales. El crecimiento de las raíces disminuyó
intensamente en las plantas ang4-1 en
comparación con el tipo natural Ler. Sin embargo, el
crecimiento de las raíces de ang4-2 y
ang4-3 fue similar al del tipo natural Col,
lo que sugiere que la mutación del gen ANG4 no altera el
crecimiento de las raíces en el contexto genético de Col.
Así, el gen ANG4 tiene una función en el
desarrollo de las hojas y de las flores y en el crecimiento de las
raíces.
El mutante, ang4, se obtuvo de la
colección de 255 líneas mutantes inducidas mediante mutagénesis con
EMS (Berna et al., 1999). El objetivo de este trabajo fue
verificar la región de ANG4 delimitada por los marcadores
AFLP, InDel y SNPs y mediante análisis recombinante. El mutante
Ler se cruzó con el tipo natural Col-0, y
los F1s resultantes se dejaron autopolinizar para producir
poblaciones de cartografía F2 (Robles y Micol., 2001). Se
analizaron 320 mutantes F2 junto con sus progenitores Ler y
Col-0 mediante el uso de un grupo estándar de ocho
combinaciones de cebadores de AFLP mostrados en la Tabla 1 para
visualizar 85 marcadores AFLP en el genoma (Peters et al.,
2004). Después de determinar los 85 marcadores AFLP resultantes, se
observó el ligamiento al cromosoma 2 y la ausencia de ligamiento a
otros cromosomas. La Tabla 2 muestra la determinación genotípica
que se realizó mediante el uso de los marcadores AFLP, InDel y SNP.
La presencia del marcador AFLP significa que el marcador se
comporta como el progenitor Col, y está representado en la Tabla 2
con el número 1. Para los individuos F2 esto significa que el
marcador es homocigoto o heterocigoto. La ausencia del marcador
AFLP indica que el marcador es Ler homocigoto, y está
indicado con un número cero (0) en la Tabla 2.
Inicialmente, como se muestra en la Tabla 2, los
recombinantes de F3 670, 227, y 1389 se determinaron como mutantes
homocigotos (100% de ang4), mientras los recombinantes 635,
1472, 1747 y 387, 1607, 1716 se determinaron como heterocigotos (1
ang4: 3 de tipo natural) y homocigotos (100% de Ler),
respectivamente. Durante la meiosis, para el recombinante 1747,
tuvo lugar una recombinación entre los marcadores CER458218 y
CER442324. Este recombinante se usó para delimitar la mutación de
ANG4 desde la parte superior del cromosoma 2, y por lo tanto
el marcador CER442324 se tomó como el marcador superior que limitó
el intervalo de ANG4. En contraste, se dio una recombinación
entre los marcadores CER458218 y CER458219 para los recombinantes
670 y 227, y entre los marcadores CER442324 y CER458218 para los
recombinantes 1389 y entre los marcadores CER442323 y CER458367
para los recombinantes 1472. Todos estos marcadores delimitaron la
mutación de ANG4 desde la parte inferior del cromosoma 2. La
delimitación de la región de ANG4 se hizo bastante difícil
porque el mutante era muy evidente fenotípicamente en el contexto
de Ler y menos evidente tras la recombinación (es decir, fue
difícil determinar el fenotipo en las poblaciones F3 derivadas de
F2).
Para verificar el intervalo de ANG4 de 27
kb, y probablemente reducir esta región a alrededor de 10 a 20 kb,
se repitieron las determinaciones fenotípicas de los F3 de nueve
recombinantes que no fueron muy informativos en la determinación
previa. Se plantaron in vitro treinta semillas de cada
recombinante en medio GM en placas Petri de 150x25 mm replicadas.
Se plantaron 200 semillas de cada recombinante in vivo en
bandejas que contenían 52 pocillos, en las que se plantó una
semilla por cada pocillo. Se realizaron las determinaciones
fenotípicas en cuatro puntos de tiempo durante un período de 4
semanas para determinar si F3 era un mutante homocigoto (100% de
ang4), heterocigoto (1 ang4: 3 de tipo natural) o de
tipo natural homocigoto (100% Ler de tipo natural), y estas
determinaciones se resumen en la Tabla 3, y se comparan con la
determinación previa menos exhaustiva. Los recombinantes 635, 670,
y 1389 se determinaron de forma diferente en comparación con la
determinación previa.
Las primeras determinaciones fenotípicas habían
demostrado que el recombinante 635 era heterocigoto, mientras los
recombinantes 670, 1385, y 1472 eran mutantes homocigotos. La Tabla
3, que indica la nueva determinación fenotípica, revisa estas
primeras determinaciones. El recombinante 227 fue muy difícil de
determinar en la segunda ronda de determinación fenotípica, ya que
fue menos evidente in vitro. Las determinaciones en las
condiciones de cultivo in vivo indicaron que fue un mutante
homocigoto.
Por ejemplo, el recombinante 670 se determinó
como un mutante homocigoto antes, y en la Tabla 3 se determinó como
heterocigoto (1 mutante: 3 de tipo natural). Se decidió, por lo
tanto, que se ignorarían varios recombinantes que no se
determinaron claramente y que por lo tanto no eran muy informativos,
lo que incluye los recombinantes 387, 670, 1389, 1607 y 1716, y que
los recombinantes que se determinaron claramente, tal como se
muestra en la Tabla 4, se usarían para delimitar la mutación de
ANG4. Como se indica en la Tabla 4, el marcador SNP que
delimitó la mutación de ANG4 desde la parte superior del
cromosoma 2 fue CER458218 basándose en el recombinante 227,
mientras el marcador CER458367 delimitó la mutación de ANG4
desde la parte inferior del cromosoma 2 basándose en el
recombinante 1472. Estos marcadores están dentro de una región de 27
kb (26.647 mb). Esta región fue la región mínima delimitada por los
marcadores, mientras la región máxima de ANG4 estuvo entre
CER458219 como marcador superior basándose en los recombinantes 377
y 1775, y CER458367 como marcador inferior basándose en el
recombinante 1472. Las líneas recombinantes que fueron las más
informativas fueron aquellas con una determinación de Ler,
porque Col-0 es una línea consanguínea recombinante
(RIL), y, como tal, cualquier recombinación en ella no indica
necesariamente ligamiento a la mutación de interés tal como se
muestra en la Tabla 4 para el recombinante 635.
La verificación de la mutación de ANG4
tras las determinaciones fenotípicas demostró que, realmente, la
mutación de ANG4 estaba dentro de la región de 27 kb
delimitada mediante determinación genotípica tal como se indica en
la Tabla 2 y en la Figura 6. Dentro de esta región de 27 kb, hay 4
genes intactos, uno de los cuales tiene que ser el gen
ANG4.
El intervalo de ANG4 se determinó a 27 kb
y estuvo flanqueado por los marcadores CER458218 y CER458367. Esto
se basó en el análisis de recombinación de las plantas de F2 de
1062. Se comprobó la región fenotípica del resto de recombinantes
en la generación F3 tanto in vivo como in vitro en 4
puntos de tiempo durante un periodo de 4 semanas. Se determinó la
región de ANG4, y permitió deducir los genotipos de F2. Esta
información genotípica de F2 se integró en la Tabla 4, y el
intervalo de ANG4 se definió en una región de 27 kb que
contenía 4 genes intactos, uno de los cuales tiene que ser el gen
ANG4.
Hay situados cuatro genes candidatos en el
intervalo de 27 kb delimitado mediante el análisis recombinante, y
se enumeran en la Tabla 5 con sus funciones respectivas. Para cada
gen, se amplificó el ADN genómico a partir del mutante ang4
y se comparó con el Ler de tipo natural para determinar el
cambio de bases simples.
Se extrajo el ADN genómico total del mutante
ang4 y de Ler mediante el uso del método CTAB y el
equipo DNeasy Plant Mini. El ADN de Ler actuó como control.
Para el mutante ang4, se amplificaron cuatro genes
candidatos llevando a cabo tres PCR independientes para cada una de
las combinaciones de cebadores (Tabla 9). Se usaron las mismas
combinaciones de cebadores para tres PCR independientes para
amplificar los cuatro genes presentes en el ADN genómico de
Ler. Se diseñaron pares de cebadores para todos los genes
candidatos que amplificaban segmentos solapantes de 800 pb - 1200
pb que abarcaban toda la región de 27 kb (Figura 6; Tabla 9). Se
secuenciaron tres reacciones de PCR independientes de estos
segmentos. Se muestra un ejemplo de esta amplificación mediante PCR
en la Figura 7, en la que cada banda indica el ADN amplificado con
dos grupos de cebadores. Se llevó a cabo la alineación de las
secuencias mediante el soporte informático CLUSTALW 1.8, y se
comparó con el de la planta de tipo natural Ler. Se muestra
un ejemplo de alineación de secuencias en la Figura 8 con el gen
At2g44950. La secuenciación de estos fragmentos y la comparación con
la secuencia de tipo natural Ler identificó un cambio sin
sentido en el gen candidato At2g44950 que generaba un codón de
parada UAG, en vez del codón CAG que corresponde al aminoácido
glutamina en el exón 16 predicho (Figura 9). La alineación de
secuencias de otros genes candidatos, At2g44940, At2g44970 y
At2g44980, no mostró ninguna mutación.
El gen At2g44950 está dentro de la región de 27
kb en el cromosoma 2 junto con los genes At2g44940, At2g44970 y
At2g44980 flanqueados por el marcador CER458218 en la parte superior
del cromosoma 2 y el marcador CER458367 en la parte inferior del
cromosoma 2, tal como se muestra en la Figura 9. Entre estos genes
candidatos, ANG4 es el más grande, y cubre una región de
6298 pb con un marco de lectura abierto (ORF) de 5245 pb; mientras
los genes At2g44940, At2g44970 y At2g44980 cubren 1157 pb con un ORF
de 887 pb, 3337 pb con un ORF de 3020 pb, y 4230 pb con el mismo
número de pares de bases para su ORF, respectivamente. El gen
ANG4 tiene dos regiones sin traducir, una en el extremo 5'
que cubre una región de 344 pb y la otra en el extremo 3' con 307
pb. Consiste en 19 exones y 18 intrones. Una vez que se han cortado
y eliminado los intrones, los exones forman el cADN de tamaño
completo que consiste en 2637 pb y que se traduce a una proteína de
878 aminoácidos (www.arabidopsis.org).
La mutación que se halló en el gen At2g44950
(Figura 8) truncó la proteína de 878 a 844 aminoácidos. Esto
ocurrió como resultado del codón de parada, UAG, que se creó en la
posición 5183 en el ARNm sin corte y empalme y en la posición 2134
en el ARNm con corte y empalme cuando el nucleótido de citosina
cambió a un nucleótido de tirosina que estuvo provocado por la
mutagénesis con EMS.
El gen At2g44950 tiene un motivo de dedos de
zinc de tipo RING que comienza con el aminoácido cisteína en la
posición 826 en la secuencia de aminoácidos y termina con el
aminoácido cisteína en la posición 864 (CKACNDRP
KEVVITKCYHLFCNPCVQKLTGTRQKKCPTC) tal como se muestra en la Figura 10. 18 aminoácidos del motivo de dedos de zinc de tipo RING son parte de los 844 que constituyen la proteína tras la mutación, y 23 aminoácidos del motivo de dedos de zinc de tipo RING se pierden (Figura 9). Esto significa que el motivo de dedos de zinc de tipo RING que funciona como parte de la ligasa E3 se inactivó en el mutante ang4, y que esto podría haber conducido a un defecto en la degradación de varias proteínas en el proteosoma.
KEVVITKCYHLFCNPCVQKLTGTRQKKCPTC) tal como se muestra en la Figura 10. 18 aminoácidos del motivo de dedos de zinc de tipo RING son parte de los 844 que constituyen la proteína tras la mutación, y 23 aminoácidos del motivo de dedos de zinc de tipo RING se pierden (Figura 9). Esto significa que el motivo de dedos de zinc de tipo RING que funciona como parte de la ligasa E3 se inactivó en el mutante ang4, y que esto podría haber conducido a un defecto en la degradación de varias proteínas en el proteosoma.
La clonación molecular de ANG4 demuestra
que la clonación basada en cartografía mediante el uso de marcadores
AFLP es una estrategia fiable para acceder a genes del genoma de
Arabidopsis thaliana. La clonación de ANG4 facilitará
los estudios sobre su función para la mejora de las cosechas.
Las búsquedas en bases de datos revelaron la
presencia de homólogos de At2g44950 en forma de cADN sin
caracterizar o de marcos de lectura abiertos obtenidos de proyectos
genómicos en varios organismos que incluyen Arabidopsis
thaliana, humanos, y arroz. ANG4 tiene un homólogo
cercano en Arabidopsis thaliana localizado en el cromosoma 1
(At1g55250). El análisis de comparación de secuencias indica que
NP_055586 es el ortólogo humano de ANG4 de
Arabidopsis. El genoma humano contiene también un segundo
homólogo de ANG4, AAK58539 (proteína con dedos de zinc de
tipo RING 20), que está codificado por un gen que es distinto del
gen NP_055586 (proteína con dedos de zinc de tipo RING 40). En
Oryza sativa (grupo de la variedad japonica), parece haber
dos homólogos de ANG4 con los números de acceso CAD41603 y
NP922769. La Figura 10 muestra una alineación de los aminoácidos
del mutante ang4 y de sus homólogos en humanos,
Arabidopsis y arroz que reveló un motivo conservado del
Really Interesting New Gene (dedos de zinc de tipo RING) al final de
las secuencias, lo que indica que ANG4 es una proteína
evolutivamente conservada. El dominio de dedos de zinc de tipo RING
se ha clasificado en 20 subgrupos diferentes en Arabidopsis
thaliana (Stone et al., 2005). En estos subgrupos,
ANG4 se clasificó por tener un dominio de unión de ATP. Se
buscó este dominio de unión de ATP (el bucle P) mediante el uso de
Prosite (www.expasy.org/cgi-bin/prosite/S) y no se
halló mediante la homología de ANG4 respecto de las ATPasas
implicadas en la segregación de los cromosomas y en la división
celular. Se realizó la búsqueda de otros motivos funcionales, pero
no se halló otro dominio funcional además del dedo de zinc de tipo
RING.
Hay disponibles varios alelos para el gen
At2g44950 con inserciones de T-DNA de las
colecciones Signal
(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress?GENE= at2g44950&FUNCTION=&TDNA=) y GABI ((http://www.mpiz-koeln.mpg.de/GABI-Kat/db/search.php?type=seq&term=60-K015154-022-276-D08-8409). Las líneas de inserción de T-DNA están disponibles también para el homólogo de ANG4 en Arabidopsis (At1g55250) (Tabla 6 A y B).
(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress?GENE= at2g44950&FUNCTION=&TDNA=) y GABI ((http://www.mpiz-koeln.mpg.de/GABI-Kat/db/search.php?type=seq&term=60-K015154-022-276-D08-8409). Las líneas de inserción de T-DNA están disponibles también para el homólogo de ANG4 en Arabidopsis (At1g55250) (Tabla 6 A y B).
Para examinar el patrón de expresión del gen
ANG4 en los órganos de Ler, se llevó a cabo un
análisis semicuantitativo mediante transcriptasa inversa
(RT)-PCR con diferentes tejidos, que incluían ápices
de brotes, flores, hojas jóvenes, hojas expandidas, cotiledones y
raíces. Se extrajo ARN de diferentes órganos de Ler
congelados y triturados mediante el uso del reactivo TRIZOL (Life
Technologies, Paisley, R.U.) según el protocolo del fabricante. Las
muestras de cADN se estandarizaron con una cantidad de transcrito de
actina (At3g18780) mediante el uso de los cebadores Defle 44 y
Defle 45 con las siguientes secuencias: TGCTGGACGTGACCTTACTG como
cebador directo y GGGCTGGAACAAGACTTCTG como cebador inverso. La
temperatura de fusión para estos cebadores estándar que actuaron
como control en este experimento fue 59ºC para ambos. Para el gen
ANG4, se usaron los siguientes cebadores específicos del
gen: syana_01 como cebador directo y syana_02 como cebador inverso
con las siguientes secuencias: TGCTCGAATCAGATGGAAGA y
AGCTAGCTGACCGCACAAAT, respectivamente. La temperatura de fusión
para syana_01 fue de 59ºC, mientras para syana_02 fue de 60ºC. La
actina es un componente fundamental del citoesqueleto en todos los
eucariotas, y dirige la organización espacial de muchos procesos
subcelulares cruciales. Hightower y Meagher (1986) propusieron que
las seis subclases de actina se han conservado durante la evolución
vascular vegetal, y por lo tanto se pueden usar como referencia para
el análisis de la expresión de otros genes vegetales. La Figura 11
muestra el resultado de un análisis típico de RT-PCR
del patrón de expresión de ANG4 en diferentes órganos de
Ler. Los cebadores Defle 44 y Defle 45 amplificaron un único
producto de PCR de actina de 253 pb, mientras los cebadores syana_01
y syana_02 amplificaron un único producto de PCR de ANG4
predicho de 164 pb. Este análisis demuestra que el gen ANG4
se expresa en todos los órganos estudiados.
El patrón de expresión del gen ANG4 en
todos los órganos de Ler estudiados podría indicar que puede
desempeñar un papel básico en todos estos órganos. La comprensión de
si el gen ANG4 puede estar implicado en otros papeles
posibles sería importante para investigar sus niveles de expresión
en respuesta al tratamiento con hormonas y estrés. Además, el
análisis de la expresión a nivel celular se analizará mediante el
uso de la línea marcadora GFP. La expresión del gen At2g44950 en
todos los órganos significa que es necesario para los procesos
fundamentales o básicos en todos los órganos de la planta y durante
todo el ciclo vital. El análisis celular experimental indicaría
también si la función del gen ANG4 está relacionada con los
procesos de división celular.
Se expresó diferencialmente (DE) un total de
1821 genes en el ápice de plantas jóvenes de ang4 en
comparación con Ler, lo que representa un 8% del genoma de
Arabidopsis. Al comparar estos resultados con los obtenidos en
otros mutantes de hojas estrechas (elo2 y
drl1-2 implicados en procesos independientes
respecto de ang4), 1314 genes parecieron expresarse
diferencialmente de forma específica en ang4 (Figura 12).
Considerando el nivel de expresión, 494 genes son DE en un umbral de
variación de la expresión del doble. El número de genes regulados
por ANG4 es mayor que aquellos regulados por los genes
DRL1 y ELP1, mutados respectivamente en los mutantes
drl1-2 y elo2, lo que demuestra la
función general de ANG4 en el desarrollo.
La mayoría de los genes regulados por
ANG4 están implicados en la citocinesis y en el ciclo
celular. Una lista parcial de los genes DE en ang4 demuestra
que 24 genes del ciclo celular y 27 genes relacionados con los
microtúbulos y la miosina están regulados en el mutante ang4
(Tabla 7). Entre éstos, se encuentran 8 genes relacionados con el
complejo E2F-DP que regula la transición de G1 a S
en las plantas (De Veylder et al., 2003). Ocho genes de
ciclinas de tipo A y B y 3 genes de cinasas dependientes de ciclinas
de tipo B implicados en la transición de G2 a M en el ciclo celular
están inhibidos en el genotipo de ang4. Las cinesinas representan
una superfamilia de proteínas motoras de los microtúbulos implicadas
en el trasporte de vesículas y orgánulos, la formación y elongación
del huso, la segregación de los cromosomas, la dinámica y la
morfogénesis de los microtúbulos (Reddy y Day, 2001). Entre los 61
genes de cinesina identificados en el genoma de Arabidopsis, 19
están inhibidos en ang4, los TETRASPORE implicados en
la formación de tétradas de microesporas tras la meiosis (Yang
et al., 2003). El gen HINKEL, otra cinesina, desempeña
un papel en la reorganización de los microtúbulos del fragmoplasto
durante la formación de la placa celular (Strompen et al.,
2002). Otros genes relacionados con la citocinesis son también DE
en ang4, como los componentes del citoesqueleto actina 8,
tubulinas, proteínas similares a miosina y proteínas asociadas a los
microtúbulos. El gen PLEIADE, que tiene una función en la
estabilización de las estructuras citocinéticas de la placa celular
durante la citocinesis, también está inhibido en el mutante
ang4 (Muller et al., 2002). El gen KNOLLE, una
sintaxina regulada por el ciclo celular implicada en la fusión de
membranas en la citocinesis, también está reprimida en ang4
(Muller et al., 2003). El gen SIAMESE, necesario para
coordinar la división celular y la diferenciación celular durante
el desarrollo de tricomas y que puede funcionar como un represor de
la mitosis en el ciclo celular de endorreduplicación, está
estimulado en ang4. Estos resultados sugieren la implicación
del gen ANG4 en la regulación del ciclo celular.
Algunos genes relacionados con el desarrollo
vegetal están regulados también por la expresión del gen ANG4
(Tabla 8). El gen GLABRA1 es un factor de transcripción MYB
que especifica el destino celular primario durante el desarrollo de
pelos epidérmicos en Arabidopsis (Schiefelbein, 2003). Los genes
homeocaja KNAT2 y KNAT6 tienen un papel en la
iniciación y el mantenimiento del meristemo (Tsiantis y Hay, 2003).
Se sabe que los genes NAM y AINTEGUMENTA están
implicados en la iniciación y la separación de los órganos (Traas y
Vernoux, 2002). En Arabidopsis, SCARECROW (SCR) es
esencial para la división asimétrica de la célula progenitora de la
corteza/endodermis en la raíz (Kamiya et al 2003). Los genes
relacionados con las auxinas son DE en ang4: un factor de
transcripción putativo sensible a auxina ARF1 y una permeasa
putativa similar a AUX1, un regulador del gravitropismo de la raíz
(Liscum y Reed, 2002).
Se analizó el efecto de la mutación de
ang4 sobre el desarrollo de las hojas y la duración del ciclo
celular mediante un análisis cinemático en el primer par de hojas
de plantas cultivadas in vitro. El área de las hojas fue
similar en Ler y en el mutante ang4-1
en las primeras observaciones. Sin embargo, el incremento del área
de las hojas fue más lento en ang4-1 en
comparación con Ler entre 5 y 8 DAS (Figura 13A). En la
madurez, el área de las hojas de ang4-1 fue
de alrededor del 47% de la de Ler, con 11 y 24 mm^{2},
respectivamente. Durante el mismo periodo, el número de células por
hoja se incrementó también más rápido en Ler que en
ang4-1 (Figura 13B). Así, en la madurez
(después de 18 DAS), las hojas de ang4-1
contuvieron solamente un 48% del número de células epidérmicas de
Ler. Las diferencias en la velocidad de incremento del área
de las hojas y del número de células deben ser debidas a efectos
sobre la expansión celular y la división celular, respectivamente.
De hecho, entre 5 y 10 DAS, la velocidad de división celular y la
velocidad relativa de expansión de las hojas (RLE) fueron menores en
ang4-1 en comparación con Ler, pero
disminuyeron más lentamente en el mutante (Figuras 13 C y D). En
consecuencia, la velocidad de división celular y la velocidad de
RLE se hicieron similares en ang4-1 y
Ler a partir del 10 DAS y a lo largo de la fase de expansión
hasta que ya no se dividió ninguna célula en el 15 DAS. La expansión
continuó tanto en Ler como en ang4-1
hasta el 18 DAS, cuando la hoja alcanzó la madurez. Así, la mutación
de ANG4 altera la división celular y la expansión de las
hojas solamente durante la etapa temprana del desarrollo de las
hojas.
En esta etapa, las células de
ang4-1 fueron mayores que en Ler, con
un área celular media de 82 \mum^{2} y 54 \mum^{2},
respectivamente, en el día 5 (Figura 13E). Después de 7 DAS, no se
pudo observar ninguna diferencia en el área celular en las etapas
posteriores entre ang4-1 y Ler, lo que
demuestra que el equilibrio entre las velocidades de división y de
expansión es el mismo en ang4-1 y en
Ler.
Debido a que las divisiones finales dan lugar a
los estomas, el índice de estomas (SI) indica la salida del ciclo
celular y el final de la actividad de proliferación, que comienza
desde la punta hacia la base de la hoja en Arabidopsis [De Veylder,
2001]. El SI se incrementó también más lentamente en
ang4-1 en comparación con Ler entre 5
y 8 DAS, lo que dio como resultado que el SI final en las hojas
maduras fuera menor, con 0,23 de media para
ang4-1 y 0,35 para Ler (Figura 13F).
Estos datos validan los datos previos que demuestran que la
mutación de ANG4 disminuye la actividad de división celular
en la etapa temprana del crecimiento de las hojas sin modificar la
duración de las fases de proliferación y de expansión. En el 5 DAS,
la duración media del ciclo celular, que es la inversa de la
velocidad de división celular, fue casi un 50% más larga en
ang4-1 (20,6 h) que en Ler (14,1 h), y
fue más larga hasta el 11 DAS, cuando la duración del ciclo celular
fue la misma en ambos genotipos (48,4 h y 50,7 h para Ler y
ang4-1, respectivamente).
Para investigar más profundamente el efecto de
la mutación de ang4 sobre la progresión del ciclo celular,
se analizaron hojas de tipo natural y mutantes por medio de
citometría de flujo. El nivel de ploidía del primer par de hojas se
determinó durante todo el desarrollo de las hojas de tipo natural y
mutantes para revelar cambios en la duración relativa de la fase
G1/G2 durante la división celular mitótica y en el ritmo y cantidad
de endorreduplicación en el mutante
ang4-1.
En el 8 DAS, cuando se pudieron recoger por
primera vez las hojas, se observó un cambio en las poblaciones
G1-a-G2 en el mutante
ang4-1 en comparación con Ler (Figura
14). En el mutante, la población de células de 4C es similar a la
de 2C (ang4-1; 2C = 46,2%, 4C = 44,0%),
mientras en el tipo natural el número de células de 4C es solamente
la mitad del de 2C (Ler; 2C = 66,2%, 4C = 33,8%), lo que
sugiere que la duración incrementada del ciclo celular está
asociada a un bloqueo en el punto de transición
G2-a-M del ciclo celular en
ang4-1. La salida de la mitosis coincidió con
el comienzo de los endociclos, y se pudo observar mediante el
incremento del contenido de 4C y la aparición de niveles más
elevados de ploidía (8C, 16C). La actividad del ciclo celular
finalizó, tal como se pone de manifiesto mediante una distribución
estable de ADN, alrededor del 18 DAS, coincidiendo con el final del
crecimiento. El endociclo se incrementó en el mutante
ang4-1 desde la etapa más temprana ya con un
10% de las células en 8C en el 8 DAS, mientras este nivel de 8C se
alcanzó solamente en el 13 DAS en Ler. La consecuencia fue
un nivel superior de ploidía en ang4-1. En
las hojas maduras, más de un 4% de las células contuvieron un nivel
de ploidía de 32C en el mutante ang4-1,
mientras el nivel de ploidía en las hojas maduras de Ler
alcanzó solamente 16C. La salida del endociclo ocurrió en la misma
fecha tanto para ang4-1 como para Ler,
en el 18 DAS. Así, cuando ANG4 muta, las células se detienen
en la fase G2/M del ciclo celular y en cambio continúan en los
endociclos. Se postula que la proteína ANG4 tiene una función en la
degradación de un/varios regulador(es) del ciclo celular que
actúan en la transición G2-M del ciclo celular
durante el crecimiento temprano de los órganos.
Para confirmar que estos efectos no fueron
específicos de las hojas, se llevó a cabo una citometría de flujo
con las raíces, hipocótilos y primeras hojas en un momento del
desarrollo (12 DAS). Los niveles de ploidía obtenidos para la raíz y
los hipocótilos fueron comparables a los de las primeras hojas, lo
que indica que ANG4 afecta al ciclo celular durante todo el
desarrollo de la planta.
El perfil de la citometría de flujo del alelo
angl, GABI_634H04, difiere del control Col y es similar, pero más
débil, que el de ang4: más endopoliploidía (presencia de 32C),
ligero cambio en las poblaciones celulares de
G1-a-G2 (número reducido de células
2C y número incrementado de células 4C). El análisis mutacional del
alelo angl indica que ANGL (At1g55250) también es funcional y podría
tener una redundancia funcional con el gen ANG4 (At2g44950).
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Las observaciones fotográficas de las plantas
con sobreexpresión de ANG4 (T1) indican de forma evidente que
las plantas tienen un rendimiento mejorado del crecimiento en
comparación con las plantas de tipo natural. Por ejemplo, el tamaño
de las hojas de las rosetas de las plantas con sobreexpresión está
considerablemente incrementado, tal como se puede observar en la
Figura 15.
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<120> MODULACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS
VEGETALES
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<151>
18-08-2004
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<160> 54
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<170> PatentIn versión 3.1
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<213> Arabidopsis thaliana
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (826)..(864)
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RING
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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\newpage
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<400> 43
\hskip1cm
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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\hskip1cm
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador usado para la amplificación
y la secuenciación de genes candidatos de ANG4 (tabla 9)
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<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de Ang alineada en la Fig.
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
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<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de Ler alineada en la Fig.
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AAP36593.1 en la Fig. 10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 975
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AAK58539_RFP_20 en la Fig. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CAD41603.3 en la Fig. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 899
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MIPS_A1g55250 en la Fig. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1001
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NP055586_RFP_40 en la Fig. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NP922769.1 en la Fig. 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (2)
1. El uso de un ácido nucleico que codifica una
proteína que comprende SEQ ID Nº:2, o un fragmento funcional de la
misma, que tiene actividad de ubiquitina proteína ligasa E3 unido de
manera operable a un promotor adecuado para la expresión en plantas
para incrementar la biomasa en las hojas.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho ácido nucleico se sobreexpresa.
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