ES2329117T3 - Alivio de los deficits de memoria y los componentes de la memoria de disfunciones psiquiatricas alterando la actividad de la pkm atipica. - Google Patents

Abstract

Método de identificación de una sustancia que afecta a un problema de la memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en un mamífero no humano que comprende: (a) determinar si dicha sustancia que va a administrarse a dicho mamífero no humano altera la expresión o la actividad de una proteína aPKMxi en el sistema nervioso central de dicho mamífero no humano en comparación con la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en el sistema nervioso central en ausencia de dicha sustancia, estando dicha proteína aPKMxi asociada con dicho problema de la memoria a corto plazo o dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica en dicho mamífero no humano; y (b) indicar que dicha sustancia afecta a dicho problema de la memoria a corto plazo o a dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica cuando la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en presencia de dicha sustancia difiere de la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en ausencia de dicha sustancia.

Description

Alivio de los déficits de memoria y los componentes de la memoria de disfunciones psiquiátricas alterando la actividad de la PKM atípica.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades mentales son significativas por su efecto debilitante sobre los individuos que padecen sus manifestaciones. El resto de la sociedad se ve afectada de manera significativa porque deben proporcionar atención a los individuos que están aquejados de estas enfermedades. Los deterioros mentales que resultan de tales acontecimientos como ataques son también significativos por sus consecuencias adversas para los individuos que sufren sus efectos debilitantes. Los déficits de memoria en los individuos tienen consecuencias graves para ellos y para otros con los que interaccionan. Aunque se ha dedicado mucho esfuerzo en un intento por superar estas enfermedades, sigue habiendo grandes deficiencias en la capacidad para entenderlas y tratarlas de manera eficaz. Están buscándose constantemente modalidades de tratamiento adicionales. En particular, las bases bioquímicas para estas enfermedades o estados siguen siendo en gran parte desconocidas y el conocimiento de estas bases fomentará descubrimientos de fármacos adicionales.

Todas estas enfermedades o estados tienen un componente de la memoria significativo. Esto es particularmente cierto, obviamente, cuando la pérdida de memoria o una memoria anómalamente mala es el principal o único síntoma. Conocer las moléculas bioquímicas que participan de manera central en la memoria conducirá a métodos y composiciones que reducen las anomalías de la memoria y aliviarán las enfermedades mentales o disfunciones psiquiátricas al dirigirse al componente de la memoria de estas enfermedades o disfunciones.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos de identificación de sustancias que pueden afectar a un problema de la memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en mamíferos no humanos. En estos métodos, una sustancia en examen ha de administrarse a un mamífero no humano. Entonces se determina si la sustancia altera la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central del mamífero no humano en comparación con la expresión o la actividad de la misma proteína en ausencia de la sustancia. Si hay una diferencia en tal expresión o actividad, y la proteína aPKM\zeta está asociada con un defecto en la memoria o una disfunción psiquiátrica dada, la sustancia afecta a ese defecto o disfunción. La parte de la disfunción psiquiátrica que se ve afectada cuando la sustancia altera la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta es el componente de formación de la memoria de la disfunción. En casos particulares, un aumento en la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta cuando se administra la sustancia es indicativo de que la sustancia potenciará el componente de formación de la memoria de la disfunción. Por el contrario, una disminución en la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta cuando se administra la sustancia es indicativa de que la sustancia interferirá con el componente de formación de la memoria de la disfunción.

En una realización preferida del método de la invención el problema de la memoria a corto plazo resulta del envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer o neurodegeneración, y la disfunción psiquiátrica es un trastorno seleccionado del grupo que consiste en trastorno por déficit de atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo y fobias.

Además, el método de la invención se caracteriza preferiblemente porque un aumento en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia no está presente, es indicativo de una potenciación de la formación de la memoria a corto plazo de dicho problema de la memoria a corto plazo o el componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.

Además se prefiere un método en el que una disminución en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia no está presente, es indicativa de una interferencia en la formación de la memoria a corto plazo normal o el componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Potenciación de la memoria mediante MaPKM\zeta en Drosophila. Potenciación de la memoria mediante inducción por choque térmico tras el entrenamiento de dos líneas independientes que portan un transgén hsp70-MaPKM\zeta. Se sometieron las moscas a un entrenamiento de un solo ciclo, se dejó que se recuperaran a 25ºC y se indujo el transgén de MaPKM\zeta con un choque térmico a 32ºC de 30 min. Se midió el comportamiento 24 h más tarde. La inducción de la línea 14 y el control de tipo natural (WT, wild-type) comenzaron 1 h después de terminar el entrenamiento, y la inducción de la línea 43 comenzó 30 min. después del entrenamiento. Ambas líneas muestran claros efectos de inducción (n = 8 para todos los grupos). Las barras de error representan el error estándar de la media y, a menos que se indique, los asteriscos indican la significación estadística calcula usando ANOVA y la prueba de Dunnet durante todo este trabajo.

Figura 1B. Especificidad temporal de la potenciación de la memoria mediante MaPKM\zeta. Se sometieron las moscas transgénicas para MaPKM\zeta (línea 14) a un choque térmico a 25-32ºC de 30 min. en diversos momentos antes y después de un solo ciclo de entrenamiento, y se sometieron a prueba para determinar la memoria a las 24 h. Histogramas de izquierda a derecha: el choque térmico finalizó 1 h antes, 30 min. después, 1 h después o 2 h después de que comenzara el entrenamiento; el choque térmico comenzó 30 min., 1 h después o 2 h después de que finalizara el entrenamiento, respectivamente, n = 8 para todos los grupos.

Figura 2A. La potenciación de la memoria requiere una actividad cinasa persistente y no se debe a la potenciación sensorial. Ni un mutante cinasa-inactivo (KI, kinase-inactive) de MaPKM\zeta ni una MaPKC\zeta de longitud completa (FL, full-length) potencian la memoria a las 24 h. Se evaluaron dos líneas independientes (FL-3A, FL-14A) del transgén hsp70-MaPKC\zeta de longitud completa (Métodos) y dos líneas independientes (KI-1 y KI-2) de un transgén hsp70-KI-MaPKM\zeta para determinar la potenciación de la memoria. El mutante KI-MaPKM\zeta (K281W) perturba la actividad cinasa alterando el dominio de unión a ATP. Se usaron dos programas de choque térmico diferentes: una inducción a 32ºC de 30 min., 3 h antes del entrenamiento, o un choque térmico a 32ºC de 30 min., aplicado 30 min. tras la finalización del entrenamiento. Ningún régimen de choque térmico produjo una potenciación dependiente de la inducción de la memoria a las 24 h en ninguna de esas líneas.

Figura 2B. La potenciación de la memoria requiere una actividad cinasa persistente y no se debe a la potenciación sensorial. La inducción de MaPKM\zeta no afecta a los comportamientos periféricos. Se sometieron las moscas a un choque térmico a 32ºC de 30 min., se dejó que se recuperaran durante 1 h, después se sometieron a prueba para determinar la reactividad al choque. Se sometió a prueba la agudeza olfativa exponiendo las moscas a un choque térmico a 32ºC de 30 min., y se sometió a prueba para determinar la agudeza olfativa 24 h más tarde. La leyenda insertada en el panel de agudeza olfativa es de aplicación a ambos conjuntos de histogramas. En todas las medidas, ambas líneas de MaPKM\zeta (14 y 43) no podían distinguirse de los controles de tipo natural. El control más crítico es la prueba de agudeza olfativa de 10^{-2}, y para ello se expusieron a choque térmico (o no) las moscas transgénicas, se almacenaron y se sometieron a prueba simultáneamente con sus respectivos controles de tipo natural. Ambos conjuntos de controles de tipo natural, adyacentes a sus homólogos transgénicos, se incluyeron para la comparación directa.

Figura 3A. Expresión y análisis bioquímicos de líneas transgénicas. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de inducción de MaPKM\zeta y MaPKC\zeta tras el choque térmico. Se sometieron las moscas a choque térmico (32ºC o 37ºC) durante 30 min. Parte superior, inmunotransferencia de tipo Western con transcurso de tiempo de ambas líneas de MaPKM\zeta. En los momentos indicados, se recogieron las moscas y se usaron extractos de cabeza para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Parte central, comparación directa de la inducción conseguida a 32ºC frente a 37ºC. En cada caso, se sometieron las moscas a choque térmico durante 30 min., y se prepararon extractos de cabeza tras 3 h de tiempo de recuperación. Parte inferior, comparación directa de la expresión de la MaPKM\zeta (línea 14), la MaPKM\zeta cinasa-inactiva (KI) (KI-1) y la MaPKC de longitud completa (FL) (FL-14A). Para cada inmunotransferencia de tipo Western, se cargaron cantidades equivalentes de proteína total (cinco cabezas por carril) en cada carril.

Figura 3B. Expresión y análisis bioquímicos de líneas transgénicas. La inducción de MaPKM\zeta da como resultado un aumento en la actividad de PKC atípica en extractos de cabeza de mosca. Se sometieron las moscas transgénicas para MaPKM\zeta (línea 43) a un choque térmico a 37ºC durante 30 min., se dejó que se recuperaran a 25ºC durante 1 h y se congelaron en nitrógeno líquido. Las moscas control permanecieron a 25ºC todo el tiempo. Se prepararon extractos de proteína total a partir de cabezas de mosca y se sometieron a ensayo para determinar la actividad de PKC. Pudo detectarse un aumento en la actividad cinasa (-Ca^{2+}/- PMA: HS+ frente a -HS, p = 0,0057, n = 4; +Ca^{2+}/+PMA: HS+ frente a -HS, p = 0,0011, n = 4: prueba de la t de Student) con un choque térmico fuerte (37ºC) pero no con uno suave (32ºC) (datos no mostrados). Los niveles de inducción son mucho mayores a 37ºC frente a 32ºC (a).

Figura 4A. La inducción de MaPKM\zeta potencia la memoria a los 4 días tras un entrenamiento masivo, pero no tras uno espaciado. La inducción de MaPKM\zeta tras un entrenamiento masivo potencia la memoria a los 4 días. Se entrenaron las moscas con MaPKM\zeta con 10 ciclos de entrenamiento masivo, se dejó que descansaran durante 30 min., después se sometieron a un choque térmico de 30 min. (32ºC). Se midió el comportamiento a los 4 días; n=8 para todos los grupos. Ambas líneas (14 y 43) muestran una mejora dependiente de la inducción significativa de la memoria a los 4 días. A los 4 días, la memoria inducida mediante el entrenamiento masivo ha decaído normalmente de modo que PI = 0, tal como es el caso para las moscas no inducidas (-HS).

Figura 4B. La memoria a los cuatro días producida por el entrenamiento espaciado no mejora mediante la inducción de MaPKM\zeta. Se entrenaron las moscas con MaPKM\zeta con 10 ciclos de entrenamiento espaciado (Métodos), se dejó que descansaran durante 30 min. y se sometieron a un choque térmico a 32ºC de 30 min. Se midió la memoria 4 días tras el entrenamiento. n = 8 para todos los grupos. Ninguna línea muestra un efecto significativo de la inducción del transgén sobre la memoria tras el entrenamiento espaciado. Para descartar un efecto de saturación, también se entrenó a las moscas con un número submáximo de ensayos espaciados (7), pero la inducción del transgén todavía no tuvo ningún efecto (datos no mostrados).

Figura 5. La inducción de MaPKM\zeta corrige el déficit de memoria de mutantes rábano. Se aparearon hembras rábano homocigóticas con machos homocigóticos para un transgén de MaPKM\zeta autosómico. (Se usó la línea 43 en este experimento.) Se entrenó la progenie macho y hembra de este apareamiento y se sometieron a prueba conjuntamente, proporcionando un control interno, y entonces se contaron por separado para generar valores de PI específicos del sexo. Los genotipos de los machos y de las hembras se facilitan debajo del histograma. Usando la prueba de Dunnet con hembras no inducidas como grupo control, el único grupo que muestra un comportamiento estadísticamente diferente es el de los machos no inducidos (indicado por el asterisco). El análisis de grupos HS+ frente a HS usando la prueba de la t de Student muestra que tanto los machos como las hembras presentan diferencias significativas en el comportamiento por la inducción del transgén (indicado por #).

Figura 6A. Un homólogo de Drosophila de MaPKM\zeta está presente y activo en extractos de cabeza de Drosophila. Los antisueros frente a MaPKC/M\zeta detectan DaPKC y DaPKM. Se analizaron extractos separados de cabezas y cuerpos de mosca en inmunotransferencias de tipo Western usando antisueros dirigidos frente a los 16 aminoácidos C-terminales de MaPKC/M\zeta. Los pesos moleculares de las dos bandas inmunorreactivas concuerdan con los predichos para las isoformas DaPKC (73 kDa) y DaPKM (55 kDa). La DaPKM putativa está enriquecida en cabezas. Figura 6B. Péptidos específicos para DaPKC compiten con la inmunorreactividad de DaPKC y DaPKM. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western en extractos de cabeza. Se añadió el antisuero junto con un exceso de 0,1, 10, 100 ó 1000 veces de péptido DaPKC-590. Este péptido se deriva del extremo C-terminal de la proteína DaPKC. Se preparó el antisuero frente al extremo C-terminal de MaPKC\zeta, que es homólogo a la proteína DaPKC. Un péptido derivado de una región de DaPKC en el sentido de 5' (545) no compite con la inmunorreactividad incluso a un exceso de 1.000 veces.

Figura 6C. La actividad de PKC atípica está enriquecida en extractos preparados a partir de cabezas de Drosophila. Se prepararon extractos separados a partir de cabezas y cuerpos de mosca de tipo natural tal como en (a). Se sometieron a ensayo para determinar la actividad aPKC tal como en la figura 2b.

Figura 7A. El tratamiento con queleritrina o la expresión de KI-MaPKM\zeta inhibe la memoria a las 24 h producida por entrenamiento masivo, pero no el aprendizaje, en Drosophila. La queleritrina inhibe la memoria a las 24 h tras el entrenamiento masivo de una manera dependiente de la dosis. Se alimentaron las moscas de tipo natural o bien con sacarosa (0 \muM) o queleritrina 25 \muM, 50 \muM o 100 \muM en una disolución de sacarosa. Se les dieron tres ciclos de entrenamiento masivo y se les evaluó para determinar la memoria a las 24 h. n = 8 para todos los grupos.

Figura 7B. El mutante KI-MaPKM\zeta inhibe la memoria a las 24 h producida por el entrenamiento masivo. Se indujo cada línea del transgén hsp70-KI-MaPKM\zeta (KI-1 y KI-2) con un choque térmico a 37ºC, de 30 min., se dejó que se recuperaran durante 3 h a 25ºC, y después se les dio 10 ciclos de entrenamiento masivo. La inducción de la línea KI-1 provocó una reducción significativa en la memoria a las 24 h, y las moscas KI-1 inducidas también eran significativamente diferentes de las moscas control inducidas (WT, HS+). La inducción de la línea KI-2 también parece reducir la memoria, pero esta línea puede no ser tan eficaz como KI-1. n = 8 para todos los grupos.

Figura 7C. Ni la inducción de queleritrina ni de KI-MaPKM\zeta afecta al aprendizaje. Tras un periodo de ayuno de 1 h, se alimentó a las moscas de tipo natural con o bien sacarosa (0 \muM) o bien queleritrina 100 \muM en una disolución de sacarosa durante 3 h. Se indujo el KI-MaPKM\zeta tal como en (b). En ambos casos, se les dio entonces a las moscas un entrenamiento de un solo ciclo y se les sometió a prueba inmediatamente tras el entrenamiento para evaluar el aprendizaje. No hubo diferencia entre los grupos relevantes: las moscas alimentadas con sacarosa no eran diferentes de las moscas alimentadas con queleritrina, y las moscas WT HS+ no eran diferentes de las moscas KI-1 HS+ o KI-2 HS+. n = 8 para todos los grupos.

Figura 8A. La inducción de DaPKM potencia la memoria. DaPKM potencia la memoria a las 24 h tras un entrenamiento de un solo ciclo. Se les dio a las moscas un entrenamiento de un solo ciclo, se dejó que se recuperaran a 25ºC durante 30 min., y se indujo el transgén de DaPKM mediante un choque térmico a 32ºC que duró 30 min. Se midió el comportamiento 24 h más tarde. Se sometieron a prueba tres líneas transgénicas independientes (FI9, M40 y M78). n = 8 para todos los grupos. Los asteriscos indican diferencias significativas.

Figura 8B. DaPKM potencia la memoria a los 4 días tras el entrenamiento masivo. Se entrenaron moscas DaPKM-M78 con 10 ciclos de entrenamiento masivo, se dejó que se recuperaran durante 30 min. a 25ºC, y se indujeron como en (a). Se midió el comportamiento a los 4 días; n = 8 para todos los grupos. Sólo se usó la línea M78 para este análisis y muestra una mejora dependiente de la inducción significativa de la memoria a los 4 días.

Figura 8C. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la inducción de DaPKM tras un choque térmico. Se sometieron las moscas a un choque térmico (32ºC) durante 30 min. Parte izquierda, inmunotransferencias de tipo Western con transcurso de tiempo de la línea DaPKM-M78. En los momentos indicados, se recogieron las moscas y se usaron extractos de cabeza para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Todos los tiempos son en relación con el final del tratamiento por choque térmico. Parte derecha, comparación directa de la inducción de las líneas M40 y M78. En ambos paneles, la banda superior es una banda de fondo incluida como una referencia de control de la carga.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a métodos de alivio de problemas de la memoria y disfunciones psiquiátricas en mamíferos no humanos modulando la expresión o la actividad de una forma truncada de una proteína aPKC\zeta en el sistema nervioso central del mamífero no humano. La expresión de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta se modula afectando a procesos moleculares de transcripción, estabilidad de ARNm, estabilidad de proteínas, procesamiento proteolítico e iniciación de la traducción. La actividad de la proteína se modula mediante modificaciones postraduccionales en la proteína, interacciones proteína:proteína y ubicación subcelular de la proteína.

La modulación de la expresión se produce cuando la cantidad de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta difiere de la cantidad que está presente sin modulación. Puede haber un aumento en la cantidad de forma truncada de la proteína aPKC\zeta, una disminución en la cantidad de forma truncada de la proteína aPKC\zeta, o una variación con respecto a un intervalo de tiempo definido de un aumento y/o una disminución en la cantidad de forma truncada de la proteína aPKC\zeta. Por ejemplo, la cantidad de forma truncada de la proteína aPKC\zeta puede aumentar de modo lineal o no lineal con respecto al tiempo, disminuir de modo lineal o no lineal, o de manera alternante aumentar y disminuir, de manera lineal o no lineal. Generalmente se prefiere un aumento en la cantidad de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta, o en la cantidad de una forma inhibidora de la proteína, de modo lineal o no lineal, para el alivio de disfunciones psiquiátricas.

La proteína que se forma mediante el proceso de expresión en esta invención es una forma truncada de una proteína aPKC\zeta. Esta proteína se produce o bien mediante síntesis de la proteína de longitud completa, seguido por procesamiento proteolítico, o bien mediante síntesis de novo de la forma truncada de la proteína, aPKM\zeta. Esta síntesis de novo puede producirse a partir de los sitios de iniciación de la transcripción ubicados en regiones intrónicas del gen, y/o la iniciación de la traducción a partir de codones de metionina internos.

La modulación de la expresión de la forma truncada de una proteína aPKC\zeta puede producirse o bien mediante una inducción o bien mediante una inhibición de la expresión de la forma truncada. Cuando se produce la inducción de la expresión, se produce más de la forma truncada que cuando esta inducción no está presente. Cuando se produce la inhibición de la expresión, se produce menos de la forma truncada que cuando esta inhibición no está presente. En determinadas condiciones, una cantidad dada de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta puede producirse normalmente. En estas condiciones, la inducción de la expresión aumenta la cantidad de la forma truncada que se produce y la inhibición de la expresión reduce la cantidad de la forma truncada que se produce a partir de esta cantidad dada. En estos casos, la modulación de la expresión de la forma truncada provoca un aumento, una disminución, o un aumento y una disminución alternantes, de manera lineal o no lineal, a partir de la cantidad dada que está presente normalmente.

La forma truncada preferida de la proteína aPKC\zeta es aPKM\zeta. Ésta es la forma truncada de la isozima PKC\zeta atípica que carece del dominio regulador N-terminal de la proteína PKC\zeta. El dominio regulador N-terminal contiene una región pseudosustrato así como sitios de unión para los cofactores requeridos. La aPKM\zeta, que carece de este dominio regulador N-terminal, contiene el dominio catalítico C-terminal y es una cinasa activa de manera persistente derivada de la isozima aPKC\zeta. Se prefieren la inducción de la expresión de la proteína aPKM\zeta o la inhibición de la expresión de la proteína aPKM\zeta en esta invención para aliviar trastornos psiquiátricos. De éstas, la inducción de la expresión es la más preferida.

Los problemas de la memoria normales pueden aliviarse modulando la expresión o la actividad de aPKM\zeta. Estos problemas de la memoria pueden resultar del envejecimiento normal, una lesión traumática en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer y neurodegeneración. Los trastornos de memoria clásicos incluyen la pérdida o la falta de capacidad para recordar acontecimientos o experiencias pasados específicos. La pérdida o la falta de capacidad para realizar asociaciones apropiadas o normales entre estos acontecimientos previos o experiencias pasadas se incluye también en estos trastornos. Estos trastornos incluyen también la pérdida o la falta de capacidad para realizar asociaciones apropiadas o normales entre acontecimientos previos o experiencias pasadas y experiencias o funciones cognitivas actuales. La pérdida de memoria a corto plazo y la pérdida de memoria a largo plazo son déficits de memoria particulares que se incluyen en estos trastornos. Las pérdidas de memoria a corto plazo son la pérdida o falta de capacidad para recordar o realizar asociaciones correctas o apropiadas entre percepciones actuales y experiencias o acontecimientos recientes. Las pérdidas de memoria a largo plazo son la pérdida o falta de capacidad para recordar o realizar asociaciones correctas o apropiadas entre percepciones actuales y experiencias o acontecimientos que se percibieron tiempo atrás por el individuo. La distinción entre la memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo varía con la especie animal, la tarea conductual y el régimen de entrenamiento, y generalmente la conocen las personas para las que esta distinción es importante. Para todos los animales, la memoria a largo plazo es la fase de memoria cuya inducción es sensible a los inhibidores de la síntesis de proteínas proporcionados de manera aguda aproximadamente durante el tiempo de entrenamiento. La memoria a largo plazo es todas las fases de memoria que son resistentes a tales inhibidores. Generalmente, las memorias a corto plazo duran desde minutos, hasta horas y unos pocos días tras el entrenamiento, mientras que las memorias a largo plazo persisten durante periodos de tiempo más largos.

Muchos problemas de la memoria y disfunciones psiquiátricas pueden aliviarse modulando la expresión de aPKM\zeta en animales. El alivio de una disfunción psiquiátrica dada se produce cuando los síntomas de la disfunción se reducen y el individuo muestra modos y patrones de comportamiento más normales. En determinados casos, y deseados habitualmente, el alivio de una disfunción psiquiátrica dada se completa esencialmente y el individuo muestra un comportamiento normal. En casos poco comunes, el individuo muestra rasgos de comportamiento normales antes de modular la expresión de proteína aPKM\zeta. En estas circunstancias, se busca un comportamiento mejor que el normal y la expresión de la forma truncada se modula para conseguir este resultado.

Entre los problemas de la memoria que pueden aliviarse modulando la expresión de aPKM\zeta están los que resultan del envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer o neurodegeneración. Entre las disfunciones psiquiátricas que pueden aliviarse modulando la expresión de aPKM\zeta están el trastorno por déficit de atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo y fobias.

La memoria se ve afectada por la modulación de la expresión de la proteína aPKM\zeta. Dependiendo de la isoforma de la proteína que se modula, las memorias pueden potenciarse o bloquearse. La aPKM\zeta parece tener un efecto evidente sobre la memoria a corto plazo cuando se modula su expresión. La memoria a corto plazo mejora cuando se induce la expresión de aPKM\zeta.

Sin restringirse a ningún mecanismo de acción, parece que las disfunciones psiquiátricas que se alivian modulando la expresión de una forma truncada de aPKM\zeta en el sistema nervioso central del animal se ven ayudadas o mitigas porque la modulación afecta al componente de formación de la memoria de la disfunción psiquiátrica. Realizando los cambios apropiados en el componente de formación de la memoria, los síntomas de la disfunción psiquiátrica se reducen y la disfunción psiquiátrica se altera de una manera favorable. En muchos casos, es el componente de la memoria a corto plazo de las disfunciones psiquiátricas el que se ve afectado modulando la expresión de la proteína aPKM\zeta. La inducción de la expresión de la aPKM\zeta provoca una potenciación del componente de la memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica. La inhibición de la expresión o actividad de aPKM\zeta provoca una interferencia con el componente de la memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica. O bien una potenciación o bien una interferencia con el componente de la memoria a corto plazo puede aliviar una disfunción psiquiátrica dada. Se empleará cualquier proceso que se desee para aliviar la disfunción psiquiátrica. Por ejemplo, cuando un individuo muestra una falta o pérdida de capacidad de memoria a corto plazo, puede inducirse la expresión de aPKM\zeta para mitigar la
sintomatología.

La cantidad de forma truncada de proteína aPKC\zeta en el sistema nervioso central del animal puede cambiarse o modularse de una variedad de maneras. Puede modularse la transcripción del gen endógeno. Cualquier molécula pequeña o estímulo fisiológico que afecte a las cantidades o la actividad de los factores de transcripción diferentes que modulan la expresión génica afectará a los niveles del ARNm y de la proteína. Alternativamente, pueden realizarse manipulaciones basadas en ADN para cambiar la regulación del gen endógeno. Pueden añadirse secuencias reguladoras exógenas al gen endógeno, poniendo el gen bajo el control de diferentes secuencias de ADN, proteínas que se unen a esas secuencias y efectores que afectan a esas proteínas. En estas situaciones, la modulación de la expresión de la forma truncada se produce cuando el efector se administra desde una fuente externa o se retiene, dependiendo de la acción que se produce en el sitio de regulación.

Otra manera de cambiar o modular la cantidad de proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central del animal es usar tecnología transgénica. Un transgén que codifica para una proteína aPKM\zeta deseada se inserta en el genoma del animal. El transgén puede insertarse usando técnicas recombinantes reconocidas por y conocidas para los expertos tales como los biólogos moleculares. El animal transgénico puede contener una o más copias del transgén que codifica para la forma truncada de la proteína aPKM\zeta. Este transgén puede contener el gen endógeno. Más probablemente, el transgén codifica para una proteína aPKM\zeta seleccionada de otra especie animal. En cualquier caso, el transgén puede estar bajo el control o bien de sitios de regulación endógenos o bien sitios de regulación obtenidos de fuentes exógenas. Pueden emplearse sitios de regulación endógenos cuando el transgén se inserta en un locus apropiado en el genoma en el que se controla la expresión génica mediante el sitio de regulación endógeno. Sin embargo, se emplean con mayor frecuencia sitios de regulación de fuentes exógenas cuando se usan transgenes. Los sitios de regulación son con frecuencia más fáciles de incluir con los transgenes cuando se realizan las inserciones en el genoma. En cualquier situación, el transgén insertado que codifica para la aPKM\zeta deseada proporciona un mayor control de la modulación, particularmente inducción, de la expresión de la forma truncada. Este aumento de control potencia la capacidad para aliviar defectos de la memoria y disfunciones psiquiátricas.

Una manera adicional de cambiar la cantidad de proteína aPKM\zeta en un individuo no humano es mediante la administración de la propia proteína al individuo no humano. La proteína se administra de modo que es activa en el sistema nervioso central del individuo y de ese modo alivia el defecto de la memoria o la disfunción psiquiátrica alterando el componente de formación de la memoria de la disfunción. Esta proteína puede ser una forma activa o inhibidora de la molécula.

Esta invención se refiere específicamente a métodos de identificación de sustancias que afectan a la formación de memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en mamíferos no humanos. La sustancia tendrá habitualmente una estructura química orgánica y está en forma de un producto farmacéutico con los diluyentes, excipientes y vehículos requeridos presentes en su formulación. La sustancia puede ser una macromolécula pero habitualmente es mucho más pequeña. En estos métodos, la sustancia en consideración se administra a un mamífero. La administración es mediante cualquier vía convencional. Por ejemplo, la administración puede producirse mediante administración oral o rectal, inhalación, aplicación tópica, o por vía parenteral mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular. Una vez administrada, se determina si la sustancia altera la expresión o la actividad de una proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central del mamífero no humano, en el que se ha mostrado previamente que la proteína aPKM\zeta está asociada con la disfunción psiquiátrica de interés. La asociación de la proteína aPKM\zeta y la disfunción psiquiátrica puede ser directa o indirecta. La asociación está presente si una alteración en la cantidad o actividad de la proteína aPKM\zeta o bien potencia o bien reduce los signos o síntomas de la disfunción psiquiátrica. La asociación está presente si una alteración en la expresión genética de la proteína aPKM\zeta o bien potencia o bien reduce los signos o síntomas de la disfunción psiquiátrica. La alteración de la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta se determina comparando la expresión o la actividad de esta proteína tras haber administrado la sustancia al mamífero no humano con la expresión de la proteína cuando no se ha administrado la sustancia. Si se encuentra una diferencia reproducible entre los valores de expresión o actividad para la proteína aPKM\zeta cuando la sustancia está presente frente a cuando la sustancia no está presente, se identifica la sustancia como que tiene la propiedad de afectar a la disfunción psiquiátrica con la que está asociada la proteína aPKM\zeta. La sustancia puede identificarse además como que tiene un efecto aliviador o uno perjudicial sobre la disfunción psiquiátrica, dependiendo de la relación del cambio de expresión con la calidad o intensidad de los signos o síntomas de la disfunción psiquiátrica. Por ejemplo, si un aumento en la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta está asociado con un alivio de los signos o síntomas de la disfunción psiquiátrica y la sustancia, cuando se administra, provoca un aumento en la expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene propiedades ventajosas para aliviar la disfunción psiquiátrica.

Con frecuencia para la aPKM\zeta, cuando la sustancia administrada provoca un aumento en la expresión o la actividad de la aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene la propiedad de potenciar el componente de formación de la memoria de la disfunción psiquiátrica. Con frecuencia, es el componente de la memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica que se potencia cuando la sustancia administrada provoca un aumento en la expresión de aPKM\zeta. A la inversa, cuando la sustancia administrada provoca una disminución en la expresión o la actividad de la aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene la propiedad de interferir con el componente de formación de la memoria de la disfunción psiquiátrica. En este caso, es de nuevo con frecuencia el componente de formación de la memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica que se interfiere con o se bloquea mediante la sustancia administrada.

Esta invención se refiere además a métodos para evaluar los efectos de fármacos sobre el componente de formación de la memoria de una disfunción psiquiátrica. En estos métodos, el fármaco candidato se administra a un animal no humano normal o a un animal que tiene una proteína aPKM\zeta inducible que está asociada con la formación de la memoria. El fármaco habitualmente tiene una estructura química orgánica y se administra mediante cualquiera de las vías de administración convencionales junto con cualquier diluyente, excipiente o vehículo requerido. En estos métodos, el tipo de animal no se limita a mamíferos no humanos sino que incluye la mayor parte del reino animal. Por ejemplo, pueden usarse insectos tales como Drosophila melanogaster o abejas como sujetos para valorar los efectos de fármacos sobre el componente de formación de la memoria. Otros organismos modelo para evaluar los efectos de fármacos sobre la formación de la memoria incluyen C. elegans, Aplysia, Xenopus, pez cebra, ratón, ratas, hurones y gatos. El único requisito para el tipo de animal es que tenga una forma truncada inducible de una proteína aPKC\zeta que esté asociada con la formación de la memoria.

Tras la administración del fármaco candidato al animal no humano en estos métodos, se induce la proteína aPKM\zeta inducible para producir la forma truncada en el animal no humano, o se examina el gen endógeno en el animal no humano no transgénico. La inducción puede realizarse mediante cualquiera de los métodos conocidos por las personas que están familiarizadas con tales procesos. En C. elegans, los médicos usan habitualmente choque térmico, antibióticos o pequeñas moléculas tales como IPTG. En Drosophila, los médicos usan habitualmente choque térmico, antibióticos o pequeñas moléculas tales como IPTG o metales pesados. En mamíferos, los médicos usan habitualmente antibióticos, hormonas o pequeñas moléculas como IPTG.

Tras haberse inducido la expresión de la proteína aPKM\zeta en el animal no humano transgénico, o el gen endógeno en el animal no humano normal, se somete el animal no humano a un ensayo de aprendizaje y memoria, y se asigna un índice de comportamiento, basándose en el resultado del protocolo. Los psicólogos y otros que estudian el aprendizaje y la memoria en animales conocen las pruebas de aprendizaje y memoria. Los protocolos de entrenamiento que son útiles en esta invención tratan los atributos de aprendizaje y memoria que tiene el animal. Puede usarse cualquier protocolo de condicionamiento clásico discriminativo. Ejemplos de estos protocolos son los protocolos de condicionamiento asociativo y no asociativo, el condicionamiento clásico y operante, y las pruebas de memoria implícita y explícita. El índice de comportamiento es una valoración de los resultados del protocolo de entrenamiento que se usó. Con frecuencia, el índice de comportamiento es un valor numérico que se asigna por el observador o investigador al resultado del protocolo de entrenamiento. Puede considerarse que el valor numérico es una puntuación a escala del comportamiento del animal con el que está probándose el protocolo de condicionamiento clásico.

En estos métodos, se considera que el fármaco tiene un efecto sobre la formación de la memoria o el componente de formación de la memoria de la disfunción psiquiátrica cuando animales no humanos tratados con el compuesto tienen un comportamiento de manera reproducible diferente del de los animales no humanos no tratados. En algunos casos, el mismo animal no humano individual puede servir como el animal no humano control y como el que al que se le va a administrar el fármaco. Sin embargo, habitualmente diferentes animales sirven como los animales no tratados (control) y los tratados (sujeto). En estos casos, los animales deben elegirse de la misma cohorte. Los fármacos que muestran un efecto sobre el componente de formación de la memoria, tal como se detecta mediante estos métodos, son candidatos para su administración a animales no humanos para aliviar disfunciones psiquiátricas en estos animales no humanos, particularmente cuando la disfunción psiquiátrica tiene un componente de formación de la memoria.

En estos métodos, la diana inducible del fármaco es aPKM\zeta. En estos casos, es normalmente el componente de formación de la memoria a corto plazo del problema de la memoria o disfunción psiquiátrica el que se ve afectado por el fármaco. Los problemas de la memoria seleccionados a los que se dirigen los fármacos seleccionados incluyen los que resultan del envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer y neurodegeneración. Las disfunciones psiquiátricas para las que los fármacos seleccionados mediante estos métodos tendrán un efecto incluyen trastorno por déficit de atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia, trastornos obsesivo compulsivos, y fobias.

El estudio de PKC en la formación de la memoria tiene una larga historia. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se realizaron antes de que se apreciara la complejidad de la familia de genes de PKC. La familia de PKC puede dividirse en tres clases basándose en sus requerimientos de cofactor. Mientras que todas las proteínas PKC requieren fosfatidilserina para su activación, los isotipos "convencionales" (cPKC) requieren diacilglicerol (DAG) y Ca2+ para una actividad completa; los isotipos "novedosos" (nPKC) son independientes del Ca2+ pero todavía requieren DAG, y los isotipos "atípicos" (aPKC) son independientes tanto de DAG como de Ca2+. Estructuralmente, estas cinasas pueden dividirse en un dominio regulador N-terminal, que contiene una región pseudosubstrato así como los sitios de unión para los cofactores requeridos, y el dominio catalítico C-terminal. La eliminación del dominio regulador N-terminal produce una cinasa activa de manera persistente, denominada PKM.

Los papeles de PKC en modelos de hipocampo de plasticidad sináptica, potenciación a largo plazo (LTP, long-term potentiation) y depresión a largo plazo (LTD, long-term depression) se han estudiado ampliamente (véase, F. Angenstein, et al., Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 21, 427-454 (1997)). Análisis de inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos para cada una de las isoformas de PKC de rata demuestran que la única cuyos niveles aumentan específicamente y se mantienen elevados durante la fase de mantenimiento de LTP es PKM\zeta, la forma truncada de la isozima atípica PKC\zeta (véase, por ejemplo, Osten, P. et al., J. Neurosci. 16, 2404-2451 (1996)). Análisis de expresión también muestran que el mantenimiento de LTD está asociado con niveles decrecientes de PKM\zeta. De la manera más interesante, el mantenimiento de LTP se suprime mediante la aplicación sostenida de bajas concentraciones del inhibidor de PKC queleritrina, mientras que la perfusión de PKM\zeta en células piramidales de CA1 produce un aumento en la transmisión sináptica mediada por los receptores de AMPA (D. S. F. Ling et al, datos no publicados).

En Drosophila, el ensayo mejor caracterizado para el aprendizaje y la memoria asociativos es una tarea conductual para evitar un olor (T. Tully, et al. J. Comp. Physio. A157, 263-277 (1985) incorporado al presente documento como referencia). Este condicionamiento clásico (pavloviano) implica exponer las moscas a dos olores (los estímulos condicionados o CS (conditioned stimuli)), de uno en uno, en sucesión. Durante una de estas exposiciones a olor (el CS+), se someten las moscas simultáneamente a un choque eléctrico (el estímulo no condicionado o US (unconditioned stimulus)), mientras que la exposición al otro olor (el CS-) carece de este refuerzo negativo. Tras el entrenamiento, se colocan entonces las moscas en un "punto de elección", en el que los olores proceden de sentidos opuestos, y se espera a que decidan qué olor evitar. Por convención, el aprendizaje se define como el comportamiento de la mosca cuando las pruebas se producen inmediatamente tras el entrenamiento. Un solo ensayo de entrenamiento produce un aprendizaje fuerte: una respuesta típica es que > 90% de las moscas evitan el CS+. El comportamiento de las moscas de tipo natural con respecto a este entrenamiento de un solo ciclo disminuye a lo largo de un periodo de aproximadamente 24 horas hasta que las moscas se distribuyen una vez más de manera uniforme entre los dos olores. Las moscas también pueden formar memorias olfativas asociativas de larga duración, pero normalmente esto requiere regímenes de entrenamiento repetitivos.

Esta tarea en Drosophila se usó para examinar de una manera a modo de ejemplo en el presente documento el papel de la PKM atípica en la formación de la memoria. La inducción del transgén de aPKM\zeta (MaPKM\zeta) de ratón potencia la memoria y corrige el defecto de la memoria de mutantes rábano. Hay una única PKC atípica en Drosophila (http://www.fruitfly.org), y se encontró que la isoforma "M" truncada, DaPKM, preferentemente se expresaba y era activa en cabezas de mosca. La intervención tanto genética negativa dominante como farmacológica de la actividad DaPKC/M altera la memoria normal. Finalmente, la inducción de la DaPKM predicha también potencia la memoria, demostrando además un papel general de la aPKM en los procesos de memoria.

A continuación viene una descripción de realizaciones preferidas de la invención.

Ejemplos Métodos Reservas de moscas y mantenimiento

La reserva de fondo (2202u) usada como moscas de tipo natural en todos los experimentos es w (isoCJl), que es una línea isogénica derivada de una línea w^{1118} retrocruzada de manera repetida con una cepa de tipo natural Canton-S. Para minimizar las diferencias en el fondo genético, 2202u también sirvió como la cepa receptora para todas las líneas transgénicas usadas en estos experimentos. Las reservas de moscas usadas para los análisis conductuales se mantuvieron en condiciones apropiadas.

Aprendizaje pavloviano y memoria en Drosophila. Para evaluar el aprendizaje y la memoria en Drosophila, se usó un protocolo de condicionamiento clásico (pavloviano) para evitar un olor. Este protocolo se modificó para facilitar regímenes de entrenamiento automatizados y repetitivos. Se usaron 3-octanol (OCT) y 4-metilciclohexanol (MCH) como olores en estos experimentos. Pueden encontrarse descripciones detalladas de pruebas así como entrenamiento masivo de un solo ciclo y espaciado, y las pruebas para determinar la agudeza olfativa y la reactividad a choques en Tully et al., Cell 79, 35-47 (1994) o Connolly, J. B. & Tully T., Drosophila. A Practical Approach (ed. Roberts, D. B., Oxford Univ. Press, Oxford 1998) incorporado al presente documento como referencia. El índice de comportamiento (PI, performance index) se calculó restando el número de moscas que hacen la elección incorrecta de las que hacen la elección correcta, dividiendo entre el número total de moscas, y multiplicando por 100. Para evitar sesgos al evitar el olor, se calculó el PI de cada n individual tomando un comportamiento promedio de dos grupos de moscas, un grupo entrenado con el CS+ que es OCT, el otro con el CS+ que es MCH.

Transgenes

Se produjo el constructo de ADN de MaPKM\zeta usando amplificación por PCR usando el ADNc de MaPKC\zeta de longitud completa (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) n.º 63247) como molde. Se usaron cebadores de PCR (cebador en el sentido de 5': 5'-CTAGCGAATTCAACATGAAGCT GCTGGTCCATAAACG-3'; cebador en el sentido de 3': 5'-CTAGCTCTAGATCACACGG ACTCCTCAGC-3') para producir el gen de MaPKM\zeta truncado. El cebador en el sentido de 5' contenía un sitio de restricción EcoRI justo en el sentido de 5' de una secuencia Kozak consenso y también codificaba para un codón de iniciación ATG. Los últimos 20 nucleótidos del cebador en el sentido de 5' corresponden a 20 nucleótidos en la región bisagra del gen de MaPKC\zeta. El segundo codón en este gen truncado corresponde al aminoácido 165 en la proteína MaPKC\zeta. El cebador en el sentido de 3' es antisentido con respecto a los últimos 20 nucleótidos en el marco de lectura abierto de MaPKC\zeta, y contiene un sitio de enzima de restricción XbaI inmediatamente tras el codón de terminación de la traducción. El producto de PCR producido usando estos cebadores se cortó con EcoRI y XbaI, después se subclonó en un vector del elemento P de choque térmico, usando los mismos sitios de restricción, y se secuenció. Se produjo el KI-MaPKM\zeta cinasa-inactivo de la misma manera excepto que se usó el ADN de mutante K281W-MaPKC\zeta como molde para la amplificación por PCR. Se subclonó el gen de MaPKC\zeta de cadena completa en el mismo vector del elemento P usando los sitios EcoRI ubicados en ambos extremos del ADNc y en el vector de choque térmico. Se prepararon moscas transgénicas usando técnicas convencionales. Basándose en la homología con las PKC\zeta de mamífero, se definió el extremo N-terminal de DaPKC como que comenzaba con los residuos M-P-S. Usando este punto de referencia, el transgén de DaPKM comienza en Met223 dentro de la región bisagra de DaPKC.

Inducción por choque térmico

Todas las reservas de moscas se mantuvieron a 25ºC antes y después del choque térmico. Se realizaron inducciones por choque térmico en tubos de plástico de 15 ml (\sim 100 moscas/tubo) sumergiendo parcialmente los tubos en un baño de agua a la temperatura apropiada (32ºC o 37ºC) durante 30 min.

Ensayo bioquímico

Las moscas transgénicas para MaPKM\zeta mantenidas a 25ºC se sometieron a choque térmico a 37ºC durante 30 min., después se dejó que se recuperaran a 25ºC durante 1 h y se congelaron en nitrógeno líquido. Las moscas de tipo natural y los controles no inducidos permanecieron a 25ºC todo el tiempo. Tras la congelación, se separaron las cabezas de mosca de los cuerpos y se homogeneizaron \sim100 \mul de cabezas en 1 ml de tampón de extracción (Hepes 20 mM pH 7,4, sacarosa 0,2 M, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y cóctel inhibidor de proteasas completo (Roche, Indianápolis, Indiana)), y se centrifugaron a 176.500 g durante 10 min. Se diluyeron los homogeneizados hasta 1 mg/ml de proteína y se ajustó a EGTA 2,5 mM. Se sometió a ensayo la actividad PKC midiendo la incorporación de ^{32}P procedente de \gamma-^{32}P-ATP en el péptido-\varepsilon (Peninsula, Belmont, California). Cada 50 \mul de reacción contenían Hepes 50 mM pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, péptido-\varepsilon 25 \muM, 20 \mug de homogeneizado de proteína y \gamma-^{32}P-ATP (2 \muCi) 20 mM. Se incubó la proteína a 26ºC durante 1 min. en la mezcla de reacción que carecía de ATP. Se inició la reacción mediante la adición de \gamma-^{32}P-ATP, se incubó a 26ºC durante 2 min. y se detuvo en hielo con 20 \mul de H_{3}PO_{4} 75 mM. Se manchó un círculo de 2 cm de papel de cromatografía P81 (GIBCO, Gaithersburg, Maryland) con una alícuota de 20 \mul de cada reacción y se lavó tres veces en H_{3}PO_{4} 75 mM, se secó y se midió la radiactividad mediante recuento de centelleo. Se midió el efecto de ésteres de forbol y Ca2+ en la reacción en presencia de CaCl_{2} 200 \muM y acetato-miristato de forbol (PMA) 400 \muM. Se estimó la actividad de fondo a partir de las reacciones simuladas que carecían de péptido-\varepsilon. La actividad PKC aumentó linealmente con el tiempo hasta 4 min. Los valores notificados son promedios de ensayos por cuadruplicado.

Inmunotransferencias de tipo Western

Se monitorizó el transcurso del tiempo de inducción por choque térmico usando extractos de cabeza de mosca (se cargaron aproximadamente cinco cabezas por carril) para los análisis de tipo Western. Se usó un anticuerpo policlonal de conejo frente a MaPKM\zeta (Sigma, St. Louis, Misuri) como anticuerpo primario y se detectó la proteína usando ECL (Pierce, Rockford, Illinois).

Alimentación de queleritrina

Se usó una disolución de sacarosa al 4% (p/v) como vehículo para la alimentación de queleritrina. Sobre papel de filtro Whatman 3MM cortado para ajustarse y colocado en la parte inferior de viales de cultivo de moscas convencionales, se aplicaron 120 \mul de queleritrina 0 \muM (sacarosa sola), o 25 \muM, 50 \muM o 100 \muM. Se sometieron a ayuno las moscas en viales vacíos (\sim 100 moscas/vial) durante 1 h y después se transfirieron a los viales de alimentación durante 3 h para permitir una alimentación suficiente. Entonces se entrenaron las moscas y se sometieron a prueba tal como se describe en el texto y las figuras. Se monitorizó la alimentación colocando un volumen de 1/50 de colorante alimentario verde en las disoluciones, que podía observarse entonces en los abdómenes de las moscas tras comer. No hubo ninguna diferencia destacable en el consumo entre ninguna de las disoluciones.

Resultados La inducción de MaPKM\zeta potencia la memoria en Drosophila

Para investigar el papel de PKC en el aprendizaje y la memoria en Drosophila, se prepararon líneas transgénicas de moscas que portaban isoformas de PKC (MaPKC) atípicas murinas inducibles por choque térmico. Considerando que los experimentos de LTP indican que los niveles de MaPKM\zeta aumentan tras la presentación de los estímulos requeridos para la potenciación de larga duración, se sometió a prueba la inducción de MaPKM\zeta tras el entrenamiento para ver si afectaba a la memoria olfativa. La inducción por choque térmico suave (32ºC) tras el entrenamiento potenció intensamente la memoria a las 24 horas (figura 1a). Esta potenciación no se debía a los efectos del choque térmico independiente del transgén, porque las moscas de tipo natural no mostraban una memoria potenciada cuando se exponían a choque térmico. Se prepararon las moscas transgénicas en esta cepa de tipo natural, de modo que la potenciación no se debía a diferencias en el fondo genético. Finalmente, la potenciación de la memoria no resultaba de una mutación insercional provocada por el transgén, porque dos líneas independientes (MaPKM\zeta-14 y MaPKM\zeta-43) tenían efectos similares.

También se sometió a prueba la potenciación de la memoria a las 24 horas tras un entrenamiento de un solo ciclo induciendo MaPKM\zeta con un choque térmico intenso (37ºC) 3 horas antes del entrenamiento, pero este régimen no tuvo ningún efecto (datos no mostrados). Dado que la inducción del transgén tras el entrenamiento conductual potenciaba la memoria, mientras que la inducción antes del entrenamiento no, se examinó a continuación la especificidad temporal de este efecto dependiente de MaPKM\zeta. Se encontró que la potenciación óptima se producía cuando la inducción por choque térmico comienza 30 minutos después de que termine el entrenamiento, y el efecto está ausente si el choque térmico se produce antes, o está retardado hasta 2 horas después del entrenamiento (figura 1b).

No se observó la potenciación de la memoria cuando se indujo un mutante cinasa-inactivo (KI) de MaPKM\zeta ni antes ni después del entrenamiento (figura 2a; dos líneas independientes, KI-1 y KI-2, de KI-MaPKM\zeta. Tampoco se observó la potenciación cuando se indujo la MaPKC\zeta de longitud completa (FL) antes o después del entrenamiento (figura 2a; dos líneas independientes, FL-3A y FL-14A). El fallo o bien del KI-MaPKM\zeta o bien del transgén de FL-MaP-KC\zeta para potenciar la memoria no se debía a la falta de expresión, porque ambos se expresan a niveles comparables a la proteína MaPKM\zeta (figura 3a; KI-1 y FL-14A frente a MaPKM\zeta-14). Juntos, estos resultados indican que la potenciación de la memoria (figura 1) requiere una isoforma de aPKM activa de manera persistente.

Detección bioquímica de la inducción de MaPKM\zeta en Drosophila

Se detectaron aumentos inducibles en los niveles de proteína MaPKM\zeta y la actividad cinasa en extractos preparados a partir de cabezas de Drosophila (figura 3). Análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostraron que los regímenes de choque térmico tanto suave como intenso inducían las isoformas MaPKM\zeta y MaPKC\zeta, y que estas proteínas persistían durante \sim18 horas tras el choque térmico (figura 3a). La proteína MaPKM\zeta inducida era activa, tal como lo indicaba una potenciación observada de la actividad PKC independiente de Ca^{2+}/DAG (diacilglicerol) en extractos de cabeza de mosca de moscas transgénicas inducidas pero no de las no inducidas (figura 3b).

La inducción de MaPKM\zeta no afecta a los comportamientos periféricos

La potenciación de la memoria se producía sólo cuando el transgén se inducía tras el entrenamiento; por tanto no es probable debido a un efecto de la expresión transgénica sobre la percepción de o bien el choque o bien los olores en el momento del entrenamiento. No se encontró ningún efecto de la inducción de MaPKM\zeta sobre la reactividad al choque, ya que las moscas transgénicas se comportaron de manera indistinguible de la cepa de tipo natural, independientemente del choque térmico (figura 2b). Por tanto, las moscas transgénicas no percibían el choque mejor durante el entrenamiento. Dado que la potenciación de la memoria era dependiente de la inducción (figura 1a), no puede atribuirse a pequeñas cantidades de pérdida de expresión durante el entrenamiento. Aunque la MaPKM\zeta había decaído hasta niveles previos al choque térmico en el momento de las pruebas a las 24 horas (figura 3a), podía producirse una potenciación de las respuestas olfativas en el momento de las pruebas mediante MaPKM\zeta. Sin embargo, éste no era el caso porque la agudeza olfativa a las 24 horas tras la inducción era normal (figura 2b). Estos datos demuestran que la inducción de MaPKM\zeta no tiene ningún efecto conductual sobre ninguna modalidad sensorial e indican que el efecto observado se debe a una auténtica potenciación de la memoria.

MaPKM\zeta potencia la memoria tras un entrenamiento masivo, pero no uno espaciado

Drosophila puede formar memorias olfativas asociativas que duran 24 horas y más, pero esto requiere normalmente un entrenamiento repetitivo. Se han establecido regímenes de entrenamiento de múltiples ensayos que producen tanto una memoria resistente a la anestesia (ARM, anesthesia-resistant memory) como una memoria a largo plazo (LTM, long-term memory). La ARM puede producirse mediante 10 ciclos de entrenamiento "masivo" sin intervalos de reposo entre los ensayos de entrenamiento individuales, y dura 2-3 días. La LTM resulta de un entrenamiento repetitivo que contiene intervalos de reposo (15 min. cada uno; véase Métodos), y 10 ciclos de este entrenamiento "espaciado" genera una LTM que dura al menos 7 días. Para someter a prueba si la MaPKM\zeta podía potenciar la ARM o LTM, se sometieron moscas a regímenes de entrenamiento masivo o espaciado, se indujo el transgén durante 30 minutos tras el entrenamiento y después se midió la memoria a los 4 días.

La inducción de MaPKM\zeta aumentó sustancialmente la memoria a los 4 días tras el entrenamiento masivo (figura 4a; HS+ en comparación con -HS para cada línea) pero no mejoró la memoria a los 4 días tras el entrenamiento espaciado (figura 4b; HS+ en comparación con -HS para cada línea). Estos datos indican que la inducción de MaPKM\zeta potencia la memoria inducida por entrenamiento masivo, pero no la inducida por entrenamiento espaciado.

La mutación rábano no bloquea la potenciación de la memoria inducida por MaPKM\zeta

Un trabajo previo indicó que la memoria consolidada en Drosophila consiste en dos componentes bioquímicamente separables: ARM y LTM. La ARM se produce mediante entrenamiento o bien masivo o bien espaciado y es insensible al tratamiento con cicloheximida. La LTM se produce mediante entrenamiento espaciado y se bloquea mediante el tratamiento con cicloheximida; por tanto se considera que requiere una síntesis de proteína aguda. Un mutante de memoria de Drosophila identificado previamente, rábano, es deficiente en ARM, ya que esta mutación bloquea la memoria producida mediante entrenamiento masivo. El entrenamiento espaciado de mutantes rábano sí produce memoria, pero esta memoria puede bloquearse completamente mediante el tratamiento de los mutantes con cicloheximida. Estos resultados condujeron a un modelo de dos rutas de memoria consolidada, una dependiente del producto génico de rábano (ARM) y la otra dependiente de la síntesis de proteína aguda inducida por actividad (LTM). (Véase Tully et al, Cell 79, 35-47 (1994).

Dado que la inducción de MaPKM\zeta potenciaba la memoria tras el entrenamiento masivo pero no tras el espaciado, se sometió a prueba la dependencia de este efecto sobre el rábano. El gen rábano está en el cromosoma X en Drosophila y se cruzaron hembras mutantes rábano homocigóticas con machos homocigóticos para una copia autosómica del transgén de MaPKM\zeta inducible por choque térmico. El mutante rábano es recesivo, por tanto la progenie hembra heterocigótica de este apareamiento tendrá una memoria normal tras el entrenamiento masivo, mientras que los machos hemicigóticos presentarán el déficit de memoria de rábano en ausencia de inducción. Se sometió la progenie a entrenamiento masivo, seguido de la inducción de MaPKM\zeta convencional tras el entrenamiento, y luego se sometió a prueba a las 24 horas para evaluar la capacidad de la MaPKM\zeta. Se entrenó a los machos y las hembras y se sometieron a prueba en masa y después se separaron y se contaron. La mutación rábano no bloqueaba el efecto sobre la memoria de la inducción de MaPKM\zeta (figura 5). El defecto de la memoria de los machos rábano era evidente en ausencia de inducción por choque térmico (HS-), pero la memoria estaba claramente presente en los machos inducidos (HS+). También se observó una potenciación de la memoria dependiente de la inducción menor, pero significativa, de las hembras rábano heterocigóticas mediante MaPKM\zeta (figura 5: hembras HS+ frente a HS-).

Un homólogo de Drosophila de MaPKM\zeta

Hay un único gen de PKC atípico (DaPKC) en el genoma de Drosophila (http://www.fruitfly.org), y es sumamente homólogo con el gen de MaPKC\zeta usado. (El dominio cinasa muestra una identidad del 76% y una similitud del 87%.) Una inmunotransferencia de tipo Western de extractos preparados a partir de cabezas y cuerpos de mosca de tipo natural mostró que el antisuero usado para detectar MaPKM\zeta y MaPKC\zeta reconocía dos bandas en extractos de mosca, el más pequeño de los cuales estaba enriquecido en extractos de cabeza (figura 6a). Este antisuero se dirige contra los 16 aminoácidos C-terminales de MaPKC/M\zeta, que comparte una homología sustancial con DaPKC. El antisuero de ratones inmunizados con péptidos derivados de DaPKC reconocía estas mismas bandas (datos no mostrados). Los pesos moleculares de estas dos bandas indican que son probablemente las isoformas DaPKC (\sim73 kDa) y DaPKM (\sim55 kDa).

No se ha establecido la secuencia N-terminal de la banda de menor peso molecular; sin embargo, probablemente representa una isoforma de DaPKM endógena. La inmunorreactividad se redujo de manera competitiva mediante un péptido de la región correspondiente de DaPKC, pero no fuera de este epítopo (figura 6b, 590 y 545, respectivamente) o mediante un péptido de otra proteína de Drosophila (dCREB2, datos no mostrados). De acuerdo con los datos de la inmunotransferencia de tipo Western, las cabezas de mosca contenían más actividad PKC independiente de Ca2+ y DAG que los cuerpos (figura 6c). La presencia de la DaPKM putativa se correlaciona fuertemente con esta actividad enriquecida, lo que sugiere que la mayor parte, si no toda, la actividad cinasa atípica endógena medida en extractos de cabeza se debía a esta isoforma DaPKM. Estos datos indican que las moscas tienen formas tanto "C" como "M" de una PKC atípica que es sumamente homóloga con MaPKC/M, y que la DaPKM está enriquecida en las
cabezas.

La queleritrina y KI-MaPKM\zeta inhiben la memoria, pero no el aprendizaje

Se ha descrito un mutante insercional de elemento P en DaPKC; sin embargo, es letal para los embriones y por tanto no es adecuado para examinar un posible papel en la formación de la memoria y el aprendizaje en adultos. Para evaluar si este producto génico es necesario para la formación de la memoria, se recurrió a dos enfoques. En primer lugar, se monitorizaron los efectos sobre la memoria de alimentar moscas con el inhibidor de PKC queleritrina. Se ha notificado que este fármaco inhibe selectivamente la PKM\zeta a bajas concentraciones (D. S. F. Ling et al., datos no publicados y Laudanna, C. et al, J. Biol. Chem. 273, 30306-30315 (1998); sin embargo, su especificidad es controvertida e inhibe otros isotipos de PKC a mayores concentraciones. También se realizaron mediciones de los efectos sobre la memoria producidos mediante la inducción de la proteína KI-MaPKM\zeta cinasa-inactiva, que presenta una actividad "negativa dominante" que es probable que sea específica para las PKC atípicas, dejando las respuestas de cPKC y nPKC inalteradas.

La alimentación de moscas con queleritrina inhibió la formación de la memoria a las 24 horas de una manera dependiente de la dosis (figura 7a), y la inducción del KI-MaPKM\zeta inhibía la memoria a las 24 horas tras el entrenamiento masivo (figura 7b). Los efectos inhibidores tanto de la queleritrina como del KI-MaPKM\zeta no se debían probablemente a efectos sobre al agudeza olfativa o la reactividad a choques porque el aprendizaje no se veía afectado por ninguno de los tratamientos (figura 7c).

La inducción de DaPKM potencia la memoria

La potenciación de la memoria producida mediante MaPKM\zeta podría haberse debido a propiedades únicas para esta proteína de mamífero. Los datos de expresión que muestran que la DaPKM se expresaba y era activa en cabezas de Drosophila, cuando se combinaban con los datos de queleritrina y negativa dominante, sugerían que la DaPKM está implicada en procesos de memoria normal en Drosophila. La amplia homología estructural entre MaPKM\zeta y DaPKM también era un argumento en contra de la exclusividad funcional. Una hipótesis de la homología funcional hace una predicción firme: la inducción de DaPKM tras el entrenamiento también debe potenciar la memoria.

Usando como base el peso molecular aproximado de la DaPKM, se truncó el gen DaPKC dentro de la región bisagra separando los dominios regulador del catalítico de modo que el gen DaPVM putativo comienza en la metionina 223. La inducción del transgén DaPKM tras el entrenamiento potenciaba la memoria a las 24 horas tras un entrenamiento de un solo ciclo (figura 8a). Se usó una de estas líneas para mostrar que también se potenciaba la memoria a los 4 días tras el entrenamiento masivo (figura 8b). Tal como con los transgenes MaPKM\zeta, las líneas DaPKM mostraron una rápida inducción por choque térmico (figura 8c). Estos resultados confirman los obtenidos con MaPKM\zeta, y por tanto indican que aPKM es fundamental en los mecanismos subyacentes a la memoria entre las especies.

Discusión de los resultados PKM atípica y memoria normal

Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la actividad de PKM atípica es suficiente para potenciar la memoria en Drosophila. Se investigaron las intervenciones tanto farmacológicas como negativas dominantes. La queleritrina inhibía la memoria normal de una manera dependiente de la dosis (figura 7a), y la inducción de un PKM atípica negativa dominante predicha producía el mismo déficit de la memoria (figura 7b).

Es importante observar que ninguna de las intervenciones inhibidoras empleadas alteraba el aprendizaje (figura 7c). Selecciones en Drosophila han identificado muchos mutantes de aprendizaje que alteran varias rutas de señalización (por ejemplo, procesos cAMP-PKA, mediados por integrina y dependientes de proteína 14-3-3; como citas originales). Considerando que el aprendizaje sigue siendo normal, es improbable que alguna intervención produzca defectos de señalización muy amplios. Teniendo esto en cuenta, la observación de que cada intervención inhibía la memoria sin alterar el aprendizaje indica que DaPKC/M es un componente de un mecanismo de memoria endógeno.

Especificidad de fase de la memoria potenciada por MaPKM\zeta

La inducción por choque térmico de MaPKM\zeta no potenciaba la memoria a largo plazo, porque no mejoraba la memoria tras el entrenamiento espaciado (figura 4b). Una explicación para esto es que el entrenamiento espaciado induce mecanismos de mantenimiento endógenos, y por tanto bloquea el efecto de inducir el transgén de MaPKM\zeta. Por tanto, la memoria tras un solo ciclo o un entrenamiento masivo puede prolongarse mediante la inducción del transgén porque estos regímenes de entrenamiento normalmente no inducen una actividad prolongada de PKM atípica. Un trabajo en abejas mostró que un entrenamiento de un solo ciclo no produce ni una actividad de PKC persistente ni una memoria de larga duración, pero que un entrenamiento de múltiples ciclos produce ambas (véase L. Grunbaum et al, J. Neurosci. 18, 4384-4392 (1998)). La potenciación de la memoria observada cuando se induce MaPKM\zeta puede evitar de manera simple los requisitos endógenos (proporcionados normalmente mediante entrenamiento espaciado) para la activación prolongada de aPKM.

La potenciación inducida por MaPKM\zeta de entrenamiento masivo, pero no espaciado dio lugar a un examen de la implicación del producto génico de rábano en este proceso. Si se requería rábano para la potenciación, la mutación rábano habría bloqueado el efecto inducido por MaPKM\zeta, y éste claramente no era el caso (figura 5). Aunque la inducción de MaPKM\zeta rescata fenotípicamente el defecto de la memoria de rábano, no lo hace porque el rábano codifique para la aPKM de Drosophila. DaPKM está en el segundo cromosoma y el rábano está en el X, y ningún gen PKC de Drosophila mapea en el locus de rábano definido genéticamente. Hay dos posibilidades principales que explican cómo la potenciación de la memoria inducida por MaPKM\zeta evita el defecto de los mutantes rábano: (1) MaPKM\zeta está en el sentido de 3' del rábano; (2) MaPKM\zeta activa una ruta que es paralela a e independiente del rábano. La primera interpretación se ve favorecida porque puede llevarse a cabo o bien un potenciación o bien una alteración de la memoria tras el entrenamiento masivo, así como un rescate parcial del fenotipo de rábano.

Plasticidad sináptica dependiente de la actividad y PKM atípica. Hay dos interpretaciones generales de estos datos: la PKM\zeta actúa aumentando o bien (1) la magnitud o bien (2) la duración de la potenciación sináptica que subyace al comportamiento. En el primer modelo, la PKM\zeta potencia la maquinaria sináptica inducida mediante el entrenamiento, creando una conexión sináptica "más fuerte" que decae más lentamente. En el segundo modelo, la PKM\zeta actúa únicamente para mantener las sinapsis modificadas previamente por la experiencia, sin ningún efecto sobre la inducción de la potenciación. Si se consideran las mediciones conductuales del aprendizaje (pruebas realizadas inmediatamente tras el entrenamiento) y la memoria (pruebas realizadas después de más tiempo) con inducción y mantenimiento, respectivamente, los datos de queleritrina y negativa dominante son un argumento para un papel en el mantenimiento. Ninguno de estos tratamientos afectó al aprendizaje (figura 7c), pero cada uno de ellos inhibió la memoria (figuras 7a y b). No se detectó una potenciación del aprendizaje mediante la inducción previa de PKM\zeta (datos no mostrados), ni hubo una mejora de la memoria a las 3 horas si se inducía la PKM\zeta 30 minutos tras el entrenamiento (datos no mostrados). Aunque los modelos de duración y magnitud pueden ser exclusivos artificialmente, tomados juntos, los datos son compatibles de la mayor manera con un papel de la PKM\zeta en el mantenimiento de la plasticidad sináptica dependiente de la experiencia.

La estabilidad de una sinapsis varía en respuesta a diferentes regímenes de estímulos. Los cambios de larga duración requieren normalmente múltiples estímulos y dependen de la síntesis de nuevas proteínas. Experimentos recientes apoyan la existencia de un sistema de marcado sináptico que permite que las neuronas etiqueten sinapsis activas recientemente, manteniendo así una especificidad sináptica durante el proceso en todas las células de formación de la memoria a largo plazo dependiente de la síntesis de proteína (véase, por ejemplo, U. Frey et al., Nature 385, 533-536 (1997)). Una sinapsis que sería normalmente estable durante sólo un periodo de tiempo corto puede potenciarse durante un periodo de tiempo mucho más largo. Sin embargo, para esto debe activarse en el plazo de 2-4 horas de estimulación que produce los cambios a largo plazo en una segunda y separada sinapsis dentro de la misma neurona. Aunque no se mostró ninguna evidencia directa de un papel de la PKM\zeta en este proceso mediante estos resultados, la similitud entre los intervalos temporales para la etiqueta sináptica propuesta y la potenciación de la memoria observada en este caso sugieren una relación mecanística entre las mismas.

DaPKC es parte de un complejo de múltiples proteínas importante tanto para la polaridad celular como las divisiones celulares asimétricas de la neurogénesis temprana de Drosophila (véase, por ejemplo, A. Wodarz et al, J. Cell Biol. 50, 1361-1374 (2000)). Estos procesos muestran fuertes paralelismos estructurales y funcionales con la primera división celular asimétrica de la embriogénesis de Caenorhabditis elegans. Los homólogos de Drosophila de proteínas de C. elegans importantes para este proceso, Par-3 (Bazooka) y Par-6 (DmPar-6), interaccionan entre sí y con DaPKC para dirigir una localización subcelular interdependiente y específica del complejo. Durante la embriogénesis temprana de Drosophila, Bazooka, DmPar-6 y DaPKC se localizan en la unión adherente (zonula adherens), una estructura de unión celular. Una mutación en cualquiera de estos genes altera la capacidad de las dos proteínas restantes de localizarse en esta estructura de manera apropiada, y esto altera la polaridad celular. Esta dependencia mutua para la localización también es evidente durante la neurogénesis y provoca la segregación inapropiada de determinantes celulares. Este complejo de múltiples proteínas es crítico en la polaridad celular de mamíferos y en la organización de uniones entre células epiteliales. Los homólogos de ratón de Bazooka y Par-6 se expresan en diversas regiones del SNC, y su localización subcelular dentro de las neuronas del hipocampo de CA1 es compatible con un papel en la plasticidad sináptica (véase D. Lin et al, Nature Cell Biol. 2,540-547 (2000)). Bazooka y DmPar-6 se expresan en cabezas de Drosophila, tal como DaPKC y DaPKM (figura 6a).

En este caso se ha mostrado que la PKM atípica es suficiente para potenciar la memoria en Drosophila, y los datos de queleritrina y negativa dominante sugieren que también es necesaria para una memoria normal.

Claims (4)

1. Método de identificación de una sustancia que afecta a un problema de la memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en un mamífero no humano que comprende:

(a)

determinar si dicha sustancia que va a administrarse a dicho mamífero no humano altera la expresión o la actividad de una proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central de dicho mamífero no humano en comparación con la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central en ausencia de dicha sustancia, estando dicha proteína aPKM\zeta asociada con dicho problema de la memoria a corto plazo o dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica en dicho mamífero no humano; y

(b)

indicar que dicha sustancia afecta a dicho problema de la memoria a corto plazo o a dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica cuando la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en presencia de dicha sustancia difiere de la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en ausencia de dicha sustancia.

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2. Método según la reivindicación 1, en el que el problema de la memoria a corto plazo resulta del envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer o neurodegeneración, y la disfunción psiquiátrica es un trastorno seleccionado del grupo que consiste en trastorno por déficit de atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo y fobias.

3. Método según la reivindicación 2, en el que un aumento en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia no está presente, es indicativo de una potenciación de la formación de la memoria a corto plazo de dicho problema de la memoria a corto plazo o el componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.

4. Método según la reivindicación 2, en el que una disminución en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia no está presente, es indicativa de una interferencia en la formación de la memoria a corto plazo normal o el componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.