ES2329117T3 - Alivio de los deficits de memoria y los componentes de la memoria de disfunciones psiquiatricas alterando la actividad de la pkm atipica. - Google Patents
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Abstract
Método de identificación de una sustancia que afecta a un problema de la memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en un mamífero no humano que comprende: (a) determinar si dicha sustancia que va a administrarse a dicho mamífero no humano altera la expresión o la actividad de una proteína aPKMxi en el sistema nervioso central de dicho mamífero no humano en comparación con la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en el sistema nervioso central en ausencia de dicha sustancia, estando dicha proteína aPKMxi asociada con dicho problema de la memoria a corto plazo o dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica en dicho mamífero no humano; y (b) indicar que dicha sustancia afecta a dicho problema de la memoria a corto plazo o a dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica cuando la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en presencia de dicha sustancia difiere de la expresión o la actividad de dicha proteína aPKMxi en ausencia de dicha sustancia.
Description
Alivio de los déficits de memoria y los
componentes de la memoria de disfunciones psiquiátricas alterando
la actividad de la PKM atípica.
Las enfermedades mentales son significativas por
su efecto debilitante sobre los individuos que padecen sus
manifestaciones. El resto de la sociedad se ve afectada de manera
significativa porque deben proporcionar atención a los individuos
que están aquejados de estas enfermedades. Los deterioros mentales
que resultan de tales acontecimientos como ataques son también
significativos por sus consecuencias adversas para los individuos
que sufren sus efectos debilitantes. Los déficits de memoria en los
individuos tienen consecuencias graves para ellos y para otros con
los que interaccionan. Aunque se ha dedicado mucho esfuerzo en un
intento por superar estas enfermedades, sigue habiendo grandes
deficiencias en la capacidad para entenderlas y tratarlas de manera
eficaz. Están buscándose constantemente modalidades de tratamiento
adicionales. En particular, las bases bioquímicas para estas
enfermedades o estados siguen siendo en gran parte desconocidas y el
conocimiento de estas bases fomentará descubrimientos de fármacos
adicionales.
Todas estas enfermedades o estados tienen un
componente de la memoria significativo. Esto es particularmente
cierto, obviamente, cuando la pérdida de memoria o una memoria
anómalamente mala es el principal o único síntoma. Conocer las
moléculas bioquímicas que participan de manera central en la memoria
conducirá a métodos y composiciones que reducen las anomalías de la
memoria y aliviarán las enfermedades mentales o disfunciones
psiquiátricas al dirigirse al componente de la memoria de estas
enfermedades o disfunciones.
La presente invención se refiere a métodos de
identificación de sustancias que pueden afectar a un problema de la
memoria a corto plazo o a un componente de formación de la memoria a
corto plazo de una disfunción psiquiátrica en mamíferos no humanos.
En estos métodos, una sustancia en examen ha de administrarse a un
mamífero no humano. Entonces se determina si la sustancia altera la
expresión o la actividad de la proteína aPKM\zeta en el sistema
nervioso central del mamífero no humano en comparación con la
expresión o la actividad de la misma proteína en ausencia de la
sustancia. Si hay una diferencia en tal expresión o actividad, y la
proteína aPKM\zeta está asociada con un defecto en la memoria o
una disfunción psiquiátrica dada, la sustancia afecta a ese defecto
o disfunción. La parte de la disfunción psiquiátrica que se ve
afectada cuando la sustancia altera la expresión o la actividad de
la proteína aPKM\zeta es el componente de formación de la memoria
de la disfunción. En casos particulares, un aumento en la expresión
o la actividad de la proteína aPKM\zeta cuando se administra la
sustancia es indicativo de que la sustancia potenciará el componente
de formación de la memoria de la disfunción. Por el contrario, una
disminución en la expresión o la actividad de la proteína
aPKM\zeta cuando se administra la sustancia es indicativa de que
la sustancia interferirá con el componente de formación de la
memoria de la disfunción.
En una realización preferida del método de la
invención el problema de la memoria a corto plazo resulta del
envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de
Alzheimer o neurodegeneración, y la disfunción psiquiátrica es un
trastorno seleccionado del grupo que consiste en trastorno por
déficit de atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil,
trastorno bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo y
fobias.
Además, el método de la invención se caracteriza
preferiblemente porque un aumento en la expresión o la actividad de
dicha aPKM\zeta cuando dicha sustancia está presente, en
comparación con la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta
cuando dicha sustancia no está presente, es indicativo de una
potenciación de la formación de la memoria a corto plazo de dicho
problema de la memoria a corto plazo o el componente de formación de
la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.
Además se prefiere un método en el que una
disminución en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta
cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la
expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha
sustancia no está presente, es indicativa de una interferencia en la
formación de la memoria a corto plazo normal o el componente de
formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción
psiquiátrica.
Figura 1A. Potenciación de la memoria mediante
MaPKM\zeta en Drosophila. Potenciación de la memoria
mediante inducción por choque térmico tras el entrenamiento de dos
líneas independientes que portan un transgén
hsp70-MaPKM\zeta. Se sometieron las moscas
a un entrenamiento de un solo ciclo, se dejó que se recuperaran a
25ºC y se indujo el transgén de MaPKM\zeta con un choque térmico
a 32ºC de 30 min. Se midió el comportamiento 24 h más tarde. La
inducción de la línea 14 y el control de tipo natural (WT,
wild-type) comenzaron 1 h después de terminar
el entrenamiento, y la inducción de la línea 43 comenzó 30 min.
después del entrenamiento. Ambas líneas muestran claros efectos de
inducción (n = 8 para todos los grupos). Las barras de error
representan el error estándar de la media y, a menos que se
indique, los asteriscos indican la significación estadística calcula
usando ANOVA y la prueba de Dunnet durante todo este trabajo.
Figura 1B. Especificidad temporal de la
potenciación de la memoria mediante MaPKM\zeta. Se sometieron las
moscas transgénicas para MaPKM\zeta (línea 14) a un choque térmico
a 25-32ºC de 30 min. en diversos momentos antes y
después de un solo ciclo de entrenamiento, y se sometieron a prueba
para determinar la memoria a las 24 h. Histogramas de izquierda a
derecha: el choque térmico finalizó 1 h antes, 30 min. después, 1 h
después o 2 h después de que comenzara el entrenamiento; el choque
térmico comenzó 30 min., 1 h después o 2 h después de que
finalizara el entrenamiento, respectivamente, n = 8 para todos los
grupos.
Figura 2A. La potenciación de la memoria
requiere una actividad cinasa persistente y no se debe a la
potenciación sensorial. Ni un mutante
cinasa-inactivo (KI,
kinase-inactive) de MaPKM\zeta ni una
MaPKC\zeta de longitud completa (FL,
full-length) potencian la memoria a las 24 h.
Se evaluaron dos líneas independientes (FL-3A,
FL-14A) del transgén
hsp70-MaPKC\zeta de longitud completa
(Métodos) y dos líneas independientes (KI-1 y
KI-2) de un transgén
hsp70-KI-MaPKM\zeta para
determinar la potenciación de la memoria. El mutante
KI-MaPKM\zeta (K281W) perturba la actividad cinasa
alterando el dominio de unión a ATP. Se usaron dos programas de
choque térmico diferentes: una inducción a 32ºC de 30 min., 3 h
antes del entrenamiento, o un choque térmico a 32ºC de 30 min.,
aplicado 30 min. tras la finalización del entrenamiento. Ningún
régimen de choque térmico produjo una potenciación dependiente de
la inducción de la memoria a las 24 h en ninguna de esas líneas.
Figura 2B. La potenciación de la memoria
requiere una actividad cinasa persistente y no se debe a la
potenciación sensorial. La inducción de MaPKM\zeta no afecta a
los comportamientos periféricos. Se sometieron las moscas a un
choque térmico a 32ºC de 30 min., se dejó que se recuperaran durante
1 h, después se sometieron a prueba para determinar la reactividad
al choque. Se sometió a prueba la agudeza olfativa exponiendo las
moscas a un choque térmico a 32ºC de 30 min., y se sometió a prueba
para determinar la agudeza olfativa 24 h más tarde. La leyenda
insertada en el panel de agudeza olfativa es de aplicación a ambos
conjuntos de histogramas. En todas las medidas, ambas líneas de
MaPKM\zeta (14 y 43) no podían distinguirse de los controles de
tipo natural. El control más crítico es la prueba de agudeza
olfativa de 10^{-2}, y para ello se expusieron a choque térmico
(o no) las moscas transgénicas, se almacenaron y se sometieron a
prueba simultáneamente con sus respectivos controles de tipo
natural. Ambos conjuntos de controles de tipo natural, adyacentes a
sus homólogos transgénicos, se incluyeron para la comparación
directa.
Figura 3A. Expresión y análisis bioquímicos de
líneas transgénicas. Análisis de inmunotransferencia de tipo
Western de inducción de MaPKM\zeta y MaPKC\zeta tras el choque
térmico. Se sometieron las moscas a choque térmico (32ºC o 37ºC)
durante 30 min. Parte superior, inmunotransferencia de tipo Western
con transcurso de tiempo de ambas líneas de MaPKM\zeta. En los
momentos indicados, se recogieron las moscas y se usaron extractos
de cabeza para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Parte central, comparación directa de la inducción conseguida a
32ºC frente a 37ºC. En cada caso, se sometieron las moscas a choque
térmico durante 30 min., y se prepararon extractos de cabeza tras 3
h de tiempo de recuperación. Parte inferior, comparación directa de
la expresión de la MaPKM\zeta (línea 14), la MaPKM\zeta
cinasa-inactiva (KI) (KI-1) y la
MaPKC de longitud completa (FL) (FL-14A). Para cada
inmunotransferencia de tipo Western, se cargaron cantidades
equivalentes de proteína total (cinco cabezas por carril) en cada
carril.
Figura 3B. Expresión y análisis bioquímicos de
líneas transgénicas. La inducción de MaPKM\zeta da como resultado
un aumento en la actividad de PKC atípica en extractos de cabeza de
mosca. Se sometieron las moscas transgénicas para MaPKM\zeta
(línea 43) a un choque térmico a 37ºC durante 30 min., se dejó que
se recuperaran a 25ºC durante 1 h y se congelaron en nitrógeno
líquido. Las moscas control permanecieron a 25ºC todo el tiempo. Se
prepararon extractos de proteína total a partir de cabezas de mosca
y se sometieron a ensayo para determinar la actividad de PKC. Pudo
detectarse un aumento en la actividad cinasa (-Ca^{2+}/- PMA: HS+
frente a -HS, p = 0,0057, n = 4; +Ca^{2+}/+PMA: HS+ frente a -HS,
p = 0,0011, n = 4: prueba de la t de Student) con un choque térmico
fuerte (37ºC) pero no con uno suave (32ºC) (datos no mostrados). Los
niveles de inducción son mucho mayores a 37ºC frente a 32ºC
(a).
Figura 4A. La inducción de MaPKM\zeta potencia
la memoria a los 4 días tras un entrenamiento masivo, pero no tras
uno espaciado. La inducción de MaPKM\zeta tras un entrenamiento
masivo potencia la memoria a los 4 días. Se entrenaron las moscas
con MaPKM\zeta con 10 ciclos de entrenamiento masivo, se dejó que
descansaran durante 30 min., después se sometieron a un choque
térmico de 30 min. (32ºC). Se midió el comportamiento a los 4 días;
n=8 para todos los grupos. Ambas líneas (14 y 43) muestran una
mejora dependiente de la inducción significativa de la memoria a
los 4 días. A los 4 días, la memoria inducida mediante el
entrenamiento masivo ha decaído normalmente de modo que PI = 0, tal
como es el caso para las moscas no inducidas (-HS).
Figura 4B. La memoria a los cuatro días
producida por el entrenamiento espaciado no mejora mediante la
inducción de MaPKM\zeta. Se entrenaron las moscas con
MaPKM\zeta con 10 ciclos de entrenamiento espaciado (Métodos), se
dejó que descansaran durante 30 min. y se sometieron a un choque
térmico a 32ºC de 30 min. Se midió la memoria 4 días tras el
entrenamiento. n = 8 para todos los grupos. Ninguna línea muestra un
efecto significativo de la inducción del transgén sobre la memoria
tras el entrenamiento espaciado. Para descartar un efecto de
saturación, también se entrenó a las moscas con un número submáximo
de ensayos espaciados (7), pero la inducción del transgén todavía
no tuvo ningún efecto (datos no mostrados).
Figura 5. La inducción de MaPKM\zeta corrige
el déficit de memoria de mutantes rábano. Se aparearon hembras
rábano homocigóticas con machos homocigóticos para un transgén de
MaPKM\zeta autosómico. (Se usó la línea 43 en este experimento.)
Se entrenó la progenie macho y hembra de este apareamiento y se
sometieron a prueba conjuntamente, proporcionando un control
interno, y entonces se contaron por separado para generar valores
de PI específicos del sexo. Los genotipos de los machos y de las
hembras se facilitan debajo del histograma. Usando la prueba de
Dunnet con hembras no inducidas como grupo control, el único grupo
que muestra un comportamiento estadísticamente diferente es el de
los machos no inducidos (indicado por el asterisco). El análisis de
grupos HS+ frente a HS usando la prueba de la t de Student muestra
que tanto los machos como las hembras presentan diferencias
significativas en el comportamiento por la inducción del transgén
(indicado por #).
Figura 6A. Un homólogo de Drosophila de
MaPKM\zeta está presente y activo en extractos de cabeza de
Drosophila. Los antisueros frente a MaPKC/M\zeta detectan
DaPKC y DaPKM. Se analizaron extractos separados de cabezas y
cuerpos de mosca en inmunotransferencias de tipo Western usando
antisueros dirigidos frente a los 16 aminoácidos
C-terminales de MaPKC/M\zeta. Los pesos
moleculares de las dos bandas inmunorreactivas concuerdan con los
predichos para las isoformas DaPKC (73 kDa) y DaPKM (55 kDa). La
DaPKM putativa está enriquecida en cabezas. Figura 6B. Péptidos
específicos para DaPKC compiten con la inmunorreactividad de DaPKC y
DaPKM. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western en
extractos de cabeza. Se añadió el antisuero junto con un exceso de
0,1, 10, 100 ó 1000 veces de péptido DaPKC-590. Este
péptido se deriva del extremo C-terminal de la
proteína DaPKC. Se preparó el antisuero frente al extremo
C-terminal de MaPKC\zeta, que es homólogo a la
proteína DaPKC. Un péptido derivado de una región de DaPKC en el
sentido de 5' (545) no compite con la inmunorreactividad incluso a
un exceso de 1.000 veces.
Figura 6C. La actividad de PKC atípica está
enriquecida en extractos preparados a partir de cabezas de
Drosophila. Se prepararon extractos separados a partir de
cabezas y cuerpos de mosca de tipo natural tal como en (a). Se
sometieron a ensayo para determinar la actividad aPKC tal como en la
figura 2b.
Figura 7A. El tratamiento con queleritrina o la
expresión de KI-MaPKM\zeta inhibe la memoria a las
24 h producida por entrenamiento masivo, pero no el aprendizaje, en
Drosophila. La queleritrina inhibe la memoria a las 24 h
tras el entrenamiento masivo de una manera dependiente de la dosis.
Se alimentaron las moscas de tipo natural o bien con sacarosa (0
\muM) o queleritrina 25 \muM, 50 \muM o 100 \muM en una
disolución de sacarosa. Se les dieron tres ciclos de entrenamiento
masivo y se les evaluó para determinar la memoria a las 24 h. n = 8
para todos los grupos.
Figura 7B. El mutante
KI-MaPKM\zeta inhibe la memoria a las 24 h
producida por el entrenamiento masivo. Se indujo cada línea del
transgén
hsp70-KI-MaPKM\zeta
(KI-1 y KI-2) con un choque térmico
a 37ºC, de 30 min., se dejó que se recuperaran durante 3 h a 25ºC,
y después se les dio 10 ciclos de entrenamiento masivo. La
inducción de la línea KI-1 provocó una reducción
significativa en la memoria a las 24 h, y las moscas
KI-1 inducidas también eran significativamente
diferentes de las moscas control inducidas (WT, HS+). La inducción
de la línea KI-2 también parece reducir la memoria,
pero esta línea puede no ser tan eficaz como KI-1. n
= 8 para todos los grupos.
Figura 7C. Ni la inducción de queleritrina ni de
KI-MaPKM\zeta afecta al aprendizaje. Tras un
periodo de ayuno de 1 h, se alimentó a las moscas de tipo natural
con o bien sacarosa (0 \muM) o bien queleritrina 100 \muM en
una disolución de sacarosa durante 3 h. Se indujo el
KI-MaPKM\zeta tal como en (b). En ambos casos, se
les dio entonces a las moscas un entrenamiento de un solo ciclo y se
les sometió a prueba inmediatamente tras el entrenamiento para
evaluar el aprendizaje. No hubo diferencia entre los grupos
relevantes: las moscas alimentadas con sacarosa no eran diferentes
de las moscas alimentadas con queleritrina, y las moscas WT HS+ no
eran diferentes de las moscas KI-1 HS+ o
KI-2 HS+. n = 8 para todos los grupos.
Figura 8A. La inducción de DaPKM potencia la
memoria. DaPKM potencia la memoria a las 24 h tras un entrenamiento
de un solo ciclo. Se les dio a las moscas un entrenamiento de un
solo ciclo, se dejó que se recuperaran a 25ºC durante 30 min., y se
indujo el transgén de DaPKM mediante un choque térmico a 32ºC que
duró 30 min. Se midió el comportamiento 24 h más tarde. Se
sometieron a prueba tres líneas transgénicas independientes (FI9,
M40 y M78). n = 8 para todos los grupos. Los asteriscos indican
diferencias significativas.
Figura 8B. DaPKM potencia la memoria a los 4
días tras el entrenamiento masivo. Se entrenaron moscas
DaPKM-M78 con 10 ciclos de entrenamiento masivo, se
dejó que se recuperaran durante 30 min. a 25ºC, y se indujeron como
en (a). Se midió el comportamiento a los 4 días; n = 8 para todos
los grupos. Sólo se usó la línea M78 para este análisis y muestra
una mejora dependiente de la inducción significativa de la memoria a
los 4 días.
Figura 8C. Análisis de inmunotransferencia de
tipo Western de la inducción de DaPKM tras un choque térmico. Se
sometieron las moscas a un choque térmico (32ºC) durante 30 min.
Parte izquierda, inmunotransferencias de tipo Western con
transcurso de tiempo de la línea DaPKM-M78. En los
momentos indicados, se recogieron las moscas y se usaron extractos
de cabeza para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Todos los tiempos son en relación con el final del tratamiento por
choque térmico. Parte derecha, comparación directa de la inducción
de las líneas M40 y M78. En ambos paneles, la banda superior es una
banda de fondo incluida como una referencia de control de la
carga.
Esta invención se refiere a métodos de alivio de
problemas de la memoria y disfunciones psiquiátricas en mamíferos
no humanos modulando la expresión o la actividad de una forma
truncada de una proteína aPKC\zeta en el sistema nervioso central
del mamífero no humano. La expresión de la forma truncada de la
proteína aPKC\zeta se modula afectando a procesos moleculares de
transcripción, estabilidad de ARNm, estabilidad de proteínas,
procesamiento proteolítico e iniciación de la traducción. La
actividad de la proteína se modula mediante modificaciones
postraduccionales en la proteína, interacciones proteína:proteína y
ubicación subcelular de la proteína.
La modulación de la expresión se produce cuando
la cantidad de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta difiere
de la cantidad que está presente sin modulación. Puede haber un
aumento en la cantidad de forma truncada de la proteína
aPKC\zeta, una disminución en la cantidad de forma truncada de la
proteína aPKC\zeta, o una variación con respecto a un intervalo
de tiempo definido de un aumento y/o una disminución en la cantidad
de forma truncada de la proteína aPKC\zeta. Por ejemplo, la
cantidad de forma truncada de la proteína aPKC\zeta puede
aumentar de modo lineal o no lineal con respecto al tiempo,
disminuir de modo lineal o no lineal, o de manera alternante
aumentar y disminuir, de manera lineal o no lineal. Generalmente se
prefiere un aumento en la cantidad de la forma truncada de la
proteína aPKC\zeta, o en la cantidad de una forma inhibidora de
la proteína, de modo lineal o no lineal, para el alivio de
disfunciones psiquiátricas.
La proteína que se forma mediante el proceso de
expresión en esta invención es una forma truncada de una proteína
aPKC\zeta. Esta proteína se produce o bien mediante síntesis de la
proteína de longitud completa, seguido por procesamiento
proteolítico, o bien mediante síntesis de novo de la forma
truncada de la proteína, aPKM\zeta. Esta síntesis de novo
puede producirse a partir de los sitios de iniciación de la
transcripción ubicados en regiones intrónicas del gen, y/o la
iniciación de la traducción a partir de codones de metionina
internos.
La modulación de la expresión de la forma
truncada de una proteína aPKC\zeta puede producirse o bien
mediante una inducción o bien mediante una inhibición de la
expresión de la forma truncada. Cuando se produce la inducción de
la expresión, se produce más de la forma truncada que cuando esta
inducción no está presente. Cuando se produce la inhibición de la
expresión, se produce menos de la forma truncada que cuando esta
inhibición no está presente. En determinadas condiciones, una
cantidad dada de la forma truncada de la proteína aPKC\zeta puede
producirse normalmente. En estas condiciones, la inducción de la
expresión aumenta la cantidad de la forma truncada que se produce y
la inhibición de la expresión reduce la cantidad de la forma
truncada que se produce a partir de esta cantidad dada. En estos
casos, la modulación de la expresión de la forma truncada provoca
un aumento, una disminución, o un aumento y una disminución
alternantes, de manera lineal o no lineal, a partir de la cantidad
dada que está presente normalmente.
La forma truncada preferida de la proteína
aPKC\zeta es aPKM\zeta. Ésta es la forma truncada de la isozima
PKC\zeta atípica que carece del dominio regulador
N-terminal de la proteína PKC\zeta. El dominio
regulador N-terminal contiene una región
pseudosustrato así como sitios de unión para los cofactores
requeridos. La aPKM\zeta, que carece de este dominio regulador
N-terminal, contiene el dominio catalítico
C-terminal y es una cinasa activa de manera
persistente derivada de la isozima aPKC\zeta. Se prefieren la
inducción de la expresión de la proteína aPKM\zeta o la
inhibición de la expresión de la proteína aPKM\zeta en esta
invención para aliviar trastornos psiquiátricos. De éstas, la
inducción de la expresión es la más preferida.
Los problemas de la memoria normales pueden
aliviarse modulando la expresión o la actividad de aPKM\zeta.
Estos problemas de la memoria pueden resultar del envejecimiento
normal, una lesión traumática en el cerebro, la enfermedad de
Alzheimer y neurodegeneración. Los trastornos de memoria clásicos
incluyen la pérdida o la falta de capacidad para recordar
acontecimientos o experiencias pasados específicos. La pérdida o la
falta de capacidad para realizar asociaciones apropiadas o normales
entre estos acontecimientos previos o experiencias pasadas se
incluye también en estos trastornos. Estos trastornos incluyen
también la pérdida o la falta de capacidad para realizar
asociaciones apropiadas o normales entre acontecimientos previos o
experiencias pasadas y experiencias o funciones cognitivas
actuales. La pérdida de memoria a corto plazo y la pérdida de
memoria a largo plazo son déficits de memoria particulares que se
incluyen en estos trastornos. Las pérdidas de memoria a corto plazo
son la pérdida o falta de capacidad para recordar o realizar
asociaciones correctas o apropiadas entre percepciones actuales y
experiencias o acontecimientos recientes. Las pérdidas de memoria a
largo plazo son la pérdida o falta de capacidad para recordar o
realizar asociaciones correctas o apropiadas entre percepciones
actuales y experiencias o acontecimientos que se percibieron tiempo
atrás por el individuo. La distinción entre la memoria a corto
plazo y la memoria a largo plazo varía con la especie animal, la
tarea conductual y el régimen de entrenamiento, y generalmente la
conocen las personas para las que esta distinción es importante.
Para todos los animales, la memoria a largo plazo es la fase de
memoria cuya inducción es sensible a los inhibidores de la síntesis
de proteínas proporcionados de manera aguda aproximadamente durante
el tiempo de entrenamiento. La memoria a largo plazo es todas las
fases de memoria que son resistentes a tales inhibidores.
Generalmente, las memorias a corto plazo duran desde minutos, hasta
horas y unos pocos días tras el entrenamiento, mientras que las
memorias a largo plazo persisten durante periodos de tiempo más
largos.
Muchos problemas de la memoria y disfunciones
psiquiátricas pueden aliviarse modulando la expresión de aPKM\zeta
en animales. El alivio de una disfunción psiquiátrica dada se
produce cuando los síntomas de la disfunción se reducen y el
individuo muestra modos y patrones de comportamiento más normales.
En determinados casos, y deseados habitualmente, el alivio de una
disfunción psiquiátrica dada se completa esencialmente y el
individuo muestra un comportamiento normal. En casos poco comunes,
el individuo muestra rasgos de comportamiento normales antes de
modular la expresión de proteína aPKM\zeta. En estas
circunstancias, se busca un comportamiento mejor que el normal y la
expresión de la forma truncada se modula para conseguir este
resultado.
Entre los problemas de la memoria que pueden
aliviarse modulando la expresión de aPKM\zeta están los que
resultan del envejecimiento normal, una lesión en el cerebro, la
enfermedad de Alzheimer o neurodegeneración. Entre las disfunciones
psiquiátricas que pueden aliviarse modulando la expresión de
aPKM\zeta están el trastorno por déficit de atención, autismo,
síndrome del cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia,
trastorno obsesivo compulsivo y fobias.
La memoria se ve afectada por la modulación de
la expresión de la proteína aPKM\zeta. Dependiendo de la isoforma
de la proteína que se modula, las memorias pueden potenciarse o
bloquearse. La aPKM\zeta parece tener un efecto evidente sobre la
memoria a corto plazo cuando se modula su expresión. La memoria a
corto plazo mejora cuando se induce la expresión de
aPKM\zeta.
Sin restringirse a ningún mecanismo de acción,
parece que las disfunciones psiquiátricas que se alivian modulando
la expresión de una forma truncada de aPKM\zeta en el sistema
nervioso central del animal se ven ayudadas o mitigas porque la
modulación afecta al componente de formación de la memoria de la
disfunción psiquiátrica. Realizando los cambios apropiados en el
componente de formación de la memoria, los síntomas de la disfunción
psiquiátrica se reducen y la disfunción psiquiátrica se altera de
una manera favorable. En muchos casos, es el componente de la
memoria a corto plazo de las disfunciones psiquiátricas el que se ve
afectado modulando la expresión de la proteína aPKM\zeta. La
inducción de la expresión de la aPKM\zeta provoca una potenciación
del componente de la memoria a corto plazo de la disfunción
psiquiátrica. La inhibición de la expresión o actividad de
aPKM\zeta provoca una interferencia con el componente de la
memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica. O bien una
potenciación o bien una interferencia con el componente de la
memoria a corto plazo puede aliviar una disfunción psiquiátrica
dada. Se empleará cualquier proceso que se desee para aliviar la
disfunción psiquiátrica. Por ejemplo, cuando un individuo muestra
una falta o pérdida de capacidad de memoria a corto plazo, puede
inducirse la expresión de aPKM\zeta para mitigar la
sintomatología.
sintomatología.
La cantidad de forma truncada de proteína
aPKC\zeta en el sistema nervioso central del animal puede
cambiarse o modularse de una variedad de maneras. Puede modularse
la transcripción del gen endógeno. Cualquier molécula pequeña o
estímulo fisiológico que afecte a las cantidades o la actividad de
los factores de transcripción diferentes que modulan la expresión
génica afectará a los niveles del ARNm y de la proteína.
Alternativamente, pueden realizarse manipulaciones basadas en ADN
para cambiar la regulación del gen endógeno. Pueden añadirse
secuencias reguladoras exógenas al gen endógeno, poniendo el gen
bajo el control de diferentes secuencias de ADN, proteínas que se
unen a esas secuencias y efectores que afectan a esas proteínas. En
estas situaciones, la modulación de la expresión de la forma
truncada se produce cuando el efector se administra desde una fuente
externa o se retiene, dependiendo de la acción que se produce en el
sitio de regulación.
Otra manera de cambiar o modular la cantidad de
proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central del animal es
usar tecnología transgénica. Un transgén que codifica para una
proteína aPKM\zeta deseada se inserta en el genoma del animal. El
transgén puede insertarse usando técnicas recombinantes reconocidas
por y conocidas para los expertos tales como los biólogos
moleculares. El animal transgénico puede contener una o más copias
del transgén que codifica para la forma truncada de la proteína
aPKM\zeta. Este transgén puede contener el gen endógeno. Más
probablemente, el transgén codifica para una proteína aPKM\zeta
seleccionada de otra especie animal. En cualquier caso, el transgén
puede estar bajo el control o bien de sitios de regulación endógenos
o bien sitios de regulación obtenidos de fuentes exógenas. Pueden
emplearse sitios de regulación endógenos cuando el transgén se
inserta en un locus apropiado en el genoma en el que se controla la
expresión génica mediante el sitio de regulación endógeno. Sin
embargo, se emplean con mayor frecuencia sitios de regulación de
fuentes exógenas cuando se usan transgenes. Los sitios de regulación
son con frecuencia más fáciles de incluir con los transgenes cuando
se realizan las inserciones en el genoma. En cualquier situación, el
transgén insertado que codifica para la aPKM\zeta deseada
proporciona un mayor control de la modulación, particularmente
inducción, de la expresión de la forma truncada. Este aumento de
control potencia la capacidad para aliviar defectos de la memoria y
disfunciones psiquiátricas.
Una manera adicional de cambiar la cantidad de
proteína aPKM\zeta en un individuo no humano es mediante la
administración de la propia proteína al individuo no humano. La
proteína se administra de modo que es activa en el sistema nervioso
central del individuo y de ese modo alivia el defecto de la memoria
o la disfunción psiquiátrica alterando el componente de formación
de la memoria de la disfunción. Esta proteína puede ser una forma
activa o inhibidora de la molécula.
Esta invención se refiere específicamente a
métodos de identificación de sustancias que afectan a la formación
de memoria a corto plazo o a un componente de formación de la
memoria a corto plazo de una disfunción psiquiátrica en mamíferos
no humanos. La sustancia tendrá habitualmente una estructura química
orgánica y está en forma de un producto farmacéutico con los
diluyentes, excipientes y vehículos requeridos presentes en su
formulación. La sustancia puede ser una macromolécula pero
habitualmente es mucho más pequeña. En estos métodos, la sustancia
en consideración se administra a un mamífero. La administración es
mediante cualquier vía convencional. Por ejemplo, la administración
puede producirse mediante administración oral o rectal, inhalación,
aplicación tópica, o por vía parenteral mediante inyección
subcutánea, intravenosa o intramuscular. Una vez administrada, se
determina si la sustancia altera la expresión o la actividad de una
proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central del mamífero no
humano, en el que se ha mostrado previamente que la proteína
aPKM\zeta está asociada con la disfunción psiquiátrica de
interés. La asociación de la proteína aPKM\zeta y la disfunción
psiquiátrica puede ser directa o indirecta. La asociación está
presente si una alteración en la cantidad o actividad de la
proteína aPKM\zeta o bien potencia o bien reduce los signos o
síntomas de la disfunción psiquiátrica. La asociación está presente
si una alteración en la expresión genética de la proteína
aPKM\zeta o bien potencia o bien reduce los signos o síntomas de
la disfunción psiquiátrica. La alteración de la expresión o la
actividad de la proteína aPKM\zeta se determina comparando la
expresión o la actividad de esta proteína tras haber administrado
la sustancia al mamífero no humano con la expresión de la proteína
cuando no se ha administrado la sustancia. Si se encuentra una
diferencia reproducible entre los valores de expresión o actividad
para la proteína aPKM\zeta cuando la sustancia está presente
frente a cuando la sustancia no está presente, se identifica la
sustancia como que tiene la propiedad de afectar a la disfunción
psiquiátrica con la que está asociada la proteína aPKM\zeta. La
sustancia puede identificarse además como que tiene un efecto
aliviador o uno perjudicial sobre la disfunción psiquiátrica,
dependiendo de la relación del cambio de expresión con la calidad o
intensidad de los signos o síntomas de la disfunción psiquiátrica.
Por ejemplo, si un aumento en la expresión o la actividad de la
proteína aPKM\zeta está asociado con un alivio de los signos o
síntomas de la disfunción psiquiátrica y la sustancia, cuando se
administra, provoca un aumento en la expresión o la actividad de la
proteína aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene
propiedades ventajosas para aliviar la disfunción psiquiátrica.
Con frecuencia para la aPKM\zeta, cuando la
sustancia administrada provoca un aumento en la expresión o la
actividad de la aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene la
propiedad de potenciar el componente de formación de la memoria de
la disfunción psiquiátrica. Con frecuencia, es el componente de la
memoria a corto plazo de la disfunción psiquiátrica que se potencia
cuando la sustancia administrada provoca un aumento en la expresión
de aPKM\zeta. A la inversa, cuando la sustancia administrada
provoca una disminución en la expresión o la actividad de la
aPKM\zeta, se considera que la sustancia tiene la propiedad de
interferir con el componente de formación de la memoria de la
disfunción psiquiátrica. En este caso, es de nuevo con frecuencia el
componente de formación de la memoria a corto plazo de la
disfunción psiquiátrica que se interfiere con o se bloquea mediante
la sustancia administrada.
Esta invención se refiere además a métodos para
evaluar los efectos de fármacos sobre el componente de formación de
la memoria de una disfunción psiquiátrica. En estos métodos, el
fármaco candidato se administra a un animal no humano normal o a un
animal que tiene una proteína aPKM\zeta inducible que está
asociada con la formación de la memoria. El fármaco habitualmente
tiene una estructura química orgánica y se administra mediante
cualquiera de las vías de administración convencionales junto con
cualquier diluyente, excipiente o vehículo requerido. En estos
métodos, el tipo de animal no se limita a mamíferos no humanos sino
que incluye la mayor parte del reino animal. Por ejemplo, pueden
usarse insectos tales como Drosophila melanogaster o
abejas como sujetos para valorar los efectos de fármacos sobre el
componente de formación de la memoria. Otros organismos modelo para
evaluar los efectos de fármacos sobre la formación de la memoria
incluyen C. elegans, Aplysia, Xenopus, pez cebra, ratón,
ratas, hurones y gatos. El único requisito para el tipo de animal es
que tenga una forma truncada inducible de una proteína aPKC\zeta
que esté asociada con la formación de la memoria.
Tras la administración del fármaco candidato al
animal no humano en estos métodos, se induce la proteína aPKM\zeta
inducible para producir la forma truncada en el animal no humano, o
se examina el gen endógeno en el animal no humano no transgénico.
La inducción puede realizarse mediante cualquiera de los métodos
conocidos por las personas que están familiarizadas con tales
procesos. En C. elegans, los médicos usan habitualmente
choque térmico, antibióticos o pequeñas moléculas tales como IPTG.
En Drosophila, los médicos usan habitualmente choque
térmico, antibióticos o pequeñas moléculas tales como IPTG o metales
pesados. En mamíferos, los médicos usan habitualmente antibióticos,
hormonas o pequeñas moléculas como IPTG.
Tras haberse inducido la expresión de la
proteína aPKM\zeta en el animal no humano transgénico, o el gen
endógeno en el animal no humano normal, se somete el animal no
humano a un ensayo de aprendizaje y memoria, y se asigna un índice
de comportamiento, basándose en el resultado del protocolo. Los
psicólogos y otros que estudian el aprendizaje y la memoria en
animales conocen las pruebas de aprendizaje y memoria. Los
protocolos de entrenamiento que son útiles en esta invención tratan
los atributos de aprendizaje y memoria que tiene el animal. Puede
usarse cualquier protocolo de condicionamiento clásico
discriminativo. Ejemplos de estos protocolos son los protocolos de
condicionamiento asociativo y no asociativo, el condicionamiento
clásico y operante, y las pruebas de memoria implícita y explícita.
El índice de comportamiento es una valoración de los resultados del
protocolo de entrenamiento que se usó. Con frecuencia, el índice de
comportamiento es un valor numérico que se asigna por el observador
o investigador al resultado del protocolo de entrenamiento. Puede
considerarse que el valor numérico es una puntuación a escala del
comportamiento del animal con el que está probándose el protocolo
de condicionamiento clásico.
En estos métodos, se considera que el fármaco
tiene un efecto sobre la formación de la memoria o el componente de
formación de la memoria de la disfunción psiquiátrica cuando
animales no humanos tratados con el compuesto tienen un
comportamiento de manera reproducible diferente del de los animales
no humanos no tratados. En algunos casos, el mismo animal no humano
individual puede servir como el animal no humano control y como el
que al que se le va a administrar el fármaco. Sin embargo,
habitualmente diferentes animales sirven como los animales no
tratados (control) y los tratados (sujeto). En estos casos, los
animales deben elegirse de la misma cohorte. Los fármacos que
muestran un efecto sobre el componente de formación de la memoria,
tal como se detecta mediante estos métodos, son candidatos para su
administración a animales no humanos para aliviar disfunciones
psiquiátricas en estos animales no humanos, particularmente cuando
la disfunción psiquiátrica tiene un componente de formación de la
memoria.
En estos métodos, la diana inducible del fármaco
es aPKM\zeta. En estos casos, es normalmente el componente de
formación de la memoria a corto plazo del problema de la memoria o
disfunción psiquiátrica el que se ve afectado por el fármaco. Los
problemas de la memoria seleccionados a los que se dirigen los
fármacos seleccionados incluyen los que resultan del envejecimiento
normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer y
neurodegeneración. Las disfunciones psiquiátricas para las que los
fármacos seleccionados mediante estos métodos tendrán un efecto
incluyen trastorno por déficit de atención, autismo, síndrome del
cromosoma X frágil, trastorno bipolar, esquizofrenia, trastornos
obsesivo compulsivos, y fobias.
El estudio de PKC en la formación de la memoria
tiene una larga historia. Sin embargo, la mayoría de los estudios
anteriores se realizaron antes de que se apreciara la complejidad de
la familia de genes de PKC. La familia de PKC puede dividirse en
tres clases basándose en sus requerimientos de cofactor. Mientras
que todas las proteínas PKC requieren fosfatidilserina para su
activación, los isotipos "convencionales" (cPKC) requieren
diacilglicerol (DAG) y Ca2+ para una actividad completa; los
isotipos "novedosos" (nPKC) son independientes del Ca2+ pero
todavía requieren DAG, y los isotipos "atípicos" (aPKC) son
independientes tanto de DAG como de Ca2+. Estructuralmente, estas
cinasas pueden dividirse en un dominio regulador
N-terminal, que contiene una región pseudosubstrato
así como los sitios de unión para los cofactores requeridos, y el
dominio catalítico C-terminal. La eliminación del
dominio regulador N-terminal produce una cinasa
activa de manera persistente, denominada PKM.
Los papeles de PKC en modelos de hipocampo de
plasticidad sináptica, potenciación a largo plazo (LTP,
long-term potentiation) y depresión a largo
plazo (LTD, long-term depression) se han
estudiado ampliamente (véase, F. Angenstein, et al., Prog.
Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 21, 427-454
(1997)). Análisis de inmunotransferencia de tipo Western con
anticuerpos específicos para cada una de las isoformas de PKC de
rata demuestran que la única cuyos niveles aumentan específicamente
y se mantienen elevados durante la fase de mantenimiento de LTP es
PKM\zeta, la forma truncada de la isozima atípica PKC\zeta
(véase, por ejemplo, Osten, P. et al., J. Neurosci. 16,
2404-2451 (1996)). Análisis de expresión también
muestran que el mantenimiento de LTD está asociado con niveles
decrecientes de PKM\zeta. De la manera más interesante, el
mantenimiento de LTP se suprime mediante la aplicación sostenida de
bajas concentraciones del inhibidor de PKC queleritrina, mientras
que la perfusión de PKM\zeta en células piramidales de CA1
produce un aumento en la transmisión sináptica mediada por los
receptores de AMPA (D. S. F. Ling et al, datos no
publicados).
En Drosophila, el ensayo mejor
caracterizado para el aprendizaje y la memoria asociativos es una
tarea conductual para evitar un olor (T. Tully, et al. J.
Comp. Physio. A157, 263-277 (1985) incorporado al
presente documento como referencia). Este condicionamiento clásico
(pavloviano) implica exponer las moscas a dos olores (los estímulos
condicionados o CS (conditioned stimuli)), de uno en uno, en
sucesión. Durante una de estas exposiciones a olor (el CS+), se
someten las moscas simultáneamente a un choque eléctrico (el
estímulo no condicionado o US (unconditioned stimulus)),
mientras que la exposición al otro olor (el CS-) carece de este
refuerzo negativo. Tras el entrenamiento, se colocan entonces las
moscas en un "punto de elección", en el que los olores
proceden de sentidos opuestos, y se espera a que decidan qué olor
evitar. Por convención, el aprendizaje se define como el
comportamiento de la mosca cuando las pruebas se producen
inmediatamente tras el entrenamiento. Un solo ensayo de
entrenamiento produce un aprendizaje fuerte: una respuesta típica
es que > 90% de las moscas evitan el CS+. El comportamiento de
las moscas de tipo natural con respecto a este entrenamiento de un
solo ciclo disminuye a lo largo de un periodo de aproximadamente 24
horas hasta que las moscas se distribuyen una vez más de manera
uniforme entre los dos olores. Las moscas también pueden formar
memorias olfativas asociativas de larga duración, pero normalmente
esto requiere regímenes de entrenamiento repetitivos.
Esta tarea en Drosophila se usó para
examinar de una manera a modo de ejemplo en el presente documento
el papel de la PKM atípica en la formación de la memoria. La
inducción del transgén de aPKM\zeta (MaPKM\zeta) de ratón
potencia la memoria y corrige el defecto de la memoria de mutantes
rábano. Hay una única PKC atípica en Drosophila
(http://www.fruitfly.org), y se encontró que la isoforma "M"
truncada, DaPKM, preferentemente se expresaba y era activa en
cabezas de mosca. La intervención tanto genética negativa dominante
como farmacológica de la actividad DaPKC/M altera la memoria
normal. Finalmente, la inducción de la DaPKM predicha también
potencia la memoria, demostrando además un papel general de la aPKM
en los procesos de memoria.
A continuación viene una descripción de
realizaciones preferidas de la invención.
La reserva de fondo (2202u) usada como moscas de
tipo natural en todos los experimentos es w (isoCJl), que es una
línea isogénica derivada de una línea w^{1118} retrocruzada
de manera repetida con una cepa de tipo natural
Canton-S. Para minimizar las diferencias en el fondo
genético, 2202u también sirvió como la cepa receptora para todas
las líneas transgénicas usadas en estos experimentos. Las reservas
de moscas usadas para los análisis conductuales se mantuvieron en
condiciones apropiadas.
Aprendizaje pavloviano y memoria en
Drosophila. Para evaluar el aprendizaje y la memoria en
Drosophila, se usó un protocolo de condicionamiento clásico
(pavloviano) para evitar un olor. Este protocolo se modificó para
facilitar regímenes de entrenamiento automatizados y repetitivos. Se
usaron 3-octanol (OCT) y
4-metilciclohexanol (MCH) como olores en estos
experimentos. Pueden encontrarse descripciones detalladas de pruebas
así como entrenamiento masivo de un solo ciclo y espaciado, y las
pruebas para determinar la agudeza olfativa y la reactividad a
choques en Tully et al., Cell 79, 35-47
(1994) o Connolly, J. B. & Tully T., Drosophila. A
Practical Approach (ed. Roberts, D. B., Oxford Univ. Press, Oxford
1998) incorporado al presente documento como referencia. El índice
de comportamiento (PI, performance index) se calculó restando
el número de moscas que hacen la elección incorrecta de las que
hacen la elección correcta, dividiendo entre el número total de
moscas, y multiplicando por 100. Para evitar sesgos al evitar el
olor, se calculó el PI de cada n individual tomando un
comportamiento promedio de dos grupos de moscas, un grupo entrenado
con el CS+ que es OCT, el otro con el CS+ que es MCH.
Se produjo el constructo de ADN de MaPKM\zeta
usando amplificación por PCR usando el ADNc de MaPKC\zeta de
longitud completa (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) n.º
63247) como molde. Se usaron cebadores de PCR (cebador en el
sentido de 5': 5'-CTAGCGAATTCAACATGAAGCT
GCTGGTCCATAAACG-3'; cebador en el sentido de 3':
5'-CTAGCTCTAGATCACACGG
ACTCCTCAGC-3') para producir el gen de MaPKM\zeta
truncado. El cebador en el sentido de 5' contenía un sitio de
restricción EcoRI justo en el sentido de 5' de una secuencia Kozak
consenso y también codificaba para un codón de iniciación ATG. Los
últimos 20 nucleótidos del cebador en el sentido de 5' corresponden
a 20 nucleótidos en la región bisagra del gen de MaPKC\zeta. El
segundo codón en este gen truncado corresponde al aminoácido 165 en
la proteína MaPKC\zeta. El cebador en el sentido de 3' es
antisentido con respecto a los últimos 20 nucleótidos en el marco
de lectura abierto de MaPKC\zeta, y contiene un sitio de enzima de
restricción XbaI inmediatamente tras el codón de terminación
de la traducción. El producto de PCR producido usando estos
cebadores se cortó con EcoRI y XbaI, después se
subclonó en un vector del elemento P de choque térmico, usando los
mismos sitios de restricción, y se secuenció. Se produjo el
KI-MaPKM\zeta cinasa-inactivo de
la misma manera excepto que se usó el ADN de mutante
K281W-MaPKC\zeta como molde para la amplificación
por PCR. Se subclonó el gen de MaPKC\zeta de cadena completa en el
mismo vector del elemento P usando los sitios EcoRI ubicados
en ambos extremos del ADNc y en el vector de choque térmico. Se
prepararon moscas transgénicas usando técnicas convencionales.
Basándose en la homología con las PKC\zeta de mamífero, se definió
el extremo N-terminal de DaPKC como que comenzaba
con los residuos M-P-S. Usando este
punto de referencia, el transgén de DaPKM comienza en Met223 dentro
de la región bisagra de DaPKC.
Todas las reservas de moscas se mantuvieron a
25ºC antes y después del choque térmico. Se realizaron inducciones
por choque térmico en tubos de plástico de 15 ml (\sim 100
moscas/tubo) sumergiendo parcialmente los tubos en un baño de agua
a la temperatura apropiada (32ºC o 37ºC) durante 30 min.
Las moscas transgénicas para MaPKM\zeta
mantenidas a 25ºC se sometieron a choque térmico a 37ºC durante 30
min., después se dejó que se recuperaran a 25ºC durante 1 h y se
congelaron en nitrógeno líquido. Las moscas de tipo natural y los
controles no inducidos permanecieron a 25ºC todo el tiempo. Tras la
congelación, se separaron las cabezas de mosca de los cuerpos y se
homogeneizaron \sim100 \mul de cabezas en 1 ml de tampón de
extracción (Hepes 20 mM pH 7,4, sacarosa 0,2 M, EDTA 1 mM, EGTA 1
mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y cóctel inhibidor
de proteasas completo (Roche, Indianápolis, Indiana)), y se
centrifugaron a 176.500 g durante 10 min. Se diluyeron los
homogeneizados hasta 1 mg/ml de proteína y se ajustó a EGTA 2,5 mM.
Se sometió a ensayo la actividad PKC midiendo la incorporación de
^{32}P procedente de
\gamma-^{32}P-ATP en el
péptido-\varepsilon (Peninsula, Belmont,
California). Cada 50 \mul de reacción contenían Hepes 50 mM pH
7,4, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM,
péptido-\varepsilon 25 \muM, 20 \mug de
homogeneizado de proteína y
\gamma-^{32}P-ATP (2 \muCi) 20
mM. Se incubó la proteína a 26ºC durante 1 min. en la mezcla de
reacción que carecía de ATP. Se inició la reacción mediante la
adición de \gamma-^{32}P-ATP, se
incubó a 26ºC durante 2 min. y se detuvo en hielo con 20 \mul de
H_{3}PO_{4} 75 mM. Se manchó un círculo de 2 cm de papel de
cromatografía P81 (GIBCO, Gaithersburg, Maryland) con una alícuota
de 20 \mul de cada reacción y se lavó tres veces en
H_{3}PO_{4} 75 mM, se secó y se midió la radiactividad mediante
recuento de centelleo. Se midió el efecto de ésteres de forbol y
Ca2+ en la reacción en presencia de CaCl_{2} 200 \muM y
acetato-miristato de forbol (PMA) 400 \muM. Se
estimó la actividad de fondo a partir de las reacciones simuladas
que carecían de péptido-\varepsilon. La actividad
PKC aumentó linealmente con el tiempo hasta 4 min. Los valores
notificados son promedios de ensayos por cuadruplicado.
Se monitorizó el transcurso del tiempo de
inducción por choque térmico usando extractos de cabeza de mosca
(se cargaron aproximadamente cinco cabezas por carril) para los
análisis de tipo Western. Se usó un anticuerpo policlonal de conejo
frente a MaPKM\zeta (Sigma, St. Louis, Misuri) como anticuerpo
primario y se detectó la proteína usando ECL (Pierce, Rockford,
Illinois).
Se usó una disolución de sacarosa al 4% (p/v)
como vehículo para la alimentación de queleritrina. Sobre papel de
filtro Whatman 3MM cortado para ajustarse y colocado en la parte
inferior de viales de cultivo de moscas convencionales, se
aplicaron 120 \mul de queleritrina 0 \muM (sacarosa sola), o 25
\muM, 50 \muM o 100 \muM. Se sometieron a ayuno las moscas en
viales vacíos (\sim 100 moscas/vial) durante 1 h y después se
transfirieron a los viales de alimentación durante 3 h para permitir
una alimentación suficiente. Entonces se entrenaron las moscas y se
sometieron a prueba tal como se describe en el texto y las figuras.
Se monitorizó la alimentación colocando un volumen de 1/50 de
colorante alimentario verde en las disoluciones, que podía
observarse entonces en los abdómenes de las moscas tras comer. No
hubo ninguna diferencia destacable en el consumo entre ninguna de
las disoluciones.
Para investigar el papel de PKC en el
aprendizaje y la memoria en Drosophila, se prepararon líneas
transgénicas de moscas que portaban isoformas de PKC (MaPKC)
atípicas murinas inducibles por choque térmico. Considerando que
los experimentos de LTP indican que los niveles de MaPKM\zeta
aumentan tras la presentación de los estímulos requeridos para la
potenciación de larga duración, se sometió a prueba la inducción de
MaPKM\zeta tras el entrenamiento para ver si afectaba a la
memoria olfativa. La inducción por choque térmico suave (32ºC) tras
el entrenamiento potenció intensamente la memoria a las 24 horas
(figura 1a). Esta potenciación no se debía a los efectos del choque
térmico independiente del transgén, porque las moscas de tipo
natural no mostraban una memoria potenciada cuando se exponían a
choque térmico. Se prepararon las moscas transgénicas en esta cepa
de tipo natural, de modo que la potenciación no se debía a
diferencias en el fondo genético. Finalmente, la potenciación de la
memoria no resultaba de una mutación insercional provocada por el
transgén, porque dos líneas independientes
(MaPKM\zeta-14 y MaPKM\zeta-43)
tenían efectos similares.
También se sometió a prueba la potenciación de
la memoria a las 24 horas tras un entrenamiento de un solo ciclo
induciendo MaPKM\zeta con un choque térmico intenso (37ºC) 3 horas
antes del entrenamiento, pero este régimen no tuvo ningún efecto
(datos no mostrados). Dado que la inducción del transgén tras el
entrenamiento conductual potenciaba la memoria, mientras que la
inducción antes del entrenamiento no, se examinó a continuación la
especificidad temporal de este efecto dependiente de MaPKM\zeta.
Se encontró que la potenciación óptima se producía cuando la
inducción por choque térmico comienza 30 minutos después de que
termine el entrenamiento, y el efecto está ausente si el choque
térmico se produce antes, o está retardado hasta 2 horas después del
entrenamiento (figura 1b).
No se observó la potenciación de la memoria
cuando se indujo un mutante cinasa-inactivo (KI) de
MaPKM\zeta ni antes ni después del entrenamiento (figura 2a; dos
líneas independientes, KI-1 y KI-2,
de KI-MaPKM\zeta. Tampoco se observó la
potenciación cuando se indujo la MaPKC\zeta de longitud completa
(FL) antes o después del entrenamiento (figura 2a; dos líneas
independientes, FL-3A y FL-14A). El
fallo o bien del KI-MaPKM\zeta o bien del
transgén de FL-MaP-KC\zeta para
potenciar la memoria no se debía a la falta de expresión, porque
ambos se expresan a niveles comparables a la proteína MaPKM\zeta
(figura 3a; KI-1 y FL-14A frente a
MaPKM\zeta-14). Juntos, estos resultados indican
que la potenciación de la memoria (figura 1) requiere una isoforma
de aPKM activa de manera persistente.
Se detectaron aumentos inducibles en los niveles
de proteína MaPKM\zeta y la actividad cinasa en extractos
preparados a partir de cabezas de Drosophila (figura 3).
Análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostraron que los
regímenes de choque térmico tanto suave como intenso inducían las
isoformas MaPKM\zeta y MaPKC\zeta, y que estas proteínas
persistían durante \sim18 horas tras el choque térmico (figura
3a). La proteína MaPKM\zeta inducida era activa, tal como lo
indicaba una potenciación observada de la actividad PKC
independiente de Ca^{2+}/DAG (diacilglicerol) en extractos de
cabeza de mosca de moscas transgénicas inducidas pero no de las no
inducidas (figura 3b).
La potenciación de la memoria se producía sólo
cuando el transgén se inducía tras el entrenamiento; por tanto no
es probable debido a un efecto de la expresión transgénica sobre la
percepción de o bien el choque o bien los olores en el momento del
entrenamiento. No se encontró ningún efecto de la inducción de
MaPKM\zeta sobre la reactividad al choque, ya que las moscas
transgénicas se comportaron de manera indistinguible de la cepa de
tipo natural, independientemente del choque térmico (figura 2b). Por
tanto, las moscas transgénicas no percibían el choque mejor durante
el entrenamiento. Dado que la potenciación de la memoria era
dependiente de la inducción (figura 1a), no puede atribuirse a
pequeñas cantidades de pérdida de expresión durante el
entrenamiento. Aunque la MaPKM\zeta había decaído hasta niveles
previos al choque térmico en el momento de las pruebas a las 24
horas (figura 3a), podía producirse una potenciación de las
respuestas olfativas en el momento de las pruebas mediante
MaPKM\zeta. Sin embargo, éste no era el caso porque la agudeza
olfativa a las 24 horas tras la inducción era normal (figura 2b).
Estos datos demuestran que la inducción de MaPKM\zeta no tiene
ningún efecto conductual sobre ninguna modalidad sensorial e indican
que el efecto observado se debe a una auténtica potenciación de la
memoria.
Drosophila puede formar memorias
olfativas asociativas que duran 24 horas y más, pero esto requiere
normalmente un entrenamiento repetitivo. Se han establecido
regímenes de entrenamiento de múltiples ensayos que producen tanto
una memoria resistente a la anestesia (ARM,
anesthesia-resistant memory) como una memoria
a largo plazo (LTM, long-term memory). La
ARM puede producirse mediante 10 ciclos de entrenamiento
"masivo" sin intervalos de reposo entre los ensayos de
entrenamiento individuales, y dura 2-3 días. La LTM
resulta de un entrenamiento repetitivo que contiene intervalos de
reposo (15 min. cada uno; véase Métodos), y 10 ciclos de este
entrenamiento "espaciado" genera una LTM que dura al menos 7
días. Para someter a prueba si la MaPKM\zeta podía potenciar la
ARM o LTM, se sometieron moscas a regímenes de entrenamiento masivo
o espaciado, se indujo el transgén durante 30 minutos tras el
entrenamiento y después se midió la memoria a los 4 días.
La inducción de MaPKM\zeta aumentó
sustancialmente la memoria a los 4 días tras el entrenamiento masivo
(figura 4a; HS+ en comparación con -HS para cada línea) pero no
mejoró la memoria a los 4 días tras el entrenamiento espaciado
(figura 4b; HS+ en comparación con -HS para cada línea). Estos datos
indican que la inducción de MaPKM\zeta potencia la memoria
inducida por entrenamiento masivo, pero no la inducida por
entrenamiento espaciado.
Un trabajo previo indicó que la memoria
consolidada en Drosophila consiste en dos componentes
bioquímicamente separables: ARM y LTM. La ARM se produce mediante
entrenamiento o bien masivo o bien espaciado y es insensible al
tratamiento con cicloheximida. La LTM se produce mediante
entrenamiento espaciado y se bloquea mediante el tratamiento con
cicloheximida; por tanto se considera que requiere una síntesis de
proteína aguda. Un mutante de memoria de Drosophila
identificado previamente, rábano, es deficiente en ARM, ya que esta
mutación bloquea la memoria producida mediante entrenamiento
masivo. El entrenamiento espaciado de mutantes rábano sí produce
memoria, pero esta memoria puede bloquearse completamente mediante
el tratamiento de los mutantes con cicloheximida. Estos resultados
condujeron a un modelo de dos rutas de memoria consolidada, una
dependiente del producto génico de rábano (ARM) y la otra
dependiente de la síntesis de proteína aguda inducida por actividad
(LTM). (Véase Tully et al, Cell 79, 35-47
(1994).
Dado que la inducción de MaPKM\zeta potenciaba
la memoria tras el entrenamiento masivo pero no tras el espaciado,
se sometió a prueba la dependencia de este efecto sobre el rábano.
El gen rábano está en el cromosoma X en Drosophila y se
cruzaron hembras mutantes rábano homocigóticas con machos
homocigóticos para una copia autosómica del transgén de
MaPKM\zeta inducible por choque térmico. El mutante rábano es
recesivo, por tanto la progenie hembra heterocigótica de este
apareamiento tendrá una memoria normal tras el entrenamiento masivo,
mientras que los machos hemicigóticos presentarán el déficit de
memoria de rábano en ausencia de inducción. Se sometió la progenie
a entrenamiento masivo, seguido de la inducción de MaPKM\zeta
convencional tras el entrenamiento, y luego se sometió a prueba a
las 24 horas para evaluar la capacidad de la MaPKM\zeta. Se
entrenó a los machos y las hembras y se sometieron a prueba en masa
y después se separaron y se contaron. La mutación rábano no
bloqueaba el efecto sobre la memoria de la inducción de MaPKM\zeta
(figura 5). El defecto de la memoria de los machos rábano era
evidente en ausencia de inducción por choque térmico (HS-), pero la
memoria estaba claramente presente en los machos inducidos (HS+).
También se observó una potenciación de la memoria dependiente de la
inducción menor, pero significativa, de las hembras rábano
heterocigóticas mediante MaPKM\zeta (figura 5: hembras HS+ frente
a HS-).
Hay un único gen de PKC atípico (DaPKC) en el
genoma de Drosophila (http://www.fruitfly.org), y es
sumamente homólogo con el gen de MaPKC\zeta usado. (El dominio
cinasa muestra una identidad del 76% y una similitud del 87%.) Una
inmunotransferencia de tipo Western de extractos preparados a partir
de cabezas y cuerpos de mosca de tipo natural mostró que el
antisuero usado para detectar MaPKM\zeta y MaPKC\zeta reconocía
dos bandas en extractos de mosca, el más pequeño de los cuales
estaba enriquecido en extractos de cabeza (figura 6a). Este
antisuero se dirige contra los 16 aminoácidos
C-terminales de MaPKC/M\zeta, que comparte
una homología sustancial con DaPKC. El antisuero de ratones
inmunizados con péptidos derivados de DaPKC reconocía estas mismas
bandas (datos no mostrados). Los pesos moleculares de estas dos
bandas indican que son probablemente las isoformas DaPKC (\sim73
kDa) y DaPKM (\sim55 kDa).
No se ha establecido la secuencia
N-terminal de la banda de menor peso molecular; sin
embargo, probablemente representa una isoforma de DaPKM endógena.
La inmunorreactividad se redujo de manera competitiva mediante un
péptido de la región correspondiente de DaPKC, pero no fuera de este
epítopo (figura 6b, 590 y 545, respectivamente) o mediante un
péptido de otra proteína de Drosophila (dCREB2, datos no
mostrados). De acuerdo con los datos de la inmunotransferencia de
tipo Western, las cabezas de mosca contenían más actividad PKC
independiente de Ca2+ y DAG que los cuerpos (figura 6c). La
presencia de la DaPKM putativa se correlaciona fuertemente con esta
actividad enriquecida, lo que sugiere que la mayor parte, si no
toda, la actividad cinasa atípica endógena medida en extractos de
cabeza se debía a esta isoforma DaPKM. Estos datos indican que las
moscas tienen formas tanto "C" como "M" de una PKC
atípica que es sumamente homóloga con MaPKC/M, y que la DaPKM está
enriquecida en las
cabezas.
cabezas.
Se ha descrito un mutante insercional de
elemento P en DaPKC; sin embargo, es letal para los embriones
y por tanto no es adecuado para examinar un posible papel en la
formación de la memoria y el aprendizaje en adultos. Para evaluar
si este producto génico es necesario para la formación de la
memoria, se recurrió a dos enfoques. En primer lugar, se
monitorizaron los efectos sobre la memoria de alimentar moscas con
el inhibidor de PKC queleritrina. Se ha notificado que este fármaco
inhibe selectivamente la PKM\zeta a bajas concentraciones (D. S.
F. Ling et al., datos no publicados y Laudanna, C. et
al, J. Biol. Chem. 273, 30306-30315 (1998); sin
embargo, su especificidad es controvertida e inhibe otros isotipos
de PKC a mayores concentraciones. También se realizaron mediciones
de los efectos sobre la memoria producidos mediante la inducción de
la proteína KI-MaPKM\zeta
cinasa-inactiva, que presenta una actividad
"negativa dominante" que es probable que sea específica para
las PKC atípicas, dejando las respuestas de cPKC y nPKC
inalteradas.
La alimentación de moscas con queleritrina
inhibió la formación de la memoria a las 24 horas de una manera
dependiente de la dosis (figura 7a), y la inducción del
KI-MaPKM\zeta inhibía la memoria a las 24 horas
tras el entrenamiento masivo (figura 7b). Los efectos inhibidores
tanto de la queleritrina como del KI-MaPKM\zeta
no se debían probablemente a efectos sobre al agudeza olfativa o la
reactividad a choques porque el aprendizaje no se veía afectado por
ninguno de los tratamientos (figura 7c).
La potenciación de la memoria producida mediante
MaPKM\zeta podría haberse debido a propiedades únicas para esta
proteína de mamífero. Los datos de expresión que muestran que la
DaPKM se expresaba y era activa en cabezas de Drosophila,
cuando se combinaban con los datos de queleritrina y negativa
dominante, sugerían que la DaPKM está implicada en procesos de
memoria normal en Drosophila. La amplia homología estructural
entre MaPKM\zeta y DaPKM también era un argumento en contra de la
exclusividad funcional. Una hipótesis de la homología funcional
hace una predicción firme: la inducción de DaPKM tras el
entrenamiento también debe potenciar la memoria.
Usando como base el peso molecular aproximado de
la DaPKM, se truncó el gen DaPKC dentro de la región bisagra
separando los dominios regulador del catalítico de modo que el gen
DaPVM putativo comienza en la metionina 223. La inducción
del transgén DaPKM tras el entrenamiento potenciaba la
memoria a las 24 horas tras un entrenamiento de un solo ciclo
(figura 8a). Se usó una de estas líneas para mostrar que también se
potenciaba la memoria a los 4 días tras el entrenamiento masivo
(figura 8b). Tal como con los transgenes MaPKM\zeta, las
líneas DaPKM mostraron una rápida inducción por choque térmico
(figura 8c). Estos resultados confirman los obtenidos con
MaPKM\zeta, y por tanto indican que aPKM es fundamental en los
mecanismos subyacentes a la memoria entre las especies.
Estos resultados proporcionan una fuerte
evidencia de que la actividad de PKM atípica es suficiente para
potenciar la memoria en Drosophila. Se investigaron las
intervenciones tanto farmacológicas como negativas dominantes. La
queleritrina inhibía la memoria normal de una manera dependiente de
la dosis (figura 7a), y la inducción de un PKM atípica negativa
dominante predicha producía el mismo déficit de la memoria (figura
7b).
Es importante observar que ninguna de las
intervenciones inhibidoras empleadas alteraba el aprendizaje (figura
7c). Selecciones en Drosophila han identificado muchos
mutantes de aprendizaje que alteran varias rutas de señalización
(por ejemplo, procesos cAMP-PKA, mediados por
integrina y dependientes de proteína
14-3-3; como citas originales).
Considerando que el aprendizaje sigue siendo normal, es improbable
que alguna intervención produzca defectos de señalización muy
amplios. Teniendo esto en cuenta, la observación de que cada
intervención inhibía la memoria sin alterar el aprendizaje indica
que DaPKC/M es un componente de un mecanismo de memoria
endógeno.
La inducción por choque térmico de MaPKM\zeta
no potenciaba la memoria a largo plazo, porque no mejoraba la
memoria tras el entrenamiento espaciado (figura 4b). Una explicación
para esto es que el entrenamiento espaciado induce mecanismos de
mantenimiento endógenos, y por tanto bloquea el efecto de inducir el
transgén de MaPKM\zeta. Por tanto, la memoria tras un solo ciclo
o un entrenamiento masivo puede prolongarse mediante la inducción
del transgén porque estos regímenes de entrenamiento normalmente no
inducen una actividad prolongada de PKM atípica. Un trabajo en
abejas mostró que un entrenamiento de un solo ciclo no produce ni
una actividad de PKC persistente ni una memoria de larga duración,
pero que un entrenamiento de múltiples ciclos produce ambas (véase
L. Grunbaum et al, J. Neurosci. 18, 4384-4392
(1998)). La potenciación de la memoria observada cuando se induce
MaPKM\zeta puede evitar de manera simple los requisitos endógenos
(proporcionados normalmente mediante entrenamiento espaciado) para
la activación prolongada de aPKM.
La potenciación inducida por MaPKM\zeta de
entrenamiento masivo, pero no espaciado dio lugar a un examen de la
implicación del producto génico de rábano en este proceso. Si se
requería rábano para la potenciación, la mutación rábano habría
bloqueado el efecto inducido por MaPKM\zeta, y éste claramente no
era el caso (figura 5). Aunque la inducción de MaPKM\zeta rescata
fenotípicamente el defecto de la memoria de rábano, no lo hace
porque el rábano codifique para la aPKM de Drosophila.
DaPKM está en el segundo cromosoma y el rábano está en el X,
y ningún gen PKC de Drosophila mapea en el locus de
rábano definido genéticamente. Hay dos posibilidades principales
que explican cómo la potenciación de la memoria inducida por
MaPKM\zeta evita el defecto de los mutantes rábano: (1)
MaPKM\zeta está en el sentido de 3' del rábano; (2) MaPKM\zeta
activa una ruta que es paralela a e independiente del rábano. La
primera interpretación se ve favorecida porque puede llevarse a
cabo o bien un potenciación o bien una alteración de la memoria tras
el entrenamiento masivo, así como un rescate parcial del fenotipo
de rábano.
Plasticidad sináptica dependiente de la
actividad y PKM atípica. Hay dos interpretaciones generales de estos
datos: la PKM\zeta actúa aumentando o bien (1) la magnitud o bien
(2) la duración de la potenciación sináptica que subyace al
comportamiento. En el primer modelo, la PKM\zeta potencia la
maquinaria sináptica inducida mediante el entrenamiento, creando
una conexión sináptica "más fuerte" que decae más lentamente.
En el segundo modelo, la PKM\zeta actúa únicamente para mantener
las sinapsis modificadas previamente por la experiencia, sin ningún
efecto sobre la inducción de la potenciación. Si se consideran las
mediciones conductuales del aprendizaje (pruebas realizadas
inmediatamente tras el entrenamiento) y la memoria (pruebas
realizadas después de más tiempo) con inducción y mantenimiento,
respectivamente, los datos de queleritrina y negativa dominante son
un argumento para un papel en el mantenimiento. Ninguno de estos
tratamientos afectó al aprendizaje (figura 7c), pero cada uno de
ellos inhibió la memoria (figuras 7a y b). No se detectó una
potenciación del aprendizaje mediante la inducción previa de
PKM\zeta (datos no mostrados), ni hubo una mejora de la memoria a
las 3 horas si se inducía la PKM\zeta 30 minutos tras el
entrenamiento (datos no mostrados). Aunque los modelos de duración
y magnitud pueden ser exclusivos artificialmente, tomados juntos,
los datos son compatibles de la mayor manera con un papel de la
PKM\zeta en el mantenimiento de la plasticidad sináptica
dependiente de la experiencia.
La estabilidad de una sinapsis varía en
respuesta a diferentes regímenes de estímulos. Los cambios de larga
duración requieren normalmente múltiples estímulos y dependen de la
síntesis de nuevas proteínas. Experimentos recientes apoyan la
existencia de un sistema de marcado sináptico que permite que las
neuronas etiqueten sinapsis activas recientemente, manteniendo así
una especificidad sináptica durante el proceso en todas las células
de formación de la memoria a largo plazo dependiente de la síntesis
de proteína (véase, por ejemplo, U. Frey et al., Nature 385,
533-536 (1997)). Una sinapsis que sería normalmente
estable durante sólo un periodo de tiempo corto puede potenciarse
durante un periodo de tiempo mucho más largo. Sin embargo, para esto
debe activarse en el plazo de 2-4 horas de
estimulación que produce los cambios a largo plazo en una segunda y
separada sinapsis dentro de la misma neurona. Aunque no se mostró
ninguna evidencia directa de un papel de la PKM\zeta en este
proceso mediante estos resultados, la similitud entre los intervalos
temporales para la etiqueta sináptica propuesta y la potenciación
de la memoria observada en este caso sugieren una relación
mecanística entre las mismas.
DaPKC es parte de un complejo de múltiples
proteínas importante tanto para la polaridad celular como las
divisiones celulares asimétricas de la neurogénesis temprana de
Drosophila (véase, por ejemplo, A. Wodarz et al, J.
Cell Biol. 50, 1361-1374 (2000)). Estos procesos
muestran fuertes paralelismos estructurales y funcionales con la
primera división celular asimétrica de la embriogénesis de
Caenorhabditis elegans. Los homólogos de Drosophila
de proteínas de C. elegans importantes para este proceso,
Par-3 (Bazooka) y Par-6
(DmPar-6), interaccionan entre sí y con DaPKC para
dirigir una localización subcelular interdependiente y específica
del complejo. Durante la embriogénesis temprana de
Drosophila, Bazooka, DmPar-6 y DaPKC se
localizan en la unión adherente (zonula adherens), una
estructura de unión celular. Una mutación en cualquiera de estos
genes altera la capacidad de las dos proteínas restantes de
localizarse en esta estructura de manera apropiada, y esto altera
la polaridad celular. Esta dependencia mutua para la localización
también es evidente durante la neurogénesis y provoca la
segregación inapropiada de determinantes celulares. Este complejo de
múltiples proteínas es crítico en la polaridad celular de mamíferos
y en la organización de uniones entre células epiteliales. Los
homólogos de ratón de Bazooka y Par-6 se expresan en
diversas regiones del SNC, y su localización subcelular dentro de
las neuronas del hipocampo de CA1 es compatible con un papel en la
plasticidad sináptica (véase D. Lin et al, Nature Cell Biol.
2,540-547 (2000)). Bazooka y DmPar-6
se expresan en cabezas de Drosophila, tal como DaPKC y DaPKM
(figura 6a).
En este caso se ha mostrado que la PKM atípica
es suficiente para potenciar la memoria en Drosophila, y los
datos de queleritrina y negativa dominante sugieren que también es
necesaria para una memoria normal.
Claims (4)
1. Método de identificación de una sustancia que
afecta a un problema de la memoria a corto plazo o a un componente
de formación de la memoria a corto plazo de una disfunción
psiquiátrica en un mamífero no humano que comprende:
- (a)
- determinar si dicha sustancia que va a administrarse a dicho mamífero no humano altera la expresión o la actividad de una proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central de dicho mamífero no humano en comparación con la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en el sistema nervioso central en ausencia de dicha sustancia, estando dicha proteína aPKM\zeta asociada con dicho problema de la memoria a corto plazo o dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica en dicho mamífero no humano; y
- (b)
- indicar que dicha sustancia afecta a dicho problema de la memoria a corto plazo o a dicho componente de formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica cuando la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en presencia de dicha sustancia difiere de la expresión o la actividad de dicha proteína aPKM\zeta en ausencia de dicha sustancia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el problema de la memoria a corto plazo resulta del envejecimiento
normal, una lesión en el cerebro, la enfermedad de Alzheimer o
neurodegeneración, y la disfunción psiquiátrica es un trastorno
seleccionado del grupo que consiste en trastorno por déficit de
atención, autismo, síndrome del cromosoma X frágil, trastorno
bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo y fobias.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
un aumento en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta
cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la
expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha
sustancia no está presente, es indicativo de una potenciación de la
formación de la memoria a corto plazo de dicho problema de la
memoria a corto plazo o el componente de formación de la memoria a
corto plazo de dicha disfunción psiquiátrica.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
una disminución en la expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta
cuando dicha sustancia está presente, en comparación con la
expresión o la actividad de dicha aPKM\zeta cuando dicha
sustancia no está presente, es indicativa de una interferencia en la
formación de la memoria a corto plazo normal o el componente de
formación de la memoria a corto plazo de dicha disfunción
psiquiátrica.
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