ES2326577B1 - Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamiferos no humanos. - Google Patents
Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamiferos no humanos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para el aislamiento de la masa
celular interna en blastocistos de mamíferos no humanos.
Procedimiento para el aislamiento de la masa
celular interna (MCI) en blastocistos de mamíferos no humanos que
incluye el cultivo directo en placa de dichos blastocistos y la
posterior ablación mediante láser del trofoectodermo de dichos
blastocistos. El procedimiento de la invención permite una mejora
de la eficiencia del aislamiento de la masa celular interna de
blastocistos y el aprovechamiento de blastocistos de poca calidad
no aptos para la separación de su masa celular interna mediante los
procedimientos mencionados en los documentos del estado de la
técnica.
Description
Procedimiento para el aislamiento de la masa
celular interna en blastocistos de mamíferos no humanos.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna (MCI)
en blastocistos de mamíferos no humanos que incluye el cultivo
directo en placa de dichos blastocistos y la posterior ablación
mediante láser del trofoectodermo de dichos blastocistos. El
procedimiento de la invención permite una mejora de la eficiencia
del aislamiento de la masa celular interna de blastocistos y el
aprovechamiento de blastocistos de poca calidad no aptos para la
separación de su masa celular interna mediante los procedimientos
mencionados en los documentos del estado de la técnica.
En 1981 se obtuvieron por primera vez células
troncales embrionarias a partir de blastocistos de ratón (Evans MJ,
Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from
mouse embryos. Nature 1981; 292:154-56). Estas
células están dotadas de dos propiedades únicas que las distinguen
de todas las células troncales órgano-específicas
identificadas hasta el momento:
Primero, que se auto-renuevan
continuamente en cultivo y que pueden ser conservadas y
multiplicadas durante prolongados periodos de tiempo, manteniéndose
en status de "no-diferenciación".
Segundo, que son pluripotentes, capaces de
diferenciarse en cualquier tipo de célula en el cuerpo (Keller G.
Em-
bryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005; 19:1129-55).
bryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005; 19:1129-55).
Las primeras líneas de células troncales
embrionarias humanas se derivaron en 1998 de la MCI de embriones no
transferidos donados y congelados (Thomson JA,
Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel
JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from
human blastocysts. Science 1998; 282:1145-7). Dichas
líneas celulares mostraban las dos referidas propiedades de
auto-renovación y pluripotencialidad. A partir de
esa fecha, numerosos laboratorios han comunicado la derivación de
líneas celulares troncales embrionarias humanas, a partir de
embriones no transferidos, utilizando bien células alimentadoras
humanas o de ratón.
Debe tenerse en cuenta que la calidad de los
blastocistos y el método de aislamiento de la MCI usado, son los
dos factores principales que conducen al éxito o al fracaso del
proceso de derivación de líneas de células troncales embrionarias
humanas. Respecto a la calidad de los blastocistos, los humanos son
de calidad más pobre que los de ratón. Ello es debido, al menos en
parte, al hecho de que los blastocistos humanos están congelados
cuando se intenta la derivación de líneas celulares troncales
embrionarias humanas, debido a restricciones éticas, mientras que
los blastocistos de ratón se utilizan normalmente en fresco. Ello
explica no solo el extremadamente bajo grado de éxito de los
procesos de derivación de líneas celulares troncales embrionarias
humanas, sino que implica también el que embriones humanos de pobre
calidad se descarten directamente, e incluso ni se descongelen ni
se usen para este propósito.
Por otro lado, los procedimientos actuales para
el aislamiento de MCI son objeto de controversia. La MCI es aislada
usualmente de los blastocistos expandidos usando una amplia
variedad de técnicas que incluyen la inmunocirugía (Solter D.,
Knowles BB. 1975. Immunosurgery of mouse blastocysts; Proc. Natl.
Acad. Sci. U S A 72:5099-5102), procedimientos
mecánicos (Bongso A, Fong CY, Ng SC, Ratnam S. 1994. Isolation and
culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum.
Reprod. 9:2110-2117), y procedimientos de cultivo
de blastocisto completo (Kim HS, Oh SK, Park YB, Anh HJ, Sung KC,
Kang MJ, Lee LA, Suh CS, Kim SH, Kim DW, Moon SY. 2005. Methods for
derivation of human embryonic stem cells. Stem Cells
23:1228-1233). Recientemente, se ha obtenido MCI a
partir de blastómeros obtenidos de embriones en fase célula (Chung
Y, Klimanskaya I, Becker S, Marh J, Lu SJ, Johnson J, Meisner L,
Lanza R. 2006. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived
from single mouse blastomeres. Nature
439:216-219).
Todos estos procedimientos de aislamiento de MCI
presentan dos inconvenientes relevantes: cambios en el cariotipo
tras cultivo prolongado y la utilización de
xeno-componentes que podrían comprometer el uso de
estas líneas celulares troncales embrionarias humanas o los
derivados de las mismas en potenciales aplicaciones terapéuticas.
Estas células troncales embrionarias y derivados de las mismas
obtenidas por los métodos indicados y cultivadas durante periodos
largos, han estado asociadas con inestabilidad genética a largo
plazo, aunque queda por dilucidar si ello es debido al propio
proceso de derivación, o a los procesos mecánicos y/o enzimáticos
utilizados para el mantenimiento rutinario de los cultivos de
células troncales embrionarias.
Existe claramente una demanda urgente de
estudios sobre calidad de blastocistos, métodos de aislamiento de
MCI y subsiguiente derivación de células troncales embrionarias,
para poder dar cumplimiento a las expectativas generadas por la
investigación con células troncales embrionarias humanas. La
tecnología láser se usa habitualmente en reproducción asistida
(Antinori S, Selman HA, Caff B, Panci C, Dani GL, Versaci C. 1996.
Zona opening of human embryos using non-contact UV
laser for assisted hatching in patients with poor prognosis of
pregnancy. Hum. Reprod. 11:2488-2492), porque
facilita la transferencia nuclear, acelerando el proceso de
enucleación de forma que se desarrolle en segundos, evitando al
mismo tiempo cualquier daño al óvulo (Chen S., Chao K., Chang C.,
Hsieh F., Ho H., Yang Y. 2004. Technical Aspects of the piezo,
laser-assisted, and conventional methods for nuclear
transfer of mouse oocytes and their efficiency and efficacy: Piezo
minimizes damage of the ooplasmic membrane at injection. J Exp.
Zool. 301:344-351).
Muy recientemente, se ha utilizado la tecnología
de ablación con láser para destruir el trofoectodermo de
blastocistos de ratón de buena calidad, permitiendo separar con
éxito la MCI y la subsiguiente derivación de líneas de células
troncales embrionarias de ratón (Cortes JL, Cobo F, Catalina P,
Nieto A, Cabrera C, Montes R, Concha A, Menendez P. "Evaluation of
the laser technique method to isolate the inner cell mass of murine
blastocysts". Biotechnol. Appl. Biochem. 2007; 46:205:209 y
solicitud de patente WO03/018783). Es importante, sin embargo,
señalar que el uso de la tecnología de ablación con láser para
destruir las células del trofoectodermo permitiendo el aislamiento
de la MCI, requiere que se usen blastocistos expandidos de muy
buena calidad con una MCI claramente distinguible, ya que si no es
así, el embriólogo no puede ver con precisión y distinguir la MCI
de las células del trofoectodermo, convirtiendo los disparos con el
láser en poco precisos y aleatorios.
El procedimiento objeto de la presente invención
permite superar estos inconvenientes, a través de la combinación de
una etapa de cultivo de los blastocistos completos seguida de la
destrucción del trofoectodermo mediante ablación con láser para
mejorar la eficacia del aislamiento de la MCI y de la derivación de
células troncales embrionarias a partir de embriones de ratón. Se
utiliza este modelo animal, previo a su uso en humanos, para
estudiar la efectividad de esta novedosa tecnología, debido a la
escasez de embriones humanos disponibles para investigación, y la
baja tasa de derivación de células troncales embrionarias humanas
experimentada hasta ahora con otras
técnicas.
técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Constituye el objeto de la presente invención un
procedimiento para el aislamiento de la MCI en blastocistos de
mamíferos no humanos que incluye una etapa de ablación mediante
láser del trofoectodermo de dichos blastocistos. Para hacer más
efectivo el aislamiento de la MCI, los blastocistos se someten,
previamente a dicha etapa de ablación mediante láser, a cultivo
directo en placa durante un periodo de tiempo de al menos 72 horas.
En un modo preferente de realización de la invención, los
blastocistos son de ratón.
El cultivo directo previo a la ablación mediante
láser incluye las siguientes subetapas:
a) cultivo de los blastocistos recuperados de
los oviductos en medio estándar, particularmente medio de cultivo
G2 V.III (Vitrolife, Sweden) a 37ºC y con 6% de CO_{2} durante un
periodo de tiempo comprendido entre 24 y 48 horas.
b) tratamiento de los blastocistos cultivados en
la subetapa anterior para conseguir una completa eliminación de la
zona pelúcida.
c) colocación de los blastocistos tratados en la
etapa anterior sobre una superficie de cultivo y posterior adhesión
del trofoectodermo y la masa celular interna de los blastocistos a
dicha superficie.
d) mantenimiento de los blastocistos sobre dicha
superficie y en un medio estándar de cultivo durante un periodo de
tiempo comprendido entre 24 y 48 horas.
e) refresco del medio de cultivo y mantenimiento
de los blastocistos en el mismo durante un nuevo periodo de tiempo
comprendido entre 24 y 48 horas.
La eliminación de la zona pelúcida se lleva a
cabo mediante tratamiento con ácido Tyrode o enzima pronasa durante
un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 60 segundos, o bien por
eclosión espontánea del blastocisto.
La superficie de cultivo sobre la cual se
colocan los blastocistos tras la eliminación de la zona pelúcida es
una placa recubierta con MEFs (Mouse embryonic fibroblasts) o con
gelatina.
El medio en el cual se mantienen los
blastocistos sobre la superficie de cultivo es medio DMEM
(Dubelcco's Modified Eagle's Médium) suplementado con suero fetal
bovino al 20%, L-glutamina al 1%, aminoácidos no
esenciales al 0,1 mM, 2000 IU/ml de factor inhibidor de leucemia de
ratón, \beta-mercaptoetanol 0,1 mM, 50 U/ml de
penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
La etapa de ablación mediante láser del
trofoectodermo de los blastocistos, a realizar inmediatamente tras
la etapa de cultivo previo, se lleva a cabo con un dispositivo de
diodo láser de emisión en infrarrojo a una frecuencia óptica
(longitud de onda) de 1,48 \mum., realizándose entre 20 y 100
disparos.
Tras la ablación con láser del trofoectodermo de
los blastocistos, se produce el establecimiento de las líneas
celulares embrionarias de ratón a partir de la MCI aislada de los
blastocistos sometidos al procedimiento.
Figura 1: Figuras representativas de la
clasificación de calidad de los blastocistos de ratón
obtenidos.
- A)
- Embrión en estadio de blastocisto compacto.
- B)
- Embrión en estadio de blastocisto expandido.
- C)
- Blastocisto de alto crecimiento y buena calidad con una masa celular interna (MCI) grande y claramente distinguible.
- D)
- Blastocistos de bajo crecimiento con una masa celular interna pequeña claramente distinguible.
- E)
- Blastocistos de bajo crecimiento con masa celular interna no distinguible. La flecha negra indica dónde se localiza la región de la MCI.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Diseño experimental para la
optimización de la eficiencia de la derivación de células troncales
embrionarias basada en la influencia de la calidad del blastocisto,
método de aislamiento de la masa celular interna y superficie de
crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Gráficas representativas de la
valoración de los distintos métodos de aislamiento de la masa
celular interna.
(A-B) Aislamiento de la MCI por
el método de cultivo de blastocisto completo.
- A)
- Crecimiento de un blastocisto adherido a MEFs a los cinco días del cultivo del blastocisto completo.
- B)
- Crecimiento de un blastocisto adherido a gelatina a los cinco días del cultivo del blastocisto completo.
(C-E) Aislamiento de la MCI
mediante la tecnología de ablación con láser.
- C)
- Blastocisto fijado por dos pipetas con liberación de la MCI mediante ablación con láser del trofoectodermo y de la zona pelúcida. Las puntas de flecha negras representan los disparos de láser.
- D)
- El blastocisto de C) justo tras la ruptura del trofoectodermo por el disparo del láser. La flecha negra muestra el trofoectodermo lisado por el láser.
- E)
- Crecimiento del mismo blastocisto dos días después de la ablación directa con láser.
(F-G) Aislamiento de la MCI
mediante cultivo previo del blastocisto completo y subsiguiente
ablación con láser del trofoectodermo.
- F)
- Crecimiento del blastocisto a los 5 días del cultivo del blastocisto completo.
- G)
- MCI limpia y libre de células de trofoectodermo tras los disparos de láser.
- H)
- Trofoectodermo residual tras la ablación con láser. Los asteriscos representan las MCIs. Las flechas blancas anchas indican la zona pelúcida del embrión. Las flechas blancas finas indican la situación exacta de los disparos de láser.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: Gráficas representativas que
muestran la derivación conseguida y la caracterización
inmunocitoquímica de las células troncales embrionarias.
- A)
- Morfología típica (magnificación 10 X) de líneas de células troncales embrionarias sobre MEFs establecidas mediante cultivo previo del blastocisto completo y posterior ablación con láser del trofoectodermo.
- B)
- Magnificación 40 X de la misma colonia de células troncales embrionarias.
- C)
- Expresión del SSEA-1 (verde). Contraste del núcleo con DAPI (azul).
- D)
- Expresión de Oct3/4 (rojo).
\newpage
Figura 5: Mantenimiento del potencial de
diferenciación de las tres capas germinales de las líneas de
células troncales embrionarias.
- A)
- Representación de blastocistos expandidos.
- B)
- Expresión de alfafetoproteína (endodermo).
- C)
- Expresión de actina (mesodermo).
- D)
- Expresión de nestina (ectodermo).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: Caracterización citogenética de las
líneas establecidas de células troncales embrionarias.
- A)
- Cariotipo diploide representativo de una línea de células troncales embrionarias establecida mediante cultivo del blastocisto completo tras 12 pases en cultivo in vitro.
- B)
- Cariotipo diploide representativo de una línea de células troncales embrionarias establecida mediante tecnología de ablación con láser tras 12 pases en cultivo in vitro.
- C)
- Cariotipo aneuploide representativo de una línea de células troncales embrionarias establecida mediante cultivo del blastocisto completo tras cultivo extensivo in Vitro.
- D)
- Cariotipo aneuploide representativo de una línea de células troncales embrionarias establecida mediante tecnología de ablación con láser tras cultivo extensivo in Vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Los blastocistos fueron obtenidos mediante el
lavado de los oviductos de ratonas de la cepa C57BL/CBA de 3 a 6
meses de edad. Estas ratonas habían sido sacrificadas previamente
por dislocación cervical en el día 4.5 de embarazo (contando que el
periodo de copulación ocurre en día 0.5). Los oviductos fueron
diseccionados y colocados en medio PBS atemperado a 37ºC y
posteriormente fueron cuidadosamente manipulados en una placa de
Petri con medio atemperado G-MOPS (Vitrolife,
Sweden) como se describe en Tanaka N. et al.
"Laser-assisted blastocyst dissection and
susequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free
culture system: applications and preliminary results in a murine
model" J. Transl. Med. 2006; 4:20-32.
Los oviductos fueron separados de la porción del
útero y de los ovarios mediante sección con bisturí. Este
procedimiento fue realizado con la ayuda de una lupa estereoscópica
y un microscopio invertido con óptica Hoffman. Los blastocistos
recuperados fueron colocados en medio de cultivo G2 V.III
(Vitrolife, Sweden) en un incubador a 37ºC y 6% de CO_{2} como se
ha descrito en la referencia mencionada de Tanaka et al.
Ciento once blastocistos de ratón fueron
incluidos en el presente estudio que presta soporte experimental al
procedimiento de la invención. Fueron recuperados en estadio de
compactación o en estadio de blastocisto expandido. Los
blastocistos en estadio de compactación fueron cultivados hasta el
estadio de blastocisto expandido. Con el objetivo de identificar el
método más eficaz respecto al aislamiento de la MCI y el posterior
establecimiento de las líneas de células troncales embrionarias de
ratón (mESC), se tuvo en cuenta la calidad blastocitaria. Debido a
la similitud en la morfología entre los blastocistos humanos y de
ratón, se adoptó el mismo sistema de calidad blastocitaria humana
utilizado por la Universidad de Cornell (Ithaca, NY). En el proceso
de derivación, los blastocistos fueron clasificados como
blastocistos de buena o de mala calidad: los blastocistos de buena
calidad poseían una MCI grande y claramente distinguible. Los
blastocistos de mala calidad fueron clasificados cuando poseían una
MCI pequeña pero distinguible y cuando poseían una MCI
indistinguible.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron tres métodos experimentales
diferentes para realizar el aislamiento de la MCI en blastocistos
de ratón y el establecimiento de mESC. La figura 2 muestra el
diseño experimental realizado para aumentar la eficiencia del
aislamiento de la MCI en blastocistos de ratón y el establecimiento
de células troncales embrionarias de ratón sobre la base de la
calidad blastocitaria, el método de aislamiento y la superficie de
crecimiento utilizada.
El blastocisto fue cultivado directamente de tal
manera que tanto las células de la MCI como las del trofoectodermo
se adhieren a los MEFs o a la gelatina. Dos días después, se
confirmó la adhesión del blastocisto a la superficie de crecimiento
y el medio de cultivo fue cambiado por medio fresco atemperado. En
el día 3 de cultivo las células comenzaron a expandirse
proporcionando un apoyo al crecimiento de la MCI creciendo y
formando una estructura en forma de cúpula. En este momento, la MCI
fue cuidadosamente levantada y transferida a una superficie de
crecimiento fresca.
El método de cultivo directo tiene el riesgo de
sobrecrecimiento del trofoectodermo, ya que este es cultivado en su
totalidad junto con la MCI, dificultando al embriólogo el acceso a
la MCI en blastocistos de mala calidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema láser utilizado para el procedimiento
de la invención (OCTAX EyewareTM, Alemania) está conectado a un
microscopio invertido (IX-71, Olympus) y procesado
mediante un programa informático el cual permite analizar los
datos. El uso del láser consiste en disparar y lisar las células del
trofoectodermo buscando su separación. Esta técnica de disparo
directo sólo puede ser usada en blastocistos de ratón de buena
calidad, donde la MCI es claramente identificable y distinguible de
las células del trofoectodermo. El láser es colocado en una zona
determinada del campo localizado en la pantalla de ordenador a modo
de diana. El blastocisto expandido es, por tanto, colocado
adecuadamente para permitir un disparo certero, gracias a la
posibilidad de movimiento en el eje x-y que posee el
sistema de micromanipulación del microscopio. Para ello los
blastocistos son fijados gracias a dos pipetas de sujeción. La
longitud de onda del láser, así como el número de disparos
necesarios para aislar la MCI será controlado por el embriólogo y
puede variar entre unos blastocistos u otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Es el objetivo principal de la presente
invención. En un intento de mejorar la metodología en el proceso de
aislamiento de la MCI y posterior establecimiento de mESC a partir
de blastocistos expandidos de mala calidad, se ha desarrollado un
nuevo método, consistente en dos pasos, i) cultivo directo del
blastocisto y, ii) tecnología láser. Con este método, todos los
blastocistos de ratón fueron tratados con ácido Tyrode para la
completa disolución de la zona pelúcida durante no más de un
minuto. Los blastocistos fueron colocados en la superficie de
crecimiento buscando la adhesión de la MCI y las células del
trofoectodermo. Dos días después, dicha adhesión fue confirmada y
se procedió al cambio de medio por medio nuevo y fresco. En torno
al día 3 de cultivo, las células del trofoectodermo comenzaron a
expandirse, dejando la MCI accesible, formando una estructura
cupular. En este momento es cuando se utiliza el láser para
disparar a todas las células del trofoectodermo que rodean a la MCI,
dejando esta área adyacente libre de células del trofoectodermo y
reduciendo el riesgo de arrastre de dichas células cuando la MCI
sea subcultivada y transferida a una nueva superficie de
crecimiento fresca.
\vskip1.000000\baselineskip
Las colonias primarias de las células obtenidas
por los procedimientos mencionados fueron cultivadas sobre MEFs o
placas con gelatina en medio compuesto de Dubelcco's Modified
Eagle's Médium (DMEM) suplementado con 20% de suero fetal bovino
(FBS), 1% L-glutamina, 0,1 M de aminoácidos no
esenciales, factor inhibidor de la leucemia, 0,1
\beta-mercaptoetanol, y 50 \mug/ml de
estreptomicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar que superficie de crecimiento
facilita el aislamiento de la MCI y el establecimiento de las mESC,
las colonias primarias fueron cultivadas individualmente sobre MEFs
o sobre placas con gelatina, como se describió previamente (Cortes
JL, Cobo F, Catalina P, Nieto A, Cabrera C, Montes R, Concha A,
Menendez P. "Evaluation of the laser technique method to isolate
the inner cell mass of murine blastocysts"; Biotechnol. Appl.
Biochem. 2007; 46:205-209).
\vskip1.000000\baselineskip
Las mESC establecidas fueron caracterizadas por
inmunohistoquimica indirecta usando anticuerpos contra el
SSEA-1 y el Oct 3/4. Brevemente, las colonias de
mESC fueron cultivadas en portas de cultivo especiales con
gelatina. Las células fueron fijadas en 4% de paraformaldehido
durante 20 minutos seguidos de 30 minutos de incubación en 10% de
suero normal bovino en PBS. Para la inmunotinción de Oct 3/4, las
células son permeabilizadas con Triton X100 (Sigma). Las colonias
fueron incubadas con los anticuerpos primarios (dilución 1:100 en
PBS) durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos
secundarios conjugados (dilución 1:100 en PBS) fueron usados
durante 30 minutos a temperatura ambiente como sigue:
FITC-conjugated anti-mouse IgM para
detectar SSEA-1 y anti-mouse IgG
para Oct 3/4. Los portas fueron montados en Vectashield conteniendo
DAPI. Para el control negativo de tinción los anticuerpos primarios
fueron reemplazados por PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se ha alcanzado la confluencia de las
mESC, estas son tratadas con 0,05% de tripsina durante 5 minutos a
37ºC, y son transferidas a placas no-adherentes
permitiendo la diferenciación espontánea y formando los cuerpos
embrioides. Para ello se utiliza medio DMEM suplementado con 20% de
FBS, 1% de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos
no-esenciales y 0,1 mM de
\beta-mercaptoetanol, pero sin añadir LIF. Los
cambios de medio se realizan cada 2-3 días.
Transcurridos 21 días de la diferenciación de los cuerpos
embrioides, estos fueron trasferidos a una placa tratada donde
crecieron y dieron lugar a un cultivo confluente en monocapa. La
capacidad de diferenciación a las tres capas germinales fue
evaluada por inmunohistoquímica. Las células de los cuerpos
embrioides fueron fijadas con formaldehído durante 10 minutos. A
continuación, las células fueron incubadas (1 hora a temperatura
ambiente) con anticuerpos primarios para
alfa-fetoproteina (Santa Cruz Biotechnology;
dilución 1:500 en PBS), anti-nestina (Chemicon;
dilución 1:100 en PBS) y antiactina (Chemicon; dilución 1:100 en
PBS). Los portas fueron entonces incubados con un anticuerpo
secundario (biotinilato) durante 30 minutos a temperatura ambiente y
con un complejo de estreptavidina peroxidasa (30 minutos a
temperatura ambiente). La inmunotinción fue visualizada usando
diaminobencidina y contrastado con hematoxilina. Todos los pasos de
lavado fueron realizados con PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del cariotipo convencional fue
determinado en dos pases diferentes (p12 y p35) después de haber
establecido las nuevas líneas mESC. Treinta metafases extendidas
por línea de mESC fueron analizadas. Se utilizaron dos sistemas de
cariotipación diferentes (Metasystem software o el CW4000 Karyo
version 1.4).
\vskip1.000000\baselineskip
Para estimar si las diferencias encontradas eran
significativas entre los distintos métodos usados, se realizó el
test de la chi-cuadrado de Pearson y la correlación
de Yate. Todos los análisis fueron realizados con el programa
Statgrafic (versión 5.0). Se consideraron diferencias significativas
cuando el valor de p fue menor de 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
De los 111 blastocistos de ratón, 88 de ellos
(el 79%) eran blastocistos expandidos de buena calidad y 23 de los
111 (el 21%), eran blastocistos expandidos de mala calidad (ver
Figura 1).
Sobre la base de esta distribución de la calidad
de los blastocistos, se diseñó la estrategia experimental ilustrada
en la Figura 2 con el propósito de determinar si el procedimiento
de cultivo directo del blastocisto ayudado de la técnica láser es
útil para los siguientes propósitos:
- i)
- mejora de la eficiencia del aislamiento de la MCI y del establecimiento de células troncales embrionarias comparado con el cultivo directo del blastocisto y con la tecnología láser por separado y
- ii)
- si se podría utilizar con éxito con blastocistos de baja calidad, los cuales no podrían haberse usado mediante la tecnología de ablación con láser debido a que la MCI no sería distinguible para el embriólogo y serían normalmente descartados (Figuras 1 y 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las MCI aisladas se dejaron expandir sobre MEFs
o sobre gelatina con el doble objetivo de:
- i)
- determinar que superficie de crecimiento facilita mejor el establecimiento de líneas de células troncales embrionarias.
- ii)
- determinar la interferencia potencial entre el método de aislamiento de la MCI, la superficie de crecimiento y la calidad de los blastocistos para la derivación de células troncales embrionarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, las líneas de células troncales
embrionarias de ratón se caracterizaron completamente mediante
análisis morfológico, inmunocitoquímico y citogenético,
determinándose también el potencial de diferenciación "in
vitro".
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el procedimiento de cultivo directo del
blastocisto, la eficiencia del aislamiento de la MCI no se vio
afectada ni por la superficie de crecimiento utilizada (MEFS: 60%
frente a gelatina: 65% con una p\geq0,05) ni por la calidad del
blastocisto (buena calidad: 53% frente a blastocistos de mala
calidad 65,5%; p\geq0,05) (ver tablas 1 y 2).
Acrónimos: MCI.- masa celular interna;
MEFs.- fibroblastos embrionarios de ratón inactivos; N.V.- No
viable
Diferencias estadísticas entre:
^{1} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a cultivo directo del blastocisto para
blastocistos de buena calidad: p=0.005.
^{2} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a ablación con láser para blastocistos
de buena calidad: p=0.001.
^{3} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a cultivo directo del blastocisto para
blastocistos de mala calidad: p=0.05.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Acrónimos: MCI.- masa celular interna;
N.D.- no determinada; N.V.- No viable.
Diferencias estadísticas entre:
^{1} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a ablación con láser para blastocistos
de buena calidad en gelatina: p=0.00001.
\newpage
El método del cultivo directo del blastocisto
tiene varias desventajas. Primero, que las células del
trofoectodermo proliferan muy rápidamente, reprimiendo el
crecimiento de la MCI y segundo que existe un riesgo de
sobrecrecimiento del trofoectodermo y es habitual que se arrastren
células del trofoectodermo cuando se procede a la separación de la
MCI (ver Figuras 3A y 3B). Para salvar esas desventajas, se utilizó
la técnica de ablación con láser desarrollada recientemente, basada
en disparos de láser a las células del trofoectodermo para
desprenderse de dichas células no deseadas (ver figuras 3C, 3D y
3E). La eficiencia del aislamiento de MCI sobre MEFs fue
prácticamente idéntica entre las técnicas de cultivo directo del
blastocisto y la de ablación con láser (53% frente a 47%,
p\geq0,05, ver tabla 1). Sin embargo, aunque esta nueva técnica
basada en láser permite una eliminación más limpia del
trofoectodermo, solo puede ser aplicada a embriones de buena
calidad (figura 3C y tablas 1 y 2), no siendo posible con embriones
de mala calidad (figuras 1D y 1E), en los cuales la MCI no es
distinguible y no puede, por tanto, ser identificada por el
embriólogo.
Con el objetivo de de mejorar la eficiencia del
aislamiento de la MCI y de la derivación de células troncales
embrionarias de ratón en comparación con el cultivo directo del
blastocisto o con la técnica de ablación con láser y también para
aprovechar embriones de mala calidad, normalmente descartados, es
por lo que se ha desarrollado el procedimiento de la invención en
dos pasos, basado en la fijación del embrión bien a MEFs, bien a
gelatina mediante el cultivo directo del blastocisto (figura 3F),
seguido de la ablación con láser del trofoectodermo (figura 3G y
3H). La figura 3G muestra la MCI aislada libre de células de
trofoectodermo, mientras que la figura 3H muestra los restos del
trofoectodermo destruido por los disparos del láser.
Sorprendentemente, cuando se usan embriones de
buena calidad, el procedimiento de la invención basado en cultivo
directo del blastocisto seguido de ablación con láser del
trofoectodermo incrementa significativamente la eficiencia del
aislamiento de la MCI sobre MEFs hasta el 100% comparado con el 53%
de eficiencia cuando se utiliza el cultivo directo del blastocisto
o el 47% cuando se utiliza la ablación con láser separadamente. Más
aún, sobre gelatina como superficie de crecimiento, este nuevo
método desarrollado multiplica por siete la eficiencia del
aislamiento de la MCI (desde el 16% hasta el 100%; p=0,0001) (ver
tabla 2).
Igual o más importante es que se ha observado
que la fijación previa de embriones de mala calidad a una monocapa
de MEFs seguida de ablación con láser del trofoectodermo, dio lugar
a una tasa de éxito en el aislamiento de la MCI significativamente
superior (casi el doble, del 100% frente al 66%), cuando se compara
con la técnica de cultivo directo del blastocisto (ver tabla 1).
Sobre gelatina como superficie de crecimiento, el procedimiento de
la invención originó una ligera mejora de la eficiencia del
aislamiento de la MCI (75% frente al 65%) (ver tabla 2). En
conjunto, los datos mostrados indican, que sin importar la
superficie de crecimiento y la calidad de los blastocistos, el
procedimiento de la invención (cultivo directo del blastocisto
seguido de ablación con láser) es el más eficiente para el
aislamiento de MCI.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los embriones de buena calidad, el 33% de
las MCIs inicialmente aisladas, crecieron y dieron lugar a líneas
de células troncales embrionarias cuando se usó la estrategia de
cultivo directo del blastocisto ayudado de la técnica láser. Ello
contrasta con el 16% (2 veces menos; p=0,04) de MCIs aisladas que
dieron lugar a líneas de células troncales embrionarias obtenido
mediante la técnica de cultivo directo del blastocisto o con el 6%
(6 veces menos; p=0,001) mediante la técnica de ablación con láser.
Es importante también el aumento de la eficiencia observado (50%
frente a 33%) con embriones de mala calidad cuando el cultivo del
blastocisto directo fue seguido de ablación con láser comparado con
el simple cultivo directo del blastocisto (ver tabla 3).
Cuando se usó gelatina como superficie de
crecimiento, se produjo aislamiento con éxito de MCIs (ver tabla
2), pero no se pudo derivar ninguna línea de células troncales
embrionarias, sin importar la calidad del blastocisto o el método
de aislamiento de la MCI utilizado (ver tabla 4).
Acrónimos: MCI.- masa celular interna;
MEFs.- fibroblastos embrionarios de ratón inactivos; N.V.- No
viable
Diferencias estadísticas entre:
^{1} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a cultivo directo del blastocisto para
blastocistos de buena calidad: p=0.04.
^{2} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a ablación con láser para blastocistos
de buena calidad: p=0.00001.
^{3} Cultivo directo del blastocisto ayudado
de la técnica láser frente a cultivo directo del blastocisto para
blastocistos de mala calidad: p=0.1.
\vskip1.000000\baselineskip
En conjunto, los datos mostrados indican que la
combinación del cultivo directo del blastocisto combinado con la
ablación por láser mejora significativamente la eficiencia de la
derivación de células troncales embrionarias sin importar la
calidad del blastocisto, pero dependiendo de la superficie de
crecimiento utilizada. El procedimiento de la invención proporciona
una alternativa a la inmunocirugía y al cultivo directo del
blastocisto, de forma que se pueda llevar a cabo la derivación de
líneas de células troncales embrionarias aprovechando blastocistos
de ratón de mala calidad, frescos y especialmente congelados, ya
que éstos constituyen la principal fuente de material de partida
para la derivación de líneas celulares troncales embrionarias.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Acrónimos: MCI.- masa celular interna;
MEFs.- fibroblastos embrionarios de ratón inactivos; N.V.- No
viable
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar que el procedimiento de la
invención no perjudica las propiedades biológicas intrínsecas de
las líneas de células troncales embrionarias derivadas, se han
caracterizado las líneas resultantes del cultivo directo del
blastocisto ayudado de la técnica láser. Estas líneas muestran una
morfología típica de células troncales embrionarias (ver figuras 4A
y 4B) y expresan marcadores asociados con estado indiferenciado
SSEA-1 (Figura 4C) y Oct3/4 (Figura 4D). Para
evaluar su potencial de diferenciación in vitro, se formaron
cuerpos embrionarios a los cuales se les permitió diferenciarse
bajo condiciones que promovieran su diferenciación en tejidos
representativos de las tres capas germinales. Como resultado se
obtuvo que las líneas de células troncales embrionarias derivadas
mediante la técnica de cultivo directo del blastocisto ayudada con
láser mostraron una expresión homogénea de los siguientes
marcadores:
- \circ
- alfafetoproteína asociado con endodermo (figura 5B)
- \circ
- actina asociado con mesodermo (figura 5C) y
- \circ
- nestina asociado con ectodermo (figura 5D)
\vskip1.000000\baselineskip
En conjunto, estos datos demuestran que la
metodología de cultivo directo del blastocisto ayudada con láser,
objeto de la presente invención, no compromete ni la capacidad de
las líneas de células troncales embrionarias derivadas para
mantenerse en estado indiferenciado en cultivo, ni su potencial de
diferenciación en las tres capas germinales.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo durante periodos prolongados de
células troncales embrionarias se asocia con cambios cariotípicos,
quedando por resolver si el procedimiento de derivación de las
líneas de células troncales embrionarias es en si mismo responsable
de la pérdida de estabilidad genética. Se ha analizado si la
metodología objeto de la presente invención usada para la
derivación de células troncales embrionarias hace a los embriones
más vulnerables a inestabilidad genética tras cultivo prolongado.
Usando cariotipado convencional, se evaluó la frecuencia de
aneuploidía de las líneas derivadas usando el método mecánico de
cultivo directo con láser o el de ablación con láser.
Las líneas de células troncales embrionarias
establecidas mediante cualquiera de los métodos se mantuvieron
diploides tras periodos cortos (12 pases) de cultivo (ver tabla 5 y
figuras 6A y 6B). Sin embargo, y sin influencia de la técnica de
derivación empleada, todas las líneas de células troncales
embrionarias adquirieron un cariotipo aneuploide anormal (más de 40
cromosomas) tras periodos prolongados (35 pases) de cultivo (tabla 5
y figuras 6C y 6D). Estos datos sugieren que la técnica empleada
para la derivación de las células troncales embrionarias no hace a
los embriones más vulnerables a inestabilidad genómica.
Claims (11)
1. Procedimiento para el aislamiento de la masa
celular interna en blastocistos de mamíferos no humanos que incluye
una etapa de ablación mediante láser del trofoectodermo de dichos
blastocistos y caracterizado porque previamente a dicha
etapa de ablación mediante láser los blastocistos se someten a
cultivo directo en placa durante un periodo de tiempo de al menos
72 horas.
2. Procedimiento para el aislamiento de la masa
celular interna en blastocistos de mamíferos, según las
reivindicación 1, caracterizado porque los blastocistos son
de ratón.
3. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el
cultivo directo previo a la ablación mediante láser incluye las
siguientes subetapas:
a) cultivo de los blastocistos recuperados de
los oviductos en medio estándar, particularmente medio de cultivo
G2 V.III (Vitrolife, Sweden) a 37ºC y con 6% de CO_{2} durante un
periodo de tiempo comprendido entre 24 y 48 horas.
b) tratamiento de los blastocistos cultivados en
la subetapa anterior para conseguir una completa eliminación de la
zona pelúcida.
c) colocación de los blastocistos tratados en la
etapa anterior sobre una superficie de cultivo y posterior adhesión
del trofoectodermo y la masa celular interna de los blastocistos a
dicha superficie.
d) mantenimiento de los blastocistos sobre dicha
superficie y en un medio estándar de cultivo durante un periodo de
tiempo comprendido entre 24 y 48 horas.
e) refresco del medio de cultivo y mantenimiento
de los blastocistos en el mismo durante un nuevo periodo de tiempo
comprendido entre 24 y 48 horas.
4. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
la eliminación de la zona pelúcida se lleva acabo mediante
tratamiento con ácido Tyrode o enzima pronasa durante un periodo de
tiempo comprendido entre 30 y 60 segundos.
5. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
la eliminación de la zona pelúcida se lleva a cabo por eclosión
espontánea del blastocisto.
6. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la
superficie de cultivo sobre la cual se colocan los blastocistos
tras la eliminación de la zona pelúcida es una placa recubierta con
MEFs (Mouse embryonic fibroblasts).
7. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la
superficie de cultivo sobre la cual se colocan los blastocistos
tras la eliminación de la zona pelúcida es una placa recubierta de
gelatina.
8. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el
medio en el cual se mantienen los blastocistos sobre la superficie
de cultivo es medio DMEM (Dubelcco's Modified Eagle's Médium)
suplementado con suero fetal bovino al 20%,
L-glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 0,1
mM, 2000 IU/ml de factor inhibidor de leucemia de ratón,
\beta-mercaptoetanol 0,1 mM, 50 U/ml de
penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
9. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la etapa de
ablación mediante láser del trofoectodermo de los blastocistos, a
realizar inmediatamente tras la etapa de cultivo previo, se lleva a
cabo con un dispositivo de diodo láser de emisión en infrarrojo a
una frecuencia óptica (longitud de onda) de 1,48 \mum.
10. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según la
reivindicación 9, caracterizado porque para la ablación
mediante láser del trofoectodermo de los blastocistos se realizan
entre 20 y 100 disparos.
11. Procedimiento para el aislamiento de masa
celular interna en blastocistos de mamíferos según la
reivindicación 10, caracterizado porque tras la ablación con
láser del trofoectodermo de los blastocistos, se produce el
establecimiento de las líneas celulares embrionarias de ratón a
partir de la masa celular interna aislada de los blastocistos
sometidos al procedimiento.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200701625A ES2326577B1 (es) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamiferos no humanos. |
| PCT/ES2008/000377 WO2008145788A1 (es) | 2007-06-01 | 2008-05-23 | Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamíferos. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200701625A ES2326577B1 (es) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamiferos no humanos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326577A1 ES2326577A1 (es) | 2009-10-14 |
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ID=40074604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200701625A Withdrawn - After Issue ES2326577B1 (es) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Procedimiento para el aislamiento de la masa celular interna en blastocistos de mamiferos no humanos. |
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|---|---|
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2007
- 2007-06-01 ES ES200701625A patent/ES2326577B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2008
- 2008-05-23 WO PCT/ES2008/000377 patent/WO2008145788A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHEN, H., et al. The derivation of two additional human embryonic stem cell lines from day 3 embryos with low morphological scores. Hum. Reprod. Agosto 2005. Vol. 20, número 8, páginas 2201-2206. Ver todo el documento. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2326577A1 (es) | 2009-10-14 |
| WO2008145788A1 (es) | 2008-12-04 |
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