ES2325847B1 - Proceso escalable para la obtencion de ficocianina. - Google Patents
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Abstract
Proceso escalable para la obtención de
ficocianina. Proceso de tres etapas para la obtención y
purificación de ficocianina procedente de microalgas del género
Anabaena, caracterizado por ser escalable y tener un alto
rendimiento. La primera etapa consiste en una ruptura celular
mediante choque osmótico que libera el material citoplasmático,
usando tampón de fosfatos. La segunda etapa utiliza una columna
cromatográfica de adsorción en lecho expandido constituida por un
intercambiador iónico como fase adsorbente. La tercera etapa es un
proceso adicional cromatográfico en columna de intercambio iónico
que utiliza como fase estacionaria un cambiador aniónico,
funcionando en formato empaquetado. En condiciones óptimas, tras la
segunda etapa se obtiene un rendimiento en torno al 87% de
recuperación de ficocianina, mientras que tras la tercera etapa se
obtiene un rendimiento global del proceso del 64% de ficocianina
pura.
Description
Proceso escalable para la obtención de
ficocianina.
La C-ficocianina es una
macromolécula biológica perteneciente a la familia de las
ficobiliproteinas con aplicaciones en diversos sectores industriales
como consecuencia de sus extraordinarias propiedades
espectroscópicas, tanto absorciométricas como fluorimétricas.
En concreto, su elevado coeficiente de extinción
molar a \lambda = 620 nm, le confiere un intenso color azul muy
apropiado para su empleo como colorante natural, mientras que su
elevado rendimiento cuántico de fluorescencia permite su detección
con mayor o similar sensibilidad que otros fluoróforos
convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ficobiliproteinas son una familia de
proteínas que poseen grupos prostéticos tetrapirrólicos,
denominados bilinas, que en su estado funcional se encuentran
enlazados covalentemente a los residuos cisteína de las cadenas de
las apoproteínas. Estas proteínas se encuentran en algas
verde-azuladas denominadas cianobacterias, en una
clase de algas unicelulares biflageladas eucariotas denominadas
algas criptomonadales y en algas rojas o rodofitas. En todos estos
organismos las ficobiliproteínas actúan como pigmentos
fotosintéticos antena y suelen estar organizadas formando parte de
unas macroestructuras celulares denominadas ficobilisomas.
Atendiendo a sus propiedades espectroscópicas de absorción se
clasifican en tres grupos principales: ficoeritrinas (PEs,
\lambdamax-540-570 nm),
ficocianinas (PCs,
\lambdamax-610-620 nm) y
aloficocianinas (APCs,
\lambdamax-650-655 nm).
Debido a sus ventajosas propiedades espectrales,
así como a su estabilidad y condiciones de solubilidad, las
ficobiliproteínas se utilizan actualmente en multitud de
aplicaciones, entre las que destacan su uso como marcadores
fluorescentes de células y macromoléculas en investigación
biomédica y clínica y en diversas técnicas fluorimétricas. Otra
aplicación de las ficobiliproteínas es su uso como colorantes
naturales en alimentación y cosmética reemplazando a colorantes de
tipo sintético que, en general, suelen ser tóxicos e incluso
cancerígenos en organismos sensibles. Por último, se conoce también
su importante valor terapéutico debido a su actividad
inmunomoduladora y anticancerígena.
Dentro de la familia de las ficobiliproteínas,
la C-ficocianina constituye una macromolécula
interesante para el conjunto de aplicaciones anteriormente citadas
como consecuencia de sus características espectroscópicas. Además,
posee propiedades fluorescentes específicas tales como su elevado
rendimiento cuántico y desplazamiento de Stokes, que evitan
interferencias en la detección procedente de matrices biológicas u
otros medios en los que puede utilizarse. Todas estas ventajas
hacen que la C-ficocianina se esté utilizando en la
actualidad como marcador fluorescente conjugado a anticuerpos,
lectinas, polisacáridos, DNA y otras macromóleculas y
macroestructuras supramoleculares. También se usa en el diseño y
caracterización de elementos fotosensibles en biosensores y en
tratamientos terapéuticos desarrollados a nivel de animales de
experimentación. Otras utilidades, debidas a su intenso y único
color azul, son el empleo como colorante natural en preparaciones
cosméticas, farmacéuticas y de la industria alimentaria.
Es habitual que los esquemas de purificación de
proteínas contengan un considerable número de etapas que, a su vez,
se suelen dividir en subetapas que, usualmente, no son escalables.
En el estado de la técnica actual, la C-ficocianina
se obtiene, en la mayoría de los casos, mediante metodologías que
utilizan tratamientos previos que involucran ruptura celular usando
ultrasonidos, congelación-descongelación,
tratamiento con lisozima, etc., posterior precipitación con sulfato
amónico y procesos de diálisis, seguidos de cromatografia de
intercambio iónico, cromatografia de filtración por gel o bien
cromatografia de adsorción sobre hidroxiapatito. Todos estos
procedimientos presentan algunos inconvenientes que hasta ahora han
limitado la obtención de cantidades elevadas de esta proteína, de
entre los cuales cabe destacar:
- Poseen rendimientos globales bajos porque la
abundancia de etapas en los procesos de purificación conlleva una
paralela y significante pérdida del producto de interés al no
optimizar cada una de las etapas utilizadas al objeto de minimizar
esas pérdidas.
- Son económicamente muy costosos porque
involucran una gran cantidad de etapas y subetapas que repercuten
negativamente en el coste global medio de producción.
- Son difícilmente escalables porque los
procesos implicados en la obtención del producto sólo han sido
estudiados a escala analítica de laboratorio y en la mayoría de los
casos las etapas que se precisan no permiten su paso al nivel de
planta piloto o industrial.
- Pueden alterar la estructura nativa de la
proteína porque algunas de las etapas utilizadas en las
metodologías comentadas utilizan sistemas físicos o químicos que
influyen en la estructura de la proteína a purificar, sin que se
haya estudiado la posible reversibilidad o irreversibilidad de los
efectos producidos en la macromolécula por los mencionados
tratamientos.
Por todo lo anterior, la presente invención
aporta, respecto a otros procedimientos conocidos, un mayor
rendimiento del proceso, extrayéndose del orden del 64% del
contenido de la C-ficocianina contenida en la
biomasa de ciertas microalgas, y una reducción de costes de
obtención. Además, a diferencia de los procesos conocidos, las
etapas en que se divide la purificación son fácilmente
escalables.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene por objeto el
desarrollo de un proceso basado en las propiedades de la
cromatografía de adsorción en lecho expandido, para la purificación
a elevado rendimiento de la proteína C-ficocianina
procedente de microalgas del género Anabaena.
\vskip1.000000\baselineskip
Proceso de tres etapas para la obtención y
purificación de ficocianina procedente de microalgas del género
Anabaena, caracterizado por ser escalable y tener un alto
rendimiento. La primera etapa consiste en una ruptura celular
mediante choque osmótico que libera el material citoplasmático,
usando tampón de fosfatos. La segunda etapa utiliza una columna
cromatográfica de adsorción en lecho expandido constituida por un
intercambiador iónico como fase adsorbente. La tercera etapa es un
proceso adicional cromatográfico en columna de intercambio iónico
que utiliza como fase estacionaria un cambiador aniónico,
funcionando en formato empaquetado. En condiciones óptimas, tras la
segunda etapa se obtiene un rendimiento en torno al 87% de
recuperación de ficocianina, mientras que tras la tercera etapa se
obtiene un rendimiento global del proceso del 64% de ficocianina
pura.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen a continuación las tres etapas para
la obtención y purificación de C-ficocianina a
partir de microalgas del género Anabaena.
Primera etapa: Pretratamiento inicial en
el que se mezcla la biomasa de microalga con tampón y tras la
correspondiente homogeneización, se produce la ruptura celular
debido al choque osmótico. De esta forma, se permite la liberación
del contenido intracelular del cual forman parte los ficobilisomas,
que son las macroestructuras que contienen las
ficobiliproteínas.
A continuación, el homogeneizado se somete a un
proceso de centrifugación que sedimenta las macroestructuras
supramoleculares (como restos de paredes celulares) y proporciona
un sobrenadante (extracto crudo) en el que se encuentran
solubilizadas la mayor parte de los componentes del microalga. En
este extracto crudo, junto a otras macromoléculas y solutos
moleculares, se encuentra la C-ficocianina. El
rendimiento de esta primera etapa alcanza el 100% de recuperación
de la ficocianina contenida en el microalga.
Segunda etapa: Consiste en la utilización
de una columna cromatográfica de adsorción en lecho expandido
constituida por un intercambiador iónico como fase adsorbente. Esta
etapa permite simplificar mucho el proceso frente a metodologías
previas convencionales. Se han estudiado y optimizado las
características y condiciones que deben tener tanto la columna de
lecho expandido, como la fase móvil utilizada y la muestra a
cromatografiar. Los resultados muestran que utilizando una fase
móvil compuesta por tampón fosfato, tras la aplicación de la
muestra a la columna, se adsorbe preferencialmente la
C-ficocianina, mientras que la mayor parte de los
componentes existentes en el extracto crudo procedente del
tratamiento inicial no son retenidos en la fase adsorbente. Tras la
aplicación de la muestra, se lleva a cabo la elución de las
proteínas adsorbidas dejando sedimentar el lecho expandido, de tal
forma que se trabaja en formato empaquetado o clásico.
En la elución se utiliza una fase móvil
compuesta por tampón fosfato. En estas condiciones se consigue la
separación de la práctica totalidad de la
C-ficocianina retenida, junto a una pequeña
cantidad de otras proteínas contaminantes. El porcentaje de
recuperación en esta segunda etapa o rendimiento medio de la misma,
depende directamente de la viscosidad de la muestra que se aplica a
la columna de lecho expandido y de la cantidad de proteína cargada
en la fase de aplicación (es decir, de la relación mg
C-ficocianina/ml de adsorbente). La Tabla 1 muestra
la influencia de estos parámetros en el porcentaje total de
recuperación logrado en esta segunda etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados evidencian que ha de utilizarse
una carga proteica que genere una viscosidad en la muestra de
aplicación a la columna, que evite la formación de canales
preferentes en el lecho expandido, lo que contribuiría a una
distribución desigual de la muestra en el lecho cromatográfico
produciendo una pérdida en el rendimiento del proceso.
Tras la segunda etapa las fracciones eluidas de
la columna corresponden a disoluciones concentradas de
C-ficocianina, con pequeñas impurezas de otras
proteínas que no han sido eliminadas totalmente en el proceso
cromatográfico en lecho expandido.
En condiciones adecuadas, el porcentaje medio de
recuperación de C-ficocianina en esta segunda etapa
es del 87%.
Tercera etapa: Consiste en hacer pasar el
producto de la segunda etapa a través de una columna cromatográfica
de intercambio iónico que utiliza como fase estacionaria un
cambiador aniónico, funcionando en formato empaquetado. La muestra
se aplica a la cabeza de la columna y, seguidamente se desarrolla
utilizando un gradiente discontinuo de fase móvil. Inicialmente, se
trata con tampón fosfato de baja fuerza iónica, que permite la
retención de C-ficocianina en el soporte sólido
mientras que el resto de proteínas que contiene la muestra no son
retenidas y eluyen en el frente de fase móvil, recogiéndose a la
salida de la columna. A continuación se aumenta la fuerza iónica de
la fase móvil y con ello se provoca la elución de la
C-ficocianina enlazada inicialmente y permite la
obtención de una disolución constituida por la proteína pura. El
análisis por anisotropía de emisión en estado estacionario muestra
que la proteína obtenida conserva la estructura trimérica, tal y
como se encuentra en su forma nativa, en los ficobilisomas del
organismo de procedencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Primera etapa: Como materia prima del
proceso se utilizan partidas de la microalga liofilizada para su
almacenamiento y transporte, preferentemente Anabaena
marina.
En esta especie, las ficobiliproteinas
constituyen en torno al 1.6% del peso seco.
La biomasa se resuspende en tampón fosfato,
preferentemente 50 mM con un pH entre 5 y 7.5, más preferentemente
pH 7, utilizando una razón de 1 litro de tampón por cada 0.1 - 1.0
kilogramos de biomasa liofilizada, preferentemente 1 litro de
tampón por cada 0.25 kilogramos de biomasa liofilizada.
Tras agitación mecánica, preferentemente durante
una hora, para conseguir la ruptura celular por choque osmótico, el
homogeneizado resultante se centrifuga, preferentemente de 5 a 30
minutos a 5000 - 30000 rpm, más preferentemente a 15000 rpm durante
10 minutos, obteniéndose un sobrenadante (extracto crudo) y un
sedimento que es desechado.
Al extracto crudo se añade un conservante,
preferentemente azida sódica, hasta una concentración del 0.01% y
se guarda refrigerada a unos 4ºC hasta su posterior
utilización.
La determinación de la cantidad de
C-ficocianina contenida en el extracto crudo da un
valor óptimo del 100% de recuperación.
Segunda etapa: Se equilibra con tampón
fosfato, preferentemente con 200 ml de tampón fosfato 50 mM pH 7,
una columna de 1.5 - 6 cm. de diámetro interno, preferentemente 1.5
cm. de diámetro interno, y 50 cm. de altura conteniendo 27 ml de
cambiador iónico Streamline-DEAE ®, lo que genera
una altura de lecho empaquetado de unos 15 cm. El lecho se expande
con un progresivo aumento del caudal de fase móvil impulsado con
una bomba peristáltica, hasta llegar a un valor de 200 cm h^{-1}.
Tras esto, se alcanza el doble de la altura inicial de lecho
empaquetado, llegando hasta 30 cm.
El extracto crudo procedente del tratamiento
inicial se aplica hasta alcanzar preferentemente una carga proteica
igual a 1.4 mg C-ficocianina/ml de adsorbente. A
continuación, 100 ml de esta disolución tamponada, preferentemente
con tampón fosfato 50 mM pH 7, se bombean a través de la columna de
lecho expandido, preferentemente a una velocidad de 200 cm
h^{-1}. Después de la aplicación de la muestra, la columna se
lava, preferentemente con 100 ml del mismo tampón utilizado en la
aplicación de la muestra, preferentemente a la misma velocidad de
flujo e igual grado de expansión en el lecho cromatográfico. Con
ello se consigue reducir al mínimo posible la pérdida de
C-ficocianina en las fases de aplicación y
lavado.
A continuación se procede a la elución en
formato de lecho empaquetado clásico, lo que se logra cortando el
flujo de fase móvil y dejando sedimentar el lecho expandido hasta
la configuración empaquetada. La C-ficocianina
adsorbida en el lecho expandido se eluye utilizando preferentemente
tampón fosfato, más preferentemente tampón fosfato 500 mM pH 7,
preferentemente a una velocidad de flujo de 86 cm h^{-1}. Las
fracciones recogidas son de color azul intenso, con una presencia
mayoritaria de C-ficocianina junto a una pequeña
cantidad de otras proteínas. La pureza de la
C-ficocianina obtenida en esta etapa permite su
utilización en diversos usos, entre ellos el uso como colorante
alimentario o en cosmética.
El rendimiento de esta segunda etapa, en las
condiciones preferentes descritas, es del orden del 87%, expresado
como porcentaje de cantidad total de C-ficocianina
recuperada en el eluato por cantidad de proteína cargada en la
columna.
Para el modo de realización preferido descrito,
esta etapa de cromatografía en lecho expandido incluye: un proceso
de equilibración (15 minutos), otro de aplicación de la muestra (17
minutos), un tercero de lavado de la columna (14 minutos) y
finalmente la elución en formato empaquetado (18 minutos), lo que
constituye un total de 64 minutos de operación.
Tercera etapa: Los resultados de la
segunda etapa muestran que la purificación hasta homogeneidad de
C-ficocianina, para su uso en aplicaciones que
requieren proteína pura, precisa de una etapa adicional que se
concreta en la necesidad del empleo de cromatografía de intercambio
iónico en lecho estacionario, preferentemente de
DEAE-celulosa DE-52.
La disolución obtenida en la segunda etapa se
aplica a una columna de 2.5 - 9.0 cm. de diámetro interno y 20 cm.
de altura, preferentemente de 2.5 cm. de diámetro interno,
preferentemente equilibrada con tampón fosfato, más preferentemente
tampón fosfato 50 mM pH 7. Seguidamente, la columna se desarrolla
con tampón, preferentemente 110 ml de tampón fosfato, más
preferentemente 110 ml de tampón fosfato 290 mM pH 7, lo que
permite obtener un eluato de C-ficocianina,
visualizado como una intensa banda azul. A continuación se procede
al lavado de la columna con tampón fosfato, preferentemente tampón
fosfato 400 mM pH 7.
En todas las fases de este proceso
cromatográfico, la velocidad de flujo se mantiene constante e igual
a 21 cm h^{-1}.
El análisis de las fracciones recogidas mediante
espectroscopia de absorción y de fluorescencia, así como mediante
electroforesis, muestra que los resultados son consistentes con los
mencionados en la bibliografía para disoluciones puras de
C-ficocianina.
El rendimiento de esta tercera etapa, para el
modo de realización preferido descrito, es del 74%.
El procedimiento compuesto por las tres etapas,
en las condiciones descritas para el modo de realización preferido,
alcanza un rendimiento global del 64% de recuperación de
C-ficocianina respecto a la contenida en la materia
prima utilizada.
En resumen, la presente invención consiste en un
proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina en dos etapas, siendo la primera de
ellas la ruptura celular por choque osmótico y la segunda la
utilización de cromatografía de adsorción en lecho expandido, que
utiliza como materia prima microalgas del género Anabaena y
obtiene un porcentaje de recuperación de
C-ficocianina mayor del 75% del contenido en la
materia prima. Preferiblemente la especie utilizada como materia
prima es Anabaena marina.
En el proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina, tras estas dos etapas se obtienen
disoluciones concentradas de C-ficocianina con
ligeras impurezas de otras proteínas. Esta ficocianina tiene pureza
suficiente para su empleo en diversas aplicaciones, entre ellas el
uso en la industria alimentaria y cosmética.
En la etapa de ruptura celular mediante choque
osmótico se emplea tampón, en particular tampón fosfato, a pH entre
5 y 7.5, preferentemente tampón fosfato 50 mM pH 7, y posteriores
fases sucesivas de mezcla, homogeneización mecánica y
centrifugación.
\newpage
Se recomienda utilizar una razón de 1 litro de
tampón por cada 0.1 - 1.0 kilogramos de biomasa liofilizada,
preferentemente 1 litro de tampón por cada 0.25 kilogramos de
biomasa liofilizada. La centrifugación posterior puede realizarse
durante 5-30 minutos a 5000-30000
rpm, preferentemente durante 10 minutos a 15000 rpm.
La segunda etapa del proceso consiste en la
utilización de una columna cromatográfica de adsorción en lecho
expandido, preferentemente de 1.5 - 6.0 cm. de diámetro interno y
50 cm. de altura, constituida por un intercambiador iónico como
fase adsorbente. La columna se desarrolla utilizando una fase móvil
constituida por tampón, preferentemente tampón fosfato 50 mM pH 7 en
las fases de aplicación de la muestra y lavado de la columna y
tampón fosfato 500 mM pH 7 en la fase de desorción. En esta segunda
etapa, se recomienda una velocidad de flujo de fase móvil de 200 cm
h^{-1}, en las fases de aplicación de la muestra y lavado de la
columna y de 86 cm h^{-1} en la fase de elución de la muestra.
Adicionalmente, para obtener un grado de pureza
superior en ficocianina, se puede utilizar una tercera etapa
consistente en la utilización de una columna cromatográfica,
preferentemente de 2.5 - 9 cm. de diámetro interno y 20 cm. de
altura, de intercambio iónico en lecho empaquetado clásico,
preferentemente de DEAE-celulosa
DE-52. La columna es desarrollada utilizando una
fase móvil constituida por tampón fosfato, preferentemente tampón
fosfato
50 mM pH 7, en las fases de equilibrado y aplicación de la muestra, y tampón fosfato 290 mM pH 7 en la fase de elución.
50 mM pH 7, en las fases de equilibrado y aplicación de la muestra, y tampón fosfato 290 mM pH 7 en la fase de elución.
En las fases de aplicación, elución y lavado de
la columna se recomienda utilizar una velocidad de flujo de fase
móvil de de 21 cm h^{-1}.
Tras esta tercera etapa, la ficocianina obtenida
puede ser empleada en aplicaciones que precisan de una mayor
pureza, como por ejemplo el uso en ensayos de fluorescencia o
ensayos biomédicos.
El proceso compuesto por las tres etapas
descritas alcanza un porcentaje de recuperación de
C-ficocianina mayor del 60% del contenido en la
materia prima.
Claims (15)
1. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina en dos etapas, mediante la ruptura
celular por choque osmótico y la posterior utilización de
cromatografía de adsorción en lecho expandido, que utiliza como
materia prima microalgas del género Anabaena y obtiene un
porcentaje de recuperación de C-ficocianina mayor
del 75% del contenido en la materia prima.
2. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicación 1,
caracterizado por la obtención de disoluciones concentradas
de C-ficocianina con ligeras impurezas de otras
proteínas, de pureza suficiente para diversos usos, entre ellos el
uso en la industria alimentaria y cosmética.
3. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado por el empleo de tampón, preferentemente tampón
fosfato a pH entre 5 y 7.5, más preferentemente tampón fosfato 50
mM pH 7, en la primera etapa de ruptura celular mediante choque
osmótico.
4. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por utilizar, tras
la etapa de ruptura celular mediante choque osmótico, fases
sucesivas de mezcla, homogeneización mecánica y centrifugación.
5. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el empleo en
la primera etapa de una razón de 1 litro de tampón por cada
0.1-1.0 kilogramos de biomasa liofilizada,
preferentemente 1 litro de tampón por cada 0.25 kilogramos de
biomasa liofilizada.
6. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
centrifugación se realiza durante 5-30 minutos a
5000-30000 rpm, preferentemente durante 10 minutos a
15000 rpm.
7. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la
segunda etapa se utiliza una columna cromatográfica de adsorción en
lecho expandido, preferentemente de 1.5-6.0 cm. de
diámetro interno y 50 cm. de altura, constituida por un
intercambiador iónico como fase adsorbente. La columna se
desarrolla utilizando una fase móvil constituida por tampón,
preferentemente tampón fosfato 50 mM pH 7 en las fases de
aplicación de la muestra y lavado de la columna y tampón fosfato 500
mM pH 7 en la fase de desorción.
8. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por la utilización
en la segunda etapa de una velocidad de flujo de fase móvil de 200
cm h^{-1}, en las fases de aplicación de la muestra y lavado de
la columna y de 86 cm. h^{-1} en la fase de elución de la
muestra.
9. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que después de la ruptura celular
y la cromatografía de adsorción en lecho expandido se emplea una
tercera etapa de cromatografía de intercambio iónico en lecho
empaquetado clásico, de forma que el proceso compuesto por las tres
etapas alcanza un porcentaje de recuperación de
C-ficocianina mayor del 60% del contenido en la
materia prima.
10. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicación 9,
caracterizado porque en la tercera etapa se utiliza una
columna cromatográfica de intercambio iónico en lecho empaquetado
clásico, preferentemente de DEAE-celulosa
DE-52.
11. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicaciones 9 ó 10,
caracterizado por utilizar en la tercera etapa una columna
cromatográfica con un diámetro interno de entre 2.5 - 9.0 cm., y 20
cm. de altura.
12. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicación 9, 10 u 11,
caracterizado porque la columna es desarrollada utilizando
una fase móvil constituida por tampón fosfato, preferentemente
tampón fosfato 50 mM pH 7, en las fases de equilibrado y aplicación
de la muestra.
13. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicación 9, 10, 11 ó 12,
caracterizado porque la columna es desarrollada utilizando
una fase móvil constituida por tampón fosfato, preferentemente
tampón fosfato 290 mM pH 7, en la fase de elución.
14. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según reivindicaciones 9, 10, 11, 12
o 13, caracterizado por el empleo en la tercera etapa de una
velocidad de flujo de fase móvil de 21 cm h^{-1} en las fases de
aplicación, elución y lavado de la columna.
15. Proceso de obtención y purificación de
C-ficocianina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la especie utilizada como
materia prima es Anabaena marina.
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2007
- 2007-10-16 ES ES200702782A patent/ES2325847B1/es active Active
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2008
- 2008-10-14 WO PCT/ES2008/000654 patent/WO2009050319A1/es active Application Filing
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FELIPE, M.A. et al. Obtención de biliproteínas de interes biotecnológico industrial mediante cromatografía de adsorción en lecho expandido. Iniciación a la investigación. Revista electrónica. Universidad de Jaén. Ini. Inv.1: al 7(2006). Ver resumen. * |
GANAPATHI,P. et al. Method to obtain C-phycocyanin of high purity. Journal of Chromatography A, 2006, vol. 1127, pag. 76-81. Ver resumen. * |
Also Published As
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