ES2324509A1 - Composicion de revelado en ensayos de inmunodeteccion. - Google Patents
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Abstract
Composición de revelado en ensayos de inmunodetección. La presente invención se refiere a una composición de revelado en ensayos de inmunodetección que comprende un compuesto de fórmula I, luminol, peróxido de hidrógeno y una solución tampón. Además la presente invención se refiere al uso de dicha composición en ensayos de inmunodetección.
Description
Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección.
La presente invención se refiere a una nueva
composición para el revelado de muestras en membranas en ensayos de
inmunodetección como el Western Blot.
Además se encuadra dentro del sector de técnica
del desarrollo de nuevas metodologías de detección de muestras
biológicas.
El Western blot es una técnica de
inmunodetección mediante la cual una proteína específica puede ser
detectada y visualizada. Esta técnica se basa principalmente en la
facultad de reconocimiento de los anticuerpos por los antígenos. En
este mismo sentido dicha técnica se basa en que las proteínas a
estudiar son separadas mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante
electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa en papel.
Desde este punto, las proteínas son estudiadas utilizando
anticuerpos específicos para dicha proteínas. En este mismo sentido
se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de
interés. A continuación un segundo anticuerpo, marcado con una
enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero,
se emplea para localizar donde se formaron los complejos
antígeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario se
puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una
señal detectable. Esta señal habitualmente es debida a un marcado
con quimioluminiscencia. El revelado es mediante
quimioluminiscencia mediante una reacción química de tal manera que
se produce una señal luminosa. Para esta reacción se utiliza la
peroxidasa de rábano (HRP) para catlizar la oxidación de luminol en
presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediantamente después de la
oxidación, el luminol se encuentra en un estado excitado del que
pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La
luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de
emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una
emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas.
Para el revelado de estas muestras, se utilizan
composiciones de revelado bien conocidas en el estado de la
técnica, como es el caso de la composición ECL de Amershan, que
principalmente se compone de la mezcla de dos reactivos A y B, en
donde A es el sustrato o luminol y el reactivo B que se trata de
peróxido de hidrógeno en cantidades y proporciones bien definidas.
En este mismo sentido existen otras muchas soluciones de revelado
producidas por casas comerciales como Pierce (Supersignal) Perkin
Elmer, Millipore... que básicamente se basan en la misma
metodología.
Sin embargo todas estas composiciones son
bastante caras, no son muy sensibles y ofrecen una resolución
moderada. Otro inconveniente de dichas soluciones es que el tiempo
de exposición es muy variable dependiendo del anticuerpo en uso y
de la cantidad de proteína cargada en el gel de poliacrilamida para
efectuar el Western-Blot. Este inconveniente hace
que muchos usuarios tengan que exponer su película al azar en
tiempos escogidos aleatoriamente que no tienen porque ser los más
adecuados para la visualización de la proteína en estudio. Con la
composición aquí detallada, nosotros hemos comprobado para un panel
de más de 20 anticuerpos testados, los tiempos de exposición son los
mismos independientemente del anticuerpo utilizado o del extracto
proteico a validar. Por lo tanto se hace necesario el desarrollo de
nuevas composiciones de revelado que abaraten costes y sobre todo
que tengan una mayor sensibilidad y resolución a la hora de
identificar las bandas que puedan aparecer en un estudio llevado a
cabo mediante la técnica de Western blot.
La presente invención hace referencia a una
nueva composición de revelado en ensayos de inmunodetección como es
el caso del Western blot. Dicha nueva composición de revelado tiene
la ventaja principal de obtener una mayor sensibilidad y resolución
de los resultados mostrados en el momento de identificar las bandas
que puedan aparecer en un estudio llevado a cabo mediante la técnica
de Western blot, además de ser aproximadamente 100 veces más barato
que el coste de las composiciones ya conocidas en el Estado de la
Técnica.
Por lo tanto un primer aspecto esencial de la
presente invención hace referencia a una composición de revelado en
ensayos de inmunodetección que comprende los siguientes
componentes:
- Un compuesto de fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R7 se sustituye por H, OH,
-OCH_{3} o -OCH_{2}-CH_{3}, y R1 representa un
compuesto de fórmula
II:
y en donde R2, R3 y R6
independientemente son H, OH, SH, -CH_{3} o
-CH_{2}-CH_{3} y en donde R4 y R5
independientemente son H, OH, -CH_{3},
-CH_{2}-CH_{3}, OCH_{3} o
OCH_{2}-CH_{3}.
- Luminol.
- Peróxido de hidrógeno.
- Una solución tampón o buffer.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida de la presente
invención, es en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de
fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH o H.
- R5: H, OH o OCH_{3}.
- R6: H o OH.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el
compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH.
- R5: H.
- R6: H.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el
compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH.
- R5: OCH_{3}.
- R6: H.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el
compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: H.
- R5: H.
- R6: OH.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el
compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: H.
- R5: H.
- R6: H.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida la composición
de revelado en ensayos de inmunodetección comprende los componentes
anteriormente descritos en las siguientes proporciones:
- Compuesto de fórmula I está presente en una
concentración desde 0,1 a 0,45 mM preferentemente desde 0,2 a 0,255
mM.
- Luminol en una concentración desde 1,25 a 8,75
mM preferentemente desde 1,25 a 4,05 mM.
- Peróxido de hidrógeno al 30% en un rango desde
el 0,01 al 1%. preferentemente desde 0,01 a 0,1%.
- Una solución tampón o buffer de Tris (1,5M) en
un rango desde 0,05 a 0,8 M. preferiblemente desde 0,05 a 0,2
M.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida la composición
de revelado en ensayos de inmunodetección comprende los componentes
anteriormente descritos en las siguientes proporciones:
- Compuesto de fórmula I está presente en una
concentración desde 0,1 a 0,45 mM preferentemente desde 0,2 a 0,255
mM.
- Luminol en una concentración desde 1,25 a 8,75
mM. preferentemente desde 1,25 a 4,05 mM.
- Peróxido de hidrógeno al 30% en un rango desde
el 0,01 al 1% preferentemente desde 0,01 a 0,1%.
- Una solución tampón o buffer de EDTA en un
rango desde 0,03 a 0,30 M preferentemente 0,03 a 0,09 M.
Un segundo aspecto esencial de la presente
invención hace referencia al uso de la composición de revelado en
ensayos de inmunodetección, preferentemente en Western blot.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características de la presente invención, de acuerdo con un ejemplo
preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como
parte integrante de dicha descripción, películas reales de
radiografías con carácter ilustrativo y no limitativo.
La figura 1.- Muestra una un estudio comparativo
entre distintos reactivos de revelado de distintas casas
comerciales del mismo extracto proteico tratado en paralelo con la
única variación del sistema de revelado. Los laboratorios a
comparar fueron: ECL de Amersham (bandas A), Supersignal de Pierce
(bandas B) y el resultado tras utilizar la nueva composición
descrita en la presente invención (bandas C). Para ello se
hibridaron extractos celulares con el anticuerpo de
beta-actina tal y como se detalla con posterioridad.
En la figura se muestra como desde el primer segundo de exposición
a la composición de revelado aparece una banda nueva (flecha negra
delgada) que no aparece a ningún tiempo para el resto de las
composiciones. La nueva banda, marcada por la flecha negra, aunque
de carácter inespecífico demuestra el alto poder resolutivo o
sensibilidad de la composición aquí expuesta. La sensibilidad de la
composición descrita en esta invención, igualmente demuestra a
tiempo de un minuto, la aparición de una segunda banda inespecífica
(flecha negra discontinua) que tampoco se aprecia en ninguna de las
otras dos composiciones. Así mismo la banda específica (flecha
negra punteada), demuestra que la composición descrita (panel C) es
unas 10 veces mayor que el panel A. Si comparamos la composición
(panel C) con el panel B, la localización exacta de la proteína es
más específica en la composición descrita en la presente invención.
Dado que la mayoría de las proteínas celulares se expresan en menor
grado de expresión que la beta-actina, este ejemplo
es representativo de que con la composición objeto de la presente
invención, el poder de resolución es mayor.
A la vista de la figura reseñada, se procede a
describir de forma detallada la presente invención:
Se compararon la eficiencia de dos reactivos de
revelado comerciales de las casa Amersham (ECL) y Pierce
(Supersignal) en comparación con la composición objeto de la
presente invención. Dicho reactivo se ha estado testando y evaluando
durante más de 6 meses, periodo en el cual se han testado más de 20
anticuerpos, y que verifican por tanto la estabilidad de los
reactivos preparados en varias concentraciones de almacenaje a 4ºC y
a -20ºC. En este sentido, se llevó a cabo el siguiente
experimento:
Extractos proteicos de la línea celular NIH3T3
que se encontraba creciendo en cultivos (libre de micoplasma y en
fase exponencial) fueron extraídos con un buffer de tisis
convencional de extracción de proteínas. Dichos extractos se
corrieron en un gel al 12% de poliacrilamida al mismo tiempo (a 120
v durante 2 h). Posteriormente el gel se transfirió a una membrana
de nitrocelulosa (en la misma membrana y bajo las mismas
condiciones (400 mA durante 1,15 h). Después del proceso de
transferencia, la membrana se bloqueó con TNT-leche
al 5% de acuerdo con protocolos estándar, se hibridó durante 14 h
con el anticuerpo primario de beta-actina
(Sigma-Aldrich) proteína de elevada expresión que se
utilizó como control positivo, posteriormente la membrana se lavó
extensamente durante 30 min; se incubó durante una hora con
anticuerpo secundario
"horse-peroxidase-labelled
anti-mouse" (Amersham or Promega ref.NA9310V),
posteriormente se lavó durante 30 min y se cortó en diferentes
partes y cada una de ellas se reveló con una composición
diferente.
En relación a la figura 1, se resalta la
especificidad dada por la composición objeto de la presente
invención (panel C), aunque el reactivo proporcionado por Pierce
(panel B) pueda parecer igualmente sensible al nuestro (panel C),
este último es en cierta medida artefactual por varios motivos:
- a)
- La señal de expresión proteica se manifiesta de forma ovalada a 1 seg de exposición, en lugar del típico patrón de proteínas (forma alargada tal y como demuestran los paneles A y C), tras haber migrado de forma homogénea en la electroforesis
- b)
- La señal de expresión proteica a 1 min. y 10 min. de exposición, va más allá de la exacta localización de la proteína. Es decir, la membrana correspondiente al panel C, fue recortada por donde indica el marcador en 1 min. y 10 min. de exposición, por tanto la señal que se ve a la izquierda de la marca realizada una vez la película fue revelada, indica señal artefactual que no es proporcional a la exacta localización de la proteína en la membrana. A 10 min. de exposición, se aprecia claramente en el panel B, una señal "añadida" sobre la forma ovalada que representa la señal principal.
Nuestra composición (panel C), si bien en cierta
medida comparable en intensidad al panel B, no proporciona dicho
artefacto a la hora de evaluar expresión proteica.
Claims (15)
1. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección caracterizada porque comprende los
siguientes elementos:
- a.
- un compuesto de fórmula general I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en el que R7 es H, OH, -OCH_{3} o –OCH_{2}-CH_{3}; y
- \quad
- en el que R1 es un compuesto de fórmula general II:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en el que R2, R3 y R6 independientemente son H, OH, SH, -CH_{3} o -CH_{2}-CH_{3}; y
- \quad
- en el que R4 y R5 independientemente son H, OH, -CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3}, -OCH_{3} o –OCH_{2}-CH_{3};
- b.
- luminol;
- c.
- peróxido de hidrógeno al 30%; y
- d.
- una solución tampón.
2. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada
porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH o H, R5 es H, OH o
OCH_{3} y R6 es H o OH.
3. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada
porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH, R5 es H y R6 es H.
4. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada
porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH, R5 es -OCH_{3} y R6 es
H.
5. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada
porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es H, R5 es H y R6 es OH.
6. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada
porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es H, R5 es H y R6 es H.
7. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada
porque la solución tampón es Tris.
8. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada
porque la solución tampón es EDTA.
9. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado
porque el compuesto de fórmula I tiene una concentración de 0,1 a
0,45 mM, preferentemente desde 0,2 a 0,255 mM.
10. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado
porque el luminol tiene una concentración de 1,25 a 8,75 mM,
preferiblemente de 1,25 a 4,05 mM.
11. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado
porque el peróxido de hidrógeno tiene una concentración del 0,01 al
1%, preferiblemente de 0,01 a 0,1%.
12. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores
1 y 7, caracterizada porque la solución tampón tiene una
concentración de 0,05 a 0,8 M, preferiblemente de 0,05 a 0,2 M.
13. Composición de revelado en ensayos de
inmunodetección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores
1 y 8, caracterizada porque la solución tampón tiene una
concentración de 0,03 a 0,30 M preferiblemente de 0,03 a 0,09
M.
14. Uso de la composición de la reivindicación
1, para ensayos de inmunodetección.
15. Uso de la composición de la reivindicación
1, para ensayos de Western Blot.
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| ES200800323A Expired - Fee Related ES2324509B1 (es) | 2008-02-06 | 2008-02-06 | Composicion de revelado en ensayos de inmunodeteccion. |
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| Country | Link |
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| ES (1) | ES2324509B1 (es) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4842997A (en) * | 1982-03-03 | 1989-06-27 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| US5424194A (en) * | 1991-03-20 | 1995-06-13 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | 4-(cyanomethylthio)phenol enhanced peroxidase assays |
| US5629168A (en) * | 1992-02-10 | 1997-05-13 | British Technology Group Limited | Chemiluminescent enhancers |
| US6432662B1 (en) * | 1997-04-15 | 2002-08-13 | Pierce Chemical Company | Assay of peroxidase activity |
-
2008
- 2008-02-06 ES ES200800323A patent/ES2324509B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4842997A (en) * | 1982-03-03 | 1989-06-27 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| US5424194A (en) * | 1991-03-20 | 1995-06-13 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | 4-(cyanomethylthio)phenol enhanced peroxidase assays |
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| US6432662B1 (en) * | 1997-04-15 | 2002-08-13 | Pierce Chemical Company | Assay of peroxidase activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2324509B1 (es) | 2010-06-17 |
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