ES2324502T3 - Receptor de quimioquina c-c 3: ckr-3 o eos-l2. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ACIDOS NUCLEICOS AISLADOS Y/O RECOMBINANTES QUE CODIFICAN LA PROTEINA RECEPTORA DE MAMIFERO (E.G., HUMANA) DESIGNADA RECEPTOR 3 DE QUIMIOQUINA C-C (CKR 3) O EOS L-2, Y A LAS PROTEINAS O POLIPEPTIDOS A LOS QUE SE HACE REFERENCIA COMO RECEPTORES CKR-3 DE MAMIFERO AISLADOS Y RECOMBINANTES. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A CONSTRUCCIONES DE ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTES QUE COMPRENDEN UN ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA PROTEINA RECEPTORA DE LA PRESENTE INVENCION O UNA PARTE DE LA MISMA; A CELULAS HUESPED QUE INCLUYEN ESTAS CONSTRUCCIONES, UTILES PARA LA PRODUCCION DE RECEPTORES CKR-3 O POLIPEPTIDOS RECOMBINANTES; Y A ANTICUERPOS REACTIVOS CONTRA LOS RECEPTORES, QUE SON UTILES EN APLICACIONES DE INVESTIGACION Y DIAGNOSTICO. SE PROPORCIONAN ADEMAS METODOS DE USO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS, PROTEINAS, Y CELULAS HUESPED PARA IDENTIFICAR LIGANDOS, INHIBIDORES (E.G., ANTAGONISTAS) O PROMOTORES (AGONISTAS) DE LA FUNCION DEL RECEPTOR. LA ADMINISTRACION DE UN COMPUESTO QUEINHIBA O PROMUEVA LA FUNCION DEL RECEPTOR A UN INDIVIDUO NECESITADO DE TERAPIA PROPORCIONA UNA NUEVA APROXIMACION A LA MODULACION SELECTIVA DE LA FUNCION DE LOS LEUCOCITOS, QUE ES UTIL EN VARIAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS O AUTOINMUNES, O EN EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES. COMO UNO DE LOS PRINCIPALES RECEPTORES DE QUIMIOQUINAS PRESENTE EN LEUCOCITOS TALES COMO LOS EOSINOFILOS Y LINFOCITOS, EL RECEPTOR CONSTITUYE UN OBJETIVO CLAVE PARA EL DISEÑO Y LA BUSQUEDA DE FARMACOS.

Description

Receptor de quimioquina C-C 3: CKR-3 o Eos-L2.

En la presente solicitud, los receptores de quimioquina C-C se denominan CKR, que es la abreviatura común en el momento de la presentación. Las reivindicaciones se refieren ahora a CCR como la abreviatura de acuerdo con la nomenclatura como se presenta en la International Union of Pharmacology XXII: Nomenclature for Chemokine Receptors.

Antecedentes

Las quimioquinas, también denominadas integrinas, son miembros solubles de bajo peso molecular de la familia de las citoquinas que tienen una función quimioatrayente. Las quimioquinas son capaces de inducir selectivamente la quimiotaxis de los elementos formados de la sangre (distintos de glóbulos rojos), incluyendo leucocitos tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y linfocitos tales como células T, células B y leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos)). Además de estimular la quimiotaxis, pueden inducirse selectivamente otros cambios por quimioquinas en células sensibles incluyendo cambios en la morfología celular, aumentos transitorios en la concentración de calcio libre intracelular ([Ca^{2+}]_{i}), exocitosis de gránulos, regulación positiva de integrinas, formación de lípidos bioactivos (por ejemplo, leucotrienos) y estallido respiratorio asociado con la activación de leucocitos. Por lo tanto, las quimioquinas son desencadenantes tempranos de la respuesta inflamatoria, causando liberación de mediadores inflamatorios, quimiotaxis y extravasación a sitios de infección o inflamación.

Las quimioquinas caracterizadas hasta la fecha están relacionadas en su estructura primaria. Comparten cuatro cisteínas conservadas que forman enlaces disulfuro. La clonación de ADNc y la caracterización bioquímica de varias quimioquinas ha revelado que las proteínas tienen una secuencia líder de 20-25 aminoácidos que se escinde tras la secreción para dar una proteína madura de aproximadamente 92-99 aminoácidos. Basándose en el motivo conservado de cisteína, la familia se divide en dos ramas, denominadas las quimioquinas C-C (quimioquinas \beta) y las quimioquinas C-X-X (quimioquinas \alpha), en las que las dos primeras cisteínas conservadas están adyacentes o están separadas por un resto intermedio, respectivamente. Baggiolini, M. y C. A. Dahinden, Immunology Today, 15: 127-133 (1994)).

Las quimioquinas C-X-C incluyen varios quimioatrayentes que son potentes quimioatrayentes y activadores de neutrófilos, tales como interleuquina 8 (IL-8), PF4 y péptido activador de neutrófilos 2 (NAP-2). Las quimioquinas C-C incluyen moléculas tales como proteínas quimiotácticas de monocitos humanas 1-3 (MCP-1, MCP-2 y MCP-3), RANTES (Regulado por activación, expresado y secretado por células T normales) y las proteínas inflamatorias de macrófagos 1\alpha y 1\beta (MIP-1\alpha y MIP-1\beta) que se han caracterizado como quimioatrayentes y activadores de monocitos o linfocitos pero no parecen ser quimioatrayentes para neutrófilos. Por ejemplo, el RANTES recombinante es un quimioatrayente para monocitos, así como para células T de memoria in vitro (Schall, T. J. y col., Nature, 347: 669-671 (1990)). Más recientemente, se ha identificado una quimioquina denominada linfotactina con un solo par de cisteínas en la molécula que atrae linfocitos (Kelner, G. S., y col., Science, 266: 1395-1359 (1994)).

Las quimioquinas C-C son de gran interés debido a su papel potencial en la inflamación alérgica. Por ejemplo, la MCP-1 induce exocitosis de basófilos humanos, dando como resultado la liberación de altos niveles de mediadores inflamatorios, tales como histamina y leucotrieno C_{4}. De forma similar, existe gran interés en los receptores para las quimioquinas C-C, que desencadenan estos acontecimientos celulares en respuesta a la unión de quimioquinas. Se ha clonado recientemente un receptor para quimioquinas C-C y se describe que se une a MIP-1\alpha y RANTES. Por consiguiente, este receptor de MIP-1\alpha/RANTES se denominó receptor de quimioquina C-C 1 (CKR-1; Neote, K. y col., Cell, 72: 415-425 (1993); Horuk, R. y col., documento WO 94/11504, publicado el 26 de mayo de 1994; Gao, J. -I. y col., J. Exp. Med., 177: 1421-1427 (1993)). También se ha clonado un receptor de MCP-1 (Charo, I. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752 (1994)). Se describe que este receptor, denominado CKR-2, se une a MCP-1 con gran afinidad y a MCP-3 con una afinidad menor (Charo, I. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752-2756 (1994)). Se ha demostrado que CKR-2 existe en dos isoformas que son el resultado del uso de un sitio de corte y empalme alternativo en la isoforma A que produce una cola citoplasmática diferente. La isoforma B, que no se corta y empalma en esta región, ha demostrado ser un receptor funcional para MCP-1 y MCP-3 en ensayos de unión y de transducción de señales (Charo, I. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752 (1994); Myers, S. J., y col., J. Biol. Chem., 270: 5786-5792 (1995)). Más recientemente, se ha descrito un nuevo receptor denominado CKR-4; se describió que el ARNc de este receptor producía una corriente de cloruro activado por Ca^{2+} en respuesta a MCP-1, MIP-1\alpha y RANTES cuando se inyectaba en ovocitos de X. laevis (Power, C. A., y col., J. Biol. Chem., 270: 19495-19500 (1995)).

Se predice que el receptor de MCP-1 (CKR-2) y el receptor de quimioquina C-C 1 pertenecen a una superfamilia de receptores acoplados a proteína G con siete dominios transmembrana (Gerard C. y Gerard, N. P., Annu. Rev. Immunol., 12: 775-808 (1994); Gerard C. y Gerard N. P., Curr. Opin. Immunol., 6: 140-145 (1994)). Esta familia de receptores acoplados a proteína G (serpentina) comprende un gran grupo de proteínas integrales de membrana que contienen siete regiones transmembrana. Los ligandos de estos receptores incluyen un grupo diverso de moléculas, incluyendo moléculas de aminas biógenas pequeñas, tales como epinefrina y norepinefrina, péptidos tales como sustancia P y neuroquininas y proteínas de mayor tamaño, tales como quimioquinas. Los receptores están acoplados a proteínas G, que son proteínas reguladoras heterotriméricas capaces de unir GTP y de mediar la transducción de señales de receptores acoplados, por ejemplo, mediante la producción de mediadores intracelulares.

La clonación y secuenciación de dos ADNc de receptores de IL-8 revela que estas proteínas receptoras de C-X-C también comparten similitud de secuencia con proteínas receptoras acopladas a proteína G con siete dominios transmembrana (Murphy P. M. y H. L. Tiffany, Science, 253: 1280-1283 (1991); Murphy y col., documento WO 93/06299; Holmes, W. E. y col., Science, 253: 1278-1280 (1991)). Se han caracterizado receptores adicionales para proteínas quimiotácticas, tales como anafilatoxina C5a y tripéptido formilado bacteriano fMLP, mediante clonación y se ha descubierto que codifican proteínas receptoras que también comparten similitud de secuencia con estas proteínas con siete dominios transmembrana (Gerard, N. P. y C. Gerard, Nature, 349: 614-617 (1991); Boulay, F. y col., Biochemistry, 29: 11123-11133 (1990)). Aunque se han identificado y clonado varias otras proteínas con una similitud de secuencia significativa y una distribución tisular y de subpoblación de leucocitos similar a receptores de quimioquinas conocidos, aún no se han definido los ligandos para estos receptores. Por lo tanto, estas proteínas se denominan receptores huérfanos. El aislamiento y la caracterización de genes adicionales y los receptores codificados y la caracterización de los ligandos correspondientes es esencial para un entendimiento de la interacción de quimioquinas con sus células diana y los acontecimientos estimulados por esta interacción, incluyendo quimiotaxis y activación celular de
leucocitos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican una proteína receptora de mamíferos (por ejemplo, seres humanos) denominada receptor de quimioquina C-C 3 (CKR-3). La invención se refiere además a construcciones de ácido nucleico recombinantes, tales como plásmidos o vectores retrovirales, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína receptora de la presente invención o porciones de dicho receptor. Los ácidos nucleicos y construcciones pueden usarse para producir proteínas receptoras recombinantes. En otra realización, el ácido nucleico codifica un ácido nucleico antisentido que puede hibridar con un segundo ácido nucleico que codifica un receptor de la presente invención y que, cuando se introduce en células, puede inhibir la expresión del receptor.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a proteínas o polipéptidos, denominados en este documento receptores CKR-3 de mamíferos recombinantes aislados. Los receptores o polipéptidos CKR-3 recombinantes pueden producirse en células huésped como se describe en este documento. En una realización, una proteína receptora se caracteriza por la unión de alta afinidad de una o más quimioquinas, tales como eotaxina, RANTES y/o MCP-3 y/o por la capacidad para estimular una (una o más) respuestas celulares (por ejemplo, quimiotaxis, exocitosis, liberación de uno o más mediadores inflamatorios).

Pueden producirse anticuerpos reactivos con los receptores usando los receptores o porciones de los mismos como inmunógeno, o células que expresen proteína o polipéptido receptor, por ejemplo. Dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación, incluyendo la purificación y estudio de las proteínas receptoras, la identificación de células que expresen receptor en superficie y la separación y el recuento de células.

También se incluyen en la presente invención procedimientos para identificar ligandos del receptor, así como inhibidores (por ejemplo, antagonistas) o promotores (agonistas) de la función del receptor. En una realización, se usan células huésped adecuadas que se han modificado para expresar una proteína o polipéptido receptor codificado por un ácido nucleico introducido en dichas células, en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de ligandos, inhibidores o promotores de la función del receptor. Dichas células también son útiles en la evaluación de la función de la proteína o polipéptido receptor expresado.

De acuerdo con la presente invención, pueden identificarse ligandos, inhibidores y promotores de la función del receptor y evaluarse adicionalmente para determinar su efecto terapéutico. Pueden usarse ligandos y promotores para estimular la función normal del receptor cuando sea necesario, mientras que pueden usarse inhibidores de la función del receptor para reducir o impedir la actividad del receptor. Por lo tanto, la presente invención proporciona una nueva estrategia de terapia antiinflamatoria útil en una diversidad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, que comprende administrar un inhibidor de la función del receptor a un individuo (por ejemplo, un mamífero). Por el contrario, la estimulación de la función del receptor por administración de un ligando o promotor a un individuo proporciona un nuevo enfoque para la estimulación selectiva de la función de leucocitos, que es útil, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones parasitarias.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-1C ilustra la secuencia de nucleótidos determinada a partir de un clon genómico que codifica una proteína CKR-3 humana, también denominada receptor Eos L2 (SEC ID Nº: 1), y la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína codificada por la fase de lectura abierta (SEC ID Nº: 2).

La Figura 2A-2B ilustra la secuencia de nucleótidos determinada a partir de los ADNc que codifican un receptor CKR-3 humano (SEC ID Nº: 3) y la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína codificada por la fase de lectura abierta (SEC ID Nº: 4).

La Figura 3 es una ilustración de un tipo de ensayo de quimiotaxis transendotelial. Se coloca un separador de cultivo en un recipiente, tal como un pocillo de una placa de 24 pocillos, generando una primera y una segunda cámara dentro del pocillo. Se cultivan células endoteliales ECV304 en una monocapa sobre la membrana de policarbonato en el lado interior del separador. Se introducen las células que se van a evaluar por su respuesta a una sustancia (por ejemplo, una quimioquina) en la cámara superior y la sustancia se introduce en la cámara inferior. Puede evaluarse la quimiotaxis por detección de las células que migran a través de la capa endotelial hacia la cámara inferior, por retirada del separador y detección o recuento de las células mediante un procedimiento adecuado. Por ejemplo, pueden recogerse las células de la cámara inferior y evaluarse mediante citometría de flujo (por ejemplo, análisis de FACS, dispersión de
luz).

La Figura 4 es un histograma que ilustra la quimiotaxis de eosinófilos humanos en respuesta a diversas quimioquinas. Los eosinófilos humanos se purificaron usando un protocolo convencional y se evaluaron por microscopía para determinar su respuesta a diversas quimioquinas en un ensayo de quimiotaxis transendotelial de 24 pocillos (células por campo de alta energía (HPF)).

Las Figuras 5A-5B son histogramas que ilustran la respuesta de células HL-60 (Figura 5A) y células HL-60 diferenciadas con butirato (Figura 5B) a diversas quimioquinas. Se realizaron ensayos de quimiotaxis usando separadores recubiertos con células endoteliales y con una duración de 1,5 horas. Los resultados son representativos de 10 experimentos diferentes.

La Figura 6 es una ilustración de un análisis de FACS de diversos clones de células pre-B L1-2 transfectadas con Eos L2. Se tiñeron células de más de 200 clones con Mab anti-FLAG M2 seguido de anti-Ig de ratón-FITC. (Eje Y, número de células; eje X, fluorescencia). En el control negativo (PAUL 001), se tiñeron células transfectadas con un anticuerpo irrelevante.

La Figura 7 es un histograma que ilustra la unión de RANTES y MIP-1\alpha a eosinófilos humanos. Se incubaron eosinófilos humanos normales purificados con MIP-1\alpha o RANTES marcado con ^{125}I ("caliente") 0,1 nM en presencia o ausencia de diversas quimioquinas frías (MIP-1\alpha, RANTES, IL-8, MCP-1, MCP-3) a 250 nM.

La Figura 8 es una gráfica que ilustra la inhibición de la unión de RANTES marcado con ^{125}I a eosinófilos humanos por diversas quimioquinas frías (RANTES, MIP-1\alpha, MCP-1 y MCP-3). Se incubaron eosinófilos humanos con RANTES radiomarcado 0,1 nM y las concentraciones indicadas de quimioquinas frías. Los datos representados son las medias y las desviaciones típicas de duplicados para cada muestra.

La Figura 9 es un histograma que ilustra la unión de MIP-1\alpha o RANTES radiomarcado ("caliente") 0,1 nM a células HL-60 diferenciadas con ácido butírico en ausencia o presencia de quimioquinas frías (250 nM).

La Figura 10 es un histograma que ilustra la unión de RANTES marcado con ^{125}I ("caliente") 0,1 nM o MCP-3 marcada con ^{125}I ("caliente") 0,1 nM a células SF9 infectadas con Eos L2 (cpm, recuentos por minuto). (De izquierda a derecha: RANTES caliente solamente; Rantes caliente + Rantes frío; MCP-3 caliente solamente; MCP-3 caliente + MCP-3 fría).

Las Figuras 11A y 11B son gráficas que ilustran la unión de MCP-3 a células HL-60 diferenciadas con butirato. En la Figura 11A, la unión de MCP-3 radiomarcada 0,1 nM se evaluó en presencia de diversas concentraciones de MCP-3 fría. La Figura 11B es una representación de Scatchard calculada a partir de los datos de la Figura 11A.

Las Figuras 12A-12B son una ilustración de los resultados de un análisis de FACS de eosinófilos humanos (Figura 12A) y linfocitos (Figura 12B) para determinar la expresión de Eos L2 usando el anticuerpo monoclonal (MAb) LS26-5H12 como primer anticuerpo y anti-Ig de ratón-FITC como segundo anticuerpo. "Neg" indica un control negativo en el que se usó un anticuerpo inespecífico como primer anticuerpo.

Las Figuras 13A-13B son gráficas que ilustran la expresión de CKR-3 en leucocitos, como se determinó usando MAb LS26-5H12 y citometría de flujo. Se tiñeron subconjuntos de leucocitos con MAb anti-CKR-3 LS26-5H12 (líneas continuas) o un anticuerpo de control del mismo isotipo de IgG_{1} (MOPC-21) (perfil sombreado). Figura 13A, eosinófilos; Figura 13B, células T; Figura 13C, monocitos; Figura 13D, neutrófilos. Se excluyeron las células muertas basándose en la tinción con yoduro de propidio.

Las Figuras 14A-14C son gráficas que ilustran la tinción de superficie celular de células L1.2 transfectadas de forma transitoria con un receptor CKR-3 (Figura 14A), células de control L1.2 con transfección simulada (Figura 14B) o la línea celular E5 (una transfectante de L1.2 con CKR-3 estable) (Figura 14C) con un anticuerpo monoclonal anti-CKR-3 (LS26-5H12, línea continua). También se muestra la tinción de fondo con anticuerpo monoclonal de control MOPC-21 (perfil sombreado).

Las Figuras 15A-15D son gráficas que ilustran los resultados de unión de ligando competitiva de eotaxina humana radiomarcada a la línea celular E5 (una línea celular L1-2 estable transfectada con un receptor CKR-3; Figura 15A) o a eosinófilos humanos (Figura 15B). Las células se incubaron con eotaxina marcada con ^{125}I 0,6 nM y diversas concentraciones de eotaxina sin marcar (O), RANTES (\Delta) o MCP-3 (\Box). Después de 60 minutos a temperatura ambiente, los sedimentos celulares se lavaron y se realizó el recuento. Se calcularon las representaciones de Scatchard de la competición con eotaxina sin marcar a partir de los datos (Figura 15C, línea celular E5; Figura 15D, eosinófilos).

La Figura 16 es un histograma que ilustra la inhibición por diversas quimioquinas de la unión de eotaxina humana a la línea celular E5. Se incubaron células E5 (transfectantes L1-2/CKR-3 estables) con eotaxina radiomarcada 0,6 nM y quimioquinas sin marcar 250 nM o sin competidor, según se indica.

Las Figuras 17A-17C son histogramas que ilustran la quimiotaxis de células L1.2 y transfectantes de L1.2 con receptor. Se colocaron 1 x 10^{6} células de la línea celular E5 (transfectantes L1-2/CKR-3 estables) (Figura 17A), la línea celular L1.2 parental (Figura 17B) o una línea transfectante de L1.2 con receptor IL-8 RB LSLW-2 (Figura 17C) en la cámara superior y se colocaron quimioquinas en la cámara inferior a las concentraciones especificadas. Se permitió la migración durante 4 horas y se contaron las células que migraban a la cámara inferior. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y los resultados son representativos de al menos tres experimentos separados. Se enumeran las quimioquinas a lo largo del eje x, el número de células migradas a lo largo del eje y la concentración de quimioquina a lo largo del eje z.

Figuras 18A-18B son gráficas que ilustran la respuesta quimiotáctica de eosinófilos de dos individuos diferentes. La respuesta se parece a la de los transfectantes de L1.2 con CKR-3. Se observó una variación entre donantes de las respuestas quimiotácticas de eosinófilos a eotaxina, RANTES, MCP-3 y MIP-1\alpha. Se purificaron eosinófilos de la sangre y se evaluaron para determinar su respuesta quimiotáctica a diversas concentraciones de quimioquinas. Los valores son de un experimento representativo de al menos 4 realizados, usando los mismos dos donantes de sangre.

La Figura 19 es una gráfica que ilustra la unión de RANTES marcado con ^{125}I a membranas de una línea celular estable (A31-293-20) obtenida por transfección de células 293 con el clon de ADNc A31 (cuadrado con un punto central) en comparación con la unión a membranas de células 293 sin transfectar (círculos rellenos).

La Figura 20 es un histograma que ilustra la unión de MCP-3 marcada con ^{125}I a membranas de una línea celular estable (A31-293-20) obtenida por transfección de células 293 con el clon de ADNc A31 en comparación con la unión a membranas de células 293 sin transfectar. La unión de MCP-3 marcada a membranas de células transfectadas (A31-20) o sin transfectar (UT293) se determinó en ausencia de MCP-3 fría (0 nM) o en presencia de MCP-3 fría (100 nM).

La Figura 21 es un histograma que ilustra la especificidad de unión que se evaluó por determinación de la cantidad de MCP-3 marcada con ^{125}I y unida que podía desplazarse por MCP-3 fría de membranas de células transfectadas (A31-20) o sin transfectar (UT293).

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Descripción detallada de la invención

Como se describe en el presente documento, se han aislado ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor humano denominado Eos L2 o receptor de quimioquina C-C 3 (CKR-3). Se han caracterizado clones tanto de genómico como de ADNc humano. El clon de ADNc se aisló de una genoteca de ADNc de eosinófilos construida a partir de eosinófilos obtenidos de un paciente con síndrome hipereosinófilo. El análisis de secuencia de los clones reveló un gen que contenía una fase de lectura abierta de 1065 nucleótidos que codifica una proteína predicha de 355 aminoácidos (Figuras 1A-1C y 2A-2B; SEC ID Nº: 2 y 4) que comparte similitud de secuencia de aminoácidos con otros receptores de quimioquina C-C que se piensa que son receptores acoplados a proteína G y que tienen una estructura similar de siete regiones transmembrana.

Las proteínas predichas codificadas por clones de genómico y ADNc de CKR-3 contienen cuatro restos de cisteína, uno en cada uno de los dominios extracelulares en las posiciones 24, 106, 183 y 273 (SEC ID Nº: 2 y 4). Las cisteínas en estas posiciones están conservadas en todos los receptores de quimioquinas, incluyendo CKR-1, CKR-2, CKR-4, IL8-RA e IL8-RB. Además, este receptor contiene un motivo aminoacídico, DRYLAIVHA (restos 130-138) (SEC ID Nº: 2 y 4) que también está altamente conservado entre receptores de quimioquinas C-X-C y C-C y se predice que es intracelular. Existen dos sitios de consenso para la fosforilación por proteína quinasa C (Kishimoto, A., y col., J. Biol. Chem., 260: 12492-12499 (1985); Woodgett, J. R., Eur. J. Biochem., 161: 177-184 (1996)), uno en el tercer bucle intracelular en la posición AA 231 y uno en la cola citoplasmática en la posición AA 333. Además, existen ocho restos de serina/treonina en la cola citoplasmática que pueden servir como sitios de fosforilación para quinasas de receptores acoplados a proteína G, tales como las aisladas de neutrófilos (Haribabu, B. y R. Snyderman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9398 (1993)) u otros miembros de la familia relacionados (Benovic, J. L. y Gomez J., J. Biol. Chem., 268: 19521-19527 (1993); Kunapuli, P. y Benovic, J. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5588-5594 (1993)). Las colas citoplasmáticas ricas en serina/treonina también son una característica común de receptores de quimioquinas. A diferencia de los receptores CKR-1, CKR-2, CKR-4, IL-8RA e IL-8RB, CKR-3 no contiene sitios para glicosilación ligada a N en ningún dominio extracelular. La proteína receptora CKR-3 es diferente del receptor de quimioquina C-C 1, también denominado el receptor de MIP-1\alpha/RANTES.

Las secuencias de ácido nucleico obtenidas de genotecas de genómico y ADNc eran colineales con las siguientes excepciones. Cadena arriba del codón de inicio las dos secuencias divergen (en posición 78 de la Figura 2A). El clon genómico parece tener un intrón que separa el promotor y la mayor parte de la región no traducida 5' de la región codificante. Esta organización genómica es similar a la que se encuentra en otros receptores quimioatrayentes con siete dominios transmembrana (Gerard, N. P., y col., Biochemistry, 32: 1243-1250 (1993); Murphy, P. M., y col., Gene, 133: 285-290 (1993)) incluyendo IL-8 RA y RB (Ahuja, S. K., y col., J. Biol. Chem., 269: 26381-89 (1994); Sprenger, H., y col., J. Biol. Chem., 269: 11065-11072 (1994); Sprenger, H., y col., J. Immunol., 153: 2524-2532 (1994)) y CKR-1 (Gao, J. L., y col., J. Exp. Med., 177: 1421-1427 (1993)). Además, el examen de la secuencia genómica alrededor del punto de divergencia revela una secuencia canónica aceptora de corte y empalme.

La información inicial de secuencia reveló dos regiones en las que la secuencia de ADNc parece estar mutada sin desplazamiento de la fase de lectura como resultado de una inserción de una base seguida de la deleción de una base, o de la deleción de una base seguida de la inserción de una base. Estas modificaciones daban como resultado cuatro diferencias de aminoácidos contiguos en las proteínas predichas en las posiciones 263-266 y 276-279, respectivamente. Otras diferencias conducían a diferencias de aminoácidos en las posiciones 182, 196, 197 y 315 de las proteínas predichas. La secuencia de nucleótidos que se presenta en la SEC ID Nº: 5 es una secuencia consenso, que incluye regiones que se secuenciaron en ambos clones, y que se construyó por alineamiento sencillo (base por base) de las secuencias de ácido nucleico iniciales. La SEC ID Nº: 6, en la que las diferencias de aminoácidos iniciales entre los clones de ADNc y genómicos se indican mediante Xaa, representa la proteína predicha de la SEC ID Nº: 5. Sin embargo, un análisis de secuencia adicional reveló que las secuencias de nucleótidos de las fases de lectura abierta parecen diferir solamente en una posición que se corresponde con los nucleótidos 918-919 de la Figura 2B. El clon genómico tiene una CG en esta posición, mientras que el clon de ADNc tiene una GC en esta posición. Por lo tanto, el clon de genómico codifica treonina (ACG) en la posición 276 y el clon de ADNc codifica serina (AGC) en la posición 276. La diferencia puede deberse a una ambigüedad de secuenciación o a un error introducido en el ADNc durante la transcripción inversa. Como alternativa, la sustitución conservativa (serina/treonina) podría deberse a un polimorfismo entre individuos. Otra alternativa es que las diferencias se deban a una mutación del gen del receptor en los eosinófilos del paciente del que se obtuvo el ARN para la construcción de la genoteca de ADNc.

Se produjeron anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para un receptor de quimioquina C-C 3 de origen humano usando un péptido sintético N-terminal del receptor. El análisis de FACS (separación de células activadas por fluorescencia) usando uno de los anticuerpos monoclonales reveló una expresión significativa de este receptor en eosinófilos humanos, pero no en leucocitos, incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos, células T, blastocitos T (producidos por activación con MAb de CD3) (Figuras 13A-13B). Este patrón de expresión se confirmó mediante análisis de Northern con ARN de subconjuntos de leucocitos altamente purificados. Sin embargo, en algunos experimentos, se detectó ARNm de CKR-3 o receptor en linfocitos T; por consiguiente, es posible que se exprese CKR-3 en un subconjunto de linfocitos T (Ejemplo 5).

También se expresaron clones de genómico y ADNc en una diversidad de sistemas. Se usó un anticuerpo para detectar la expresión de receptor a partir del clon de genómico en células de mamífero transfectadas y células de insecto transfectadas con baculovirus. Se construyeron transfectantes estables de células de mamífero que expresaban CKR-3 y se demostró que el receptor codificado se unía a eotaxina radiomarcada específicamente y con gran afinidad, comparable a la afinidad de unión observada con eosinófilos. Los estudios con células de mamífero transfectadas indicaban que el receptor también se une a RANTES y MCP-3 específicamente y con gran afinidad pero no a otras quimioquinas CC o CXC ensayadas. De acuerdo con los datos de unión, como se muestra en este documento, los transfectantes con receptor generados en una línea de linfoma de células B murino migraban en ensayos de quimiotaxis en respuesta a eotaxina, RANTES y MCP-3, pero no a ninguna otra quimioquina ensayada. Cuando se expresaba en varios sistemas heterólogos, el receptor humano no se unía significativamente a MIP-1\alpha en las condiciones usadas. Además, los ensayos de quimiotaxis y unión a ligando usando eosinófilos y una línea celular tipo eosinófilo indican que RANTES y MCP-3 se unen a eosinófilos mediante un receptor que es diferente del receptor de quimioquina C-C 1, el receptor de MIP-1\alpha/RANTES.

El papel de MIP-1\alpha como quimioatrayente de eosinófilos ha sido polémico. Algunos investigadores detectan respuestas quimiotácticas (Rot, A., y col., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1995)) mientras que otros no (Figura 4, Ejemplo 1; Ebisawa, M., y col., J. Immunol., 153: 2153-2160 (1994); y Ponath, P. D., y col., J. Clin. Invest., (1996) (en prensa)). Curiosamente, la MIP-1\alpha es un quimioatrayente de eosinófilos en el ratón y parece estar mediada por el homólogo murino de CKR-3, que también se une y señaliza con eotaxina murina (Post, T. W., y col., J. Immunol., 155: 5299-5305 (1995)).

Usando las proteínas y anticuerpos de la presente invención, pueden identificarse ligandos adicionales, así como tipos celulares adicionales (por ejemplo, leucocitos tales como basófilos) que expresen receptor CKR-3. La capacidad de otras quimioquinas para unirse a receptores CKR-3 de mamíferos puede evaluarse de acuerdo con la presente invención.

La clonación y la caracterización de clones que codifican un nuevo receptor y el aislamiento y la caracterización del nuevo receptor CKR-3, que de forma demostrable se une a y media la quimiotaxis en respuesta a quimioquinas tales como eotaxina, RANTES y MCP-3, sugieren que este receptor es un miembro de una familia de receptores acoplados a proteína G con siete dominios transmembrana que están implicados en la quimiotaxis y activación selectiva de leucocitos en respuesta a quimioquinas. El receptor CKR-3 y sus homólogos de mamíferos son diferentes del receptor de MIP-1\alpha/RANTES y del receptor de MCP-1 (es decir, son receptores distintos del receptor de quimioquina C-C 1 (CKR-1) y del receptor de MCP-1 (CKR-2) y sus homólogos).

Debido al papel de los receptores de quimioquinas en la inducción selectiva de la quimiotaxis de leucocitos y la activación de leucocitos en respuesta a quimioatrayentes, los receptores de quimioquinas desempeñan un papel fundamental en la migración de leucocitos y, particularmente, en la migración asociada con inflamación. Las quimioquinas producidas en sitios de inflamación e infección reclutan específicamente subtipos de leucocitos seleccionados desde la circulación hacia el sitio de inflamación en los tejidos. Posterior a la unión de quimioquinas a un receptor de quimioquinas en leucocitos, se produce la activación de integrinas y los leucocitos se adhieren firmemente a la pared celular endotelial mediante integrinas de leucocitos y moléculas de adhesión de células endoteliales. La forma de los leucocitos se aplana y migran a través del endotelio hacia sitios de inflamación en los tejidos. La especificidad de un leucocito por un tejido o sitio inflamatorio se determina, en muchos casos, a nivel de la interacción quimioquina-receptor en lugar de a nivel de la interacción de adhesión entre integrina y moléculas de adhesión celulares.

El RANTES y la MCP-3 están entre las citoquinas quimiotácticas más potentes para eosinófilos y basófilos. Además, se ha descrito que RANTES es un quimioatrayente para células T de memoria, una subpoblación de linfocitos T. Como se muestra en este documento, RANTES y MCP-3 pueden inducir la quimiotaxis de eosinófilos y células similares a eosinófilos. Las proteínas receptoras CKR-3 descritas en este documento también se unen a RANTES y MCP-3 con gran afinidad.

Como se muestra adicionalmente en este documento, CKR-3 se une a eotaxina específicamente y con gran afinidad (comparable a la afinidad de unión observada con eosinófilos) y el receptor CKR-3 está altamente limitado en su expresión. Aunque se han identificado varios quimioatrayentes para eosinófilos, tales como RANTES y MCP-3 (Baggiolini, M. y Dahinden, C. A., Immunol. Today, 15: 127-33 (1994); Dahinden, C. A., y col., J. Exp. Med., 179: 751-756 (1994); Kameyoshi, Y, y col., J. Exp. Med., 176: 587-592 (1992); Rot, A., y col., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1995)), así como PAF, C5a e IL-16 (Wardlaw, A. J., y col., J. Clin. Invest., 78: 1701-1706 (1986), Gerard, N. P., y col., J. Biol. Chem., 264: 1760-1765 (1989); Rand, T. H., y col., J. Exp. Med., 173: 1521-1528 (1991)), estos quimioatrayentes también inducen la migración de otros tipos celulares de leucocitos. Por otro lado, la quimioquina eotaxina, un potente quimioatrayente de eosinófilos identificado originariamente en cobayas y, posteriormente, en ratones y seres humanos, es selectivamente quimiotáctico para eosinófilos (Jose, P. J., y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 788-794 (1994); Jose, P. J., y col., J. Exp. Med., 179: 881-887 (1994); Rothenburg, M. E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 8960-8964 (1995); Ponath, P. D., y col., J. Clin. Invest., (1996) (en prensa)). Además, la eotaxina se une a y señaliza mediante CKR-3 con alto grado de fidelidad, al contrario que quimioquinas tales como MCP-3, que se unen a CKR-1 y CKR-2 (Ben-Baruch, A., y col., J. Biol. Chem., 270: 22123-22128 (1995)) además de a CKR-3, o MIP-1\alpha, que se une a CKR-1 y CKR-4 (Neote, K., y col., Cell, 72: 415-425 (1993); Power, C. A., y col., J. Biol. Chem., 270: 19495-19500 (1995)). La expresión limitada de CKR-3 en eosinófilos y la fidelidad de la unión de eotaxina a CKR-3 proporciona un mecanismo potencial para el reclutamiento y la migración selectiva de eosinófilos dentro de tejidos. A este respecto, la producción de eotaxina dentro de un tejido puede conducir al reclutamiento selectivo de eosinófilos; una inyección de eotaxina en la piel de monos Rhesus conduce a la migración selectiva de eosinófilos. Además, se demostró que la eotaxina recluta eosinófilos in vivo a una dosis 10 veces inferior que el RANTES, similar a la quimiotaxis in vitro de transfectantes con CKR-3 (Ponath, P. D., y col., J. Clin. Invest., (1996) (en prensa)).

La modulación de la función del receptor CKR-3 de mamíferos de acuerdo con la presente invención, a través de la inhibición o de la estimulación de la función del receptor, tal como la unión, señalización o estimulación de una respuesta celular, proporciona un modo eficaz y selectivo de inhibir o promover una acción inflamatoria mediada por leucocitos, particularmente la de eosinófilos y/o células T. Pueden usarse ligandos, inhibidores y promotores de la función del receptor CKR-3, tales como los identificados como se describe en este documento, para modular la función de leucocitos con fines terapéuticos.

Los eosinófilos no expresan el receptor de MIP-1\alpha y no expresan cantidades significativas del receptor de MCP-1. Además, como se ha indicado anteriormente, la eotaxina y el RANTES son algunos de los quimioatrayentes más potentes para eosinófilos y la eotaxina y el RANTES se unen específicamente y con gran afinidad al receptor CKR-3. Como un receptor de quimioquinas de eosinófilos y linfocitos principal, el receptor CKR-3 es una diana importante para interferir con o promover la función de eosinófilos y/o linfocitos T. Los compuestos que inhiben o promueven la función del receptor CKR-3, tales como ligandos, inhibidores y promotores identificados de acuerdo con la presente invención, son particularmente útiles para modular la función de eosinófilos y/o células T con fines terapéuticos.

Ácidos nucleicos, construcciones y vectores

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (incluyendo, por ejemplo, esencialmente puros) que tienen secuencias que codifican una proteína receptora de mamíferos (por ejemplo, seres humanos) denominada Eos L2 o receptor de quimioquina C-C 3 (CKR-3) o una porción de dicho receptor. En una realización, el ácido nucleico o porción del mismo codifica una proteína o polipéptido que tiene al menos una función característica de un receptor de quimioquina C-C de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 de mamífero), tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [ca^{2+}]_{i}), y/o estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos, activación de integrinas). La presente invención también se refiere más específicamente a ácido nucleicos aislados y/o recombinantes o una porción de los mismos que comprende secuencias que codifican un receptor CKR-3 de mamífero o una porción del mismo.

La invención se refiere además a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que se caracterizan por (1) su capacidad para hibridar con: (a) un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 5, (b) la complementaria de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5, (c) una porción de la anterior que comprende la región codificante (nucleótidos 181-1245 de la SEC ID Nº: 1, nucleótidos 92-1156 de la SEC ID Nº: 3 o nucleótidos 15-1079 de la SEC ID Nº: 5) o el homólogo de ARN de una cualquiera de las anteriores, en las que U sustituye a T; o (2) por su capacidad para codificar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6 o equivalentes funcionales de las mismas (es decir, un polipéptido que tiene actividad de unión a ligando por uno o más ligandos naturales o fisiológicos del receptor y/o una función estimuladora sensible a la unión a ligando, de modo que puede estimular una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos); o (3) por ambas características.

En una realización, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos entre la SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 y equivalentes funcionales de las mismas es de al menos aproximadamente el 70% (\geq70%). En una realización preferida, los equivalentes funcionales de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 comparten una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80% con las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6, respectivamente. Más preferiblemente, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos entre las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 y equivalentes funcionales de las mismas es de al menos aproximadamente el 90% y, aún más preferiblemente, de al menos aproximadamente el 95%. Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que cumplen estos criterios comprenden ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a secuencias de receptores CKR-3 de mamíferos de origen natural y porciones de los mismos, o variantes de las secuencias de origen natural. Dichas variantes incluyen mutantes que se diferencian por la adición, deleción o sustitución de uno o más restos, ácidos nucleicos modificados en los que uno o más restos están modificados (por ejemplo, análogos de ADN o ARN) y mutantes que comprenden uno o más restos modificados.

Dichos ácidos nucleicos pueden detectarse y aislarse por hibridación en condiciones de alta rigurosidad o condiciones de rigurosidad moderada, por ejemplo. Las "condiciones de alta rigurosidad" y "condiciones de rigurosidad moderada" para hibridaciones de ácido nucleico se explica en las páginas 2.10.1-2.10.16 (véanse particularmente las 2.10.8-11) y las páginas 6.3.1-6 en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. y col., eds., Vol. 1, Supl. 26, 1991) (véase también el Ejemplo 2). Factores tales como la longitud de la sonda, la composición de bases, el porcentaje de emparejamiento erróneo entre las secuencias que se están hibridando, la temperatura y la fuerza iónica influyen en la estabilidad de los híbridos de ácido nucleico. Por lo tanto, pueden determinarse empíricamente condiciones de rigurosidad alta o moderada dependiendo en parte de las características del ADN conocido con el que se están comparando otros ácidos nucleicos desconocidos para determinar su homología.

Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que se caracterizan por su capacidad para hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 o las complementarias de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 (por ejemplo, en condiciones de rigurosidad alta o moderada) pueden codificar además una proteína o polipéptido que tenga al menos una función característica de un receptor de quimioquina C-C de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 de mamífero), tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]_{i}) y/o estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos, activación de integrinas).

La función de señalización de una proteína o polipéptido codificado por un ácido nucleico que hibrida puede detectarse mediante ensayos enzimáticos para actividad de proteína G sensible a la unión a receptor (por ejemplo, intercambio de GTP por GDP en la subunidad \alpha de la proteína G usando fracciones de membrana). El acoplamiento a proteína G puede evaluarse adicionalmente, por ejemplo, usando ensayos en los que la estimulación por proteína G se bloquea mediante el tratamiento o pretratamiento de las células o de una fracción celular adecuada (por ejemplo, membranas) con inhibidores específicos de proteínas G, tales como toxina de Bordetella pertussis (Bischoff, S. C. y col., Eur. J. Immunol. 23: 761-767 (1993); Sozzani, S. y col., J. Immunol. 147: 2215-2221 (1991)).

La función estimuladora de un proteína o polipéptido codificado por un ácido nucleico que hibrida puede detectarse mediante ensayos convencionales para quimiotaxis o liberación de mediadores, usando células que expresen la proteína o polipéptido (por ejemplo, ensayos que controlen la quimiotaxis, exocitosis (por ejemplo, de enzimas tales como peroxidasa del eosinófilo, \beta-glucuronidasa) o liberación de mediadores en respuesta a un ligando (por ejemplo, una quimioquina tal como eotaxina, RANTES o MCP-3) o un promotor.

La función de unión de una proteína o polipéptido codificado por un ácido nucleico que hibrida puede detectarse en ensayos de unión o de inhibición de la unión usando fracciones de membrana que contienen receptor o células que expresan el receptor, por ejemplo, (véase, por ejemplo el Ejemplo 9; Van Riper y col., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Sledziewski y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.284.746 (8 de febrero de 1994)). Por lo tanto, puede evaluarse la capacidad de la proteína o polipéptido codificado para unirse a un ligando, tal como eotaxina, RANTES o MCP-3, un inhibidor y/o promotor. También pueden evaluarse funciones características de un receptor CKR-3 de mamífero mediante otros procedimientos adecuados (véase a continuación).

Estos procedimientos, en solitario o en combinación con otros procedimientos adecuados también pueden usarse en procedimientos para la identificación y/o aislamiento de ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6 o equivalentes funcionales de las mismas y que tengan una actividad detectada por el ensayo. También pueden identificarse y aislarse de esta forma porciones de los ácidos nucleicos aislados que codifiquen porciones polipeptídicas de la SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 que tengan una determinada función.

Pueden usarse ácidos nucleicos de la presente invención en la producción de proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, un ácido nucleico, que contiene toda o parte de la secuencia codificante para un receptor CKR-3 de mamífero, o ADN que hibrida con la secuencia SEC ID Nº: 1, 3 ó 5, o la complementaria de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5, puede incorporarse en diversas construcciones y vectores generados para la manipulación adicional de secuencias o para la producción del polipéptido codificado en células huésped adecuadas.

Los ácidos nucleicos denominados en este documento como "aislados" son ácidos nucleicos separados de los ácidos nucleicos del ADN genómico o ARN celular de su fuente de origen (por ejemplo, como existe en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos tales como una genoteca) y pueden haberse sometido a un procesamiento adicional. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen ácidos nucleicos obtenidos por procedimientos descritos en este documento, procedimientos similares y otros procedimientos adecuados, incluyendo ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de procedimientos biológicos y químicos, y ácidos nucleicos recombinantes que estén aislados. Los ácidos nucleicos denominados en este documento como "recombinantes" son ácidos nucleicos que se han producido mediante metodología de ADN recombinante, incluyendo los ácidos nucleicos que se generan por procedimientos que dependen de un procedimiento de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o clonación en un vector usando enzimas de restricción. Los ácidos nucleicos "recombinantes" también son los que son el resultado de acontecimientos de recombinación que se producen por los mecanismos naturales de las células, pero se seleccionan después de la introducción en las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir y hacer probable un acontecimiento de recombinación deseado.

Construcciones antisentido

En otra realización, el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido que es complementario, en su totalidad o en parte, a una molécula diana que comprende una cadena sentido y puede hibridar con la molécula diana. La diana puede ser ADN o su homólogo de ARN (es decir, en el que los restos T del ADN son restos U en el homólogo de ARN). Cuando se introduce en una célula usando procedimientos conocidos en la técnica u otros procedimientos adecuados, el ácido nucleico antisentido puede inhibir la expresión del gen codificado por la cadena sentido. Pueden producirse ácidos nucleicos antisentido mediante técnicas convencionales.

En una realización, el ácido nucleico antisentido es totalmente o parcialmente complementario a y puede hibridar con un ácido nucleico diana, donde el ácido nucleico diana puede hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia de la complementaria de la SEC ID Nº: 1, 3 ó 5. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido puede ser complementario a un ácido nucleico diana que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma suficiente para permitir la hibridación. En otra realización, el ácido nucleico antisentido es totalmente o parcialmente complementario a y puede hibridar con un ácido nucleico diana que codifica un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, receptor Eos L2 humano).

Los ácidos nucleicos antisentido son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo aplicaciones de investigación y terapéuticas. Por ejemplo, puede introducirse una construcción que comprende un ácido nucleico antisentido en una célula adecuada para inhibir la expresión de receptores. Dicha célula proporciona una célula de control valiosa, por ejemplo, en la evaluación de la especificidad de la interacción receptor-ligando con la célula parental u otros tipos celulares relacionados. En otro aspecto, dicha construcción se introduce en algunas o todas las células de un mamífero. El ácido nucleico antisentido inhibe la expresión de receptores y pueden inhibirse procesos inflamatorios mediados por receptores CKR-3 en las células que contienen la construcción. Por lo tanto, una enfermedad o afección inflamatoria puede tratarse usando un ácido nucleico antisentido de la presente invención. Los animales de laboratorio adecuados que comprenden una construcción antisentido también pueden proporcionar modelos útiles para deficiencias de la función de leucocitos y deficiencia de eosinófilos en particular, y proporcionar información adicional con respecto a la función del receptor CKR-3. Dichos animales pueden proporcionar modelos valiosos de enfermedad infecciosa, útiles para dilucidar el papel de leucocitos, tales como eosinófilos y/o linfocitos T en las defensas del huésped.

Ácido nucleicos de mamíferos

Debido a que los avances en el entendimiento y el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes humanas y de infecciones parasitarias sería tremendamente beneficioso, el CKR-3 humano fue la especie seleccionada para la mayor parte del trabajo experimental descrito en este documento. Sin embargo, los enfoques descritos para aislar y manipular el genómico y los ADNc de CKR-3 humano (Eos L2), para construir vectores y cepas huésped, y para producir y usar los receptores o fragmentos de los mismos, pueden aplicarse a otras especies de mamíferos incluyendo, pero sin limitación, especies de primates (por ejemplo, un primate distinto de un ser humano, tal como un mono (por ejemplo, mono Cynomolgus)), bovinos (por ejemplo, vacas), ovinos (por ejemplo, ovejas), equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gato doméstico) y roedores (por ejemplo, cobaya, especies murinas tales como rata, ratón). Los clones de ADNc o genómico de CKR-3 humano descritos en este documento, o porciones suficientes de los mismos, ya estén aislados y/o sean recombinantes o sintéticos, incluyendo fragmentos dentro de la secuencia codificante producidos por PCR, pueden usarse como sondas para detectar y/o recuperar genes de CKR-3 homólogos (homólogos) u otros genes de receptores relacionados (por ejemplo, nuevos genes de receptores de quimioquina C-C) de otras especies de mamíferos (por ejemplo, por hibridación, PCR u otras técnicas adecuadas). Esto puede lograrse usando los procedimientos descritos en este documento u otros procedimientos adecuados.

Proteínas y péptidos

La invención también se refiere a proteínas o polipéptidos codificados por ácidos nucleicos de la presente invención. Las proteínas y polipéptidos de la presente invención pueden estar aislados y/o ser recombinantes. Las proteínas o polipéptidos denominados en este documento como "aislados" son proteínas o polipéptidos purificados hasta un estado más allá de aquel en el que existen en células de mamífero. Las proteínas o polipéptidos "aislados" incluyen proteínas o polipéptidos obtenidos por procedimientos descritos en este documento, procedimientos similares u otros procedimientos adecuados, incluyendo proteínas o polipéptidos esencialmente puros, proteínas o polipéptidos producidos por síntesis química o mediante combinaciones de procedimientos biológicos y químicos, y proteínas o polipéptidos recombinantes que están aislados. Las proteínas o polipéptidos denominados en este documento "recombinantes" son proteínas o polipéptidos producidos mediante la expresión de ácidos nucleicos recombinantes.

En una realización preferida, la proteína o polipéptido tiene al menos una función característica de un receptor CKR-3 de mamífero, tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [ca^{2+}]_{i}) y/o estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos, activación de integrinas). Como tales, estas proteínas se denominan proteínas CKR-3 de origen de mamíferos o proteínas receptoras de quimioquinas 3 de mamíferos e incluyen, por ejemplo, receptores CKR-3 de mamíferos de origen natural, variantes de esas proteínas y/o porciones de las mismas. Dichas variantes incluyen variantes polimórficas y mutantes naturales o artificiales que difieren por la adición, deleción o sustitución de uno o más restos aminoacídicos o polipéptidos modificados, en los que se modifican uno o más restos, y mutantes que comprenden uno o más restos modificados. Un ejemplo sería una proteína receptora CKR-3 de mamífero que se une a eotaxina.

En una realización particularmente preferida, como proteínas o polipéptidos receptores CKR-3 de mamíferos de origen natural, los receptores CKR-3 de mamífero de la presente invención tienen una función de unión a ligando por uno o más ligandos naturales o fisiológicos y/o una función estimuladora sensible a la unión a ligando, de modo que pueden estimular una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos). Por ejemplo, en el caso de una proteína receptora de quimioquinas 3 humana, una proteína CKR-3 humana aislada se unirá a uno o más ligandos naturales o fisiológicos. Como se muestra en este documento, una proteína CKR-3 humana aislada se une a eotaxina y RANTES específicamente y con gran afinidad y se une específicamente a MCP-3. En una realización, una proteína o polipéptido receptor CKR-3 humano también desencadena quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos en respuesta a la unión a ligando.

La invención se refiere además a proteínas de fusión que comprenden una proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero (como se ha descrito anteriormente) como un primer resto, unido a un segundo resto que no aparece en el receptor CKR-3 de mamífero como se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, el segundo resto puede ser un aminoácido o polipéptido. El primer resto puede estar en una localización N-terminal, localización C-terminal o interno a la proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión comprende un receptor CKR-3 humano como el primer resto y un segundo resto que comprende una secuencia enlazadora y un ligando de afinidad (por ejemplo, una enzima, un antígeno o un marcador epitópico).

Pueden producirse proteínas de fusión mediante una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, algunas realizaciones pueden producirse mediante la inserción de un gen de CKR-3 o porción del mismo en un vector de expresión adecuado, tal como Bluescript®II SK +/ (Stratagene), pGEX-4T-2 (Pharmacia) y pET-15b (Novagen). La construcción resultante se introduce después en una célula huésped adecuada para la expresión. Tras la expresión, puede aislarse o purificarse una proteína de fusión a partir de un lisado celular por medio de una matriz de afinidad adecuada (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. y col., eds., Vol. 2, Supl. 26, págs. 16.4.1-16.7.8 (1991)). Además, los marcadores de afinidad proporcionan un medio para detectar proteínas receptoras CKR-3 o polipéptidos presentes en una proteína de fusión. Por ejemplo, la expresión en superficie celular o la presencia en una fracción celular particular de una proteína de fusión que comprende un antígeno o marcador de afinidad epitópico puede detectarse por medio de un anticuerpo apropiado (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3).

La invención también se refiere a porciones aisladas y/o recombinantes de un receptor CKR-3 de origen de mamífero, tal como un fragmento de un receptor CKR-3 humano. Como se describe en más detalle a continuación, pueden producirse porciones de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, péptidos sintéticos) y usarse para producir anticuerpos. En una realización, una porción aislada y/o recombinante (por ejemplo, un péptido) de un receptor CKR-3 de mamífero seleccionado tiene al menos una propiedad inmunológica. Como se usa en este documento, con referencia a una porción de un receptor, una propiedad inmunológica incluye inmunorreactividad (unida por anticuerpos generados contra una proteína receptora CKR-3 de mamífero de la presente invención, incluyendo una porción de la misma), inmunogenicidad (induce una respuesta de anticuerpos contra sí misma cuando se usa en un protocolo de inmunización adecuado) y/o reactividad cruzada (induce anticuerpos reactivos con un receptor de mamífero seleccionado). Además, también pueden producirse porciones de un receptor CKR-3 que tengan al menos una función característica de receptores CKR-3 de mamíferos, tal como una actividad de unión, actividad de señalización o función estimuladora (estimulación de una respuesta celular). Los estudios exhaustivos sobre la estructura y función de receptores acoplados a proteína G de mamíferos proporcionan la base para ser capaces de dividir los receptores CKR-3 de mamíferos en dominios funcionales (véase, por ejemplo Lefkowitz y col., J. Biol. Chem., 263: 4993-4996 (2988); Panayotou y Waterfield, Curr. Opinion Cell Biol., 1: 167-176 (1989)). Además, pueden producirse porciones del receptor que tengan una función completa o parcial por sí mismos, o que cuando se unen con otra porción de un segundo receptor (aunque sean completamente, parcialmente o no funcionales en solitario) constituyen una proteína funcional que tiene al menos una función característica de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, función de unión a ligando, inhibidor o promotor). (Véase, por ejemplo Sledziewski y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.284.746 con respecto a la construcción y uso de receptores acoplados a proteína G híbridos útiles en la detección de la presencia de un ligando en una muestra de ensayo).

Procedimiento para producir receptores CKR-3 de mamífero recombinantes

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir un receptor CKR-3 de mamífero o una porción del mismo. También se proporcionan construcciones adecuadas para la expresión de un receptor CKR-3 de mamífero o una porción del mismo. Las construcciones pueden introducirse en una célula huésped adecuada. Pueden aislarse y mantenerse en cultivo células que expresen un receptor CKR-3 de mamífero recombinante o una porción del mismo. Dichas células son útiles para una diversidad de propósitos tales como la producción de proteína para caracterización, aislamiento y/o purificación, y en ensayos de unión para la detección de ligandos o inhibidores o promotores de la unión a ligando. Las células huésped adecuadas pueden ser procariotas, incluyendo células bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y/o otras bacterias adecuadas o eucariotas tales como células fúngicas o de levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, especies de Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) u otras células eucariotas inferiores y células de eucariotas superiores tales como las de insectos (por ejemplo, células de insecto Sf9) o de mamíferos (por ejemplo, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO)). (Véase, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)).

Las células huésped que producen una proteína receptora CKR-3 de mamífero recombinante, una porción de la misma o una proteína de fusión pueden producirse de la forma siguiente. Un ácido nucleico que codifica toda o parte de la secuencia codificante de un receptor o proteína de fusión de CKR-3 de mamífero puede insertarse en un vector de ácido nucleico, por ejemplo, un vector de ADN, tal como un plásmido, virus u otro replicón adecuado para la expresión. Están disponibles una diversidad de vectores, incluyendo vectores que se mantienen en una sola copia o en múltiples copias, o que se integran en el cromosoma de la célula huésped.

Las señales de transcripción y/o traducción de un receptor CKR-3 seleccionado pueden usarse para dirigir la expresión. Como alternativa, están disponibles vectores de expresión adecuados. Los vectores adecuados para la expresión de un ácido nucleico que codifican todo o parte de la secuencia codificante de un receptor CKR-3 de mamífero o una proteína de fusión pueden contener varios componentes adicionales, incluyendo, pero sin limitación, uno más de los siguientes: un origen de replicación; un gen marcador de selección; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador) y/o una o más señales de traducción; una secuencia señal o secuencia líder (para el direccionamiento a membrana codificado por el vector o receptor).

Se proporciona un promotor para la expresión en una célula huésped adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. En los vectores, el promotor se une operativamente a un ácido nucleico que codifica la proteína receptora, una porción de la misma o una proteína de fusión, y que es capaz de dirigir la expresión del polipéptido codificado. Están disponibles una diversidad de promotores adecuados para huéspedes procariotas (por ejemplo, promotores de lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucariotas (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH1), SV40, CMV).

Además, los vectores de expresión comprenden típicamente un marcador de selección para la selección de células huésped que lleven el vector, y un origen de replicación, en el caso de un vector de expresión replicable. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármacos son marcadores de selección comunes y pueden usarse en células procariotas (por ejemplo, gen de \beta-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y eucariotas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una diversidad de huéspedes. Se usan con frecuencia genes que codifican el producto génico de marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) como marcadores de selección en levaduras. También se contempla el uso de vectores virales (por ejemplo, baculovirus) o de fagos y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, tales como vectores retrovirales. La presente invención también se refiere a células que llevan estos vectores de expresión.

Cuando el ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido receptor se inserta en el vector, unido operativamente a uno o más de estos componentes, y la construcción resultante se introduce en células huésped mantenidas en condiciones adecuadas para la expresión, se produce la proteína o polipéptido receptor. La construcción puede introducirse en células mediante un procedimiento apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección). Para la producción de receptor, las células huésped que comprenden la construcción se mantienen en condiciones apropiadas para la expresión, por ejemplo, en presencia de un inductor (por ejemplo, n-butirato), medios adecuados complementados con sales, factores de crecimiento, antibióticos, complementos nutricionales apropiados, etc.

Anticuerpos

La invención se refiere además a anticuerpos reactivos con un receptor CKR-3 o porción del mismo. En una realización, se generan anticuerpos contra una proteína CKR-3 de mamífero aislada y/o recombinante, incluyendo porciones de la misma (por ejemplo, un péptido). En una realización preferida, los anticuerpos se unen específicamente a un receptor o receptores CKR-3 o a una porción de los mismos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5) y el término anticuerpo pretende incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Pueden generarse anticuerpos de la presente invención contra un inmunógeno apropiado, incluyendo proteínas o polipéptidos de la presente invención, tales como una proteína receptora CKR-3 de mamífero aislada y/o recombinante o una porción de la misma, o moléculas sintéticas, tales como péptidos sintéticos. Además, pueden usarse células que expresen receptor, tales como células transfectadas, como inmunógenos o en una exploración para un anticuerpo que se una al receptor. Véase, por ejemplo, Chuntharapai y col., J. Immunol. 152: 1783-1789 (1994)).

La preparación de un antígeno inmunizante y la producción de un anticuerpo policlonal y monoclonal pueden realizarse usando cualquier técnica adecuada. Se han descrito una diversidad de procedimientos (véase, por ejemplo, Kohler y col., Nature, 256: 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein y col., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.172.124; Harlow, E. y D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, verano de 1994), Ausubel, F. M. y col., Eds., (John Wiley & Sons: Nueva York, NY), Capítulo 11, (1991)). Generalmente, se produce un hibridoma por fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como SP2/0) con células productoras de anticuerpos. La célula productora de anticuerpos, preferiblemente las del bazo o de ganglios linfáticos, se obtienen de animales inmunizados con el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) se aíslan usando condiciones de cultivo selectivas y se clonan por dilución limitante. Se seleccionan las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).

También se incluyen en la presente invención y en el término "anticuerpo" anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados (injertados a CDR) así como anticuerpos de cadena sencilla quiméricos o injertados a CDR que comprenden porciones procedentes de diferentes especies. Las diversas porciones de estos anticuerpos pueden unirse entre sí químicamente mediante técnicas convencionales, o pueden prepararse como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, pueden expresarse ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada para producir una proteína contigua. Véase, por ejemplo, Cabilly y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Cabilly y col., Patente Europea Nº 0.125.023 B1; Boss y col., Patente de Estados Unidos Nº 816.397; Boss y col., Patente Europea Nº 0.120.694 B1; Neuberger, M. S. y col., documento WO 86/01533; Neuberger, M. S. y col., Patente Europea Nº 0.194.276 B1; Winter, Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; y Winter, Patente Europea Nº 0.239.400 B1. Véase también Newman, R. y col., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), con respecto a un anticuerpo primatizado y Ladner y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778 y Bird, R. E. y col., Science, 242: 423-426 (1988)) con respecto a anticuerpos de cadena sencilla.

Además, también pueden producirse fragmentos funcionales de anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos quiméricos, humanizados, primatizados o de cadena sencilla. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos anteriores conservan al menos una función de unión y/o una función de modulación del anticuerpo de longitud completa del que proceden. Por ejemplo, se incluyen en la invención fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a un receptor CKR-3 de mamífero o porción del mismo, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')_{2}. Dichos fragmentos pueden producirse por escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión con papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')_{2}, respectivamente. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos en una diversidad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de terminación cadena arriba del sitio de terminación natural. Por ejemplo, puede diseñarse un gen quimérico que codifique una porción de cadena pesada F(ab')_{2} para incluir secuencias de ADN que codifiquen el dominio CH_{1} y la región de bisagra de la cadena pesada.

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en una diversidad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, de diagnóstico y terapéuticas. Por ejemplo, pueden usarse para aislar y/o purificar un receptor o porciones del mismo y para estudiar la estructura (por ejemplo, la conformación) y la función del receptor.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse para modular la función de un receptor en aplicaciones de investigación y terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden actuar como inhibidores para inhibir (reducir o impedir) (a) la unión (por ejemplo, de un ligando, un segundo inhibidor o un promotor) al receptor, (b) una señalización de receptor, (c) y/o una función estimuladora. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función del receptor pueden bloquear la unión al ligando o promotor directamente o indirectamente (por ejemplo, causando un cambio conformacional). Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función del receptor por inhibición de la unión de un ligando o por desensibilización (con o sin inhibición de la unión de un ligando).

Los anticuerpos que se unen a un receptor también pueden actuar como agonistas de la función del receptor, desencadenando o estimulando una función del receptor, tal como una función de señalización y/o estimuladora de un receptor (por ejemplo, quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores proinflamatorios) tras la unión al receptor.

Además, los diversos anticuerpos de la presente invención pueden usarse para detectar o medir la expresión de receptor, por ejemplo, en leucocitos tales como eosinófilos, basófilos y linfocitos o en células transfectadas con un gen de receptor. Por lo tanto, también tienen utilidad en aplicaciones tales como la separación de células (por ejemplo, citometría de flujo, separación de células activadas por fluorescencia) para fines de diagnóstico o investigación.

También se proporcionan anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos anti-idiotípicos reconocen determinantes antigénicos asociados con el sitio de unión a antígeno de otro anticuerpo. Pueden prepararse anticuerpos anti-idiotípicos contra un segundo anticuerpo por inmunización de un animal de la misma especie y, preferiblemente, de la misma estirpe, que el animal usado para producir el segundo anticuerpo. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.699.880.

En una realización, se generan anticuerpos contra un receptor o una porción del mismo y estos anticuerpos se usan a su vez para producir un anticuerpo anti-idiotípico. El anti-Id producido de este modo puede unirse a compuestos que se unen al receptor, tales como ligandos, inhibidores o promotores de la función del receptor y pueden usarse en un inmunoensayo para detectar o identificar o cuantificar dichos compuestos. Dicho anticuerpo anti-idiotípico también puede ser un inhibidor de la función del receptor, aunque no se una al propio receptor.

El propio anticuerpo anti-idiotípico (es decir, anti-Id) puede usarse para generar un anticuerpo anti-idiotípico (es decir, anti-anti-Id). Dicho anticuerpo puede ser similar o idéntico en especificidad al anticuerpo inmunizante original. En una realización, pueden usarse antagonistas de anticuerpos que bloqueen la unión a receptor para generar anti-Id y los anti-Id pueden usarse para generar anti-anti-Id que pueden tener una especificidad que sea similar o idéntica a la del antagonista de anticuerpo. Estos anticuerpos anti-anti-Id pueden evaluarse para determinar su efecto inhibidor sobre la función del receptor para determinar si son antagonistas.

Pueden prepararse anticuerpos de cadena sencilla y quiméricos como humanizados o primatizados (injertados a CDR), así como anti-idiotípicos de cadena sencilla, quiméricos o injertados a CDR, y se incluyen en el término de anticuerpo anti-idiotípico. También pueden prepararse fragmentos de anticuerpo de dichos anticuerpos.

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Identificación de ligandos, inhibidores o promotores de la función del receptor

Como se usa en el presente documento, un ligando es una sustancia que se une a una proteína receptora. Un ligando de un receptor CKR-3 de mamífero seleccionado es una sustancia que se une al receptor de mamífero seleccionado. En una realización, un ligando puede unirse selectivamente a dos o más receptores de quimioquinas de mamíferos, incluyendo CKR-3. En una realización preferida, la unión a ligando de un receptor CKR-3 de mamífero se produce con gran afinidad. El término ligando se refiere a sustancias que incluyen, pero sin limitación, un ligando natural, ya esté aislado y/o purificado, sea sintético y/o recombinante, un homólogo de un ligando natural (por ejemplo, de otro mamífero), anticuerpos, porciones de dichas moléculas y otras sustancias que se unen a receptor. Un ligando natural de un receptor de mamífero seleccionado puede unirse al receptor en condiciones fisiológicas y es de un origen de mamífero que es el mismo que el del receptor CKR-3 de mamífero. El término ligando incluye sustancias que son inhibidores o promotores de la actividad del receptor, así como sustancias que se unen pero que carecen de actividad inhibidora o promotora.

Como se usa en el presente documento, un inhibidor es una sustancia que inhibe al menos una función característica de un receptor de quimioquina C-C de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 de mamífero) tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]_{i}) y/o estimulación de una respuesta celular. El término inhibidor se refiere a sustancias que incluyen antagonistas que se unen a receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un mutante de un ligando natural, otros inhibidores competitivos de unión a ligando) y sustancias que inhiben la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico).

Como se usa en el presente documento, un promotor es una sustancia que promueve (induce o potencia) al menos una función característica de un receptor de quimioquina C-C de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 de mamífero), tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]_{i}) y/o estimulación de una respuesta celular. El término promotor se refiere a sustancias que incluyen agonistas que se unen a receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie) y sustancias que promueven la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, por activación de una proteína asociada).

Los ensayos que se describen a continuación, que dependen de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, pueden usarse en solitario o en combinación entre sí o con otros procedimientos adecuados, para identificar ligandos, inhibidores o promotores de una proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero. El CKR-3 humano no existe habitualmente en células a niveles adecuados para una exploración de alto rendimiento; por lo tanto, las células que contienen y expresan un ácido nucleico de la presente invención son particularmente valiosas para identificar ligandos, inhibidores y promotores de proteínas receptoras CKR-3.

Tras el aislamiento de un gen de receptor CKR-3 de un mamífero, el gen puede incorporarse en un sistema de expresión para producir una proteína o polipéptido receptor como se ha descrito anteriormente. Una proteína o polipéptido receptor aislado y/o recombinante, tal como un receptor expresado en células transfectadas de forma estable o transitoria con una construcción que comprende un ácido nucleico de la presente invención, o en una fracción celular (por ejemplo, fracción de membrana de células transfectadas) que contiene receptor, puede usarse en ensayos para determinar la función del receptor. El receptor puede purificarse adicionalmente si se desea. El ensayo de la función del receptor puede realizarse in vitro o in vivo.

Una proteína receptora CKR-3 de mamífero recombinante aislada, tal como un receptor CKR-3 humano como el que se muestra en la Figura 1A-1C (véase también la SEC ID Nº: 2), la Figura 2A-2B (véase también la SEC ID Nº: 4) o la SEC ID Nº: 6 puede usarse en el presente procedimiento, en el que el efecto de un compuesto se evalúa por control de la función del receptor como se describe en este documento, usando otras técnicas adecuadas. Por ejemplo, pueden usarse en ensayos de unión transfectantes estables o transitorios, tales como transfectantes estables A31/293/#20 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9), transfectantes estables de células pre-B L1-2 de ratón (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3), células Sf9 infectadas con baculovirus (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). Pueden usarse transfectantes estables de células pre-B L1-2 de ratón o de otras células adecuadas capaces de quimiotaxis (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3) en ensayos de quimiotaxis, por ejemplo.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, los compuestos pueden explorarse individualmente o uno o más compuestos pueden ensayarse simultáneamente de acuerdo con los procedimientos de este documento. Cuando se ensaya una mezcla de compuestos, los compuestos seleccionados mediante los procedimientos descritos pueden separarse (según sea apropiado) e identificarse mediante procedimientos adecuados (por ejemplo, PCR, secuenciación, cromatografía). La presencia de uno o más compuestos (por ejemplo, un ligando, inhibidor, promotor) en una muestra de ensayo también puede determinarse de acuerdo con estos procedimientos.

Pueden ensayarse grandes bibliotecas combinatorias de compuestos (por ejemplo, compuestos orgánicos, péptidos recombinantes o sintéticos, "peptoides", ácidos nucleicos) producidos mediante síntesis química combinatoria u otros procedimientos (véase, por ejemplo, Zuckerman, R. N. y col., J. Med. Chem., 37: 2678-2685 (1994) y las referencias citadas en el mismo; véase también Ohlmeyer, M. H. J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 (1993) y Dewitt, S. H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993), en relación con compuestos marcados; Rutter, W. J. y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.010.175; Huebner, V. D. y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.182.366; y Geysen, H. M., Patente de Estados Unidos Nº 4.833.092). Cuando los compuestos seleccionados de una biblioteca combinatoria mediante el presente procedimiento llevan marcadores únicos, es posible la identificación de compuestos individuales mediante procedimientos cromatográficos.

En una realización, se usa la metodología de presentación en fagos. Por ejemplo, el receptor se pone en contacto con un fago (por ejemplo, un fago o una colección de fagos tal como una biblioteca) que presenta un polipéptido en condiciones apropiadas para la unión a receptor (por ejemplo, en un tampón de unión adecuado). El fago unido al receptor se selecciona usando técnicas convencionales u otros procedimientos adecuados. El fago puede separarse del receptor usando un tampón de elución adecuado. Por ejemplo, un cambio en la fuerza iónica o pH puede conducir a una liberación del fago. Como alternativa, el tampón de elución puede comprender un componente o componentes de liberación diseñados para romper la unión de compuestos (por ejemplo, uno o más compuestos que pueden romper la unión del péptido presentado al receptor, tal como un ligando, inhibidor y/o promotor que inhibe competitivamente la unión). Opcionalmente, el procedimiento de selección puede repetirse o puede usarse otra etapa de selección para enriquecer adicionalmente para fagos que se unen al receptor. El polipéptido presentado se caracteriza (por ejemplo, mediante secuenciación de ADN del fago). Los polipéptidos identificados pueden producirse y ensayarse adicionalmente para determinar su unión a ligando, función inhibidora y/o promotora. Pueden producirse análogos de dichos péptidos que tendrán una estabilidad aumentada u otras propiedades deseables.

En una realización, puede producirse la expresión y presentación en fagos de proteínas de fusión que comprenden una proteína de cubierta con un péptido N-terminal codificado por ácido nucleicos de secuencia aleatoria. Las células huésped adecuadas que expresan una proteína o polipéptido receptor de la presente invención se ponen en contacto con el fago, se selecciona el fago unido, se recupera y se caracteriza. (Véase, por ejemplo, Doorbar, J. y G. Winter, J. Mol. Biol., 244-361 (1994) que analiza un procedimiento de presentación en fago usado con un receptor acoplado a proteína G).

Otras fuentes de ligandos, inhibidores y/o promotores potenciales de un receptor CKR-3 de mamífero incluyen, pero sin limitación, sustancias tales como otros quimioatrayentes (por ejemplo, anafilatoxina C5a y tripéptido formilado bacteriano (fMLP)); otras quimioquinas (por ejemplo, eotaxina), tal como una quimioquina de mamífero del mismo mamífero que el receptor, de otro mamífero (por ejemplo, para un receptor humano, un homólogo de una quimioquina humana obtenido de una fuente no humana); variantes de otros quimioatrayentes o quimioquinas, tales como variantes de origen natural, sintéticas o recombinantes; otros ligandos, inhibidores y/o promotores de receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, anticuerpos, antagonistas, agonistas) y variantes de los mismos; otros ligandos, inhibidores y/o promotores de receptor acoplados a proteína G (por ejemplo, antagonistas o agonistas); y porciones solubles de un receptor CKR-3 de mamífero, tal como un péptido receptor adecuado o análogo, que pueden inhibir la función del receptor (véase, por ejemplo, Murphy, R. B., documento WO 94/05695).

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El procedimiento in vitro de la presente invención puede usarse en una exploración de alto rendimiento. Estos ensayos pueden adaptarse para procesar un gran número de muestras (por ejemplo, un formato de 96 pocillos). Para dicha exploración, se prefiere el uso de una célula huésped que exprese receptor en lugar de eosinófilos aislados debido a la dificultad de aislar eosinófilos.

Para ensayos de unión, se prefiere un alto nivel de expresión de receptor en una célula huésped adecuada. La expresión de receptor puede controlarse de una diversidad de formas. Por ejemplo, la expresión puede controlarse usando anticuerpos de la presente invención que se unen al receptor o a una porción del mismo. Además, pueden usarse anticuerpos disponibles en el mercado para detectar la expresión de una proteína de fusión marcada con un antígeno o epítope que comprende una proteína o polipéptido receptor (por ejemplo, receptores marcados con FLAG; véase el Ejemplo 3).

Ensayos de unión

Las proteínas receptoras aisladas y/o recombinantes, porciones de las mismas o proteínas de fusión adecuadas de la presente invención pueden usarse en un procedimiento para seleccionar e identificar compuestos que se unan a (una o más) proteínas receptoras CKR-3 de mamífero, tales como un receptor CKR-3 humano, y que son ligandos, o inhibidores o promotores potenciales de la actividad del receptor. Los compuestos seleccionados mediante el procedimiento, incluyendo ligandos, inhibidores o promotores, pueden evaluarse adicionalmente para un efecto inhibidor o estimulador sobre la función del receptor y/o por su utilidad terapéutica.

En una realización, se identifican mediante el procedimiento compuestos que se unen a una proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero activo, aislado y/o recombinante. En esta realización, la proteína o polipéptido receptor usado tiene al menos una función característica de un receptor CKR-3, tal como una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína a G de mamífero), función estimuladora (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis o liberación de mediadores inflamatorios) y/o función de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor). En una realización particularmente preferida, la proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero aislado y/o recombinante tiene función de unión a ligando, de modo que se une a un ligando natural del receptor.

Por ejemplo, una proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero aislado y/o recombinante puede mantenerse en condiciones adecuadas para la unión, el receptor se pone en contacto con un compuesto a ensayar y se detecta o se mide la unión. En una realización, una proteína receptora puede expresarse en células transfectadas de forma estable o transitoria con una construcción que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de la presente invención. Las células se mantienen en condiciones apropiadas para la expresión del receptor. Las células se ponen en contacto con un compuesto en condiciones adecuadas para la unión (por ejemplo, en un tampón de unión adecuado) y la unión se detecta mediante técnicas convencionales. Para medir la unión, el grado de unión puede determinarse con respecto a un control adecuado (por ejemplo, en comparación con un fondo determinado en ausencia de compuesto, en comparación con la unión de un segundo compuesto (es decir, un patrón), o en comparación con la unión de compuesto a células sin transfectar). Opcionalmente, puede usarse una fracción celular, tal como una fracción de membrana que contiene receptor, en lugar de células completas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9).

En una realización, el compuesto está marcado con un marcador adecuado (por ejemplo, marcador fluorescente, marcador isotópico) y la unión se determina por detección del marcador. Puede evaluarse la especificidad de la unión por competición o desplazamiento, por ejemplo, usando compuesto sin marcar o un segundo ligando como competidor.

De esta forma pueden identificarse ligandos del receptor de mamífero, incluyendo ligandos naturales de la misma especie de mamífero o de otra especie. La actividad de unión de un promotor o inhibidor que se une a receptor también puede evaluarse usando dichos ensayo de unión a ligando.

También pueden usarse ensayos de inhibición de la unión para identificar ligandos e inhibidores y promotores que se unen a un receptor e inhiben la unión de otro compuesto tal como un ligando. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de unión en el que se detecta o se mide una reducción en la unión de un primer compuesto (en ausencia de un segundo compuesto) en comparación con la unión del primer compuesto en presencia del segundo compuesto. El receptor puede ponerse en contacto con el primer y segundo compuestos simultáneamente, o con uno después de otro, en cualquier orden. Una reducción en el grado de unión del primer compuesto en presencia del segundo compuesto es indicativa de inhibición de la unión por el segundo compuesto. Por ejemplo, la unión del primer compuesto podría disminuirse o suprimirse.

En una realización, se controla la inhibición directa de la unión de un primer compuesto (por ejemplo, una quimioquina tal como RANTES) a un receptor CKR-3 humano por un segundo compuesto de ensayo. Por ejemplo, puede controlarse la capacidad de un compuesto para inhibir la unión de RANTES marcado con ^{125}I o MCP-3 marcada con ^{125}I a CKR-3 humano. Dicho ensayo puede realizarse usando células completas (por ejemplo, células HL-60 diferenciadas con ácido butírico o una línea celular adecuada que contiene un ácido nucleico que codifica un receptor CKR-3 humano) o una fracción de membrana de dichas células, por ejemplo.

Están disponibles otros procedimientos para identificar la presencia de un compuesto o compuestos que se unen a un receptor, tales como procedimientos que controlan acontecimientos que se desencadenan por unión a receptor, incluyendo la función de señalización y/o la estimulación de una respuesta celular (véase a continuación).

Se entenderá que el efecto inhibidor de anticuerpos de la presente invención puede evaluarse en un ensayo de inhibición de la unión. También puede evaluarse la competición entre anticuerpos por la unión a receptor en el procedimiento en el que el primer compuesto en el ensayo es otro anticuerpo, en condiciones adecuadas para la unión a anticuerpo.

Los ligandos, así como inhibidores de la unión a receptor (por ejemplo, antagonistas) y promotores, (por ejemplo, agonistas) que se identifican de esta forma pueden evaluarse adicionalmente para determinar si, posteriormente a la unión, actúan inhibiendo o activando otras funciones de receptores CKR-3 y/o para evaluar su utilidad terapéutica.

Ensayos de señalización

La unión de un ligando o promotor, tal como un agonista, puede dar como resultado la señalización por un receptor acoplado a proteína G y se estimula la actividad de proteínas G. La inducción de inducir la función de señalización por un compuesto puede controlarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, la actividad de proteína G, tal como la hidrólisis de GTP a GDP o acontecimientos de señalización posteriores desencadenados por la unión a receptor, tales como la inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre (citosólico) intracelular [Ca^{2+}]_{i}, pueden ensayarse por procedimientos conocidos en la técnica u otros procedimientos adecuados (véase, por ejemplo, Neote, K. y col., Cell, 72: 415-425 1993); Van Riper y col., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Dahinden, C. A. y col., J. Exp. Med., 179: 751-756 (1994).

El ensayo funcional de Sledziewski y col. usando receptores acoplados a proteína G híbridos también puede usarse para controlar la capacidad de un ligando o promotor para unirse a un receptor y activar una proteína G (Sledziewski y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.284.746).

Se controla una respuesta biológica de la célula huésped (desencadenada por la unión a un receptor híbrido), siendo la detección de la respuesta indicativa de la presencia de ligando en la muestra de ensayo. Sledziewski y col. describe un procedimiento para detectar la presencia de un ligando en una muestra de ensayo en el que el ligando es un compuesto que es capaz de unirse por el dominio de unión a ligando de un receptor. En una realización del procedimiento, se transforman células huésped de levaduras con una construcción de ADN capaz de dirigir la expresión de un receptor acoplado a proteína G híbrido biológicamente activo (es decir, una proteína de fusión). El receptor híbrido comprende un receptor acoplado a proteína G de mamífero que tiene al menos un dominio distinto del dominio de unión a ligando sustituido con un dominio correspondiente de un receptor acoplado a proteína G de levadura, tal como un producto génico de STE2. Las células huésped de levadura que contienen la construcción se mantienen en condiciones en las que se expresa el receptor híbrido y las células se ponen en contacto con una muestra de ensayo en condiciones adecuadas para permitir la unión de ligando al receptor híbrido. El ensayo se realiza como se ha descrito y se controla la respuesta biológica de la célula huésped (desencadenada por la unión a receptor híbrido), siendo la detección de la respuesta indicativa de una función de señalización.

Por ejemplo, se proporciona un ensayo en el que la unión a un receptor híbrido obtenido de un producto génico de STE2 conduce a la inducción del promotor BAR1. La inducción del promotor se mide por medio de un gen indicador (\beta-gal) que está unido al promotor BAR1 y que se introduce en células huésped en una segunda construcción. La expresión del gen indicador puede detectarse mediante un ensayo enzimático in vitro en lisados celulares o por la presencia de colonias azules en placas que contienen un indicador (X-gal) en el medio, por ejemplo.

En otra realización, el ensayo se usa para identificar inhibidores potenciales de la función del receptor. La actividad inhibidora de un compuesto puede determinarse usando un ligando o promotor en el ensayo y evaluando la capacidad del compuesto para inhibir la actividad inducida por un ligando promotor.

También pueden explorarse variantes de ligandos conocidos por su capacidad reducida (capacidad disminuida o ninguna capacidad) para estimular la actividad de una proteína G acoplada. En esta realización, aunque el compuesto tiene actividad de unión a ligando (como se determina por otro procedimiento por adelantado o posteriormente), el acoplamiento del receptor no desencadena o sólo desencadena débilmente actividad de una proteína G acoplada. Dichos compuestos son antagonistas potenciales y pueden evaluarse adicionalmente usando un ensayo adecuado. Por ejemplo, el mismo ensayo puede realizarse en presencia de un ligando o promotor y se evalúa la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de un ligando o promotor.

Quimiotaxis y ensayos de estimulación celular

También pueden usarse ensayos de quimiotaxis para evaluar la función de un receptor. Estos ensayos se basan en la migración funcional de células in vitro o in vivo inducida por un compuesto y puede usarse para evaluar la unión y/o el efecto quimioatrayente de ligandos, inhibidores o promotores. El uso de un ensayo de quimiotaxis transendotelial in vitro se describe en el Ejemplo 1. Springer y col. describen un ensayo de quimiotaxis de linfocitos transendotelial (Springer y col., documento WO 94/20142, publicado el 15 de septiembre de 1994; véase también Berman y col., Immunol Invest. 17: 625-677 (1988)). También se ha descrito la migración a través del endotelio hacia geles de colágeno (Kavanaugh y col., J. Immunol, 146: 4149-4156 (1991)).

Pueden usarse transfectantes estables de células pre-B L1-2 de ratón o de otras células huésped adecuadas capaces de quimiotaxis (véase, por ejemplo, Ejemplo 3) en ensayos de quimiotaxis, por ejemplo. Como se describe adicionalmente en este documento también pueden incorporarse en ensayos de quimiotaxis líneas celulares de tipo eosinófilo, tales como la línea HL60 diferenciada con butirato que elabora un receptor CKR-3.

Generalmente, los ensayos de quimiotaxis controlan el movimiento o la migración direccional de una célula adecuada (tal como un leucocito (por ejemplo, linfocito, eosinófilo, basófilo)) hacia o a través de una barrera (por ejemplo, endotelio, un filtro) hacia niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie de la barrera hacia una segunda superficie opuesta. Las membranas o filtros proporcionan barreras convenientes, de modo que se controla el movimiento o la migración direccional de una célula adecuada hacia o a través de un filtro, hacia niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro. En algunos ensayos, la membrana está recubierta con una sustancia para facilitar la adhesión, tal como ICAM-1, fibronectina o colágeno.

Por ejemplo, se puede detectar o medir la migración de células en un recipiente adecuado (un medio de contención) desde una primera cámara, hacia o a través de una membrana microporosa, hacia una segunda cámara que contiene un compuesto a ensayar y que está dividida de la primera cámara por la membrana. Se selecciona una membrana adecuada que tiene un tamaño de poro adecuado para controlar la migración específica en respuesta a un compuesto, incluyendo, por ejemplo, nitrocelulosa y policarbonato. Por ejemplo, pueden usarse tamaños de poro de aproximadamente 3-8 micrómetros y, preferiblemente, de aproximadamente 5-8 micrómetros. El tamaño de poro puede ser uniforme en un filtro o estar dentro de un intervalo de tamaños de poro adecuados.

Para evaluar la migración, puede determinarse la distancia de migración hacia el filtro, el número de células que atraviesan el filtro que permanecen adherentes en la segunda superficie del filtro y/o el número de células que se acumulan en la segunda cámara usando técnicas convencionales (por ejemplo, microscopía). En una realización, las células se marcan con un marcador detectable (por ejemplo, radioisótopo, marcador fluorescente, marcador antigénico o epitópico) y puede evaluarse la migración determinando la presencia del marcador adherente a la membrana y/o presente en la segunda cámara usando un procedimiento apropiado (por ejemplo, por detección de radioactividad, fluorescencia, inmunoensayo). Puede determinarse el grado de migración inducida por un compuesto con respecto a un control adecuado (por ejemplo, en comparación con la migración de fondo determinada en ausencia del compuesto, con el grado de migración inducida por un segundo compuesto (es decir, un patrón) en comparación con la migración de células no transfectadas inducidas por el compuesto).

Las cámaras pueden estar formadas por diversos sólidos, tales como plásticos, vidrio, polipropileno, poliestireno, etc. Las membranas que son extraíbles de las cámaras, tales como un separador de cultivo Biocoat (Collaborative Biomedical Products) o Transwell (Costar, Cambridge, MA) facilitan el recuento de células adherentes.

En el recipiente, el filtro se sitúa de modo que contacte con el líquido que contiene células en la primera cámara y el líquido en la segunda cámara. Aparte del compuesto de ensayo o de un ligando, inhibidor o promotor adicional presente para los fines del ensayo, el líquido a cada lado de la membrana es preferiblemente el mismo o sustancialmente similar. El líquido en la cámara puede comprender soluciones de proteínas (por ejemplo, albúmina de suero bovino, suero fetal de ternera, albúmina de suero humano) que pueden actuar aumentando la estabilidad e inhibiendo la unión inespecífica de células y/o medios de cultivo.

En una realización preferida, particularmente para eosinófilos, células similares a eosinófilos, linfocitos o células que expresan un receptor CKR-3, se controla la migración transendotelial. Se prefiere un ensayo de migración transendotelial. Dichos ensayos son mejores modelos fisiológicos, debido a que resumen con mayor precisión las condiciones in vivo en la que los leucocitos emigran desde los vasos sanguíneos hacia quimioatrayentes presentes en los tejidos en sitios de inflamación, atravesando la capa de células endoteliales que reviste la pared del vaso. Además, los ensayos transendoteliales tiene un fondo menor (proporción de señal con respecto a interferencias).

En esta realización, se evalúa la transmigración a través de una capa celular endotelial. Para preparar la capa celular, pueden cultivarse células endoteliales en un filtro microporoso o membrana, opcionalmente recubierto con una sustancia tal como colágeno, fibronectina u otras proteínas de la matriz extracelular, para facilitar la unión de células endoteliales. Preferiblemente, se cultivan células endoteliales hasta que se forma una monocapa confluente. Están disponibles para la formación de una monocapa una diversidad de células endoteliales de mamíferos incluyendo, por ejemplo, endotelio de venas, arterias o microvascular, tal como células endoteliales de vena umbilical humana (Clonetics Corp, San Diego, CA) o una línea celular adecuada, tal como la línea celular ECV304 usada en el Ejemplo 1. Para ensayar la quimiotaxis en respuesta a un receptor de mamífero particular, se prefieren células endoteliales del mismo mamífero; sin embargo, también pueden usarse células endoteliales de una especie o género de mamífero heterólogo.

Generalmente, el ensayo se realiza detectando la migración direccional de células hacia o a través de una membrana o filtro, en una dirección hacia niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro, donde el filtro contiene una capa de células endoteliales en una primera superficie. La migración direccional se produce desde el área adyacente a la primera superficie, hacia o a través de la membrana, hacia un compuesto situado en el lado opuesto del filtro. La concentración de compuesto presente en el área adyacente a la segunda superficie es superior que en el área adyacente a la primera superficie.

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En una realización, se usa la quimiotaxis para ensayar la actividad de ligando o promotor de un compuesto, se coloca en la primera cámara una composición que comprende células capaces de migración y expresión de un receptor CKR-3 de mamífero y se coloca en la segunda cámara una composición que comprende el compuesto a ensayar, preferiblemente en ausencia de otros ligandos o promotores capaces de inducir la quimiotaxis de las células en la primera cámara (que tiene función quimioatrayente). Sin embargo, pueden estar presentes uno o más ligandos o promotores que tiene función quimioatrayente. Los compuestos que pueden unirse al receptor e inducir la quimiotaxis de las células que expresan un receptor CKR-3 de mamífero en este ensayo son ligandos o promotores de la función del receptor.

En una realización usada para ensayar un inhibidor, se coloca en la primera cámara una composición que comprende células capaces de la migración y expresión de un receptor CKR-3 de mamífero. Una composición que comprende uno o más ligandos o promotores capaces de inducir la quimiotaxis de las células en la primera cámara (que tiene una función quimioatrayente) se coloca en la segunda cámara. Poco antes de que las células se coloquen en la primera cámara, o simultáneamente con las células, se coloca una composición que comprende el compuesto que se va a ensayar, preferiblemente, en la primera cámara. Los compuestos que pueden unirse al receptor e inhibir la inducción de la quimiotaxis, mediante un ligando o promotor, de las células que expresan un receptor CKR-3 de mamífero en este ensayo son inhibidores de la función del receptor (es decir, inhibidores de la función estimuladora). Una reducción en el grado de migración inducida por el ligando o promotor en presencia del compuesto de ensayo es indicativa de actividad inhibidora (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). Podrían realizarse estudios de unión separados (véase anteriormente) para determinar si la inhibición es un resultado de la unión del compuesto de ensayo al receptor o se produce a través de un mecanismo diferente.

Se describen a continuación ensayos in vivo que controlan la infiltración de leucocitos de un tejido en respuesta a una inyección de un compuesto en el tejido, como se describe a continuación (véase Modelos de inflamación). Estos modelos miden la capacidad de las células para responder a un ligando o promotor por emigración y quimiotaxis hacia un sitio de inflamación.

Además de los procedimientos descritos, los efectos de un ligando, inhibidor o promotor sobre la función estimuladora del receptor pueden evaluarse controlando respuestas celulares inducidas por un receptor activo, usando células huésped adecuadas que contienen el receptor. De forma similar, estos ensayos pueden usarse para determinar la función de un receptor. Por ejemplo, puede controlarse la exocitosis (por ejemplo, desgranulación de eosinófilos que conduce a liberación de proteína catiónica eosinófila y/o una o más enzimas u otros componentes de gránulos; liberación de histamina de basófilos), liberación de mediadores inflamatorios (tal como liberación de lípidos bioactivos tales como leucotrienos (por ejemplo, leucotrieno C_{4}) y estallido respiratorio (Rot, A. y col., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1992)), mediante procedimientos conocidos en la técnica u otros procedimientos adecuados. Véase, por ejemplo Bischoff. S. C. y col., Eur. J. Immunol., 23: 761-767 (1993) y Baggliolini, M. y C. A. Dahinden, Immunology Today, 15: 127-133 (1994) y referencias citadas en los mismos).

En una realización, se identifica un ligando, inhibidor y/o promotor por control de la liberación de una enzima tras la desgranulación o exocitosis por una célula capaz de esta función. Las células que contienen un ácido nucleico de la presente invención que codifica una proteína receptora activa capaz de estimular la exocitosis o desgranulación se mantienen en un medio adecuado en condiciones adecuadas, en las que se expresa el receptor y puede inducirse la desgranulación. El receptor se pone en contacto con un compuesto que se va a ensayar y se evalúa la liberación de enzimas. La liberación de una enzima hacia el medio puede detectarse o medirse usando un ensayo adecuado, tal como un ensayo inmunológico o ensayo bioquímico para determinar la actividad enzimática.

El medio puede ensayarse directamente por introducción de los componentes del ensayo (por ejemplo, sustrato, cofactores, anticuerpo) en el medio (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de que se combinen las células y el compuesto). Como alternativa, el ensayo puede realizarse en un medio que se haya separado de las células o fraccionado adicionalmente antes del ensayo.

Por ejemplo, están disponibles ensayos convenientes para enzimas tales como \beta-glucuronidasa y peroxidasa del eosinófilo (White, S. R. y col., A kinetic assay for eosinophil peroxidase activity in eosinophils and eosinophil conditioned media, J. Immunol. Methods, 144 (2): 257-63 (1991)).

La estimulación de la desgranulación por un compuesto puede ser indicativa de que el compuesto es un ligando o promotor de un receptor CKR-3 de mamífero. En otra realización, la inhibición de la desgranulación es indicativa de un inhibidor. En esta realización, las células que expresan el receptor se combinan con un ligando promotor y se añade un compuesto a ensayar antes, después o simultáneamente con el mismo.

Modelos de inflamación

Están disponibles una diversidad de modelos de inflamación in vivo no humanos que pueden usarse para evaluar los efectos de ligandos, inhibidores o promotores in vivo como agentes terapéuticos.

Por ejemplo, están disponibles modelos de primates con infiltración eosinófila en el pulmón para el ensayo in vivo (véase, por ejemplo Wegner, C. D. y col., Science, 247: 456 (1990)). En una realización, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que reacciona con CKR-3 humano y que presenta reacción cruzada con CKR-3 de primate se administra al animal. Pueden medirse varios parámetros para evaluar la eficacia in vivo incluyendo, pero sin limitación, el número de eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar, distensibilidad respiratoria y frecuencia respiratoria. Una disminución en los síntomas de hipersensibilidad de las vías respiratorias es indicativa de un beneficio terapéutico.

Además, puede usarse un modelo de oveja para asma, un modelo de cobaya para anafilaxis cutánea pasiva u otro modelo adecuado para evaluar compuestos in vivo (véase por ejemplo, Weg, V. B y col., J. Exp. Med., 177: 561 (1993); Abraham, W. M. y col., J. Clin. Invest., 93: 776 (1994)).

Además, puede controlarse la infiltración de leucocitos tras una inyección intradérmica de un compuesto en un animal adecuado, tal como un conejo, rata o cobaya (véase, por ejemplo, Van Damme J. y col., J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. y col., J. Exp. Med. 171: 2177-2182 (1990); Jose, P. J. y col., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)). En una realización, se evalúan histológicamente biopsias de piel para determinar la infiltración de leucocitos (por ejemplo, eosinófilos, granulocitos). En otra realización, se administran al animal células marcadas (por ejemplo, células transfectadas de forma estable que expresan un receptor CKR-3 marcado con ^{111}In, por ejemplo) capaces de quimiotaxis y extravasación. La infiltración de células en respuesta a una inyección de una muestra de ensayo (por ejemplo, un compuesto a ensayar en un tampón o vehículo fisiológico adecuado) es indicativa de la presencia de un ligando o promotor, tal como un agonista, en la muestra. Estos ensayos también pueden modificarse para identificar inhibidores de quimiotaxis y extravasación de leucocitos. Por ejemplo, puede administrarse un inhibidor, antes, simultáneamente con o después de que se administre un ligando o agonista al animal de ensayo. Una disminución en el grado de infiltración en presencia de inhibidor en comparación con el grado de infiltración en ausencia de inhibidor es indicativa de inhibición.

Aplicaciones de diagnóstico

La presente invención tiene una diversidad de aplicaciones de diagnóstico. Estas aplicaciones incluyen, pero no se limitan necesariamente a las aplicaciones analizadas en este documento.

Una mutación o mutaciones en genes que codifican un receptor CKR-3 de mamífero pueden causar deficiencias en al menos una función del receptor codificado, reduciendo o aumentando por lo tanto la función del receptor. Por ejemplo, las mutaciones que producen una variante del receptor o alteran el nivel de expresión pueden reducir o aumentar la función del receptor, reduciendo o aumentando los procesos inflamatorios mediados por el receptor.

Por ejemplo, los procedimientos para detectar o medir la función del receptor pueden usarse para caracterizar la actividad de receptores en células (por ejemplo, leucocitos) de un individuo o de receptores aislados de dichas células. En estos ensayos, puede valorarse una función de receptor reducida o aumentada.

Los ácidos nucleicos de la presente invención proporcionan reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores de PCR) que pueden usarse para explorar, caracterizar y/o aislar un gen de receptor CKR-3 de mamífero defectuoso que codifique un receptor que tenga una actividad reducida o aumentada. Pueden emplearse procedimientos convencionales de exploración de un gen defectuoso, por ejemplo. Un gen defectuoso y la actividad del receptor codificado pueden aislarse y expresarse en una célula huésped adecuada para una evaluación adicional, como se describe en este documento, para receptores CKR-3 de mamífero. Varias enfermedades humanas se asocian con deficiencias en la función de un receptor acoplado a proteína G (Clapham, D. E., Cell, 75: 1237-1239 (1993); Lefkowitz, R. J., Nature, 365: 603-04 (1993)).

Los anticuerpos de la presente invención tienen aplicación en procedimientos en los que el receptor puede detectarse en la superficie de las células. El receptor proporciona un marcador de los tipos celulares de leucocitos en los que se expresa, particularmente en eosinófilos. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos generados contra una proteína o péptido receptor para realizar un recuento de las células que expresan el receptor. Pueden usarse recuentos celulares en el diagnóstico de una diversidad de enfermedades o afecciones en las que se observan tipos celulares leucocitarios aumentados o disminuidos (por ejemplo, hipereosinofilia, por ejemplo, en el síndrome hipereosinófilo; hipoeosinofilia). La presencia de un nivel aumentado de eosinófilos en una muestra obtenida de un individuo puede ser indicativa de infiltración de eosinófilos debida a una enfermedad o afección inflamatoria, tal como asma, o una infección tal como una infección parasitaria. Como alternativa, o además, los anticuerpos pueden usarse para separar células que expresen receptor de entre una mezcla de células. Pueden usarse con este fin procedimientos adecuados para el recuento y/o separación de células (por ejemplo, citometría de flujo, separación de células activadas por fluorescencia).

Además, los anticuerpos pueden usarse para detectar o medir una expresión disminuida o aumentada de receptor en diversas enfermedades o afecciones en las que se alteran procesos inflamatorios de leucocitos (por ejemplo, se aumentan o disminuyen con respecto a un control adecuado, tal como el nivel de expresión en un individuo normal). Por ejemplo, pueden obtenerse leucocitos (por ejemplo, eosinófilos, linfocitos tales como linfocitos T, monocitos, basófilos) a partir de un individuo y puede usarse un ensayo inmunológico adecuado (por ejemplo, ELISA, análisis de FACS) para evaluar el nivel de expresión. El nivel de expresión de un receptor CKR-3 de mamífero puede usarse en el diagnóstico de una enfermedad o afección en el que esté presente una expresión aumentada o disminuida de un receptor CKR-3 de mamífero.

Animales transgénicos no humanos

Pueden construirse animales transgénicos no humanos en los que el genoma del huésped animal se modifica usando técnicas de ADN recombinante. En una realización, la alteración no es heredable (por ejemplo, se modifican células somáticas, tales como células progenitoras en la médula ósea). En otra realización la alteración es heredable (se modifica la línea germinal). Pueden construirse animales transgénicos no humanos usando técnicas convencionales u otros procedimientos adecuados (véase, por ejemplo, Cooke. M. P. y col., Cell, 65: 281-291 (1991) con respecto a la alteración de linfocitos T; Hanahan, D., Science, 246: 1265-1275 (1989)).

En un aspecto, puede inactivarse o inutilizarse un gen de receptor CKR-3 de mamífero endógeno, en su totalidad o en parte, en un huésped animal no humano adecuado (por ejemplo, mediante técnicas de interrupción de genes) para producir un animal transgénico no humano. Pueden usarse ácidos nucleicos de la presente invención para evaluar la construcción con éxito de un huésped que contiene un gen de CKR-3 inactivado o inutilizado (por ejemplo, mediante hibridación de Southern). Además, puede evaluarse la construcción con éxito de un huésped que contiene un gen de CKR-3 inactivado o inutilizado mediante ensayos adecuados que controlen la función del receptor codificado.

En otra realización, un ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido receptor CKR-3 de mamífero se introduce en un huésped adecuado para producir un animal transgénico no humano. En una realización preferida, se inactivan genes de receptor CKR-3 endógeno presentes en los animales transgénicos no humanos (por ejemplo, simultáneamente con la introducción del ácido nucleico mediante recombinación homologa, que interrumpe y sustituye el gen endógeno). Por ejemplo, puede producirse un animal transgénico no humano (por ejemplo, un ratón, cobaya, oveja) capaz de expresar un ácido nucleico que codifica un receptor CKR-3 de mamífero de una especie de mamífero diferente (por ejemplo, un ser humano) en leucocitos (tales como eosinófilos, linfocitos (por ejemplo, linfocitos T) y proporciona un modelo animal no humano conveniente para evaluar la función del receptor introducido. Además, puede administrarse un compuesto al animal transgénico no humano y puede controlarse el efecto del compuesto sobre un proceso inflamatorio mediado por receptor en un ensayo adecuado (véase, por ejemplo Weg, V. B. y col., J. Exp. Med., 177: 561 (1993); Abraham, W. M. y col., J. Clin. Invest., 93: 776 (1994)). De esta forma, pueden identificarse o evaluarse compuestos que inhiben o promueven la función del receptor para determinar su efecto
in vivo.

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Procedimientos de terapia

La modulación de una función de receptor CKR-3 de mamífero de acuerdo con la presente invención, a través de la inhibición o estimulación de al menos una función característica de un receptor CKR-3 de mamífero, proporciona una forma eficaz y selectiva de inhibir o promover una acción inflamatoria mediada por leucocitos. Uno o más ligandos, inhibidores y/o promotores de una función de receptor CKR-3, tales como los identificados que se describen en este documento, pueden usarse para modular la función leucocitaria con fines terapéuticos.

Como receptores de quimioquinas principales de eosinófilos y linfocitos, los receptores CKR-3 de mamífero proporcionan una diana para interferir con o promover la función de eosinófilos y/o linfocitos en un mamífero, tal como un ser humano. Consecuentemente, se observa una colocalización de células T y eosinófilos en ciertos infiltrados inflamatorios. Por lo tanto, son particularmente útiles compuestos que inhiben o promueven la función del receptor CKR-3, tales como ligandos, inhibidores y promotores identificados de acuerdo con el presente procedimiento, para modular la función de eosinófilos y/o linfocitos con fines terapéuticos.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir o promover una respuesta inflamatoria en un individuo que necesite dicha terapia, que comprende administrar un compuesto que inhibe o promueve la función del receptor CKR-3 de mamífero en un individuo que necesite dicha terapia.

En una realización, se administra un compuesto que inhibe una o más funciones de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 humano) para inhibir (es decir, reducir o prevenir) la inflamación. Como resultado, se inhiben uno o más procesos inflamatorios, tales como emigración leucocitaria, quimiotaxis, exocitosis (por ejemplo, de enzimas, histamina) o liberación de mediadores inflamatorios. Por ejemplo, puede inhibirse la infiltración eosinófila en sitios inflamatorios (por ejemplo, en el asma) de acuerdo con el presente procedimiento.

En otra realización, se administra un compuesto que promueve una o más funciones de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 humano) para estimular (inducir o potenciar) una respuesta inflamatoria, tal como emigración leucocitaria, quimiotaxis, exoditos (por ejemplo, de enzimas, histamina) o liberación de mediadores inflamatorios, dando como resultado la estimulación beneficiosa de procesos inflamatorios. Por ejemplo, pueden reclutarse eosinófilos para combatir infecciones parasitarias.

Además de primates, tales como seres humanos, puede tratarse una diversidad de otros mamíferos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención. Por ejemplo, pueden tratarse mamíferos incluyendo, pero sin limitación, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, de roedores o murinas. Sin embargo, el procedimiento también puede realizarse en otras especies, tales como especies de aves (por ejemplo, pollos).

Pueden tratarse usando el procedimiento enfermedades y afecciones asociadas con inflamación e infección. En una realización preferida, la enfermedad o afección es una en la que las acciones de eosinófilos y/o linfocitos deben inhibirse o promoverse para modular la respuesta inflamatoria.

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Las enfermedades o afecciones de seres humanos u otras especies que pueden tratarse con inhibidores de la función del receptor CKR-3 incluyen, pero sin limitación:

\bullet enfermedades y afecciones inflamatorias o alérgicas incluyendo enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades pulmonares por hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, neumonía eosinófila (por ejemplo, síndrome de Loeffler, neumonía eosinófila crónica), enfermedades pulmonares intersticiales (ILD) (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática o ILD asociada con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis); respuestas de anafilaxis o hipersensibilidad sistémica, alergias farmacológicas (por ejemplo, a penicilina, cefalosporinas), alergias a la picadura de insectos; enfermedades inflamatorias del intestino, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; espondiloartropatías; esclerodermia; psoriasis y dermatosis inflamatorias tales como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, urticaria; vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrotizante, cutánea y por hipersensibilidad);

\bullet miositis eosinófila, fascitis eosinófila;

\bullet enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, diabetes de comienzo juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Behcet;

\bullet rechazo de injertos (por ejemplo, en un transplante), incluyendo rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped;

\bullet cánceres con infiltración leucocitaria de la piel o de órganos;

\bullet pueden tratarse otras enfermedades o afecciones en las que se deben inhibir respuestas inflamatorias indeseables, incluyendo, pero sin limitación, lesión por reperfusión, aterosclerosis, ciertos tumores malignos hematológicos, toxicidad inducida por citoquinas (por ejemplo, choque séptico, choque endotóxico), polimiositis, dermatomiositis.

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Las enfermedades o afecciones de seres humanos u otras especies que pueden tratarse con promotores de la función del receptor CKR-3 incluyen, pero sin limitación:

\bullet inmunosupresión, tal como la de individuos con síndromes de inmunodeficiencia tales como el SIDA, individuos que se estén sometiendo a una terapia con radiación, quimioterapia, terapia para una enfermedad autoinmune u otra terapia farmacológica (por ejemplo, terapia con corticosteroides) que causen inmunosupresión; inmunosupresión debida a una deficiencia congénita en la función del receptor u otras causas;

\bullet enfermedades infecciosas tales como enfermedades parasitarias incluyendo, pero sin limitación, infecciones por helmintos tales como nematodos (vermes redondos); (tricuriasis, enterobiasis, ascariasis, anquilostomiasis, estrongiloidiasis, triquinosis, filariasis); trematodos (diarreas) (esquistosomiasis, clonorquiasis), cestodos (tenias) (equinococosis, infección por Taenia saginata, cisticercosis); vermes viscerales, larva migratoria visceral (por ejemplo, Toxocara), gastroenteritis eosinófila (por ejemplo, Anisaki spp., Phocanema ssp.), larva migratoria cutánea (Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum).

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Eosinófilos como la célula diana en ciertas reacciones inflamatorias, particularmente asma

Se producen eosinófilos en la médula ósea y circulan hacia los tejidos, predominantemente a tejidos mucosos, tales como los pulmones, tracto gastrointestinal y tracto genitourinario. Los eosinófilos constituyen típicamente el 1-3% de los leucocitos en la sangre. Sin embargo, en personas que padecen enfermedades alérgicas e infecciones parasitarias por helmintos se produce una acumulación aumentada de eosinófilos en los tejidos o en la sangre. La acumulación de eosinófilos puede ser tanto beneficiosa como perjudicial para el huésped.

Por ejemplo, los eosinófilos poseen numerosos gránulos que contienen proteínas catiónicas. La desgranulación de eosinófilos, desencadenada por ejemplo por el acoplamiento de receptores de IgG, IgA o IgE o por estimulación por mediadores inflamatorios tales como factor activador de plaquetas (PAF), leucotrienos o quimioquinas, conduce a la liberación de los componentes en el gránulo. Los productos de eosinófilos también causan daños a las células del huésped. Las más dañinos son las proteínas catiónicas que son detectables en concentraciones elevadas en pacientes con asma. Los eosinófilos también generan varios mediadores inflamatorios incluyendo leucotrieno C4 y factor activador de plaquetas (PAF). Estos mediadores contraen el músculo liso de las vías respiratorias, promueven la secreción de moco, alteran la permeabilidad vascular y provocan una infiltración adicional de eosinófilos y neutrófilos.

Los eosinófilos están implicados en el inicio y el mantenimiento de la diátesis alérgica/asmática. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento puede usarse para tratar estados de asma o hipersensibilidad (alérgicos), particularmente los que implican tejidos mucosos así como en otras enfermedades asociadas con eosinófilos. En una realización particularmente preferida, se administra un compuesto que inhibe una o más funciones de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, un receptor CKR-3 humano) a un individuo con asma.

Los eosinófilos son claramente importantes en la defensa del huésped frente a, y la destrucción de organismos grandes no fagocitables tales como parásitos helmínticos multicelulares. Los eosinófilos también son células efectoras importantes en reacciones inmunes contra otros patógenos que inducen altos niveles de anticuerpos IgE. Por consiguiente, el procedimiento puede usarse para tratar enfermedades infecciosas, tales como enfermedades parasitarias, para estimular o promover defensas inflamatorias o para suprimir las respuestas inflamatorias que sean destructivas para el huésped.

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Eosinófilos y patogénesis del asma

El asma se caracteriza por la obstrucción de las vías respiratorias o bronquios y es el resultado de una hipersensibilidad bronquial y de la constricción rápida en respuesta a una amplia variedad de mediadores farmacológicos. Muchos piensan que la inflamación crónica del revestimiento mucoso de los bronquios desempeña un papel fundamental en el desarrollo del asma.

Se observa una infiltración intensa de la mucosa bronquial con eosinófilos, macrófagos y linfocitos en el asma y otras hipersensibilidades. Con frecuencia la migración selectiva de eosinófilos a vías respiratorias inflamadas puede ser impresionante y parece ser el resultado de la unión selectiva de eosinófilos al endotelio y extracción desde la sangre. Los eosinófilos en particular están implicados como los agentes causales de lesiones de la mucosa bronquial. Estudios de pacientes asmáticos sugieren que los recuentos de eosinófilos en sangre se correlacionan con el grado de hipersensibilidad bronquial. Además, las biopsias bronquiales y el líquido de lavado broncoalveolar de asmáticos muestran una clara relación entre el grado de eosinofilia y la gravedad clínica. Por lo tanto, existe una fuerte relación entre la presencia de eosinófilos y las reacciones inmunes adversas, particularmente en el asma.

Un receptor de quimioquinas principal en eosinófilos y linfocitos que funciona en la quimiotaxis, extravasación y activación selectiva de leucocitos en respuesta a un quimioatrayente proporciona una diana excelente para interferir con el reclutamiento de eosinófilos. Por ejemplo, la administración de un inhibidor de al menos una función de un receptor CKR-3 de mamífero (por ejemplo, ser humano), tal como por inhibición de la unión de quimioquina al mismo, puede proporcionar una forma eficaz y selectiva de tratar el asma. Reduciendo o impidiendo el reclutamiento (extravasación, infiltración) de leucocitos, particularmente eosinófilos, hacia tejidos pulmonares y de las vías respiratorias inflamados, y/o reduciendo la función de leucocitos en esos tejidos, pueden inhibirse los procesos inflamatorios destructivos del asma y aliviarse los síntomas.

Existen pruebas de que el bloqueo del reclutamiento de eosinófilos hacia los pulmones puede aliviar los síntomas del asma. Se describió que la administración de un anticuerpo monoclonal reactivo con integrina \alpha4 inhibía la acumulación de eosinófilos en los pulmones y vías respiratorias y bloqueaba la hipersensibilidad de las vías respiratorias a la exposición a antígenos en ovejas. En un modelo de asma en primate, se describe que un anticuerpo monoclonal contra ICAM-1 atenúa la eosinofilia y la hipersensibilidad de las vías respiratorias. Además, en un modelo de cobaya para anafilaxis cutánea pasiva, se describió que el pretratamiento in vitro de eosinófilos con el monoclonal anti-\alpha4 suprimía la acumulación de eosinófilos. (Véase Wegner, C. D. y col., Science, 247: 456 (1990); Weg, V. B. y col., J. Exp. Med., 177: 561 (1993); y Abraham, W. M. y col., J. Clin. Invest., 93: 776 (1994) en relación con estos
modelos).

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Modos de administración

De acuerdo con el procedimiento, pueden administrarse uno o más compuestos al huésped mediante una vía apropiada, en solitario o en combinación con otro fármaco. Se administra una cantidad eficaz de un compuesto (por ejemplo, un péptido receptor que inhibe la unión a ligando, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo). Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para conseguir el efecto terapéutico deseado en las condiciones de administración, tal como una cantidad suficiente para la inhibición o estimulación de una función del receptor CKR-3 y, por lo tanto, la inhibición o estimulación, respectivamente, de una respuesta inflamatoria.

Son posibles una diversidad de vías de administración incluyendo, pero no necesariamente limitadas a vías de administración oral, dietética, tópica, parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea), por inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales) dependiendo de la enfermedad o afección que se trate. Para enfermedades alérgicas respiratorias tales como el asma, la inhalación es un modo preferido de administración.

La formulación de un compuesto que se va a administrar variará de acuerdo con la vía de administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsión, cápsula). Puede prepararse una composición apropiada que comprende el compuesto que se va a administrar en un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes o reemplazos de líquidos, nutrientes o electrolitos (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, 16ª Edición, Mack, Ed. 1980). Para inhalación, el compuesto puede solubilizarse y cargarse en un dispensador adecuado para la administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado).

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Ejemplificación

La presente invención se ilustrará ahora mediante los siguientes Ejemplos, que de ningún modo pretenden ser limitantes.

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Ejemplo 1

Propiedad quimiotáctica de eosinófilos humanos y una línea celular de tipo eosinófilo Quimiotaxis de eosinófilos humanos

Para identificar antagonistas de un receptor o receptores eosinófilos de quimioquina, es necesario identificar las quimioquinas importantes para la quimiotaxis de eosinófilos, y determinar el receptor o receptores a los que se unen estas quimioquinas. Se realizaron experimentos de quimiotaxis en un ensayo de quimiotaxis sensible y mejorado, que emplea una línea celular endotelial cultivada en la membrana de policarbonato del pocillo de quimiotaxis.

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Aislamiento de eosinófilos

Se diluyeron 100 ml de sangre heparinizada 1:1 con PBS. Se estratificaron alícuotas de 20 ml sobre gradientes de fase de Percoll al 65%, 75%. Se centrifugaron los gradientes a 1500 rpm, 25 min a temperatura ambiente. Las capas de eosinófilos/neutrófilos se transfirieron a un tubo nuevo y se lisaron los eritrocitos añadiendo 20 ml de NaCl al 0,2% durante 1 min, seguido de la adición de 30 ml de NaCl al 1,8%. Se lavaron las células dos veces con un tampón constituido por PBS, BSA al 0,5%, EDTA 0,5 mM. Se resuspendieron las células a 5 x 10^{7}células/50 \mul en tampón frío (PBS, BSA al 0,5%, EDTA 0,5 mM) y se añadieron a las células 50 \mul de microperlas cD16. Se incubó la mezcla a 4ºC durante 25 min seguido de la adición de 900 \mul de tampón frío. Se usó la unidad de separación miniMACS^{TM} (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn CA 95603) para reducir las células positivas a CD16 (neutrófilos) Se cargaron las células en la columna en alícuotas de 200 \mul. Se recogieron células del flujo a través y se evaluaron histológicamente. La preparación de eosinófilos tenía una pureza >99%.

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Ensayo de quimiotaxis

Se obtuvieron quimioquinas en Peprotech, Inc. (Rocky Hill, N. J.). Los experimentos de quimiotaxis se realizaron usando separadores de cultivo celular Biocoat de 3.0 micras (Collaborative Biomedical Products), en placas de 24 pocillos. Las células endoteliales se cultivaron hasta confluencia en los separadores durante dos días antes de los experimentos de quimiotaxis. Las células endoteliales usadas eran una línea celular denominada ECV 304 (Colección Europea de Cultivos de Células Animales, Porton Down, Salisbury, Reino Unido), que expresan marcadores de células endoteliales tales como factor von Willebrand, así como ICAM-1 y VCAM-1. Esta línea de células endoteliales facilita enormemente estos ensayos, ya que las células endoteliales de vena umbilical humana pueden ser de naturaleza variable, pueden usarse sólo para varios pases y crecen mucho más lentamente que las ECV 304. El ensayo se llevó a cabo a 37ºC durante 1,5 horas y se realizó un recuento de las células migradas usando un microscopio
invertido.

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Resultados

Los resultados, presentados en la Figura 4, son representativos de al menos cinco experimentos. El cultivo de células endoteliales ECV 304 en la membrana de policarbonato reducía la migración de fondo casi completamente. Los eosinófilos aplicados a ensayos de quimiotaxis transendotelial mostraron migración hacia varias quimioquinas, particularmente RANTES, MCP-3 y en un grado menor MCP-1. MIP-1\beta, IL-8, MCP-2 e IP-10 tuvieron escaso efecto sobre la quimiotaxis de eosinófilos. La MIP-1\alpha era quimiotáctica para eosinófilos en algunos experimentos, aunque generalmente era inactiva. En estos experimentos, se usó un intervalo de concentraciones de quimioquinas, debido a la variabilidad en la sensibilidad de leucocitos a quimioquinas diferentes y a las dudas sobre la calidad de las preparaciones de quimioquinas. Un descubrimiento constante era el elevado nivel de quimiotaxis de eosinófilos para RANTES y MCP-3.

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Inducción de quimiotaxis por RANTES en células HL-60 diferenciadas con butirato

Es difícil aislar eosinófilos en cantidades suficientes de sangre humana para usarse para muchos estudios, particularmente exploración de alto rendimiento. Las líneas celulares de tipo eosinófilo pueden proporcionar un sustituto para eosinófilos. Algunos laboratorios han descubierto que las células HL-60 pueden diferenciarse hacia una ruta eosinófila (Tagari. P. y col., Int. Arch. Allergy Immunol., 101: 227-233 (1993); Van Riper, G. y col., J. Immunol., 152: 4055-4061 (1994)). Se ensayaron células HL-60 para determinar si dichas células podían emular las propiedades quimiotácticas de los eosinófilos.

Se resuspendieron células HL-60 en RPMI (sin HEPES) + suero fetal de ternera (FCS) a 0,5 x 10^{6} células/ml. Se añadió ácido n-butírico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; #B5887) a una concentración final de 0,4 mM a partir de una solución madre de ácido n-butírico 1 M. Se incubaron células HL-60 a 37ºC, CO_{2} al 5% durante cuatro días. La naturaleza de tipo eosinófilo de estas células HL-60 se indica por la inducción de sensibilidad a RANTES y MCP-3 en ensayos de quimiotaxis (Figuras 5A-5B). Además, los estudios de unión a ligando así como los análisis de transferencia de northern de expresión de receptor de quimioquina (véase a continuación) confirmaron que se inducían en estas células HL-60 diferenciadas receptores de quimioquinas que son similares a los de eosinófilos.

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Ejemplo 2

Identificación de un receptor de quimioquina eosinófilo principal Selección y diseño de cebadores

Se alinearon y se compararon cinco genes de receptores de quimioquinas para generar un conjunto de oligonucleótidos degenerados para usar en la clonación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) de nuevos receptores de quimioquinas de eosinófilos. La selección de estos cinco genes de receptores se basaba en el tipo de ligando de quimioquina con el que se unen (receptor A de ll-8 (IL8RA), receptor B de II-8 (IL8RB), receptor de MIP-1\alpha (MIP1\alphaR)) o en receptores huérfanos con una similitud de secuencia significativa con estos receptores cuya expresión se ha descrito que está limitada a células o tejidos linfoides (receptor inducible por Epstein Barr 1 (EBl1R) y Receptor de linfoma de Burkitt 1 (BLR1)). Las secuencias de los receptores se alinearon a mano basándose en varios alineamientos publicados (IL-8RA, Holmes y col., Science, 253: 1278-1280 (1991); IL-8RB, Murphy, P. A. y col., Science, 253: 1280-1283 (1991); MIP1\alpha/RANTES, Neote, K. y col., Cell, 72: 415-425 (1991); EBI1R, Birkenbach, M y col., J. Virol., 67: 2209-2220 (1993) y BLR1 (Dobner, T. y col., Eur. J. Immunol., 22: 2795-2799 (1992)).

Se seleccionaron secuencias dentro de las regiones transmembrana (TM) 2, 6 y 7, así como una región justo C-terminal a la TM3, como dianas para el diseño de oligonucleótidos degenerados en base al alto grado de similitud de secuencia. En la siguiente Tabla se ilustran las secuencias de nucleótidos de los cebadores oligonucleotídicos degenerados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA Conjunto de cebadores 2

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1

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Aislamiento y purificación de eosinófilos

Se diluyeron 100 ml de sangre heparinizada 1:1 con PBS. Se estratificaron alícuotas de 20 ml en gradientes de fase de Percoll al 65%, 75%. Se centrifugaron los gradientes a 1500 rpm, 25 min a temperatura ambiente. Las capas de eosinófilos/neutrófilos se transfirieron a un tubo nuevo y se lisaron los eritrocitos añadiendo 20 ml de NaCl al 0,2% durante 1 min, seguido de la adición de 30 ml de NaCl al 1,8%. Se lavaron las células dos veces con una solución salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5%, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mM. Se resuspendieron las células a 5 x 10^{7}células/50 \mul en tampón frío (solución de PBS, BSA, EDTA) y se añadieron a las células 50 \mul de microperlas CD16. Se incubó la mezcla a 4ºC durante 25 min, seguido de la adición de 900 \mul de tampón frío. Se usó la unidad de separación miniMACS^{TM} (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA 95603) para reducir las células positivas a CD16 (neutrófilos) Se cargaron las células en la columna en alícuotas de 200 \mul. Se recogieron las células del flujo a través y se evaluaron histológicamente. Mediante estos criterios, la preparación eosinófila tenía una pureza >99%.

Aislamiento de ARNm y PCR

Se extrajo ARNm para RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) directamente de células purificadas usando el kit de aislamiento de ARNm Micro-FastTrack^{TM} adquirido en Invitrogen. La calidad del ARNm se evaluó mediante amplificación por PCR del ARNm de \beta-actina y/o GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) antes de usarlo con cebadores degenerados 7TMS.

Se realizó una transcripción inversa de 20-50 ng de ARNm usando un kit de PCR de ARN GeneAmp® (Perkin-Elmer) con oligo dT y/o hexámeros aleatorios como cebadores en un volumen final de 20 \mul, según lo especificado por el fabricante. Se mezclaron 2-5 \mul de este ADNc (mensaje de eosinófilo sometido a transcripción inversa) con dNTP 200 \muM y 50-100 pmol de cebadores degenerados en un volumen de 50 \mul. Para cada par cebadores se optimizó la concentración de magnesio y el pH. La concentración de magnesio variaba de 1,0 a 3,0 mM y el pH variaba de 8,5 a 10,0. Aunque también se evaluaron diversos parámetros de ciclado, las condiciones usadas generalmente eran similares a las siguientes: 3 ciclos: 94ºC, 30 s; 37ºC, 30 s; rampa de 2 min hasta 72ºC, 1 min, seguidos de 30 ciclos: 94ºC, 45 s; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min (rampa = aumento gradual).

Con respecto al fragmento de 201 pb aislado (véase a continuación), se usaron los pares de cebadores 2a-1 y 7-1, o los pares de cebadores 2a-1 y 3R, en una reacción de PCR (como se ha descrito anteriormente) en Tris-HCl 60 mM, pH 9,5 y MgCl_{2} 1,5 mM. Se usó un \mul de producto de cada reacción en una ronda de PCR distinta (segunda) con los cebadores "anidados" 2a-2 y 3R. (Los cebadores "anidados" son cebadores que hibridan con secuencias dentro de los cebadores externos). Las condiciones de reacción para la PCR anidada fueron exactamente como las descritas para la primera PCR.

Los productos de PCR se evaluaron y se separaron por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de un tamaño apropiado se purificaron y se subclonaron usando el kit de clonación pCR-Script^{TM} SK+ (Stratagene). (Los tamaños de fragmento apropiados son los siguientes: para una PCR con los pares de cebadores de las regiones 2a y 7 (véase la Tabla anterior), -700 pb; para una PCR con cebadores de la región 2a y cebador 3R, -200 pb; para una PCR con cebador 3F y cebadores de la región 6b, -400 pb, y para una PCR con cebador 3F y cebadores de la región 7, ~550 pb). Los tamaños de fragmentos esperados se predijeron en base a la hipótesis de que una proteína receptora relacionada compartiría cierta similitud estructural.

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Ensayo de exploración rápida

Para explorar rápidamente un gran número de clones para nuevos miembros de la familia 7TMS, los insertos de colonias bacterianas obtenidos como se ha descrito anteriormente (es decir, transformantes de plásmidos que comprenden fragmentos de un tamaño apropiado subclonados en pCR-Script SK+) se exploraron por PCR usando los cebadores T3 y KS complementarios a la secuencia que flanquea el poliengarce de pCR-Script^{TM}. En particular, una parte de una colonia bacteriana de una transformación durante una noche se mezcló directamente con 40 \mul de una mezcla de PCR que contenía dNTP 200 \muM, Tris 20 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, 50 pmol de cada cebador y 0,25 unidades de Taq polimerasa. Las condiciones de ciclado eran 25 ciclos: 94ºC, 20 s; 55ºC, 20 s; 72ºC, 30 s. Los insertos del tamaño correcto se identificaron evaluando 20 \mul de producto PCR en geles de agarosa al 1,5%. Los 20 \mul restantes de la reacción se digirieron con Alu I, Hha I y Rsa I (digestión triple) y se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 12% para explorar para patrones de digestión diferentes. Después, se seleccionaron clones de patrones diferentes para análisis de secuencia.

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Resultados

El análisis de secuencia de un fragmento de PCR generado a partir de oligonucleótidos degenerados identificó un clon de ADNc parcial de 201 pb en pCR-Script. (Los oligonucleótidos degenerados eran: 2a-1, 2a-2, 3F, 3R y 7-1). Se descubrió que este clon parcial, designado Eos L2 (también denominado L2 y EL2), tenía una similitud de aminoácidos del 78,3% (similitud de ácido nucleico del 81,1%) con el receptor de MIP1\alpha/RANTES y una similitud de aminoácidos del 60,8% (similitud de ácido nucleico del 61,6%) con el receptor de MCP-1. Una búsqueda de las bases de datos de secuencia más corrientes reveló que este clon parcial era único.

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Análisis de Southern y Northern

El fragmento de PCR se marcó y se usó para sondar transferencias tanto de Southern como de Northern. Para preparar la sonda de PCR, se liberó el fragmento de 201 pb del vector pCR-Script con las enzimas de restricción EcoRI y Not I. Esta digestión dio como resultado un fragmento de 240 pb compuesto por el fragmento de 201 pb más 39 pares de bases del poliengarce del vector. El fragmento se separó del vector por electroforesis a través de un gel de agarosa, y se purificó mediante (Magic Mini Prep, Promega Corp. Madison, WI), exactamente según lo recomendado por el fabricante. Se marcaron aproximadamente 200 ng de material con el kit de marcaje de ADN cebado aleatorio adquirido en Boehringer Mannheim, siguiendo el protocolo de marcaje recomendado por el
fabricante.

Para las transferencias Southern, el ADN genómico (adquirido en Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) se digirió con una enzima de restricción durante una noche y se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% seguido de transferencia capilar a una membrana de nylon Hybond-N (Amersham). La hibridación fue en 6x SSC (el SSC 1x es cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M) que contenía solución de Denhardt 5x (la solución de Denhardt 1x es albúmina de suero bovino al 0,02%, ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%), sulfato de dextrano al 10% p/v, SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) durante una noche a 65ºC. La membrana se aclaró dos veces en SSC 2X, SDS al 0,5% a 65ºC seguido de dos lavados (de 15 minutos cada uno) en SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC.

La hibridación de Southern reveló un sólo fragmento que hibridaba fuertemente y un sólo fragmento que hibridaba débilmente con cada enzima usada. Es probable que el fragmento que hibridaba débilmente sea el receptor de MIP1\alpha1/RANTES.

Se adquirieron transferencias de Northern de múltiples tejidos en Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). También se adquirió solución ExpressHyb^{TM}_{ }en Clontech Laboratories, Inc. Las transferencias de Northern de múltiples tejidos se realizaron según lo recomendado por el fabricante. La sonda era como la descrita anteriormente para las transferencias de Southern. Los resultados de la hibridación de Northern mostraron elevados niveles de un mensaje de 1,6 kb en el bazo, leucocitos de sangre periférica y timo. Se presentan análisis de Northern adicionales en el Ejemplo 5.

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Exploración de genoteca genómica

Se exploró una biblioteca de fagos genómica humana construida en el vector EMBL3 SP6/T7, adquirido en CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), con el fragmento de PCR de 201 pb para obtener un clon de longitud completa. Se mezclaron aproximadamente 25.000 unidades formadoras de placas con 600 \mul de un cultivo bacteriano de una noche la cepa K802 de E. coli, proporcionada con la biblioteca en NZCYM top-agarosa, y se sembró en placas de petri de 150 mm que contenían agar NZCYM (el caldo NZYCM, el Agar y la agarosa se adquirieron en Gibco/BRL). Después de la incubación a 37ºC durante 7 horas, las placas se cubrieron con membranas de nitrocelulosa BA-85 (Schleicher y Schuell, Keene, NH) durante 5 minutos para permitir la transferencia del fago a la membrana. Después, las membranas se empaparon durante 5 minutos en solución desnaturalizante (cloruro de sodio 1,5 M, hidróxido de sodio 0,5 N), seguido de neutralización en cloruro de sodio 1,5 M, Tris 0,5 M, pH 8,0. Se dejaron secar los filtros al aire durante 15 minutos y después se hornearon durante dos horas a 80ºC al vacío. Después, se hibridaron los filtros según se ha descrito anteriormente para la transferencia de Southern. El fragmento de PCR de 201 pb contenía los nucleótidos entre los cebadores oligonucleotídicos 2a-2 (TM2) y 3R (TM3).

Un clon de fago de genómico, designado Eos L2.8, contenía un inserto que comprende el fragmento Hind III de 1,8 kb observado en transferencias de Southern (el tamaño de inserto completo no se determinó, pero es de -17 kb).

El clon de fago Eos L2.8 se digirió con la enzima de restricción Hind III y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa. Se cortó un fragmento Hind III de aproximadamente 1,8 kb se cortó, se electroeluyó de la agarosa, se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El fragmento de 1,8 kb se resuspendió en agua y se ligó en el sitio Hind III del vector pBluescript II KS+ (Stratagene), seguido de la transformación en células competentes DH5\alpha adquiridas en Gibco/BRL.

Se secuenciaron ambas cadenas de este fragmento Hind III, y se descubrió que el fragmento contenía la región codificante de aminoácidos completa para el receptor Eos L2 (un receptor CKR-3 humano). La comparación de esta secuencia y del clon de ADNc que se describe a continuación indica que el clon es un clon de longitud completa. La fase de lectura abierta de 1065 nucleótidos codifica una proteína de 355 aminoácidos (SEC ID Nº: 2) con una masa molecular predicha de 41 Kd.

La comparación de la secuencia del receptor Eos L_{2} de longitud completa con receptores de MIP1\alpha/RANTES y MCP-1 reveló una similitud de aminoácidos del 73,4% y del 60,5%, respectivamente. Para esta comparación las secuencias se alinearon a mano y el número de aminoácidos similares, dividido por el número total de aminoácidos se multiplicó por 100).

Las secuencias también se alinearon mediante el procedimiento Clustal usando MegAlign^{TM} (DNASTAR, Inc.). La comparación con otras secuencias de receptores de quimioquinas reveló una similitud de secuencia de aminoácidos del 62%, 47% y 41% con CKR-1, CKR-2B y CRK-4, respectivamente. Por el contrario, la similitud de secuencia de aminoácidos con los receptores de IL-8 A y B era únicamente del 27% para ambos receptores. La similitud de secuencia de este receptor con receptores de MIP1\alpha/RANTES y MCP-1, ambos receptores de quimioquina C-C, concuerda con los resultados descritos en este documento que indican que Eos L2 es un receptor de quimioquina
C-C.

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Ejemplo 3

Expresión de Eos L2 en líneas celulares transfectadas Construcción del receptor Eos L2 (CRK-3) marcado con FLAG

Se construyó una proteína de fusión de receptor Eos L2 como se indica a continuación:

1. Se realizó una digestión doble con Hind III y EcoRI de una construcción de receptor PAF-FLAG en pCDM8 (construida según se describe en Kunz, D. y col., J. Biol. Chem., 267: 9101-9106) para liberar un fragmento de 48 pb que contiene los nucleótidos que codifican el péptido FLAG. La secuencia de nucleótidos es AAGCTTCCA GCA GCC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAA GAATTC (SEC ID Nº: 15). La secuencia de aminoácidos es MDYKDDDDKEF (SEC ID Nº: 16). El fragmento Hind III/EcoRI de 48 pb que contiene los nucleótidos de FLAG subclonado en los sitios HindIII/EcoRI del vector pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) dan origen al pcDNA3/FLAG.

2. El vector pBluescript II KS+ que contiene el fragmento Hind III de Eos L2 de 1,8 kb se digirió con BamHI y Xho I para liberar un fragmento de 1,261 kb. Este fragmento BamHI-XhoI contiene nucleótidos que codifican 91 aminoácidos de Eos L2 por el codón de terminación más la misma región no traducida 3' y 21 pb del vector pBluescript II KS+.

3. Se generaron dos cebadores de PCR para amplificar el extremo 5' del gen de Eos L2, pero eliminando la primera Met e introduciendo por ingeniería genética un sitio EcoRI que sea compatible con el sitio EcoRI descrito anteriormente en la etapa 1. El cebador 5' (SEC ID Nº: 17) era:

100

Este cebador contiene un sitio EcoRI y los 17 primeros nucleótidos del gen de EosL2 excepto por el codón Met. El cebador 3' (SEC ID Nº: 18) era:

101

Estos cebadores ceban en el gen de Eos L2 justo 3' al sitio BamHI. La amplificación con estos dos cebadores usando el vector pBluescript II KS+ que contiene el fragmento de Eos L2 de 1,8 kb como molde amplificará un fragmento de 280 pb que contiene el extremo 5' del Eos L2 que puede digerirse con EcoRI y BamHI para dar un fragmento para ligación, como se describe a continuación.

Las condiciones de amplificación eran: se combinaron 100 ng de pBluescript II KS+ que contenía el fragmento de EosL2 de 1,8 kb con dNTP 200 \muM y 50 pmol de cebadores en un volumen de reacción de 50 \mul. La concentración final de magnesio era de 2,5 \muM y el pH era de 8,0. Se amplificó el fragmento con 25 ciclos de 94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s; 72ºC 30 s. El producto amplificado se separó en un gel de agarosa y se purificó por electroelución como se ha descrito anteriormente. El fragmento se digirió con EcoRI y BamHI y se purificó de nuevo en un gel de agarosa.

4. Para la construcción del gen de EosL2 marcado con FLAG, el vector pcDNA3 que contenía el fragmento FLAG (descrito en la etapa 1) se digirió con EcoRI y Xho I. El fragmento de vector (un fragmento EcoRI-XhoI que comprendía la secuencia codificante de FLAG) se separó del fragmento de poliengarce por electroforesis, y el fragmento de vector se purificó como se ha descrito para otros fragmentos electroeluidos. El fragmento de vector se combinó con el fragmento EcoRI-BamHI generado por PCR en la etapa tres. Estos dos fragmentos se combinaron con el fragmento BamHI-XhoI de 1,261 kb de la etapa dos. Se realizó una ligación triple de los tres fragmentos entre sí para producir el receptor Eos L2 marcado con FLAG en pcDNA3. El ADN ligado se transformó en DH5\alpha.

Transfectantes transitorios

Se cultivaron células 293 (Nº de Acceso ATCC CRL 1573) en Medio Alfa-Medio Esencial Mínimo (MEM) obtenido en Gibco/BRL y complementado con suero fetal de ternera al 10%, Glutamina y Penicilina/Estreptomicina (todos de Gibco/BRL). Para cada transfección transitoria, se sembraron en placas 2 x 10^{6} células 293 1 día antes de la transfección en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm. El día de la transfección, las células (que crecen adheridas a la placa) se lavaron 1 x con Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS, Gibco/BRL) y se aplicó a las células una mezcla de ADN y reactivo lipofectAMINE^{TM} (Gibco/BRL).

La mezcla de ADN/reactivo lipofectAMINE^{TM} se realizó incubando 2 \mug de vector de expresión de receptor Eos L2 marcado con Flag en un volumen final de 100 \mul de OptiMEM^{TM} (Gibco/BRL) con 12 \mul de reactivo LipofectAMINE^{TM} en un volumen de 100 \mul durante 45 minutos a temperatura ambiente. El volumen de mezcla final es de 200 \mul. Después de 45 minutos de incubación, se añaden 800 \mul de OptiMEM^{TM} a los 200 \mul de ADN/reactivo lipofectAMINE^{TM} y el 1 ml de solución se estratifica sobre las células como se ha descrito anteriormente. Después, se incubaron las células a 37ºC durante 5 horas, momento en el que se añade 1 ml de Medio Alfa-MEM complementado, como se ha descrito anteriormente. Después, se incubaron las células durante 12 horas más, momento en el que se retira todo el medio y las células se lavan 2 x con PBS y se añaden 2 ml de medio Alfa-MEM complementado, como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas se incuban después durante 72 horas más. Las células se recogen pipeteándolas con cuidado después de la incubación en PBS EDTA 10 mM.

Se demostró expresión en superficie celular de un receptor Eos L2 marcado con FLAG en las células 293 transfectadas transitoriamente. Aproximadamente el 2,6% de las células expresan el receptor en la superficie, como se determinó mediante tinción inmunofluorescente y análisis de FACS. Se descubrió que los niveles de expresión en algunas células eran hasta 2 logaritmos mayores que el fondo, indicando que podían conseguirse altos niveles de expresión en esta línea celular. Como el gen de Eos L2 lo lleva el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen Corp, San Diego, CA), que contiene el gen de resistencia a neomicina, pueden seleccionarse transfectantes 293 estables usando selección con geneticina (G418).

Líneas celulares estables

Se han generado más de 500 líneas estables de células pre-B L1-2 de ratón con el receptor marcado con FLAG. Se obtuvieron células pre-B L1-2 del Dr. Eugen Dutcher, (Universidad de Stanford, Stanford, CA) y se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco/BRL), complementado con albúmina de suero bovino al 10% y Pen/Strep, piruvato sódico y \beta-mercaptoetanol. Se exploraron células de más de 200 clones para expresión en superficie mediante tinción con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), seguido de anti-Ig de ratón-FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) y se analizaron mediante separación de células activadas por fluorescencia (FACS). La tinción inmunofluorescente y el análisis de FACS se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Coligan, J. y col., Eds., (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY). Los resultados del análisis de FACS para varias líneas celulares revelaron varios clones que expresan altos niveles del receptor Eos L2 marcado (Figura 6). Las células sin transfectar (no se muestran) fueron negativas para la tinción. Pueden usarse líneas celulares estables con alto nivel de expresión como inmunógenos para la producción de anticuerpos reactivos con el receptor Eos L2. Además, estas líneas celulares son útiles para el estudio de la quimiotaxis y la unión a ligando.

Expresión de baculovirus

Para la construcción de un vector de expresión de baculovirus, el receptor Eos L2 marcado con Flag en pcDNA3 se digirió con HindIII para eliminar el gen marcado con Flag. Se enromaron los extremos del fragmento HindIII que contenía el gen rellenando los salientes con el fragmento Klenow y dNTP. El fragmento de extremos romos se subclonó en el sitio Sma I de pVL1393 (Invitrogen). Se mezclaron 2,0 \mug del vector pVL1393 que contenía el gen de Eos L2 con 0,5 \mug de ADN viral de AcMNPV (Invitrogen) y se co-transfectaron en células de insecto Sf9 (Invitrogen) con Insectin^{TM} (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio SF-900 (sin suero) se sustituyó con 5 ml de medio de cultivo SF-9 (Medio de Células de Insecto de Grace Complementado) (Gibco/BRL) que contenía suero fetal de ternera al 10%) al día siguiente, y se permitió que las células crecieran durante cinco días. El virus recombinante se purificó por formación de placas según se describe en D. R. O'Reilly, L. K., Miller, y V. A. Luckow (1994) Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, págs. 149-158.

La expresión del receptor Eos L2 se obtuvo en células Sf9 infectando células Sf9 con el virus recombinante purificado por formación de placas descrito anteriormente. Se infectaron las células Sf9 (2 x 10^{6} células/ml) a una multiplicidad de infección de 10:1. La infección se desarrolló durante 72 horas, momento en el que se tiñeron las células con el anticuerpo anti-FLAG M2.

También se consiguió la expresión exitosa de este receptor con un sistema de expresión de baculovirus en células Sf9. Se han conseguido buenos niveles de expresión en base a la tinción con anticuerpo anti-FLAG (véase Ejemplo 5). También se consiguió la unión a ligando con los mismos transfectantes de células Sf9 que se demostró por FACS que estaban expresando receptor. Aunque se demostró expresión en superficie celular definitiva mediante exclusión con yoduro de propidio, la expresión en estas células parecía ser baja, comparada con un control negativo (es decir, células Sf9 transfectadas con un vector de expresión que carece del inserto del gen de Eos L2). Puede disminuirse la duración de la infección y puede optimizarse adicionalmente la MOI, para una mayor expresión en superficie celular.

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Ejemplo 4

Estudios de unión a ligando Procedimiento de unión a ligando

Se lavaron células transfectadas con receptores Eos L2 o eosinófilos humanos normales purificados (véase anteriormente) en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS), después se resuspendieron en tampón de unión: HEPES 50 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, Albúmina de Suero Bovino (BSA) al 0,5%, pH 7,3. En tubos de microfuga, se incubaron 5 x 10^{5} células con quimioquina radiomarcada 0,1 nM (adquirida en New England Nuclear, Massachussets) en alícuotas de 200 \mul a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las células se incubaron sólo con quimioquina radiomarcada o junto con quimioquinas sin marcar (de PeproTech) como competidores, que se usaron a las concentraciones indicadas. Al final de la incubación, las células se lavaron 3 veces en el tampón de unión, consistiendo cada lavado en una centrifugación en una microfuga a 7.000 x g durante 2 minutos. Después del lavado, los sedimentos se transfirieron a tubos LP3 y se midió la radiactividad de las células, que representaba la cantidad de unión, en un contador gamma. Todas las muestras estaban por duplicado y todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces. La representación de Scatchard se calculó a partir de los datos de unión mediante Microsoft Excell y CricketGraph en un ordenador Macintosh.

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Unión a eosinófilos humanos

Basándose en los descubrimientos de ensayos de quimiotaxis (véase el Ejemplo 1), los estudios de unión a ligando se centraron en RANTES, MP-1\alpha y MCP-3. Los estudios de unión a ligando se realizaron usando quimioquinas radiomarcadas y diversas quimioquinas "frías" como competidores. Se incubaron eosinófilos humanos normales purificados con MIP-1\alpha o RANTES marcado con ^{125}I 0,1 nM en presencia o ausencia de diversas quimioquinas frías (MIP-1\alpha, RANTES, IL-8, MCP-1 o MCP-3 250 nM). Después de lavar exhaustivamente las células, se midió la unión mediante un contador gamma.

La Figura 7 es un histograma que ilustra la unión de eosinófilos humanos a RANTES y MIP-1\alpha. Estos resultados sugieren que los eosinófilos se unen sólo débilmente a MIP-1\alpha y que está unión puede inhibirse por la propia MIP-1\alpha y por otras quimioquinas de la familia \beta, por ejemplo, MCP-1, MCP-3 y RANTES (Figura 7). Por el contrario, los eosinófilos se unen a RANTES más abundantemente (Figura 7). La unión por RANTES no podía inhibirse eficazmente por una cantidad en exceso de MIP-1\alpha "fría" (Figura 8), sugiriendo que en eosinófilos, podrían distinguirse receptores para MIP-1\alpha y para RANTES.

El análisis de la representación de Scatchard reveló que hay 1,8 x 10^{3} sitios de unión a MIP-1\alpha con una afinidad de 91 pM. El análisis también reveló un receptor de menor afinidad (883 pM) para Rantes, que tiene más sitios de unión (3,6 x 10^{4}/células). En las condiciones usadas, no hubo una unión significativa de MCP-1 a eosinófilos (no se muestra), y MCP-1 no inhibió la unión de RANTES excepto a concentraciones muy elevadas (un exceso de 2.500 veces, Figura 8).

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Unión a células HL-60 diferenciadas con ácido butírico

Se usaron células HL-60 diferenciadas con ácido butírico en el ensayo de unión a ligando para determinar si estas células se comportaban del mismo modo que los eosinófilos. Se realizaron ensayos como se han descrito anteriormente, usando 0,5 x 10^{6} células HL-60 incubadas con MIP-1\alpha o RANTES marcado con ^{125}I 0,1 nM en ausencia o presencia de quimioquina fría 250 nM (MIP-1\alpha, RANTES, MCP-3, I1-8, MCP-1). En estas células, tanto la MIP-1\alpha como el RANTES se unían igual de bien y ambas presentaban inhibición cruzada entre sí (Figura 9). Esta observación concuerda con el ensayo de quimiotaxis (véase el Ejemplo 1) en el que ambas quimioquinas inducían la migración transendotelial de eosinófilos (Figura 8). Parece que durante el procedimiento de inducción, ninguno de los receptores estaba regulado ya que la unión de MIP-1\alpha y RANTES era insignificante en células HL-60 indiferenciadas (no se muestran los datos).

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Transfectantes de receptor Eos L2

Después de la clonación y expresión del receptor Eos L2, se usaron células transfectadas para ensayar la unión a varias quimioquinas. Los primeros intentos usando transfectantes 293 no tuvieron éxito, ya que la adición de quimioquinas frías interfería con la unión, un fenómeno observado por otros investigadores. Por el contrario, usando células SF9 infectadas con baculovirus, podía detectarse una buena unión a RANTES (Figura 10). Las condiciones de ensayo para células SF9 eran diferentes de las de células de mamíferos. La unión de RANTES marcado con ^{125}I 0,1 nM tuvo lugar en HEPES 50 mM, pH 7,3, MgCl_{2} 5 mM y CaCl_{2} 1 mM, complementado con BSA al 0,5%. Después de 60 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron tres veces en el tampón de unión que contenía NaCl 0,5 M, y se realizó un recuento de la radiactividad en los sedimentos celulares usando un contador gamma.

En estos ensayos de unión a ligando, el competidor heterólogo más eficaz de la unión a MIP-1\alpha o RANTES era MCP-3. De hecho, la MCP-3 también inhibía eficazmente la unión de MCP-1 a células T activadas. Por lo tanto, la MCP-3 parece unirse a CKR-1, CKR-2 y CKR-3 (CKR-1, Gao, J. L., y col., J. Exp. Med., 177: 1421-1427 (1993) y Neote, K., y col., Cell, 72: 415-425 (1993); CKR-2, Charo, I. F., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752-2756 (1994) y Myers, S. J., y col., J. Biol. Chem., 270: 5786-5792 (1995)).

También se usó MCP-3 radiomarcada (Preprotech, Inc. Rocky Hill, N. J.) para estudios de unión. Las Figuras 11A-11B son gráficas que ilustran la unión de MCP-3 a células HL-60 diferenciadas. La unión de MCP-3 se realizó como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. Se incubaron células con MCP-3 marcada con ^{125}I 0,1 nM. El tampón de unión usado era HBSS más BSA al 0,5% y azida sódica al 0,1%. La unión tuvo lugar a 37ºC durante 30 min. El isótopo no unido se separó centrifugando las células a través de 800 \mul de sacarosa al 20%, a 12.000 x g durante 2 min. Después los tubos se congelaron instantáneamente en nieve carbónica, se cortaron las puntas con unas tenazas y se realizó un recuento.

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Ejemplo 5

Expresión del receptor de quimioquina eosinófilo

Para confirmar que el receptor Eos L2 es el receptor funcional en eosinófilos, se evaluó la expresión del receptor mediante (a) análisis de transferencia de Northern y (b) citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales anti-anticuerpos peptídicos reactivos con el receptor.

Purificación de eosinófilos, neutrófilos y PBMC humanas

Se aislaron eosinófilos de sangre heparinizada de individuos con altos niveles de eosinófilos en sangre circulante (5-17%) mediante centrifugación en gradiente de densidad y selección negativa con perlas magnéticas anti-CD16 combinadas (Hansel, T. T. y col., J. Immunol. Meth., 122: 97 (1989)). En resumen, la fracción de granulocitos de la centrifugación en Percoll se incubó con microperlas CD16 (Miltenyi Biotec, Inc., Sunnyvale, CA) durante 30 minutos. Después se hizo pasar las células a través de una columna MACS (Miltenyi Biotec. Inc.), y se recogieron los eosinófilos en el flujo a través. Se demostró histológicamente que los eosinófilos tenían una pureza >99%, según se determinó por análisis de preparaciones de citocentrifugación teñidas con Diff-Quick mediante microscopía óptica.

Se aislaron neutrófilos humanos de sangre venosa heparinizada por centrifugación en gradiente de densidad de Percoll (\delta = 1,088) a temperatura ambiente (Coligan y col., Eds., 1992, Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons: Nueva York, NY)). Se eliminaron los RBC por lisis hipotónica.

Se aislaron también PBMC como se describe (Coligan y col., Eds., 1992, Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons: Nueva York, NY)). Se purificaron monocitos por selección positiva de CD14 con perlas magnéticas y se purificaron células T por paso de linfocitos sobre lana de nylon. Para generar blastos con CD3 se añadieron 2 X 10^{6} PBMC/ml en RPMI-1640 más FCS al 10% a placas de cultivo de tejidos recubiertas primero con el anticuerpo anti-CD3 TR77. Después de 4-6 días los blastos se llevaron a medio recién preparado y complementado con IL-2 (Genzyme) a 50 unidades/ml.

Analizadores de Northern: CKR-3 se expresa selectivamente en eosinófilos

Aunque la eotaxina es un quimioatrayente selectivo para eosinófilos, el receptor CKR-3 también se une a RANTES y MCP-3, que se sabe que atraen monocitos y células T. Se examinó la expresión de mensaje del receptor en diversas poblaciones de leucocitos.

Los resultados de una hibridación de Northern inicial (véase el Ejemplo 2) mostraban la expresión de un mensaje de -1,6 kb en bazo, leucocitos de sangre periférica y timo, y varias subpoblaciones de leucocitos, tales como eosinófilos y células T, así como en la línea celular HL-60. Los niveles de mensaje aumentaron espectacularmente en la línea celular HL-60 tras la inducción con ácido butírico hacia la ruta eosinófila.

Es probable que este mensaje sea el de Eos L2, ya que el mensaje para el receptor de MIP1\alpha/RANTES que presenta hibridación cruzada en transferencias de Southern es débil y se describe que es de aproximadamente 3,0 kb. Cuando el fragmento de PCR original de 201 pb se usa como sonda en transferencias de Southern, se observa un fragmento HindIII de 1,8 kb que hibrida firmemente. Este es el fragmento que se clonó y se analizó en este documento. Además de este fragmento, se observó un fragmento que hibridaba débilmente a aproximadamente 10 kb. Este fragmento de 10 kb se corresponde con el tamaño del fragmento HindIII descrito del receptor de MIP1\alpha/RANTES. Este receptor de MIP1\alpha/RANTES produce un mensaje de aproximadamente 3 kb que no se observa en Northern. Por lo tanto, el mensaje de 1,6 kb observado en Northern probablemente procede del gen de Eos L2. De lejos la expresión más abundante de Eos L2 se observó en una preparación de eosinófilos purificados de un paciente con síndrome hipereosinófilo (véase el Ejemplo 8).

Debido a la elevada similitud de secuencia de CKR-3 con otros receptores de quimioquina CC y al hecho de que el clon de longitud completa hibrida con múltiples secuencias en transferencias de Southern, los análisis de Northern adicionales usaban un fragmento de 250 pb de la región no traducida 3' del clon genómico que no presenta hibridación cruzada con otras secuencias en transferencias de Southern. Para la hibridación, se usó una sonda de la región no traducida 3' específica para CKR-3 que incluye los nucleótidos 1203-1453 (Figura 1C).

Se preparó un panel de transferencia de Northern usando ARN de diferentes poblaciones de leucocitos, incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos, células T, blastocitos T producidos por activación con MAb de CD3 y eosinófilos. Se aisló el ARN usando reactivo TriZOL^{TM} (Gibco/BRL) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se separaron 15 \mug de ARN total aislado de cada población de leucocitos altamente purificada en geles de agarosa con formaldehído al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nylon Nytran-Plus^{TM} (Schleicher y Schuell), y se entrecruzó usando un Stratalinker®. La hibridación con una sonda de región no traducida 3' radiomarcada se realizó con solución ExpressHyb^{TM} (Clontech) usando el protocolo sugerido por el fabricante. Las transferencias de Northern se expusieron a una película X-OMAT AR durante 3-5 días con una exploración que se iba intensificando. La sonda específica de CKR-3 se eliminó por ebullición en SDS al 0,5% y la transferencia se volvió a sondar con \beta-actina para determinar variaciones en la carga.

La única población celular que dio una señal detectable eran los eosinófilos, en los que se encontró un mensaje de 1,8 kb de tamaño. Estos resultados concuerdan con el patrón de expresión en superficie detectado inmunológicamente en las Figuras 13A-13D. Aunque en este experimento no se detectó mensaje en células T en reposo o activadas, es posible que un subconjunto de células T pueda expresar el receptor.

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Anticuerpos monoclonales (MAb) reactivos con el receptor de quimioquina eosinófilo

Se generaron MAb reactivos con el receptor Eos L2 inmunizando ratones con un péptido sintético que se corresponde con los 35 aminoácidos N-terminales. Los 35 aminoácidos N-terminales de Eos L2, deducidos a partir de la secuencia de nucleótidos (véanse las Figuras 1A-1C; véase también, la SEC ID Nº: 2), se sintetizaron y se acoplaron a la proteína transportadora PPD (Derivado de Proteína Purificada Mycobacterium tuberculosis; Severn Biotech Ltd., Cambridge, Reino Unido).

Se inmunizaron ratones hembra Balb/C con 50 \mug de este conjugado peptídico de péptido-transportadora en PBS 4 veces a intervalos de 2 semanas. A los ratones se les inyectó el conjugado peptídico por vía intraperitoneal, usando adyuvante completo (primera inyección) e incompleto (inyecciones posteriores) de Freund. La inmunización final se realizó por inyección por vía intravenosa sin adyuvante. También se recogió el antisuero policlonal de ratones inmunizados con péptido sintético.

Se realizaron dos fusiones exitosas que generaron más de 15.000 hibridomas. Cuatro días después de la inyección final, se extirpó el bazo y se preparó una suspensión de una sola célula en medio DMEM sin suero. Se fusionaron estas células con el compañero de fusión del hibridoma SP2/0, de acuerdo con Galfre, G. y col. (Galfre, G. y col., Nature, 266: 550-552 (1977)). Se combinaron 20 ml de células de bazo y 20 ml de SP2/0, se centrifugó a 800 g durante 5 min y se retiró el medio. Se añadió una solución de polietilenglicol 1500 al 50% (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) precalentada a 37ºC al sedimento celular durante 2 min, seguido de 10 ml de medio DMEM durante 3 min. La suspensión celular se centrifugó a 400 g durante 3 min y se retiró el sobrenadante. El sedimento se resuspendió suavemente en medio DMEM que contenía suero fetal de ternera al 20% L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml, sulfato de estreptomicina 100 \mug/ml y medio de selección HAT (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Las células se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a 200 \mul/pocillo.

10-14 días después, se exploraron los sobrenadantes de los pocillos para reactividad contra el péptido usando un anticuerpo anti-ratón marcado con enzima (anti-IgG de ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (Jackson) en un ensayo de ELISA. Se seleccionaron aproximadamente 200 mAb que mostraban una fuerte reactividad contra el péptido sintético. Los hibridomas de interés se subclonaron usando una dilución limitante.

Para determinar qué anticuerpos podían reconocer la molécula nativa expresada en superficie, se exploraron los MAb contra células de insecto Sf9 infectadas con virus AcMNPV que lleva ADN genómico de Eos L2 humano. Estas células de insecto expresaban receptor Eos L2 (CKR-3) en la superficie celular, a juzgar por la fuerte tinción anti-FLAG de aproximadamente el 10% de las células. La tinción se realizó usando anticuerpo anti-FLAG M2, seguido de anti-Ig de ratón-FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), y se analizó mediante separación de células activadas por fluorescencia, usando un análisis FACScan para cuantificar la expresión (Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Coligan. J. y col., Eds., (John Wiley & Sons; Nueva York, NY).

Aproximadamente el 33% de los hibridomas anti-péptido reaccionaban con las células de insecto transfectadas con Eos L2, con un patrón de tinción idéntico al del anticuerpo FLAG, según se determinó mediante análisis de FACS usando anti-Ig de ratón-FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) como segundo anticuerpo. Las células de insecto sin transfectar teñidas con anti-FLAG eran completamente negativas. El anticuerpo anti-péptido también se ensayó contra células sin transfectar, que eran negativas para tinción.

Los MAb que se descubrió que teñían las células de insecto transfectadas se examinaron usando un análisis de FACS para determinar su reactividad con eosinófilos humanos, linfocitos de sangre periférica, monocitos, neutrófilos y células T activadas (células T activadas; los linfocitos se trataron con un anticuerpo anti-CD3 para activar las células T). Se tiñeron las células con mAb LS26-5H12 y después, anti-Ig de ratón-FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). La unión a receptor Fc se controló usando un exceso de suero humano normal.

Todos los eosinófilos se tiñeron con un mAb anti-Eos L2 seleccionado, LS26-5H12 (Figura 12A). Los monocitos eran débilmente positivos por inmunofluorescencia. Una pequeña proporción de linfocitos eran positivos para tinción (Figura 12B) y sustancialmente todas las células T activadas se tiñeron débilmente con el anticuerpo LS26-5H12 (no se muestra), sugiriendo que las células T expresan receptor que está regulado positivamente tras la activación de células T. En las condiciones del ensayo los neutrófilos no se tiñeron significativamente por el anticuerpo LS26-5H12. Basándose en la distribución esperada del receptor Eos L2, y que funciona en la unión a RANTES, el MAb LS26-5H12 parece reconocer la forma de este receptor expresada de forma natural. Además del MAb LS26-5H1, cinco Mab adicionales se comportaron de manera similar.

El hibridoma LS26-5H12 se purificó adicionalmente por dilución limitante. En otro experimento, subconjuntos de leucocitos altamente purificados (purificados como se describe en el Ejemplo 5) se tiñeron con MAb LS26-5H12 y se analizaron por citometría de flujo (Figuras 13A-13D). Los perfiles de tinción eran representativos de al menos 4 experimentos. Se identificaron células T basándose en la tinción de CD3. Se identificaron monocitos y neutrófilos por dispersión frontal y lateral.

Los eosinófilos altamente purificados se teñían fuertemente con LS26-5H12 (Figura 13A), sugiriendo una expresión abundante del receptor en la superficie de eosinófilos, y de acuerdo con un elevado número de receptores determinado mediante unión a ligando y análisis de Scatchard. Los neutrófilos, células T en sangre y monocitos mostraban escasa o ninguna tinción con este MAb (Figuras 13B-13D). Estos últimos resultados, usando un anticuerpo del hibridoma reclonado, sugieren que CKR-3 se expresa selectivamente en eosinófilos, y que no se expresa sensiblemente en otros tipos de leucocitos ensayados. Sin embargo, es posible que un subconjunto de células T exprese el receptor.

Inhibición de quimiotaxis por anticuerpos

Se usó un antisuero policlonal (recogido del mismo ratón del que se obtuvo el Mab LS26-5H12) en un ensayo de quimiotaxis, usando células HL-60 diferenciadas con ácido butírico como se ha descrito anteriormente y separadores de cultivo. (El separador forma una cámara superior cuando se coloca en un pocillo de la placa de microtitulación). Se controló la quimiotaxis de las células HL-60 diferenciadas con ácido butírico en respuesta a 100 ng/ml de RANTES (en la cámara inferior). La quimiotaxis en respuesta a RANTES se producía en la misma medida en un control sin suero que en presencia de 1\mul de suero de ratón normal (situado en la cámara superior con células). Por el contrario, en presencia de 1,0 \mul de antisuero (situado en la cámara superior con células), la quimiotaxis inducida por RANTES se inhibía en el 40%. En un ensayo diferente, usando un suero policlonal de conejo anti-péptido, no se inhibía la quimiotaxis de forma similar.

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Ejemplo 6

Selección de transfectantes estables de células L1.2

El 2%-5% de las células COS, HEK-293 y CHO transfectadas transitoriamente eran positivas en superficie, según se evaluó usando anticuerpos contra receptor marcado con FLAG (véase anteriormente), aunque podía detectarse una cantidad sustancial de proteína intracelular, sugiriendo un tránsito de proteínas ineficaz. Se usó la línea de células pre-B de ratón L1.2 para seleccionar líneas con mayores niveles de expresión en superficie (véase la Figura 6) para una evaluación adicional de la especificidad de unión a ligando y de la transducción de señales por CKR-3. Esta línea celular se ha usado con éxito para el estudio de otros receptores quimiotácticos (Honda, S., y col., J. Immunol., 152: 4026-4035 (1994)), y la expresión de receptores de quimioquina humanos transfectados confiere una capacidad quimiotáctica específica a diversos ligandos (véase a continuación).

Para controlar la expresión en superficie de CKR-3, se produjo un anticuerpo monoclonal (MAb) contra la región N-terminal del receptor, inmunizando ratones con un péptido sintético que tenía una secuencia que se corresponde con los 35 aminoácidos N-terminales de CKR-3. Mediante ELISA se detectaron Mab anti-péptido y se identificaron MAb que reconocen el receptor nativo por su reactividad con eosinófilos humanos, así como por su tinción de transfectantes transitorios.

Construcción de CKR-3/pcDNA3

Se usó PCR para modificar el gen de CKR-3 contenido en el fragmento genómico de 1,8 kb insertando un sitio de restricción HindIII y una secuencia de Kozak óptima inmediatamente 5' al codón de inicio. La región codificante y 448 pb de la región no traducida 3' se insertaron en el sitio HindIII de pcDNA3 (Invitrogen), colocando el gen bajo el control del promotor del gen temprano inmediato de CMV humano del vector. En el Ejemplo 3 se proporcionan los detalles de la construcción de esta construcción de receptor Eos L2 (CKR-3) marcado con FLAG (denominada también en este documento CKR-3/pcDNA3).

Transfección y selección de una línea celular estable

Se obtuvo la línea celular de linfoma pre-B murino L1.2 del Dr. Eugene Butcher (Universidad de Stanford) y se mantuvo en RPMI-1640 complementado con suero bovino al 10%. Se usaron 20 \mug de CKR-3/pcDNA3 linealizado para transfectar la línea celular de la forma siguiente. Se lavaron dos veces las células L1.2 en HBSS y se resuspendieron en 0,8 ml del mismo. Se mezcló el ADN plasmídico con las células y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y se aplicó un solo pulso a 250 V, 960 \muF. La electroporación se siguió de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadió G418 a una concentración final de 0,8 mg/ml 48 horas post-transfección y las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 25.000 células/pocillo. Después de 2-3 semanas bajo selección farmacológica, las células resistentes a G418 se tiñeron con mAb anti-receptor 5H12 (véase a continuación) y se analizaron mediante FACScan®.

Las líneas con tinción superficial detectable se expandieron y se clonaron varias veces mediante dilución limitante. Los clones con la tinción superficial más brillante se analizaron adicionalmente por hibridación de Northern para confirmar la presencia de receptor transfectado, así como por RT-PCR usando un cebador T7 complementario al vector pcDNA3 como el cebador 5' y un cebador específico de CKR-3 como el cebador 3' (no se muestra). No se observó amplificación sin adición de transcriptasa inversa.

Para la transfección transitoria, se usaron 20 \mug de ADN superenrollado en la electroporación exactamente como se ha descrito para la producción de una línea celular estable. La tinción de la superficie celular se evaluó después de 48-72 horas.

Las células L1.2 transfectadas con CKR-3/pcDNA3 se diluyeron hasta 1 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo de tejidos. Se añadió ácido n-butírico (sal sódica, Sigma Chemical Corp., Cat. Nº B5887) a una concentración final de 5 mM (diluido a partir de una solución madre 1 M preparada en medio de cultivo de tejidos). Las células se cultivaron durante una noche (18-24 horas) a 37ºC, CO_{2} al 5% antes del uso. Se han usado con éxito concentraciones menores (por ejemplo, ácido n-butírico 2,5 mM y 1 mM). Se ha descrito que el tratamiento con n-butirato induce niveles de proteína de hasta aproximadamente 10 veces respecto a controles sin inducción (véase, por ejemplo, Palermo, D. P., y col., J. Biotech., 19: 35-48 (1991) y referencias citadas en el mismo). Los niveles de ARNm de CKR-3 dirigidos por el promotor del gen temprano inmediato de CMV humano aumentaron espectacularmente mediante el tratamiento con n-butirato.

Producción de anticuerpos monoclonales y citometría de flujo

Se produjeron MAb reactivos con péptido sintético como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5. Los MAb se exploraron por ELISA de la forma siguiente. Se usaron 50 \mul de péptido, a una concentración de 2 \mug/ml en tampón carbonato, para recubrir placas Maxisorp de 96 pocillos NUNC durante al menos 4 horas a 4ºC. Se añadieron 300 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (PBS + BSA al 1%) durante al menos 2 horas. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se añadieron 50 \mul de sobrenadante de MAb a cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS/Tween 20 y se añadió a cada pocillo un segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) diluido 1:500 en PBS. Después de una incubación a 37ºC durante 30 minutos, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20. El sustrato usado para la reacción de color era p-nitrofenilfosfato disuelto en tampón de dietanolamina (Bio-Rad). Las placas se leyeron a 410 nm en un lector de ELISA.

Para determinar qué MAb anti-péptido podían reconocer CKR-3 nativo expresado en superficie, se exploraron los MAb anti-péptido contra células transfectadas transitoriamente y eosinófilos. Para la tinción de MAb, se lavaron las células una vez con PBS y se resuspendieron en 100 \mul de PBS que contenía FCS al 2%, azida sódica al 0,1% (tampón FACS), anticuerpo purificado 5 \mug/ml, MAb de control del mismo isotipo de IgG_{1} MOPC-21 5 \mug/ml o 100 \mul de sobrenadante de cultivo de hibridoma. Después de 30 minutos a 4ºC, se lavaron las células dos veces en tampón FACS, y se resuspendieron en 100 \mul de F(ab')_{2} de cabra anti-IgG de ratón purificado por afinidad conjugado con FITC (Jackson). Después de una incubación durante 30 minutos a 4ºC, se lavaron las células dos veces con tampón FACS y se analizaron por FACScan® para determinar el nivel de expresión en superficie. Se usó yoduro de propidio para excluir las células muertas.

Expresión en superficie de receptor en transfectantes estables de la línea celular L1.2

La Figura 14A muestra una tinción superficial detectable del receptor transfectado transitoriamente en una subpoblación de células L1.2, usando un MAb anti-receptor, LS26-5H12. Las células L1.2 sin transfectar eran negativas (Figura 14B). Se construyó una línea celular estable mediante clonación por dilución limitante de los transfectantes y selección de la mayor tinción superficial, como se ha descrito anteriormente. Este procedimiento produjo líneas que tenían niveles de expresión de receptor mucho mayores (Figura 14C). El análisis de transferencia de Northern confirmó la presencia de ARNm de CKR-3 transfectado en uno de los subclones, denominado E5, y su ausencia en células L1.2 sin transfectar (no se muestra).

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Ejemplo 7

Especificidad de unión a ligando de transfectantes de L1.2 estables Quimioquinas

Se obtuvieron quimioquinas humanas recombinantes en Peprotech, Inc. (Rocky Hill, NJ), excepto por la eotaxina humana que se sintetizó usando procedimientos en fase sólida que se optimizaron y adaptaron a un sintetizador de péptidos completamente automatizado (modelo 430A; Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) como se describe (Clark-Lewis, I., y col., Biochemistry, 30: 3128-3135 (1991)). La eotaxina humana también está disponible en el mercado en Peprotech.

Marcaje con ^{125}I

Se produjo eotaxina marcada con ^{125}I usando el reactivo de Bolton Hunter (NEN), como se describe (Coligan, J. E., y col., Eds., 1992, Current Protocols in Immunology (Nueva York: John Wiley and Sons)). Se calculó que la actividad específica de la eotaxina radiomarcada era de 180 Ci/mM.

Unión a Ligando

La unión de quimioquina a células diana se realizó usando una modificación de un procedimiento descrito anteriormente (Van Riper, G., y col., J. Exp. Med. 177: 851-856 (1993)). Se lavaron las células una vez en PBS y se resuspendieron en tampón de unión (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, BSA al 0,5% y azida al 0,05%) a una concentración de 1 x 10^{7} ml. Se dispensaron alícuotas de 50 \mul (5 x 10^{5} células) en tubos de microfuga, seguido de la adición de competidor frío y quimioquinas radiomarcadas. El volumen de reacción final era de 200 \mul. Se determinó la unión inespecífica incubando las células con quimioquinas radiomarcadas en presencia de 250-500 nM de quimioquinas sin marcar. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las células 3 veces con 1 ml de tampón de unión que contenía NaCl 0,5 M. Después se realizó un recuento de los sedimentos celulares.

La competición se presenta como el porcentaje de unión específica como se calcula mediante 100(S-B)/(T-B), en la que S es la radioactividad de la muestra, B como la unión de fondo y T como la unión total sin competidores. La unión de fondo se obtuvo incubando células con quimioquina radiomarcada y un exceso de al menos 400 veces de quimioquinas sin marcar. La unión total de eotaxina a células E5 era de 11611 \pm 119 cpm y la unión de fondo 2248 \pm 745 cpm. La unión total de eotaxina a eosinófilos era de 7866 \pm 353 cpm y la unión de fondo 1148 \pm 518 cpm. Se usaron duplicados en todos los experimentos y las desviaciones típicas siempre eran inferiores al 10% de la media. Se repitieron todos los experimentos al menos tres veces. El ajuste de la curva se calculó mediante el programa informático KaleidaGraph.

La línea celular E5 descrita en el Ejemplo 6 se ensayó para determinar su capacidad para unirse a eotaxina radiomarcada. Se incubaron células con eotaxina marcada con ^{125}I 0,6 nM y diversas concentraciones de competidor frío. La Figura 15A muestra que las células transfectadas se unían a eotaxina marcada con ^{125}I específicamente y con gran afinidad. El análisis de Scatchard de los datos de unión indicaba una constante de disociación (Kd) de 1,5 nM (Figura 15C), parecido al valor de 0,5 nM obtenido usando eosinófilos humanos purificados (Figura 15D). Además, tanto RANTES como MCP-3 fueron capaces de competir específicamente por la unión. Ninguna de las otras quimioquinas ensayadas, incluyendo MIP-1\alpha, MIP-1\beta o IL-8 eran capaces de competir específicamente por ligando radiomarcado (Figura 16).

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Ensayos de quimiotaxis

Se evaluó la quimiotaxis con eosinófilos humanos usando una modificación de un ensayo transendotelial (Carr, M. W. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3652-3656 (1994)). Las células endoteliales usadas para este ensayo eran la línea de células endoteliales ECV 304, obtenida de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (Porton Down, Reino Unido) Se cultivaron células endoteliales en separadores de cultivo de tejidos Biocoat® Transwell de 6,5 mm de diámetro (Costar Corp., Cambridge MA) con un tamaño de poro de 3,0 \muM. El medio de cultivo para células ECV 304 consistía en M199 + suero fetal de ternera al 10%, L-glutamina y antibióticos.

El medio de ensayo consistía en partes iguales de RPMI 1640 y M199, con BSA al 0,5%. 24 horas antes del ensayo, se sembraron 2 x 10^{5} células ECV 304 sobre cada separador de la placa de quimiotaxis de 24 pocillos y se incubaron a 37ºC. Se añadieron factores quimiotácticos (diluidos en medio de ensayo) a las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en un volumen final de 600 \mul. Los separadores de cultivo de tejidos recubiertos con células endoteliales se insertaron en cada pocillo y se añadieron 10^{6} células a la cámara superior en un volumen final de 100 \mul. Se incubó la placa a 37ºC en CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 4 horas.

Se contaron las células que habían migrado a la cámara inferior usando citometría de flujo. Se colocaron en un tubo 500 \mul de la suspensión celular de la cámara inferior y se obtuvieron recuentos relativos de células mediante la captación de acontecimientos durante un periodo de tiempo establecido de 30 segundos. Se descubrió que este procedimiento de recuento era reproducible, y permitía la selección de leucocitos y la exclusión de residuos u otras células. Los recuentos obtenidos de este modo coinciden estrechamente con los obtenidos mediante recuento con un microscopio.

Se usó el mismo ensayo para evaluar la quimiotaxis de células L1.2 o líneas celulares transfectantes de L1.2 con receptor, excepto por que no se usaron células endoteliales para recubrir los separadores de cultivo de tejidos Biocoat® Transwell.

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La expresión de CKR-3 en células L1.2 confiere sensibilidad quimiotáctica para eotaxina, RANTES y MCP-3

Se ensayaron transfectantes de L1.2 con receptor para determinar su capacidad para migrar en respuesta a un panel de quimioquinas en un intervalo de concentraciones. La línea celular que expresa CKR-3 E5 mostró una respuesta quimiotáctica a eotaxina, RANTES y MCP-3, con una respuesta máxima a eotaxina a 100 ng/ml, aunque podía detectarse una migración específica a una concentración tan baja como de 10 ng/ml (Figura 17A). Aunque era evidente una respuesta a RANTES tanto a 10 ng/ml como a 100 ng/ml, la magnitud de la respuesta no era tan buena como con eotaxina. Parecía que MCP-3 era un quimioatrayente menos potente en la línea celular E5 que en eosinófilos, sin migración detectable por debajo de 100 ng/ml. No se observó una respuesta significativa a otras quimioquinas ensayadas con esta línea celular. En otros experimentos de control, las células no migraron a la cámara inferior cuando se añadió quimioquina sólo al pocillo superior, confirmando que la migración celular era quimiotáctica más que quimiocinética (no se muestra).

La línea celular L1.2 sin transfectar no migraba en respuesta a ninguna quimioquina ensayada (Figura 17B). De hecho, una característica llamativa de la línea celular L1.2 era la muy baja quimiotaxis de fondo para ligandos inespecíficos. Como control de especificidad, las células L1.2 transfectadas con IL-8 RB migraron específicamente en respuesta a IL-8 y GRO\alpha (Figura 17C), así como NAP-2 y ENA-78 (no se muestra), pero no a otras quimioquinas CXC o CC. Otros receptores de quimioquinas que se introdujeron en células L1.2 por transfección también confieren capacidad quimiotáctica a sus ligandos específicos, incluyendo transfectantes de CKR-2 (que responden a MCP-1 y MCP-3), transfectantes de CKR-1 (que responden a MIP-1\alpha) y transfectantes de IL-8 RA (que responden a IL-8) (no se muestra). La toxina pertusis anuló completamente la respuesta quimiotáctica tanto de eosinófilos como de transfectantes de CKR-3 a eotaxina, indicando que el receptor estaba señalizando a través de la subclase G\alpha (Simon, M. I., y col., Science, 252: 802-808 (1991)) tanto en células normales como transfectadas (no se
muestra).

El perfil quimiotáctico de los eosinófilos se parece al de transfectantes de CKR-3

Para evaluar si la función de eosinófilos normales se parece a la de transfectantes de L1.2 con CKR-3, se realizaron experimentos de quimiotaxis usando eosinófilos de varios individuos normales (seres humanos), que tenían altos niveles de eosinófilos (-6 al 8% de WBC) (purificados como se ha descrito en el Ejemplo 5). Las Figuras 18A-18B muestran dos patrones característicos de quimiotaxis de eosinófilos observada en dos individuos diferentes. Un patrón se caracterizaba por una fuerte migración de eotaxina, y una menor respuesta a RANTES y MCP-3 (Figura 18A). El otro patrón mostraba una quimiotaxis esencialmente equivalente en respuesta a eotaxina, RANTES y MCP-3 (Figura 18B). Estos patrones no se debían a variaciones en el ensayo, ya que dentro de cada individuo, eran altamente reproducibles durante un periodo de tiempo prolongado. La MIP-1\alpha mostraba solamente una débil actividad quimiotáctica por eosinófilos en la segunda clase de individuos.

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Ejemplo 8

Clonación de un ADNc que codifica Eos L2 Construcción de una genoteca de ADNc de eosinófilos

Se obtuvieron eosinófilos de un paciente (M. V.) diagnosticado con síndrome hipereosinófilo idiopático (Costa, J. J. y col., J. Clin. Invest. 91: 2673 (1993). Se aisló el ARN usando un procedimiento convencional de isotiocianato de guanidinio /cloruro de cesio (En: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Ausubel, F. M. y col., Eds., (John Wiley & Sons: Nueva York, NY) páginas 4.2.2-4.2.3 (1991)). El ARNm se obtuvo usando Dynabeads® (Dynal, Inc.), y la biblioteca de bacteriófagos se construyó usando el sistema SUPERSCRIPT^{TM} Lambda para síntesis de ADNc y clonación en \lambda (Gibco, BRL, Life Technologies) que viene con \lambdagt22A, brazos NotI-SalI.

Exploración de genoteca

Se exploraron aproximadamente 750.000 placas de bacteriófagos de la genoteca de ADNc de eosinófilos humanos resultante por duplicado. La sonda usada era una sonda de ADNc radiomarcada de longitud completa (ADNc p4) que codifica el receptor de MIP-1\alpha/RANTES (CKR-1) (Gao y col., J. Exp. Med., 177: 1421 (1993)). Se clonó el ADNc p4 en los sitios BamHI (5') y Xhol (3') del pcADNI (Invitrogen). Se obtuvo un fragmento BamHI-XhoI de este clon (es decir, ADNc p4 en pcADNI) mediante digestión de restricción y se aisló usando Gene Clean (Bio101). Se marco el fragmento con ^{32}P usando un kit de marcaje de cebador aleatorio (Boehringer Mannheim Biochemicals).

Los filtros se prehibridaron por incubación durante dos horas a 42ºC, en una solución de formamida al 50%, SSC 5X, Denhardt 1X, Sulfato de Dextrano al 10%, TRIS 20 mM, pH 7,5 SDS al 0,1% (dodecilsulfato sódico). La hibridación se realizó durante una noche a 42ºC en la misma solución. Los filtros de la genoteca de ADNc de eosinófilos se lavaron después dos veces con SSC 2X/SDS al 0,1% a temperatura ambiente y dos veces con SSC 2X/SDS al 0,1% a 42ºC. Cada lavado era de 30 minutos. Se expusieron los filtros durante una noche y se escogieron las placas positivas por duplicado. Los clones se evaluaron adicionalmente cuando eran positivos por duplicado después de lavados de rigurosidad reducida.

Caracterización de clones de ADNc

Las placas se purificaron por formación de placas, y se aisló el ADN mediante un protocolo de lisis de fagos a pequeña escala (En: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Supl. 10, Ausubel, F. M. y col., Eds. (John Wiley & Sons: Nueva York, NY), página1.13.7 (1991). El ADN de bacteriófago se digirió con EcoRI (sitio en el brazo del vector) y NotI. Los insertos liberados por digestión se visualizaron en un gel y se descubrió que eran de aproximadamente 1,6 kb de longitud. El inserto -1,6 kb presente en una placa denominada Mip-16 o M-16, se aisló usando Gene Clean (Bio101), y se clonó en los sitios de EcoRI y NotI del vector KS Bluescript® (Stratagene), que se había digerido tanto con EcoRI como con NotI para producir extremos asimétricos. El plásmido ligado se introdujo en células de E. coli XL1-Blue (Stratagene) hechas competentes como se describe por Hanahan (Hanahan, D., (19985), En: DNA Cloning, Volumen 1, D. M. Glover, Ed. (IRL Press: Washington, D. C.), págs. 109.135).

La secuenciación didesoxi de la construcción M-16/Bluescript se realizó usando un kit de secuenciación de didesoxinucleótidos de USB (United States Biochemical, Cleveland, OH). Se determinó que la secuencia de nucleótidos de este clon codifica una nueva proteína con un alto grado de homología con el receptor de MIP-1\alpha/RANTES; sin embargo, a partir de los datos de secuencia, el clon no parecía ser de longitud completa.

Para identificar un clon de longitud completa, se aislaron y se purificaron 15-20 placas adicionales, y los insertos presentes en el fago se caracterizaron mediante análisis de enzimas de restricción y/o secuenciación. Se descubrió que otro clon \lambda que se aisló, denominado M31, contenía un inserto de -1,8 kb. El insertó se clonó en los sitios EcoRI y NotI del vector KS Bluescript® (Stratagene) y se introdujo en células de E. coli XL1-Blue (Stratagene) como se ha descrito anteriormente. La secuenciación de ADN de este clon (inserto M31 en Bluescript, denominada construcción M31/Bluescript) se realizó como se ha descrito anteriormente y reveló que codificaba un receptor de longitud completa.

El inserto M31 se liberó de la construcción M31/Bluescript mediante digestión con EcoRI y NotI. El fragmento resultante se aisló usando Gene Clean (Bio101), y se insertó en los sitios EcoRI y NotI del vector Ap^{r}M9, que se había digerido tanto con EcoRI como con NotI para producir extremos asimétricos. El vector Ap^{r}M9 (de Fougerolles, A. R. y col., J. Exp. Med., 177: 1187-1192 (1993)) es un derivado de CDM8 (Invitrogen) que contiene la \beta-lactamasa de pBluescript y un poliengarce de pSP64. La construcción resultante, denominada A31, se introdujo en células competentes XL1-Blue.

En las Figuras 2A-2B se muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de longitud completa y la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína codificada (véase también la SEC ID Nº: 3 y la SEC ID Nº: 4). La secuencia de ADNc mostrada en las Figuras 2A-2B se determinó a partir de clones A31 (bases 15-365 (numeración como en las Figuras 2A-2B)), y la construcción M-16/Bluescript (bases 366 a 1152 (numeración como en las Figuras 2A-2B)). Una comparación de la secuencia de aminoácidos del nuevo receptor con otras proteínas reveló que el nuevo receptor y el receptor de MIP-1\alpha/RANTES comparten una identidad de secuencia del 62%, y el nuevo receptor y el receptor de MCP-1 comparten una identidad de secuencia del 50,57%. La identidad de secuencia se determinó usando el paquete Wisconsin UW GCG (programa gap), con el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)).

Análisis de Northern

Se obtuvo ARN para el análisis de Northern de un paciente que tenía hipereosinofilia. Los eosinófilos se aislaron como se ha descrito (Costa, J. J. y col., J. Clin. Invest. 91: 2673 (1993)). El ARN eosinófilo total se aisló usando procedimientos convencionales (En: Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 19, Ausubel, F. M. y col., Eds. (John Wiley & Sons: Nueva York, NY) páginas 4.2.2-4.2.3 (1991)). El ARN total se fraccionó en un gel de agarosa al 1% y después se transfirió sobre filtros Gene-Screen (New England Nuclear). Los filtros se sondaron a rigurosidad elevada de acuerdo con el protocolo del fabricante para un lavado de rigurosidad elevada de transferencias Gene Screen (New England Nuclear).

Se prepararon varios Northern. Uno implicaba sondar con el fragmento EcoRI-NotI de la construcción M16/
Bluescript, y otros se sondaron con el fragmento EcoRI-NotI del clon A31. Ambos fragmentos EcoRI-NotI incluyen las regiones no traducidas 3'. Se marcaron las sondas con ^{32}P usando un kit de marcaje de cebador aleatorio (Boehringer Manneheim Biochemicals).

Cada transferencia de Northern reveló una señal muy fuerte de aproximadamente 1,8 kb en ARN eosinófilo humano total. Este resultado indica que el ARN de A31 se expresa a niveles muy altos en los eosinófilos de este paciente.

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Ejemplo 9

Expresión de ADNc que codifica receptor Eos L2 y estudios de unión a ligando Construcciones

Para la expresión y análisis de unión se usaron vectores A31 (descritos anteriormente) y A31-pcDNA3. Para construir el A31-pcDNA3, se digirió el vector A31 con EcoRI y NotI, el inserto de 1,8 kb se aisló usando Gene Clean (Bio101) y se insertó en los sitios EcoRI y NotI del vector pcDNA-3 (Invitrogen), que se había digerido tanto con EcoRI como con NotI. La construcción ligada, denominada A31-pcDNA3, se introdujo en células XL1-Blue competentes.

Transfecciones transitorias

Las transfecciones transitorias usando A31 en la línea celular de riñón 293 sugerían inicialmente una gran afinidad de unión de A31 con RANTES radiactivo. Estos estudios de unión iniciales han sido difíciles de reproducir. Por consiguiente, se han producido posteriormente líneas celulares estables con A31/pcDNA3 integrado de forma estable en células tanto RBL (leucemia basófila de rata) como 293. Las células RBL (Nº de Acceso ATCC CRL 1378) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y las células 293 (Nº de Acceso ATCC CRL 1573) se obtuvieron por cortesía de I. Charo, Gladstone Cardiovascular Institute.

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Líneas Celulares Estables

Se construyeron líneas celulares estables de la forma siguiente. Se linealizó el A31-pcDNA3 mediante digestión con NotI. El plásmido linealizado se introdujo en células RBL y 293 mediante electroporación. Se tripsinizaron células 293 y RBL confluentes que crecían en placas de 100 x 20 mm, se resuspendieron en 1 cc de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sometieron a electroporación en una cubeta de 0,4 cm (BioRad) con ajustes de 960 microfaradios y 250 voltios. Se aislaron transfectantes estables por selección positiva en medio que contenía geneticina. Específicamente, las células se cultivaron primero en DMEM (BRL), suero fetal de ternera al 10% durante varios días y después se cambiaron a DMEM, suero fetal de ternera al 10% con 0,9 mg/cc de Geneticina (BRL). (DMEM, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco). Después de 3 semanas, las colonias supervivientes se aislaron de manera estéril con cilindros de clonación y los clones individuales se cultivaron en pocillos individuales en DMEM, suero fetal de ternera al 10% con 0,9 mg/cc de Geneticina (BRL).

Se detectaron los clones supervivientes que expresaban ARN de A31 a altos niveles mediante análisis de Northern. Se exploraron 120 transfectantes estables de la línea RBL y 38 transfectantes estables de la línea celular 293. Específicamente, se aisló el ARN de clones individuales usando el procedimiento de fenol ácido (Chomczynski, P. y N. Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987)). Se fraccionó el ARN mediante electroforesis, y se transfirió sobre GeneScreen (New England Nuclear), y se sondaron las transferencias de Northern de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para un lavado de rigurosidad elevada. Se aisló el inserto EcoRI-NotI del plásmido A31, se radiomarcó con ^{32}P usando el kit de marcaje de cebador aleatorio (Boehringer Mannheim Biochemicals), y se usó como una sonda. El ARN se cuantificó por tinción con bromuro de etidio en geles. Se usaron células 293 o RBL sin transfectar como controles negativos para los transfectantes correspondientes.

Posteriormente se descubrió que las líneas celulares estables denominadas A31-293-#8, A31-293-#9, A31-293-#17 y A31-293-#20 expresaban ARN de A31 a elevados niveles con respecto a otras líneas. Se seleccionó el clon A31-293-#20 con una elevada expresión del mensaje de A31 por análisis de Northern, para un estudio adicional.

Se descubrió una línea RBL expresaba cantidades reducidas-medias de ARN, pero no parecía unirse a RANTES en las condiciones usadas (no se muestra).

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Unión a ligando

Para ensayos de unión, se cultivó el clon estable A31-293-#20 en cantidades suficientes. En particular, se cultivaron células en placas de 100 mm en DMEM, suero fetal de ternera al 10%, geneticina 0,9 mg/cc. Las placas se cultivaron hasta la confluencia, y se prepararon las membranas como se indica a continuación. Se retiró el medio de cultivo, y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. Se recuperaron las células mediante lavado con TEN (TRIS 40 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y NaCl 150 mM). Se congelaron las células en nitrógeno líquido, se descongelaron a temperatura ambiente, y la fracción de membrana se recogió por centrifugación en un tubo cónico durante 10 minutos a 18.000 rpm. Cada punto de unión se determinó usando la mitad de las membranas recuperadas de una sola placa de 100 mm cultivada hasta la confluencia.

Se adquirió RANTES marcado con ^{125}I en New England Nuclear y se adquirió RANTES frío en Peprotech (Princeton, N. J.). La MCP-3 marcada con ^{125}I se obtuvo por cortesía de New England Nuclear, y la MCP-3 fría se obtuvo por cortesía de J. Van Damme, Rega Institute for Medical Research, University of Leuven, Bélgica (véase también Opdenakker, G. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 191 (2): 535-542 (1993)). Los ensayos de unión se realizaron como se describe por Van Riper, G. y col., J. Exp. Med., 177: 851 (1993), con las siguientes modificaciones. En particular, se realizó la unión a membranas de 0,125 nanomolar de ^{125}I-RANTES en presencia de concentraciones variables de ligando sin marcar. El tampón de unión era Hepes 50 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, BSA al 0,5%, pH 7,2. Se añadieron ligando radiomarcado y frío simultáneamente a las membranas (véase anteriormente), y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La reacción de unión se añadió a 2 cc de tampón de lavado (NaCl 0,5 M, Hepes 50 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, BSA al 0,5%, pH 7,2), se mezcló por agitación vorticial y después se colocó en filtros Whatman GFC tratados con polietilenimina. Se lavaron los filtros con dos cc adicionales de tampón de lavado. La actividad conservada en los filtros después del lavado se determinó mediante recuento por escintilación. Se colocaron los filtros en 5 cc de líquido de escintilación y después se realizó el recuento en un contador de escintilación líquida miniaxi-beta (United Technologies, Packard, Downers Grove, IL). Se determinaron todos los puntos por triplicado, excepto para el punto a 2 nM, que se determinó por duplicado.

Los resultados del ensayo indicaba una gran afinidad de unión de RANTES al receptor codificado por el clon A31 (Figura 19). El análisis de Scatchard de los datos indicaba una K_{d} de -2,5 nM para RANTES, que era la esperada en células normales.

También se evaluó la unión de MCP-3 a membranas del clon A31-293-#20 usando el ensayo de unión a ligando descrito anteriormente para la unión de RANTES a membranas de A31-293-#20 (Figura 20). Las reacciones de unión contenían MCP-3 marcada con ^{125}I 0,125 nanomolar.

Además, se evaluó la especificidad de unión determinando el grado en que la MCP-3 marcada (unida en ausencia de MCP-3 fría) podía desplazarse por MCP-3 fría (Figura 21). Todos los puntos se tomaron por duplicado.

La MCP-3 unida a membranas de células sin transfectar no podía desplazarse por MCP-3 marcada con ^{125}I, indicando una unión inespecífica. En comparación, la MCP-3 unida a membranas de células A31-293-#20 podía desplazarse por MCP-3 caliente, siendo indicativo de unión específica.

Los resultados de estos ensayos indican que el receptor codificado por el ADNc de A31 se une específicamente a MCP-3 humana.

Equivalentes

Los expertos en la técnica serán capaces de reconocer o capaces de determinar, usando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes para las realizaciones específicas de la invención aquí descritas. Se pretende incluir dichos equivalentes en las siguientes reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Gerard, Craig

\hskip3.9cm

Gerard, Norma P.

\hskip3.9cm

Mackay, Charles

\hskip3.9cm

Ponath, Paul D.

\hskip3.9cm

Post, Theodore W.

\hskip3.9cm

Qin, Shixin

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GEN DE RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNA G

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P. C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Two Militia Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Lexington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02173

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/375.199

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-ENERO-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Brook, David E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 22.592

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: LKS94-05A PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-861-6240

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617-861-9540

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1689 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1193 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 92..1156

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

11

12

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 19

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base=i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 16..48

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

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13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

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14

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

110

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

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111

Claims (63)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3 (antiguamente denominado CKR-3 y enmendado para ajustarse a la International Union for Pharmacology XXII: Nomenclature for Chemokine Receptors), en el que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3 y media la quimiotaxis o un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}) en respuesta a la unión a ligando y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con uno cualquiera de i) a iv);o

C)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que dicho CCR3 se une a eotaxina y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

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4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

a)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

b)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

6. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ácido nucleico aislado codifica un CCR3 de mamífero.

7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en el que dicho CCR3 de mamífero es un CCR3 humano.

8. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7, en el que dicho ácido nucleico es esencialmente puro.

9. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-8, en el que dicho ácido nucleico aislado es un ácido nucleico recombinante.

10. Una construcción recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que comprende un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3) en la que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y dicho ácido nucleico hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3 y media la quimiotaxis o un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}) en respuesta a la unión a ligando, y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con uno cualquiera de i) a iv);o

C)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

11. Una célula huésped aislada que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que comprende un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3) en la que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y dicho ácido nucleico hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de uno cualquiera de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3 y media la quimiotaxis o un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}) en respuesta a la unión a ligando y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con uno cualquiera de i) a iv);o

C)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

12. La construcción recombinante de la reivindicación 10 o la célula huésped de la reivindicación 11, en la que dicho CCR3 se une a eotaxina y dicho ácido nucleico hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T.

13. La construcción recombinante de la reivindicación 10 o la célula huésped de la reivindicación 11, en la que dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

14. La construcción recombinante de la reivindicación 10 o la célula huésped de la reivindicación 11, en la que dicho ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

a)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

b)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

15. La construcción recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 12-14, o la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en la que dicho ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

16. La construcción recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 12-14, o la célula huésped de una cualquier de las reivindicaciones 11-14, en la que el ácido nucleico recombinante codifica un CCR3 de mamífero.

17. La construcción recombinante o célula huésped de la reivindicación 16, en la que dicho CCR3 de mamífero es un CCR3 humano.

18. La construcción recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12-14, 16 y 17, o la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, 16 y 17, en la que dicho ácido nucleico recombinante codifica una proteína de fusión que comprende dicho CCR3.

19. La construcción recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12-14 y 16-18, o la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14 y 16-18, en la que el ácido nucleico recombinante está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

20. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende una proteína receptora de quimioquina C-C 3 (CCR3) o una porción funcional de la misma, que comprende mantener una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14 y 16-19 en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante, en la que el polipéptido codificado se expresa y se produce.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, que comprende además aislar dicho polipéptido de dicha célula huésped o de su medio de cultivo.

22. Un polipéptido aislado que comprende un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3) en el que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3 y media la quimiotaxis o un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}) en respuesta a la unión a ligando, y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con uno cualquiera de i) a iv);o

C)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

23. El polipéptido aislado de la reivindicación 22, en el que dicho CCR3 se une a eotaxina y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T.

24. El polipéptido aislado de la reivindicación 22, en el que dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a un ligando seleccionado del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

25. El polipéptido aislado de la reivindicación 22, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo constituido por:

a)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

b)

la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

26. El polipéptido aislado de la reivindicación 22, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

27. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 en el que dicho polipéptido aislado comprende un CCR3 de mamífero.

28. El polipéptido aislado de la reivindicación 27, en el que dicho CCR3 de mamífero es un CCR3 humano.

29. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, 27 y 28, en el que dicho polipéptido aislado es una proteína de fusión que comprende dicho CCR3.

30. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene especificidad de unión por un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3) en el que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2.

31. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 30, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la unión de un ligando a dicho CCR3.

32. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 31, en el que dicho ligando se selecciona del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

33. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 31, en el que dicho ligando es eotaxina.

34. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-33, en el que dicho CCR3 es un CCR3 de mamífero.

35. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 34, en el que dicho CCR3 de mamífero es un CCR3 humano.

36. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 30 o de la reivindicación 31, en el que dicho CCR3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

37. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 30 o de la reivindicación 31, en el que dicho CCR3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

38. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-36, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un péptido constituido por los restos aminoacídicos 1-35 de la SEC ID Nº: 2.

39. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-36 y 38, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno seleccionado del grupo constituido por un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')_{2} y un fragmento Fv.

40. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-36, 38 y 39 para usar en terapia o diagnóstico.

41. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-36, 38 y 39 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria.

42. El uso de la reivindicación 41, en el que dicha enfermedad inflamatoria es asma.

43. Un procedimiento para identificar un inhibidor de un receptor de quimioquina C-C 3 (CCR3) que comprende combinar un compuesto a ensayar, un ligando de CCR3 y

a) una célula huésped que expresa un polipéptido recombinante que comprende un CCR3 o

b) una fracción de dicha célula huésped que comprende un polipéptido recombinante que comprende un CCR3 y/o

c) un polipéptido aislado que comprende dicho CCR3, en condiciones adecuadas para la unión de dicho ligando a dicho CCR3 y la medición o detección de la formación de un complejo entre dicho CCR3 y dicho ligando, en el que la inhibición de la formación de complejo por el compuesto es indicativa de que el compuesto es un inhibidor; y en el que:

A)

dicho CCR3 se une a eotaxina y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

viii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T; o

B)

dicho CCR3 se une a una quimioquina seleccionada del grupo constituido por RANTES y MCP-3 y media la quimiotaxis o un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}) en respuesta a la unión a ligando y dicho ácido nucleico aislado hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con uno cualquiera de i) a iv);o

C)

dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y se une a una quimioquina seleccionada del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

44. El procedimiento de la reivindicación 43, en la que la formación de un complejo se detecta o se mide por detección o medición de la unión de dicho ligando a dicho CCR3.

45. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que la formación de un complejo se detecta o se mide por detección o medición de una actividad de señalización o respuesta celular inducida tras la unión de dicho ligando a dicho CCR3.

46. El procedimiento de la reivindicación 45, en el que la formación de un complejo se detecta o se mide por detección o medición de una actividad de señalización seleccionada del grupo constituido por hidrólisis de GTP y un aumento transitorio en la concentración de calcio libre citosólico ([Ca^{2+}]_{i}).

47. El procedimiento de la reivindicación 45, en el que la formación de un complejo se detecta o se mide por detección o medición de una respuesta celular seleccionada del grupo constituido por quimiotaxis, exocitosis, desgranulación, liberación de mediadores inflamatorios y estallido respiratorio.

48. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en el que dicho CCR3 se une a eotaxina y está codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de SSC 6X que contiene solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 2% y ADN de esperma de salmón cortado (100 \mug/ml) a 65ºC y condiciones de lavado de SSC 0,2X, SDS al 0,5% a 65ºC, con un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

i)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

ii)

un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 5 o una porción de la misma que comprende la fase de lectura abierta;

iii)

el complementario de i) o ii); y

iv)

el homólogo de ARN de uno cualquiera de i) a iii), en el que U sustituye a T.

49. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en el que dicho CCR3 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 6 y dicho CCR3 se une a una quimioquina seleccionada del grupo constituido por RANTES y MCP-3.

50. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-49, en el que dicho CCR3 es un CCR3 de mamífero.

51. El procedimiento de la reivindicación 50, en el que dicho CCR3 de mamífero es un CCR3 humano.

52. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en el que dicho CCR3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

53. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en el que dicho CCR3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

54. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en el que dicho CCR3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

55. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-52 y 54, en el que dicho ligando es RANTES o MCP-3.

56. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-52 y 55 en el que dicho ligando es eotaxina.

57. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43-52 y 54-56, en el que dicho ligando está marcado con un marcador detectable.

58. Un procedimiento para detectar y/o identificar un agente que se une a una proteína receptora de quimioquina C-C 3 de mamífero que comprende combinar un agente que se va a ensayar con un polipéptido aislado de la reivindicación 22, en condiciones adecuadas para la unión de un ligando al mismo y la detección o medición de la formación de complejo entre dicho agente y una proteína receptora de quimioquina C-C 3.

59. Un procedimiento para detectar y/o identificar un agente que se une a una proteína receptora de quimioquina C-C 3 de mamífero, que comprende combinar un agente que se va a ensayar con una célula huésped de la reivindicación 1 en condiciones adecuadas para la unión de ligando a proteína receptora de quimioquina C-C 3, y detectar o medir la formación de un complejo entre dicho agente y una proteína receptora de quimioquina C-C 3.

60. El procedimiento de la reivindicación 58 o de la reivindicación 59, en el que la formación de complejo se detecta o se mide por detección o medición de una actividad de señalización o respuesta celular por dicho receptor de quimioquina C-C 3 en respuesta a la unión de un ligando.

61. Un ácido nucleico antisentido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es la complementaria del ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7.

62. El ácido nucleico antisentido aislado de la reivindicación 61, en el que dicho ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es la complementaria de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 5.

63. Un procedimiento in vitro para modular al menos una función de una proteína receptora de quimioquina C-C 3 de mamífero, que comprende la etapa de poner en contacto dicha proteína con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-36, 38 y 39.