ES2324406T3 - Mutantes de herpesvirus equino (ehv) gm-negativos sin elementos heterologos. - Google Patents

Mutantes de herpesvirus equino (ehv) gm-negativos sin elementos heterologos. Download PDF

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Abstract

Un herpesvirus equino, en el que la proteína gM está ausente, caracterizado porque el citado herpesvirus equino está libre de elementos heterólogos.

Description

Mutantes de herpesvirus equino (EHV) gM-negativos sin elementos heterólogos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la salud animal, y en particular de los herpesvirus equinos (EHV) en los que el gen que codifica la proteína gM está ausente y que están libres de elementos heterólogos. Aspectos adicionales de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos virus, a usos de los mismos y a métodos para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por EHV. La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden la combinación de virus EHV-1 y EHV-4, en los que el gen que codifica la proteína gM está ausente y que están libres de elementos heterólogos.
Antecedentes de la invención
El herpesvirus equino 1 (EHV-1), un miembro de los Alphaherpesvirinae, es la causa principal de aborto inducido por virus en equinos y causa enfermedades respiratorias y neurológicas. El herpesvirus equino 4 (EHV-4) puede inducir también síntomas respiratorios, abortos o trastornos neurológicos. Se ha determinado la secuencia de ADN completa de ambas especies (EHV-1: cepa Ab4p, EHV-4: cepa NS80567) (Telford, E.A.R., et al., 1992; Telford, E.A.R., et al., 1998). Sin embargo, sólo se han caracterizado unos pocos genes y productos génicos con respecto a su relevancia para la virulencia y propiedades inmunogénicas del EHV.
Las glicoproteínas de herpesvirus están implicadas crucialmente en las etapas tempranas de la infección, en la liberación de viriones de las células y en la extensión directa célula a célula de los viriones mediante fusión de las células vecinas. Hasta la fecha, se han identificado 11 glicoproteínas codificadas por herpesvirus simplex de tipo 1 (HSV-1), y se han designado gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL y gM. Los mutantes de HSV-1 que carecen de gC, gE, gG, gI, gJ y gM son viables, indicando que estos genes son innecesarios para la replicación en células cultivadas. La comparación de las secuencias nucleotídicas del HSV-1 y del herpesvirus equino 1 reveló que todas las glicoproteínas de HSV-1 conocidas están conservadas en EHV-1. Según la nomenclatura actual, estas glicoproteínas se designan por los nombres de sus homólogas de HSV-1. Es conocido que gC, gE y gI de EHV-1 no son esenciales para el crecimiento en cultivo celular, mientras que gB y gD son esenciales para el crecimiento del virus en células cultivadas. No son conocidas las contribuciones de otras glicoproteínas de EHV-1 a la replicación en células cultivadas (Flowers, C.C. et al., 1992). Los análisis transcripcionales y de proteínas han mostrado que las glicoproteínas gB, gC, gD, gG, gH y gK se expresan en células infectadas por EHV-1. La glicoproteína gM (codificada por el gen UL10 [Baines, J.D., et al., 1991; Baines, J.D. et al., 1993]) es la única glicoproteína no esencial reseñada que se conserva en todas las subfamilias de herpesvirus, y se ha descrito para citomegalovirus humano y de múrido y los miembros de Gammaherpesvirinae EHV-2, herpesvirus de mono ardilla y virus de Epstein-Barr. Como muchas glicoproteínas de herpesvirus, la gM de HSV-1 está presente en viriones y membranas de células infectadas. Los mutantes de HSV-1 que carecen sólo de gM crecieron en los sistemas de cultivo celular a valoraciones reducidas aproximadamente 10 veces con respecto a las de los virus de tipo natural, y mostraron una virulencia reducida en un modelo de múrido (Baines, J.D. et al., 1991; MacLean, C.A. et al., 1993). La homóloga de gM de EHV-1 (gp21/22a; indicada como gM de EHV-1 de ahora en adelante) se describió por primera vez por Allen y Yeargan (Allen, G.P. et al., 1987), y se mostró que era un constituyente principal de la cubierta viral. Investigaciones posteriores revelaron que el gen 52, el gen homólogo de UL10 de HSV-1, codifica el polipéptido gM de EHV-1 de 450 aminoácidos (Pilling, A. et al., 1994; Telford, E.A.R. et al., 1992). La gM de EHV-1 representa una proteína hidrófoba múltiple que contiene ocho dominios transmembrana predichos, y se ha reseñado que está presente en células infectadas y en viriones purificados en forma de una proteína de M_{r} 45.000 (Pilling, A. et al., 1994; Telford. E.A.R. et al., 1992).
Para el control de las infecciones por EHV-1, se siguieron dos enfoques diferentes. En primer lugar, se han desarrollado vacunas vivas modificadas (MLV), incluyendo la cepa RacH (Mayr, A. et al., 1968; Hübert, P.H., et al., 1996), que se utiliza ampliamente en Europa y los Estados Unidos. En segundo lugar, vacunas inactivadas y vacunas de subunidades basadas en glicoproteínas virales expresadas recombinantemente tales como las glicoproteínas (g) B, C, D y H, que inducían protección parcial frente a la exposición ulterior a infección por EHV-1 en un modelo de múrido. Las vacunas de subunidades que comprenden dichas glicoproteínas, por ejemplo gB, gC, gD y gH, protegen sólo débil-
mente frente a la reinfección (Awan, et al., 1990; Osterrieder et al., 1995; Tewari, et al., 1994; Stokes et al., 1996).
El problema técnico subyacente de esta invención era proporcionar vacunas mejoradas que protegieran mejor frente a la infección por EHV que las vacunas de la técnica anterior.
Leyendas de las figuras
Figura 1
Generación de un virus RacH EHV-1 negativo de gM sin secuencias extrañas (H\DeltagM-w)
Esta figura muestra el mapa de virus y plásmidos utilizados para la construcción de H\DeltagM-w. El virus H\DeltagM "de primera generación" se ha construido previamente insertando el módulo de expresión de lacZ de Escherichia coli (H\DeltagM-lacZ) o de la proteína fluorescente verde (GFP) (H\DeltagM-GFP). Se muestra el mapa BamHI (A) de la cepa RacH de EHV-1 y se aumenta de escala el fragmento BamHI-HindIII que contiene el ORF de gM, mostrando la organización genómica de la región (B). El virus negativo de gM, H\DeltagM-GFP, porta un módulo de expresión de GFP que reemplaza la mayor parte del gen de gM de EHV-1. Se representa la sonda específica de GFP (C), que se utilizó en transferencias Southern. El plásmido pBH3.1 porta el fragmento de interés BamHI-HindIII de EHV-1, y se utilizó para construir el plásmido pXuBaxA. Después de la cotransfección de ADN de H\DeltagM-GFP con el plásmido pXuBaxA, dio como resultado H\DeltagM-w (D). Sitios de restricción: BamHI-B, HindIII-H, SphI-S, HincII-Hc, ApaI-A, PstI-P.
Figura 2
Transferencia Southern de virus EHV-1 con gM suprimida sin secuencias extrañas (H\DeltagM-w)
Se escindió ADN de RacH, H\DeltagM-GFP y H\DeltagM-w con BamHI, HindIII o PstI, y se analizó con una sonda específica de GFP (GFP) o el fragmento BamHI-HindIII de EHV-1 de pBH3.1 (pBH3.1). Los híbridos de ADN se detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando CSPD. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (Biolabs) se dan en kpb en el margen izquierdo. La flecha apunta a un híbrido específico apenas visible.
Figura 3
Generación de un virus EHV-4 negativo de gM sin secuencias extrañas (E4\DeltagM-w)
En esta figura, se representa un mapa BamHI de la cepa NS80567 de EHV-4. El fragmento BamHI-e ampliado comprende los ORF de gM y vecinos (A). Se representan los constructos de plásmido y los sitios de cebado (B). Se utilizó el plásmido pgM4GFP+ para la generación de E4\DeltagM-GFP, el EHV-4 positivo de GFP y negativo de gM (B, C). La recombinación de ADN de E4\DeltagM-GFP o con el plásmido pgM4R (B), que contiene 3.109 pb de secuencias de EHV-4 incluyendo el ORF de gM, dio como resultado E4RgM, el EHV-4 con gM reparada (A), o bien con el plásmido pgM4w (B), dio como resultado E4\DeltagM-w, el EHV-4 negativo de GFP y negativo de gM (D).
Sitios de restricción: BamHI-B, PstI-P, EcoRI-E, SalI-Sa, MluI-M, AsnI-As, EcoRV-EV.
Figura 4
Transferencia Southern de un virus EHV-4 con gM suprimida sin secuencias extrañas (E4\DeltagM-w)
Se escindió ADN de EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP con PstI, EcORV o HindIII como se indica, y los fragmentos de ADN se transfirieron a membranas de nailon. Paralelamente, hibridaron membranas con secuencias específicas de GFP o con una sonda, denominada gM3.1, que contenía las secuencias específicas de EHV-4 tomadas del plásmido pgM4R (Fig. 3). Los híbridos de ADN se detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando CSPD. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (Biolabs) se dan en kpb.
Figura 5
Características de crecimiento del virus EHV-4 con gM suprimida, E4\DeltagM-w
Se infectaron células con una MOI de 2 de los diferentes virus, como se enumeran en la tabla. Se representan las cinéticas del crecimiento viral como valoraciones virales determinadas en sobrenadantes de células infectadas (actividad extracelular) o en células infectadas (actividad intracelular) respecto al punto temporal indicado. Se muestran las medias de dos experimentos individuales, las desviaciones estándar se dan como barras de error.
Figura 6
Tamaño de placas de E4\DeltagM-w
Se infectaron células Vero o Vero-gM en placas de 6 pocillos con 50 PFU de EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-GFP o E4\DeltagM-w. Se determinaron los diámetros máximos de 150 placas respectivas, y los tamaños medios de placa se dan en porcentaje respecto a los tamaños de las placas de tipo natural, que se fijaron como 100%. Las desviaciones estándar se dan como barras de error (A). Las placas se tiñeron mediante inmunofluorescencia indirecta (Mab 20C4 anti-gD, 1:1000) el día 4 p.i. y se analizaron en un Axioscope (x100, Zeiss, Alemania). Las imágenes se escanearon y se procesaron digitalmente (B).
Figura 7
Penetración del virus EHV-4 en células Vero
La penetración de EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP se produjo en células Vero no complementarias (A) o en células Vero-gM no complementarias (B). A puntos temporales dados, se determinó la eficacia de penetración como el porcentaje del número de placas presentes después del tratamiento con citrato respecto al de placas presentes después del tratamiento de control. Se dan las medias de dos experimentos independientes. Las desviaciones estándar se representan como barras de error.
Figura 8
Secuencias de cebador de PCR y localización de las amplificaciones en el genoma de EHV-4. Las secuencias que representan los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción se imprimen en negrita, y se enumeran las enzimas respectivas. Los productos de PCR se insertaron en los vectores dados, dando como resultado los plásmidos pCgM4, pgM4R, pgM4Del1 o pgM4Del2, como se indica. La localización de un fragmento en el genoma de EHV-4 se da respecto a la secuencia determinada por Telford et al. (1998).
Figura 9
Análisis de transferencia Western de sueros de caballo
Se calentaron lisados de la estirpe celular ccgM que expresa gM de EHV-1 y células Rk13 durante 2 minutos a 56ºC (1, 2) o bien durante 5 minutos a 95ºC (3) (gM es altamente hidrófoba y conocida por agregar tras ebullición, de modo que no entra ya en el gel separador). Se incubaron transferencias idénticas con diversos sueros de caballo (1:3000) o suero de conejo anti-gM. Las flechas apuntan a la reactividad específica de gM en muestras hervidas y no hervidas. Las valoraciones neutralizantes de ensayo (NT) se dan para los sueros que se obtuvieron a partir de la unidad de diagnóstico virológico.
Figura 10
(A) Comparación de gM de EHV-1 con gM de EHV-4 utilizando un anticuerpo policlonal anti-gM de EHV-1. Las células se infectaron con los virus indicados (MOI de 0,5-1) y se prepararon lisados celulares en los puntos temporales fijados p.i. Se purificaron viriones de EHV-1 ó 4 mediante centrifugación repetida a través de un colchón de sacarosa (30%) y se resuspendieron en PBS. Se mezclaron las muestras con tampón que contenía 5% de 2-mercaptoetanol y después se calentaron a 99ºC durante 50 minutos o se dejaron a 4ºC. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se visualizó la unión de anticuerpo utilizando conjugado de inmunoglobulina G (IgG) anti-conejo y peroxidasa (Sigma), seguido de detección por ECLTM (Pharmacia-Amersham).
(B) Los viriones se purificaron a partir de células Edmin337 infectadas con EHV-4, E4\DeltagM-w, E4\DeltagM-GFP o E4RgM, y se sometieron a análisis de transferencia Western como se describe en (A). Se comparó después la reactividad ante gB de los viriones con la reactividad ante gM utilizando el anticuerpo monoclonal 3F6 anti-gB de EHV-1 o el anticuerpo policlonal anti-gM de EHV-1.
Exposición de la invención Definiciones de los términos utilizados en la descripción
Antes de las realizaciones de la presente invención, debe observarse que como se utilizan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una", "uno/una" y "el/la" incluyen referencia al plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un virus EHV" incluye una pluralidad de dichos virus EHV que comprende también todas las subespecies como EHV1, 4 y otras, la referencia a la "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidos por el experto en la técnica, y así. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que se entienden habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o el ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos, aparatos y materiales preferidos. Todas las publicaciones citadas en la presente memoria se incorporan a ésta como referencia con los fines de describir y exponer las estirpes celulares, vectores y metodologías como se reseñan en las publicaciones que podrían utilizarse en conexión con la invención. Nada en la presente memoria ha de considerarse como una admisión de que la invención no está habilitada por anticiparse dicha exposición en virtud de la invención anterior.
El término "EHV" como se utiliza en la presente memoria indica todos los herpesvirus equinos tales como las especies EHV-1 y EHV-4 en la familia Alphaherpesvirinae. Los términos virus EH, virus EHV y EHV se refieren todos a herpesvirus equinos.
Virulencia: "Virulencia" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un virus EH capaz de propagarse en la especie hospedadora diana (concretamente caballos) con el potencial de inducir enfermedades subclínicas y clínicas caracterizadas por síntomas respiratorios, abortos o trastornos neurológicos. Los ejemplos de EHV virulentos son virus de tipo natural que inducen fuertes síntomas clínicos. Son ejemplos de factores de virulencia hemolisinas (que lisan glóbulos rojos) o adhesinas (proteínas mediante las que el patógeno puede adherirse al hospedador e iniciar la colonización o invasión). Más específicamente, "virulencia" significa aquí que el producto génico de gM, un constituyente principal de la cubierta viral, posibilita que el virus penetre en el hospedador y está implicado en la extensión célula a célula.
Atenuación: "Un virus EH atenuado" como se describe en la presente memoria se refiere a un EHV infeccioso que no causa enfermedades subclínicas o clínicas asociadas a EHV. En particular, según la invención, dichos virus EH atenuados son EHV que pueden replicarse y no expresan gM.
Una "variante funcional" del virus EH según la invención es un virus EHV que posee una actividad biológica (funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la del EHV según la invención. La expresión "variante funcional" incluye también "un fragmento", "una variante funcional", "variante basada en el código degenerado de los ácidos nucleicos", o "derivado químico". Dicha "variante funcional" puede portar, por ejemplo, uno o varios intercambios, deleciones o inserciones de ácido nucleico. Dichos intercambios, deleciones o inserciones pueden dar cuenta de un 10% de la secuencia completa. Dicha variante funcional retiene al menos parcialmente su actividad biológica, por ejemplo funciona como un clon infeccioso o una cepa de vacuna, o incluso exhibe una actividad biológica mejorada.
Una "variante basada en la naturaleza degenerada del código genético" es una variante resultante del hecho de que un cierto aminoácido puede estar codificado por diversos tripletes nucleotídicos diferentes. Dicha variante retiene al menos parcialmente su actividad biológica, o incluso exhibe una actividad biológica mejorada.
Una "molécula de fusión" puede ser la molécula de ADN o de virus EHV infeccioso según la invención condensada, por ejemplo, a un indicador tal como un marcaje radiactivo, una molécula química tal como un marcaje fluorescente o cualquier otra molécula conocida en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, un "derivado químico" según la invención es una molécula de ADN o clon infeccioso de EHV según la invención químicamente modificado o que contiene restos químicos adicionales que no forman parte normalmente de la molécula. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula.
Una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si ambas moléculas tienen secuencias nucleotídicas o actividad biológica sustancialmente similares. Por tanto, a condición de que dos moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes como se utiliza ese término en la presente memoria si la secuencia nucleotídica no es idéntica, y dos moléculas que tienen una secuencia nucleotídica similar se consideran variantes como se utiliza ese término en la presente memoria incluso si su actividad biológica no es idéntica.
El término "vacuna" como se utiliza en la presente memoria indica una composición farmacéutica que comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce una respuesta inmunológica en un animal y posiblemente, pero no necesariamente, uno o más componentes adicionales que potencian la actividad inmunológica de dicho componente activo. Una vacuna puede comprender adicionalmente componentes adicionales típicos de composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender partículas de virus completos en su forma original o como partículas atenuadas en la denominada vacuna viva modificada (MLV), o partículas inactivadas mediante métodos apropiados en la denominada vacuna muerta (KV). En otra forma, el componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender elementos apropiados de dichos organismos (vacunas de subunidades), con lo cual estos elementos se generan destruyendo la partícula entera o los cultivos de crecimiento que contienen dichas partículas y opcionalmente con etapas de purificación ulteriores que proporcionan la estructura o estructuras deseadas, o mediante procesos sintéticos que incluyen una manipulación apropiada mediante el uso de un sistema adecuado basado, por ejemplo, en bacterias, insectos, mamíferos u otras especies, más opcionalmente los procedimientos de aislamiento y purificación ulteriores, o mediante la inducción de dichos procesos sintéticos en el animal necesitado de una vacuna mediante la incorporación directa de material genético utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación de polinucleótidos). Una vacuna puede comprender uno o simultáneamente más de uno de los elementos descritos anteriormente.
El término "vacuna" como se entiende en la presente memoria es una vacuna para uso veterinario que comprende sustancias antigénicas y se administra con el fin de inducir una inmunidad específica y activa frente a una enfermedad provocada por EHV. La vacuna de EHV según la invención confiere inmunidad activa que puede transferirse pasivamente mediante anticuerpos maternos frente a los inmunógenos que contiene, y a veces también frente a organismos antigénicamente relacionados.
Los componentes adicionales para potenciar las respuestas inmunes son constituyentes habitualmente indicados como coadyuvantes, como por ejemplo hidróxido de aluminio, aceites minerales u otros o moléculas auxiliares añadidas a la vacuna o generadas por el cuerpo después de la respectiva inducción de dichos componentes adicionales como, pero sin limitación, interferones, interleucinas o factores de crecimiento.
Una "composición de vacuna o composición farmacéutica" está constituida esencialmente por uno o más ingredientes capaces de modificar las funciones fisiológicas, por ejemplo inmunológicas, del organismo al que se administra, o de organismos que viven en o sobre el organismo. La expresión incluye, pero sin limitación, antibióticos o antiparasitarios, así como otros constituyentes utilizados habitualmente para conseguir ciertos objetivos como, pero sin limitación, características de procesamiento, esterilidad, estabilidad, capacidad de administrar la composición por vías entéricas o parenterales tales como oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica u otras vías adecuadas, tolerancia tras la administración o propiedades de liberación controlada.
Exposición de la invención
La solución al problema técnico anterior se consigue mediante la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
La invención supera las dificultades y prejuicios de la técnica de que un herpesvirus equino no puede generarse libre de secuencias extrañas. Al utilizar los métodos según la invención, se proporcionan virus EH de calidad superior para uso en vacunas. La secuencia de codificación central para la proteína gM se elimina de modo que las secuencias carboxiterminales restantes de gM están en un marco de lectura diferente que las secuencias aminoterminales. El gen vecino del homólogo de la proteína UL9 esencial (gen 53), su orientación y superposición con el gen que codifica la proteína gM requiere que una secuencia nucleótidica mínima del gen de gM deba permanecer para permitir la expresión del gen 53 y así retener la viabilidad del virus. Por lo tanto, un EHV según la invención se refiere a EHV que se caracterizan porque se suprime el gen que codifica la proteína gM de modo que la expresión del gen que codifica el homólogo de UL9 (gen 53) no esté afectada. La expresión "no afectada" no se refiere a una cierta cantidad o a propiedades cualitativas de UL9, sino simplemente significa que la expresión del gen no está afectada a condición de que dicha
proteína se exprese por el virus y esté presente en una cantidad esencialmente suficiente para la viabilidad del virus.
La necesidad largamente deseada en la técnica de una vacuna que comprenda herpesvirus equinos 4 recombinantes se satisfizo por los presentes inventores, que superaron las importantes dificultades de la técnica. Los virus EHV-1 y EHV-4 según la invención pueden utilizarse ventajosamente para uso por ejemplo en una vacuna.
Por tanto, en una primera realización importante, la invención se refiere a un herpesvirus equino (EHV) en el que el gen que codifica la proteína gM, y por tanto la gM misma, está ausente, caracterizado porque está libre de elementos heterólogos. "Libre de elementos heterólogos" significa que no está presente ninguna secuencia extraña, concretamente ninguna secuencia no EHV, tal como un módulo que codifica lacZ o GFP, en la secuencia de codificación de dicho virus según la invención (un denominado "clon blanco"). Por tanto, el EHV según la invención está enteramente codificado por secuencias de EHV. El EHV según la invención está libre de elementos bacterianos o ácidos nucleicos que codifican dichos elementos bacterianos. Además, se suprime casi toda la secuencia de codificación de la proteína gM, y por tanto la proteína gM anteriormente citada codificada. Por tanto, preferiblemente, dicho EHV según la invención se caracteriza porque la proteína gM está ausente debido a la deleción del gen que codifica la proteína gM. Sin embargo, como se indica anteriormente, "el gen que codifica la proteína gM está ausente" requiere también que permanezca una secuencia mínima de gM de modo que al menos la secuencia superpuesta del gen 53 esté todavía presente, pudiendo suprimirse el resto de las secuencias de gM (véase a continuación). Esto puede conseguirse mediante técnicas de biología molecular (véase a continuación) para generar EHV recombinantes.
El uso del lacZ como marcador para una deleción exitosa del gen de gM de EHV-1 ó 4 no condujo a la generación exitosa de virus según la invención (véanse los ejemplos 1, 2). Los inventores desarrollaron por tanto un método inventivo para obtener dicho virus. Se construyó un virus EH en el que se suprimió el gen de gM mediante la inserción de un módulo que contenía el marcador GFP. Este enfoque permitió sorprendentemente la diferenciación entre virus de partida (placas fluorescentes verdes) y placas recombinantes nuevas (placas no fluorescentes).
Se prefiere un EHV obtenible mediante un método que comprende las etapas de:
a)
aislamiento de un EHV de tipo natural;
b)
establecimiento de un plásmido que codifique el gen de gM de EHV, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
c)
generación de una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
d)
establecimiento de un virus EH que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
e)
deleción del módulo que codifica GPF; y
f)
selección de los clones de EHV en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
"LacZ" es conocido por el experto como el gen que codifica la \beta-galactosidasa. Según la invención, "GFP" se refiere a la proteína fluorescente verde (GFP) producida por la medusa bioluminiscente (Chalfie et al., 1994).
"Estirpe celular complementaria" designa una estirpe celular en la que se introduce un gen normalmente no presente en el genoma de la estirpe celular y se expresa constitutivamente. Las estirpes celulares útiles incluyen, pero sin limitación, la estirpe celular de riñón de conejo Rk13, la estirpe celular cc (Seyboldt et al., 2000) o las estirpes celulares Vero (nº de catálogo ATCC CRL-1586), tal como el clon 1008, como se expone también en los ejemplos 1 y 2, y cualquier otra estirpe celular conocida por el experto. Habitualmente, puede seleccionarse de clones celulares que expresan esta proteína adicional. Esta estirpe celular expresa el gen que está suprimido en el virus, complementando esta deficiencia, y posibilita el crecimiento del virus después de la deleción génica.
Los métodos de uso estándar en biología molecular de enzimas de restricción, ligamiento, PCR, transfección, etc., son conocidos en la técnica (véase por ejemplo Sambrook, et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Preferiblemente, dicho EHV según la invención se caracteriza porque es EHV-1. Más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprimen 850-1110 pb del marco abierto de lectura de gM de 1332 pb. Aún más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen 900-1000 pb del marco abierto de lectura de gM. Más preferiblemente también, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprimen 960-970 pb del marco abierto de lectura de gM (960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969 o 970 pb). Lo más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprimen los 962 pb del marco abierto de lectura de gM.
Más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 150-200 pares de bases (pb) de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de gM y 150-250 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 93118-93267 a 93118-93317 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 94223-94472 a 94323-94472 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, es más preferible un EHV-1 según la invención caracterizado porque se suprimen los nucleótidos 93268-93318 a 94222-94322 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1992). Dentro de los intervalos dados, puede suprimirse cualquier número de nucleótidos. Por tanto, según la invención, las deleciones pueden empezar no antes de la posición de nucleótido 93268, pero tienen que empezar en la posición 93318. La deleción puede terminar tan temprano como en la posición 94222, pero no después de la posición 94322. Por tanto, un EHV-1 preferido según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 93268 a 94322 de la secuencia de codificación de gM correspondientes a las posiciones de Telford (1992). Cualquier combinación está dentro del alcance de la invención, tal como 93272 a 94312, 93300 a 94300 y demás.
Aún más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 160-190 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de gM y 190-220 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 93118-93277 a 93118-93307 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 94523-94472 a 94283-94472 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, es más preferible un EHV-1 según la invención caracterizado porque se suprimen los nucleótidos 93278-93308 a 94252-94282 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1992).
Más preferiblemente también, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 180 a 190 (180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190) pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de la secuencia de codificación de gM y 200 a 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, ó 210) pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 93118-93297 a 93118-93307 (93297, 93298, 93299, 939300, 93301, 93302, 93303, 93304, 93305, 93306, 93307) de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 94263-94472 a 94273-94472 (94263, 94264, 94265, 94266, 94267, 94268, 94269, 94270, 94271, 94272, 94273) de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, es más preferible un EHV-1 según la invención caracterizado porque se suprimen los nucleótidos 94298-94308 a 94262-94272 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1992). Esto significa que puede suprimirse cualquier nucleótido dentro de los nucleótidos restantes anteriormente citados según la invención, por ejemplo los nucleótidos 94299-94263 ó 94299-94264 ó 94300-94272 o cualquier combinación de los mismos.
Lo más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 184 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de la secuencia de codificación de gM y 209 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 93118-93301 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 94264-94472 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, lo más preferido es un EHV-1 según la invención caracterizado porque se suprimen los nucleótidos 94263 a 93302 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1992). En esta realización más preferida, se suprimen 962 nucleótidos de la secuencia que codifica gM. Esto se ejemplifica de manera no limitante en el ejemplo 1.
También más preferiblemente, un EHV-1 según la invención se caracteriza porque la gM está suprimida y está libre de elementos heterólogos, y porque es una variante recombinante basada en una cepa seleccionada del grupo de AB69 (ATCC VR2581), el mutante Ts ECACC V99061001 de EHV-1, KyA, KyD, Ab1, Ab4, RacH, RacL11 o RacM de EHV-1, y ningún elemento heterólogo tal como elementos GFP o lacz está presente. También más preferiblemente, un EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como elementos GFP o lacZ, y porque es una variante recombinante basada en la cepa RacH de EHV-1. Lo más preferiblemente, un EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como elementos GFP o lacZ, y porque es el aislamiento H\DeltagM-w de variante recombinante basada en RacH como se expone en el ejemplo 1. Dicho H\DeltagM-w según la invención se depositó en el "Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Cell Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, RU, como depósito de patente según el Tratado de Budapest. La fecha del depósito fue el 16 de octubre de 2002, la referencia de identificación preliminar es H-delta-gM-w y el número de acceso dado por la autoridad depositaria internacional ECACC/CAMR es 02101663. Se prefieren también EHV-1 que tengan todas las características identificativas de dicho EHV-1 depositado.
Todos los EHV-1 anteriormente citados tienen propiedades superiores frente a otros virus con elementos heterólogos tales como GFP. Dichos EHV-1 según la invención tienen un infectividad extracelular ventajosamente mayor que aquellos que todavía comprenden elementos heterólogos. Esto se ejemplifica en la figura 5 (por ejemplo entre 4 y 12 horas).
Hasta la realización de la presente invención, nadie en la técnica fue capaz de generar un virus EHV-4 recombinante que pudiera utilizarse como vacuna. EHV-1 y EHV-4 son homólogos y reactivos cruzados en cierto grado. Sin embargo, había una larga necesidad en la técnica de virus EHV-4 atenuados, ya que EHV-1 parece no proporcionar suficiente protección frente a la infección por EHV-4. Por tanto, preferiblemente, un EHV según la invención se caracteriza porque es EHV-4. Más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen 900-1150 pb del marco abierto de lectura de gM de 1332 pb. Aún más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen 1000-1150 pb del marco abierto de lectura de gM. Más preferiblemente también, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprimen 1110-1115 pb del marco abierto de lectura de gM (1110, 1111, 1112, 1113, 1114 ó 1115 pb). Lo más preferiblemente, el EHV-1 según la invención se caracteriza porque se suprimen las 1110 pb del marco abierto de lectura de gM.
Más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 0-50 pares de bases (pb) de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de gM y 150-250 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92680 a 92681-92730 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 93766-94033 a 93866-94033 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92681-92731 a 93765-93865 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1998). Dentro de los intervalos dados, puede suprimirse cualquier número de nucleótidos. Por tanto, según la invención, las deleciones pueden empezar no antes de la posición de nucleótido 92681, pero tienen que empezar en la posición 92731. La deleción puede terminar tan temprano como en la posición 93765, pero no después de la posición 93865. Por tanto, preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92681 a 93865 de la secuencia de codificación de gM correspondientes a las posiciones de Telford (1998). Cualquier combinación está dentro del alcance de la invención, tal como 92672 a 93801, 92700 a 93800 y demás.
Aún más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 10-40 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de gM y 190-220 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92690 a 92681-92720 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 93806-94033 a 93863-94033 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92691-92721 a 93805-93835 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1998).
Más preferiblemente también, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 30 a 40 (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40) pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de gM y 200 a 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 ó 210) pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92710 a 92681-92720 (92710, 92711, 92712, 92713, 92714, 92715, 92716, 92717, 92718, 92719, 92720) de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 93816-94033 a 93826-94033 (93824, 93825, 93826, 93827, 93828, 93829, 93830, 93831, 93832, 93833, 93834) de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92711-92721 a 93823-93833 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1998). Esto significa que puede suprimirse cualquier nucleótido dentro de los nucleótidos restantes anteriormente citados según la invención, por ejemplo los nucleótidos 94299-94257 ó 94299-94256 ó 94300-94257 o cualquier combinación de los mismos.
Lo más preferiblemente, el EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 34 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción C-terminal de la secuencia de codificación de gM y 209 pb de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92714 de la secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y los nucleótidos 93825-94033 de la secuencia de codificación que codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, lo más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92715 a 93824 (que codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford, 1998). En esta realización más preferida, se suprimen 1110 nucleótidos de la secuencia que codifica gM. Esto se ejemplifica de manera no limitante en el ejemplo 2.
Más preferiblemente también, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como elementos GFP o lacZ, y porque es una variante recombinante basada en la cepa MSV lote 071398 de EHV-4. Lo más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como elementos GFP o lacZ, y porque está basado en la cepa MSV lote 071398 y el aislamiento E4\DeltagM-4 como se expone en el ejemplo 2. Dicho H\DeltagM-w de EHV-1 según la invención se depositó en el "Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Cell Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, RU, como depósito de patente según el Tratado de Budapest. La fecha de depósito fue el 14 de enero de 2003, la referencia de identificación preliminar es EHV-4 y el número de acceso dado por la autoridad depositaria internacional ECACC/CAMR es 03011401. Se prefieren también los EHV-4 con todas las características identificativas de dicho EHV-4 depositado.
Todos los EHV-4 anteriormente citados tienen propiedades superiores frente a virus conocidos en la técnica anterior, ya que no hay EHV-4 recombinantes disponibles en la técnica. Además, dicho EHV-4 según la invención tiene una infectividad extracelular ventajosamente más alta que aquellos que comprenden todavía elementos heterólogos tales como GFP. Esto se ejemplifica en la figura 10 (por ejemplo a 24 horas).
Otro elemento importante de la invención es un ácido nucleico que codifica un EHV como se expone anteriormente. El experto puede determinar fácilmente la secuencia correspondiente mediante métodos estándar de biología molecular conocidos en la técnica.
Había una dificultad particular en la técnica para obtener el EHV según la invención. Los presentes inventores construyeron virus EHV negativos de gM introduciendo un gen marcador (lacz) en el gen de gM. Cuando se intentó suprimir este módulo, ambos mutantes EHV-1 y EHV-4 producidos por inserción de lacZ, siendo todos los clones fenotípicamente negativos de lacZ, contenían todavía el módulo lacZ. Los inventores desarrollaron por tanto un método inventivo para obtener dichos virus. Se construyó un virus EH en el que se suprimió el gen de gM mediante la inserción de un módulo que contenía el marcador GFP. Este enfoque permitió sorprendentemente la diferenciación entre virus de partida (placas fluorescentes verdes) y placas recombinantes nuevas (placas no fluorescentes). Además, se generó una estirpe celular Vero (basada en el clon de células Vero 1008) que expresaba constitutivamente gM de EHV4 por los presentes inventores para superar las dificultades de la técnica. Dicha estirpe celular se generó mediante la transfección del gen de gM apropiado y la ulterior selección de células Vero que expresan gM. Sólo dichas células posibilitaron a los inventores replicar virus EHV-4 negativos de gM.
Dicha estirpe celular Vero complementaria de gM según la invención se depositó en el "Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Cell Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, RU, como depósito de patente según el Tratado de Budapest. La fecha del depósito fue el 28 de enero de 2003, la referencia de identificación preliminar es VERO GM y el número de acceso dado por la autoridad depositaria internacional ECACC/CAMR es 03012801. Se prefieren también estirpes celulares que tengan todas las características identificativas de dicha estirpe celular VERO GM depositada.
Se prefiere un método para obtener EHV recombinante que comprende las etapas de:
a)
aislamiento de un EHV de tipo natural;
b)
establecimiento de un plásmido según el gen de gM de EHV, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
c)
generación de una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
d)
establecimiento de un virus EH que porta una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
e)
deleción del módulo que codifica GFP; y
f)
selección de los clones de EHV en los que se suprime exitosamente el módulo de codificación de GFP.
Dichas células anteriormente indicadas son una realización importante de la presente invención. Por tanto, la invención se refiere a una estirpe celular para uso en un método según la invención, caracterizada porque el gen que codifica la proteína gM se transfecta a la citada estirpe celular y la citada estirpe celular expresa gM. La invención se refiere preferiblemente a una estirpe celular según la invención, caracterizada porque es una estirpe celular seleccionada del grupo de células Vero (células Vero-gM), RK-13 y cc (cc-gM).
Como se expone anteriormente para EHV-1, el uso de lacZ como marcador en lugar de GFP no condujo tampoco en EHV-4 a una generación exitosa de virus según la invención (véase de manera no limitante el ejemplo 2). Las células "positivas de lacZ" generalmente se teñían menos intensamente en células Vero que en células Rk13, y eran por tanto más difíciles de identificar, y el sistema EHV-4 se replicaba más lentamente que EHV-1, y por tanto proporcionaba menos tiempo entre la identificación de placa y el aislamiento de la progenie viral viable. Por lo tanto, el uso de GFP representaba el único modo de obtener dicho virus EHV-4. El procedimiento se llevó a cabo como se describe anteriormente para EHV-1 y, sorprendentemente, condujo también a una exitosa identificación del virus EHV-4 con gM suprimida en virtud de la identificación de las placas fluorescentes.
El aislamiento de EHV de tipo natural se realiza recogiendo tejido pulmonar de necropsia de animales sospechosos de haber enfermado por EHV, y aislando el EHV en células de tejido como es conocido en la técnica. Se ha publicado la secuencia genómica completa de EHV-1 por Telford et al. (1992). Igualmente, se ha publicado la secuencia genómica completa de EHV-4 por Telford et al. (1998). La amplificación por PCR de secuencias de ADN mediante el uso de la unión de cebadores específicos a cadenas complementarias de ADN diana flanqueante del intervalo de ADN de interés representa un método estándar de biología molecular. Son conocidos por un experto en la técnica los métodos para ligar secuencias de ADN apropiadas a plásmidos adecuados para las construcciones pretendidas, para la transfección de ADN a células eucariotas, para el análisis de transferencia Southern y Western, para la escisión dirigida a sitio de fragmentos de ADN mediante enzimas de restricción y para la selección de estirpes celulares que expresan el gen heterólogo deseado o plásmidos que albergan el gen o virus deseado, en el que se suprime un cierto gen. Son conocidos por el experto en la técnica métodos estándar de biología molecular tales como las técnicas citadas anteriormente, y pueden encontrarse también por ejemplo en Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y Bertram, S. y Gassen, H.G. "Gentechnische Methoden", editorial G. Fischer, Stuttgart, Nueva York, 1991).
"Deleción" significa la eliminación de uno o varios nucleótidos o aminoácidos.
Otra realización importante de la invención es una composición farmacéutica o vacuna que comprende un EHV según la invención, opcionalmente en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una parte importante también de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico según la invención como se expone anteriormente.
Preferiblemente, una vacuna según la invención indica una vacuna como se define anteriormente. La expresión "vacuna viva" indica una vacuna que comprende una partícula capaz de replicación, particularmente un componente viral activo de replicación.
Preferiblemente, una vacuna según la invención comprende un EHV-1 con gM suprimida según la invención como se expone anteriormente combinado con un EHV-4 con gM suprimida según la invención como se expone anteriormente, o cualquier otro grupo antigénico, y opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna puede administrarse en forma de una vacuna combinada en el mismo punto temporal. Lo más preferiblemente, dicho EHV-1 atenuado según la invención puede administrarse primero, seguido por la administración de un EHV-4 atenuado según la invención de tres a cuatro semanas después. Lo más preferiblemente también, dicho EHV-1 atenuado según la invención puede administrarse en combinación con un EHV-4 atenuado según la invención en un esquema de vacunación típico en el que se administran dos o tres vacunaciones básicas. Es un esquema de vacunación típico de dicha vacuna dos vacunaciones separadas por cuatro semanas (vacunación básica), seguida de recuerdos regulares cada seis meses. Sin embargo, cualquiera de dichas vacunas según la invención como se exponen anteriormente puede administrarse también a diferentes intervalos, por ejemplo cada tres meses.
El experto puede elegir dividir la administración en dos o más aplicaciones que pueden aplicarse poco después una de otra, o en algún otro intervalo predeterminado. Preferiblemente, dicho intervalo puede ser: 1ª inmunización, 2ª inmunización aproximadamente 4 semanas después de ella y opcionalmente 3ª inmunización 5-6 meses después de ella. Dependiendo de la duración y eficacia deseadas del tratamiento, las vacunas pueden administrarse una o varias veces, también intermitentemente. Las vacunas según la invención pueden administrarse a una yegua antes de criar y de nuevo durante el embarazo para prevenir abortos asociados a EHV. Pueden vacunarse otros caballos, por ejemplo una vez al año. Los potros pueden vacunarse poco después de nacer.
Las vacunas de la presente invención pueden aplicarse mediante diferentes vías de aplicación conocidas por el experto, especialmente inyección intravenosa o inyección directa en tejidos diana. Para aplicación sistémica, se prefieren las vías intravenosa, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral o intramucosa (por ejemplo pulverizador nasal o respiratorio o inyección). Puede efectuarse una aplicación más local por vía subcutánea, intracutánea, intrapulmonar o directamente a o cerca del tejido a tratar (tejido conectivo, óseo, muscular, nervioso, epitelial). Puede aplicarse una composición de vacuna según la invención también mediante un implante o por vía oral. La más preferida es la administración intramuscular.
Para preparar preparaciones de vacuna adecuadas para las aplicaciones descritas anteriormente, el experto puede utilizar soluciones estériles inyectables conocidas fisiológicamente aceptables. Para preparar una solución lista para utilizar para inyección o infusión parenteral, están fácilmente disponibles soluciones acuosas isotónicas, tales como por ejemplo solución salina o las correspondientes soluciones de proteína plasmática. Las preparaciones de vacuna pueden presentarse como liofilizados o preparaciones secas, que pueden reconstituirse con una solución inyectable conocida directamente antes del uso en condiciones estériles, por ejemplo como un kit de unidades. La preparación final de las preparaciones de vacuna de la presente invención se prepara para inyección, infusión o perfusión mezclando virus purificado según la invención con una solución estéril fisiológicamente aceptable, que puede suplementarse con sustancias vehículo y/o excipiente conocidas. La dosis aplicada de cada virus EH según la invención presente en la formulación de vacuna puede estar preferiblemente entre 10^{4} y 10^{8} TCID_{50}/por animal, entre 10^{5} y 10^{7} TCID_{50}/por animal, lo más preferiblemente 10^{6} TCID_{50}/por animal.
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La invención se refiere además al uso de EHV según la invención en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de estados patológicos asociados a EHV.
La invención se refiere además al uso de un ácido nucleico según la invención en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de estados patológicos asociados a EHV.
La invención se refiere además a un método para la profilaxis y/o el tratamiento de un animal caracterizado porque la composición farmacéutica según la invención se aplica a dicho animal y se monitoriza el éxito terapéutico.
La invención se refiere preferiblemente a un método de tratamiento de un animal equino infectado por EHV con un EHV con gM suprimida según la invención como se describe anteriormente, en el que dicho EHV atenuado o la composición de vacuna como se describe anteriormente se administra al animal equino necesitado de ello a una dosis adecuada, como es conocido por el experto, y se monitoriza la reducción de los síntomas de EHV tales como viremia y leucopenia y/o tos y/o pirexia y/o descarga nasal y/o diarrea y/o depresión y/o aborto. Dicho tratamiento puede repetirse preferiblemente. Por tanto, la invención se refiere a un método para la profilaxis y/o el tratamiento de un animal, caracterizado porque se aplica una composición farmacéutica según la invención a dicho animal y se monitoriza el
éxito terapéutico. El tratamiento puede llevarse a cabo como se expone para la composición de vacuna anteriormente.
La invención se refiere preferiblemente a un método para detectar anticuerpos contra estructuras específicas de infección de EHV-1 o EHV-4 y a un método para diferenciar infecciones de tipo natural de la presencia de EHV-1 o EHV-4 con gM suprimida como se describe anteriormente mediante un método inmunológico. Los métodos inmunológicos son conocidos por el experto en el campo e incluyen, pero sin limitación, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzima) o ELISA sándwich, transferencias de mancha, inmunotransferencias, radioinmunoensayos (Radioimmunoassay, RIA), ensayos de Ouchterlony basados en difusión, ensayos inmunofluorescentes de inmunoelectrodifusión o transferencias Western. Los ejemplos de métodos inmunológicos se describen, por ejemplo, en: "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, Holanda (1986); Bullock et al. "Techniques in Immunocytochemistry", Academic Press, Orlando, FL, vol. 1 (1982), vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, Holanda (1985). Dicho ELISA puede utilizarse, pero no limitarse, al uso del producto génico de gM o una parte del producto génico de gM o cualquier otro producto génico del virus EH-1 o EH-4 inmovilizado sobre una superficie plástica para análisis ELISA.
Un ELISA según la presente invención comprende, pero sin limitación, las etapas de:
a)
inmovilización de un producto génico de gM o un fragmento del mismo sobre un soporte plástico.
b)
lavado de la superficie plástica con un tampón de lavado apropiado (por ejemplo PBS-Tween),
c)
adición de las muestras a pocillos seleccionados e incubación de la placa ELISA según los métodos estándar.
d)
lavado de los pocillos de la placa ELISA y adición de un anticuerpo adecuado acoplado a una enzima tal como HRP (peroxidasa de rábano picante),
detección del conjugado anticuerpo unido/HRP añadiendo un sustrato adecuado, seguido de la lectura fotométrica de la densidad óptica de pocillos individuales. Son conocidos en el campo anticuerpos adecuados, por ejemplo Ig de conejo anti-caballo.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la presente invención, pero no debe considerarse que los mismos limiten el alcance de la invención expuesta en la presente memoria.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamientos de EHV-1 con gM suprimida
Se construyeron EHV-1 negativos de gM insertando el módulo de expresión de lacZ de Escherichia coli (H\DeltagM-lacZ) o de la proteína fluorescente verde (H\DeltagM-GFP), reemplazando así un 74,5% de las secuencias del gen de gM. La expresión de una proteína marcadora facilita la identificación y purificación ulteriores de un virus recombinante. Para evitar la presencia de cualquier secuencia "no EHV-1" en el virus de vacuna, se decidió suprimir las secuencias del gen marcador y construir otro EHV-1 negativo de gM de segunda generación, un H\DeltagM "blanco" (H\DeltagM-w).
Con este fin, se construyó un plásmido pXuBaxA (Figura 1): En primer lugar, se intentó la recombinación de secuencias pXuBaxA en el virus H\DeltagM-lacZ marcado con lacZ. En una primera etapa, se optimizaron las transfecciones de ADN mediadas por el método de fosfato de calcio de modo que dieron como resultado diversas placas blancas después del sembrado de 100-1000 PFU de sobrenadantes de transfección. En consecuencia, se eligieron diversas placas para la purificación del virus progenie y se sometieron a cuatro a cinco rondas de aislamiento de placas individuales.
Se analizaron genotípicamente múltiples poblaciones aisladas independientemente fenotípicamente negativas de lacZ mediante transferencia Southern, y resultó que portaban todavía secuencias del módulo lacZ. Se han anticipado las dificultades del aislamiento de poblaciones de virus verdaderamente negativos de lacZ debido al "silenciamiento lacZ", y por lo tanto se purificaron un gran número de poblaciones de virus fenotípicamente negativos de lacZ y se analizaron sin éxito. Por lo tanto, se cambió la estrategia de generar un virus RacH negativo de gM "blanco" por pasar a cotransfecciones con el EHV-1 negativo de gM, que se había construido mediante inserción de un módulo GFP. Utilizar el virus que expresa GFP facilitó la distinción entre virus de partida (placas fluorescentes verdes) y virus recombinantes nuevos (placas no fluorescentes) y aumentó por tanto la eficacia del aislamiento de placas fenotípicamente negativas de GFP. El cambio del RacH negativo de gM "de partida" no se suponía que influyera en el genotipo del virus recombinante esperado, ya que (i) ambos virus H\DeltagM de primera generación son, aparte del marcador, genéticamente idénticos y (ii) el genotipo final en la región de interés está determinado por el plásmido de recombinación (pXuBaxA).
Para la construcción del plásmido pXuBaxA (constructo necesario para obtener el EHV-1 negativo de gM "blanco"), se suprimió el fragmento ApaI-HincII de 962 pb en el marco abierto de lectura de 1352 pb de gM de EHV-1 del plásmido pBH3.1 (figura 1D). El plásmido pBH3.1 porta el fragmento BamHI-HindIII de EHV-1 rodeando al gen de gM (Seyboldt et al., 2000). Para evitar la expresión de cualquier producto truncado de gM, se han elegido las endonucleasas de restricción ApaI e HincII de tal modo que después del ajuste de extremos romos y el ligamiento, las secuencias C-terminales de gM restantes (183 pb) no estaban en fase con las secuencias N-terminales restantes
(208 pb).
La estirpe celular ccgM que expresa gM de EHV-1 (Seyboldt et al., 2000; obtenida del Dr. N. Osterrieder) se mantuvo en medio esencial mínimo suplementado con 5-10% de suero fetal bovino (Biochrom, irradiado con \gamma). Se consiguió la recombinación homóloga en EHV-1 mediante cotransfección mediada por fosfato de calcio de células ccgM con 5-10 \mug del plásmido pXuBaxA (figura 1D) y 2 \mug de ADN de H\DeltagM-lacZ o H\DeltagM-GFP, respectivamente.
Los análisis ulteriores de ADN de H\DeltagM-GFP con una sonda marcada con digoxigenina específica del fragmento BamHI-HindIII del plásmido pBH3.1 (figura 2) revelaron:
(i)
un fragmento de 2.757 pb y un fragmento de 9.043 pb con BamHI,
(ii)
un fragmento de 10.006 pb y un fragmento de 825 pb con HindIII,
(iii)
y un fragmento de 5.415 pb y 4.474 pb en ADN digerido con PstI.
Las enzimas de restricción utilizadas (BamHI, HindIII, PstI) cortan en secuencias del módulo marcador GFP, alterando así el patrón del fragmento respecto al ADN libre del módulo marcador GFP.
La sonda de GFP se unió a los respectivos primeros fragmentos (i-iii) y no detectó secuencias específicas de GFP en ADN de RacH o de H\DeltagM-w.
En ADN de RacH, se detectaron los fragmentos BamHI (11.166 pb), HindIII (10.199 pb) y PstI (9.257 pb) esperados, que redujeron consiguientemente su tamaño después de la supresión de 962 pb de secuencias de gM: (10.204 pb, 9.237 pb y 8.279 pb, figura 3B).
Se realizaron cinéticas de crecimiento de una etapa de virus negativos de gM (H\DeltagM-w o H\DeltagM-GFP), que se habían construido como se describe en la leyenda de la figura 1, y RacH. Se infectaron células Rk13 en placas de 24 pocillos a una MOI de 2 de los respectivos virus. Los sobrenadantes y sedimentos celulares infectados se recogieron separadamente en diversos momentos p.i. (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h p.i.). Los sobrenadantes se clarificaron de desechos celulares mediante centrifugación a baja velocidad, y las células se sometieron a liofilización antes de ensayar la infectividad asociada a células. Todas las valoraciones virales se determinaron individualmente en células Rk13 o ccgM, respectivamente, en placas de 24 pocillos. Los resultados (datos no mostrados) pueden resumirse de la siguiente manera: la infectividad asociada a célula de ambos virus H\DeltagM se redujo entre un factor de 1,6 (4 h p.i.) y 45 (20 h p.i.) en células Rk13 en comparación con las valoraciones de células infectadas con RacH (infectividad intracelular). Las valoraciones virales extracelulares de ambos virus H\DeltagM se redujeron como máximo 186 (H\DeltagM-w) o 650 (H\DeltagM-GFP) veces (12 h p.i.) en comparación con las de RacH (infectividad extracelular), apoyando un papel de la gM en la egresión viral también en RacH.
Ejemplo 2 Aislamientos de EHV-4 con gM suprimida
Paralelamente a la construcción de EHV-1 negativo de gM, se eligió la selección por lacZ para la selección de EHV-4. Para permitir el aislamiento de un EHV-4 negativo de gM, se construyó una estirpe celular Vero que expresaba constitutivamente gM de EHV-4. Se mantuvo el clon C1008 de células Vero (nº ATCC: CRL-1586) en medio esencial mínimo suplementado con 5-10% de suero fetal bovino (Biochrom, irradiado con \gamma). La estirpe celular recombinante Vero-gM se generó mediante la transfección mediada por Effectene^{TM} (Qiagen) de 1 \mug de plásmido pCgM4 (figura 3B) y 0,1 \mug de plásmido pSV2neo (que confiere resistencia a G418; Neubauer et al., 1997) en células Vero. Los clones celulares se seleccionaron primero por resistencia a G418 (Calbiochem), después por complementariedad trans de un EHV-4 negativo de gM. Se añadió G418 al medio cada 5 pasadas de estirpes recombinantes (500 \mug/ml). En todas las células se analizaron regularmente antígenos de Mycoplasma por PCR y de virus de la diarrea viral bovina (BVDV) por análisis FACS. El clon celular seleccionado se denominó Vero-gM y se utilizó en los siguientes experimentos.
Se cotransfectó ADN de EHV-4 con el plásmido pgM4\beta+ (figura 3B) en células Vero-gM. La recombinación dio como resultado diversas placas "positivas de lacZ" que se aislaron y resembraron. Pero entonces, la purificación de un mutante de deleción en EHV-4 resultó ser más difícil y más lenta que en EHV-1, ya que (i) las placas "positivas de lacZ" se teñían generalmente menos intensamente en células Vero que en células Rk13, y eran por tanto más difíciles de identificar, y (ii) el sistema EHV-4 se replicaba más lentamente que EHV-1, y proporcionaba por tanto menos tiempo entre la identificación de placa y el aislamiento de la progenie viral viable.
Todas las placas positivas de lacZ que se aislaron se perdieron durante la primera ronda de purificación, lo que hizo imperiosa la búsqueda de otra solución. Se intentó por lo tanto utilizar el marcador GFP también para EHV-4. En una primera etapa, se construyó el plásmido pgM4GFP+ (Figura 3B) y se utilizó para recombinación en ADN de EHV-4. Las placas positivas de GFP se purificaron mediante tres rondas de aislamiento de placas individuales en la estirpe celular Vero-gM. Se eligió una población viral positiva de GFP homogénea y el ADN viral se sometió a análisis de transferencia Southern (Figura 4). Se contransfectó después ADN del virus resultante, E4\DeltagM-GFP (Figura 3C) con el plásmido pgM4R o pgM4w (Figura 3B). El plásmido pgM4R se utilizó para la construcción de un EHV-4 con gM reparada denominado E4RgM (Figura 3A). El plásmido pgM4w era la base para generar el EHV-4 simultáneamente negativo de gM y marcador génico, E4\DeltagM-w (Figura 3D). Se aislaron las poblaciones virales E4RgM y E4\DeltagM-w para un fenotipo negativo de GFP, se purificaron en células Vero o Vero-gM y finalmente se analizaron mediante transferencia Southern (Figura 4). Para expresar gM de EHV-4 en células eucariotas, se generó el plásmido pCgM4 (Figura 3B). El ORF completo de gM de EHV-4 se amplificó por PCR utilizando los cebadores dados en la Figura 8 y la polimerasa Taq (MBI-Fermentas). El producto de PCR resultante se insertó en el vector pcDNAI/Amp
(Invitrogene).
El plásmido pgM4R era el resultado de la amplificación por PCR de los nucleótidos 91.699 a 94.808 (Telford et al., 1998) de EHV-4 y la inserción del producto de amplificación en el vector pGEM3Zf+ (Promega) (Figura 3B, Figura 8). Este plásmido se utilizó para la construcción del EHV-4 con gM reparada, E4RgM (Figura 3A).
Para construir el plásmido pgM4\beta+ (Figura 3B), que se diseñó para suprimir inicialmente 1110 pb de las 1352 pb de gM de EHV-4, se eligió una estrategia multietapa. En una primera etapa, se amplificaron independientemente ambas secuencias flanqueantes necesarias para la recombinación de ADN mediante PCR utilizando la polimerasa PFU (Stratagene). Los sitios de restricción necesarios para la clonación por etapas se añadieron con secuencias cebadoras (Figura 8). Los productos de PCR se insertaron en el vector pTZ18R (Pharmacia), dando como resultado los plásmidos pgM4Del1 y pgM4Del2 (Figura 8). En una siguiente etapa, se liberó el módulo de expresión lacZ de E. coli de 3,9 kpb del plásmido ptt264A+ (Osterrieder et al., 1996) mediante digestión con SalI y BamHI, y se insertó en el plásmido pgM4Del1, dando como resultado el plásmido pgM4Del1\beta+. Después, se introdujeron secuencias específicas de EHV-4, tomadas de pgM4Del2, en pgM4Del1\beta+ utilizando PstI y SalI, de tal modo que el módulo del gen marcador estaba flanqueado por secuencias específicas de EHV-4 en el plásmido resultante pgM4\beta+ (Figura 3B).
El plásmido pgM4\beta+ se digirió después con SalI y BamHI, liberando de nuevo el módulo lacZ, se rellenaron los salientes 5' resultantes con la polimerasa Klenow, y el constructo resultante del religamiento se denominó pgM4w (Fig. 3B). De nuevo, se diseñó un cambio de marco de lectura entre los 208 nt N-terminales y los 33 nt C-terminales restantes de la secuencia de gM.
Para generar el plásmido pgM4GFP+ (Fig. 3B), se tomó el módulo lacZ de pgM4\beta+ (Figura 3B) utilizando los sitios SalI y BamHI y se reemplazó por el módulo GFP (incluyendo el promotor CMV y SV40-poliA), que se había suprimido del vector pEGFP-C1 (Clontech) mediante digestión con AsnI y MluI. Los salientes generados por la enzima de restricción se ajustaron a extremos romos con la polimerasa Klenow.
Se confirmó la correcta amplificación de todos los productos de PCR mediante secuenciación cíclica (MWG Biotech) y comparación con la secuencia publicada de la cepa NS80567 de EHV-4 (Telford et al., 1998).
Se realizó la recombinación en EHV-4 utilizando la línea celular Vero-gM y se cotransfectó el plásmido pgM4\beta+ o pgM4GFP+ (Figura 3B) con ADN de EHV-4 para generar un EHV-4 negativo de gM de primera generación (Figura 3C). El plásmido pgM4w (Figura 3B) en combinación con ADN de EHV-4 negativo de gM dio como resultado E4\DeltagM-w (Figura 3D). Finalmente, el EHV-4 con gM reparada, E4RgM (Figura 3A), se aisló después de cotransfección del plásmido pgM4R (Figura 3B) con ADN de E4\DeltagM-GFP en células Vero.
Se escindió ADN de EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP con PstI, EcoRV o HindIII, y los fragmentos de ADN se transfirieron a membranas de nailon. Se hibridaron membranas paralelas con secuencias específicas de GFP (idénticamente a la Figura 2) o con una sonda, denominada gM3.1, que contiene las secuencias específicas de EHV-4 tomadas del plásmido pgM4R (Figura 3B).
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Los resultados de la digestión obtenidos (Figura 4) fueron los siguientes:
(i) en ADN de E4\DeltagM-GFP, la sonda GFP reconoció fragmentos de 5.531 pb cuando se escindió con PstI, de 8.383 pb después de digestión con EcoRV y de 4.528 pb después de digestión con HindIII. Fragmentos idénticos más fragmentos de 1.792 pb (PstI), 1.801 pb (EcoRV) y 826 pb más 5.487 pb (HindIII) reaccionaron con la sonda gM3.1.
(ii) ni el EHV-4 original ni los virus reparados E4RgM ni E4\DeltagM-w portaban ninguna secuencia específica de GFP;
(iii) los fragmentos de ADN reactivos con gM3.1 en EHV-4 y E4RgM se detectaron a 6.806 pb (PstI), a 7.874 pb más 1.801 pb (EcoRV) y a 4.837 pb más 5.487 pb (HindIII), respectivamente;
(iv) el virus E4\DeltagM-w negativo de gM y de módulo GFP no hibridó con secuencias GFP, sino con las respectivas secuencias específicas de EHV-4 (gM3.1). La última sonda detectó fragmentos que carecían de 1110 pb de las secuencias gM, en comparación con el virus de tipo natural, concretamente de 5.696 pb (PstI), de 6.764 pb más 1.801 pb (EcoRV) y de 3.727 pb más 5.487 pb (HindIII), respectivamente.
En ADN escindido con HindIII de todos estos virus, existe otro fragmento específico de sonda gM3.1 de 126 pb (Fig. 2C), pero este fragmento es demasiado pequeño para mostrarse en esta transferencia Southern.
Los virus E4\DeltagM-GFP y E4\DeltagM-w perdieron su capacidad de expresar gM y además E4\DeltagM-w perdió la secuencia génica marcadora.
a) Crecimiento viral en células de cultivo. Se compararon las propiedades de crecimiento viral de los diversos virus mutantes como se detalla anteriormente en células Vero y Vero-gM. Las células sembradas en placas de 24 pocillos se infectaron a una MOI de 1-2 y se determinaron las valoraciones virales extracelular (infectividad extracelular) e intracelular (infectividad intracelular) a diferentes puntos temporales p.i. (Fig. 5). Mientras que las propiedades de crecimiento del virus E4RgM de rescate correspondieron bien a las de EHV-4, hubo una sorprendente inhibición en la producción de las valoraciones virales extracelulares de E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP en células no complementarias. En esta serie de experimentos (media de dos experimentos independientes), la infectividad extracelular no pudo detectarse nunca antes de 24 h p.i. Incluso a 30 horas p.i., sólo se observaron valoraciones extracelular muy bajas (máximo de 1,5 placas/ml a la dilución menor de 10^{-1}), aunque las células mostraron un grave efecto citopático. Las diferencias en infectividad intracelular, sin embargo, nunca alcanzaron 100 veces y tuvieron un máximo a 24 horas p.i. (84 veces entre EHV-4 y E4\DeltagM-w). El retardo en la detección de la infectividad intracelular fue sólo de un punto temporal (12 h frente a 15 h p.i.). Tomado conjuntamente, podía demostrarse sorprendentemente que la deleción de secuencias de gM del fondo de EHV-4 influenciaba masivamente la replicación viral in vitro, pero esa expresión de gM no es esencial para la replicación. Especialmente, se redujo el virus infeccioso extracelular, y bajó la capacidad de infectar directamente células adyacentes, como refleja el tamaño de las placas.
b) Tamaño de placas. Se midieron los diámetros de 150 placas después de la infección de células Vero o Vero-gM con EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-w o E4\DeltagM-GFP, y se determinaron los tamaños medios de placa respecto a los tamaños de placas de tipo natural, que se fijaron a 100%. Se demostró claramente que los virus negativos de gM eran capaces de infectar y replicarse en células Vero, pero que los diámetros máximos de placa estaban notablemente reducidos, a menos de un 20% de los diámetros de placa de tipo natural (Fig. 6). La infección con el virus original o de rescate dio como resultado la aparición de placas de tipo natural, indicando que el fenotipo observado estaba realmente inducido por la deleción de gM. Esto se corroboró adicionalmente por el hecho de que la formación de placa de E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP se restableció totalmente en la línea celular Vero-gM (datos no mostrados).
c) Experimentos de penetración. En este experimento, se evaluó la influencia de gM de EHV-4 sobre la cinética de entrada de EHV-4. Se permitieron adsorber 100 PFU de los diferentes virus, EHV-4 original, el virus E4RgM con gM reparada, así como los mutantes de deleción de gM y E4\DeltagM-GFP (véase la Figura 3), a 4ºC en células Vero en placas de 6 pocillos. Después de 90 minutos, se reemplazaron los respectivos inóculos por medio fresco y se inició la penetración cambiando la temperatura de incubación a 37ºC. A diferentes momentos después del cambio de temperatura, empezando inmediatamente (= 0 min), la infectividad extracelular se inactivó por pH mediante el tratamiento de las células con un tampón citrato (pH 3,0). Se lavaron consiguientemente muestras paralelas, pero el tampón citrato se reemplazó por PBS de tal modo que en cada punto temporal la "infectividad adsorbida" pudiera compararse con la "infectividad penetrada". Se determinaron los números de placas después de incubar las células durante cuatro días en recubrimiento de Methocell.
c) Se realizaron diversos conjuntos de experimentos: en la Figura 7A, se representan los resultados de virus genotípica y fenotípicamente negativos de gM después de propagación en células Vero no complementarias; mientras que la Figura 7B representa la cinética de E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP fenotípicamente complementados, ya que los virus se han hecho crecer en células Vero-gM que expresan gM.
Se protegió una medida de 52,8% (56,7%) del EHV-4 (E4RgM) original infeccioso del tratamiento ácido extracelular a 40 minutos después de iniciar la penetración (Fig. 7A, círculos blancos), mientras que sin embargo se protegieron sólo 33,7% (E4\DeltagM-rectángulos negros) y 38,5% (E4\DeltagM-GFP, triángulos negros) de virus negativos de gM. A puntos temporales posteriores de cinética de entrada, las diferentes gráficas empiezan a superponerse diversamente y se alcanza una eficacia de penetración máxima de entre 61,7% y 78,9% después de 150 minutos de tiempo de penetración, indicando que una cierta variabilidad de ensayo puede dar cuenta de las ligeras diferencias observadas.
(Fig. 7A). Cuando los virus negativos de gM se habían preparado en células Vero-gM complementarias, no se observó ninguna diferencia en su eficacia de penetración (7B). En contraposición con un retardo en la cinética de entrada de EHV-1 negativo de gM de aproximadamente un 20% (cepa RacL11; Osterrieder et al., 1996) hasta un 40% (cepa KyA; Seyboldt et al., 2000), el efecto de suprimir la gM de EHV-4 tiene que anotarse con reservas. Sin embargo, pueden extraerse las siguientes conclusiones: (i) se observó una diferencia en la cinética de virus negativos de gM fenotípicamente complementados y no complementados (Fig. 7A-B), pero (ii) la influencia de la deleción de gM sobre la penetración de EHV-4 es virtualmente insignificante.
Ejemplo 3 Análisis en sueros de caballo de anticuerpos gM utilizando un ensayo serológico específico de gM
Para afirmar si gM puede utilizarse como marcador serológico para la distinción de infección de tipo natural frente a vacunación con una vacuna negativa de gM, tenían que comprobarse diversas suposiciones. Principalmente, necesitaba evaluarse si los sueros de caballos infectados con virus de campo contienen anticuerpos específicos de gM. Para el análisis inicial se eligió un ensayo de transferencia Western, ya que este sistema permitía identificar una reacción específica frente a la reactividad de fondo. Cuando se utilizan sueros altamente neutralizantes (valoraciones neutralizantes de EHV-1 y/o 4 entre 1:128 y 256), se estableció (datos no mostrados) que los lisados de la estirpe celular ccgM que expresa gM de EHV-1 permitían la detección de una señal específica por sueros de caballo, y que una dilución de sueros de 1:3000 parecía funcionar óptimamente.
En consecuencia, se analizó en los sueros de los 12 potros (6 vacunados y 6 controles) que habían participado en un ensayo de vacuna de gM de EHV-1 la reactividad frente a gM en transferencia Western. De cada caballo individual, se ensayaron tres sueros diferentes: tomado antes de entrar en el ensayo (Pre), 4 semanas después de la segunda vacunación (V2) y dos semanas después de la exposición a la infección (C), respectivamente.
En resumen, por análisis de transferencia Western (Figura 9) se mostró que (i) los sueros de caballos que exhibían actividad de neutralización de EHV-1 dieron todos positivo por gM, que (ii) la reactividad frente a gM no se detectó nunca en ninguna de las muestras analizadas antes del contacto conocido con EHV-1 o después de la vacunación con el EHV-1 negativo de gM y que (iii) después de la infección de los caballos del ensayo de vacuna con el virus de exposición positivo de gM, la gM fue claramente detectable en 10 de 12 casos. Finalmente, (iv) se observó que las valoraciones de anticuerpo anti-EHV-1 y la intensidad de la reactividad frente a gM no parecían directamente correlacionadas.
Debido a la alta reactividad de fondo de los sueros de caballo, el establecimiento de ensayos serológicos es difícil. Basándose en datos de inmunofluorescencia indirecta (IIF) obtenidos de sueros de caballo, se confirmó que tendrá que establecerse un sistema de ensayo indirecto o de bloqueo o tendrán que utilizarse polipéptidos gM altamente purificados en un ensayo ELISA. Con este fin, se estableció un ELISA como sigue. Se inmovilizaron polipéptidos gM purificados o gM completa sobre el soporte sólido de una placa de 96 pocillos que se recubrió para asegurar una buena adherencia de la proteína capturadora. Para el ensayo, los sitios de unión no específica se bloquearon con leche desecada o sustancias similares para evitar la unión inespecífica. Después de ello, se lavó la superficie plástica con un tampón de lavado apropiado (por ejemplo PBS-Tween) para eliminar el exceso de agente bloqueante. Después, se añadieron las muestras de ensayo a los pocillos seleccionados y la placa ELISA se incubó a 37ºC según métodos estandarizados, permitiendo a los anticuerpos en la muestra de ensayo que se unieran a la proteína capturadora inmovilizada. En la siguiente etapa, se lavó concienzudamente la placa ELISA varias veces lavando con tampón de lavado, seguido de la adición de un anticuerpo anti-caballo adecuado acoplado a una enzima tal como HRP (peroxidasa de rábano picante). La detección del conjugado anticuerpo unido/HRP se realizó finalmente añadiendo un sustrato adecuado, seguido de la lectura fotométrica de la densidad óptica de pocillos individuales. El valor obtenido ha de compararse con los controles positivos y negativos realizados en el mismo ensayo.
Ejemplo 4 Identificación de gM de EHV-4
Aunque la secuencia aminoacídica predicha de gM de EHV-4 se calcula que es un 86,7% idéntica a la de gM de EHV-1 (Telford et al., 1998), el Mab 13B2 anti-gM de EHV-1 (Allen y Yeargan, 1987) reacciona específicamente en transferencia Western sólo con la proteína específica de tipo (Crabb et al., 1991). Para identificar sin embargo el homólogo de EHV-4 en este estudio, se ensayaron otros anticuerpos anti-gM de EHV-1 (Seyboldt, et al., 2000; Day, 1999) en viriones de EHV-4 purificados, en lisados de células infectadas con EHV-4 o en lisados de células Vero-gM, siendo esta última una estirpe celular recombinante desarrollada para sintetizar gM de EHV-4 bajo el control del promotor IE-HCMV. La reactividad de todos los anticuerpos monoclonales anti-gM de EHV-1 frente a gM de EHV-4 estaba por debajo del límite de detección de la transferencia Western, mientras que las muestras de EHV-1 paralelas eran siempre fácilmente reactivas (datos no mostrados). Sólo el antisuero policlonal, que se había generado en conejos frente a un polipéptido derivado de gM de EHV-1 con cola de His (aminoácidos 376-450; Seyboldt et al., 2000) reaccionó suficientemente fuerte con la gM heteróloga para permitir la identificación de gM de EHV-4 (Fig. 10A). Utilizando este anticuerpo, se observó reactividad específica a una Mr de aproximadamente 50.000 a 55.000 en viriones de EHV-4 purificados. Según sus propiedades hidrófobas predichas, la proteína gM detectada agregó tras ebullición. En contraposición, la forma de gM expresada en células Vero-gM corre principalmente a una Mr de aproximadamente 46.000 a 48.000, indicando que las proteínas gM de EHV-4 se procesan similarmente a como se ha mostrado para EHV-1 (Osterrieder et al., 1997; Rudolph y Osterrieder, 2002).
Se realizaron diversos experimentos para analizar el fenotipo de la deleción de gM en EHV-4. Para comparar la expresión de otras glicoproteínas, se sometieron lisados de células Vero infectadas con EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-w o E4\DeltagM-GFP a análisis de transferencia Western. Se demuestra que la deleción de gM no influía en la producción de las proteínas tardías gB o gD, indicando que las etapas tempranas de la replicación viral no estaban sustancialmente afectadas por la deleción.
En otro experimento, pudo demostrarse mediante análisis de preparaciones de viriones de tipo natural, EHV-4 con gM reparada o ambos con gM suprimida, que no era detectable ninguna reactividad frente a gM con virus negativos de gM, mientras que la proteína era fácilmente reactiva en viriones de control. La presencia de viriones en la respectiva preparación se mostró en un ensayo de transferencia paralelo frente a gB (Fig. 10B).
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Claims (29)

1. Un herpesvirus equino, en el que la proteína gM está ausente, caracterizado porque el citado herpesvirus equino está libre de elementos heterólogos.
2. El herpesvirus equino según la reivindicación 1, caracterizado porque está suprimido el gen que codifica la proteína gM.
3. El herpesvirus equino según la reivindicación 1 ó 2, obtenible mediante un método que comprende las etapas de:
a)
aislar un herpesvirus equino de tipo natural;
b)
establecer un plásmido que codifique el gen de gM de herpesvirus equino, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
c)
generar una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
d)
establecer un herpesvirus equino que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de herpesvirus equino y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
e)
suprimir el módulo que codifica GPF; y
f)
selecionar los clones de herpesvirus equino en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
4. El herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es herpesvirus equino-1.
5. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque están suprimidas 850-1100 pb del marco abierto de lectura de gM.
6. El herpesvirus equino-1 según las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque está suprimida la secuencia de codificación entera de gM, excepto por 150-200 pb de la secuencia de codificación de la porción C-terminal y excepto por 150-250 pb de la secuencia de codificación de la porción N-terminal.
7. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 93268-93318 a 94222-94322 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1992.
8. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 93268 a 94322 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1992.
9. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque está suprimida la secuencia de codificación completa de gM excepto por 184 pb de la secuencia de codificación de la porción C-terminal y excepto por 209 pb de la secuencia de codificación de la porción N-terminal.
10. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 94263 a 933302 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1992.
11. El herpesvirus equino-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizado porque es una variante recombinante basada en la cepa RacH de EHV-1.
12. Un herpesvirus equino-1, caracterizado porque es un aislamiento H\DeltagM-w depositado en el ECACC/CAMR el 16 de octubre de 2002 con el número de acceso 02101663.
13. El herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es herpesvirus equino-4.
14. El herpesvirus equino-4 según la reivindicación 13, caracterizado porque están suprimidas 900-1150 pb del marco abierto de lectura de gM.
15. El herpesvirus equino-4 según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque está suprimida la secuencia de codificación completa de gM excepto 0-50 pb de la secuencia de codificación de la porción C-terminal y excepto por 150-250 pb de la secuencia de codificación de la porción N-terminal.
16. El herpesvirus equino-4 según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 92681-92731 a 93765-93865 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1998.
17. El herpesvirus equino-4 según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 92681 a 93865 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1998.
18. El herpesvirus equino-4 según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque está suprimida la secuencia de codificación entera de gM excepto por 34 pb de la secuencia de codificación de la porción C-terminal y excepto por 209 pb de la secuencia de codificación de la porción N-terminal.
19. El herpesvirus equino-4 según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 92715 a 93824 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford 1998.
20. Un herpesvirus equino-4, caracterizado porque es un aislamiento E4\DeltagM que se depositó en el ECACC/
CAMR el 14 de enero de 2003 con número de acceso 03011401.
21. Un ácido nucleico que codifica un herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
22. Una preparación de vacuna que comprende un herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
23. Una preparación de vacuna que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21.
24. Uso de un herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones por herpesvirus equino.
25. Uso de un ácido nucleico según la reivindicación 21 en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones por herpesvirus equino.
26. Una preparación de vacuna que comprende al menos un herpesvirus equino-1 según las reivindicaciones 1 a 12 y un herpesvirus equino-4 según las reivindicaciones 13 a 20.
27. Uso de al menos un herpesvirus equino-1 según las reivindicaciones 1 a 12 y un herpesvirus equino-4 según las reivindicaciones 13 a 20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por herpesvirus equino.
28. Método para la obtención de un herpesvirus equino recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
a)
aislar un herpesvirus equino de tipo natural;
b)
establecer un plásmido que codifique el gen de gM de herpesvirus equino, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
c)
generar una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
d)
establecer un herpesvirus equino que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
e)
suprimir el módulo que codifica GPF; y
f)
seleccionar los clones de EHV en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
29. Una estirpe celular complementaria de gM, caracterizada porque es VERO GM que se depositó en el ECACC/
CAMR el 28 de enero de 2003 con el número de acceso 03012801.
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