ES2324406T3 - Mutantes de herpesvirus equino (ehv) gm-negativos sin elementos heterologos. - Google Patents
Mutantes de herpesvirus equino (ehv) gm-negativos sin elementos heterologos. Download PDFInfo
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Abstract
Un herpesvirus equino, en el que la proteína gM está ausente, caracterizado porque el citado herpesvirus equino está libre de elementos heterólogos.
Description
Mutantes de herpesvirus equino (EHV)
gM-negativos sin elementos heterólogos.
La presente invención se refiere al campo de la
salud animal, y en particular de los herpesvirus equinos (EHV) en
los que el gen que codifica la proteína gM está ausente y que están
libres de elementos heterólogos. Aspectos adicionales de la
invención se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden
dichos virus, a usos de los mismos y a métodos para la profilaxis y
el tratamiento de infecciones por EHV. La invención se refiere
también a composiciones farmacéuticas que comprenden la combinación
de virus EHV-1 y EHV-4, en los que
el gen que codifica la proteína gM está ausente y que están libres
de elementos heterólogos.
El herpesvirus equino 1 (EHV-1),
un miembro de los Alphaherpesvirinae, es la causa principal
de aborto inducido por virus en equinos y causa enfermedades
respiratorias y neurológicas. El herpesvirus equino 4
(EHV-4) puede inducir también síntomas
respiratorios, abortos o trastornos neurológicos. Se ha determinado
la secuencia de ADN completa de ambas especies
(EHV-1: cepa Ab4p, EHV-4: cepa
NS80567) (Telford, E.A.R., et al., 1992; Telford, E.A.R.,
et al., 1998). Sin embargo, sólo se han caracterizado unos
pocos genes y productos génicos con respecto a su relevancia para
la virulencia y propiedades inmunogénicas del EHV.
Las glicoproteínas de herpesvirus están
implicadas crucialmente en las etapas tempranas de la infección, en
la liberación de viriones de las células y en la extensión directa
célula a célula de los viriones mediante fusión de las células
vecinas. Hasta la fecha, se han identificado 11 glicoproteínas
codificadas por herpesvirus simplex de tipo 1
(HSV-1), y se han designado gB, gC, gD, gE, gG, gH,
gI, gJ, gK, gL y gM. Los mutantes de HSV-1 que
carecen de gC, gE, gG, gI, gJ y gM son viables, indicando que estos
genes son innecesarios para la replicación en células cultivadas.
La comparación de las secuencias nucleotídicas del
HSV-1 y del herpesvirus equino 1 reveló que todas
las glicoproteínas de HSV-1 conocidas están
conservadas en EHV-1. Según la nomenclatura actual,
estas glicoproteínas se designan por los nombres de sus homólogas de
HSV-1. Es conocido que gC, gE y gI de
EHV-1 no son esenciales para el crecimiento en
cultivo celular, mientras que gB y gD son esenciales para el
crecimiento del virus en células cultivadas. No son conocidas las
contribuciones de otras glicoproteínas de EHV-1 a
la replicación en células cultivadas (Flowers, C.C. et al.,
1992). Los análisis transcripcionales y de proteínas han mostrado
que las glicoproteínas gB, gC, gD, gG, gH y gK se expresan en
células infectadas por EHV-1. La glicoproteína gM
(codificada por el gen UL10 [Baines, J.D., et al., 1991;
Baines, J.D. et al., 1993]) es la única glicoproteína no
esencial reseñada que se conserva en todas las subfamilias de
herpesvirus, y se ha descrito para citomegalovirus humano y de
múrido y los miembros de Gammaherpesvirinae
EHV-2, herpesvirus de mono ardilla y virus de
Epstein-Barr. Como muchas glicoproteínas de
herpesvirus, la gM de HSV-1 está presente en
viriones y membranas de células infectadas. Los mutantes de
HSV-1 que carecen sólo de gM crecieron en los
sistemas de cultivo celular a valoraciones reducidas aproximadamente
10 veces con respecto a las de los virus de tipo natural, y
mostraron una virulencia reducida en un modelo de múrido (Baines,
J.D. et al., 1991; MacLean, C.A. et al., 1993). La
homóloga de gM de EHV-1 (gp21/22a; indicada como gM
de EHV-1 de ahora en adelante) se describió por
primera vez por Allen y Yeargan (Allen, G.P. et al., 1987), y
se mostró que era un constituyente principal de la cubierta viral.
Investigaciones posteriores revelaron que el gen 52, el gen
homólogo de UL10 de HSV-1, codifica el polipéptido
gM de EHV-1 de 450 aminoácidos (Pilling, A. et
al., 1994; Telford, E.A.R. et al., 1992). La gM de
EHV-1 representa una proteína hidrófoba múltiple
que contiene ocho dominios transmembrana predichos, y se ha reseñado
que está presente en células infectadas y en viriones purificados
en forma de una proteína de M_{r} 45.000 (Pilling, A. et
al., 1994; Telford. E.A.R. et al., 1992).
Para el control de las infecciones por
EHV-1, se siguieron dos enfoques diferentes. En
primer lugar, se han desarrollado vacunas vivas modificadas (MLV),
incluyendo la cepa RacH (Mayr, A. et al., 1968; Hübert,
P.H., et al., 1996), que se utiliza ampliamente en Europa y
los Estados Unidos. En segundo lugar, vacunas inactivadas y vacunas
de subunidades basadas en glicoproteínas virales expresadas
recombinantemente tales como las glicoproteínas (g) B, C, D y H,
que inducían protección parcial frente a la exposición ulterior a
infección por EHV-1 en un modelo de múrido. Las
vacunas de subunidades que comprenden dichas glicoproteínas, por
ejemplo gB, gC, gD y gH, protegen sólo débil-
mente frente a la reinfección (Awan, et al., 1990; Osterrieder et al., 1995; Tewari, et al., 1994; Stokes et al., 1996).
mente frente a la reinfección (Awan, et al., 1990; Osterrieder et al., 1995; Tewari, et al., 1994; Stokes et al., 1996).
El problema técnico subyacente de esta invención
era proporcionar vacunas mejoradas que protegieran mejor frente a la
infección por EHV que las vacunas de la técnica anterior.
Figura
1
Esta figura muestra el mapa de virus y plásmidos
utilizados para la construcción de H\DeltagM-w. El
virus H\DeltagM "de primera generación" se ha construido
previamente insertando el módulo de expresión de lacZ de
Escherichia coli (H\DeltagM-lacZ) o de la
proteína fluorescente verde (GFP) (H\DeltagM-GFP).
Se muestra el mapa BamHI (A) de la cepa RacH de
EHV-1 y se aumenta de escala el fragmento
BamHI-HindIII que contiene el ORF de gM, mostrando
la organización genómica de la región (B). El virus negativo de gM,
H\DeltagM-GFP, porta un módulo de expresión de GFP
que reemplaza la mayor parte del gen de gM de EHV-1.
Se representa la sonda específica de GFP (C), que se utilizó en
transferencias Southern. El plásmido pBH3.1 porta el fragmento de
interés BamHI-HindIII de EHV-1, y se
utilizó para construir el plásmido pXuBaxA. Después de la
cotransfección de ADN de H\DeltagM-GFP con el
plásmido pXuBaxA, dio como resultado H\DeltagM-w
(D). Sitios de restricción: BamHI-B,
HindIII-H, SphI-S,
HincII-Hc, ApaI-A,
PstI-P.
Figura
2
Se escindió ADN de RacH,
H\DeltagM-GFP y H\DeltagM-w con
BamHI, HindIII o PstI, y se analizó con una sonda específica de GFP
(GFP) o el fragmento BamHI-HindIII de
EHV-1 de pBH3.1 (pBH3.1). Los híbridos de ADN se
detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando CSPD. Los tamaños
de los marcadores de peso molecular (Biolabs) se dan en kpb en el
margen izquierdo. La flecha apunta a un híbrido específico apenas
visible.
Figura
3
En esta figura, se representa un mapa BamHI de
la cepa NS80567 de EHV-4. El fragmento
BamHI-e ampliado comprende los ORF de gM y vecinos
(A). Se representan los constructos de plásmido y los sitios de
cebado (B). Se utilizó el plásmido pgM4GFP+ para la generación de
E4\DeltagM-GFP, el EHV-4 positivo
de GFP y negativo de gM (B, C). La recombinación de ADN de
E4\DeltagM-GFP o con el plásmido pgM4R (B), que
contiene 3.109 pb de secuencias de EHV-4 incluyendo
el ORF de gM, dio como resultado E4RgM, el EHV-4 con
gM reparada (A), o bien con el plásmido pgM4w (B), dio como
resultado E4\DeltagM-w, el EHV-4
negativo de GFP y negativo de gM (D).
Sitios de restricción: BamHI-B,
PstI-P, EcoRI-E,
SalI-Sa, MluI-M,
AsnI-As, EcoRV-EV.
Figura
4
Se escindió ADN de EHV-4, E4RgM,
E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP
con PstI, EcORV o HindIII como se indica, y los fragmentos de ADN se
transfirieron a membranas de nailon. Paralelamente, hibridaron
membranas con secuencias específicas de GFP o con una sonda,
denominada gM3.1, que contenía las secuencias específicas de
EHV-4 tomadas del plásmido pgM4R (Fig. 3). Los
híbridos de ADN se detectaron mediante quimioluminiscencia
utilizando CSPD. Los tamaños de los marcadores de peso molecular
(Biolabs) se dan en kpb.
Figura
5
Se infectaron células con una MOI de 2 de los
diferentes virus, como se enumeran en la tabla. Se representan las
cinéticas del crecimiento viral como valoraciones virales
determinadas en sobrenadantes de células infectadas (actividad
extracelular) o en células infectadas (actividad intracelular)
respecto al punto temporal indicado. Se muestran las medias de dos
experimentos individuales, las desviaciones estándar se dan como
barras de error.
Figura
6
Se infectaron células Vero o
Vero-gM en placas de 6 pocillos con 50 PFU de
EHV-4, E4RgM, E4\DeltagM-GFP o
E4\DeltagM-w. Se determinaron los diámetros
máximos de 150 placas respectivas, y los tamaños medios de placa se
dan en porcentaje respecto a los tamaños de las placas de tipo
natural, que se fijaron como 100%. Las desviaciones estándar se dan
como barras de error (A). Las placas se tiñeron mediante
inmunofluorescencia indirecta (Mab 20C4 anti-gD,
1:1000) el día 4 p.i. y se analizaron en un Axioscope (x100, Zeiss,
Alemania). Las imágenes se escanearon y se procesaron digitalmente
(B).
Figura
7
La penetración de EHV-4, E4RgM,
E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP se
produjo en células Vero no complementarias (A) o en células
Vero-gM no complementarias (B). A puntos temporales
dados, se determinó la eficacia de penetración como el porcentaje
del número de placas presentes después del tratamiento con citrato
respecto al de placas presentes después del tratamiento de control.
Se dan las medias de dos experimentos independientes. Las
desviaciones estándar se representan como barras de error.
Figura
8
Secuencias de cebador de PCR y localización de
las amplificaciones en el genoma de EHV-4. Las
secuencias que representan los sitios de reconocimiento de enzimas
de restricción se imprimen en negrita, y se enumeran las enzimas
respectivas. Los productos de PCR se insertaron en los vectores
dados, dando como resultado los plásmidos pCgM4, pgM4R, pgM4Del1 o
pgM4Del2, como se indica. La localización de un fragmento en el
genoma de EHV-4 se da respecto a la secuencia
determinada por Telford et al. (1998).
Figura
9
Se calentaron lisados de la estirpe celular ccgM
que expresa gM de EHV-1 y células Rk13 durante 2
minutos a 56ºC (1, 2) o bien durante 5 minutos a 95ºC (3) (gM es
altamente hidrófoba y conocida por agregar tras ebullición, de modo
que no entra ya en el gel separador). Se incubaron transferencias
idénticas con diversos sueros de caballo (1:3000) o suero de conejo
anti-gM. Las flechas apuntan a la reactividad
específica de gM en muestras hervidas y no hervidas. Las
valoraciones neutralizantes de ensayo (NT) se dan para los sueros
que se obtuvieron a partir de la unidad de diagnóstico
virológico.
Figura
10
(A) Comparación de gM de EHV-1
con gM de EHV-4 utilizando un anticuerpo policlonal
anti-gM de EHV-1. Las células se
infectaron con los virus indicados (MOI de 0,5-1) y
se prepararon lisados celulares en los puntos temporales fijados
p.i. Se purificaron viriones de EHV-1 ó 4 mediante
centrifugación repetida a través de un colchón de sacarosa (30%) y
se resuspendieron en PBS. Se mezclaron las muestras con tampón que
contenía 5% de 2-mercaptoetanol y después se
calentaron a 99ºC durante 50 minutos o se dejaron a 4ºC. Las
proteínas se separaron por SDS-PAGE al 10% y se
transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se visualizó la unión de
anticuerpo utilizando conjugado de inmunoglobulina G (IgG)
anti-conejo y peroxidasa (Sigma), seguido de
detección por ECLTM (Pharmacia-Amersham).
(B) Los viriones se purificaron a partir de
células Edmin337 infectadas con EHV-4,
E4\DeltagM-w, E4\DeltagM-GFP o
E4RgM, y se sometieron a análisis de transferencia Western como se
describe en (A). Se comparó después la reactividad ante gB de los
viriones con la reactividad ante gM utilizando el anticuerpo
monoclonal 3F6 anti-gB de EHV-1 o el
anticuerpo policlonal anti-gM de
EHV-1.
Antes de las realizaciones de la presente
invención, debe observarse que como se utilizan en la presente
memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares
"un/una", "uno/una" y "el/la" incluyen referencia al
plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por
tanto, por ejemplo, la referencia a "un virus EHV" incluye una
pluralidad de dichos virus EHV que comprende también todas las
subespecies como EHV1, 4 y otras, la referencia a la "célula"
es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas
conocidos por el experto en la técnica, y así. A menos que se
definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos
utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que
se entienden habitualmente por un experto en la técnica a la que
pertenece la invención. Aunque puede utilizarse cualquier método y
material similar o equivalente a los descritos en la presente
memoria en la práctica o el ensayo de la presente invención, se
describen ahora los métodos, aparatos y materiales preferidos. Todas
las publicaciones citadas en la presente memoria se incorporan a
ésta como referencia con los fines de describir y exponer las
estirpes celulares, vectores y metodologías como se reseñan en las
publicaciones que podrían utilizarse en conexión con la invención.
Nada en la presente memoria ha de considerarse como una admisión de
que la invención no está habilitada por anticiparse dicha exposición
en virtud de la invención anterior.
El término "EHV" como se utiliza en la
presente memoria indica todos los herpesvirus equinos tales como las
especies EHV-1 y EHV-4 en la familia
Alphaherpesvirinae. Los términos virus EH, virus EHV y EHV se
refieren todos a herpesvirus equinos.
Virulencia: "Virulencia" como se utiliza en
la presente memoria se refiere a un virus EH capaz de propagarse en
la especie hospedadora diana (concretamente caballos) con el
potencial de inducir enfermedades subclínicas y clínicas
caracterizadas por síntomas respiratorios, abortos o trastornos
neurológicos. Los ejemplos de EHV virulentos son virus de tipo
natural que inducen fuertes síntomas clínicos. Son ejemplos de
factores de virulencia hemolisinas (que lisan glóbulos rojos) o
adhesinas (proteínas mediante las que el patógeno puede adherirse
al hospedador e iniciar la colonización o invasión). Más
específicamente, "virulencia" significa aquí que el producto
génico de gM, un constituyente principal de la cubierta viral,
posibilita que el virus penetre en el hospedador y está implicado en
la extensión célula a célula.
Atenuación: "Un virus EH atenuado" como se
describe en la presente memoria se refiere a un EHV infeccioso que
no causa enfermedades subclínicas o clínicas asociadas a EHV. En
particular, según la invención, dichos virus EH atenuados son EHV
que pueden replicarse y no expresan gM.
Una "variante funcional" del virus EH según
la invención es un virus EHV que posee una actividad biológica
(funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la del
EHV según la invención. La expresión "variante funcional"
incluye también "un fragmento", "una variante funcional",
"variante basada en el código degenerado de los ácidos
nucleicos", o "derivado químico". Dicha "variante
funcional" puede portar, por ejemplo, uno o varios intercambios,
deleciones o inserciones de ácido nucleico. Dichos intercambios,
deleciones o inserciones pueden dar cuenta de un 10% de la
secuencia completa. Dicha variante funcional retiene al menos
parcialmente su actividad biológica, por ejemplo funciona como un
clon infeccioso o una cepa de vacuna, o incluso exhibe una actividad
biológica mejorada.
Una "variante basada en la naturaleza
degenerada del código genético" es una variante resultante del
hecho de que un cierto aminoácido puede estar codificado por
diversos tripletes nucleotídicos diferentes. Dicha variante retiene
al menos parcialmente su actividad biológica, o incluso exhibe una
actividad biológica mejorada.
Una "molécula de fusión" puede ser la
molécula de ADN o de virus EHV infeccioso según la invención
condensada, por ejemplo, a un indicador tal como un marcaje
radiactivo, una molécula química tal como un marcaje fluorescente o
cualquier otra molécula conocida en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, un
"derivado químico" según la invención es una molécula de ADN o
clon infeccioso de EHV según la invención químicamente modificado o
que contiene restos químicos adicionales que no forman parte
normalmente de la molécula. Dichos restos pueden mejorar la
solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula.
Una molécula es "sustancialmente similar" a
otra molécula si ambas moléculas tienen secuencias nucleotídicas o
actividad biológica sustancialmente similares. Por tanto, a
condición de que dos moléculas posean una actividad similar, se
consideran variantes como se utiliza ese término en la presente
memoria si la secuencia nucleotídica no es idéntica, y dos
moléculas que tienen una secuencia nucleotídica similar se
consideran variantes como se utiliza ese término en la presente
memoria incluso si su actividad biológica no es idéntica.
El término "vacuna" como se utiliza en la
presente memoria indica una composición farmacéutica que comprende
al menos un componente inmunológicamente activo que induce una
respuesta inmunológica en un animal y posiblemente, pero no
necesariamente, uno o más componentes adicionales que potencian la
actividad inmunológica de dicho componente activo. Una vacuna puede
comprender adicionalmente componentes adicionales típicos de
composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo
de una vacuna puede comprender partículas de virus completos en su
forma original o como partículas atenuadas en la denominada vacuna
viva modificada (MLV), o partículas inactivadas mediante métodos
apropiados en la denominada vacuna muerta (KV). En otra forma, el
componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender
elementos apropiados de dichos organismos (vacunas de subunidades),
con lo cual estos elementos se generan destruyendo la partícula
entera o los cultivos de crecimiento que contienen dichas
partículas y opcionalmente con etapas de purificación ulteriores que
proporcionan la estructura o estructuras deseadas, o mediante
procesos sintéticos que incluyen una manipulación apropiada
mediante el uso de un sistema adecuado basado, por ejemplo, en
bacterias, insectos, mamíferos u otras especies, más opcionalmente
los procedimientos de aislamiento y purificación ulteriores, o
mediante la inducción de dichos procesos sintéticos en el animal
necesitado de una vacuna mediante la incorporación directa de
material genético utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas
(vacunación de polinucleótidos). Una vacuna puede comprender uno o
simultáneamente más de uno de los elementos descritos
anteriormente.
El término "vacuna" como se entiende en la
presente memoria es una vacuna para uso veterinario que comprende
sustancias antigénicas y se administra con el fin de inducir una
inmunidad específica y activa frente a una enfermedad provocada por
EHV. La vacuna de EHV según la invención confiere inmunidad activa
que puede transferirse pasivamente mediante anticuerpos maternos
frente a los inmunógenos que contiene, y a veces también frente a
organismos antigénicamente relacionados.
Los componentes adicionales para potenciar las
respuestas inmunes son constituyentes habitualmente indicados como
coadyuvantes, como por ejemplo hidróxido de aluminio, aceites
minerales u otros o moléculas auxiliares añadidas a la vacuna o
generadas por el cuerpo después de la respectiva inducción de dichos
componentes adicionales como, pero sin limitación, interferones,
interleucinas o factores de crecimiento.
Una "composición de vacuna o composición
farmacéutica" está constituida esencialmente por uno o más
ingredientes capaces de modificar las funciones fisiológicas, por
ejemplo inmunológicas, del organismo al que se administra, o de
organismos que viven en o sobre el organismo. La expresión incluye,
pero sin limitación, antibióticos o antiparasitarios, así como
otros constituyentes utilizados habitualmente para conseguir ciertos
objetivos como, pero sin limitación, características de
procesamiento, esterilidad, estabilidad, capacidad de administrar
la composición por vías entéricas o parenterales tales como oral,
intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica u
otras vías adecuadas, tolerancia tras la administración o
propiedades de liberación controlada.
La solución al problema técnico anterior se
consigue mediante la descripción y las realizaciones caracterizadas
en las reivindicaciones.
La invención supera las dificultades y
prejuicios de la técnica de que un herpesvirus equino no puede
generarse libre de secuencias extrañas. Al utilizar los métodos
según la invención, se proporcionan virus EH de calidad superior
para uso en vacunas. La secuencia de codificación central para la
proteína gM se elimina de modo que las secuencias carboxiterminales
restantes de gM están en un marco de lectura diferente que las
secuencias aminoterminales. El gen vecino del homólogo de la
proteína UL9 esencial (gen 53), su orientación y superposición con
el gen que codifica la proteína gM requiere que una secuencia
nucleótidica mínima del gen de gM deba permanecer para permitir la
expresión del gen 53 y así retener la viabilidad del virus. Por lo
tanto, un EHV según la invención se refiere a EHV que se
caracterizan porque se suprime el gen que codifica la proteína gM de
modo que la expresión del gen que codifica el homólogo de UL9 (gen
53) no esté afectada. La expresión "no afectada" no se refiere
a una cierta cantidad o a propiedades cualitativas de UL9, sino
simplemente significa que la expresión del gen no está afectada a
condición de que dicha
proteína se exprese por el virus y esté presente en una cantidad esencialmente suficiente para la viabilidad del virus.
proteína se exprese por el virus y esté presente en una cantidad esencialmente suficiente para la viabilidad del virus.
La necesidad largamente deseada en la técnica de
una vacuna que comprenda herpesvirus equinos 4 recombinantes se
satisfizo por los presentes inventores, que superaron las
importantes dificultades de la técnica. Los virus
EHV-1 y EHV-4 según la invención
pueden utilizarse ventajosamente para uso por ejemplo en una
vacuna.
Por tanto, en una primera realización
importante, la invención se refiere a un herpesvirus equino (EHV) en
el que el gen que codifica la proteína gM, y por tanto la gM misma,
está ausente, caracterizado porque está libre de elementos
heterólogos. "Libre de elementos heterólogos" significa que no
está presente ninguna secuencia extraña, concretamente ninguna
secuencia no EHV, tal como un módulo que codifica lacZ o GFP, en la
secuencia de codificación de dicho virus según la invención (un
denominado "clon blanco"). Por tanto, el EHV según la
invención está enteramente codificado por secuencias de EHV. El EHV
según la invención está libre de elementos bacterianos o ácidos
nucleicos que codifican dichos elementos bacterianos. Además, se
suprime casi toda la secuencia de codificación de la proteína gM, y
por tanto la proteína gM anteriormente citada codificada. Por
tanto, preferiblemente, dicho EHV según la invención se caracteriza
porque la proteína gM está ausente debido a la deleción del gen que
codifica la proteína gM. Sin embargo, como se indica anteriormente,
"el gen que codifica la proteína gM está ausente" requiere
también que permanezca una secuencia mínima de gM de modo que al
menos la secuencia superpuesta del gen 53 esté todavía presente,
pudiendo suprimirse el resto de las secuencias de gM (véase a
continuación). Esto puede conseguirse mediante técnicas de biología
molecular (véase a continuación) para generar EHV recombinantes.
El uso del lacZ como marcador para una deleción
exitosa del gen de gM de EHV-1 ó 4 no condujo a la
generación exitosa de virus según la invención (véanse los ejemplos
1, 2). Los inventores desarrollaron por tanto un método inventivo
para obtener dicho virus. Se construyó un virus EH en el que se
suprimió el gen de gM mediante la inserción de un módulo que
contenía el marcador GFP. Este enfoque permitió sorprendentemente la
diferenciación entre virus de partida (placas fluorescentes verdes)
y placas recombinantes nuevas (placas no fluorescentes).
Se prefiere un EHV obtenible mediante un método
que comprende las etapas de:
- a)
- aislamiento de un EHV de tipo natural;
- b)
- establecimiento de un plásmido que codifique el gen de gM de EHV, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
- c)
- generación de una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
- d)
- establecimiento de un virus EH que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
- e)
- deleción del módulo que codifica GPF; y
- f)
- selección de los clones de EHV en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
"LacZ" es conocido por el experto como el
gen que codifica la \beta-galactosidasa. Según la
invención, "GFP" se refiere a la proteína fluorescente verde
(GFP) producida por la medusa bioluminiscente (Chalfie et
al., 1994).
"Estirpe celular complementaria" designa
una estirpe celular en la que se introduce un gen normalmente no
presente en el genoma de la estirpe celular y se expresa
constitutivamente. Las estirpes celulares útiles incluyen, pero sin
limitación, la estirpe celular de riñón de conejo Rk13, la estirpe
celular cc (Seyboldt et al., 2000) o las estirpes celulares
Vero (nº de catálogo ATCC CRL-1586), tal como el
clon 1008, como se expone también en los ejemplos 1 y 2, y
cualquier otra estirpe celular conocida por el experto.
Habitualmente, puede seleccionarse de clones celulares que expresan
esta proteína adicional. Esta estirpe celular expresa el gen que
está suprimido en el virus, complementando esta deficiencia, y
posibilita el crecimiento del virus después de la deleción
génica.
Los métodos de uso estándar en biología
molecular de enzimas de restricción, ligamiento, PCR, transfección,
etc., son conocidos en la técnica (véase por ejemplo Sambrook, et
al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva
York).
Preferiblemente, dicho EHV según la invención se
caracteriza porque es EHV-1. Más preferiblemente, el
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprimen 850-1110 pb del marco abierto de lectura de
gM de 1332 pb. Aún más preferiblemente, el EHV-4
según la invención se caracteriza porque se suprimen
900-1000 pb del marco abierto de lectura de gM. Más
preferiblemente también, el EHV-1 según la invención
se caracteriza porque se suprimen 960-970 pb del
marco abierto de lectura de gM (960, 961, 962, 963, 964, 965, 966,
967, 968, 969 o 970 pb). Lo más preferiblemente, el
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprimen los 962 pb del marco abierto de lectura de gM.
Más preferiblemente, el EHV-1
según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de
codificación de gM excepto por 150-200 pares de
bases (pb) de la secuencia de codificación que codifica la porción
C-terminal de gM y 150-250 pb de la
secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. En esta realización más
preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM,
permaneciendo sólo los nucleótidos 93118-93267 a
93118-93317 de la secuencia que codifica la porción
C-terminal de gM y los nucleótidos
94223-94472 a 94323-94472 de la
secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. Por tanto, es más preferible un
EHV-1 según la invención caracterizado porque se
suprimen los nucleótidos 93268-93318 a
94222-94322 (que codifican la porción núcleo de gM)
(numeración según Telford, 1992). Dentro de los intervalos dados,
puede suprimirse cualquier número de nucleótidos. Por tanto, según
la invención, las deleciones pueden empezar no antes de la posición
de nucleótido 93268, pero tienen que empezar en la posición 93318.
La deleción puede terminar tan temprano como en la posición 94222,
pero no después de la posición 94322. Por tanto, un
EHV-1 preferido según la invención se caracteriza
porque se suprimen los nucleótidos 93268 a 94322 de la secuencia de
codificación de gM correspondientes a las posiciones de Telford
(1992). Cualquier combinación está dentro del alcance de la
invención, tal como 93272 a 94312, 93300 a 94300 y demás.
Aún más preferiblemente, el
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprime la secuencia de codificación de gM excepto por
160-190 pb de la secuencia de codificación que
codifica la porción C-terminal de gM y
190-220 pb de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. En esta
realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación
de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos
93118-93277 a 93118-93307 de la
secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y
los nucleótidos 94523-94472 a
94283-94472 de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, es
más preferible un EHV-1 según la invención
caracterizado porque se suprimen los nucleótidos
93278-93308 a 94252-94282 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1992).
Más preferiblemente también, el
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 180 a 190
(180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190) pb de la
secuencia de codificación que codifica la porción
C-terminal de la secuencia de codificación de gM y
200 a 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, ó 210)
pb de la secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. En esta realización más preferida,
se suprime la secuencia de codificación de gM, permaneciendo sólo
los nucleótidos 93118-93297 a
93118-93307 (93297, 93298, 93299, 939300, 93301,
93302, 93303, 93304, 93305, 93306, 93307) de la secuencia que
codifica la porción C-terminal de gM y los
nucleótidos 94263-94472 a
94273-94472 (94263, 94264, 94265, 94266, 94267,
94268, 94269, 94270, 94271, 94272, 94273) de la secuencia de
codificación que codifica la porción N-terminal de
gM. Por tanto, es más preferible un EHV-1 según la
invención caracterizado porque se suprimen los nucleótidos
94298-94308 a 94262-94272 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1992). Esto significa que puede suprimirse cualquier nucleótido
dentro de los nucleótidos restantes anteriormente citados según la
invención, por ejemplo los nucleótidos 94299-94263 ó
94299-94264 ó 94300-94272 o
cualquier combinación de los mismos.
Lo más preferiblemente, el EHV-1
según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de
codificación de gM excepto por 184 pb de la secuencia de
codificación que codifica la porción C-terminal de
la secuencia de codificación de gM y 209 pb de la secuencia de
codificación que codifica la porción N-terminal de
gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de
codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos
93118-93301 de la secuencia que codifica la porción
C-terminal de gM y los nucleótidos
94264-94472 de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, lo
más preferido es un EHV-1 según la invención
caracterizado porque se suprimen los nucleótidos 94263 a 93302 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1992). En esta realización más preferida, se suprimen 962
nucleótidos de la secuencia que codifica gM. Esto se ejemplifica de
manera no limitante en el ejemplo 1.
También más preferiblemente, un
EHV-1 según la invención se caracteriza porque la gM
está suprimida y está libre de elementos heterólogos, y porque es
una variante recombinante basada en una cepa seleccionada del grupo
de AB69 (ATCC VR2581), el mutante Ts ECACC V99061001 de
EHV-1, KyA, KyD, Ab1, Ab4, RacH, RacL11 o RacM de
EHV-1, y ningún elemento heterólogo tal como
elementos GFP o lacz está presente. También más preferiblemente, un
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como
elementos GFP o lacZ, y porque es una variante recombinante basada
en la cepa RacH de EHV-1. Lo más preferiblemente,
un EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como
elementos GFP o lacZ, y porque es el aislamiento
H\DeltagM-w de variante recombinante basada en
RacH como se expone en el ejemplo 1. Dicho
H\DeltagM-w según la invención se depositó en el
"Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European
Collection of Cell Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire, SP4
0JG, RU, como depósito de patente según el Tratado de Budapest. La
fecha del depósito fue el 16 de octubre de 2002, la referencia de
identificación preliminar es
H-delta-gM-w y el
número de acceso dado por la autoridad depositaria internacional
ECACC/CAMR es 02101663. Se prefieren también EHV-1
que tengan todas las características identificativas de dicho
EHV-1 depositado.
Todos los EHV-1 anteriormente
citados tienen propiedades superiores frente a otros virus con
elementos heterólogos tales como GFP. Dichos EHV-1
según la invención tienen un infectividad extracelular
ventajosamente mayor que aquellos que todavía comprenden elementos
heterólogos. Esto se ejemplifica en la figura 5 (por ejemplo entre 4
y 12 horas).
Hasta la realización de la presente invención,
nadie en la técnica fue capaz de generar un virus
EHV-4 recombinante que pudiera utilizarse como
vacuna. EHV-1 y EHV-4 son homólogos
y reactivos cruzados en cierto grado. Sin embargo, había una larga
necesidad en la técnica de virus EHV-4 atenuados, ya
que EHV-1 parece no proporcionar suficiente
protección frente a la infección por EHV-4. Por
tanto, preferiblemente, un EHV según la invención se caracteriza
porque es EHV-4. Más preferiblemente, el
EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprimen 900-1150 pb del marco abierto de lectura de
gM de 1332 pb. Aún más preferiblemente, el EHV-4
según la invención se caracteriza porque se suprimen
1000-1150 pb del marco abierto de lectura de gM. Más
preferiblemente también, el EHV-1 según la
invención se caracteriza porque se suprimen
1110-1115 pb del marco abierto de lectura de gM
(1110, 1111, 1112, 1113, 1114 ó 1115 pb). Lo más preferiblemente, el
EHV-1 según la invención se caracteriza porque se
suprimen las 1110 pb del marco abierto de lectura de gM.
Más preferiblemente, el EHV-4
según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de
codificación de gM excepto por 0-50 pares de bases
(pb) de la secuencia de codificación que codifica la porción
C-terminal de gM y 150-250 pb de la
secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. En esta realización más
preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM,
permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92680 a
92681-92730 de la secuencia que codifica la porción
C-terminal de gM y los nucleótidos
93766-94033 a 93866-94033 de la
secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. Por tanto, más preferiblemente,
un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprimen los nucleótidos 92681-92731 a
93765-93865 (que codifican la porción núcleo de gM)
(numeración según Telford, 1998). Dentro de los intervalos dados,
puede suprimirse cualquier número de nucleótidos. Por tanto, según
la invención, las deleciones pueden empezar no antes de la posición
de nucleótido 92681, pero tienen que empezar en la posición 92731.
La deleción puede terminar tan temprano como en la posición 93765,
pero no después de la posición 93865. Por tanto, preferiblemente,
un EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprimen los nucleótidos 92681 a 93865 de la secuencia de
codificación de gM correspondientes a las posiciones de Telford
(1998). Cualquier combinación está dentro del alcance de la
invención, tal como 92672 a 93801, 92700 a 93800 y demás.
Aún más preferiblemente, el
EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprime la secuencia de codificación de gM excepto por
10-40 pb de la secuencia de codificación que
codifica la porción C-terminal de gM y
190-220 pb de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. En esta
realización más preferida, se suprime la secuencia de codificación
de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos
92681-92690 a 92681-92720 de la
secuencia que codifica la porción C-terminal de gM y
los nucleótidos 93806-94033 a
93863-94033 de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, más
preferiblemente, un EHV-4 según la invención se
caracteriza porque se suprimen los nucleótidos
92691-92721 a 93805-93835 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1998).
Más preferiblemente también, el
EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprime la secuencia de codificación de gM excepto por 30 a 40 (30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40) pb de la secuencia de
codificación que codifica la porción C-terminal de
gM y 200 a 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 ó
210) pb de la secuencia de codificación que codifica la porción
N-terminal de gM. En esta realización más
preferida, se suprime la secuencia de codificación de gM,
permaneciendo sólo los nucleótidos 92681-92710 a
92681-92720 (92710, 92711, 92712, 92713, 92714,
92715, 92716, 92717, 92718, 92719, 92720) de la secuencia que
codifica la porción C-terminal de gM y los
nucleótidos 93816-94033 a
93826-94033 (93824, 93825, 93826, 93827, 93828,
93829, 93830, 93831, 93832, 93833, 93834) de la secuencia de
codificación que codifica la porción N-terminal de
gM. Por tanto, más preferiblemente, un EHV-4 según
la invención se caracteriza porque se suprimen los nucleótidos
92711-92721 a 93823-93833 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1998). Esto significa que puede suprimirse cualquier nucleótido
dentro de los nucleótidos restantes anteriormente citados según la
invención, por ejemplo los nucleótidos 94299-94257 ó
94299-94256 ó 94300-94257 o
cualquier combinación de los mismos.
Lo más preferiblemente, el EHV-4
según la invención se caracteriza porque se suprime la secuencia de
codificación de gM excepto por 34 pb de la secuencia de
codificación que codifica la porción C-terminal de
la secuencia de codificación de gM y 209 pb de la secuencia de
codificación que codifica la porción N-terminal de
gM. En esta realización más preferida, se suprime la secuencia de
codificación de gM, permaneciendo sólo los nucleótidos
92681-92714 de la secuencia que codifica la porción
C-terminal de gM y los nucleótidos
93825-94033 de la secuencia de codificación que
codifica la porción N-terminal de gM. Por tanto, lo
más preferiblemente, un EHV-4 según la invención se
caracteriza porque se suprimen los nucleótidos 92715 a 93824 (que
codifican la porción núcleo de gM) (numeración según Telford,
1998). En esta realización más preferida, se suprimen 1110
nucleótidos de la secuencia que codifica gM. Esto se ejemplifica de
manera no limitante en el ejemplo 2.
Más preferiblemente también, un
EHV-4 según la invención se caracteriza porque se
suprime gM y está libre de elementos heterólogos tales como
elementos GFP o lacZ, y porque es una variante recombinante basada
en la cepa MSV lote 071398 de EHV-4. Lo más
preferiblemente, un EHV-4 según la invención se
caracteriza porque se suprime gM y está libre de elementos
heterólogos tales como elementos GFP o lacZ, y porque está basado
en la cepa MSV lote 071398 y el aislamiento
E4\DeltagM-4 como se expone en el ejemplo 2. Dicho
H\DeltagM-w de EHV-1 según la
invención se depositó en el "Centre for Applied Microbiology and
Research (CAMR) and European Collection of Cell Cultures
(ECACC)", Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, RU, como depósito de
patente según el Tratado de Budapest. La fecha de depósito fue el
14 de enero de 2003, la referencia de identificación preliminar es
EHV-4 y el número de acceso dado por la autoridad
depositaria internacional ECACC/CAMR es 03011401. Se prefieren
también los EHV-4 con todas las características
identificativas de dicho EHV-4 depositado.
Todos los EHV-4 anteriormente
citados tienen propiedades superiores frente a virus conocidos en la
técnica anterior, ya que no hay EHV-4 recombinantes
disponibles en la técnica. Además, dicho EHV-4 según
la invención tiene una infectividad extracelular ventajosamente más
alta que aquellos que comprenden todavía elementos heterólogos
tales como GFP. Esto se ejemplifica en la figura 10 (por ejemplo a
24 horas).
Otro elemento importante de la invención es un
ácido nucleico que codifica un EHV como se expone anteriormente. El
experto puede determinar fácilmente la secuencia correspondiente
mediante métodos estándar de biología molecular conocidos en la
técnica.
Había una dificultad particular en la técnica
para obtener el EHV según la invención. Los presentes inventores
construyeron virus EHV negativos de gM introduciendo un gen marcador
(lacz) en el gen de gM. Cuando se intentó suprimir este módulo,
ambos mutantes EHV-1 y EHV-4
producidos por inserción de lacZ, siendo todos los clones
fenotípicamente negativos de lacZ, contenían todavía el módulo lacZ.
Los inventores desarrollaron por tanto un método inventivo para
obtener dichos virus. Se construyó un virus EH en el que se suprimió
el gen de gM mediante la inserción de un módulo que contenía el
marcador GFP. Este enfoque permitió sorprendentemente la
diferenciación entre virus de partida (placas fluorescentes verdes)
y placas recombinantes nuevas (placas no fluorescentes). Además, se
generó una estirpe celular Vero (basada en el clon de células Vero
1008) que expresaba constitutivamente gM de EHV4 por los presentes
inventores para superar las dificultades de la técnica. Dicha
estirpe celular se generó mediante la transfección del gen de gM
apropiado y la ulterior selección de células Vero que expresan gM.
Sólo dichas células posibilitaron a los inventores replicar virus
EHV-4 negativos de gM.
Dicha estirpe celular Vero complementaria de gM
según la invención se depositó en el "Centre for Applied
Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Cell
Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, RU, como
depósito de patente según el Tratado de Budapest. La fecha del
depósito fue el 28 de enero de 2003, la referencia de
identificación preliminar es VERO GM y el número de acceso dado por
la autoridad depositaria internacional ECACC/CAMR es 03012801. Se
prefieren también estirpes celulares que tengan todas las
características identificativas de dicha estirpe celular VERO GM
depositada.
Se prefiere un método para obtener EHV
recombinante que comprende las etapas de:
- a)
- aislamiento de un EHV de tipo natural;
- b)
- establecimiento de un plásmido según el gen de gM de EHV, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
- c)
- generación de una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
- d)
- establecimiento de un virus EH que porta una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
- e)
- deleción del módulo que codifica GFP; y
- f)
- selección de los clones de EHV en los que se suprime exitosamente el módulo de codificación de GFP.
Dichas células anteriormente indicadas son una
realización importante de la presente invención. Por tanto, la
invención se refiere a una estirpe celular para uso en un método
según la invención, caracterizada porque el gen que codifica la
proteína gM se transfecta a la citada estirpe celular y la citada
estirpe celular expresa gM. La invención se refiere preferiblemente
a una estirpe celular según la invención, caracterizada porque es
una estirpe celular seleccionada del grupo de células Vero (células
Vero-gM), RK-13 y cc
(cc-gM).
Como se expone anteriormente para
EHV-1, el uso de lacZ como marcador en lugar de GFP
no condujo tampoco en EHV-4 a una generación
exitosa de virus según la invención (véase de manera no limitante el
ejemplo 2). Las células "positivas de lacZ" generalmente se
teñían menos intensamente en células Vero que en células Rk13, y
eran por tanto más difíciles de identificar, y el sistema
EHV-4 se replicaba más lentamente que
EHV-1, y por tanto proporcionaba menos tiempo entre
la identificación de placa y el aislamiento de la progenie viral
viable. Por lo tanto, el uso de GFP representaba el único modo de
obtener dicho virus EHV-4. El procedimiento se
llevó a cabo como se describe anteriormente para
EHV-1 y, sorprendentemente, condujo también a una
exitosa identificación del virus EHV-4 con gM
suprimida en virtud de la identificación de las placas
fluorescentes.
El aislamiento de EHV de tipo natural se realiza
recogiendo tejido pulmonar de necropsia de animales sospechosos de
haber enfermado por EHV, y aislando el EHV en células de tejido como
es conocido en la técnica. Se ha publicado la secuencia genómica
completa de EHV-1 por Telford et al. (1992).
Igualmente, se ha publicado la secuencia genómica completa de
EHV-4 por Telford et al. (1998). La
amplificación por PCR de secuencias de ADN mediante el uso de la
unión de cebadores específicos a cadenas complementarias de ADN
diana flanqueante del intervalo de ADN de interés representa un
método estándar de biología molecular. Son conocidos por un experto
en la técnica los métodos para ligar secuencias de ADN apropiadas a
plásmidos adecuados para las construcciones pretendidas, para la
transfección de ADN a células eucariotas, para el análisis de
transferencia Southern y Western, para la escisión dirigida a sitio
de fragmentos de ADN mediante enzimas de restricción y para la
selección de estirpes celulares que expresan el gen heterólogo
deseado o plásmidos que albergan el gen o virus deseado, en el que
se suprime un cierto gen. Son conocidos por el experto en la técnica
métodos estándar de biología molecular tales como las técnicas
citadas anteriormente, y pueden encontrarse también por ejemplo en
Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, Nueva York y Bertram, S. y Gassen, H.G.
"Gentechnische Methoden", editorial G. Fischer, Stuttgart,
Nueva York, 1991).
"Deleción" significa la eliminación de uno
o varios nucleótidos o aminoácidos.
Otra realización importante de la invención es
una composición farmacéutica o vacuna que comprende un EHV según la
invención, opcionalmente en combinación con un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Una parte importante también de la presente
invención es una composición farmacéutica que comprende un ácido
nucleico según la invención como se expone anteriormente.
Preferiblemente, una vacuna según la invención
indica una vacuna como se define anteriormente. La expresión
"vacuna viva" indica una vacuna que comprende una partícula
capaz de replicación, particularmente un componente viral activo de
replicación.
Preferiblemente, una vacuna según la invención
comprende un EHV-1 con gM suprimida según la
invención como se expone anteriormente combinado con un
EHV-4 con gM suprimida según la invención como se
expone anteriormente, o cualquier otro grupo antigénico, y
opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Dicha vacuna puede administrarse en forma de una vacuna combinada
en el mismo punto temporal. Lo más preferiblemente, dicho
EHV-1 atenuado según la invención puede
administrarse primero, seguido por la administración de un
EHV-4 atenuado según la invención de tres a cuatro
semanas después. Lo más preferiblemente también, dicho
EHV-1 atenuado según la invención puede
administrarse en combinación con un EHV-4 atenuado
según la invención en un esquema de vacunación típico en el que se
administran dos o tres vacunaciones básicas. Es un esquema de
vacunación típico de dicha vacuna dos vacunaciones separadas por
cuatro semanas (vacunación básica), seguida de recuerdos regulares
cada seis meses. Sin embargo, cualquiera de dichas vacunas según la
invención como se exponen anteriormente puede administrarse también
a diferentes intervalos, por ejemplo cada tres meses.
El experto puede elegir dividir la
administración en dos o más aplicaciones que pueden aplicarse poco
después una de otra, o en algún otro intervalo predeterminado.
Preferiblemente, dicho intervalo puede ser: 1ª inmunización, 2ª
inmunización aproximadamente 4 semanas después de ella y
opcionalmente 3ª inmunización 5-6 meses después de
ella. Dependiendo de la duración y eficacia deseadas del
tratamiento, las vacunas pueden administrarse una o varias veces,
también intermitentemente. Las vacunas según la invención pueden
administrarse a una yegua antes de criar y de nuevo durante el
embarazo para prevenir abortos asociados a EHV. Pueden vacunarse
otros caballos, por ejemplo una vez al año. Los potros pueden
vacunarse poco después de nacer.
Las vacunas de la presente invención pueden
aplicarse mediante diferentes vías de aplicación conocidas por el
experto, especialmente inyección intravenosa o inyección directa en
tejidos diana. Para aplicación sistémica, se prefieren las vías
intravenosa, intravascular, intramuscular, intraarterial,
intraperitoneal, oral o intramucosa (por ejemplo pulverizador nasal
o respiratorio o inyección). Puede efectuarse una aplicación más
local por vía subcutánea, intracutánea, intrapulmonar o
directamente a o cerca del tejido a tratar (tejido conectivo, óseo,
muscular, nervioso, epitelial). Puede aplicarse una composición de
vacuna según la invención también mediante un implante o por vía
oral. La más preferida es la administración intramuscular.
Para preparar preparaciones de vacuna adecuadas
para las aplicaciones descritas anteriormente, el experto puede
utilizar soluciones estériles inyectables conocidas fisiológicamente
aceptables. Para preparar una solución lista para utilizar para
inyección o infusión parenteral, están fácilmente disponibles
soluciones acuosas isotónicas, tales como por ejemplo solución
salina o las correspondientes soluciones de proteína plasmática.
Las preparaciones de vacuna pueden presentarse como liofilizados o
preparaciones secas, que pueden reconstituirse con una solución
inyectable conocida directamente antes del uso en condiciones
estériles, por ejemplo como un kit de unidades. La preparación
final de las preparaciones de vacuna de la presente invención se
prepara para inyección, infusión o perfusión mezclando virus
purificado según la invención con una solución estéril
fisiológicamente aceptable, que puede suplementarse con sustancias
vehículo y/o excipiente conocidas. La dosis aplicada de cada virus
EH según la invención presente en la formulación de vacuna puede
estar preferiblemente entre 10^{4} y 10^{8} TCID_{50}/por
animal, entre 10^{5} y 10^{7} TCID_{50}/por animal, lo más
preferiblemente 10^{6} TCID_{50}/por animal.
\newpage
La invención se refiere además al uso de EHV
según la invención en la fabricación de un medicamento para la
profilaxis y/o el tratamiento de estados patológicos asociados a
EHV.
La invención se refiere además al uso de un
ácido nucleico según la invención en la fabricación de un
medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de estados
patológicos asociados a EHV.
La invención se refiere además a un método para
la profilaxis y/o el tratamiento de un animal caracterizado porque
la composición farmacéutica según la invención se aplica a dicho
animal y se monitoriza el éxito terapéutico.
La invención se refiere preferiblemente a un
método de tratamiento de un animal equino infectado por EHV con un
EHV con gM suprimida según la invención como se describe
anteriormente, en el que dicho EHV atenuado o la composición de
vacuna como se describe anteriormente se administra al animal equino
necesitado de ello a una dosis adecuada, como es conocido por el
experto, y se monitoriza la reducción de los síntomas de EHV tales
como viremia y leucopenia y/o tos y/o pirexia y/o descarga nasal y/o
diarrea y/o depresión y/o aborto. Dicho tratamiento puede repetirse
preferiblemente. Por tanto, la invención se refiere a un método para
la profilaxis y/o el tratamiento de un animal, caracterizado porque
se aplica una composición farmacéutica según la invención a dicho
animal y se monitoriza el
éxito terapéutico. El tratamiento puede llevarse a cabo como se expone para la composición de vacuna anteriormente.
éxito terapéutico. El tratamiento puede llevarse a cabo como se expone para la composición de vacuna anteriormente.
La invención se refiere preferiblemente a un
método para detectar anticuerpos contra estructuras específicas de
infección de EHV-1 o EHV-4 y a un
método para diferenciar infecciones de tipo natural de la presencia
de EHV-1 o EHV-4 con gM suprimida
como se describe anteriormente mediante un método inmunológico. Los
métodos inmunológicos son conocidos por el experto en el campo e
incluyen, pero sin limitación, ELISA (ensayo de inmunosorción
ligado a enzima) o ELISA sándwich, transferencias de mancha,
inmunotransferencias, radioinmunoensayos (Radioimmunoassay, RIA),
ensayos de Ouchterlony basados en difusión, ensayos
inmunofluorescentes de inmunoelectrodifusión o transferencias
Western. Los ejemplos de métodos inmunológicos se describen, por
ejemplo, en: "An Introduction to Radioimmunoassay and Related
Techniques", Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, Holanda
(1986); Bullock et al. "Techniques in
Immunocytochemistry", Academic Press, Orlando, FL, vol. 1 (1982),
vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen, "Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Ámsterdam,
Holanda (1985). Dicho ELISA puede utilizarse, pero no limitarse, al
uso del producto génico de gM o una parte del producto génico de gM
o cualquier otro producto génico del virus EH-1 o
EH-4 inmovilizado sobre una superficie plástica para
análisis ELISA.
Un ELISA según la presente invención comprende,
pero sin limitación, las etapas de:
- a)
- inmovilización de un producto génico de gM o un fragmento del mismo sobre un soporte plástico.
- b)
- lavado de la superficie plástica con un tampón de lavado apropiado (por ejemplo PBS-Tween),
- c)
- adición de las muestras a pocillos seleccionados e incubación de la placa ELISA según los métodos estándar.
- d)
- lavado de los pocillos de la placa ELISA y adición de un anticuerpo adecuado acoplado a una enzima tal como HRP (peroxidasa de rábano picante),
detección del conjugado anticuerpo unido/HRP
añadiendo un sustrato adecuado, seguido de la lectura fotométrica
de la densidad óptica de pocillos individuales. Son conocidos en el
campo anticuerpos adecuados, por ejemplo Ig de conejo
anti-caballo.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
adicionalmente la presente invención, pero no debe considerarse que
los mismos limiten el alcance de la invención expuesta en la
presente memoria.
Se construyeron EHV-1 negativos
de gM insertando el módulo de expresión de lacZ de Escherichia
coli (H\DeltagM-lacZ) o de la proteína
fluorescente verde (H\DeltagM-GFP), reemplazando
así un 74,5% de las secuencias del gen de gM. La expresión de una
proteína marcadora facilita la identificación y purificación
ulteriores de un virus recombinante. Para evitar la presencia de
cualquier secuencia "no EHV-1" en el virus de
vacuna, se decidió suprimir las secuencias del gen marcador y
construir otro EHV-1 negativo de gM de segunda
generación, un H\DeltagM "blanco"
(H\DeltagM-w).
Con este fin, se construyó un plásmido pXuBaxA
(Figura 1): En primer lugar, se intentó la recombinación de
secuencias pXuBaxA en el virus H\DeltagM-lacZ
marcado con lacZ. En una primera etapa, se optimizaron las
transfecciones de ADN mediadas por el método de fosfato de calcio de
modo que dieron como resultado diversas placas blancas después del
sembrado de 100-1000 PFU de sobrenadantes de
transfección. En consecuencia, se eligieron diversas placas para la
purificación del virus progenie y se sometieron a cuatro a cinco
rondas de aislamiento de placas individuales.
Se analizaron genotípicamente múltiples
poblaciones aisladas independientemente fenotípicamente negativas
de lacZ mediante transferencia Southern, y resultó que portaban
todavía secuencias del módulo lacZ. Se han anticipado las
dificultades del aislamiento de poblaciones de virus verdaderamente
negativos de lacZ debido al "silenciamiento lacZ", y por lo
tanto se purificaron un gran número de poblaciones de virus
fenotípicamente negativos de lacZ y se analizaron sin éxito. Por lo
tanto, se cambió la estrategia de generar un virus RacH negativo de
gM "blanco" por pasar a cotransfecciones con el
EHV-1 negativo de gM, que se había construido
mediante inserción de un módulo GFP. Utilizar el virus que expresa
GFP facilitó la distinción entre virus de partida (placas
fluorescentes verdes) y virus recombinantes nuevos (placas no
fluorescentes) y aumentó por tanto la eficacia del aislamiento de
placas fenotípicamente negativas de GFP. El cambio del RacH negativo
de gM "de partida" no se suponía que influyera en el genotipo
del virus recombinante esperado, ya que (i) ambos virus H\DeltagM
de primera generación son, aparte del marcador, genéticamente
idénticos y (ii) el genotipo final en la región de interés está
determinado por el plásmido de recombinación (pXuBaxA).
Para la construcción del plásmido pXuBaxA
(constructo necesario para obtener el EHV-1 negativo
de gM "blanco"), se suprimió el fragmento
ApaI-HincII de 962 pb en el marco abierto de lectura
de 1352 pb de gM de EHV-1 del plásmido pBH3.1
(figura 1D). El plásmido pBH3.1 porta el fragmento
BamHI-HindIII de EHV-1 rodeando al
gen de gM (Seyboldt et al., 2000). Para evitar la expresión
de cualquier producto truncado de gM, se han elegido las
endonucleasas de restricción ApaI e HincII de tal modo
que después del ajuste de extremos romos y el ligamiento, las
secuencias C-terminales de gM restantes (183 pb) no
estaban en fase con las secuencias N-terminales
restantes
(208 pb).
(208 pb).
La estirpe celular ccgM que expresa gM de
EHV-1 (Seyboldt et al., 2000; obtenida del
Dr. N. Osterrieder) se mantuvo en medio esencial mínimo
suplementado con 5-10% de suero fetal bovino
(Biochrom, irradiado con \gamma). Se consiguió la recombinación
homóloga en EHV-1 mediante cotransfección mediada
por fosfato de calcio de células ccgM con 5-10
\mug del plásmido pXuBaxA (figura 1D) y 2 \mug de ADN de
H\DeltagM-lacZ o H\DeltagM-GFP,
respectivamente.
Los análisis ulteriores de ADN de
H\DeltagM-GFP con una sonda marcada con
digoxigenina específica del fragmento BamHI-HindIII
del plásmido pBH3.1 (figura 2) revelaron:
- (i)
- un fragmento de 2.757 pb y un fragmento de 9.043 pb con BamHI,
- (ii)
- un fragmento de 10.006 pb y un fragmento de 825 pb con HindIII,
- (iii)
- y un fragmento de 5.415 pb y 4.474 pb en ADN digerido con PstI.
Las enzimas de restricción utilizadas (BamHI,
HindIII, PstI) cortan en secuencias del módulo marcador GFP,
alterando así el patrón del fragmento respecto al ADN libre del
módulo marcador GFP.
La sonda de GFP se unió a los respectivos
primeros fragmentos (i-iii) y no detectó secuencias
específicas de GFP en ADN de RacH o de
H\DeltagM-w.
En ADN de RacH, se detectaron los fragmentos
BamHI (11.166 pb), HindIII (10.199 pb) y PstI (9.257 pb) esperados,
que redujeron consiguientemente su tamaño después de la supresión de
962 pb de secuencias de gM: (10.204 pb, 9.237 pb y 8.279 pb, figura
3B).
Se realizaron cinéticas de crecimiento de una
etapa de virus negativos de gM (H\DeltagM-w o
H\DeltagM-GFP), que se habían construido como se
describe en la leyenda de la figura 1, y RacH. Se infectaron células
Rk13 en placas de 24 pocillos a una MOI de 2 de los respectivos
virus. Los sobrenadantes y sedimentos celulares infectados se
recogieron separadamente en diversos momentos p.i. (0, 4, 8, 12, 16,
20, 24 h p.i.). Los sobrenadantes se clarificaron de desechos
celulares mediante centrifugación a baja velocidad, y las células se
sometieron a liofilización antes de ensayar la infectividad
asociada a células. Todas las valoraciones virales se determinaron
individualmente en células Rk13 o ccgM, respectivamente, en placas
de 24 pocillos. Los resultados (datos no mostrados) pueden
resumirse de la siguiente manera: la infectividad asociada a célula
de ambos virus H\DeltagM se redujo entre un factor de 1,6 (4 h
p.i.) y 45 (20 h p.i.) en células Rk13 en comparación con las
valoraciones de células infectadas con RacH (infectividad
intracelular). Las valoraciones virales extracelulares de ambos
virus H\DeltagM se redujeron como máximo 186
(H\DeltagM-w) o 650
(H\DeltagM-GFP) veces (12 h p.i.) en comparación
con las de RacH (infectividad extracelular), apoyando un papel de la
gM en la egresión viral también en RacH.
Paralelamente a la construcción de
EHV-1 negativo de gM, se eligió la selección por
lacZ para la selección de EHV-4. Para permitir el
aislamiento de un EHV-4 negativo de gM, se construyó
una estirpe celular Vero que expresaba constitutivamente gM de
EHV-4. Se mantuvo el clon C1008 de células Vero (nº
ATCC: CRL-1586) en medio esencial mínimo
suplementado con 5-10% de suero fetal bovino
(Biochrom, irradiado con \gamma). La estirpe celular recombinante
Vero-gM se generó mediante la transfección mediada
por Effectene^{TM} (Qiagen) de 1 \mug de plásmido pCgM4 (figura
3B) y 0,1 \mug de plásmido pSV2neo (que confiere resistencia a
G418; Neubauer et al., 1997) en células Vero. Los clones
celulares se seleccionaron primero por resistencia a G418
(Calbiochem), después por complementariedad trans de un
EHV-4 negativo de gM. Se añadió G418 al medio cada 5
pasadas de estirpes recombinantes (500 \mug/ml). En todas las
células se analizaron regularmente antígenos de Mycoplasma
por PCR y de virus de la diarrea viral bovina (BVDV) por análisis
FACS. El clon celular seleccionado se denominó
Vero-gM y se utilizó en los siguientes
experimentos.
Se cotransfectó ADN de EHV-4 con
el plásmido pgM4\beta+ (figura 3B) en células
Vero-gM. La recombinación dio como resultado
diversas placas "positivas de lacZ" que se aislaron y
resembraron. Pero entonces, la purificación de un mutante de
deleción en EHV-4 resultó ser más difícil y más
lenta que en EHV-1, ya que (i) las placas
"positivas de lacZ" se teñían generalmente menos intensamente
en células Vero que en células Rk13, y eran por tanto más difíciles
de identificar, y (ii) el sistema EHV-4 se replicaba
más lentamente que EHV-1, y proporcionaba por tanto
menos tiempo entre la identificación de placa y el aislamiento de la
progenie viral viable.
Todas las placas positivas de lacZ que se
aislaron se perdieron durante la primera ronda de purificación, lo
que hizo imperiosa la búsqueda de otra solución. Se intentó por lo
tanto utilizar el marcador GFP también para EHV-4.
En una primera etapa, se construyó el plásmido pgM4GFP+ (Figura 3B)
y se utilizó para recombinación en ADN de EHV-4.
Las placas positivas de GFP se purificaron mediante tres rondas de
aislamiento de placas individuales en la estirpe celular
Vero-gM. Se eligió una población viral positiva de
GFP homogénea y el ADN viral se sometió a análisis de transferencia
Southern (Figura 4). Se contransfectó después ADN del virus
resultante, E4\DeltagM-GFP (Figura 3C) con el
plásmido pgM4R o pgM4w (Figura 3B). El plásmido pgM4R se utilizó
para la construcción de un EHV-4 con gM reparada
denominado E4RgM (Figura 3A). El plásmido pgM4w era la base para
generar el EHV-4 simultáneamente negativo de gM y
marcador génico, E4\DeltagM-w (Figura 3D). Se
aislaron las poblaciones virales E4RgM y
E4\DeltagM-w para un fenotipo negativo de GFP, se
purificaron en células Vero o Vero-gM y finalmente
se analizaron mediante transferencia Southern (Figura 4). Para
expresar gM de EHV-4 en células eucariotas, se
generó el plásmido pCgM4 (Figura 3B). El ORF completo de gM de
EHV-4 se amplificó por PCR utilizando los cebadores
dados en la Figura 8 y la polimerasa Taq
(MBI-Fermentas). El producto de PCR resultante se
insertó en el vector pcDNAI/Amp
(Invitrogene).
(Invitrogene).
El plásmido pgM4R era el resultado de la
amplificación por PCR de los nucleótidos 91.699 a 94.808 (Telford
et al., 1998) de EHV-4 y la inserción del
producto de amplificación en el vector pGEM3Zf+ (Promega) (Figura
3B, Figura 8). Este plásmido se utilizó para la construcción del
EHV-4 con gM reparada, E4RgM (Figura 3A).
Para construir el plásmido pgM4\beta+ (Figura
3B), que se diseñó para suprimir inicialmente 1110 pb de las 1352
pb de gM de EHV-4, se eligió una estrategia
multietapa. En una primera etapa, se amplificaron independientemente
ambas secuencias flanqueantes necesarias para la recombinación de
ADN mediante PCR utilizando la polimerasa PFU (Stratagene). Los
sitios de restricción necesarios para la clonación por etapas se
añadieron con secuencias cebadoras (Figura 8). Los productos de PCR
se insertaron en el vector pTZ18R (Pharmacia), dando como resultado
los plásmidos pgM4Del1 y pgM4Del2 (Figura 8). En una siguiente
etapa, se liberó el módulo de expresión lacZ de E. coli de
3,9 kpb del plásmido ptt264A+ (Osterrieder et al., 1996)
mediante digestión con SalI y BamHI, y se insertó en
el plásmido pgM4Del1, dando como resultado el plásmido
pgM4Del1\beta+. Después, se introdujeron secuencias específicas
de EHV-4, tomadas de pgM4Del2, en pgM4Del1\beta+
utilizando PstI y SalI, de tal modo que el módulo del
gen marcador estaba flanqueado por secuencias específicas de
EHV-4 en el plásmido resultante pgM4\beta+ (Figura
3B).
El plásmido pgM4\beta+ se digirió después con
SalI y BamHI, liberando de nuevo el módulo lacZ, se
rellenaron los salientes 5' resultantes con la polimerasa Klenow, y
el constructo resultante del religamiento se denominó pgM4w (Fig.
3B). De nuevo, se diseñó un cambio de marco de lectura entre los 208
nt N-terminales y los 33 nt
C-terminales restantes de la secuencia de gM.
Para generar el plásmido pgM4GFP+ (Fig. 3B), se
tomó el módulo lacZ de pgM4\beta+ (Figura 3B) utilizando los
sitios SalI y BamHI y se reemplazó por el módulo GFP
(incluyendo el promotor CMV y SV40-poliA), que se
había suprimido del vector pEGFP-C1 (Clontech)
mediante digestión con AsnI y MluI. Los salientes
generados por la enzima de restricción se ajustaron a extremos romos
con la polimerasa Klenow.
Se confirmó la correcta amplificación de todos
los productos de PCR mediante secuenciación cíclica (MWG Biotech) y
comparación con la secuencia publicada de la cepa NS80567 de
EHV-4 (Telford et al., 1998).
Se realizó la recombinación en
EHV-4 utilizando la línea celular
Vero-gM y se cotransfectó el plásmido pgM4\beta+
o pgM4GFP+ (Figura 3B) con ADN de EHV-4 para generar
un EHV-4 negativo de gM de primera generación
(Figura 3C). El plásmido pgM4w (Figura 3B) en combinación con ADN
de EHV-4 negativo de gM dio como resultado
E4\DeltagM-w (Figura 3D). Finalmente, el
EHV-4 con gM reparada, E4RgM (Figura 3A), se aisló
después de cotransfección del plásmido pgM4R (Figura 3B) con ADN de
E4\DeltagM-GFP en células Vero.
Se escindió ADN de EHV-4, E4RgM,
E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP
con PstI, EcoRV o HindIII, y los fragmentos de
ADN se transfirieron a membranas de nailon. Se hibridaron membranas
paralelas con secuencias específicas de GFP (idénticamente a la
Figura 2) o con una sonda, denominada gM3.1, que contiene las
secuencias específicas de EHV-4 tomadas del plásmido
pgM4R (Figura 3B).
\newpage
Los resultados de la digestión obtenidos (Figura
4) fueron los siguientes:
(i) en ADN de E4\DeltagM-GFP,
la sonda GFP reconoció fragmentos de 5.531 pb cuando se escindió con
PstI, de 8.383 pb después de digestión con EcoRV y de 4.528 pb
después de digestión con HindIII. Fragmentos idénticos más
fragmentos de 1.792 pb (PstI), 1.801 pb (EcoRV) y 826 pb más 5.487
pb (HindIII) reaccionaron con la sonda gM3.1.
(ii) ni el EHV-4 original ni los
virus reparados E4RgM ni E4\DeltagM-w portaban
ninguna secuencia específica de GFP;
(iii) los fragmentos de ADN reactivos con gM3.1
en EHV-4 y E4RgM se detectaron a 6.806 pb (PstI), a
7.874 pb más 1.801 pb (EcoRV) y a 4.837 pb más 5.487 pb (HindIII),
respectivamente;
(iv) el virus E4\DeltagM-w
negativo de gM y de módulo GFP no hibridó con secuencias GFP, sino
con las respectivas secuencias específicas de EHV-4
(gM3.1). La última sonda detectó fragmentos que carecían de 1110 pb
de las secuencias gM, en comparación con el virus de tipo natural,
concretamente de 5.696 pb (PstI), de 6.764 pb más 1.801 pb (EcoRV) y
de 3.727 pb más 5.487 pb (HindIII), respectivamente.
En ADN escindido con HindIII de todos estos
virus, existe otro fragmento específico de sonda gM3.1 de 126 pb
(Fig. 2C), pero este fragmento es demasiado pequeño para mostrarse
en esta transferencia Southern.
Los virus E4\DeltagM-GFP y
E4\DeltagM-w perdieron su capacidad de expresar gM
y además E4\DeltagM-w perdió la secuencia génica
marcadora.
a) Crecimiento viral en células de
cultivo. Se compararon las propiedades de crecimiento viral de
los diversos virus mutantes como se detalla anteriormente en
células Vero y Vero-gM. Las células sembradas en
placas de 24 pocillos se infectaron a una MOI de
1-2 y se determinaron las valoraciones virales
extracelular (infectividad extracelular) e intracelular
(infectividad intracelular) a diferentes puntos temporales p.i.
(Fig. 5). Mientras que las propiedades de crecimiento del virus
E4RgM de rescate correspondieron bien a las de
EHV-4, hubo una sorprendente inhibición en la
producción de las valoraciones virales extracelulares de
E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP
en células no complementarias. En esta serie de experimentos (media
de dos experimentos independientes), la infectividad extracelular
no pudo detectarse nunca antes de 24 h p.i. Incluso a 30 horas p.i.,
sólo se observaron valoraciones extracelular muy bajas (máximo de
1,5 placas/ml a la dilución menor de 10^{-1}), aunque las células
mostraron un grave efecto citopático. Las diferencias en
infectividad intracelular, sin embargo, nunca alcanzaron 100 veces
y tuvieron un máximo a 24 horas p.i. (84 veces entre
EHV-4 y E4\DeltagM-w). El retardo
en la detección de la infectividad intracelular fue sólo de un punto
temporal (12 h frente a 15 h p.i.). Tomado conjuntamente, podía
demostrarse sorprendentemente que la deleción de secuencias de gM
del fondo de EHV-4 influenciaba masivamente la
replicación viral in vitro, pero esa expresión de gM no es
esencial para la replicación. Especialmente, se redujo el virus
infeccioso extracelular, y bajó la capacidad de infectar
directamente células adyacentes, como refleja el tamaño de las
placas.
b) Tamaño de placas. Se midieron los
diámetros de 150 placas después de la infección de células Vero o
Vero-gM con EHV-4, E4RgM,
E4\DeltagM-w o E4\DeltagM-GFP, y
se determinaron los tamaños medios de placa respecto a los tamaños
de placas de tipo natural, que se fijaron a 100%. Se demostró
claramente que los virus negativos de gM eran capaces de infectar y
replicarse en células Vero, pero que los diámetros máximos de placa
estaban notablemente reducidos, a menos de un 20% de los diámetros
de placa de tipo natural (Fig. 6). La infección con el virus
original o de rescate dio como resultado la aparición de placas de
tipo natural, indicando que el fenotipo observado estaba realmente
inducido por la deleción de gM. Esto se corroboró adicionalmente por
el hecho de que la formación de placa de
E4\DeltagM-w y E4\DeltagM-GFP se
restableció totalmente en la línea celular Vero-gM
(datos no mostrados).
c) Experimentos de penetración. En este
experimento, se evaluó la influencia de gM de EHV-4
sobre la cinética de entrada de EHV-4. Se
permitieron adsorber 100 PFU de los diferentes virus,
EHV-4 original, el virus E4RgM con gM reparada, así
como los mutantes de deleción de gM y
E4\DeltagM-GFP (véase la Figura 3), a 4ºC en
células Vero en placas de 6 pocillos. Después de 90 minutos, se
reemplazaron los respectivos inóculos por medio fresco y se inició
la penetración cambiando la temperatura de incubación a 37ºC. A
diferentes momentos después del cambio de temperatura, empezando
inmediatamente (= 0 min), la infectividad extracelular se inactivó
por pH mediante el tratamiento de las células con un tampón citrato
(pH 3,0). Se lavaron consiguientemente muestras paralelas, pero el
tampón citrato se reemplazó por PBS de tal modo que en cada punto
temporal la "infectividad adsorbida" pudiera compararse con la
"infectividad penetrada". Se determinaron los números de
placas después de incubar las células durante cuatro días en
recubrimiento de Methocell.
c) Se realizaron diversos conjuntos de
experimentos: en la Figura 7A, se representan los resultados de
virus genotípica y fenotípicamente negativos de gM después de
propagación en células Vero no complementarias; mientras que la
Figura 7B representa la cinética de E4\DeltagM-w y
E4\DeltagM-GFP fenotípicamente complementados, ya
que los virus se han hecho crecer en células Vero-gM
que expresan gM.
Se protegió una medida de 52,8% (56,7%) del
EHV-4 (E4RgM) original infeccioso del tratamiento
ácido extracelular a 40 minutos después de iniciar la penetración
(Fig. 7A, círculos blancos), mientras que sin embargo se protegieron
sólo 33,7% (E4\DeltagM-rectángulos negros) y
38,5% (E4\DeltagM-GFP, triángulos negros) de virus
negativos de gM. A puntos temporales posteriores de cinética de
entrada, las diferentes gráficas empiezan a superponerse
diversamente y se alcanza una eficacia de penetración máxima de
entre 61,7% y 78,9% después de 150 minutos de tiempo de
penetración, indicando que una cierta variabilidad de ensayo puede
dar cuenta de las ligeras diferencias observadas.
(Fig. 7A). Cuando los virus negativos de gM se
habían preparado en células Vero-gM complementarias,
no se observó ninguna diferencia en su eficacia de penetración
(7B). En contraposición con un retardo en la cinética de entrada de
EHV-1 negativo de gM de aproximadamente un 20% (cepa
RacL11; Osterrieder et al., 1996) hasta un 40% (cepa KyA;
Seyboldt et al., 2000), el efecto de suprimir la gM de
EHV-4 tiene que anotarse con reservas. Sin embargo,
pueden extraerse las siguientes conclusiones: (i) se observó una
diferencia en la cinética de virus negativos de gM fenotípicamente
complementados y no complementados (Fig. 7A-B), pero
(ii) la influencia de la deleción de gM sobre la penetración de
EHV-4 es virtualmente insignificante.
Para afirmar si gM puede utilizarse como
marcador serológico para la distinción de infección de tipo natural
frente a vacunación con una vacuna negativa de gM, tenían que
comprobarse diversas suposiciones. Principalmente, necesitaba
evaluarse si los sueros de caballos infectados con virus de campo
contienen anticuerpos específicos de gM. Para el análisis inicial
se eligió un ensayo de transferencia Western, ya que este sistema
permitía identificar una reacción específica frente a la
reactividad de fondo. Cuando se utilizan sueros altamente
neutralizantes (valoraciones neutralizantes de EHV-1
y/o 4 entre 1:128 y 256), se estableció (datos no mostrados) que
los lisados de la estirpe celular ccgM que expresa gM de
EHV-1 permitían la detección de una señal específica
por sueros de caballo, y que una dilución de sueros de 1:3000
parecía funcionar óptimamente.
En consecuencia, se analizó en los sueros de los
12 potros (6 vacunados y 6 controles) que habían participado en un
ensayo de vacuna de gM de EHV-1 la reactividad
frente a gM en transferencia Western. De cada caballo individual,
se ensayaron tres sueros diferentes: tomado antes de entrar en el
ensayo (Pre), 4 semanas después de la segunda vacunación (V2) y dos
semanas después de la exposición a la infección (C),
respectivamente.
En resumen, por análisis de transferencia
Western (Figura 9) se mostró que (i) los sueros de caballos que
exhibían actividad de neutralización de EHV-1 dieron
todos positivo por gM, que (ii) la reactividad frente a gM no se
detectó nunca en ninguna de las muestras analizadas antes del
contacto conocido con EHV-1 o después de la
vacunación con el EHV-1 negativo de gM y que (iii)
después de la infección de los caballos del ensayo de vacuna con el
virus de exposición positivo de gM, la gM fue claramente detectable
en 10 de 12 casos. Finalmente, (iv) se observó que las valoraciones
de anticuerpo anti-EHV-1 y la
intensidad de la reactividad frente a gM no parecían directamente
correlacionadas.
Debido a la alta reactividad de fondo de los
sueros de caballo, el establecimiento de ensayos serológicos es
difícil. Basándose en datos de inmunofluorescencia indirecta (IIF)
obtenidos de sueros de caballo, se confirmó que tendrá que
establecerse un sistema de ensayo indirecto o de bloqueo o tendrán
que utilizarse polipéptidos gM altamente purificados en un ensayo
ELISA. Con este fin, se estableció un ELISA como sigue. Se
inmovilizaron polipéptidos gM purificados o gM completa sobre el
soporte sólido de una placa de 96 pocillos que se recubrió para
asegurar una buena adherencia de la proteína capturadora. Para el
ensayo, los sitios de unión no específica se bloquearon con leche
desecada o sustancias similares para evitar la unión inespecífica.
Después de ello, se lavó la superficie plástica con un tampón de
lavado apropiado (por ejemplo PBS-Tween) para
eliminar el exceso de agente bloqueante. Después, se añadieron las
muestras de ensayo a los pocillos seleccionados y la placa ELISA se
incubó a 37ºC según métodos estandarizados, permitiendo a los
anticuerpos en la muestra de ensayo que se unieran a la proteína
capturadora inmovilizada. En la siguiente etapa, se lavó
concienzudamente la placa ELISA varias veces lavando con tampón de
lavado, seguido de la adición de un anticuerpo
anti-caballo adecuado acoplado a una enzima tal
como HRP (peroxidasa de rábano picante). La detección del conjugado
anticuerpo unido/HRP se realizó finalmente añadiendo un sustrato
adecuado, seguido de la lectura fotométrica de la densidad óptica
de pocillos individuales. El valor obtenido ha de compararse con los
controles positivos y negativos realizados en el mismo ensayo.
Aunque la secuencia aminoacídica predicha de gM
de EHV-4 se calcula que es un 86,7% idéntica a la de
gM de EHV-1 (Telford et al., 1998), el Mab
13B2 anti-gM de EHV-1 (Allen y
Yeargan, 1987) reacciona específicamente en transferencia Western
sólo con la proteína específica de tipo (Crabb et al., 1991).
Para identificar sin embargo el homólogo de EHV-4
en este estudio, se ensayaron otros anticuerpos
anti-gM de EHV-1 (Seyboldt, et
al., 2000; Day, 1999) en viriones de EHV-4
purificados, en lisados de células infectadas con
EHV-4 o en lisados de células
Vero-gM, siendo esta última una estirpe celular
recombinante desarrollada para sintetizar gM de
EHV-4 bajo el control del promotor
IE-HCMV. La reactividad de todos los anticuerpos
monoclonales anti-gM de EHV-1
frente a gM de EHV-4 estaba por debajo del límite de
detección de la transferencia Western, mientras que las muestras de
EHV-1 paralelas eran siempre fácilmente reactivas
(datos no mostrados). Sólo el antisuero policlonal, que se había
generado en conejos frente a un polipéptido derivado de gM de
EHV-1 con cola de His (aminoácidos
376-450; Seyboldt et al., 2000) reaccionó
suficientemente fuerte con la gM heteróloga para permitir la
identificación de gM de EHV-4 (Fig. 10A). Utilizando
este anticuerpo, se observó reactividad específica a una Mr de
aproximadamente 50.000 a 55.000 en viriones de EHV-4
purificados. Según sus propiedades hidrófobas predichas, la
proteína gM detectada agregó tras ebullición. En contraposición, la
forma de gM expresada en células Vero-gM corre
principalmente a una Mr de aproximadamente 46.000 a 48.000,
indicando que las proteínas gM de EHV-4 se procesan
similarmente a como se ha mostrado para EHV-1
(Osterrieder et al., 1997; Rudolph y Osterrieder, 2002).
Se realizaron diversos experimentos para
analizar el fenotipo de la deleción de gM en EHV-4.
Para comparar la expresión de otras glicoproteínas, se sometieron
lisados de células Vero infectadas con EHV-4, E4RgM,
E4\DeltagM-w o E4\DeltagM-GFP a
análisis de transferencia Western. Se demuestra que la deleción de
gM no influía en la producción de las proteínas tardías gB o gD,
indicando que las etapas tempranas de la replicación viral no
estaban sustancialmente afectadas por la deleción.
En otro experimento, pudo demostrarse mediante
análisis de preparaciones de viriones de tipo natural,
EHV-4 con gM reparada o ambos con gM suprimida, que
no era detectable ninguna reactividad frente a gM con virus
negativos de gM, mientras que la proteína era fácilmente reactiva en
viriones de control. La presencia de viriones en la respectiva
preparación se mostró en un ensayo de transferencia paralelo frente
a gB (Fig. 10B).
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Claims (29)
1. Un herpesvirus equino, en el que la proteína
gM está ausente, caracterizado porque el citado herpesvirus
equino está libre de elementos heterólogos.
2. El herpesvirus equino según la reivindicación
1, caracterizado porque está suprimido el gen que codifica la
proteína gM.
3. El herpesvirus equino según la reivindicación
1 ó 2, obtenible mediante un método que comprende las etapas de:
- a)
- aislar un herpesvirus equino de tipo natural;
- b)
- establecer un plásmido que codifique el gen de gM de herpesvirus equino, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
- c)
- generar una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
- d)
- establecer un herpesvirus equino que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de herpesvirus equino y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
- e)
- suprimir el módulo que codifica GPF; y
- f)
- selecionar los clones de herpesvirus equino en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
4. El herpesvirus equino según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es
herpesvirus equino-1.
5. El herpesvirus equino-1 según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque están suprimidas 850-1100 pb del marco
abierto de lectura de gM.
6. El herpesvirus equino-1 según
las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque está
suprimida la secuencia de codificación entera de gM, excepto por
150-200 pb de la secuencia de codificación de la
porción C-terminal y excepto por
150-250 pb de la secuencia de codificación de la
porción N-terminal.
7. El herpesvirus equino-1 según
una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado
porque están suprimidos los nucleótidos 93268-93318
a 94222-94322 de la secuencia de codificación de gM,
en donde las posiciones de los nucleótidos se refieren a las
posiciones de nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino
según se describe en Telford 1992.
8. El herpesvirus equino-1 según
una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado
porque están suprimidos los nucleótidos 93268 a 94322 de la
secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los
nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la
secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford
1992.
9. El herpesvirus equino-1 según
una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado
porque está suprimida la secuencia de codificación completa de gM
excepto por 184 pb de la secuencia de codificación de la porción
C-terminal y excepto por 209 pb de la secuencia de
codificación de la porción N-terminal.
10. El herpesvirus equino-1
según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9,
caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 94263 a
933302 de la secuencia de codificación de gM, en donde las
posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de
nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe
en Telford 1992.
11. El herpesvirus equino-1
según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10,
caracterizado porque es una variante recombinante basada en
la cepa RacH de EHV-1.
12. Un herpesvirus equino-1,
caracterizado porque es un aislamiento
H\DeltagM-w depositado en el ECACC/CAMR el 16 de
octubre de 2002 con el número de acceso 02101663.
13. El herpesvirus equino según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es
herpesvirus equino-4.
14. El herpesvirus equino-4
según la reivindicación 13, caracterizado porque están
suprimidas 900-1150 pb del marco abierto de lectura
de gM.
15. El herpesvirus equino-4
según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque está
suprimida la secuencia de codificación completa de gM excepto
0-50 pb de la secuencia de codificación de la
porción C-terminal y excepto por
150-250 pb de la secuencia de codificación de la
porción N-terminal.
16. El herpesvirus equino-4
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15,
caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos
92681-92731 a 93765-93865 de la
secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones de los
nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la
secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford
1998.
17. El herpesvirus equino-4
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16,
caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 92681 a
93865 de la secuencia de codificación de gM, en donde las posiciones
de los nucleótidos se refieren a las posiciones de nucleótidos de la
secuencia de herpesvirus equino según se describe en Telford
1998.
18. El herpesvirus equino-4
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17,
caracterizado porque está suprimida la secuencia de
codificación entera de gM excepto por 34 pb de la secuencia de
codificación de la porción C-terminal y excepto por
209 pb de la secuencia de codificación de la porción
N-terminal.
19. El herpesvirus equino-4
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18,
caracterizado porque están suprimidos los nucleótidos 92715 a
93824 de la secuencia de codificación de gM, en donde las
posiciones de los nucleótidos se refieren a las posiciones de
nucleótidos de la secuencia de herpesvirus equino según se describe
en Telford 1998.
20. Un herpesvirus equino-4,
caracterizado porque es un aislamiento E4\DeltagM que se
depositó en el ECACC/
CAMR el 14 de enero de 2003 con número de acceso 03011401.
CAMR el 14 de enero de 2003 con número de acceso 03011401.
21. Un ácido nucleico que codifica un
herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
20.
22. Una preparación de vacuna que comprende un
herpesvirus equino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
20.
23. Una preparación de vacuna que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 21.
24. Uso de un herpesvirus equino según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 en la fabricación de un
medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones por
herpesvirus equino.
25. Uso de un ácido nucleico según la
reivindicación 21 en la fabricación de un medicamento para la
profilaxis y/o el tratamiento de infecciones por herpesvirus
equino.
26. Una preparación de vacuna que comprende al
menos un herpesvirus equino-1 según las
reivindicaciones 1 a 12 y un herpesvirus equino-4
según las reivindicaciones 13 a 20.
27. Uso de al menos un herpesvirus
equino-1 según las reivindicaciones 1 a 12 y un
herpesvirus equino-4 según las reivindicaciones 13 a
20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
infecciones por herpesvirus equino.
28. Método para la obtención de un herpesvirus
equino recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende las etapas de:
- a)
- aislar un herpesvirus equino de tipo natural;
- b)
- establecer un plásmido que codifique el gen de gM de herpesvirus equino, opcionalmente con secuencias flanqueantes;
- c)
- generar una estirpe celular complementaria que exprese gM o partes de la misma;
- d)
- establecer un herpesvirus equino que porte una inserción de módulo que codifica GFP en su secuencia de codificación de gM mediante cotransfección de la estirpe celular complementaria de la etapa b) con ácido nucleico de EHV y un plásmido que codifica gM que está interrumpido con una inserción de módulo que codifica GFP;
- e)
- suprimir el módulo que codifica GPF; y
- f)
- seleccionar los clones de EHV en los que el módulo que codifica GFP está exitosamente suprimido.
29. Una estirpe celular complementaria de gM,
caracterizada porque es VERO GM que se depositó en el
ECACC/
CAMR el 28 de enero de 2003 con el número de acceso 03012801.
CAMR el 28 de enero de 2003 con el número de acceso 03012801.
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