ES2322888T3 - Metodo para la cuantificacion de la expresion de proteina akt. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en una muestra celular o tisular, comprendiendo el método las etapas de: (a) teñir inmunohistoquímicamente la proteína AKT en una pluralidad de sedimentos celulares de control usando un anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra AKT, donde la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en la pluralidad de sedimentos celulares de control se conoce independientemente, y donde la expresión, el nivel de activación o tanto la expresión como el nivel de activación de AKT en cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control no son iguales; (b) determinar una densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular para cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control teñidos en (a); (c) generar una curva de calibración que relacione la cantidad conocida de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos con dicha densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular determinada en (b) para cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control; (d) teñir inmunohistoquímicamente la proteína AKT de dicha célula o tejido usando dicho anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra la proteína AKT; (e) determinar una densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular en dicha muestra celular o tisular; (f) determinar la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en dicha muestra celular o tisular comparando la densidad óptica promedio de la proteína AKT teñida por píxel de área celular determinada en la etapa (e) en dicha muestra biológica con la curva de calibración generada en la etapa (c), donde la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos se deriva de la curva de calibración.
Description
Método para la cuantificación de la expresión de
proteína AKT.
La invención se refiere a métodos para la
cuantificación de la expresión proteica en muestras celulares o
tisulares relacionados con el diagnóstico y tratamiento de
patologías, particularmente patologías cancerosas. Específicamente,
la invención se refiere a métodos para la cuantificación de la
expresión proteica de AKT1 y AKT2 así como su estado de activación
en que se usa un sistema de formación de imágenes para cuantificar
la expresión proteica de AKT1 y AKT2.
Un diagnóstico de cáncer se confirma
convencionalmente a través del examen histológico de muestras
celulares o tisulares recogidas de un paciente. Los patólogos
clínicos necesitan ser capaces de determinar de forma precisa si
dichas muestras son benignas o malignas y de clasificar la
agresividad de las muestras tumorales consideradas como malignas,
porque estas determinaciones a menudo forman la base para
seleccionar un transcurso adecuado de tratamiento del paciente.
El examen histológico tradicionalmente conlleva
procedimientos de tinción de los tejidos que permiten que se
observen fácilmente las características morfológicas de una muestra
al microscopio óptico. Un patólogo, después de examinar la muestra
teñida, típicamente hace una determinación cualitativa de si la
muestra tumoral es maligna. Es difícil, sin embargo, establecer la
agresividad del tumor simplemente a través del examen histológico
de la muestra.
Los sistemas de análisis de imágenes automáticos
(asistidos por ordenador) conocidos en la técnica pueden aumentar
el examen visual de las muestras. En un sistema representativo, la
imagen aumentada de una muestra celular o tisular se expone a
reactivos que detectan un marcador biológico específico, y las
imágenes se procesan por un ordenador que recibe la imagen desde un
dispositivo acoplado por carga (CCD) o cámara tal como una cámara
de televisión. Dicho sistema puede usarse, por ejemplo, para
detectar y medir los niveles de expresión del receptor de
estrógenos (ER), el receptor de progesterona (PR), o el oncogén
HER-2/neu en una muestra particular. Usando
esta metodología, puede administrarse un régimen de terapia más
eficaz; por ejemplo, puede usarse terapia hormonal cuando la
muestras dan positivo para ER y PR, y puede usarse terapia
anti-receptor de oncogenes cuando las muestras dan
positivo para HER-2/neu (National Institute
of Health Consensus Development Conference: Steroid Receptors in
Breast Cancer, 1919, Bethesda, MD; Hancock et al., 1991,
Cancer Res. 51:4575-80; Arteaga et al.,
1994, Cancer Res. 54:3758-65; Bacus et al.,
1997, Anal. Quant. Cytol. Histol. 19:316-28;
Sliwkowski et al., 1999, Semin. Oncol.
26:60-70; Shale, 1999, Semin. Oncol.
26:71-77; Cobleigh et al., 1999, J. Clin.
Oncol. 17:2639-48). Además, Bacus et al.
(Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual,
vol. 42, página 243, Marzo de 2001), describen la regulación
positiva de AKT2 en cánceres de mama que
sobre-expresan Her-2/neu.
La apoptosis, o muerte celular programada que
sucede como parte del desarrollo normal de los mamíferos, se
observó por primera vez hace casi cien años. La inducción de muerte
celular en el desarrollo es un proceso altamente regulado que puede
suprimirse por una diversidad de estímulos extracelulares. Por
ejemplo, las profundas consecuencias biológicas de la supresión por
factores de crecimiento de la apoptosis se ejemplifican por el
papel crítico de las neurotrofinas derivadas de la diana en la
supervivencia de las neuronas y el mantenimiento de los circuitos
neuronales funcionales (Pettmann and Henderson, 1998, Neuron
20:633-47). La capacidad de los factores tróficos
de promover la supervivencia se atribuye, al menos en parte, a la
cascada de la fosfatidilinosítido 3'-OH quinasa
(PI3K)/c-akt quinasa. Se han identificado
varias dianas de la vía de señalización
PI3K/c-akt que pueden estar subyacentes a la
capacidad de la cascada reguladora para promover la supervivencia y
prevenir la apoptosis. Este comportamiento es relevante para el
diagnóstico del cáncer porque la supervivencia celular y la
evitación de la apoptosis es una parte necesaria de la proliferación
incontrolada característica de las células cancerosas.
Por tanto, existe la necesidad en la técnica de
detectar células, particularmente células cancerosas, que sean
capaces de prevenir la apoptosis, como parte de métodos mejores para
diagnosticar, clasificar y evaluar muestras celulares y tisulares
obtenidas de pacientes, como parte de un diagnóstico inicial de
cáncer, en el control de la eficacia de los esfuerzos clínicos por
controlar o eliminar las células cancerosas, o para detectar la
recurrencia de un tumor primario o la existencia de enfermedad
metastásica en un paciente con cáncer. Existe específicamente la
necesidad en la técnica de una detección mejorada de la expresión de
los productos de genes marcadores tumorales para mejorar los
diagnósticos y hacer diagnósticos precisos tan pronto como sea
posible en el transcurso de la enfermedad.
La invención proporciona métodos para
cuantificar la expresión proteica y los niveles de activación de
AKT1 o AKT2 en muestras celulares o tisulares obtenidas de un
animal, más preferiblemente un paciente humano con cáncer o un
individuo que se sospecha que tiene cáncer. Específicamente, la
invención proporciona métodos para cuantificar la expresión
proteica o los niveles de activación de AKT1 y AKT2 usando un
sistema de formación de imágenes de forma cuantitativa. Más
específicamente, la invención proporciona métodos en que se usa un
sistema de formación de imágenes para recibir, potenciar, y procesar
imágenes de muestras celulares o tisulares, que se han teñido con
tintes específicos de la proteína AKT, para determinar la cantidad o
nivel de activación de proteína AKT expresada en las muestras
celulares o tisulares de dicho animal. En realizaciones preferidas
de los métodos de la invención, se genera una curva de calibración
de la expresión proteica de AKT1 y AKT2 para al menos dos líneas
celulares que expresan cantidades diferentes de proteína AKT. La
curva de calibración entonces se usa para determinar de forma
cuantitativa la cantidad de proteína AKT que se expresa en una
muestra celular o tisular. Pueden hacerse curvas de calibración
análogas para proteínas AKT1 o AKT2 activadas usando reactivos
específicos para las características de activación. También puede
usarse para determinar cambios en las cantidades y estado de
activación de AKT (AKT1 y AKT2) antes y después del tratamiento
clínico del cáncer.
En una realización de los métodos de la
invención, se cuantifica la expresión proteica de AKT2 en una
muestra celular o tisular usando un ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) para determinar la cantidad de proteína AKT2 en
una parte de un sedimento celular preparado a partir de al menos dos
líneas celulares de control que expresan cantidades diferentes de
proteína AKT2, con la que se compara la expresión de AKT2 en la
muestra celular o tisular. En otras realizaciones de los métodos de
la invención, se cuantifica indirectamente la cantidad de proteína
AKT2 expresada en una muestra celular o tisular por hibridación del
ARNm de c-akt2 aislado de la muestra celular
o tisular con series de oligonucleótidos de elevada densidad, o por
determinación de la expresión del ARNm de
c-akt2 por RT-PCR o por
experimentos de hibridación por transferencia de Northern. De forma
importante, después se tiñe una parte diferente del mismo sedimento
celular con un anticuerpo anti-AKT2 seguido de
análisis inmunohistoquímico para determinar la cantidad de proteína
AKT2 en la muestra, preferiblemente midiendo la densidad óptica de
la muestra a una longitud de onda específica para el tinte
inmunohistoquímico usado para detectar la proteína
AKT-2. En la práctica de una realización preferida
de la invención, se prepara una curva de calibración en la que
representa la concentración de proteína AKT2, más preferiblemente
determinada por ELISA, frente a la medición de densidad óptica para
la proteína AKT2. Para determinar la cantidad de proteína AKT2
expresada en una muestra celular o tisular, se mide la densidad
óptica para
\hbox{la proteína AKT2 y se compara con la curva
de calibración generada a partir de las líneas celulares de
control.}
Las realizaciones preferidas específicas de la
presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la
siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones y las
reivindicaciones.
La Figura 1 es un gráfico que muestra los
resultados de la cuantificación de HER-2/neu
y AKT-2 por análisis de imágenes de células de
cáncer de mama en secciones tumorales. Los resultados de
AKT-2 se muestran en unidades arbitrarias de
densidad óptica mientras que los resultados de
HER-2/neu se expresan en picogramos de
proteína HER-2/neu por célula. Las células
que no sobre-expresan
HER-2/neu (+1 y negativo) se indican por
cuadrados negros rellenos y las células que expresan
HER-2/neu a niveles correspondientes a +2 y
+3 se indican por cuadrados grises.
La Figura 2 es un análisis inmunohistoquímico de
secciones en parafina de tejidos de cáncer de mama teñidas para
HER-2/neu (2114 HER-2 IHC),
para AKT-2 (2114 AKT2 IHC), o por la técnica de
fosfatasa alcalina y teñidas con contraste por el método de Feulgen
para proporcionar el análisis de hibridación in situ
fluorescente (FISH) (2114 HER-2 FISH).
La Figura 3 es una transferencia de Western que
muestra los niveles de AKT1 y AKT2 en formas fosforiladas y no
fosforiladas. Carril 1: control negativo; Carril 2: tratamiento con
activador de AKT NDF/Heregulina; Carril 3: tratamiento con
herceptina.
Esta invención proporciona métodos para
determinar cuantitativamente los niveles de expresión y activación
para proteínas celulares, AKT1 y AKT2, que están implicadas en la
mediación de la evitación de la apoptosis en células tumorales,
particularmente células tumorales humanas detectadas en muestras
celulares o tisulares de un individuo. Estos métodos dependen de la
identificación de proteínas AKT como mediadores importantes de la
apoptosis en células normales y tumorales en mamíferos,
particularmente seres humanos.
La identificación de AKT (el producto proteico
del gen c-akt) como un regulador clave de la
supervivencia celular tiene implicaciones significativas para la
oncogénesis y la resistencia a fármacos. Por ejemplo, la pérdida de
un supresor tumoral humano, PTEN, se correlaciona con una actividad
AKT aumentada (Li et al., 1997, Science
275:1943-47; Liaw et al., 1997, Nat. Genet.
16:64-67; Nelen et al., 1997, Hum. Mol.
Genet. 6:1383-87; Cantley and Neel, 1999, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4240-45; Datta et
al., 1999, Genes Dev. 13:2905-27). Además, la
supresión de la apoptosis no es la única función que puede tener AKT
para promover la oncogénesis. En algunas circunstancias, AKT
también puede inducir el progreso del ciclo celular. Sin embargo, la
observación de que AKT puede suprimir la apoptosis, considerada a
la luz del hallazgo de que las células pueden volverse resistentes
a la apoptosis a través de la deleción de PTEN, la
sobre-expresión de Ras activo, o la
sobre-expresión de PI3K activa, sugiere que los
oncogenes pueden bloquear la apoptosis celular adaptativa
hiperactivando AKT.
Dada la complejidad de la maquinaria apoptótica,
existen varias vías por las que AKT puede actuar para promover la
supervivencia celular e inhibir la muerte celular. AKT puede
bloquear la apoptosis regulando la expresión o actividad de
miembros de los genes de la familia Bcl-2
(que se sabe que desempeñan un papel en la supervivencia celular o
la muerte celular). Como alternativa, AKT puede regular la expresión
o actividad de la familia de proteínas caspasas, o la función de
las vías de muerte. El efecto regulador de AKT puede ser a través de
un mecanismo directo - la fosforilación de componentes de la
maquinaria apoptótica, por ejemplo - o un mecanismo
indirecto - tal como alterando el nivel de expresión de genes que
codifican componentes de la maquinaria de muerte. Estudios
recientes sugieren que AKT regula la apoptosis en múltiples sitios.
Se han identificado varias dianas de AKT, que desempeñan todas
papeles críticos en la mediación de la muerte celular, incluyendo
BAD, la caspasa-9, la familia de factores de
transcripción Forkhead, y el regulador de NF\kappaB IKK (Datta
et al., 1999, supra).
El primer componente de la maquinaria apoptótica
encontrado que fosforila AKT era el miembro de la familia
Bcl-2 BAD. BAD se identificó en base a su
capacidad de unirse a BCL-2; el análisis de la
estructura primaria de Bad reveló que es similar a
Bcl-2 (Yang et al., 1995, Cell
80:285-91). El hallazgo de que AKT suprime la
muerte inducida por BAD por la fosforilación directa de BAD es
coherente con la evidencia correlativa que sugiere que la vía
endógena PI3K/AKT culmina en la fosforilación de BAD endógena.
Además, estímulos tales como ceramida, irradiación ultravioleta
(UV), radiación infrarroja (IR), y sorbitol, que regula
negativamente la actividad de AKT a través de mecanismos todavía no
caracterizados, cada inhibe también la fosforilación de BAD (Zundel
and Giaccia, 1998, Genes Dev. 12:1941-46).
AKT también fosforila la
caspasa-9. Este acontecimiento de fosforilación
tiene consecuencias funcionales, ya que extractos de líneas
celulares que sobre-expresan AKT bloquean la
activación de caspasa-9 mediada por citocromo C
in vitro. Estos resultados sugieren que AKT promueve la
supervivencia celular a través de la inactivación de la
caspasa-9 corriente abajo de la liberación de
citocromo C. No está claro cómo la fosforilación de la
caspasa-9 provoca su inactivación, aunque parece que
\hbox{la fosforilación de la caspasa-9 inactiva
la actividad catalítica intrínseca de la proteína.}
Además, existen evidencias de que AKT está
implicada en la mediación de los efectos tumorigénicos de la
expresión de genes de la familia ErbB. La familia ErbB (HER) de
receptores oncogénicos contiene cuatro miembros: HER (EGFR),
HER-2, (ErbB-2),
HER-3, y HER-4. El interés en esta
familia de receptores se ha estimulado enormemente por el hallazgo
de que la sobre-expresión de HER-2
transforma las células, y se correlaciona con un aumento en el
progreso y la metástasis de cánceres humanos de mama y ovario. Más
recientemente, se ha aprobado un anticuerpo monoclonal humanizado
contra HER-2 para el tratamiento de pacientes con
cáncer de mama con HER-2
sobre-expresado. Por tanto, se ha establecido el
significado de la sobre-expresión de
HER-2 en el desarrollo de cáncer de mama (Liu et
al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun.
261:897-903).
La heregulina, que es un ligando para los
receptores tanto HER-3 (ErbB-3) y
HER-4 (ErbB-4), puede activar
HER-2/neu a través de la formación de un
heterodímero. La heregulina también es un activador potente y
rápido de la actividad enzimática de AKT en células
MCF-7 que expresan HER-2. Esta
activación está mediada por la estimulación por
HER-2 o HER-3 de la vía de PI3K.
Además, la sobre-expresión de HER-2
en células de cáncer de mama BT474 se correlaciona con un aumento
en la actividad basal de AKT. Finalmente, un anticuerpo monoclonal
contra HER-2, que se usa para tratar a pacientes con
cáncer de mama, disminuye la actividad basal de AKT en estas
células. Esto implica a la vía de PI3K/AKT como una de las dianas
corriente abajo de la señalización de
heregulina/HER-2. Por tanto, la cascada de PI3K/AKT
puede desempeñar un papel en la capacidad de la
sobre-expresión de HER-2 para
generar un fenotipo de cáncer de mama más agresivo.
AKT2 también desempeña un papel importante en la
supervivencia celular y en el bloqueo de la muerte celular
programada después de radiación o tratamiento con quimioterapia. Por
ejemplo, se descubrió que AKT2 se sobre-expresaba
en cánceres pancreático, de mama, y de ovario. En pacientes en los
que se ha detectado sobre-expresión de
HER-2/neu, no solamente se halla que el gen
c-akt2 se activa transcripcionalmente, sino
que se ha demostrado que la proteína AKT2 se
sobre-expresa. En una comparación de células
MCF-7, que expresan un nivel basal de
HER-2/neu, y células MCF-7
transfectadas con una construcción de expresión de
HER-2/neu, los niveles de ARNm de
c-akt2 aumentaban 27 veces en las células
MCF-7 transfectadas con
HER-2/neu. En muestras tumorales en que se
descubrió que se sobre-expresaba
HER-2/neu, se descubrió que AKT2 se regulaba
positivamente (Tabla I).
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
Estos resultados sugieren que la activación y
sobre-expresión de AKT2 en cánceres de mama que
sobre-expresan HER-2/neu
puede ser un factor significativo en el comportamiento biológico
agresivo de estos cánceres. Los agentes terapéuticos dirigidos a
componentes de las vías de señalización de AKT y los ensayos de
diagnóstico para detectar y medir el nivel de proteínas AKT y para
detectar y medir sus estados de activación son importantes en el
tratamiento de dichos cánceres. Existe la necesidad en la técnica de
un ensayo fiable para determinar los niveles proteicos de AKT y su
estado de activación en muestras celulares o tisulares obtenidas de
pacientes. Un método satisfactorio también debe permitir al
patólogo excluir tejido normal del análisis.
En la práctica de una realización preferida de
los métodos de esta invención, se usa un sistema de tinción
inmunohistoquímico de dos componentes de modo que los sedimentos
celulares o el tejido se tiñan con contraste con un color mientras
que las proteínas de interés en el sedimento celular o el tejido se
tiñan con un color diferente. La imagen de las células en el
sedimento celular y la muestra tisular después se aumenta en un
microscopio óptico y se divide en un par de imágenes separadas. Se
usa un par de filtros ópticos que son específicamente coincidentes
para que tengan una absorción máxima para cada tinte específico para
potenciar las imágenes separadas. Uno de los filtros ópticos
transmite de forma preferente luz que tiene una longitud de onda en
la longitud de onda de absorción del tejido teñido con contraste.
El otro filtro óptico pasabanda estrecho transmite de forma
preferente en las regiones de absorción espectral para el tinte
usado para detectar la proteína de interés. Usando filtros de
análisis de imágenes, pueden cuantificarse diferentes proteínas
celulares en diversos componentes, tales como la membrana, el
citoplasma y el núcleo. Para resultados óptimos, el sistema de
formación de imágenes se calibra antes de tomar ninguna
medición.
La realización preferida de la presente
invención y sus ventajas se entienden mejor por referencia a los
Ejemplos 1-5. Estos Ejemplos son ilustrativos de
realizaciones específicas de la invención, y diversos usos de las
mismas. Se exponen solamente para propósitos de explicación, y no se
adoptan como limitantes de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Usando un sistema de tinción inmunohistoquímico
de dos componentes como se ha descrito anteriormente, se genera una
curva de calibración usando al menos dos líneas celulares que
expresan cantidades diferentes de proteína AKT2. Las muestras
celulares o tisulares para pacientes humanos con cáncer se tiñen del
mismo modo que la segunda parte del sedimento celular de control y
se determinan las densidades ópticas que miden el grado de tinción
inmunohistoquímica para cada muestra tisular ensayada. En la
realización preferida del método de la presente invención, la
muestra tisular y la segunda parte del sedimento celular se tiñen
simultáneamente para explicar cualquier diferencia potencial entre
los lotes de los tintes usados o variaciones en el proceso de
tinción. La cantidad de proteína biológica en la muestra tisular se
determina usando la curva de calibración generada a partir de las
mediciones de proteína AKT2 en las líneas celulares de control.
La suma promedio de la densidad óptica por
píxel, calculada en análisis de imágenes, toma en cuenta la densidad
óptica total de la imagen teñida positiva para proteína AKT2 y la
divide por la cantidad total de píxeles de la imagen teñida usando
tintes de contraste tales como Fast Green (Verde Rápido) o verde de
etilo para derivar los píxeles totales que comprende la membrana o
el área nuclear. Se genera una curva de calibración después de cada
tinción.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Una curva de calibración se deriva para calibrar
el sistema de modo que puedan usarse los sedimentos celulares como
patrones para cuantificar los niveles proteicos de AKT2 en tejidos.
La intensidad del color formado por la reacción enzimática en el
ELISA como se sabe en la técnica es proporcional a la concentración
de proteína AKT2 en la muestra, dentro del intervalo de trabajo del
ensayo. Puede obtenerse una curva representando la concentración
proteica de AKT2 (fmol/mg de ELISA) o receptores por célula
frente a los datos promedio de O.D. del análisis de imágenes de los
muestras teñidas cortadas de una parte diferente de estos mismos
tres sedimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Usando HER-2/neu como
ejemplo, se cortaron y tiñeron cuatro sedimentos de calibración
celular congelados correspondientes a células que expresan
HER-2/neu, para los que se conoce la cantidad
determinada por ELISA (fmol) de
HER-2/neu por mg de proteína, junto con
secciones tisulares de pacientes en cada ronda de tinción. Para
cada tejido, se examinaron dos partes - una embebida en O.C.T.
(Optimal Cutting Temperature (Temperatura de Corte Óptima), Baxter
Scientific Products, McGraw Park, IL) para el seccionamiento
congelado y otra que se molió en nitrógeno líquido y se colocó en
tampón de homogeneización para usarse en un ensayo ELISA. La parte
para ELISA de cada tejido se proceso para
HER-2/neu usando el Kit de ELISA CalBiochem.
Estas muestras teñidas después se cuantificaron usando análisis de
imágenes para determinar la O.D. promedio
(HER-2/neu). La cantidad de proteína
HER-2/neu expresada en las líneas celulares
de calibración determinada por ELISA y análisis de imágenes se
muestra en la Tabla II.
La O.D. promedio para cada uno de los sedimentos
de calibración se representó frente al valor de
HER-2/neu por mg de proteína obtenido del
ELISA de los mismos sedimentos de calibración. La ecuación de este
gráfico después se usó para derivar la cantidad (fmol) de
HER-2/neu en cinco muestras tisulares de
pacientes usando la O.D. promedio de la cuantificación. Cada ronda
de tinción de muestras tisulares se hizo junto con secciones de una
serie de sedimentos de calibración. Cada vez que se ensayó una serie
de tejidos, se incluyeron secciones de los sedimentos en el proceso
de tinción y sus valores cuantificados (O.D. promedio) se usaron
para generar una curva de calibración. La cantidad de proteína
HER-2/neu expresada en las muestras tisulares
de pacientes determinada por ELISA y análisis de imágenes se
muestra en la Tabla III.
Los resultados de estos procedimientos indicaron
que este método produce valores cuantitativos para las cantidades
de HER-2/neu expresado por células tumorales.
La Tabla I muestra resultados preliminares obtenidos usando
unidades de densidad óptica de anticuerpos para determinar los
niveles de proteína AKT2 en tejido de mama que expresa niveles
normales (+1) de HER-2/neu o
sobre-expresa HER-2/neu. Se
ha detectado un elevado nivel de expresión proteica de AKT2 en
cánceres que sobre-expresan
HER-2/neu (+3 o +4). Por tanto, un sistema
de análisis de imágenes automático (asistido por ordenador)
combinado con una serie de sedimentos celulares a usar como
calibradores presenta un método preciso para la cuantificación de
los niveles de expresión proteica de AKT2 en muestras celulares o
tisulares. El mismo método puede aplicarse para medir la cantidad
de activación de AKT antes y después del tratamiento con un fármaco
específico que bloque la actividad de AKT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se cultivaron células MCF7 (obtenidas de la
Michigan Cancer Foundation, Detroit, Ml) y
MCF7/HER-2/neu que expresan
HER-2/neu a un nivel de expresión elevado
5-8 veces, que se generaron previamente por
transducción de células MCF7 con un vector de expresión de ADNc de
ErbB-2 (Bacus et al., 1996; Peles et
al., 1993; Daly et al., 1997), en RPMI 1640 (Gibco,
Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal al 10%,
penicilina (100 \mug/ml), en una incubadora humidificada con
CO_{2} al 8% en aire a 37ºC. Las células se indujeron a
experimentar apoptosis en condiciones crecientes de hipoxia en
presencia o ausencia del inhibidor de la PI3 quinasa/Akt Wortmanina
(Calbiochem, San Diego, CA). Las células tratadas con Wortmanina se
expusieron a 50 \muM del inhibidor 7-48 horas
después de la siembra celular y durante 1-3 días
después de ello. En condiciones hipóxicas, las células MCF7 eran
sensibles a la apoptosis. La presencia de Wortmanina tenía un
efecto solamente marginal sobre la supervivencia de las células MCF7
en hipoxia. Sin embargo, las células
MCF7/HER-2/neu resistían la apoptosis en
hipoxia, mientras que se reducía enormemente la viabilidad de las
células MCF7/HER-2/neu expuestas a
Wortmanina. La resistencia celular a la hipoxia en células que
sobre-expresan HER-2/neu, por
lo tanto, está asociada con la activación de las vías de AKT. El
papel de las vías de PI3 quinasa/AKT y
HER-2/neu en la supervivencia celular en
hipoxia se confirmó cultivando diversas líneas celulares en
condiciones hipóxicas y correlacionando la supervivencia con la
expresión de HER-2/neu.
Se obtuvieron células
MDA-MB-435 y
MDA-MB-435/HER-2 del
Dr. Yu en el UTMD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Las células
se cultivaron en RPMI 1640 suplementado como anteriormente en
CO_{2} al 8% a 37ºC. Se hizo la transferencia de Western del
siguiente modo. Las células se lisaron en tampón de lisis
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, cloruro sódico 150 mM,
EDTA 1 mM, Nonidet P-40 al 1%, ortovanadato sódico 1
mM, fluoruro sódico 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 2
\mug/ml de pepstatina, 2 \mug/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de
aprotinina), se centrifugaron a 4ºC durante 5 min. a 6500 g, y se
determinó la concentración de proteína con un Kit de Ensayo de
Proteínas BioRad (BioRad, Hercules, CA). Las proteínas se separaron
por electroforesis usando un sistema Bis-Tris
NuPAGE con tampón de desplazamiento MOPS 1x (Novex, San Diego, CA) y
se transfirieron a una membrana Hybond C-extra
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Las membranas se
bloquearon con leche en polvo desnatada, se incubaron con los
anticuerpos apropiados, se lavaron con PBS (solución salina
tamponada con fosfato) y se incubaron con anticuerpo secundario
conjugado con peroxidasa de rábano rusticano. La detección se
realizó con Renaissance Chemiluminescence Reagent Plus (NEN Life
Science, Boston, MA). Las células
MDA-MB-435/HER-2
sobre-expresan HER-2/neu 10
veces en comparación con la línea celular parental
MDA-MB-435 determinado por análisis
de transferencia de Western. Los lisados de estas células se
recogieron y se examinó la expresión de AKT-2 por
análisis de transferencia de Western con dos anticuerpos diferentes
contra AKT-2, un anticuerpo policlonal (Santa Cruz,
CA) y un anticuerpo monoclonal (Dr. Testa, Fox Chase Cancer Center,
Philadelphia, PA). Se observó un aumento en los niveles de
AKT-2 en las células que
sobre-expresan
HER-2/neu.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se examinaron muestras tumorales de 42 pacientes
para la expresión de c-akt-1
y c-akt-2. Los tejidos se
dividieron en dos grupos: los que expresan niveles normales (hasta
+1) de HER-2/neu y los que
sobre-expresan (de +2 a +3)
HER-2/neu. Los tejidos se tiñeron para
AKT-1 y AKT-2. Aunque los niveles de
AKT-1 eran similares en ambos grupos, el análisis
de imágenes reveló que AKT-2 estaba regulada
positivamente hasta 10 veces en los tejidos que
sobre-expresan HER-2/neu
(Figura 1). La Figura 2 muestra por análisis inmunohistoquímico que
la elevada expresión de AKT-2 se correlaciona con la
sobre-expresión de HER-2/neu
en una sección en parafina de un tumor canceroso de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se midió el estado activado (fosforilado) de AKT
total (AKT-1 más AKT-2) en células
que sobre-expresan HER-2/neu
para estudiar el significado funcional de
c-akt en células que
sobre-expresan HER-2/neu y
cánceres. Se trataron células SKBR3, BR474, y AU565 (Cell Culture
Laboratory Navy Biosciences Laboratory, Navy Supply Center,
Oaldand, CA), todas las cuales expresan
HER-2/neu, con el activador conocido de
c-akt, NDF/Heregulina (10 ng/ml; un presente
de Y. Yarden, Rehovot, Israel), o el anticuerpo monoclonal contra
HER-2/neu, Herceptina (20 mg/ml),
7-48 horas después de la siembra y se continuó
durante 1-3 días. Los lisados celulares de las
células SKBR3, BR474, y AU565 se examinaron por análisis de
transferencia de Western como se ha descrito anteriormente. AKT
activada se determinó por anticuerpos que reconocen específicamente
el estado fosforilado de la proteína AKT. Las células se lisaron
como anteriormente y se sometieron a inmunoprecipitación con
anticuerpos anti-AKT-1 y
anti-AKT-2. La inmunoprecipitación
se realizó del siguiente modo. Los lisados celulares (250 \mug de
proteína por 500 \mul de tampón) se pre-incubaron
con perlas de agarosa de proteína A + proteína G (Gibco BRL Life
Technologies, Rockville, MD), se incubaron con 0,5 \mug de
anticuerpos anti-AKT-1 o
anti-AKT-2 (Upstate Biotechnology
Lake Placid, NY) durante una noche a 4ºC, seguido de incubación
durante 1 hora con 40 \mul de perlas de agarosa de proteína A +
proteína G. Los complejos inmunes se lavaron con tampón de lisis
frío y se examinaron por transferencia de Western con
anti-fosfo-Akt para detectar las
formas fosforiladas de AKT-1 o
AKT-2 (Figura 3).
La cantidad total de AKT así como la
fosforilación de AKT-1 estaba aumentada en células
tratadas con Heregulina. El tratamiento con Herceptina disminuyó la
fosforilación de AKT total y AKT-1. El nivel basal
de fosforilación de AKT-2 era elevado y permanecía
elevado después del tratamiento con Heregulina o Herceptina. La
exposición a Herceptina y Heregulina durante 3 días provocaba la
regulación negativa del estado fosforilado de AKT-1
pero no afectaba a AKT-2. Por lo tanto, la
activación del receptor HER-2/Her-3
por NDF/Heregulina conduce a la activación de AKT y
AKT-1. El tratamiento con Herceptina, que conduce a
la regulación negativa de HER-2/neu, también
conduce a la regulación negativa de AKT-1, pero no
de AKT-2. Para determinar si la heterodimerización
de HER-2 y HER-3 desempeña un papel
en la activación de AKT-1, se inmunoprecipitó
HER-3 a partir de células
MDA-MB-474 no tratadas y tratadas
con NDF y Herceptina. Los inmunoprecipitados se analizaron por
transferencia de Western con anticuerpos
anti-HER-2. La regulación negativa
de la activación de AKT se correlacionaba con la regulación
negativa de los heterodímeros
HER-2/Her-3. El tratamiento con
Herceptina estaba asociado con la regulación negativa de estos
heterodímeros, que provocaba la regulación negativa de la actividad
de AKT-1. Los niveles basales de
AKT-2 fosforilada no se veían afectados por el
tratamiento con Heregulina o Herceptina.
Claims (8)
1. Un método para determinar la cantidad de
proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en
una muestra celular o tisular, comprendiendo el método las etapas
de:
- (a)
- teñir inmunohistoquímicamente la proteína AKT en una pluralidad de sedimentos celulares de control usando un anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra AKT, donde la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en la pluralidad de sedimentos celulares de control se conoce independientemente, y donde la expresión, el nivel de activación o tanto la expresión como el nivel de activación de AKT en cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control no son iguales;
- (b)
- determinar una densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular para cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control teñidos en (a);
- (c)
- generar una curva de calibración que relacione la cantidad conocida de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos con dicha densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular determinada en (b) para cada uno de la pluralidad de sedimentos celulares de control;
- (d)
- teñir inmunohistoquímicamente la proteína AKT de dicha célula o tejido usando dicho anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra la proteína AKT;
- (e)
- determinar una densidad óptica promedio de proteína AKT teñida por píxel de área celular en dicha muestra celular o tisular;
- (f)
- determinar la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos en dicha muestra celular o tisular comparando la densidad óptica promedio de la proteína AKT teñida por píxel de área celular determinada en la etapa (e) en dicha muestra biológica con la curva de calibración generada en la etapa (c), donde la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína AKT o ambos se deriva de la curva de calibración.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
expresión, el nivel de activación o tanto la expresión como los
niveles de activación de AKT2 en cada uno de la pluralidad de
sedimentos celulares de control no son iguales.
3. El método de la reivindicación 1, donde la
expresión, el nivel de activación o tanto la expresión como los
niveles de activación de AKT1 en cada uno de la pluralidad de
sedimentos celulares de control no son iguales.
4. El método de la reivindicación 2 ó 3, donde
la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína
AKT, o ambos de cada uno de los sedimentos celulares de control se
determina por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
5. El método de la reivindicación 2 ó 3, donde
la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína
AKT, o ambos de cada uno de los sedimentos celulares de control se
determina por hibridación de series de oligonucleótidos de elevada
densidad con el ARNm celular o el ADNc preparado a partir del
mismo.
6. El método de la reivindicación 2 ó 3, donde
la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína
AKT, o ambos de cada uno de los sedimentos celulares de control se
determina por RT-PCR del ARN celular o el ARNm.
7. El método de la reivindicación 2 ó 3, donde
la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína
AKT, o ambos de cada uno de los sedimentos celulares de control se
determina por hibridación por transferencia de Northern.
8. El método de la reivindicación 2 ó 3, donde
la cantidad de proteína AKT, el nivel de activación de la proteína
AKT, o ambos de cada uno de los sedimentos celulares de control se
determina por microserie de proteínas.
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