ES2322141T3 - Endofitos de pastos. - Google Patents
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Abstract
Un endófito de las especies Neotyphodium coenophialum, seleccionado del grupo que consiste de: AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535; AR539; y combinaciones de éstos; AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535; AR539 que son cultivos depositados el 2 de octubre del 2002 en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia (AGAL) con números de acceso: NM02/31935; NM02/31936; NM02/31937; NM02/31938; NM02/31939; NM02/31940; NM02/31941; NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944; Caracterizados porque, en combinación con un pasto huésped, dicho endófito no causan síntomas de toxicosis en animales; en donde: el endófito retiene los niveles de protección de por lo menos dos alcaloides seleccionados del grupo que consiste de: agroclavina; setoclavina; isosetoclavina; y combinaciones de éstos, para proteger de esta manera el pasto huésped de las plagas o las tensiones abióticas o ambos. y el pasto huésped es artificialmente inoculado con el endófito.
Description
Endófitos de pastos.
Esta invención se relaciona con endófitos
fungosos y combinaciones de endófitos con plantas de pastos. Más
particularmente la invención se relaciona con endófitos que forman
combinaciones de cañuela alta (Festuca arundinacea) y
algunos otros pastos relacionados. Aún más particularmente la
invención se relaciona con combinaciones que tienen toxicidad
reducida a pastura de ganado comparado con los cultivares de
combinaciones de endófito/cañuela alta en uso común.
Los endófitos fungosos del género Neotyphodium
(anteriormente Acremonium) infectan un número de pastos Pooideae de
clima moderado. Los endófitos Neotyphodium pueden producir
alcaloides que se considera confieren grados de plaga y
posiblemente protección de enfermedad a las plantas en las cuales
ellos ocurren de manera natural. (Rowan y Latch, 1994; Blank and
Gwinn, 1992). Los endófitos Neotyphodium se transmiten verticalmente
a través de la semilla de los pastos y no se ha establecido
transmisión horizontal natural (Leuchtmann, 1997).
Muchas de las infecciones de endófitos naturales
predominantes de cultivares de pastos mejorados utilizados para
producción agrícola pastoril también causan significativos
trastornos en animales, por ejemplo las toxicosis de cañuela alta
(Stuedemann y Hoveland, 1988) y tambaleos por pastos centeno
(Fletcher et al., 1999). Estas pueden ser reacciones tóxicas
complejas de animales a los alcaloides producidos bajo un rango de
condiciones de crecimiento de la planta. Pérdidas económicas
significativas en los sistemas agrícolas pastoriles pueden ocurrir
debido a tales toxicosis en animales. De otra parte la presencia de
por lo menos algunos endófitos puede ser esencial para la
persistencia competitiva del pasto escogido en una pastura (Elberson
y West, 1996, Fletcher y Easton, 2000).
Las líneas de pastos se pueden infectar
artificialmente con endófitos seleccionados. Los cultivos axénicos
de endófitos se pueden utilizar para infectar plántulas de pasto,
crecidas inicialmente bajo condiciones estériles (Latch y
Christensen, 1985), que se seleccionan entonces por cualidades
deseables, y multiplicada para uso comercial. Se han desarrollado
tres ejemplos significativos de esta tecnología por la división
Grasslands de AgResearch Ltd: pasto centeno híbrido tetraploide
GREENSTONE^{TM} con endófitos ENDOSAFE^{TM} (Tapper y Latch,
1999, Patente NZ 233083); varios pastos centeno perennes e híbridos
con endófito AR1 (Fletcher y Easton, 2000); y cultivares de cañuela
alta con endófito MaxQ^{TM} (Bouton et al., 2000; Bouton
et al., 2002, Patente US 6,111,170).
La toxicosis de cañuela se ha asociado con la
infección natural de la cañuela alta por cepas comunes de
Neoty-phodium coenophialum. Estas cepas producen
típicamente el alcaloide ergopeptina, ergovalina, que es de una
clase de ergopeptinas conocidas por ser tóxicas para los animales.
La ergovalina se considera por ser la causa principal de la
toxicidad de la cañuela. Otros compuestos, notablemente compuestos
de ergolina y ergoleno, por ejemplo ácido lisérgico, posiblemente
se agregan al síndrome (Oliver, 1997; Gadberry et al., 1997;
Hill et al., 2001).
Los niveles de ergovalina tienden a ser mayores
en vaina y cabezas de hoja de la cañuela alta que en la lámina de
la hoja y sufren de variación estacional (Rottinghaus et al.,
1991). Existe poca ergovalina en las raíces. Típicamente una
concentración de ergovalina en las hiervas o productos herbáceos
tales como paja de heno, paja, semilla o ensilaje de más de un
promedio de 0.4 ppm de materia seca se ha considerado como un riesgo
de originar la toxicosis de cañuela (Tor-Agbidye
et al., 2001) especialmente cuando se combina con las
condiciones climáticas que exacerban los síntomas de la toxicosis
de cañuela.
La peramina se produce en pastos infectados con
endófito (Rowan et al., 1986) y probablemente movilizados
dentro de la planta. Es un potente disuasor de la alimentación para
un rango de insectos, por ejemplo, gorgojo del vástago argentino
(Listronotus bonariensis), (Rowan y Latch 1994) y un factor
significativo para proteger los pastos infectados con endófito de
la predación de plagas de insectos.
Las lolinas (N-formillolina,
N-acetillolina, N-acetilnorlolina y
otros compuestos cercanamente relacionados) se producen por algunos
endófitos Neotyphodium que incluyen N. coenophialum típico de
la cañuela alta. Estos compuestos en pastos apropiados infectados
con endófito tienen propiedades de disuadir o resistir un número de
insectos, notablemente insectos chupadores, por ejemplo,
Rhopalosiphum padi (Seigel et al., 1990).
La infección con endófito se ha asociado con la
persistencia mejorada de plantas de cañuela alta bajo condiciones
de déficit de agua o sequía. Si este efecto se debe a la mejor
resistencia de los factores de tensión biótica expresados en
situaciones de déficit de agua; la salud general mejor de las
plantas de cañuela alta infectadas con endófito (particularmente de
los sistemas radiculares); o debido a respuestas fisiológicas
diferenciales específicas de las plantas infectadas con endófito a
la tensión con agua; no es claramente evidente. Sin embargo, el
efecto total es la resistencia mejorada al déficit de agua.
Algunos endófitos Neotyphodium, notablemente
aquellos de derivación evolucionaria de cepas de Epicholë
festucae tal como N. lolii, producen potentes
tremorgenos que son tóxicos a las pasturas de los animales. Para
asegurar que tales tremorgenos no se producen por un endófito
introducido artificialmente en la cañuela alta o el pasto centeno
de forraje, se verifica la presencia de los tremorgenos potentes
conocidos típicos de los endófitos, que son los lolitremos. También
se busca la actividad tremorgénica en animales de prueba para
pastura.
Es un objetivo de la presente invención
suministrar un endófito que pueda producir ergovalina y algunos
compuestos de ergolina o ergoleno en la base de las vainas de hoja
de cañuela alta y en la corona de la planta pero solamente de una
manera tal que la concentración usual en la hierba que se consume en
general por animales de pastura en las prácticas comunes en las
fincas es menor que el nivel de umbral de toxicidad práctico.
Para el propósito de esta especificación
"corona" se define como el área de la planta de pasto que está
generalmente a menos de 2 cm por encima del nivel del suelo y
excluye las raíces de los pastos, pero incluye la base de los
retoños y los puntos de crecimiento del meristema lateral para
nuevos retoños vegetativos.
Es un objetivo adicional de la invención
suministrar un endófito que pueda producir lolinas en cantidades
que se consideren por ser parcial o sustancialmente efectivas en
disuadir la alimentación de algunas plagas de insectos sobre las
plantas.
Es un objetivo adicional de la invención
suministrar un endófito que no produzca niveles detectables de
lolitremos y no sean observablemente tremorgénicos.
Es aún un objetivo adicional de la presente
invención manejar los problemas anteriores o por lo menos
suministrarle al público una elección útil.
Se reconoce que el término "comprende"
puede, bajo varias jurisdicciones, ser considerado con un
significado exclusivo o inclusivo. Para el propósito de esta
especificación, y a menos que se anote de otra manera, el término
"comprende" debe tener un significado inclusivo, es decir, que
significará una inclusión de no solamente los componentes listados
directamente de las referencias, sino también de otros componentes o
elementos no especificados. Este raciocinio también se utilizará
cuando el término "comprendido" o "que comprende" se
utilizan en relación con una o más etapas en un método o
proceso.
Aspectos y ventajas adicionales de la presente
invención serán evidentes de la descripción siguiente que se da
solamente por vía de ejemplo.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención se suministra un endófito de especies Neotyphodium
coeno-phialum, seleccionado del grupo que consiste de:
AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535;
AR539; y combinaciones de éstos; AR512; AR513; AR514; AR517; AR521;
AR522; AR524; AR525; AR535; AR539; que son cultivos depositados el
2 de octubre del 2002 en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de
Australia (AGAL) con números de acceso: NM02/31935; NM02/31936;
NM02/31937; NM02/31938; NM02/19399; NM02/31940; NM02/31941;
NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944;
Caracterizados porque, en combinación con un
pasto huésped, dichos endófitos no causan síntomas de toxicosis en
animales y se caracterizan adicionalmente en que el endófito retiene
suficientes niveles de por lo menos dos alcaloides seleccionados
del grupo que consiste de: agroclavina; setoclavina; isosetoclavina;
y combinaciones de éstos, que protegen el pasto huésped de las
plagas o las tensiones abióticas o ambos.
y se caracteriza adicionalmente porque el pasto
huésped es artificialmente inoculado con el endófito.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra un cultivo de endófito de las
especies Neotyphodium coenophialum, seleccionado del grupo
que consiste de: AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524;
AR525; AR535; AR539; y combinaciones de éstos; AR512; AR513; AR514;
AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535; AR539; son cultivos
depositados el 2 de octubre del 2002 en los Laboratorios Analíticos
del Gobierno de Australia (AGAL) con números de acceso: NM02/31935;
NM02/31936; NM02/31937; NM02/31938; NM02/31939; NM02/31940;
NM02/31941; NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944; caracterizados
porque, en combinación con un pasto huésped, dicho cultivo de
endófitos no causan síntomas de toxicosis en animales:
y se caracterizan adicionalmente porque el
cultivo de endófito retiene suficientes niveles de por lo menos dos
alcaloides seleccionados del grupo que consiste de: agroclavina;
setoclavina; isosetoclavina; y combinaciones de éstos, que protegen
el pasto huésped de las plagas o las tensiones abióticas o
ambos.
y se caracteriza adicionalmente porque el pasto
huésped es artificialmente inoculado con el cultivo de endófito.
Preferiblemente, la toxicosis que se evita es la
toxicosis de cañuela. Más preferiblemente la toxicosis se origina
por una toxina ergovalina.
Preferiblemente, el nivel de ergovalina en la
presente invención es de menos de 0.4 ppm en la materia seca en la
hierba consumida por los animales de pastura. Más preferiblemente,
el nivel de ergovalina es de menos de 0.4 ppm en la materia seca en
las hierbas, diferentes de la corona de las plantas de pasto
huésped, consumidas por los animales de pastura.
Preferiblemente, la tensión abiótica es un
déficit de agua.
Preferiblemente, el cultivo de endófito, si se
utiliza, es un cultivo axénico.
Preferiblemente, el endófito o el cultivo de
endófito produce menos del 0.2 ppm de ergovalina en materia seca de
las hierbas totales cuando se infecta en pasto huésped.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra una combinación del endófito como
se describió anteriormente, y un pasto huésped.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se suministra una combinación del cultivo endófito como
se describió anteriormente, y un pasto huésped.
Preferiblemente, la combinación, sustancialmente
como se describió anteriormente, se logra mediante la modificación
de pasto huésped infectado con el endófito o el cultivo de endófito
por los métodos seleccionados del grupo que consiste de: crianza;
cruce; hibridización; modificación genética; y combinaciones de
ésta.
Preferiblemente, el pasto huésped utilizado en
la combinación descrita anteriormente se selecciona del grupo que
consiste de: cultivares de pasto cañuela alta, cultivar de pasto
centeno, cultivar de cañuela de pradera, y combinaciones de
éstos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención el pasto huésped es un pasto Pooideae.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra una combinación de endófito o
cultivo de endófito, como se describió anteriormente, y un pasto
huésped en donde la combinación produce isosetoclavina y
setoclavina a una velocidad mayor de 0.5 ppm en cada una de la
materia seca en las coronas de plantas de pasto huésped.
Preferiblemente también, la combinación produce menos de 0.2 ppm de
materia seca de ergovalina en las hierbas totales.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra una combinación de endófito como
se describió anteriormente y un pasto huésped, en donde la
combinación tiene las características seleccionadas del grupo que
consiste de: mejoramiento de la protección a las plagas, resistencia
a los insectos, resistencia a la pastura, y combinaciones de
éstos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra una combinación como se describió
anteriormente y un pasto huésped, en donde la combinación tiene las
características de mejoramiento de crecimiento de los animales de
pastura y una productividad creciente de los animales con relación
al pasto infectado con los endófitos conocidos capaces de inducir
toxicosis de cañuela.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministra una combinación como se describió
anteriormente y un pasto huésped en donde la plaga a la cual se le
confiere resistencia creciente sobre el pasto huésped se selecciona
del grupo que consiste de: nematodo de lesión, áfidos de raíz,
escarabajo pulga del maíz, y combinaciones de éstos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministran semillas de un pasto huésped
infectado con el endófito sustancialmente como se describió
anteriormente.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se suministran semillas de un pasto huésped
infectado con el cultivo de endófito como se describió
anteriormente.
La invención es la combinación de ejemplos de
una clase de endófito Neotyphodium coenophialum y cultivares
de pasto mejorado mediante la inoculación artificial para producir
pastos huéspedes que no originan síntomas de toxicosis por vía de
la toxina ergovalina, pero que retienen suficientes niveles de otros
alcaloides (por ejemplo: agroclavina, setoclavina y/o
isosetoclavina) para continuar individualmente o en combinación la
protección de pastos huéspedes de plagas o tensiones abióticas
(tales como déficit de agua) o ambos.
La invención se ha logrado al entender la
biología de los endófitos de pastos de climas moderados, aislar los
endófitos de interés seleccionados, inocular los endófitos en las
plántulas de pastos esterilizadas en la superficie, ejemplificadas
por la cañuela alta mejorada o las líneas de cultivares de pasto
centeno perenne, re-evaluar la producción de
alcaloide, multiplicar la semilla, evaluar los factores agronómicos,
probar la producción animal, evaluar por cualquier evidencia de
trastornos de animal tales como la toxicosis de cañuela,
tembladeras, hipertermia, o depresión de la hormona prolactina y
probar la protección de plagas en invertebrados.
La invención consiste de lo anterior y también
visualiza construcciones de las cuales las siguientes son
ejemplos.
Todos los endófitos de esta invención son cepas
de colecciones de semillas de cañuela alta originalmente conseguidas
de la clase Claviplus. La semilla de varias colecciones de cañuela
alta se examinaron para la presencia del endófito mediante la
técnica de calabaza de semilla. Una selección de plantas para cada
una de las muestras de semilla, donde un endófito se mostró por
estar presente, creció durante pocas semanas en condiciones de
invernadero y se reprobaron para presencia de endofitos en sus
vainas de hojas.
Los endófitos de las plantas con quimiotipos de
interés se aislaron y se hicieron crecer en cultivo de acuerdo con
el método de Latch y Christensen (1985). Los endófitos de esta
invención se mantienen en una colección de cultivo o en plantas
clonadas en el sitio Grasslands de AgResearch Ltd en Palmerston
North, Nueva Zelanda. Los cultivos también se depositaron en los
Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia en Sydney,
Australia.
Los números de acceso son: NM02/31935;
NM02/31936; NM02/31937; NM02/31938; NM02/31939; NM02/
31940; NM02/31941; NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944; depositados el 2 de octubre del 2002. Todas las cepas de endófito de esta invención se acomodan dentro de un subgrupo único de especies Neotyphodium coenophialum. Los aislados, cuando crecen en agar de dextrosa de papa a 22ºC, crecen lentamente (crecimiento radial aproximadamente 0.1-0.3 mm por día) con colonias típicamente blancas y algonodosas. Los coridios se han observado a velocidades variables de producción cerca al margen de las colonias.
31940; NM02/31941; NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944; depositados el 2 de octubre del 2002. Todas las cepas de endófito de esta invención se acomodan dentro de un subgrupo único de especies Neotyphodium coenophialum. Los aislados, cuando crecen en agar de dextrosa de papa a 22ºC, crecen lentamente (crecimiento radial aproximadamente 0.1-0.3 mm por día) con colonias típicamente blancas y algonodosas. Los coridios se han observado a velocidades variables de producción cerca al margen de las colonias.
Los cultivos axénicos de los endófitos AR512,
AR513, AR514, AR517, AR521, AR522, AR524, AR525, AR535 y AR539 como
ejemplos de esta invención, se inocularon exitósamente (Latch y
Christensen, 1985) en plántulas crecidas de semillas esterilizadas
en la superficie del cultivar de cañuela alta Kentucky 31. Los
endófitos AR514, AR524, y AR525 también se infectaron en otros
cultivares tales como, por ejemplo Grasslands Flecha, Jesup
Improved, Georgia 5 y varias líneas experimentales, generalmente con
una tasa de éxito satisfactoria mayor del 5% de intentos. No se
observaron fallas completas al infectar la cañuela alta con los
endófitos de esta invención.
Un cultivar de cañuela de pradera típico
(Ensign) se inoculó exitósamente con el endófito AR512. De manera
similar una línea de prueba de pasto centeno perenne típica (GA66)
se inoculó exitósamente con los endófitos AR514 y AR525 para examen
adicional con las características de los quimiotipos de las
combinaciones similares a cuando se infecta la cañuela alta, pero
generalmente con niveles inferiores de acumulación de alcaloide, y
con velocidades de infección del orden del 1% al 5% de intentos.
La semilla se ha producido exitosamente de
plantas infectadas que contienen los endófitos de esta invención
bajo condiciones de producción de semilla de rutina con velocidades
relativamente altas y útiles de infección de endófito.
Las partes basales de los retoños infectados con
endófito se secaron por congelamiento, algunas veces molidas, y
extraídas y analizadas cualitativamente para la presencia de
ergovalina con cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) como
se establece adelante. Aquellos que indican una ergovalina menor de
aproximadamente 0.2 ppm de materia seca se analizaron
adicionalmente para la producción de peramina a velocidades mayores
de aproximadamente 2 ppm de materia seca. Los endófitos de tales
selecciones se aislaron, clasificados mediante los atributos de
cultivo, y generalmente re-inoculados en plántulas
de cañuela alta libre de endófito, cultivar Kentucky 31, como un
huésped de pastura mejorada típica para propósitos comparativos. Las
muestras de tales plantas en varias etapas de crecimiento se
analizaron con más detalle para producción de alcaloide, incluyendo
la producción de lolitrems tremorgénicos típicos de la infección con
N. lolii y lolinas típicas de N. coenophialum.
La expresión de la producción de alcaloide de la
cañuela alta infectada con endófito, que utiliza los endófitos
seleccionados de fuentes de cañuela alta, se observó que caía
ampliamente en los tres grupos. El grupo más numeroso produce tanto
ergovalina como peramina a niveles a menudo mayores de 1 ppmen el
material de los retoños basales. Tales endófitos están
probablemente asociados con la toxicosis de cañuela de los animales
de pastura si están presentes a tasas altas de infección en el
forraje.
Un segundo grupo de quimiotipo produjo peramina
y lolinas, pero no trazas detectables de ergovalina. Los endófitos
típicos de este grupos se han desarrollado para aplicación comercial
(Bouton, 2000; Bouton et al., 2002, Patente US
6,111,170).
Un tercer grupo, de esta invención, que tiene
bajos niveles y una característica de distribución dentro de las
plantas de ergovalina, se discute adelante. Ellos se caracterizan
adicionalmente por la presencia de peramina en hierbas generalmente
de más de 1 ppm, y la presencia de lolinas en hierbas en cantidades
dentro de rangos típicos de infección de N. coenophialum. En
el curso de los análisis cromatográficos para ergovalina se
observaron la presencia de otros compuestos con UV y propiedades
espectrales de fluorescencia típicas de los derivados de ergoleno
(es decir, "alcaloides ergot" fluorescentes), notablemente en
las porciones basales de los retoños, coronas, y semillas de las
plantas de cañuela alta infectada con este grupo de endófitos. Estos
compuestos también se discuten adelante.
Las lolinas (N-formillolina,
N-acetillolina, y N-acetilnorlolina,
en orden de la abundancia usual observada) se detectaron mediante
cromatografía de gas capilar en extractos de planta de cañuela alta
y de cañuela de pradera infectada con los endófitos de esta
invención en cantidades más o menos comparables con aquellas
observadas en las plantas de cañuela alta comparables infectadas
con N. coenophialum común. Los métodos utilizados fueron
modificaciones menores del método de Yates et al.,
(1990).
Los lolitremos no se detectaron mediante
análisis cromatográfico en ninguna de las cañuelas altas infectadas
con los endófitos de esta invención. Los efectos posibles de los
lolitremos no se consideraron adicionalmente de manera directa,
diferente de las observaciones en pasturas de ovejas que contienen
el endófito AR514 para signos de tremores.
La concentración de ergovalina se midió mediante
HPLC con detección de fluorescencia. Típicamente, una muestra de
aproximadamente 50 mg de tejido infectado por endófito, secado por
congelamiento molido (1 mm malla) de menos de 3 a 5 cm de los
retoños provenientes de plantas vegetativas maduras (material de
retoño basal que consisten predominantemente de vainas de hojas) se
extrajo con 1 ml de una mezcla de partes iguales de
propan-2-ol y agua que contiene
también 1% de ácido láctico. La extracción continuó durante una hora
a temperatura ambiente con una mezcla suave. Se utilizó un estándar
interno de tartrato de ergotamina agregada (c. 1 \mug por muestra)
para comparaciones cuantitativas.
Luego de una centrifugación breve, se tomó una
muestra de solución de extracto clorificado por HPLC utilizando una
columna de fase inversa (típicamente Prodigy 150 x 4.6 mm, 5\mum
de silica ODS), Phenomenex, CA, USA); con elusión a 1 ml por minuto
y un gradiente de disolvente de acetonitrilo y 100 mM de acetato de
amonio acuoso por volumen que inicia a 27.5% de acetonitrilo y que
progresa en etapas lineales a 35% a 20 min, 50% a 35 min, 60% a 40
min y 75% a 50 min.
Los compuestos de ergoleno naturalmente
fluorescentes que incluyen ergovalina (y su isómero ergovalinina),
la ergotamina estándar interna (y su isómero ergotaminina
parcialmente formado durante la extracción) y los compuestos
observados en la sección anterior de los cromatogramos se detectaron
al utilizar excitación UV a 310 nm y emisión a 410 nm. La
ergovalina su isómero ergovalinina, el estándar interno de
ergotamina agregado y su isómero ergotaminina se eluyeron a
aproximadamente 22, 36, 30 y 42 minutos respectivamente. El nivel
de detección mínimo para análisis de rutina de ergovalina
(cantidades combinadas con el isómero de ergovalinina) es de
aproximadamente 0.05 ppm de materia seca.
Durante el curso de los ejemplos de examen de la
cañuela alta infectada con endófitos de esta invención para
ergovalina, se observaron otros derivados de ergoleno por estar
presentes en un patrón no previo reconocido. Los compuestos que
eluyen a aproximadamente 6.5 minutos (compuesto A) y 8.0 minutos
(compuesto B) ambos están presentes característicamente en retoños
basales infectados con endófitos y los materiales corona de esta
invención. Estos compuestos se han identificado como isosetoclavina
y setoclavina respectivamente, como sigue.
Las fracciones enriquecidas en los compuestos A
y B se prepararon de metanol-1% de ácido acético
acuoso (4:1) extracto de vainas inferiores molidas y secadas por
congelamiento de retoños que contienen los endófitos AR514 y AR524
(pre-extraídos con hexano). El extracto se fraccionó
mediante cromatografía flash de fase inversa secuencial sobre
silica gel funcionarizado con octadecilo (Aldrich) con gradientes de
etapas ácidas (metanol-1% de ácido acético acuoso) y
neutro (metanol-agua), y cromatografía flash de fase
normal sobre silica gel (silica gel 60, 40-63
\mu, Merck) con un gradiente de etapa de etil
acetato-metanol.
La fluorescencia característica y el espectro de
absorción UV y los datos de masa espectral de la ionización de
electropulverizado (ESI) para los compuestos A y B obtenidos
mediante análisis HPLC de fracciones enriquecidas que utilizan
variaciones de condiciones y detectores de separación HPLC
(instrumento Shimadzu LC-MS QP-5050
con una disposición de diodo SPD-10AVP UV y
detectores espectrales de fluorescencia RF-10A),
junto con los datos comparativos con los estándares que establecen
estos compuestos como setoclavinas (isosetoclavina y setoclavina
respectivamente). Ambos compuestos muestran picos de fluorescencia
fuertes en el HPLC (\lambda_{EX} 310 nm \lambda_{EX} 410
nm). Los espectros UV se caracterizan por las absorbancias máximas a
307 nm y 312 nm respectivamente y para ambos compuestos el espectro
de masa ESI de ión positivo muestra un pico base a m/z = 237
(MH^{+}-H_{2}O = y un ión MH^{+} a m/z = 255.
El compuesto B co-eluido con una muestra de
setoclavina de referencia suministrado por el Dr Miroslav Flieger,
Instituto de la Academia de Microbiología de Ciencias de la
República Checa. Los compuestos A y B fueron idénticos mediante
HPLC, y las propiedades espectrales de la isosetoclavina (compuesto
A) y la setoclavina (compuesto B) obtenidas mediante oxidación
química de agroclavina mediante un procedimiento estándar. La
presencia de isosetoclavina y setoclavina no se ha reportado
previamente en pastos infectados con endófitos aunque ellos se han
reportado como productos de oxidación de agroclavina en otros
sistemas de plantas (revisión de Kren,
1999).
1999).
Los mismos extractos también se mostraron por
contener agroclavina mediante LC-MS de
electropulverizado, con un ión de espectro de masa ESI atribuido a
MH^{+} a m/z = 239 que eluye al mismo tiempo con esencialmente el
mismo espectro UV como la agroclavina auténtica.
La Tabla 1 resume los resultados de análisis de
alcaloide de las partes de plantas especificadas de cañuela alta
infectada con endófitos y que usualmente crecen bajo condiciones
estacionales de verano moderado, en general en el cultivar de
prueba comparativo Kentucky 31. Por consideración de la producción
del alcaloide ergot en la corona y la parte basal de los retoños,
también se hizo comparación con la cañuela alta infectada con los
endófitos AR501 y AR542 que consistentemente no parecen producir
ninguna ergovalina o setoclavinas.
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Todos los endófitos discutidos anteriormente se
caracterizan por una "huella" de ADN (locus microsatelital
polimórfico seleccionado y/o Técnica de Polimorfismos Longitudinales
de Fragmento Arbritario (AFLP)) como perteneciendo a un subgrupo de
Neotyphodium coenophialum.
Las muestras de aproximadamente 50 mg frescas o
15 mg de retoños basales secos se utilizaron para la extracción de
ADN que utiliza un kit FastDNA para plantas (Bio 101, Vista,
California) mediante los procedimientos recomendados con el kit. Se
extrajo el ADN alternativamente genómico del endófito cultivado
(Moon et al., 1999). La amplificación PCR de microsatélite
se desarrolló utilizando pares iniciadores marcados con tintes
fluorescentes, B10.1 (5'-TET)/B10.2 y B11.1
(5'-HEX)/B11.4, como se describió por Moon et
al., (1999). El tamaño aparente de los productos marcados
fluorescentes PCR microsatélites se midió relativamente para estar
dentro de un estimado de 0.3 unidades de nucleótido por
electroforesis de capilar utilizando un Analizador Genético ABI 3100
con una química de polímero POP6 en unas disposiciones de capilar
de 50 cm y estándares de GeneScan-400HD (Applied
Biosystems Inc., Foster City, CA). Los tamaños aparentes de los
productos PCR mediante esta técnica (ajustada al sustraer una
unidad donde un nucleótido de adenina parece haber sido agregado
terminalmente) se establecen en la Tabla 2.
La Tabla 2 muestra que los endófitos de esta
invención se pueden distinguir de los otros grupos de los endófitos
Neotyphodium por el número de alelos observados y los tamaños
aparentes de tales alelos. Así todas las cepas de esta invención
comparten un alelo B11 de un tamaño c. de 128 pares base y un
segundo alelo B11 dentro del rango de tamaño c. de 192 a 200 bp.
Ellos también comparten con otras cepas de N. coenophialum
hasta los tres alelos B10 dentro del rango c. 154 a 185 bp.
\newpage
La presencia de tres alelos para los endófitos
de esta invención para el locus B10 es consistente con la evidencia
para
el N. coenophialum como un endófito híbrido derivado de tres diferentes especies fuente de Epichloë (Tsai et al., 1994).
el N. coenophialum como un endófito híbrido derivado de tres diferentes especies fuente de Epichloë (Tsai et al., 1994).
\newpage
Análisis mediante AFLP (Griffiths et al.,
1999) también confirmaron que los ejemplos de los endófitos AR514,
AR525 y AR535 de esta invención son de un subgrupo que se puede
distinguir de otros endófitos de N. coenophialum por fuera
de esta subgrupo mediante una o más diferencias polimórficas, pero
no muchas diferencias, desde más de 200 bandas de AFLP observadas
por ser polimórficas para el género Neotyphodium y Epichloë.
Las pasturas de cañuela alta infectadas con
ejemplos de los endófitos de esta invención no inducen toxicosis
típica de cañuela en animales de pastura. La Tabla 3 muestra las
velocidades de crecimiento de ovejas en ensayos conducidos en
Eatonton, GA, USA para dos estaciones (21 de
abril-30 de junio 1997, 2 de abril-2
de julio 1998). El crecimiento de las ovejas sobre las pasturas de
cañuela alta Kentucky 31 infectada con la cepa de endófito AR514
fue esencialmente el mismo crecimiento que sobre pasturas libres de
endófito equivalente y significativamente mejor que el crecimiento
en pasturas naturalmente infectadas con endófito utilizando el
cultivar Jesup comparable. La infección de endófito tipo silvestre
redujo significativamente la ganancia de peso vivo (P < 0.05) y
la temperatura del cuerpo medio creciente (rectal).
La depresión neta de la prolactina en la sangre
es otro síntoma de la toxicosis de cañuela. La cepa de endófito
AR514 no originó una depresión de prolactina mientras que con la
prolactina de endófito tipo silvestre se redujo de manera neta.
En total, el desempeño de la pastura de ovejas
sobre la pastura AR514 fue similar a aquella de la pastura libre de
endófito. No se observaron síntomas de tremores o "tembladera de
pasto centeno".
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En algunos ambientes, notablemente los suelos
arenosos con climas relativamente calientes y húmedos, los nemátodos
pueden originar daño significativo a los sistemas radiculares de
cañuela alta afectando así la persistencia del pasto en la pastura.
Un ensayo de invernadero con tres plantas y nueve replicas por
tratamiento ha demostrado que la infección con endófito puede
conferir resistencia a los nemátodos de lesión, Pratylenchus
spp. En un experimento de invernadero se investigó la
reproducción de nemátodo con dos cultivares de cañuela alta
infectadas con varios endofitos o libres de endófito.
La Tabla 4 indica que un endófito de esta
invención, el AR514, confiere resistencia parcial a nemátodos de
lesión a un grado mayor que las plantas libres de endófito (EF) o
dos endófitos a los que les falta la producción de ergovalina
(AR542 & AR584) aunque no el mismo grado que el endófito común
(EI) de los cultivares.
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La infección de endófito se conoce por afectar
la infestación de pastos por áfidos. La Tabla 5 compara los
tratamientos de catorce plantas cada una del cultivar de cañuela
alta Kentucky 31 para los números medios de áfidos de raíz en donde
la infección de AR514 se muestra por conferir una protección
considerable en comparación con otros conjuntos de plantas
infectados con endófito o plantas libres de endófito.
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Las hojas de cañuela alta Kentucky 31 infectadas
con los ejemplos de los endófitos de esta invención (E+) y también
las hojas infectadas con el endófito tóxico tipo silvestre se
compararon con el material libre de endófito (EF) utilizando el
escarabajo pulga del maíz Chaetocnema pulicaria en un
experimento de prueba de preferencia de alimentación. Los endófitos
AR512, AR513, AR514, AR524 y AR525 confieren todos resistencia o
abstinencia de alimentación similar a aquella de las hojas
infectadas con el endófito tóxico tipo silvestre. La media de las
calificaciones de alimentación para los ejemplos de esta invención
fueron E+ = 0.4 como contra EF = 2.8 (P < 0.001) sobre una
escala de 0 a 3 (donde 0 es ninguna alimentación y 3 es alimentación
extensiva). Conteos de calificación de cicatrices de alimentación
(E+ = 2.2, EF = 27.8, media del número total de cicatrices a través
de 3 transectos por lámina de hoja) y de glóbulos fecales (E+ = 9.2,
EF = 75.8, número medio de glóbulos fecales sobre cada lámina)
también fueron diferentes altamente significativos con aquellos de
E+ cercanamente comparables con aquellos del endófito tipo
silvestre tóxico de Kentucky 31.
Una prueba de preferencia única similar con el
endófito AR512 infectado con el cultivar de cañuela de pradera
Ensign demostró un efecto de preferencia aún más extremo con
calificaciones de alimentación de E+ = 0.0, EF = 3.0, conteos de
calificación de cicatrices de alimentación E+ = 0, EF = 33, y
glóbulos fecales E+ = 3, EF = 50.
Los aspectos de la presente invención se han
descrito por vía solamente de ejemplo y se debe apreciar que se
pueden hacer modificaciones y adiciones a ésta.
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Claims (25)
1. Un endófito de las especies Neotyphodium
coenophialum, seleccionado del grupo que consiste de: AR512;
AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535; AR539; y
combinaciones de éstos; AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522;
AR524; AR525; AR535; AR539 que son cultivos depositados el 2 de
octubre del 2002 en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de
Australia (AGAL) con números de acceso: NM02/31935; NM02/31936;
NM02/31937; NM02/31938; NM02/31939; NM02/31940; NM02/31941;
NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944;
Caracterizados porque, en combinación con
un pasto huésped, dicho endófito no causan síntomas de toxicosis en
animales;
en donde: el endófito retiene los niveles de
protección de por lo menos dos alcaloides seleccionados del grupo
que consiste de: agroclavina; setoclavina; isosetoclavina; y
combinaciones de éstos, para proteger de esta manera el pasto
huésped de las plagas o las tensiones abióticas o ambos.
y el pasto huésped es artificialmente inoculado
con el endófito.
2. Un endófito de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la toxicosis es toxicosis de cañuela.
3. Un endófito de acuerdo con la reivindicación
1 o 2, en donde la toxicosis se origina por ergovalina.
4. Un endófito de acuerdo con la reivindicación
2 o 3, en donde el nivel de ergovalina es de menos de 0.4 ppm en
materia seca en hierba consumida por animales de pastura.
5. Un endófito de acuerdo a la reivindicación 3
o 4, en donde el nivel de ergovalina es de menos de 0.4 ppm en
materia seca en hierbas, diferentes de la corona de la planta de
pasto huésped, consumida por los animales de pastura.
6. Un endófito de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en donde la tensión abiótica es un
déficit de agua.
7. Un cultivo endófito de las especies
Neotyphodium coenophialum, seleccionado del grupo que
consiste de: AR512; AR513; AR514; AR517; AR521; AR522; AR524;
AR525; AR535; AR539; y combinaciones de éstos; AR512; AR513; AR514;
AR517; AR521; AR522; AR524; AR525; AR535; AR539 que son cultivos
depositados el 2 de octubre del 2002 en los Laboratorios Analíticos
del Gobierno de Australia (AGAL) con números de acceso: NM02/31935;
NM02/31936; NM02/31937; NM02/31938; NM02/31939; NM02/31940;
NM02/31941; NM02/31942; NM02/31943; NM02/31944;
caracterizados porque, en combinación con un pasto huésped,
dicho cultivo de endófito no causa síntomas de toxicosis en animales
de pastura;
en donde: dicho cultivo de endófito retiene los
niveles protectores de por lo menos dos alcaloides seleccionados
del grupo que consiste de: agroclavina; setoclavina; isosetoclavina;
y combinaciones de éstos, para proteger de esta manera el pasto
huésped de las plagas o las tensiones abióticas o ambos.
y el pasto huésped es artificialmente inoculado
con el endófito.
8. Un cultivo de endófito de acuerdo a la
reivindicación 7, en donde el cultivo de endófito es un cultivo
axénico.
9.Un cultivo de endófito de acuerdo a la
reivindicación 7 u 8, en donde la toxicosis es toxicosis de
cañuela.
10. Un cultivo de endófito de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la toxicosis se
origina por ergovalina.
11. Un cultivo de endófito de acuerdo a la
reivindicación 9 o 10, en donde el nivel de ergovalina es de menos
de 0.4 ppm en materia seca en hierba consumida por animales de
pastura.
12. Un cultivo de endófito de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el nivel de
ergovalina es de menos de 0.4 ppm en materia seca en hierba,
diferente de la corona de la planta de pasto huésped, consumida por
animales de pastura.
13. Un cultivo de endófito de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la tensión
abiótica es un déficit de agua.
14. Una combinación de un endófito de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un pasto huésped.
15. Una combinación de un cultivo de endófito de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, y un pasto
huésped.
16. Una combinación de acuerdo a la
reivindicación 14 o 15, en donde dicha combinación se logra mediante
la modificación de pasto huésped infectado con el endófito o el
cultivo de endófito mediante los métodos seleccionados del grupo
que consiste de: crianza; cruce; hibridización; modificación
genética; y combinaciones de éstos.
17. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 16, en donde dicho pasto huésped se
selecciona del grupo que consiste de: cultivar de pasto cañuela
alto; cultivar de pasto centeno; cultivar de cañuela de pradera; y
combinaciones de éstos.
18. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 16, en donde dicho pasto huésped es un
pasto Pooideae.
19. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 18, en donde la combinación produce
isosetoclavina y setoclavina a una tasa mayor de 0.5 ppm cada una
de la materia seca en las coronas de la planta de pasto
huésped.
20. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 19, en donde la combinación produce menos
de 0.2 ppm de materia seca de ergovalina en hierba completa.
21. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 20, en donde la combinación tiene por lo
menos una característica seleccionada del grupo que consiste de:
mejoramiento de protección de plaga; resistencia a insectos;
persistencia a la pastura; y una combinación de ésta.
22. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 21, en donde la combinación tiene las
características de mejoramiento de crecimiento de animal de pastura
y/o productividad mejorada de animal relativa al pasto infectado
con endófitos conocidos capaces de inducir toxicosis de cañuela.
23. Una combinación de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 22, en donde la plaga, a la cual se le
confiere resistencia mejorada sobre el pasto huésped, se selecciona
del grupo que consiste de: nematodo de lesión; áfido de raíz;
escarabajo pulga de maíz; y combinaciones de éstos.
24. Semilla de un pasto huésped
caracterizada porque las semillas son de un pasto huésped, la
semilla y el pasto huésped se infectan con un endófito de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
25. Semilla de un pasto huésped
caracterizada porque las semillas provienen de un pasto, la
semilla y el pasto se infectan con un cultivo de endófito de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13.
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