ES2321359B1 - Proteinas de fusion de p53 sin actividad de transcripcion y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Proteínas de fusión de p53 sin actividad de
transcripción y sus aplicaciones.
Las proteínas de fusión están basadas en la
proteína p53, comprenden un dominio de unión a Mdm2 y/o un dominio
de ubiquitilación, y carecen de la totalidad o parte del dominio
responsable de la unión al ADN de dicha proteína p53, el cual ha
sido reemplazado, total o parcialmente, por un péptido etiqueta;
por tanto, dichas proteínas de fusión carecen de la actividad de
transcripción de las proteínas p53. De aplicación en el cribado de
compuestos que inhiben la degradación de la proteína p53 vía Mdm2
y/o vía proteasoma.
Description
Proteínas de fusión de p53 sin actividad de
transcripción y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a una proteína
de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína
p53 nativa en la que el dominio responsable de la unión al ADN de
dicha proteína p53 ha sido reemplazado, prácticamente en su
totalidad, por un péptido etiqueta y, por tanto, carece de la
actividad de transcripción de dicha proteína p53 nativa, y donde
dicha proteína de fusión comprende un dominio de unión a Mdm2 y/o
un dominio de ubiquitilación.
La proteína p53 es una proteína que está
presente en células eucariotas y desempeña una función fundamental
en los mecanismos de respuesta celular frente al daño o mutación en
el genoma, hecho por el que a principios de la década de los 90
recibió el sobrenombre de "guardián del genoma".
En general, se distinguen 3 dominios en una
proteína p53, concretamente, un dominio
amino-terminal, un dominio (central) de unión al ADN
y un dominio carboxilo-terminal. A modo
ilustrativo, la proteína p53 humana nativa, estructuralmente, está
fonnada por 393 aminoácidos, los cuales pueden agruparse en tres
dominios, tal como se muestra en la Figura 1 [Arrowsmith C.H.
Structure and function in the p53 family. Cell Death Differ. 1999
Dec; 6(12):1169-73. Review].
Comprende desde el aminoácido 1 hasta el
aminoácido 112. Los primeros 54 residuos (1-54)
constituyen el dominio de activación y poseen actividad
transactivadora. Este dominio interacciona con la ARN polimerasa y
aumenta la transcripción. Entre las proteínas que se unen a p53 en
este dominio se encuentran la proteína E1b de adenovirus, la ligasa
de ubiquitina Mdm2 (aminoácidos 17-29) y la proteína
X del virus de la hepatitis B. En la región
amino-terminal también se encuentra una región rica
en prolina (aminoácidos 63-97) que presenta una
elevada similaridad con las proteínas que unen SH3, que es
necesaria para la apoptosis y que interacciona con proteínas
celulares tales como
c-abl. La región que comprende los aminoácidos 92-112 ha sido implicada en la degradación de p53 vía el proteasoma. La proteína Mdm2 inactiva a p53 de forma que promueve su degradación. Un péptido sintético con una secuencia de aminoácidos que corresponde a dicha secuencia de degradación de p53 suprime la degradación de p53 mediada por Mdm2. La inhibición de la degradación de p53 mediada por Mdm2 resulta en un incremento en los niveles de la proteína p53 en la célula y restablece o aumenta su función supresora tumoral.
c-abl. La región que comprende los aminoácidos 92-112 ha sido implicada en la degradación de p53 vía el proteasoma. La proteína Mdm2 inactiva a p53 de forma que promueve su degradación. Un péptido sintético con una secuencia de aminoácidos que corresponde a dicha secuencia de degradación de p53 suprime la degradación de p53 mediada por Mdm2. La inhibición de la degradación de p53 mediada por Mdm2 resulta en un incremento en los niveles de la proteína p53 en la célula y restablece o aumenta su función supresora tumoral.
Comprende del aminoácido 113 hasta el aminoácido
290. La región central es resistente a la acción de enzimas
proteolíticas y, además, interacciona con el antígeno mayor del
virus SV40. En este dominio se localizan cuatro regiones altamente
conservadas entre diferentes especies y sirve de reconocimiento y de
unión al ADN. Los residuos 248 y 273 (ambos Arg) son los que se
unen directamente al ADN y, además, son los que sufren mayor número
de mutaciones en muestras tumorales. Esta región posee el principal
dominio de interacción con la ligasa de ubiquitina
E6/E6-AP.
Comprende desde el aminoácido 291 hasta el
aminoácido 393. La región carboxilo-terminal
incluye una región de enlace y un dominio de oligomerización
(aminoácidos 319-363). En esta zona se localizan 3
tipos de funciones: la secuencia de localización nuclear (NLS) que
es bipartita (aminoácidos 305-306 y
319-321), el dominio de oligomerización
(aminoácidos 319-363) y una diana de fosforilación
para la CDK (kinasa dependiente de ciclina). Este dominio también
contiene la secuencia de exportación nuclear (NES) (aminoácidos
339-352). Los mutantes en NES muestran una proteína
p53 de localización exclusivamente citoplasmática. Este dominio
también interviene en la promoción de la apoptosis, en la
regulación de la transcripción y en el reconocimiento del daño de
la doble cadena de ADN.
En condiciones normales, la vida media de p53,
en general, es muy corta y, consecuentemente, los niveles de p53 en
la célula son bajos. Sin embargo, en respuesta a daño en el ADN
celular o a estrés celular, los niveles de p53 aumentan. Este
aumento en los niveles de p53 lleva a la activación de la
transcripción de un número de genes que conducen a la célula bien
hacia una parada del ciclo celular o bien a la muerte por apoptosis
celular si a la célula le resulta imposible subsanar el daño en el
genoma. Por tanto, una función importante de p53 consiste en
prevenir la proliferación incontrolada de las células dañadas y
proteger al organismo del desarrollo de tumores evitando que las
células hijas hereden alteraciones genómicas.
Una anormalidad (e.g., deleciones o mutaciones
en el gen que codifica para la proteína p53) se correlaciona con el
desarrollo de algunos tipos de cáncer y tumores malignos incluyendo
tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de hueso, cáncer de
pulmón, etc. Asimismo, se han descrito aumentos en su forma nativa
en patologías donde los procesos apoptóticos se encuentran
incrementados. La pérdida de la función p53 puede producirse por la
inactivación de esta proteína debido a mutaciones que modifiquen su
capacidad de unión al ADN, por la pérdida de la capacidad de
regulación de proteínas que controlan los niveles de p53, o por su
actividad y exclusión nuclear que interfiere con su papel como
factor de transcripción.
Los niveles proteicos de p53 registran un
aumento rápido en respuesta a estímulos tales como el daño directo
en el ADN, la depleción de nucleótidos, la hipoxia, el shock de
calor, la exposición a monóxido de nitrógeno, la radiación gamma
(\gamma) y ultravioleta y la presencia de dímeros de ciclobutano
piridina. En situaciones de estrés hay un incremento en la unión de
p53 al ADN, y aumenta su actividad biológica. La actividad de p53
es regulada por medio de múltiples modificaciones
post-traduccionales dentro de las que se encuentran
fosforilaciones, acetilaciones, ubiquitilaciones, neddilaciones y
sumoilaciones, que no sólo aumentan su vida media, sino que también
regulan su actividad como factor de transcripción.
La regulación de p53 está basada en su recambio
o "turn-over" estricto efectuado por la ligasa
de ubiquitina Mdm2. El gen de Mdm2 codifica para una fosfoproteína
(Mdm2) de 90 kDa que tiene actividad E3 ubiquitina proteína ligasa y
es capaz de interaccionar con el extremo
amino-terminal de p53 y, de esta manera, contribuye
a la translocación de p53 desde el núcleo hacia el citoplasma donde
se degradará. Esta vía adquiere importancia debido a que p53 es
capaz de unirse y regular de forma positiva la transcripción del
gen de Mdm2. Así, aumentos en los niveles de proteína p53 resultan
en incrementos de Mdm2 que conducen a la proteólisis de p53. Mdm2
contribuye a mantener los bajos niveles de p53 en células que no se
someten a estrés. En determinadas situaciones, la transcripción de
Mdm2 se induce más tarde que otros genes diana de p53, lo que
favorece la existencia de un intervalo de tiempo que permite a p53
ejercer su actividad antes de su degradación. El tráfico
núcleo-citoplásmico de p53 es esencial para su
degradación dependiente de Mdm2 y depende de las secuencias de
exportación nuclear (NES) que se encuentran en las regiones amino y
carboxilo-terminal de dicha proteína y de la
secuencia de localización nuclear (NLS).
Corriente abajo (downstream) del sitio requerido
para la unión con Mdm2, la región amino-terminal de
p53 también contiene una señal de susceptibilidad proteolítica que
ha sido implicada en la degradación dependiente del proteasoma. La
vía mayoritaria de degradación de p53 es la ruta de la
ubiquitina-26S proteasoma, si bien también se ha
descrito que p53 puede hidrolizarse por miembros de la familia de
las cisteín-proteasas, como las calpaínas. Aunque
el sistema proteasomal se presenta tanto en el citoplasma como en
el núcleo, la degradación de p53 tiene lugar principalmente en el
citoplasma, por lo que se necesita un retorno de p53 desde el
núcleo a este compartimento.
La pérdida de actividad de p53 predispone a las
células a exponerse a adquirir mutaciones oncogénicas. La proteína
p53 es responsable del mantenimiento de una proliferación y
crecimiento celular ordenado así como de una diferenciación de
células normales. Una mutación en este gen puede ser uno de los
cambios genéticos más significativos que lleven a la transformación
de las células normales en malignas.
Debido a la importancia de p53 en la protección
del genoma, este factor vital ha sido considerado como una diana de
alto interés para el desarrollo de tratamientos contra el cáncer.
La patente norteamericana US 6.831.155 describe el desarrollo de
péptidos inhibidores de la degradación de p53 que tienen como origen
p53. Dichas moléculas actúan por competición e interfieren en la
degradación de p53 vía Mdm2. También se han documentado pequeñas
moléculas no genotóxicas antagonistas de Mdm2 que son capaces de
fijarse al sitio de unión de p53 e interferir con la unión del
supresor tumoral con Mdm2. La administración de dichos péptidos,
llamados nutlinas, suprime el crecimiento tumoral, in vitro
e in vivo. La apoptosis inducida por las nutlinas es
dependiente de p53, afecta únicamente a células cancerígenas y no
tiene efecto sobre células que proliferan normalmente. Su potente
acción sobre células de osteosarcoma sugiere que dichos péptidos
pueden ser utilizados en el tratamiento de tumores que expresen p53
nativa [Vassilev LT., (2004). Small-molecule
antagonists of p53-Mdm2 binding: research tools and
potencial therapeutics. Cell Cycle 3, 419-421].
La mayor parte de los métodos utilizados para la
identificación de compuestos con efecto positivo en la actividad
supresora tumoral de p53 se basan en la inducción y comprobación de
la muerte celular programada generada como consecuencia de un
aumento en su estabilidad. Recientemente, las estrategias utilizadas
consideran el desarrollo de pequeños péptidos que se unan a los
sustratos o a las ligasas, de manera que puedan interferir con la
interacción y, consecuentemente, con el catabolismo del sustrato.
Existe, por tanto, una necesidad de encontrar métodos rápidos y
eficaces de cribado de compuestos que inhiban específicamente la
degradación de p53 dependiente de Mdm2 o, en general, de la vía
ubiquitina-proteasoma.
Los inventores ahora han identificado un nuevo
sistema de cribado de compuestos con actividad inhibidora de la
degradación de p53 basado en el empleo de unas construcciones
génicas que contienen las secuencias nucleotídicas codificantes de
unas proteínas de fusión que comprenden la secuencia de aminoácidos
de una proteína p53 nativa en la que la totalidad o la mayor parte
del dominio responsable de la unión al ADN de dicha proteína p53 ha
sido reemplazado por un péptido etiqueta y, por tanto, dichas
proteínas de fusión carecen de actividad de transcripción y, además,
dichas proteínas de fusión comprenden un dominio de unión a Mdm2
y/o un dominio de ubiquitilación de una proteína p53 nativa. Dichas
construcciones génicas pueden utilizarse para transfectar células
eucariotas que no expresan la proteína p53 nativa de forma que, al
ponerse en contacto dichas células con un compuesto a ensayar,
permitirá seleccionar aquel compuesto que presente capacidad
inhibidora de la degradación de la proteína p53. Este nuevo sistema
elimina la capacidad de transcripción que es inherente a la
proteína p53 lo que conlleva la subsecuente regulación negativa de
la actividad supresora tumoral de p53. Dicha eliminación permitirá
identificar un amplio espectro de compuestos con efecto moderado,
medio o potente sobre la actividad supresora tumoral de p53, que no
sería posible detectar en presencia de su actividad de transcripción
ya que p53 de forma natural termina con sus propias funciones al
inducir la síntesis de moléculas inhibidoras como Mdm2.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona
con una proteína de fusión, basada en una proteína p53, que
comprende un péptido etiqueta, un dominio de unión a Mdm2 y/o un
dominio de ubiquitilación de una proteína p53, y carece de la
totalidad o de una parte del dominio de unión al ADN de dicha
proteína p53, de manera que dicha proteína de fusión carece de la
actividad de transcripción de la proteína p53.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polinucleótido que codifica para dicha proteína de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector que comprende dicho polinucleótido. En una realización
particular, dicho vector contiene, además, la secuencia de
nucleótidos codificante de Mdm2.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula que comprende dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir dicha proteína de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método ex vivo para el cribado de compuestos que inhiben
la degradación de la proteína p53 vía Mdm2 y/o vía proteasoma que
comprende transfectar una célula con dicho vector y, en su caso, con
un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
para Mdm2, poner en contacto dicha célula con un compuesto a
ensayar y ensayar la capacidad de dicho compuesto de inhibir la
degradación de la proteína p53.
La Figura 1 es un gráfico que muestra un esquema
de las diferentes regiones de la proteína p53 humana nativa. En
dicho esquema están representadas las diferentes señales, sitios de
modificación y de interacción con factores celulares que intervienen
en la regulación de p53 humana.
La Figura 2 es un gráfico que muestra
esquemáticamente diferentes proteínas de fusión proporcionadas por
esta invención. En dicha figura se muestra, además, la detección de
las diferentes proteínas de fusión por Western blot mediante el
empleo de distintos anticuerpos específicos
(anti-Sv5, anti-p53 y
anti-EGFP). La secuencia de aminoácidos que
contiene cada proteína de fusión se encuentra indicada en los
esquemas correspondientes. El círculo situado en el extremo
carboxilo-terminal representa el epítopo Sv5 (véase
el Ejemplo 1).
La Figura 3 muestra el resultado de la
degradación, mediada por Mdm2, de proteínas de fusión
proporcionadas por esta invención. La Figura 3A muestra el
resultado, mediante un análisis Western-blot, de la
transfección de células H1299 (células que no expresan p53) con 100
ng del plásmido pcDNA3-p53 (que expresa la p53
humana nativa) y con cantidades crecientes (0; 0,25; 0,5 y 1
microgramo) del plásmido pcDNA3-Mdm2 (que expresa
Mdm2 nativa). Se observa la degradación del supresor tumoral (p53)
en forma dependiente de la dosis. La Figura 3B muestra los
resultados obtenidos al transfectar células H1299 con 100 ng de cada
plásmido conteniendo las construcciones génicas
EGFP-1,
p53-EGFP-2,
p53-EGFP-3,
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-5,
p53-EGFP-6,
p53-EGFP-7,
p53-EGFP-8,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11 (Tabla 1, Ejemplo
2), en presencia o en ausencia del vector
pcDNA3-Mdm2. Como control de transfección se utilizó
el vector que genera la \beta-galactosidasa. Las
diferentes proteínas [p53 WT y las proteínas de fusión
EGFP-1, p53-EGFP-2,
p53-EGFP-3,
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-5,
p53-EGFP-6,
p53-EGFP-7,
p53-EGFP-8,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11 (Tabla 1, Ejemplo 2)]
fueron detectadas por Western blot utilizando anticuerpos
específicos anti-Sv5, anti-p53,
anti-Mdm2 y
anti-\beta-galactosidasa.
La Figura 4 pone de manifiesto que la
degradación de las proteínas de fusión proporcionadas por esta
invención es dependiente del proteasoma. Células H1299 fueron
transfectadas con plásmidos que codificaban para la proteína p53
humana nativa (p53 WT) o para las proteínas de fusión
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11 (Tabla 1, Ejemplo 3),
identificadas en esta figura como GFP-p53(4),
GFP-p53(9),
GFP-p53(10) y
GFP-p53(11), respectivamente, en presencia o
en ausencia del vector pcDNA3-Mdm2. 8 horas después
de la transfección las células fueron tratadas o no con MG132, un
inhibidor del proteasoma, 10 nM, durante 8 horas.
La Figura 5 es un histograma que muestra la
evaluación de la actividad de transcripción de la proteína de
fusión p53-EGFP-11 (Tabla 1, Ejemplo
3), identificada en esta figura como
GFP-p53(11), comparada con la de la proteína
p53 humana nativa. Como controles se utilizaron el vector pcDNA3
vacío y la proteína verde fluorescente (EGFP).
En un aspecto, la invención se relaciona con una
proteína de fusión, en adelante proteína de fusión de la invención,
basada en una proteína p53, que comprende un dominio de unión a
Mdm2 y/o un dominio de ubiquitilación de dicha proteína p53 pero
que carece de la totalidad o de una parte del dominio de unión al
ADN de dicha p53, el cual ha sido reemplazado y sustituido por un
péptido etiqueta, de manera que dicha proteína de fusión de la
invención carece de la actividad de transcripción propia de la
proteína p53 nativa.
De forma más concreta, la proteína de fusión de
la invención puede ser representada por la fórmula (I) ó (II),
(I);
o(M)_{n}-T-(U)_{p}
(II){}\hskip0,3cm(U)_{p}-T-(M)_{n}
donde,
M es un péptido que comprende un dominio de
unión a Mdm2;
T es un péptido etiqueta;
U es un péptido que comprende un dominio de
ubiquitilación;
n es un número entero igual a 0 ó 1; y
p es un número entero igual a 0 ó 1,
con la condición de que la suma de n y p es
mayor o igual a 1 (n + p \geq 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Un experto en la materia entenderá que, por
ejemplo, el péptido que comprende el dominio de unión a Mdm2 (M) de
la proteína de fusión de la invención puede estar unido por su
extremo carboxilo-terminal al extremo
amino-terminal del péptido etiqueta (T) [proteína de
fusión de la invención de fórmula (I)] o, alternativamente, el
péptido que comprende el dominio de unión a Mdm2 (M) de la proteína
de fusión de la invención puede estar unido por su extremo
amino-terminal al extremo
carboxilo-terminal del péptido etiqueta (T)
[proteína de fusión de la invención de fórmula (II)]. De igual
modo, el péptido que comprende el dominio de ubiquitilación (U) de
la proteína de fusión de la invención puede estar unido por su
extremo amino-terminal al extremo
carboxilo-terminal del péptido etiqueta (T)
[proteína de fusión de la invención de fórmula (I)], o,
alternativamente, el péptido que comprende el dominio de
ubiquitilación (U) de la proteína de fusión de la invención puede
estar unido por su extremo carboxilo-terminal al
extremo amino-terminal del péptido etiqueta (T)
[proteína de fusión de la invención de fórmula (II)].
Uno de los componentes de la proteína de fusión
de la invención es un péptido etiqueta. Virtualmente cualquier
péptido etiqueta puede ser utilizado para la puesta en práctica de
la presente invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho
péptido etiqueta comprende una etiqueta o cola (tag) de
(poli)histidinas (His-tags) (e.g., H_{6},
H_{10}, etc.), una etiqueta o cola (tag) de
(poli)argininas (Arg-tags),
FLAG-tag, una etiqueta para su uso con sistemas
IMAC (del inglés, Immobilized Metal Affinity Chromatography), e.g.,
columnas de afinidad Ni^{+2}, etc., estreptavidina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de unión
a maltosa (MBP), la secuencia diana de biotinilización BSP de la
enzima bacteriana Bira, un epítopo susceptible de ser reconocido
por un anticuerpo (e.g., c-myc, etc.), una proteína
fluorescente (e.g., la proteína verde fluorescente o EGFP, etc.),
una enzima (e.g., \beta-galactosidasa, etc.). En
una realización particular, el péptido etiqueta se selecciona entre
EGFP y \beta-galactosidasa. Como será apreciado
por un experto en la materia, dicho péptido etiqueta puede ser
utilizado para la purificación, escrutinio, selección y/o
visualización, de la proteína de fusión de la invención.
La proteína de fusión de la invención, basada en
una proteína p53, comprende un dominio de unión a Mdm2 y/o un
dominio de ubiquitilación de una proteína p53 pero carece de la
totalidad o de una parte del dominio de unión al ADN de dicha
proteína p53 el cual ha sido reemplazado y sustituido por un
péptido etiqueta, de manera que la proteína de fusión de la
invención carece de la actividad de transcripción de dicha p53.
La proteína p53 es una proteína que se encuentra
en células eucariotas, por lo que el origen de la p53 en la que se
basa la proteína de fusión de la invención puede ser muy variado.
En una realización particular, dicha p53 es una proteína de
mamífero, tal como la proteína p53 humana, cuya secuencia de
aminoácidos completa se muestra en la SEQ ID NO: 56, mientras que
en otra realización particular el origen de dicha p53 es equino,
porcino, murino, bovino, ovino, primate no humano, etc. Aunque la
invención se ilustrará en relación con la p53 humana, lo mencionado
en esta descripción es igualmente aplicable a otras proteínas p53
de distinto origen, independientemente de que el dominio de unión
al ADN, así como los dominios de unión a Mdm2 y/o ubiquitilación se
encuentren en localizaciones distintas a las de los correspondientes
dominios en la proteína p53 humana y de que la secuencia de
aminoácidos de dichos dominios sean diferentes; dichos dominios
pueden ser identificados fácilmente en la secuencia de aminoácidos
de la proteína p53 nativa de cualquier especie animal mediante el
empleo de técnicas bien conocidas en el estado de la técnica,
incluyendo, entre otras, el alineamiento múltiple de secuencias de
aminoácidos que permite identificar secuencias de aminoácidos
posicionalmente equivalentes en distintas proteínas.
\newpage
En una realización particular, la proteína de
fusión de la invención está basada en la proteína p53 humana, pero
carece de la totalidad o de una parte del dominio de unión al ADN
de dicha proteína p53, de manera que la proteína de fusión de la
invención carece de la actividad de transcripción de dicha p53,
comprendiendo dicha proteína de fusión un dominio de unión a Mdm2
y/o un dominio de ubiquitilación de dicha p53. Tal como se muestra
en la Figura 1, el dominio de unión al ADN de la p53 humana se
localiza entre los aminoácidos 113-290. La secuencia
de aminoácidos de la p53 humana completa se muestra en la SEQ ID
NO: 56. Por tanto, en una realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad o de parte de la secuencia de aminoácidos comprendida
entre el aminoácido 113 y el aminoácido 290 de la proteína p53
humana nativa (cuya secuencia de aminoácidos completa se muestra en
la SEQ ID NO: 56).
En una realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 113 y el aminoácido 290 de la proteína p53 humana
nativa.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 33 y el aminoácido 360 de la proteína p53 humana
nativa.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 49 y el aminoácido 360 de la proteína p53 humana
nativa.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 84 y el aminoácido 360 de la proteína p53 humana
nativa.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
mayor parte de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 113 y el aminoácido 290 de la proteína p53 humana
nativa, por ejemplo de la secuencia aminoacídica comprendida entre
los aminoácidos 119 y 290 de dicha p53 humana nativa, de manera que
la proteína de fusión de la invención resultante carece de la
actividad de transcripción de dicha p53.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
totalidad de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 119 y el aminoácido 360 de la proteína p53 humana
nativa.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención se basa en una p53 humana que carece de la
mayor parte de la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 113 y el aminoácido 290 de la proteína p53 humana
nativa, y carece, además, de un fragmento de la secuencia de
aminoácidos adyacente al aminoácido 290, que comienza a partir del
aminoácido 291, de dicha proteína p53 humana nativa. Así, en una
realización concreta, la proteína de fusión de la invención se basa
en una p53 humana que carece de la secuencia de aminoácidos
comprendida entre el aminoácido 119 y el aminoácido 301 de la
proteína p53 humana nativa, o entre el aminoácido 119 y el
aminoácido 316 de la proteína p53 humana nativa, o entre el
aminoácido 119 y el aminoácido 323 de la proteína p53 humana nativa,
o entre el aminoácido 119 y el aminoácido 360 de la proteína p53
humana nativa, de manera que la proteína de fusión de la invención
resultante carece de la actividad de transcripción de dicha
p53.
El experto en la materia entenderá que la
proteína de fusión de la invención puede contener cualquier
fragmento de la secuencia de aminoácidos de dicha p53 que carezca
de la totalidad o de una parte del dominio de unión al ADN, siempre
y cuando la proteína de fusión resultante carezca de la actividad
de transcripción de dicha p53. La actividad de transcripción de
dicha proteína de fusión puede ser ensayada mediante métodos
convencionales, conocidos por los expertos en la materia, tales como
el contenido en el Ejemplo 2 que acompaña a esta descripción.
La proteína de fusión de la invención, basada en
una proteína p53, comprende un dominio de unión a Mdm2 y/o un
dominio de ubiquitilación de dicha p53.
En una realización particular, la proteína de
fusión de la invención comprende un péptido que comprende un
dominio de unión a Mdm2 de una p53. Tal como aquí se utiliza, la
expresión "dominio de unión a Mdm2" se refiere a una secuencia
de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos
responsable de la unión a Mdm2 de una proteína p53.
Como es conocido, Mdm2 es un regulador clave de
la función de la proteína p53. Mdm2 se une al dominio de
transactivación amino-terminal de p53 inhibiendo su
actividad; de esta forma, Mdm2 inhibe la capacidad de p53 de activar
la transcripción. En condiciones normales, este mecanismo de
regulación es responsable de mantener bajos niveles de p53; sin
embargo, en tumores con p53 salvaje, es decir, sin alteraciones, el
equilibrio en la concentración de p53 activa puede incrementarse
obstaculizando la interacción Mdm2-p53.
\newpage
En una realización particular, el péptido que
comprende un dominio de unión a Mdm2 (M) presente en la proteína de
fusión de la invención se selecciona entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención comprende un péptido que comprende un
dominio de ubiquitilación. Tal como aquí se utiliza, la expresión
"dominio de ubiquitilación" se refiere a una secuencia de
aminoácidos del extremo carboxilo-terminal de una
proteína p53 nativa que comprende unos aminoácidos, generalmente
lisinas, a los que se unen moléculas de ubiquitina mediante un
enlace covalente del tipo tio-éster. En una realización particular,
dicho extremo carboxilo-terminal contiene las seis
lisinas de la proteína p53 nativa implicadas en su degradación y,
además, contiene el sitio de interacción con la proteasa de
ubiquitina HAUSP.
Como es conocido, los niveles de p53 dependen
principalmente de la velocidad de degradación más que de la
velocidad a la que se genera nueva proteína p53. Esta degradación
se regula mediante mecanismos post-traduccionales,
mediante los cuales p53, que en situaciones banales se degrada
rápidamente, se estabiliza incrementándose su vida media. La
degradación de p53 es dependiente de la vía ubiquitina/proteasoma,
sistema que "marca" la proteína con varias copias de un pequeño
péptido (ubiquitina), que es ahora identificada por la maquinaria
de degradación "proteasoma". Mdm2 actúa como la ligasa E3 de
la ubiquitina, una de las enzimas involucradas en el marcaje de la
proteína p53. Mdm2 interacciona con el extremo de p53 que contiene
el dominio de transactivación. La inducción de p53 activa la
transcripción del promotor de Mdm2 y cuando se genera la proteína
Mdm2 ésta se une a p53 y la marca.
En una realización particular, el péptido que
comprende un dominio de ubiquitilación (U) presente en la proteína
de fusión de la invención se selecciona entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como aquí se utiliza, la expresión
"variante funcionalmente equivalente de una secuencia de
aminoácidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos que (i) es
sustancialmente homóloga a dicha secuencia de aminoácidos y (ii)
ejerce la misma función (e.g., en un caso, unión a Mdm2, y, en otro
caso, ubiquitilación). Una secuencia de aminoácidos es
sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos determinada
cuando presenta un grado de identidad de, al menos, un 70%,
ventajosamente de, al menos, un 75%, típicamente de, al menos, un
80%, preferentemente de, al menos, un 85%, más preferentemente de,
al menos, un 90%, aún más preferentemente de, al menos, un 95%,
97%, 98% ó 99%, respecto a dicha secuencia de aminoácidos
determinada. El grado de identidad entre dos secuencias de
aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por
ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias
conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST
[Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J
Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10].
Asimismo, el experto en la materia entenderá que las secuencias de
aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden
estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones
químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como,
fosforilaciones, acetilaciones, etc.
La capacidad de unión de la proteína de fusión
de la invención a Mdm2 y/o de ubiquitilación puede ser determinada
mediante el empleo de métodos convencionales conocidos por los
técnicos en la materia, por ejemplo, midiendo algún efecto asociado
con la unión de la proteína de fusión de la invención a Mdm2 y/o a
la modificación con ubiquitina. Existen distintos métodos
pertenecientes al estado de la técnica, tales como ensayos de unión
proteína-proteína, que permiten determinar la
capacidad de unión de la proteína de fusión de la invención a Mdm2
y/o la modificación con la ubiquitina. A modo simplemente
ilustrativo, los procedimientos mostrados en el Ejemplo 2 describen
algunos métodos que permiten determinar la capacidad de unión de las
proteínas de fusión de la invención a Mdm2 y/o la modificación con
la ubiquitina.
En una realización particular, la invención se
relaciona con una proteína de fusión de la invención de la fórmula
(I) antes mostrada, en la que "n" es 1, es decir, en la que el
extremo carboxilo del péptido que comprende el dominio de unión a
Mdm2 (M) está unido al extremo amino del péptido etiqueta (T), y
"p" es 0 ó 1.
En otra realización particular, la invención se
relaciona con una proteína de fusión de la invención de la fórmula
(I) antes mostrada, en la que "p" es 1, es decir, en la que el
extremo amino del péptido que comprende el dominio de ubiquitilación
(U) está unido al extremo carboxilo del péptido etiqueta (T), y
"n" es 0 ó 1.
En una realización particular y preferida, la
invención se relaciona con una proteína de fusión de la invención
de la fórmula (I) antes mostrada, en la que "n" es 1 y
"p" es 1, es decir, en la que el extremo carboxilo del péptido
que comprende el dominio de unión a Mdm2 (M) está unido al extremo
amino del péptido etiqueta (T), y el extremo amino del péptido que
comprende el dominio de ubiquitilación (U) está unido al extremo
carboxilo del péptido eti-
queta (T).
queta (T).
En otra realización particular, la invención se
relaciona con una proteína de fusión de la invención de la fórmula
(II) antes mostrada, en la que "n" es 1, es decir, en la que
el extremo amino del péptido que comprende el dominio de unión a
Mdm2 (M) está unido al extremo carboxilo del péptido etiqueta (T),
y "p" es 0 ó 1.
En otra realización particular, la invención se
relaciona con una proteína de fusión de la invención de la fórmula
(II) antes mostrada, en la que "p" es 1, es decir, en la que
el extremo carboxilo del péptido que comprende el dominio de
ubiquitilación (U) está unido al extremo amino del péptido etiqueta
(T), y "n" es 0 ó 1.
En otra realización particular y preferida, la
invención se relaciona con una proteína de fusión de la invención
de la fórmula (II) antes mostrada, en la que "n" es 1 y
"p" es 1, es decir, en la que el extremo carboxilo del péptido
que comprende el dominio de ubiquitilación (U) está unido al
extremo amino del péptido etiqueta (T), y el extremo amino del
péptido que comprende el dominio de unión a Mdm2 (M) está unido al
extremo carboxilo del péptido etiqueta (T).
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
proteínas de fusión de la invención incluyen las proteínas de
fusión cuyas secuencias aminoacídicas son las identificadas como
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16,
SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID
NO: 21, SEQ ID NO: 22, y sus variantes funcionalmente equivalentes.
Dichas proteínas de fusión incorporan en su extremo carboxilo
terminal el epítopo Sv5 (Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly
Leu Asp Ser y Thr) como consecuencia de su método de obtención; no
obstante, si se desea, dicho epítopo Sv5 puede ser retirado
fácilmente por métodos convencionales conocidos por los expertos en
la materia. La inclusión de dicho epítopo, o de cualquier otro
epítopo apropiado en el extremo carboxilo de la proteína de fusión
de la invención permite verificar que la proteína de fusión de la
invención ha sido generada completamente, por lo que puede ser
recomendable mantenerlo.
El péptido etiqueta de las proteínas de fusión
de la invención cuyas secuencias aminoacídicas son las
identificadas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, es la proteína verde fluorescente (EGFP),
mientras que el péptido etiqueta de las proteínas de fusión de la
invención cuyas secuencias aminoacídicas son las identificadas como
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21
y SEQ ID NO: 22, es la \beta-galactosidasa.
Las proteínas de fusión de la invención cuyas
secuencias aminoacídicas son las identificadas como SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17
comprende la región carboxilo-terminal de la
proteína p53 humana nativa que contiene las seis lisinas (Lys) de
la p53 humana nativa implicadas en su degradación y, además,
contiene el sitio de interacción con la proteasa de ubiquitina
HAUSP. De ellas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Por otra parte, se ha descrito que la región
amino-terminal de la p53 es crítica para la unión a
Mdm2 y en la degradación de p53 vía Mdm2, por lo que modificaciones
en dicha región pueden causar cambios significativos en la actividad
de la p53 nativa en su función supresora. En una realización
particular, la proteína de fusión de la invención comprende la
secuencia de aminoácidos responsable de la unión a Mdm2 y de la
degradación de p53 vía Mdm2 del dominio
amino-terminal de una proteína p53 nativa. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de dichas proteínas de fusión de la
invención incluyen las proteínas de fusión cuyas secuencias de
aminoácidos son las identificadas como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. De ellas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polinucleótido, en adelante polinucleótido de la invención, que
codifica para una proteína de fusión de la invención.
El polinucleótido de la invención puede
obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el
estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning,
a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. Ejemplos ilustrativos,
no limitativos, de polinucleótidos de la invención incluyen los
polinucleótidos cuyas secuencias nucleotídicas son las identificadas
como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID
NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID
NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. Dichos polinucleótidos de la
invención incorporan la secuencia de nucleótidos que codifica para
el epítopo Sv5 en el extremo carboxilo terminal de la proteína de
fusión de la invención.
El polinucleótido de la invención puede
incorporar, operativamente unido, una secuencia reguladora de la
expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican para la
proteína de fusión de la invención, constituyendo de este modo un
cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la
expresión "operativamente unida" significa que la proteína de
fusión codificada por dicho polinucleótido, es expresada en el
marco de lectura conecto bajo el control de las secuencias de
control o reguladoras de expresión.
El polinucleótido proporcionado por esta
invención, puede ser insertado en un vector apropiado. Por tanto,
en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como
un vector de expresión, que comprende dicho polinucleótido de la
invención. La elección del vector dependerá de la célula
hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. El término
vector de expresión se refiere a una construcción de ADN
replicativo utilizado para expresar ADN que codifica la proteína de
fusión de la invención y que incluye una unidad transcripcional que
comprende un ensamblaje de (a) elemento(s)
genético(s) que tiene(n) un papel regulatorio en la
expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores o
potenciadotes ("enhancers"), operativamente unidos a (b) una
secuencia de ADN que codifica para la proteína de fusión de la
invención que es transcrita a ARN mensajero y traducida a proteína
y (c) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la
transcripción y traducción. La elección del promotor y
otro(s) elemento(s) regulatorio(s)
generalmente varía en función de la célula hospedadora utilizada. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicho polinucleótido de la invención puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar células animales. Un vector de expresión preferido de la invención es un vector de expresión derivado de pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender. elementos no transcribibles como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unido al gen a ser expresado y otras secuencias flanqueantes 5' ó 3' no transcribibles y secuencias 5' ó 3' no traducibles, como los necesarios sitios de unión de ribosoma, sitios de poliadenilación, sitios aceptores y donantes de "splicing" y secuencias de terminación transcripcional. Los promotores y potenciadotes comúnmente utilizados, son derivados de polioma, adenovirus-2, virus de simio 40 (SV-40) y citomegalovirus humano (CMV), entre otros.
generalmente varía en función de la célula hospedadora utilizada. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicho polinucleótido de la invención puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar células animales. Un vector de expresión preferido de la invención es un vector de expresión derivado de pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender. elementos no transcribibles como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unido al gen a ser expresado y otras secuencias flanqueantes 5' ó 3' no transcribibles y secuencias 5' ó 3' no traducibles, como los necesarios sitios de unión de ribosoma, sitios de poliadenilación, sitios aceptores y donantes de "splicing" y secuencias de terminación transcripcional. Los promotores y potenciadotes comúnmente utilizados, son derivados de polioma, adenovirus-2, virus de simio 40 (SV-40) y citomegalovirus humano (CMV), entre otros.
Ventajosamente, dicho vector comprende, además,
un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo
que permita la selección de la célula hospedadora transformada,
transfectada o infectada con dicho vector. Ejemplos ilustrativos,
no limitativos, de dichos marcadores que podrian estar presentes en
el vector de la invención incluyen genes de resistencia a
antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en
general, todos aquellos que permitan seleccionar a las células
transformadas genéticamente.
En una realización particular, el vector de la
invención contiene, además, la secuencia de nucleótidos que
codifica para Mdm2 operativamente unida a una secuencia reguladora
de su expresión. En este caso, dicho vector es un vector que
codifica para ambas proteínas, es decir, la proteína de fusión de
la invención y Mdm2; por ese motivo, dicho vector de la invención
es un vector "bivalente" (es decir, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para las dos proteínas) para
distinguirlo del vector de la invención que contiene la secuencia
de nucleótidos que codifica únicamente para la proteína de fusión
de la invención (vector "univalente").
El vector de la invención puede ser utilizado
para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de
ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector.
Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en
otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que
comprende un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha
podido ser transformada, transfectada o infectada con un vector
proporcionado por esta invención. Dicha célula transformada,
transfectada o infectada comprende, por tanto, un polinucleótido de
la invención o un vector proporcionado por esta invención. Células
transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por
métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia
[Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una
realización particular, dicha célula hospedadora es una célula
animal transfectada o infectada con un vector apropiado, siendo
dicha célula animal transfectada o infectada capaz de expresar la
proteína de fusión de la invención, por lo que dichos vectores
pueden utilizarse para la expresión en células animales de la
proteína de fusión de la
invención.
invención.
Células hospedadoras adecuadas incluyen células
procariotas, levaduras y células eucariotas. En una realización
particular, dicha célula se selecciona entre una célula de
mamífero, una célula vegetal, una levadura y una bacteria. Las
células hospedadoras preferidas son células eucariotas. Varios
sistemas de cultivo de células de insecto o de mamíferos pueden ser
empleados para expresar la proteína de fusión de la invención.
Algunos ejemplos de líneas celulares de mamíferos hospedadoras
adecuadas incluyen pero no se limitan a células NS/0, células L,
C127, 3T3, células de ovario de hámster chino (CHO), células
embrionarias humanas de riñón (HEK-293), células de
cáncer de pulmón (H1299), células de osteosarcoma
(Saos-2), células de carcinoma cervical humano
(HeLa) y células embrionarias de riñón de hámster (BHK); así como
células CV-1 (ATCC CCL70) y células
COS-7, ambas derivadas de riñón de mono. En una
realización particular, la célula hospedadora es una célula
eucariota incapaz de expresar el gen que codifica para la proteína
p53 nativa. En una realización concreta, dicha célula es una célula
eucariota knock out para el gen que codifica para la proteína
p53.
Las proteínas de fusión de la invención se
pueden obtener mediante diversos métodos conocidos por el experto
en la materia, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas de ADN
recombinante. De hecho, el polinucleótido o vector de la invención
puede ser utilizado para producir la proteína de fusión de la
invención. Por tanto, a modo ilustrativo, no limitativo, un método
para producir dicha proteína de fusión de la invención comprende
crecer una célula u organismo proporcionado por esta invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicha proteína de fusión.
Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula u
organismo dependerán de la célula u organismo utilizado. Si se
desea, la proteína de fusión de la invención puede ser aislada y,
opcionalmente, purificada, por métodos convencionales.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención de una proteína de
fusión de la invención que comprende el cultivo de una célula
hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la invención que codifica para la proteína de
fusión de la invención bajo condiciones que promuevan la expresión
de la misma. La proteína de fusión de la invención, si se desea, es
aislada y, opcionalmente, purificada, utilizando, por ejemplo, una
matriz de purificación adecuada y, una vez eluída, puede ser
concentrada utilizando un filtro concentrador de proteínas
comercialmente disponible, por ejemplo, Amicon o Millipore
Pellicon, tal como es conocido por los técnicos en la materia.
En el Ejemplo 1 que acompaña la presente descripción se describe un
modo particular, no limitante, de obtención de proteínas de fusión
de la invención mediante la tecnología del ADN recombinante.
Alternativamente, las proteínas de fusión de la
invención se pueden obtener mediante unión covalente o no covalente
de los distintos componentes de la proteína de fusión de la
invención, los cuales, a su vez, pueden haber sido obtenidos por
técnicas de ADN recombinante o por técnicas de síntesis química de
péptidos, por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase
sólida.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método ex vivo, en adelante método de la invención, para el
cribado de compuestos que inhiben la degradación de la proteína p53
vía Mdm2 y/o vía proteasoma que comprende las etapas de:
- a)
- transfectar una célula con un vector "bivalente" de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención y la secuencia de nucleótidos que codifica para Mdm2, o, alternativamente, con un vector "univalente" de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención, y con un segundo vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para Mdm2;
- b)
- poner en contacto dicha célula transfectada con un compuesto a ensayar;
- c)
- ensayar la capacidad de dicho compuesto de inhibir la degradación de la proteína p53; y
- d)
- seleccionar el compuesto que presenta una capacidad inhibidora de la degradación de la proteína p53 ex vivo.
Como puede apreciarse, en una realización
particular, dicha célula es transfectada con un vector
"bivalente" de la invención, es decir, con un vector que
contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
de fusión de la invención, y, además, la secuencia de nucleótidos
que codifica para la proteína Mdm2. En otra una realización
particular, dicha célula es co-transfectada con un
vector "univalente" de la invención, es decir, con un vector
que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la
proteína de fusión de la invención, y, además, con un segundo
vector diferente que contiene la secuencia de nucleótidos que
codifica para la proteína Mdm2.
Tal como se ha mencionado anteriormente, p53
sufre un mecanismo de regulación basado en su recambio o "turn
over" mediado por Mdm2, de forma que Mdm2 controla la
degradación de p53 vía proteasoma, y p53, a su vez, induce la
expresión de Mdm2. Por este motivo, en una realización particular,
la célula es transfectada con un vector "bivalente" capaz de
expresar ambas proteínas (proteína de fusión de la invención y
Mdm2), o, alternativamente, dicha célula es
co-transfectada con dos vectores, uno de ellos
codifica la proteína de fusión de la invención (univalente) y el
otro codifica para Mdm2. De esta forma, al encontrarse ambas
proteínas en prácticamente la misma proporción en la célula
transfectada, el mecanismo de activación y degradación de la
proteína p53 funcionará correctamente en dicha célula.
En una realización particular y preferida de la
invención, la célula a transfectar es una célula que no expresa
p53, tal como, por ejemplo, una célula "knock out" para el gen
que codifica para dicha proteína p53, de manera que, cuando es
transfectada se expresa la proteína de fusión de la invención la
cual, como ya se ha mencionado, está basada en una proteína p53. A
modo ilustrativo, no limitativo, dicha célula es una célula de
cáncer de pulmón (H 1299) o una célula de osteosarcoma
(Saos-2) knock out para el gen que codifica para la
proteína p53.
Tal como se muestra en el Ejemplo 3, un
compuesto a ensayar, tal como un inhibidor conocido del proteasoma
(MG 132), se pone en contacto con dicha célula
co-transfectada con un vector "univalente" de
la invención, que expresa una proteína de fusión de la invención, y
con un vector que expresa Mdm2, y, posteriormente, se mide la
capacidad de dicho compuesto para inhibir la degradación de la
proteína de fusión de la invención (basada en una p53 a la que se
le ha eliminado el dominio de unión al ADN, reemplazándolo por un
péptido etiqueta, y mantiene un dominio de unión a Mdm2 y/o de
ubiquitilación. La medida de la capacidad de dicho compuesto para
inhibir la degradación de la proteína de fusión de la invención
puede realizarse por métodos convencionales conocidos por el
experto en la materia, como por ejemplo mediante extracción de
proteínas y análisis por Western blot.
El método de la invención constituye, por tanto,
un eficiente sistema de cribado de compuestos con actividad
inhibidora de la degradación de p53. Dichos compuestos pueden ser
utilizados con fines terapéuticos, por ejemplo, como agentes
potencialmente antitumorales, etc. Como se muestra en la Figura 5
que acompaña a la presente descripción, la eliminación de la
capacidad de transcripción de la proteína de fusión de la
invención, que es inherente a la proteína p53 nativa, conlleva la
subiguiente regulación negativa de la actividad supresora tumoral
de p53. El método de la invención permite identificar así un amplio
rango de compuestos con efecto moderado, medio o potente sobre la
actividad supresora tumoral de p53, que no sería posible detectar en
presencia de actividad de transcripción de la proteína p53 nativa
ya que dicha proteína, de forma natural, termina con las funciones
de dicha proteína al inducir la síntesis de compuestos inhibidores
tales como Mdm2.
Por otra parte, el método de la invención
permite, cuando se buscan compuestos que inhiben la degradación de
p53, eliminar eficazmente los efectos secundarios asociados a la
regulación de la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la
expresión del principal inhibidor de p53, Mdm2, inducido con el
aumento de la estabilidad de la proteína p53 nativa. Ello permite
evaluar de forma eficaz los compuestos inhibidores de la
degradación de p53 y excluir que el efecto sea debido a una
actuación a otro nivel diferente a la degradación.
Así, si la inhibición de p53 a través de Mdm2 es
dificultada, se producirá un incremento en los niveles funcionales
de p53 lo que incrementará el efecto terapéutico de agentes dañinos
del ADN celular en quimioterapia restaurando la función de p53
nativa lo que lleva a apoptosis y/o revertiendo la resistencia a
dichas drogas asociada a p53. La combinación de esta inhibición de
Mdm2 con el tratamiento con agentes dañinos del ADN celular, podría
llevar a efectos antitumorales sinérgicos. Así, la interrupción de
la interacción Mdm2-p53 es una intervención
terapéutica en tumores con p53 tipo salvaje (WT).
En una realización particular, el método de la
invención puede emplearse, adicionalmente, para la búsqueda de
nuevos compuestos inhibidores de la degradación dependiente del
proteasoma, tal como se muestra en la Figura 4.
Las construcciones génicas conteniendo las
distintas secuencias nucleotídicas que codificaban para distintas
proteínas de fusión compuestas por distintos fragmentos de los
dominios de unión a Mdm2 y/o de ubiquitilación de la proteína p53
humana nativa fusionados bien a la proteína verde fluorescente
(EGFP) o bien a la \beta-galactosidasa
(\beta-gal) fueron generadas por donación estándar
de los fragmentos de ADN, amplificados por PCR, que codificaban
para los distintos fragmentos de los dominios de unión a Mdm2 y/o
de ubiquitilación de la proteína p53 humana nativa, en el vector
pcDNA3-SV5 [Rodríguez M.S., et al. 1995.
Inducible degradation of I\kappaB\alpha in vitro and
in vivo requires the acidic C-terminal domain
of the protein. Molecular and Cellular Biology, 2413–2419 Vol. 15,
No. 5]. Los sitios utilizados en el vector
pcDNA3-SV5 fueron KpnI-KpnI para
donar las secuencias de ADN que codificaban para los fragmentos del
extremo amino-terminal de la p53 humana nativa y
BamHI-EcoRI para donar las secuencias de ADN que
codificaban para los fragmentos del extremo
carboxilo-terminal de p53 humana nativa. Las
secuencias de nucleótidos que codificaban para las proteínas
reporteras EGFP o \beta-galactosidasa, contenidas,
respectivamente, en los plásmidos pEGFP-C1 (número
de acceso GenBank U55763) y pSV\beta (número de acceso GenBank
UO2435), fueron introducidas en fase de lectura correcta utilizando
el sitio BamHI de dicho plásmido pcDNA3-SV5.
Asimismo se hicieron unas construcciones que
contenían las secuencias de nucleótidos que codificaban para las
proteínas reporteras EGFP o \beta-galactosidasa
en el sitio BamHI de dicho plásmido pcDNA3-SV5, que
se utilizaron como controles en algunos ensayos.
Para amplificar los fragmentos del extremo
amino-terminal de la p53 humana nativa se utilizó
como iniciador (primer) el siguiente oligonucleótido universal
sens:
| 5'-CCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3' | (SEQ ID NO: 45). |
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho primer fue utilizado con los siguientes
iniciadores (primers) anti-sens:
- para generar los fragmentos
1-32 de p53 humana:
| 5'-CCGGTACCCAGAACGTTGTTTTCAGGAAG-3' | (SEQ ID NO: 46); |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
1-48 de p53 humana:
| 5'-CCGGTACCGTCCGGGGACAGCATCAAATC-3' | (SEQ ID NO: 47); |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
1-83 de p53 humana:
| 5'-CCGGTACCCGCCGGTGTAGGAGCTGC-3' | (SEQ ID NO: 48); y |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
1-118 de p53 humana:
| 5'-CCGGTACCAGAATGCAAGAAGCCCAGAGC-3' | (SEQ ID NO: 49). |
\vskip1.000000\baselineskip
Para amplificar los fragmentos del extremo
carboxilo-terminal de p53 humana nativa se utilizó
como iniciador (primer) el oligonucleótido
anti-sens universal:
| 5'-CGGAATTCGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG-3' | (SEQ ID NO: 50). |
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho primer fue utilizado con los siguientes
iniciadores (primers):
- para generar los fragmentos
361-393 de p53 humana:
| 5'-GCGGATCCAGGGCTCACTCCAGCCAC-3' | (SEQ ID NO: 51); |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
337-393 de p53 humana:
| 5'-GCGGATCCCGCTTCGAGATGTTCCGAGAG-3' | (SEQ ID NO: 52); |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
324-393 de p53 humana:
| 5'-GCGGATCCGATGGAGAATATTTCACCCTT C-3' | (SEQ ID NO: 53); |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
317-393 de p53 humana:
| 5'-GCGGATCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGG-3' | (SEQ ID NO: 54); y |
\vskip1.000000\baselineskip
- para generar los fragmentos
302-393 de p53 humana:
| 5'-GCGGATCCACTAAGCGAGCACTGCCCAAC-3' | (SEQ ID NO: 55). |
\vskip1.000000\baselineskip
De este modo se obtuvieron las distintas
construcciones génicas que se recogen en la Tabla 1, las cuales
codificaban para las proteínas de fusión de fórmula (I)
[(X)_{n}-T-(Y)_{m}] indicadas en
dicha tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Figura 2 muestra esquemáticamente las
proteínas de fusión p53-EGFP-2,
p53-EGFP-3,
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-5,
p53-EGFP-6,
p53-EGFP-7,
p53-EGFP-8,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11, así como la proteína
EGFP-Sv5. El círculo situado en el extremo
carboxilo terminal de dichas proteínas de fusión representa el
epítopo Sv5. La estructura de las proteínas de fusión
p53-\beta-gal-13,
p53-\beta-gal-14,
p53-\beta-gal-15,
p53-\beta-gal-15,
p53-\beta-gal-16,
p53-\beta-gal-17,
p53-\beta-gal-18,
p53-\beta-gal-19,
p53-\beta-gal-20,
p53-\beta-gal-21 y
p53-\beta-gal-22
es similar a la de las proteínas de fusión
p53-EGFP-2 a
p53-EGFP-11 pero reemplazando el
péptido etiqueta EGFP por \beta-gal.
Para evaluar la actividad de transcripción de
las proteínas de fusión generadas según se ha descrito en el
Ejemplo 1 se emplearon células H1299 y Saos2, las cuales no
expresan la proteína p53 humana, es decir, son células "p53 knock
out". Dichas células H1299 y Saos2 fueron transfectadas con las
distintas construcciones génicas generadas en el Ejemplo 1 y
mencionadas en la Tabla 1 y se midieron las unidades relativas de
luz (RLU), del inglés "Relative Light Units", por microgramo
de proteína. Este sistema ha sido utilizado en otros trabajos de
los mismos inventores [Rodriguez M.S. et al. (1999).
SUMO-1 modification activates the transcriptional
response of p53. EMBO J. 18(22):6455-61;
Rodriguez M.S. et al. (2000). Multiple
C-terminal lysine residues target p53 for
ubiquitin-proteasome-mediated
degradation. Mol.Cell Biol. 22, 8458-67] y consiste
en la utilización de la enzima luciferasa que se encuentra bajo el
control de un promotor artificial con motivos de fijación al ADN de
p53. La actividad de la luciferasa sirve de reportera de la
actividad de transcripción de p53. Las células H 1299 y Saos2
utilizadas, así como las condiciones de cultivo y los métodos de
transfección, medida de la actividad luciferasa e inmunodetección
de proteínas por Western-blot, se llevaron a cabo
según se ha descrito anteriormente [Rodriguez M.S. et al.
(1999) y Rodriguez M.S. et al. (2000), citados
supra].
Como puede observarse en los resultados
mostrados en la Figura 5, relativos a la evaluación de la actividad
de transcripción de la proteína de fusión
p53-EGFP-11 (Tabla 1), identificada
como p53-GFP(11) en dicha Figura 5, a
cantidades iguales de plásmido transfectado (5 ng), las secuencias
aminoacídicas de p53 humana nativa incluidas en dicha proteína de
fusión (aminoácidos 1-118 y 302-393
de p53 humana nativa) no poseen actividad transcripcional en
comparación con la actividad transcripcional de la p53 humana
nativa, identificada como p53 WT en la Figura 5. El vector vacío
(Figura 5), considerado como ruido de fondo, presenta valores
similares a los del control, constituido por la proteína
EGFP-1 (Tabla 1), identificada como Control
GFP(1) en dicha Figura 5. Para cada columna se utilizaron 6
transfecciones independientes y se calcularon la media y la
desviación estándar. Los resultados expresan las RLU/microgramo de
proteína. Estos resultados explican la razón por la que, al no
activar la transcripción, el método de cribado de compuestos
proporcionado por esta invención, es más sensible para identificar
compuestos reguladores de la actividad del supresor tumoral p53.
Como se ha mencionado previamente, dicho método se basa en el
empleo de proteínas de fusión compuestas por la secuencia de
aminoácidos de la proteína p53 en la que el dominio responsable de
la unión al ADN de dicha proteína ha sido reemplazado por un
péptido etiqueta y, por tanto, carece de la actividad de
transcripción de la proteína p53 nativa, y comprendiendo dichas
proteínas de fusión un dominio de unión a Mdm2 y/o un dominio de
ubiquitilación de dicha proteína p53.
Asimismo, tal como se observa en la Figura 3, al
transfectar células H1299 con 100 ng del plásmido
pcDNA3-p53 (vector pcDNA3 (Invitrogen) que contiene
la secuencia de nucleótidos de la proteína p53 humana nativa) y con
cantidades crecientes (0, 0,25, 0,5 y 1 microgramo) del vector
pcDNA3-Mdm2 (vector pcDNA3 que contiene la
secuencia de nucleótidos de Mdm2) [Rodriguez M.S. et al.
(2000). Multiple C-terminal lysine residues target
p53 for
ubiquitin-proteasome-mediated
degradation. Mol.Cell Biol. 22, 8458-67], se
observa la degradación del supresor tumoral (p53) en forma
dependiente de la dosis (Figura 3A).
En la Figura 3B se muestran los resultados de la
transfección de células H1299 con 100 ng de cada uno de los
plásmidos que contenían las distintas construcciones génicas
EGFP-1,
p53-EGFP-2,
p53-EGFP-3,
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-5,
p53-EGFP-6,
p53-EGFP-7,
p53-EGFP-8,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11, en presencia o
en ausencia del vector pcDNA3-Mdm2. Los resultados
ponen de manifiesto que se produce una degradación parcial en
distintas proporciones en las proteínas de fusión
p53-EGFP-3,
p53-EGFP-4,
p53-EGFP-5,
p53-EGFP-6,
p53-EGFP-8,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11 (Tabla 1), siendo la
proteína de fusión p53-EGFP-11
(SEQ ID NO: 11) la que mejor se degrada, a niveles comparables con
la proteína p53 humana nativa.
Para el cribado de compuestos inhibidores de la
degradación de p53 por Mdm2 se puede proceder utilizando bien un
sistema transitorio de expresión de las proteínas de fusión
y Mdm2 o bien un sistema de expresión estable por medio de la
generación de líneas celulares reporteras que expresen de manera
permanente las fusiones de p53 y Mdm2 de forma condicionada
utilizando un vector Tet/ON.
Células H1299 o Saos-2 (células
"p53 knock out") fueron co-transfectadas con
plásmidos que expresaban la proteína de fusión
p53-EGFP-11 (SEQ ID NO: 11) y Mdm2
utilizando lipofectamina según las instrucciones de los fabricantes
(Gibco/Invitrogen). Dichas células fueron crecidas hasta alcanzar
60% de confluencia de un frasco de 75 cm^{2}. 24 horas después de
la transfección, las células fueron despegadas con tripsina y
cultivadas en placas de cultivo de 96 pozos (con paredes negras y
fondo transparente) a razón de 10 x 10^{3} células por pozo. 8
horas después, las células fueron tratadas o no con inhibidores del
proteasoma tales como MG132 (Biomol) y Bortezomid (Millenium
Pharmaceutical). La fluorescencia fue medida utilizando una
longitud de onda de excitación (\lambdaex) de 272 nm y una
longitud de onda de emisión (\lambdaem) de 512 nm, con un filtro
de emisión con corte a 495 nm en un lector de placas SpectraMax M2
(Molecular Devices). Alternativamente, el resultado del experimento
puede ser analizado en un FacsCanto
(Becton-Dickinson) adaptado con un lector de
placas. Para el análisis de las proteínas de fusión en las que el
péptido etiqueta es la \beta-galactosidasa, la
actividad enzimática puede ser medida coloriméticamente por medio
de un lector de placas SpectraMax, utilizando el filtro
correspondiente.
La construcción génica
p53-EGFP-11, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión
p53-EGFP-11 (Tabla 1) fue subclonada
en el plásmido pIRES2 (Clontech), un vector de resistencia a
puromicina. La secuencia de nucleótidos codificante de Mdm2 fue
subclonada en el plásmido pTRE2 (Clontech), un vector de expresión
inducible con tetraciclina. Junto con el vector
pTet-ON (Clontech), las construcciones génicas
fueron expresadas en las líneas celulares H1299 y Saos2 y
seleccionadas con puromicina y G418. La población de células
seleccionadas con dichos antibióticos fue subclonada. Las células
seleccionadas fueron cultivadas en placas de 96 pozos en presencia
de tetraciclina y fueron tratadas o no con inhibidores de
proteasoma [MG132 (Biomol) o Bortezomid (Millenium Pharmaceutical)].
La fluorescencia se midió como se ha indicado en el párrafo
precedente.
Tal como se muestra esquemáticamente en la
Figura 4, se transfectaron células H1299 con distintos plásmidos,
concretamente, con:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en presencia o en ausencia del
vector pcDNA3-Mdm2 que expresa Mdm2. 8 horas
después de la transfección, las células fueron tratadas o no con el
inhibidor de proteasoma MG132 10 nM durante 8 horas. Los resultados
obtenidos ponen de manifiesto que, en presencia de MG132, se
produce una acumulación de formas de alto peso molecular y un
bloqueo de la degradación de la proteína p53 humana nativa y de las
proteínas de fusión ensayadas
(p53-EGFP-4,
p53-EGFP-9,
p53-EGFP-10 y
p53-EGFP-11). Estos resultados
indican que este fenómeno es dependiente de la vía
ubiquitina-proteasoma.
<110> Centro de Investigación Cooperativa
en Biociencias-CIC bioGUNE
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Centro de Investigación Príncipe
Felipe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE p53 SIN
ACTIVIDAD DE TRANSCRIPCIÓN Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200601537
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2006-06-07
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 56
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 275
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión
EGFP-Sv5
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 308
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión
EGFP-p53[361-393]-Sv5
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<211> 340
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión
p53[1-32]-EGFP-p53[361-393]-Sv5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Proteína de fusión
p53[1-48]-EGFP-p53[361-393]-Sv5
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p53[1-118]-EGFP-p53[337-393]-Sv5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-EGFP-p53[317-393]-Sv5
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<211> 485
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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p53[1-118]-EGFP-p53[302-393]-Sv5
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\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Proteína de fusión
p53[1-83]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
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<212> PRT
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-Sv5
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<211> 1205
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-p53[337-393]-Sv5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-p53[324-393]-Sv5
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<211> 1225
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-p53[317-393]-Sv5
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<211> 1240
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión
p53[1-118]-\beta-gal-p53[302-393]-Sv5
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<211> 825
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción
EGFP-Sv5
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<211> 927
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción
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<211> 1020
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción
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<211> 1068
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción
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<211> 1173
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-83]-EGFP-p53[361-393]-Sv5
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<211> 1278
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción
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<211> 1179
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción
p53[1-118]-EGFP-Sv5
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<211> 1350
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción
p53[1-118]-EGFP-[337-393]-Sv5
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<211> 1389
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción
p53[1-118]-EGFP-[324-393]-Sv5
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<210> 32
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<211> 1410
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción
p53[1-118]-EGFP-[317-393]-Sv5
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1455
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-EGFP-[302-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3090
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
\beta-gal-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-32]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-48]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3438
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-83]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-p53[361-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-p53[337-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-p53[324-393]-Sv5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3675
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-p53[317-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción
p53[1-118]-\beta-gal-p53[302-393]-Sv5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido universal
sens empleado para amplificar el extremo
amino-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisens
empleado para amplificar el fragmento 1-32 del
extremo amino-terminal de la proteína p53
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisens
empleado para amplificar el fragmento 1-48 del
extremo amino-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisens
empleado para amplificar el fragmento 1-83 del
extremo amino-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisens
empleado para amplificar el fragmento 1-118 del
extremo amino-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido universal
antisens empleado para amplificar el extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido empleado para
amplificar el fragmento 361-393 del extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido empleado para
amplificar el fragmento 337-393 del extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido empleado para
amplificar el fragmento 324-393 del extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido empleado para
amplificar el fragmento 317-393 del extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido empleado para
amplificar el fragmento 302-393 del extremo
carboxi-terminal de la proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína p53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Una proteína de fusión, basada en una
proteína p53, que comprende un péptido etiqueta, un dominio de
unión a Mdm2 y/o un dominio de ubiquitilación de una proteína p53,
y carece de la totalidad o parte del dominio de unión al ADN de
dicha proteína p53, de manera que carece de la actividad de
transcripción de dicha p53.
2. Proteína de fusión según la reivindicación 1,
seleccionada entre:
- una proteína de fusión de fórmula (I)
(I)(M)_{n}-T-(U)_{p}
donde,
M es un péptido que comprende un dominio de
unión a Mdm2;
T es un péptido etiqueta;
U es un péptido que comprende un dominio de
ubiquitilación;
n es un número entero igual a 0 ó 1; y
p es un número entero igual a 0 ó 1,
con la condición de que la suma de n y p es
mayor o igual a 1 (n + p \geq 1); y
\vskip1.000000\baselineskip
- una proteína de fusión de fórmula (II)
(II)(U)_{p}-T-(M)_{n}
donde M, T, U, n y p tienen los
significados previamente
mencionados.
3. Proteína de fusión según la reivindicación 1
ó 2, en la que dicho péptido etiqueta comprende una cola de
(poli)histidina, una cola de (poli)arginina, glutatión
S-transferasa-tag,
FLAG-tag, proteína de unión a maltona (MBP),
estreptavidina, la secuencia diana de biotinilización BSP de la
enzima bacteriana Bira, un epítopo de una etiqueta reconocido por
un anticuerpo, una proteína fluorescente o una enzima.
4. Proteína de fusión según la reivindicación 3,
en la que dicho péptido etiqueta se selecciona entre la proteína
verde fluorescente (EGFP) y
\beta-galactosidasa.
5. Proteína de fusión según la reivindicación 1
ó 2, en la que dicho dominio de unión a Mdm2 (M) se selecciona
entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
6. Proteína de fusión según la reivindicación 1
ó 2, en la que dicho dominio de ubiquitilación se selecciona
entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
7. Proteína de fusión según la reivindicación 2,
seleccionada entre una proteína de fusión de fórmula (I) en la que
"n" es 1 y "p" es 0, una proteína de fusión de fórmula
(I) en la que "p" es 1 y "n" es 0, y una proteína de
fusión de fórmula (I) en la que "n" es 1 y "p" es 1.
8. Proteína de fusión según la reivindicación 2,
seleccionada entre una proteína de fusión de fórmula (II) en la que
"n" es 1 y "p" es 0, una proteína de fusión de fórmula
(II) en la que "p" es 1 y "n" es 0, y una proteína de
fusión de fórmula (II) en la que "n" es 1 y "p" es 1.
9. Proteína de fusión según la reivindicación 1,
seleccionada entre las proteínas de fusión cuyas secuencias
aminoacídicas son las identificadas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,
y sus variantes funcionalmente equivalentes.
10. Un polinucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Polinucleótido según la reivindicación 10,
seleccionado entre los polinucleótidos cuyas secuencias
nucleotídicas son las identificadas como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ
ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:
35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ
ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO:
44.
12. Un vector que comprende un polinucleótido
según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.
13. Vector según la reivindicación 12, que
comprende, además, la secuencia de nucleótidos que codifica para la
proteína Mdm2.
14. Una célula que comprende un vector según
cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13.
15. Célula según la reivindicación 14,
seleccionada entre una célula de mamífero, una célula vegetal, una
levadura y una bacteria.
16. Un procedimiento para la obtención de una
proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
que comprende cultivar una célula según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15 bajo condiciones que promuevan la expresión
de dicha proteína de fusión y, si se desea, aislar y,
opcionalmente, purificar, dicha proteína de fusión.
17. Un método ex vivo para el cribado de
compuestos que inhiben la degradación de la proteína p53 vía Mdm2
y/o vía proteasoma que comprende las etapas de:
- a)
- transfectar una célula con un vector según la reivindicación 13, o, alternativamente, con un vector según la reivindicación 12 y con un segundo vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para Mdm2;
- b)
- poner en contacto dicha célula transfectada con un compuesto a ensayar;
- c)
- ensayar la capacidad de dicho compuesto de inhibir la degradación de la proteína p53; y
- d)
- seleccionar el compuesto que presenta una capacidad inhibidora de la degradación de la proteína p53 ex vivo.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
dicha célula a transfectar es una célula que no expresa p53.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
dicha célula a transfectar es una célula "knock out" para el
gen que codifica para dicha proteína p53.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
dicha célula a transfectar es una célula de cáncer de pulmón
(H1299) o una célula de osteosarcoma (Saos-2) knock
out para el gen que codifica para la proteína p53.
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|---|---|---|---|
| ES200601537A ES2321359B1 (es) | 2006-06-07 | 2006-06-07 | Proteinas de fusion de p53 sin actividad de transcripcion y sus aplicaciones. |
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| ES2321359B1 true ES2321359B1 (es) | 2010-03-03 |
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Family Applications (1)
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| ES200601537A Expired - Fee Related ES2321359B1 (es) | 2006-06-07 | 2006-06-07 | Proteinas de fusion de p53 sin actividad de transcripcion y sus aplicaciones. |
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2007
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