ES2321289T3 - Metodo de diagnostico serologico. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico serológico in vitro, en el que se detecta la presencia de anticuerpos específicos de un agente microbiano infeccioso en una muestra a ensayar, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas en las que: a) se deposita sobre un soporte sólido un primer antígeno (Ag 1) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y por lo menos un segundo antígeno (Ag 2) que es característico de un agente infeccioso microbiano (Ag2), y b) se hace reaccionar el primer (Ag 1) y el(los) segundo(s) (Ag 2) antígenos con una muestra a ensayar, y c) se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac1) reacciona con el primer antígeno (Ag1) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag1-Ac1) con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con el primer antígeno (Ag1), y d) se controla que dicha muestra a ensayar contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas humanas reaccionan con el primer antígeno.
Description
Método de diagnóstico serológico.
La presente invención se refiere a un método de
diagnóstico de las enfermedades infecciosas humanas. Más
particularmente, se refiere al campo del diagnóstico indirecto por
serología. Uno de los métodos de laboratorio para el diagnóstico de
las enfermedades infecciosas humanas es la serología microbiana. Se
trata de un método de diagnóstico indirecto que se basa en la
búsqueda en el suero de un paciente de anticuerpos específicos del
agente microbiano infeccioso, a saber, una bacteria, un virus, un
parásito o un hongo responsable de una patología (denominada a
continuación "microbio"). Este método de diagnóstico es
primordial para el diagnóstico de las infecciones con microorganismo
de cultivo y de identificación difícil, en particular los virus,
las bacterias intracelulares estrictas y las bacterias
intracelulares facultativas del género Rickettsie, Coxiella,
Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia, Chlamydia, Mycoplasma, Treponema,
Boffelia, y Leptospira, por ejemplo.
Técnicamente, la serología microbiana consiste
en detectar en el suero del paciente una reacción antígeno -
anticuerpo en la que el antígeno está representado por todo o una
fracción del agente microbiano infeccioso a detectar, y el
anticuerpo está representado por las inmunoglobulinas humanas
específicas de dicho agente microbiano infeccioso presentes en el
suero del paciente. Se puede cuantificar ensayando sucesivamente una
serie de diluciones crecientes de razón 2 o de razón 10 del suero
del paciente.
Habitualmente, un método de diagnóstico
serológico comprende más particularmente las siguientes etapas:
- 1.
- Depositar el antígeno sobre un soporte sólido tal como unas microperlas de látex, especialmente en la técnica de detección por aglutinación en la que se recubren unas microperlas de látex con el antígeno microbiano a ensayar y se aglutinan entre sí por el suero del paciente que presenta unos anticuerpos específicos, siendo esta aglutinación visible a simple vista; o sobre un portaobjeto de vidrio o microplaca de filtración para las técnicas de detección por inmunofluorescencia o técnica enzimática, especialmente de tipo ELISA "Enzyme Linked Immunosorbent Assay", o sobre una hoja de nitrocelulosa o de nylon para las técnicas de detección de tipo transferencia western, en la que los antígenos microbianos separados por electroforesis y después transferidos sobre un soporte sólido (hoja de nitrocelulosa o de nylon) reaccionan separadamente entre sí con el suero del paciente. Estas técnicas de detección son bien conocidas por el experto en la técnica,
- 2.
- Descomplementar el suero por calentamiento hasta 56ºC durante 30 minutos,
- 3.
- Poner en contacto el antígeno que corresponde al agente microbiano infeccioso con el suero del paciente, y después incubar bajo unas condiciones de tiempo, de temperatura, de higrometría, de agitación mecánica y de fuerza iónica del medio que permitan la reacción antígeno-anticuerpo,
- 4.
- Lavar con cuidado y de forma general para eliminar el suero del paciente en exceso no-fijado al soporte sólido,
- 5.
- Aplicar un anticuerpo secundario de detección que es una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana, especialmente una inmunoglobulina de cabra conjugada con una sustancia de fluorocromo, generalmente iso-tio-sulfato de fluoresceína, o una enzima, generalmente una peroxidada, e incubar bajo unas condiciones de tiempo, de temperatura, de higrometría, de agitación mecánica y de fuerza iónica del medio que permitan la reacción antígeno-anticuerpo,
- 6.
- Lavar con cuidado y de forma general para eliminar la inmunoglobulina conjugada, no fijada, en exceso,
- 7.
- Detectar una reacción leyendo con la ayuda de un equipo tal como un microscopio de fluorescencia para la técnica de inmunofluorescencia indirecta, o un lector de densidad óptica para la técnica de detección enzimática de tipo ELISA. La lectura de la reacción de transferencia western se realiza a simple vista, o después de cargar digitalmente el gel, y análisis por un programa de densitometría.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada una de esas etapas puede ser una fuente de
errores de manipulación que dan como resultado una ausencia de
reacción antígeno-anticuerpo y, por lo tanto, una
reacción falsamente negativa. Un error de manipulación conduce por
lo tanto de forma eventual a interpretar como negativa una reacción
que es en realidad positiva (falso negativo). Un error frecuente en
la realización de los ensayos serológicos, especialmente para los
ensayos serológicos en batería realizados sobre un gran número de
sueros a ensayar, se debe a defectos en la introducción de los
sueros a ensayar, especialmente por pipeteado. Estos errores
intervienen especialmente en las etapas que implican el
desplazamiento de la muestra a ensayar, especialmente por pipeteado,
puesto que algunos recipientes que contienen especialmente el
soporte sólido sobre el cual se deposita el antígeno a detectar,
pueden no ser llenados inadvertidamente con el suero humano a
ensayar. Se sabe que el pipeteado del suero supone un riesgo de
error de 1%, relacionado con un problema totalmente técnico por
ausencia de pipeteado por la pipeta, o un error humano por ausencia
de pipeteado
inadvertida.
inadvertida.
\newpage
Estos errores imponen la introducción de
controles en la realización de la reacción. La incorporación
sistemática durante cada nueva manipulación de un suero de control
negativo, es decir, que no contiene ningún anticuerpo específico
del antígeno a ensayar, permite interpretar las reacciones
positivas. Asimismo, la incorporación de un suero de control
positivo, es decir, que contiene el anticuerpo específico del
antígeno a ensayar en un título conocido, permite verificar la
calidad del antígeno y de la inmunoglobulina conjugada.
Si no existe ningún control de que el suero a
ensayar ha sido efectivamente introducido en el ensayo serológico,
y si por inadvertencia el suero a ensayar no se introduce en el
ensayo serológico, la reacción antígeno
bacteriano-anticuerpo sérico probablemente no
existirá, y el ensayo se interpretará, falsamente, como negativo
(falso negativo).
El documento DE 1000322 describe la realización
de anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas, de
origen animal, a título de control de la presencia de suero en una
muestra a ensayar por trasferencia western. El artículo Europeen
Journal of Clinical investigation, 1999 (29,
697-699) de JA GARROTE et al., describe un
inmunoensayo de detección visual que implica el uso de una
sustancia de detección constituida de un conjugado de proteína
A-oro coloidal.
La proteína A es un polipéptido de 42 kDa, y es
un constituyente de la pared de las cepas de Staphylococcus
aureus, unas proteínas similares pero diferentes se caracterizan
en la superficie de las bacterias del género Streptococcus
[Langone J. J. Adv. lmmunol. 1982, 32: 157-251].
Se sabe que una fracción de la pared de
Staphylococcus aureus se une a las inmunoglobulinas humanas,
y que la proteína A es el constituyente de la pared de
Staphylococcus aureus que se une al suero humano [Forsgren
A. y J. Sjöquist. J. lmmunol. 1966, 97: 822-827], y
más particularmente en el extremo Fc de las inmunoglobulinas
humanas. La proteína A dispone de cuatro sitios de unión con el
extremo Fc de las inmunoglobulinas, incluyendo dos sitios de
fijación que son móviles durante una misma reacción
antígeno-anticuerpo. Se ha realizado el análisis
cristalino de esta reacción [Deisenhofer J. Biochemistry 1981, 20:
2361-2370]. Se ha estudiado la afinidad de la
proteína A por los diferentes sueros animales [Kronvall G. Seal US,
Finstad J., Williams RC Jr. J. lmmunol.
1970104:140-147; Richman DD, Cleueland PH, Oxman MN,
Johnson Km. J. lmmunol. 1982 128: 2300-2305], y
está proteína A presenta una afinidad por los sueros de origen
animal, especialmente el caballo, los bóvidos, el cerdo, el conejo,
la cobaya y el ratón; y a un grado menor el hámster, la rata y la
oveja. Por el contrario, el suero de polluelo y de cabra no
reacciona con la proteína A.
Ya se introdujo Staphylococcus aureus
como antígeno detector en unos ensayos serológicos de anticuerpos
específicos [Ryding U, Esperson F, Sôderquist B, Christensson B.
Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2002, 42: 9-15]. Los
trabajos publicados han mostrado la ausencia de especificidad de
estos ensayos.
El objeto de la presente invención es la adición
de un control que detecta la inclusión del suero a ensayar durante
unas reacciones de serologías bacterianas.
Se ha descubierto de manera fortuita durante un
trabajo serológico en unos pacientes que presentan una endocarditis,
que los sueros de esos pacientes reaccionaban todos frente a
Staphylococcus aureus, y se ha demostrado, según la presente
invención, que se trataba de una propiedad general, a saber, que la
reacción de un suero humano con un antígeno que contiene la
proteína A no estaba alterada en el caso de suero humano de
patología infecciosa, incluyendo las patologías infecciosas que
modifican mayoritariamente el porcentaje y la naturaleza de las
inmunoglobulinas segregadas tales como las enfermedades víricas que
implican los virus V.I.H., C.M.V. o también
Epstein-Barr. En efecto, si se conocía que la
proteína A se unía con cualquier suero humano normal, no se conocía
que esta propiedad se conservaba para unos sueros humanos extraídos
en unos pacientes que presentan diferentes patologías infecciosas.
No se conocía tampoco que el Staphylococcus aureus podía
desempeñar ese papel de "portador" de proteína A durante unas
reacciones de serología bacteriana.
La presente invención consiste por lo tanto
esencialmente en añadir una bacteria de Staphylococcus aureus
a título de antígeno para controlar que la muestra a ensayar
contiene ciertamente un suero de origen humano, y para detectar una
reacción antígeno-inmunoglobulina humana con una
sustancia específica.
En efecto, se ha descubierto que en la medida en
la que la proteína A reacciona con unas inmunoglobulinas humanas de
manera no específica, incluso en un caso de patología infecciosa
importante, es posible usar esta proteína A como control positivo
de la introducción de un suero humano en la muestra a ensayar,
puesto que por otro lado la proteína A no reacciona con ciertos
anticuerpos.
Más precisamente, la presente invención
proporciona un método de diagnóstico serológico in vitro en
el que se detecta la presencia de anticuerpos específicos de un
agente microbiano infeccioso en una muestra a ensayar,
caracterizado porque se controla que dicha muestra a ensayar
contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas
humanas reaccionan con un antígeno que contiene una bacteria de
Staphylococcus aureus.
Según la invención, se realizan las etapas en
las que:
- -
- se hace reaccionar la muestra a ensayar con un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que comprende la proteína A, y
- -
- se detecta la presencia de un producto de reacción antígeno-anticuerpo (Ag_{1}-Ac_{1}) en el que el anticuerpo (Ac_{1}) es una inmunoglobulina humana, haciendo reaccionar dicho producto de reacción con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con dicho primer antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la expresión "detección de
inmunoglobulina humana que reacciona con un antígeno que contiene la
proteína A" se entiende que se puede determinar un nivel de
dilución de la muestra a ensayar que contiene un suero humano, y
más particularmente un nivel de dilución del suero humano a ensayar,
nivel más allá del cual ya no se detecta más dicha inmunoglobulina
humana que haya reaccionado con dicho antígeno que comprende la
proteína A debido al método de detección llevado a cabo.
Según la invención, se realizan las etapas
siguientes en las que:
- a)
- se deposita sobre un soporte sólido el primer antígeno que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A (Ag_{1}) y uno o más segundos antígenos (Ag_{2}) que son característicos de un agente o respectivamente de varios agentes infecciosos microbianos, y
- b)
- se hacen reaccionar los primeros (Ag_{1}) y los segundos (Ag_{2}) antígenos con una muestra de suero a ensayar, y
- c)
- se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac_{1}) reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag_{1}-Ac_{1}) con un anticuerpo secundario de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A.
\vskip1.000000\baselineskip
En un modo de realización ventajoso, el primer
antígeno es una bacteria entera de Staphylococcus aureus que
comprende la proteína A. Se pueden usar más particularmente las
bacterias de Staphylococcus aureus depositadas en las
colecciones públicas tales como las bacterias depositadas en
A.T.C.C. con el nº 29213 y en C.N.C.M del Instituto Pasteur
(Francia) con el número 65.8T.
Por otro lado, más allá de las cepas tipo, se
puede usar como antígeno Ag_{1} cualquier cepa bacteriana
identificada como Staphylococcus aureus.
También ventajosamente, la presencia de un
producto de la reacción se detecta con una inmunoglobulina
anti-inmunoglobulina humana que es una
inmunoglobulina de origen animal, preferiblemente una
inmunoglobulina de cabra o de polluelo.
Como soporte sólido, se puede usar cualquier
dispositivo adaptado para la manipulación de suspensiones celulares
y bacterianas, y especialmente unos tubos, unos portaobjetos de
vidrio, unos tubos Bijoux o unas placas rígidas de microtitulación
de polietileno, poliestireno, cloruro de polivinilo o nitrocelulosa,
que comprenden unos micropocillos.
Como tipo de marcado de la inmunoglobulina
anti-humana, se usa por lo tanto de forma ventajosa
un marcado enzimático, radioactivo o fluorescente, siendo este
último tipo de marcado preferido.
La expresión "marcado fluorescente"
significa que el anticuerpo se ha hecho fluorescente por
acoplamiento o complejación con un agente fluorescente apropiado tal
como el iso(tio)cianato de fluoresceína.
La expresión "marcado radioactivo"
significa que el anticuerpo lleva un isotopo radioactivo que permite
cuantificarlo mediante recuento de su radioactividad asociada,
pudiendo el isotopo ser portado bien sobre un elemento de la
estructura del anticuerpo, por ejemplo los restos de tirosina
constitutivos, o bien sobre un radical apropiado que le ha sido
fijado.
La expresión "marcado enzimático" significa
que el anticuerpo específico está acoplado o complejado con una
enzima que, asociada con el uso de agentes reactivos apropiados,
permite una medición cuantitativa de ese anticuerpo específico.
El sustrato y los agentes reactivos se eligen de
manera que el producto final de la reacción o de la secuencia de
reacciones provocada por la enzima y que usa estas sustancias
sea:
- -
- una sustancia teñida o fluorescente que se difunde en el medio líquido que rodea la muestra ensayada y que es objeto de la medición final espectrofotométrica o fluorimétrica, respectivamente, o que es objeto de una evaluación visual; eventualmente con relación a una escala de colores calibrada,
- -
- o bien una sustancia teñida insoluble que se deposita sobre la muestra ensayada y que puede ser objeto de una medición fotométrica por reflexión, o de una evaluación visual, eventualmente con relación a una escala de colores calibrada.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa una inmunoglobulina hecha
fluorescente, la fluorescencia asociada con la muestra ensayada se
lee directamente sobre un aparato apropiado.
Cuando se usa una sonda radioactiva, como por
ejemplo el yodo 125, la radioactividad asociada con la muestra
ensayada se recuenta en un contador gamma usando cualquier método
adecuado y, por ejemplo, después de la solubilización de las
células por una disolución alcalina (por ejemplo una disolución de
sosa) y de la recuperación de la disolución que contiene la
radioactividad con la ayuda de un tampón absorbente.
Cuando se usa una enzima sobre el anticuerpo
específico, se obtiene la aparición de un producto teñido o
fluorescente añadiendo una disolución que contiene el sustrato de
la enzima y uno o más agentes reactivos auxiliares que permiten
obtener finalmente como producto de reacción un producto teñido
soluble en el medio, o un producto teñido insoluble, o bien un
producto fluorescente soluble, tal como se ha explicado
anteriormente. Después, la señal luminosa que procede de las
muestras así tratadas se mide con la ayuda del equipo adaptado para
cada caso: fotómetro de transmisión, o de reflexión o fluorímetro,
respectivamente. Alternativamente, también se puede evaluar a
simple vista la coloración obtenida, ayudándose eventualmente de una
escala calibrada de disoluciones teñidas.
Usando como enzima la fosfatasa alcalina, el
acoplamiento de esa enzima con el anticuerpo específico se efectúa
según el método propuesto por Boehringer
Mannheim-Biochemica. Los sustratos preferidos de esa
enzima son el fosfato de paranitrofenilo para una lectura
fluorométrica, o el fosfato de
5-bromo-4-cloro-umbeliferilo
para una lectura fluorométrica, o el fosfato de
5-bromo-4-cloro-6-indolilo
para obtener un producto de reacción teñido insoluble. Se puede
asimismo usar como enzima la \beta-galactosidasa
cuyos sustratos preferidos son el
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
o el
4-metil-umbeliferil-\beta-D-galactopiranósido.
Preferentemente, se pueden acoplar los
anticuerpos específicos con la peroxidada. En este caso, el
procedimiento de acoplamiento deriva de aquel descrito por M. B.
Wilson y P. K. Nakane en lmmunofluorescence and related staining
techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wicks ed. Elsevier/North
Holland. Ámsterdam 1978, p. 215-224.
Los agentes reactivos usados para revelar la
peroxidada conjugada con los anticuerpos específicos contienen agua
oxigenada, un sustrato de la enzima, y un cromógeno apropiado por
ejemplo ortofenilendiamina o el ácido
azino-2,2'-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)
o ABTS para obtener un producto final de reacción teñido y soluble
en el medio, o bien la
diamino-3,3'-bencidina, o el
3-amino-9-etil-carbazol
o el
4-cloro-\alpha-naftol
para obtener un producto final de reacción insoluble, o bien el
ácido parahidroxifenil-propiónico para obtener un
producto de reacción fluorescente soluble en el medio.
Otro modo de realización de la invención es el
uso de inmunoglobulina acoplada a la acetilcolinesterasa.
La acetilcolinesterasa se acopla al anticuerpo
usando preferentemente un procedimiento derivado del descrito en la
patente francesa nº 2 550 799, o un procedimiento que comprende
esquemáticamente la preparación de fragmentos del anticuerpo
mediante una técnica conocida, la modificación de la enzima por
reacción con un agente heterobifuncional apropiado y finalmente el
acoplamiento de los productos así obtenidos. En este caso, se pueden
usar otros procedimientos conocidos de construcción de conjugados
inmunoenzimáticos.
La revelación de la actividad enzimática
específicamente unida al antígeno reconocido por el conjugado de
acetilcolinesterasa se realiza preferiblemente según la técnica bien
conocida que utiliza la acetiltiocolina como sustrato de la enzima
y el agente reactivo de Ellman o el ácido
ditio-5,5'-nitro-2-benzoico
como cromógeno, según cualquier variante adaptada al caso en
cuestión, por ejemplo aquella descrita por Pradelles et al.,
en Anal. Chem. 1985, 57:1170-1173.
Más particularmente todavía, se realiza una
serie de ensayos con diluciones crecientes de la muestra a ensayar
y se usa una sustancia de detección (Ac_{2}) que es una
inmunoglobulina conjugada con una sustancia fluorescente, y se
verifica si se detecta mediante fluorescencia un producto de
reacción
(Ag_{1}-Ac_{1}-Ac_{2}) a una
dilución de la muestra a ensayar inferior o igual a 1/200, más
exactamente igual a la dilución límite usada para la detección del
antígeno Ag_{2}, es decir, la dilución más pequeña a partir de la
cual la muestra de suero puede dar lugar a la detección de una
reacción contra los antígenos específicos Ag_{2}, siendo esta
dilución límite variable en función del agente patógeno y del método
de detección, y estando generalmente comprendida entre 1:4 y 1:200.
Tal como se menciona anteriormente, para cada método de detección se
puede determinar un título dado de anticuerpo (Ac_{2}), es decir,
un límite dado de dilución del suero a ensayar, más allá del cual
ya no se detecta más dicho anticuerpo (Ac_{2}) que se une a la
proteína A.
Tal como se muestra en los ejemplos a
continuación en el caso de un método de detección por
inmunofluorescencia, se demuestra que cualquier suero humano
incorporado en una reacción de inmunofluorescencia indirecta a una
dilución inferior o igual a 1/200 presenta una reacción frente a
Staphylococcus aureus, es decir, que el título de anticuerpos
anti-Staphylococcus aureus es de por lo menos 1/200.
En un modo de realización particular, dicho
agente microbiano infeccioso que consiste en el segundo antígeno se
selecciona de entre unos microorganismos que comprenden una
bacteria, un virus, un parásito o un hongo.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Más particularmente, el segundo antígeno es una
bacteria intracelular, y de forma especial el segundo antígeno se
selecciona de entre las bacterias del género Rickettsia,
Coxiella, Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia, Chlamydia, Mycoplasma,
Treponema, Borrelia, y Leptospira, no siendo exhaustiva
esta lista.
Todavía más particularmente, el segundo antígeno
que corresponde a una bacteria es responsable de una
endocarditis.
En otro modo de realización, el segundo antígeno
es un antígeno vírico, especialmente un virus seleccionado de entre
los virus V.I.H., C.M.V. o Epstein-Barr.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un kit de diagnóstico útil para llevar a cabo un método según la
invención, que comprende por lo menos un control positivo de la
introducción de un suero humano en la muestra a ensayar que
comprende un primer antígeno que comprende la proteína A y unos
agentes reactivos que permiten detectar la presencia de un producto
de reacción del primer antígeno con una inmunoglobulina humana.
Más particularmente, el kit de diagnóstico
comprende:
- -
- un soporte sólido sobre el cual se ha depositado un primer antígeno que comprende la proteína A, y un segundo antígeno que corresponde a un agente microbiano infeccioso a detectar, y una sustancia de detección de un producto de reacción del primer antígeno con una inmunoglobulina humana que comprende una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A de forma preferida una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana que es una inmunoglobulina de carba o de polluelo marcada con un marcado fluorescente.
Otras características y ventajas de la presente
invención aparecerán a la luz de los ejemplos a continuación.
Las figuras 1A, 1B y 1C representan unos ensayos
de serología bacteriana realizados mediante el método de
inmunofluorescencia indirecta que ilustra la invención.
Las muestras ensayadas comprenden:
- -
- suero de persona donante de sangre (n = 100),
- -
- suero de paciente que presenta una endocarditis (n = 400),
- -
- suero de paciente que presenta la enfermedad del arañazo de gato debido a la bacteria Bartonella henselae, y
- -
- suero de paciente que presenta una infección aguda de Coxiella burnetti (n = 50),
- -
- suero de pacientes que presentan unas infecciones diversas (virus de Epstein-Barr, infección por V.I.H., infección por C.M.V.) (n = 50)
El suero se descomplementa mediante
calentamiento a 56ºC durante 30 minutos, se puede conservar a 4ºC si
el análisis no se realiza inmediatamente.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Portaobjeto DINA TECH(R) de 18 pocillos
- -
- Microplacas en forma de U para la dilución ref.: Elvetec(R) 025085096
- -
- Microscopio de fluorescencia
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Control positivo por antígeno
- -
- Cola Fluoprep ref.: Biomerieux 75521, conservación a 20ºC
- -
- Diez alícuotas de antígenos: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Rickettsia conorii ATCC VR-141, Rickettsia slovaca, Rickettsia typhi ATCC VR-144, Coxiella burnetti Cepa Mine Mile ATCC VR-616, Francisella tularensis A TCC 15482, conservados a -30ºC
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- Bartonella henselae ATCC 49882, Bartonella quintana ATCC 49793, Bartonella clarridgeae (cepa depositada, colección Unité des Rickettsies, Facultad de medicina, Marsella), Bartonella, massilae (cepa depositada, colección Unité des Rickettsies, Facultad de medicina, Marsella). Conservados a 4ºC.
- -
- Anticuerpos de detección: inmunoglobulina de cabra anti-inmunoglobulina humana IGH (Fluolina-H, bioMérieux sa, Marcy l'Etoile, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Los portaobjetos deben ser desgrasados en el alcohol metílico durante un mínimo de 2 h, idealmente toda la noche.
- -
- Preparación de los antígenos.
Después de descongelar y dejar volver a
temperatura ambiente, se diluye al ½ en PBS estéril (conservación a
4ºC). Se asegura previamente la calidad del lote de antígeno
ensayándole mediante un suero de control (es decir, con una
concentración de anticuerpos conocida) a fin de determinar la
dilución óptima de uso de este antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Se depositan los antígenos sobre los puntos de los portaobjetos desgrasados, con la ayuda de una pluma diferente para cada antígeno. Estas plumas se aclaran, se escurren y se secan después de cada uso.
- -
- El primer portaobjeto de detección debe comprender los siguientes antígenos, siempre depositados en la misma posición a partir de la parte superior y en el sentido de las agujas de un reloj: Staphylococcus aureus, Coxiella burnetii, Rickettsia slovaca, Rickettsia conorii, Rickettsia typhi. Se fijan los portaobjetos durante 10 min. en acetona.
- -
- El segundo portaobjeto de detección debe comprender los siguientes antígenos, siempre depositados en la misma posición a partir de la parte superior y en el sentido de las agujas de un reloj: Staphylococcus aureus, Bartonella henselae, Bartonella clarridgeae, Bartonella quintana, Francisella tularensis y B. massiliae en el medio. Los portaobjetos se fijan en alcohol metílico durante 10 min..
- -
- Recordatorio: la lectura con el microscopio estará invertida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sueros deben ser descomplementados,
numerados y procesados informáticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan sistemáticamente tres diluciones
1/25, 1/50, 1/100 en un PBS-leche (Para LCR dilución
1/2, 1/4, 1/8, para picadura de garrapata 1/8).
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- treinta \mul de cada una de las 3 diluciones de cada paciente una bajo la otra.
- -
- el primer punto del portaobjeto se reserva para el control positivo constituido por un grupo de sueros positivos conocidos para cada uno de los antígenos ensayados.
- -
- el último punto del portaobjeto se reserva para el control negativo (PBS-leche).
Se deja incubar durante 30 minutos a 37ºC en
atmósfera húmeda.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavan los portaobjetos con un chorro de PBS y
en unos baños de PBS tween, y después con agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación: IgH fluorescente total a diluir en
PBS-leche con una gota de azul de Evans al 1/400
(con la condición de que la dilución haya sido ensayada al abrir el
frasco según el procedimiento desarrollado en el punto nº 4). Se
depositan 30 \mul sobre cada punto. Se deja incubar durante 30
minutos a 37ºC en atmósfera húmeda y después se aclara según el
mismo procedimiento descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se depositan 3 gotas de Fluoprep® sobre los
portaobjetos secos. Se coloca un cubreobjeto sin moverlo, y se deja
que el Fluoprep® se difunda sobre todo el portaobjeto. Se protege de
la luz hasta la lectura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ésta se realiza sobre el microscopio de
fluorescencia. La lectura con microscopio está invertida en relación
con el depósito. Se anotan todos los resultados positivos sobre una
hoja de trabajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió una serie de suero en personas
donantes de sangre (controles de la población general) (n = 100) y
en pacientes que presentan una endocarditis (n = 40), una enfermedad
del arañazo de gato debido a la bacteria Bartonella henselae
(n = 50), una infección aguda de Coxiella burnetii (fiebre Q
aguda) (n = 50), o unas infecciones diversas caracterizadas por un
aumento policlonal no específico del porcentaje de las
inmunoglobulinas séricas (infección con virus de
Epstein-Barr, infección por V.I.H., infección por
C.M.V.) (n = 50).
Este ensayo serológico ha mostrado un título de
anticuerpos anti-Staphylococcus aureus 1:400 en 100% de los
pacientes que presentan una endocarditis, y un título de 1:200 en
100% de los demás pacientes así como en los donantes de sangre.
Se realizó una operación de control sobre 10
ensayos en los que la muestra a ensayar contenía únicamente la
inmunoglobulina conjugada de detección, y en los que el suero de
paciente fue voluntariamente omitido. No se detectó ninguna
fluorescencia sobre esas 10 muestras confirmando la ausencia de
reacción de la inmunoglobulina de cabra con la proteína A. Estos
resultados demuestran que cualquier suero humano incorporado en una
reacción de inmunofluorescencia indirecta a una dilución \leq
1:200 presenta una reacción frente a Staphylococcus aureus; y
que esta reacción no está alterada por las patologías infecciosas,
incluyendo las patologías infecciosas que inducen una
hipergammaglubulinemia policlonal, y que modifica por lo tanto
fuertemente el porcentaje y la calidad de las inmunoglobulinas
séricas humanas; y que la ausencia de suero humano se traduce por
una ausencia de fluorescencia.
Para los resultados presentados en las figuras
1A, 1B y 1C, se realizó el ensayo contra tres antígenos, S.
aureus ATCC 29 213 en el centro del portaobjeto, R.
conorii ATCC VR-141 a la izquierda del
portaobjeto, y B. henselae ATCC 49882 a la derecha del
portaobjeto.
- figura 1A = sin ningún suero humano,
- figura 1B = con suero humano positivo para
R. conorii,
- figura 1C = con suero humano positivo para
B. henselae.
La omisión de suero humano conlleva una ausencia
de fluorescencia (figura 1A), la introducción de suero conlleva
sistemáticamente una fluorescencia frente a S. aureus
(figuras 1B y 1C).
Claims (11)
1. Método de diagnóstico serológico in
vitro, en el que se detecta la presencia de anticuerpos
específicos de un agente microbiano infeccioso en una muestra a
ensayar, caracterizado porque se realizan las siguientes
etapas en las que:
- a)
- se deposita sobre un soporte sólido un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y por lo menos un segundo antígeno (Ag_{2}) que es característico de un agente infeccioso microbiano (Ag_{2}), y
- b)
- se hace reaccionar el primer (Ag_{1}) y el(los) segundo(s) (Ag_{2}) antígenos con una muestra a ensayar, y
- c)
- se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac_{1}) reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag_{1}-Ac_{1}) con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}), y
- d)
- se controla que dicha muestra a ensayar contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas humanas reaccionan con el primer antígeno.
2. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicha sustancia de
detección es un anticuerpo secundario de detección (Ac_{2}) que es
una inmunoglobulina de origen animal
anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona
con la proteína A.
3. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 2, caracterizado porque dicha inmunoglobulina
de origen animal anti-inmunoglobulina humana
(Ac_{2}) es una inmunoglobulina de carba o de polluelo.
4. Método de diagnóstico serológico según una de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha
sustancia de detección está marcada mediante marcado
fluorescente.
5. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 4, caracterizado porque:
- -
- se realiza una serie de ensayos a diluciones crecientes de la muestra a ensayar, y se usa una sustancia de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina conjugada con una sustancia fluorescente, y
- -
- se verifica si se detecta mediante fluorescencia un producto de reacción (Ag_{1}-Ac_{1}-Ac_{2}) a una dilución de la muestra a ensayar inferior o igual a 1/200.
6. Método de diagnóstico serológico según una de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho agente
microbiano infeccioso que consiste en dicho segundo antígeno se
selecciona de entre unos microorganismos que comprenden una
bacteria, un virus, un parásito o un hongo.
7. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 6, caracterizado porque el segundo antígeno
(Ag_{2}) es una bacteria intracelular o un virus.
8. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el segundo
antígeno se selecciona de entre las bacterias del género
Rickettsia, Coxiella, Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia,
Chlamydia, Mycoplasma, Treponema, Borrelia, y
Leptospira.
9. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 8, caracterizado porque el segundo antígeno
que corresponde al agente microbiano infeccioso es una bacteria
responsable de una endocarditis.
10. Método de diagnóstico serológico según una
de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el
segundo antígeno que corresponde a dicho agente microbiano
infeccioso es un antígeno vírico seleccionado de entre los virus
V.I.H., C.M.V. o Epstein-Barr.
11. Kit de diagnóstico útil para la realización
de un método según una de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizado porque comprende por lo menos:
- -
- un soporte sólido sobre el cual se ha depositado por lo menos un segundo antígeno (Ag_{2}) que corresponde a un agente microbiano infeccioso a detectar, y
- -
- un control positivo de la introducción de un suero humano en la muestra a ensayar que comprende un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y
- -
- unos agentes reactivos que permiten detectar la presencia de un producto de reacción del primer antígeno (Ag_{1}) con una inmunoglobulina humana (Ac_{1}), que comprende una sustancia de detección (Ac_{2}) que com-prende una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A.
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