ES2318682T3 - Estructuras cristalinas de la carnitina palmitoiltransferasa-2 (cpt-2) y utilizaccion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un cristal de la proteína CPT-2, en el que el cristal tiene unas dimensiones de celda unitaria de a = b= de 66 AMSTRONGS a 70 AMSTRONGSA, c = de 302 AMSTRONGS a 312 alfa; = a =gamma= 90º, y el cristal tiene simetría P4 32 12
Description
Estructuras cristalinas de la carnitina
palmitoiltransferasa-2 (CPT-2) y
utilización de las mismas.
El sistema de la carnitina palmitiltransferasa
(CPT) facilita la importación de ácidos grasos de cadena larga al
interior de la mitocondria de los eucariotas superiores. La
CPT-1 está integrada en la membrana mitocondrial
externa y cataliza la transferencia de porciones acilo de cadena
larga desde un acil-CoA a carnitina. La reacción
inversa la lleva a cabo la CPT-2, una proteína
localizada en el lado de la matriz de la membrana mitocondrial
interna. La modulación de la actividad catalítica de las isoformas
CPT-1 específicas de tejido es de interés para el
desarrollo de nuevos fármacos contra la diabetes mellitus no
dependiente de insulina (tipo 2) y la obesidad.
Las estructuras cristalinas de las proteínas son
útiles para identificar y optimizar compuestos que se unen al
centro activo de las enzimas. Hasta ahora, la estructura cristalina
de CPT-2 no había sido resuelta.
La presente invención está relacionada con la
estructura de la secuencia completa de la CPT-2 de
rata, sola o acomplejada con el inhibidor reversible de CPT,
ST1326, un análogo de sustrato que mimetiza a la palmitoil
carnitina. La estructura de CPT-2 acomplejada con
ST1326 proporciona información sobre el papel de los residuos
conservados en las CPT-1/2 y en las aciltransferasas
de cadena corta en la interacción
proteína-ligando.
La estructura de la CPT-2 se
determinó en tres formas cristalinas diferentes a una resolución de
2,0 \ring{A} y 1,6 \ring{A} para la apoenzima y 2,5 \ring{A}
de resolución para el complejo con ST1326 (ver los Ejemplos para
los detalles y la Tabla 1).
El plegamiento completo de la
CPT-2 puede subdividirse en un dominio aminoterminal
(residuos 111-440) y uno carboxiterminal (residuos
441-658, más 32-110). Estos dominios
consisten en seis láminas \beta antiparalelas centrales, dos de
las cuales (\beta1, \beta16) median el contacto del dominio
principal, y hélices-\alpha circundantes (Figuras
1/2). La estructura secundaria de la CPT-2 contiene
27 hélices \alpha y 18 láminas \beta. El lazo que conecta las
hélices 22 y 23 adopta una conformación helicoidal en la estructura
apo y es por lo tanto designada hélice 22B. La región
correspondiente de la estructura del complejo con ST1326 está
localizada cerca de un contacto cristalino, que puede interferir con
la formación de la estructura secundaria. La inserción de 30
aminoácidos que sólo se encuentran en la CPT-2
comparado con otras carnitina aciltransferasas (29 aminoácidos en
el caso de la L-CPT-1, Figura 2)
sobresale del dominio aminoterminal.
La densidad electrónica del núcleo catalítico
completo de la CPT-2 de rata está bien definida. Los
primeros 26 aminoácidos aminoterminales de la construcción usada
para la cristalización que comprenden la cola de His y cinco
residuos de la secuencia real de CPT-2 están
desordenados tanto en la estructura acomplejada como en la
estructura apo. Los últimos residuos con densidad electrónica
interpretable en el extremo carboxiterminal son la Lys 654
(complejo ST1326) e Ile 656 (apo, P4_{3}2_{1}2), mientras el
extremo carboxiterminal completo es visible en la cadena A de la
estructura apo ortorrómbica (C222_{1}).
La apo-CPT-2 y
el complejo con ST1326 cristalizaron en diferentes formas
cristalinas pero las estructuras tienen conformaciones similares,
como lo indica por la distancia r.m.s. (valor cuadrático medio) de
0,38 \ring{A} entre los átomos de C\alpha equivalentes. En las
tres estructuras, el residuo Arg 498 del centro activo está en la
región ampliamente permitida del diagrama de Ramachandran, y la Leu
129 así como la Asn 230 no cumplen con la geometría favorable del
diagrama de Ramachandran, pero la inequívoca densidad electrónica es
visible para estos residuos. La Leu 129 es el segundo residuo en un
giro inverso tipo II (equivalente a la Ile 116 en la CrAT de ratón,
código PDB 1t7n), mientras la Asn 230 se localiza en un giro \beta
cuya geometría puede estar deformada debido a la interacción con el
Asp 297 y la Arg 124 vecinas. La mutación de la Arg 124 se asocia
con una deficiencia heredada de CPT-2 (ver a
continuación).
Así, la presente invención está relacionada con
las tres formas cristalinas de la proteína CPT-2. Un
cristal de CPT-2 tiene unas dimensiones de celda
unitaria de a = b = de 66 \ring{A} a 70 \ring{A}, c = de 302
\ring{A} a 312 \ring{A}; \alpha = \beta = \gamma = 90º, y
el cristal tiene una simetría P4_{3}2_{1}2. En otra
realización, el cristal tiene unas dimensiones de celda unitaria de
a = de 93 \ring{A} a 97 \ring{A}, b= de 94 \ring{A} a 98
\ring{A}, c= de 304 \ring{A} a 312 \ring{A}; \alpha =
\beta = \gamma = 90º, y el cristal tiene una simetría
C222_{1}. La presente invención también está relacionada con un
co-cristal de la proteína CPT-2 y
un ligando unido al centro activo de la CPT-2, en el
que el co-cristal tiene unas dimensiones de celda
unitaria de a = de 83 \ring{A} a 87 \ring{A}, b= de 94
\ring{A} a 98 \ring{A}, c de 121 \ring{A} a 127 \ring{A};
\alpha = \beta = \gamma = 90º, y el cristal tiene una simetría
P2_{1}2_{1}2_{1}.
El inhibidor de la CPT ST1326 se une al centro
activo de CPT-2, que se localiza en un túnel que
penetra CPT-2 en la interfaz del dominio (Figura
3). ST1326 es un análogo no escindible de la palmitoil carnitina, el
sustrato fisiológico de CPT-2. El túnel de acilo y
de carnitina del centro activo tripartito (Nic a' Bhaird, N et
al., Comparison of the active sites of the purified carnitine
acyltransferases from peroxisomes and mitochoncria by using a
reaction-intermediate analogue. Biochem J., 294,
645-651 (1993)) de la CPT-2 están
ocupados por ST1326, mientras el túnel de CoA puede asignarse en un
modelo por homología basado en la estructura del complejo de la
CrAT con CoA (Figura 3). El grupo principal hidrofílico de
aminocarnitina del ST1326 está fuertemente unido en una red de
puentes de hidrógeno. La base catalítica His 372 forma un puente de
hidrógeno con el nitrógeno amino (N11) de ST1326, que sustituye al
oxígeno del éster del ligando nativo de palmitoil carnitina. La Ser
590 del motivo Ser-Thr-Ser
conservado entre las carnitina aciltransferasas establece un puente
de hidrógeno con el oxígeno carbamoilo (O13) del ligando. La Tyr
486, la Ser 488 y la Thr 499 del dominio carboxiterminal están
directamente enlazadas por puentes de hidrógeno a los oxígenos
carboxilo (O9 y O10) de ST1326. Los puentes de hidrógeno del grupo
guanidino de la Arg 554 también estabilizan la orientación de la Tyr
486 y la Thr 499. Los residuos Trp 116, Tyr 120 y Asp 376 del
dominio aminoterminal y una molécula de agua fijada sistemáticamente
son también parte de la red de puentes de hidrógeno que se unen al
grupo carboxilo de ST1326. La Arg 498 forma un puente de hidrógeno
fuerte con la cadena lateral del Asp 376 y su grupo guanidino
interacciona con el oxígeno carbonilo de la cadena principal de la
Ser 373 en el lazo catalítico, situando de ese modo los residuos del
centro activo en una posición ideal para la catálisis. La amina
terciaria cargada positivamente de ST1326 se estabiliza mediante
interacciones catión-pi con la Phe 602
conservada.
El túnel hidrofóbico que aloja a la cola
alifática tetradecanoilo de ST1326 está revestido de residuos de
las láminas \beta 1 y 16, que forman una lámina \beta
antiparalela en la interfaz del dominio, y las dos láminas \beta
carboxiterminales 17 y 18. Un mapa fofc de unión simulada
acotado a 2,5 \sigma muestra una densidad electrónica clara para
el ligando ST1326 unido al centro activo. Las láminas \beta que
forman el túnel hidrofóbico se separan para hacer espacio para la
cola hidrofóbica extendida del análogo de sustrato ST1326 comparado
con la disposición cerrada en las CrAT y CrOT (códigos PBD 1ndb,
1t7n y 1x18). El residuo de glicina Gly 600, en una posición en la
que en la CrAT (Met 564) y la CrOT (Gln 552) se encuentran residuos
más voluminosos, permite la unión de derivados de la carnitina LCFA
a la CPT-2, determinando de ese modo una
especificidad de sustrato. Al contrario que en las CrAT y CrOT, el
túnel acilo se abre a la superficie en CPT-2.
El Glu 487 y el Glu 500 de
CPT-2, que están conservados en todas las carnitina
aciltransferasas, se han implicado en la unión al sustrato y la
catálisis por medio de análisis de mutantes (Zheng, G., et
al., Identification by mutagenesis of a conserved glutamate
(Glu487) residue important for catalytic activity in rat liver
carnitine palmitoyltransferase II. J. Biol. Chem., 277,
42219-42223 (2002)). La estructura cristalina de
CPT-2 revela, además, que el Glu 487 está
localizado en la parte del túnel del centro activo que aloja al CoA.
El Glu 487 junto con el Asp 464 altamente conservado forma una
región cargada negativamente, que probablemente es necesaria para
guiar los sustratos hacia el centro activo. La cadena lateral del
Glu 500 interacciona con la cadena principal de la Arg 554
conservada, que es un componente decisivo de la red de hidrógeno
necesaria para la unión de la porción carnitina de los sustratos de
la aciltransferasa.
En las estructuras apo las cadenas laterales de
la Tyr 120 y la His 372 catalítica están desordenadas a pesar de la
mayor calidad del conjunto de datos y de la resolución del análisis
de la estructura. Aquellos residuos del centro activo que
interaccionan con el grupo principal hidrofílico aminocarnitina del
ST1326, así como la Ser 590, están alejados del punto de unión al
ligando, pero la forma general del túnel del centro activo está
preformada en la apoen-
zima.
zima.
La enfermedad clínicamente heterogénea de
deficiencia de CPT-2 la causan varias mutaciones en
el gen de la CPT-2 y se hereda de una manera
autosómica recesiva (Bonnefont, J-P. et al.
Carnitine palmitoyltransferases 1 and 2: biochemical, molecular and
medical aspects. Mol. Aspects Med., 25, 495-520
(2004)); Bonnefont, J-P et al. Carnitine
palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68,
424-440 (1999)). Dos manifestaciones diferentes del
trastorno pueden distinguirse en base al momento de aparición, es
decir, la aparición temprana (neonatal o infantil) y la forma
adulta de deficiencia de CPT-2, más frecuente. La
forma de aparición temprana se caracteriza por una sintomatología
grave, lo que incluye cardiomiopatía e hipoglucemia hipocetótica y
se ha relacionado con el fallo hepático agudo en el síndrome de
muerte súbita infantil (Demaugre, F. et al. Infantil form of
carnitine palmitoyltransferase II deficiency with hepatomuscular
symptoms and sudden death. Physiopathological approach to carnitine
palmitoyltransferase II deficiencies. J. Clin. Invest., 87,
859-864 (1991)). Los síntomas clínicos de la
deficiencia de CPT-2 en el adulto son mialgia
recurrente y mioglobinuria en respuesta al ayuno y al
ejercicio.
Se han identificado más de 30 mutaciones
puntuales en la región codificante de CPT-2 que
producen cambios de un único aminoácido en la enzima, además de
deleciones/inserciones que causan cambios en el marco de lectura o
formas truncadas de la proteína. Mientras que el gen
CPT-2 truncado inevitablemente conduce a una
presentación neonatal severa de la deficiencia de
CPT-2 por pérdida de la función de
CPT-2, se hace obvia una correlación gradual del
genotipo y la severidad del fenotipo clínico para las mutaciones de
cambio de sentido que se han descrito en homozigosis (Tabla 2)
(Bonnefont, J.P. et al. Carnitine palmitoyltransferase
deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68, 424-440
(1999)); Thuillier, L. et al. Correlation between genotype,
metabolic data, and clinical presentation in carnitine
palmitoyltransferase 2 (CPT-2) deficiency. Hum.
Mutat., 21, 493-501 (2003)). Una excepción a esa
correlación es la mutación Arg 631 Cys, que se ha identificado en
pacientes homocigotos, tanto con la forma adulta como en la forma
infantil de la deficiencia de CPT-2. La estructura
cristalina de CPT-2 permite el mapado y la
interpretación de los efectos de las mutaciones descritas (resumido
en la Tabla 2). La mayoría de casos (60%) de deficiencia de
CPT-2 en adultos están asociados con la mutación Ser
113 Leu. La Ser 113 se localiza en el extremo aminoterminal de la
hélice 5\alpha cerca de la interfaz del dominio. La cadena
lateral de la Ser 113 no tiene ningún contacto directo con los
aminoácidos circundantes pero la mutación de ese residuo a una Leu,
de mayor tamaño e hidrofóbica, altera la interacción con la Phe 117
vecina. Esto cambia la posición y el entorno de los residuos
catalíticamente importantes Trp 116 y Arg 498, dando lugar a una
enzima menos activa (Taroni, F. et al. Identification of a
common mutation in the carnitine palmitoyltransferase II gene in
familial recurrent myoglobinurua patients. Nat. Genet., 4,
314-320 (1993)).
314-320 (1993)).
\newpage
El Asp 213 y el Glu 487 están afectados por
mutaciones que ocurren de manera natural y se ha determinado que
son importantes para la función de CPT-2 mediante
análisis bioquímicos (Zheng, G. et al., Identification by
mutagenesis of a conserved glutamate (Glu487) residue important for
catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II.
J. Biol. Chem., 277, 42219-42223 (2002); Liu, H.,
et al. Cysteine-scanning mutagenesis of
muscle carnitine palmitoyltransferase I reveals a single custeine
residue (Cys-305) is important for catalysis. J.
Bol. Chem., 280, 4524-4531 (2005)). El Asp 213 se
localiza en un lazo entre \beta3 y \alpha10 de
CPT-2 y se alinea con una cisteína conservada en
todas las isoformas humanas de CPT-1. La mutación de
esta cisteína a Ala anula completamente la actividad enzimática en
la M-CPT-1 humana, lo que indica que
esa posición es crucial para la integridad estructural de todas las
isoformas de CPT. En la CPT-2 la cadena lateral del
Asp 213 tiene una fuerte interacción con el nitrógeno de la cadena
principal de la His 496. Esto es importante para el posicionamiento
de la Arg 498 y Arg 499 que están implicadas en la unión al
sustrato. La mutación de Glu 487 a ácido aspártico en la \beta13
conduce a una pérdida casi completa de la actividad de
CPT-2. Esta mutación puede interferir con la unión
a CoA, puesto que el Glu 487 forma parte de la superficie del túnel
de CoA. A partir de la estructura cristalina de
CPT-2 se puede predecir que un ácido aspártico en la
posición 487 formaría un puente de hidrógeno fuerte con la cadena
lateral de la Thr 589 del motivo conservado STS, deformando de ese
modo la geometría del centro activo. Un intercambio Glu 487 Lys es
una de las 6 mutaciones identificadas en la deficiencia de
CPT-2 que causa un trastorno de los puentes salinos
internos o interacciones de los puentes de hidrógeno que están
completamente conservadas en la CPT-1, CrAT y CrOT
(Tabla 2). El nitrógeno guanidino de la Arg 296 establece un
contacto fuerte (2,7 \ring{A}) con un oxígeno de la cadena lateral
del Asp 353, que está conservado en las carnitina aciltransferasas.
Se ha propuesto que el residuo equivalente en la
M-CPT-1, Asp 454, formaría parte de
la tríada catalítica (Liu, H., et al.,
Cysteine-scanning mutagénesis of muscle carnitine
palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue
(Cys-305) is important for catalysis. J. Biol.
Biochem., 280, 4524-4531 (2005)), mientras que la
estructura cristalina de CPT-2 implica este residuo
en la formación de un puente salino conservado. Ninguno de los
mutantes descritos asociados con la deficiencia de
CPT-2 está localizado en el inserto, aunque están
distribuidos uniformemente en la estructura terciaria.
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La numeración de los residuos para las isoformas
de humano y rata son idénticas. Las mutaciones homozigotas marcadas
como A están asociadas con la aparición tardía o forma adulta de la
deficiencia de CPT-2, aquellas marcadas como I con
la aparición temprana o presentación infantil.
Los cristales apo, derivados y
co-cristales de la invención pueden obtenerse
mediante técnicas bien conocidas en la materia de la cristalografía
de proteínas, lo que incluye métodos por lotes (del inglés
"batch"), microlotes (del inglés microbatch) (modificado),
puente líquido, diálisis, de difusión de vapor y por gota colgante
(ver por ejemplo McPherson, 1982, Preparation and Analysis of
Protein Crystals, John Wiley, NY; McPherson, 1990, Eur. J. Biochem.
189: 1-23; Webber, 1991, Adv. Protein Chem. 41:
1-36; Crystallization of Nucleic Acids and Protein,
Edited by Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press;
Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips, Edited by
Terese Bergfors, International University Line, 1999). Generalmente,
los apo- o cocristales de la invención se obtienen mediante la
introducción de un polipéptido de CPT-2
sustancialmente puro en un tampón acuoso que contiene un agente de
precipitación a una concentración justo por debajo de la necesaria
para precipitar la proteína. Entonces se elimina el agua de la
solución por evaporación controlada para conseguir las condiciones
de cristalización, que se mantienen hasta que el crecimiento del
cristal cesa.
Como se utiliza aquí, una "solución acuosa
tamponada" se refiere a una solución basada en agua que contiene
una sustancia que minimiza los cambios de pH de la solución cuando
se añaden un ácido o una base a la solución.
Como se utiliza aquí, un "exceso molar" se
refiere a un número de moléculas de ligando superior al número de
moléculas de proteína.
Como se utiliza aquí, una "difusión de
vapor" se refiere a un método de cristalización de proteínas bien
conocido en la materia en el que se permite que la solución de
cristalización se equilibre con la solución de agente de
precipitación del reservorio a través solamente de la fase
gaseosa.
En una realización preferida de la invención,
los apo o co-cristales se hacen crecer mediante
difusión de vapor. En este método, se permite que la solución de
polipéptido/agente de precipitación se equilibre en un contenedor
cerrado con un reservorio acuoso mayor que posee una concentración
de agente de precipitación óptima para producir cristales.
Generalmente, se mezclan menos de 10 \mul de solución de
polipéptido sustancialmente pura con un volumen igual o similar de
solución del reservorio, lo que da lugar a una concentración de
agente de precipitación sobre la mitad de la necesaria para la
cristalización. Esta solución queda suspendida como una gota debajo
de un cubreobjetos, que se sella encima de un reservorio. El
contenedor sellado se deja reposar, entre un día y un año,
generalmente durante unas 2-6 semanas, hasta que los
cristales crecen.
Para los cristales de la invención, se ha
determinado que las gotas colgantes que contienen unos
2-5 \mul de CPT-2 de rata
[3,75-50 mg/ml de CPT-2 de rata en
Tris/HCl 25 mM a pH 8,0, NaCl 0,15 M, TCEP 2 mM,
n-octilo-\beta-D-glucopiranósido
(\betaOG) al 1% (p/v) o CHAPS al 0,33% (p/v) o
n-dodecil-\beta-D-maltosido
(DMB) 1,15 mM y NaN_{3} al 0,02% (p/v)] que se hacen crecer a
temperatura ambiente (21ºC +/- 2ºC), en una cantidad igual o similar
de solución del reservorio (Índice 21, 37, 67, 69, 75, 76, 79, 88,
90, 91, 92, Hampton Research, además de soluciones derivadas de
éstas por alteraciones del pH o de la concentración de sus
ingredientes), suspendida sobre entre 0,33 y 1,0 mL de tampón del
reservorio durante unos 1-7 días proporcionan
cristales apropiados para la determinación estructural de alta
resolución mediante rayos X. Las condiciones particularmente
preferibles son: un ensayo por microlote (modificado) con unos 0,1
\mul-1 \mul de CPT-2 de rata
(13,5 mg/ml en Tris/HCl 25 mM a pH 8,0, NaCl 0,15 M, TCEP 2 mM y
\beta-D-OG al 1% (p/v))
pre-incubados con un exceso molar de 3 veces de
ST1326, así como los ensayos de gotas colgantes con entre 1 \mul y
5 \mul de CPT-2 de rata (12 mg/ml, a partir de
expresión convencional o como proteína marcada con
seleno-metionina, en Tris/HCl 25 mM a pH 8,0, NaCl
0,15 M, TCEP 2 mM y \beta-D-OG al
1% (p/v)) mezclados con entre 0,5 \mul y 2 \mul de solución de
agente de precipitación Índice 91 (Hampton Research) sobre entre
0,33 ml y 1,0 ml de solución del reservorio (Índice 91, Hampton
Research).
Todos los cristales que se hicieron crecer en
gotas colgantes se sumergieron en la respectiva solución de origen
suplementada con polietilenglicol 200 (PEG 200) entre el 20% (p/v) y
el 30% (p/v) y con la concentración de ligando apropiada en el caso
de las estructuras complejas, previamente a la congelación en
nitrógeno líquido o del montaje en un goniómetro equipado con un
dispositivo de enfriamiento por nitrógeno líquido.
Los cristales que se han hecho crecer utilizando
el método por microlote se congelaron como se ha descrito para los
cristales que se han hecho crecer en gotas colgantes o bien se
intercambió la solución de origen y el aceite que rodean el cristal
por aceite de parafina al 100% (p/v).
A partir de los cristales congelados se
obtuvieron los datos de difracción típicamente hasta 2,0 \ring{A}
en la línea de luz del sincrotrón X10SA (PX1) o X10SA (PX2) en el
SLS, Villigen, Suiza. Bajo óptimas condiciones, se registraron
datos de hasta 1,6 \ring{A}.
Por supuesto, los expertos en la materia
reconocerán que las condiciones de cristalización previamente
descritas pueden variarse. Tales variaciones pueden introducirse
solas o en combinación, e incluyen las soluciones de polipéptidos
que contienen concentraciones de polipéptidos entre 1 mg/ml y 60
mg/mL, cualquier sistema de tampón disponible comercialmente que
pueda mantener el pH desde alrededor de 3,0 a alrededor de 11,0,
componentes reductores en varias concentraciones (ditiotreitol,
ditioeritol, \beta-mercapto-etanol
u otros equivalentes reconocidos en la materia), componentes
estabilizantes como azúcares o gliceroles en concentraciones entre
el 0% (p/v) y el 30% (p/v) o la sustitución con otros ligandos
conocidos que se unen a CPT-2. Las soluciones de
agente de precipitación y del reservorio contienen concentraciones
de polietilenglicol (PEG) entre un 1% (p/v) y un 30% (p/v), con
polietilenglicol de peso
molecular promedio entre alrededor de 200 y alrededor de 20.000 daltons, y la temperatura oscila entre 4ºC y 30ºC.
molecular promedio entre alrededor de 200 y alrededor de 20.000 daltons, y la temperatura oscila entre 4ºC y 30ºC.
Así, la presente invención también se relaciona
con un proceso para co-cristalizar
CPT-2 con un ligando que se une al centro activo,
cuyo proceso consta de proporcionar una solución acuosa tamponada de
entre 3,75 y 50 mg/ml de CPT-2, añadir un exceso
molar del ligando a una solución acuosa de CPT-2, y
hacer crecer los cristales por difusión de vapor o microlote
utilizando una solución del reservorio tamponada con PEG entre el 0%
y el 30% (p/v), en la que el PEG tiene un peso molecular promedio
de entre 200 Da y 20000 Da. El PEG puede añadirse como éster de
monometilo. Puede utilizarse PEG con un peso molecular promedio de
entre 500 Da y 5.000 Da. La solución del reservorio tamponada
también consta de citrato triamónico entre 0 M y 2 M a pH 7,
L-prolina entre 0 M y 1 M, N-óxido de trimetilamina
entre 0 M y 1 M, sulfato de amonio entre 0 M y 1 M, sulfato de litio
entre 0 M y 1 M, acetato amónico entre 0 M y 1 M, formato sódico o
magnésico entre 0 M y 1 M, y ácido D/L-málico entre
0 M y 1 M a pH 7. Dicho ensayo por microlote puede ser modificado.
La presente invención además está relacionada con los cristales
producidos mediante el proceso previamente descrito.
Los cristales derivados de la invención pueden
obtenerse sumergiendo apo- o co-cristales en una
solución de origen que contiene sales de átomos de metales pesados,
según los procedimientos conocidos para los expertos en la materia
de la cristalografía de rayos X.
Los co-cristales de la invención
pueden obtenerse sumergiendo un apo-cristal o un
cristal de CPT-2 con un ligando de baja afinidad en
la solución de origen o en cualquier otra solución estabilizante que
contenga un ligando que se una al centro activo, o puede obtenerse
co-cristalizando el polipéptido
CPT-2 en presencia de uno o más ligandos que se
unen al centro activo.
Los métodos para obtener la estructura
cristalina tridimensional de CPT-2 descrita aquí,
así como las coordenadas atómicas de la estructura, son bien
conocidos en la materia (véase por ejemplo D.E. McRee, Practical
Protein Crystallography, publicado por Academic Press, San Diego
(1993), y las referencias que se citan en éste).
Los cristales de la invención, y particularmente
las coordenadas atómicas de la estructura obtenidas de los mismos,
tienen una amplia variedad de usos. Por ejemplo, los cristales y
coordenadas de estructura descritos aquí son particularmente útiles
para identificar compuestos que inhiben o modifican en general la
actividad de CPT-2 como una aproximación para el
desarrollo de nuevos agentes terapéuticos.
Las coordenadas de estructura aquí descritas
pueden ser usadas como modelos de fase en la determinación de otras
estructuras cristalinas de CPT-2 naturales o
mutadas, así como las estructuras de co-cristales de
tal CPT-2 con inhibidores o activadores unidos. Las
coordenadas de estructura, así como los modelos tridimensionales de
las estructuras que se obtienen de las mismas, también pueden
utilizarse como ayuda en la elucidación de las estructuras en
solución de la CPT-2 natural o mutada, como las
obtenidas mediante RMN. Por lo tanto, los cristales y coordenadas
atómicas de la estructura de la invención proporcionan una forma
conveniente para elucidar las estructuras y funciones de
CPT-2.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un método para identificar compuestos que pueden unirse
a la proteína CPT-2, que comprende los pasos de:
aplicar un algoritmo de modelado molecular tridimensional a las
coordenadas atómicas de la proteína CPT-2 que se
muestran en las Fig. 4 o 5 para determinar las coordenadas
espaciales del bolsillo de unión de la proteína
CPT-2; y escanear electrónicamente las coordenadas
espaciales almacenadas de un conjunto de compuestos candidatos
frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de la
proteína CPT-2 para identificar los compuestos que
pueden unirse a la proteína CPT-2.
En una realización de los cristales,
co-cristales, métodos y procesos aquí descritos
anteriormente, dicha proteína CPT-2 es una proteína
CPT-2 de rata. Además, dicha proteína
CPT-2 de rata puede ser la proteína del Id. de Sec.
Nº2.
Con el propósito de clarificar y como discusión,
los cristales de la invención se describen haciendo referencia a
ejemplos de apo-cristales y
co-cristales específicos de CPT-2.
Los expertos en la materia apreciarán que los principios descritos
aquí pueden aplicarse en general a cristales de
CPT-2 de cualquier mamífero, lo que incluye pero no
se limita a la CPT-2 del Id. de Sec. Nº2.
Como se utiliza aquí,
"apo-cristal" se refiere a los cristales de
CPT-2 formados sin la adición de ligandos
específicos.
Figura 1. Estructura de la CPT-2
de rata con ST1326 unido al centro activo. El ligando ST1326 y su
mapa fofc de densidad electrónica de hibridación simulada
circundante (acotado a 2,5\sigma) se representan en rosa en
A-C. A, ST1326 se une a la interfaz de los dominios
aminoterminal (naranja) y carboxiterminal (cian) de la
CPT-2 de rata. B, las láminas \beta centrales
(azul) están rodeadas por hélices \alpha (verde), el inserto
específico de CPT-2 (rojo) sobresale del dominio
aminoterminal. C, igual a B pero rotado 90º hacia atrás.
Figura 2. Alineamiento de la secuencia de
aminoácidos de la CPT-2 de rata
(rCPT-2) y la CPT-1 humana
(hCPT-1). Se indican los elementos de la estructura
secundaria (E.S). La numeración de los residuos corresponde a la
del precursor de la rCPT-2 y su secuencia de
importación mitocondrial está en cursiva. El inserto específico de
CPT-2 (aminoácidos 179-208) está
subrayado. Los residuos clave del sitio de unión de acilcarnitina de
la rCPT-2 están en negrita y marcados con * cuando
están completamente conservados en la hCPT-1. Los
residuos que se han descrito mutados en la deficiencia de
CPT-2 se imprimen en rojo.
Figura 3. A, Figura estereográfica del túnel del
centro activo visto en perpendicular a la interfaz del dominio. Los
residuos clave del centro activo están indicados en amarillo. El
ST1326 co-cristalizado se muestra en rosa y una
molécula de CoA (azul) se modeló en base a las coordenadas de CoA
obtenidas a partir de la estructura del complejo
CrAT-CoA (código PDB 1t7q). B, proyección de Fischer
de ST1326 con numeración atómica.
Figura 4. Coordenadas del cristal apo1
(C222_{1}).
Figura 5. Coordenadas del cristal apo 1
(P4_{3}2_{1}2).
Figura 6. Coordenadas del
co-cristal de CPT-2/ST1316.
El DNA que codifica los aminoácidos
27-658 de la CPT-2 de rata (cedido
por V.A. Zammit, Hannah Research Institute, Ayr, Escocia) se
subclonó en un vector pET28a de Novagen. Esa construcción se utilizó
para expresar la secuencia completa de CPT-2
(exento de la secuencia de importación mitocondrial, aminoácidos
1-26 del precursor de CPT-2) en la
cepa de E. coli BL21DE3 a 20ºC. Tras la lisis celular el
lisado (en HEPES/NaOH 50 mM a pH 8, NaCl 0,15 M, TCEP 5 mM,
MgCl_{2}10 mM, DNAsa I 30 mg/l, inhibidor de proteasa completo de
Roche 30 cucharadas/l) se ajustó con
Triton-X-100 al 0,1% (v/v). Tras la
solubilización y la centrifugación (30,000 g, 45 min.) se realizó
una cromatografía de afinidad a metal inmovilizado en una resina de
Ni-NTA. El detergente se intercambió a
n-octilo-\beta-D-glucopiranósido
(\betaOG) al 1% (v/v) en la columna. El eluído del paso de IMAC se
sometió a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño
equilibrada con Tris/HCl 25 mM a pH 8, NaCl 0,15 M, TCEP 2 mM,
\betaOG al 1% (v/v), NaN_{3} 0,02% (p/v)). La
ESI-MS confirmó la identidad de
CPT-II y mostró que la proteína estaba modificada
mediante \alpha-N-glucosilación
aminoterminal (Geoghegan, K.F. et al. Spontaneous
alpha-N-6-phosphogluconoylation
of a "His-tag" in Escherichia coli: the
cause of extra mass of 258 or 178 Da in fusion proteins. Anal.
Biochem., 267, 169-184 (1999)) (datos no mostrados).
La cola de His no se escindía con trombina. Una fermentación de 10
L (45 g de biomasa) dio un rendimiento de 30 mg de proteína
electroforéticamente pura, monomérica y monodispersa.
Se obtuvieron cristales de apo
CPT-2 y del complejo ST1326
[(R)-N-tetradecilcarbamoil-aminocarnitina]
(en solución de reserva de H_{2}O/NaOH 33 mM en) a una
concentración de proteína de 15 mg/ml (en Tris/HCl 25 mM a pH 8,0,
NaCl 150 mM, TCEP 2 mM,
n-octilo-\beta-D-glucopiranósido
(\betaOG) al 1% (p/v) y NaN_{3} 0,2% (p/v)) y a 21ºC usando los
métodos de gota colgante con PEG 1500 al 25% (p/v) o de microlote
modificado (D'Arcy, A. et al., The advantages of using a
modified microbatch method for rapid screening of protein
crystallization conditions. Acta Cryst. D59,
396-399 (2003)) con ácido DL-málico
0,15 M a pH 7,0, PEG 3350 al 20% (p/v), respectivamente (Índice 37
y 91, Hampton Research). Para la formación del complejo
CPT-2 se incubó con un exceso molar de 3 veces de
inhibidor ST1326 durante 3 h en hielo previamente a la
cristalización. Los cristales se congelaron al instante en
nitrógeno líquido tras inmersiones de 30s en la solución de origen
suplementada con PEG 200 al 25% (p/v) (apo) o intercambiando el
exceso de solución de origen y aceite de Al con aceite de parafina
al 100% (v/v) (ST1326).
El conjunto de datos para apo
CPT-2 y el complejo ST1326 se recogieron en una
línea de luz X10SA en SLS, Villigen, Suiza. Las mediciones se
hicieron a 100K con una \lambda = 0,97853 \ring{A} (apo, pico de
longitud de onda de Se) y una \lambda = 1.008 \ring{A}
(ST1326). El conjunto de datos se procesó y escaló con el XDS
(Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from
crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl.
Cryst., 26, 795-800 (1993)). El grupo espacial se
determinó era P4_{3}2_{1}2 (apo tetragonal, a = b = 67,6, c =
307,3, \alpha = \beta = \gamma = 90º, Coef. de Matthews = 2,4
(Matthews, B. W. J. Mol. Biol., 33, 491-497
(1968))), C222_{1} (apo ortorrómbico, a = 95,2, b = 97,3, c =
310,4, Coef. de Matthews = 2,4) y P2_{1}2_{1}2_{1} (ST1326, a
= 85,8, b = 96,2, c = 124,3, \alpha = \beta = \gamma = 90º,
Coef. de Matthews = 3,5). Los primeros cristales de apo
CPT-2 difractaron a una resolución de 1,9 \ring{A}
pero el grupo espacial no pudo asignarse de forma inequívoca. Por
el contrario, los apo-cristales obtenidos a partir
de material marcado con selenio-metionina mediante
procedimientos estándar (Chene, C. et al. Crystallization of
the complex of human IFN-gamma and the extracellular
domain of the IFN-gamma receptor. Proteins, 23,
591-594 (1995)) eran de una calidad de difracción
superior, que podía atribuirse a una mayor calidad de la proteína
debido a la diferente composición del medio y al perfil de expresión
de la proteína bacteriano durante el marcado.
El estadístico de rechazo XDS presenta un 0,26%
de desajustes rechazados que apoyan completamente la elección de
P2_{1}2_{1}2_{1} como el grupo espacial correcto para el
complejo cristalino a pesar del valor bastante más elevado para
R_{conjunta} de 16,7%. Los datos estadísticos están resumidos en
la Tabla 1. Ambas formas cristalinas contienen una molécula de
CPT-2 por unidad asimétrica.
Solución de la estructura y refinado. El
reemplazo molecular se realizó usando AmoRe en la interfaz de CCP4
(Navazza, J. AMoRe: a new Package for molecular replacement, in
Molecular replacement. Proceedings of the CCP4 Study Weekend,
87-90, Daresbury Laboratory, Warrington, Inglaterra
(1992); Collaborative Computational Project, Número 4. The CCP4
suite: Programs for protein crystallography. Acta Cryst., D50,
760-763 (1994)). Para el complejo ST1326 se
construyó un modelo con homología al CPT-2 de rata
con XSAE (C. Broger, F. Hoffman La-Roche) basado en
la CrAT de ratón (Hsiao, Y.S. et al. Structural and
biochemical Studies of the substrate selectivity of carnitine
acetyltransferase. J. Biol. Chem., 279, 31584-31589
(2004)) (código PDB 1t7n) y sirvió como modelo de búsqueda. La
solución se refinó mediante hibridación simulada con CNS (Brünger,
A.T. X-PLOR Manual Versión 3.1. New Have, CT, USA,
Yale University Press (1992)). El modelo final se obtuvo utilizando
ciclos iterativos de construcción de modelos en MOLOC (Gerber, P. R.
Peptidemechanics: a force field for peptides and proteins working
with entire residues as small units. Biopolymers, 32,
1003-1017 (1992)), construcción de solventes en
auto BUSTER (Roversi, P. et al., Modelling prior
distributions of atoms for macromolecular refinement and
completion. Acta Cryst. D56, 1316-1323 (2000) y
refinado en Refmac (Murshudow, G.N., Vagin, A.A., Lebedev, A.,
Wilson, K.S y Dodson, E.J. Efficient anisotropic refinement of
macromolecular structures using FFT. Acta Cryst., D55,
247-255 (1999)). A pesar del marcaje con Se, la
apoestructura también se resolvió mediante reemplazo molecular
usando la estructura del complejo refinado como modelo de búsqueda,
seguido por la construcción automatizada del modelo con Arp/wArp
(Perrakis, A., et al. Automated protein model building
combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol., 6,
458-463 (1999)) y ciclos iterativos Refmac y MOLOC.
Para la apoestructura ortorrómbica (tetragonal) el 94,0% (92,7%) de
los residuos se sitúan en las regiones más favorables y el 5,4%
(6,8%) en las regiones adicionalmente permitidas del Diagrama de
Ramachandran. Para la estructura del complejo ST1326 estos valores
son del 88,2% y 11,3%, respectivamente. La Arg 498 (región
ampliamente permitida) y la Leu 129 así como el Asn 230 (anomalía de
Ramachandran) explican las diferencias del 100%.
El refinado estadístico está resumido en la
Tabla 1. Las Figuras con representaciones de moléculas se han
realizado con PyMol (Delano, W. L. The PyMOL User's Manual, Delano
Scientific, San Carlos, CA, USA (2002) y MOE (Chemical Computing
Group Inc. MOE, 1010 Sherbrooke Street West, Suite 910, Montreal,
Canadá, H3A 2R7).
<110> F. Hoffman-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Cristales de
CPT-2
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 23284
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 658
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CPT-2 de rata
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (658)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Swissprot Nº registro P18886
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CPT-1 madura de
rata
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (632)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> la posición 1 corresponde a la
posición 27 del Id de Sec. Nº1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (6)
1. Un cristal de la proteína
CPT-2, en el que el cristal tiene unas dimensiones
de celda unitaria de a = b= de 66 \ring{A} a 70 \ring{A}, c =
de 302 \ring{A} a 312 \ring{A}; \alpha = \beta = \gamma=
90º, y el cristal tiene simetría P4_{3}2_{1}2.
2. Un cristal de la proteína
CPT-2, en el que el cristal tiene unas dimensiones
de celda unitaria de a = de 93 \ring{A} a 97 \ring{A}, b= de 94
\ring{A} a 98 \ring{A}, c = de 304 \ring{A} a 312 \ring{A};
\alpha = \beta = \gamma= 90º, y el cristal tiene simetría
C222_{1}.
3. Un co-cristal de la proteína
CPT-2 y un ligando unido al centro activo de
CPT-2, en el que el co-cristal
tiene unas dimensiones de celda unitaria de a = de 83 \ring{A} a
87 \ring{A}, b = de 94 \ring{A} a 98 \ring{A}, c de 121
\ring{A} a 127 \ring{A}; \alpha = \beta = \gamma= 90º, y
el cristal tiene simetría P2_{1}2_{1}2_{1}.
4. Un método para la identificación de
compuestos que pueden unirse a la proteína CPT-2 que
comprende los pasos de:
aplicar un algoritmo de modelado molecular
tridimensional a las coordenadas atómicas de la proteína
CPT-2 que se muestran en la Fig. 4 o 5 para
determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión a la
proteína CPT-2; y
escanear electrónicamente las coordenadas
espaciales almacenadas de un conjunto de compuestos candidatos
contra las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de la
proteína CPT-2 para identificar un compuesto que
pueda unirse a la proteína CPT-2.
5. Un proceso para
co-cristalizar CPT-2 con un ligando
que se une al centro activo que comprende
proporcionar una solución acuosa tamponada, de
CPT-2 a entre 3,75 a 50 mg/ml,
añadir un exceso molar del ligando a la solución
acuosa de CPT-2, y
hacer crecer los cristales por difusión de vapor
o microlote utilizando una solución de reserva tamponada con PEG
entre el 0% y el 30% (p/v), en la que el PEG tiene un peso molecular
promedio de 200 Da a 20.000 Da.
6. El proceso de la reivindicación 5, en el que
el tampón de reserva consta adicionalmente de citrato de triamonio
de 0 M a 2 M a pH 7, L-prolina de 0 M a 1 M, N-óxido
de trimetilamina de 0 M a 1 M, sulfato amónico de 0 M a 1 M,
sulfato de litio de 0 M a 1 M, acetato amónico de 0 M a 1 M, formato
sódico o magnésico de 0 M a 1 M y ácido D/L-málico
de 0 M a 1 M a pH 7.
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