ES2317939T3 - Oligonucleotidos para marcar sondas oligonucleotidicas y proteinas. - Google Patents
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Abstract
Una sonda oligonucleotídica sintética que comprende un primer dominio que tiene un dominio marcador compuesto por una secuencia no específica de gen de un polímero de la secuencia repetitiva (CTATTTT)n, y un segundo dominio que comprende un dominio diana que tiene una secuencia diana específica de gen, donde el dominio marcador está marcado de forma detectable.
Description
Oligonucleótidos para marcar sondas
oligonucleotídicas y proteínas.
Esta invención se refiere a sondas
oligonucleotídicas y colecciones de sondas oligonucleotídicas para
detectar o localizar dianas génicas de ácido nucleico dentro de una
muestra celular o tisular. En particular, la invención se refiere a
colecciones de oligosondas.
El análisis in situ incluye hibridación
in situ e inmunohistoquímica. La hibridación in situ
(ISH) emplea moléculas sonda de ADN o ARN marcadas que son
anti-sentido para una secuencia génica diana o
transcrito para detectar o localizar genes diana de ácido nucleico
diana dentro de una muestra celular o tisular. Se ha demostrado que
la ISH es una herramienta útil en varios campos biomédicos,
incluyendo biología del desarrollo, biología celular, y biología
molecular. La ISH se ha usado, por ejemplo, para diagnosticar
trastornos genéticos, mapear genes, estudiar la expresión génica, y
localizar sitios de expresión de genes diana.
Típicamente, la ISH se realiza exponiendo una
muestra celular o tisular inmovilizada sobre un portaobjetos de
vidrio a una sonda de ácido nucleico marcada que es capaz de
hibridar específicamente con un gen diana dado en la muestra
celular o tisular (In Situ Hybridization: Medical
Applications (G. R. Coulton y J. de Belleroche, eds., Kluwer
Academic Publishers, 1992); In Situ Hybridization: In
Neurobiology; Advances in Methodology (J. H. Eberwine, K. L.
Valentino, y J. D. Barchas, eds., Oxford University Press, 1994);
In Situ Hybridization: A Practical Approach (D. G.
Wilkinson, ed., Oxford University Press, 1992)). La hibridación de
moléculas sonda marcadas con ácidos nucleicos en la muestra celular
o tisular después puede detectarse usando, por ejemplo, métodos de
detección directa basada en radiactividad, métodos de detección
directa basada en fluorescencia, o métodos de detección indirecta
basados en la unión de una proteína marcada con fluorescencia que
se une a un hapteno tal como BrdU, nucleótidos marcados con
digoxigenina o marcados con biotina incorporados en sondas. Los
métodos basados en haptenos se han ampliado adicionalmente para que
incluyan aquellas moléculas a unir por conjugados
proteína-enzima de unión tales como conjugados
anticuerpo-enzima y química de detección basada en
colorimetría. Además, pueden analizarse varios genes diana
simultáneamente exponiendo una muestra celular o tisular a una
pluralidad de sondas de ácido nucleico que se ha marcado con una
pluralidad de diferentes marcas de ácido nucleico. Por ejemplo,
puede marcarse una pluralidad de sondas de ácido nucleico con una
pluralidad de compuestos fluorescentes que tienen diferentes
longitudes de onda de emisión, permitiendo de este modo el análisis
multicoloreado simultáneo a realizar en una única etapa sobre una
única muestra celular o tisular diana.
Un problema significativo asociado con la
incorporación de nucleótidos marcados en sondas oligonucleotídicas
es que los restos de conjugación que se unen al nucleótido
habitualmente impiden la formación de apareamiento de bases de
Watson-Crick, afectando de este modo de forma
negativa a la hibridación de la sonda con su diana. Esto se ha
observado con el uso de marcadores unidos mediante nucleótidos
citosina N4-sustituidos, a causa del impedimento
estérico y el desplazamiento esperado al estado menos reactivo de
una amina secundaria (como se observa con citosina N4 marcada), en
comparación con el enlace G-C natural formado con
una citosina no sustituida (una amina primaria). Cualquier pequeño
cambio o interferencia con la unión G-C en un
pequeño oligonucleótido (de 25 a 50 bases) puede reducir la
capacidad de estos oligos de hibridar con la secuencia diana
pretendida.
Sigue existiendo la necesidad en la técnica de
desarrollar diseños de sondas adecuadas para incorporar nucleótidos
marcados en sondas oligonucleotídicas. Se demuestra que unas pocas
secuencias artificiales son alternativas viables para el marcaje de
sondas y también funcionan tanto individualmente como en mezclas de
sondas oligonucleotídicas complejas para detectar o localizar genes
diana de ácido nucleico dentro de una muestra celular o tisular. El
desarrollo de dichas secuencias genéricas y la estrategia de marcaje
para colecciones de sondas tienen amplia aplicación en las técnicas
médica, genética, y de biología molecular.
Esta interferencia debida a la química de
marcaje y la rigurosidad y la cinética de hibridación se resuelve
en este documento diseñando el oligo para que tenga al menos dos
dominio funcionales distintos, un dominio o secuencia que sea
específico de gen y esté implicado en la formación de pares de
bases, y el segundo dominio que sea una secuencia artificial, no
específica (con referencia al genoma de la muestra) comprendido de
nucleótidos espaciados y el nucleótido marcado. Estos elementos se
posicionan de tal modo que estos oligonucleótidos marcadores son
más accesibles como haptenos para las proteínas de unión
(inmunoglobulina(s) o avidina(s)) y por tanto no
impiden el apareamiento de bases de Watson-Crick en
el dominio específico de gen.
La presente invención proporciona una nueva
estrategia para incorporar un marcador en sondas oligonucleotídicas
y colecciones de sondas oligonucleotídicas marcadas para detectar o
localizar genes diana de ácido nucleico dentro de una muestra
celular o tisular. En particular, la presente invención proporciona
sondas oligonucleotídicas sintéticas caracterizadas en las
reivindicaciones. La invención se refiere a secuencias no
específicas de gen usando fórmulas de secuencia para hacer
polímeros repetitivos de dichas secuencias que pueden incorporarse
en colecciones de sondas oligonucleotídicas para su uso en análisis
de hibridación in situ. Además, el uso de polímeros
oligonucleotídicos sintéticos marcados, basados en fórmulas de
secuencia, cuando se conjugan con proteínas de unión, es decir
inmunoglobulinas, es un proceso muy eficaz y controlado para marcar
dichas proteínas usadas en análisis inmunohistoquímico. La presente
invención proporciona colecciones o "cócteles" de sondas
oligonucleotídicas para detectar o localizar genes diana de ácido
nucleico específicos dentro de una muestra celular o tisular. El
cóctel es útil para detectar el gen Kappa (SEC ID Nº
1-16 inclusive).
La invención también se refiere a un conjunto de
sondas para detectar el ARNm de cadena ligera de la inmunoglobulina
Kappa o ARN heteronuclear correspondiente donde las sondas se
seleccionan entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 401 a 416,
inclusive.
Las realizaciones preferidas específicas de la
presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la
siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones
preferidas y las reivindicaciones.
La Figura 1 ilustra una estructura de sonda
genérica del diseño de sonda de dos dominios. Este es el diseño de
oligonucleótido usado para las sondas en los cócteles específicos de
gen descritos en los siguientes ejemplos. Cada sonda está compuesta
por dos dominios: un dominio de marcaje 5' y un dominio específico
de gen diana 3'. El dominio de marcaje consta de esta secuencia
específica (CTATTTT)n, donde cada citosina puede estar
marcada con un fluoróforo o un conjugado
citosina-hapteno, siendo el hapteno fluoresceína en
esta realización. Esta ilustración muestra específicamente las
secuencias de ácido nucleico para las sondas 301 (SEC ID Nº 55) y
302 (SEC ID Nº 56), cada una de las cuales tiene dominios
específicos del gen diana correspondientes a secuencias Alu
repetitivas humanas y dominios de marcaje que tienen un hapteno
fluoresceína.
La Figura 2 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de hibridación in situ (ISH) de
tejido cutáneo humano usando una sonda que comprende el dominio de
marcaje (sonda 330; SEC ID Nº 58). La ausencia de una señal
detectable indica que la fórmula de secuencia, (CTATTTT)n,
del dominio de marcaje común a los oligonucleótidos usados en estos
ejemplos de ISH es no específica, y no reactiva en su capacidad de
formar apareamientos de bases de Watson-Crick con
secuencias de ácido nucleico humanas porque no hibridan.
La Figura 3 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido cutáneo humano usando una sonda
que comprende el dominio de marcaje y un dominio específico de gen
diana poli d(T) (sonda 320; SEC ID Nº 57). La presencia de
una señal detectable localizada en el citoplasma indica que esta
sonda es capaz de hibridar específicamente son la región
poliadenilada del ARN mensajero.
Las Figuras 4A-4B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido cutáneo
humano usando la sonda 320, donde la muestra tisular no se trató
con ribonucleasa A antes de la hibridación in situ (A), o se
trató con ribonucleasa A antes de la hibridación in situ (B).
La disminución en la señal detectable en (B) indica que esta sonda
hibrida específicamente con la región poliadenilada común al ARN
mensajero.
Las Figuras 5A-5B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando la sonda 320, donde la hibridación y el lavado
riguroso se realizaron a temperatura ambiente (A), o a 37ºC (B).
Este resultado ilustra que la intensidad de color está relacionada
con la rigurosidad de las condiciones de hibridación, indicando el
color más intenso condiciones menos rigurosas.
La Figura 6 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular Raji humana usando la
sonda 320. Esto muestra que este diseño de sonda también es
funcional con líneas celulares embebidas así como tejido
embebido.
La Figura 7 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular Raji humana usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302.
La Figura 8 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular HT humana usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302.
La Figura 9 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular de rata usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302. La ausencia
de una señal detectable indica que esta colección de sondas es
específica para secuencias de ácido nucleico humanas.
La Figura 10 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular HT humana negativa al
virus Epstein-Barr (EBV) usando una sonda que tiene
un dominio específico de gen diana correspondiente al ARN nuclear
de EBER de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
La Figura 11 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido esplénico humano usando una
colección de sondas compuesta por sondas que tienen dominios
específicos de gen diana correspondientes al ADN nuclear de de EBER
1 y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
La Figura 12 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano usando una
colección de sondas compuesta por sondas que tienen dominios
específicos de gen diana correspondientes al ARN nuclear de EBER 1
y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
Las Figuras 13A-13B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando una colección de sondas compuesta por sondas que
tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al ARN
nuclear de EBER 1 y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54], donde la
muestra tisular no se trató con ribonucleasa A antes de la
hibridación in situ (A), o se trató con ribonucleasa A antes
de la hibridación in situ (B). La disminución en la señal
detectable en (B) indica que esta sonda hibrida específicamente con
el ARN nuclear de EBER 1 y EBER 2 humano.
La Figura 14 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano positivo a la
cadena ligera kappa usando una sonda que tiene un dominio específico
de gen diana correspondiente al ARNm de cadena ligera lambda de
inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 15].
La Figura 15 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejidos de linfoma usando una colección
de sondas compuesta por sondas que tienen dominios específicos de
gen diana correspondientes al ARNm de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 2 - 4, SEC ID Nº 7 - 12, SEC ID Nº
14, 15]. El tejido de linfoma en (A) sobre-expresa
la cadena ligera kappa y el tejido en (B)
sobre-expresa la cadena ligera lambda. La ausencia
de una señal detectable en (B) indica que la colección de sondas de
cadena ligera kappa es específica para el ARNm de cadena ligera
kappa.
La Figura 16 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano positivo a la
cadena ligera lambda usando una sonda que tiene un dominio
específico de gen diana correspondiente al ARNm de la región
variable de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana [SEC
ID Nº 19 a 29].
La Figura 17 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular RPMI 8226 humana
positiva a la cadena ligera lambda usando una colección de sondas
compuesta por sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARNm de cadena ligera lambda de inmunoglobulina
humana [SEC ID Nº 19 a 29].
Las Figuras 18A-18B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando una colección de sondas compuesta por sondas que
tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al ARNm
de cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 19 a
29]. El tejido en (A) sobre-expresa la cadena
ligera lambda y el tejido en (B) sobre-expresa la
cadena ligera kappa. La ausencia de una señal detectable en (B)
indica que la colección de sondas de cadena ligera lambda es
específica para el ARNm de cadena ligera lambda humana.
La Figura 19 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido pulmonar humano positivo a
citomegalovirus (CMV) usando una colección de sondas compuesta por
sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARN temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 -
32, SEC ID Nº 34 - 35, SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50]. [célula
infectada por CMV]
La Figura 20 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular 9G de rata en que la
expresión del ARN temprano inmediato de CMV no se ha inducido por
ciclohexamida usando una colección de sondas compuesta por sondas
que tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al
ARNm temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 - 32, SEC ID Nº 34 -
35, SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50].
Las Figuras 21A-21B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de una línea celular 9G
de rata en que la expresión del ARN temprano inmediato de CMV se ha
inducido por ciclohexamida usando una colección de sondas compuesta
por sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARN temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 -
32, SEC ID Nº 34 - 35, SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50]. El tejido en (A)
se muestra a un aumento de 40X y el tejido en (B) se muestra a un
aumento de 20X.
La presente invención proporciona sondas
oligonucleotídicas y colecciones de sondas oligonucleotídicas para
detectar o localizar genes diana de ácido nucleico dentro de una
muestra celular o tisular. En particular, la invención se refiere a
colecciones de sondas oligonucleotídicas para su uso en análisis de
hibridación in situ.
Más específicamente, esta invención se refiere
al uso de fórmulas de secuencia específicas para polímeros
nucleotídicos o dominios marcadores para unir un resto detectable
(un marcador) a sondas oligonucleotídicas o proteínas. La utilidad
específica de estas secuencias o derivados de las mismas, es la
característica inerte o no reactiva que no hibrida con ADN o ARN
humano a un nivel detectable en condiciones de hibridación de
rigurosidad convencional. Se demostró que estos dominios marcadores
o polímeros eran secuencias genéricas útiles para la incorporación
en sondas oligonucleotídicas para detectar secuencias específicas de
gen dentro de muestras celulares o tisulares en análisis de
hibridación in situ. Además, este conjunto inerte de
secuencias es útil para unir un marcador a inmunoglobulinas u otras
proteínas para detectar haptenos y antígenos en análisis
inmunohistoquímicos.
Como se usa en este documento, los términos
"sonda" o "sonda oligonucleotídica" se refieren a una
molécula de ácido nucleico usada para detectar un gen diana de
ácido nucleico complementario.
Como se usa en este documento, el término
"hibridación" se refiere al proceso por el que secuencias de
ácido nucleico complementarias se unen para formar una molécula de
ácido nucleico bicatenaria. Marcando la molécula de ácido nucleico
diana con, por ejemplo, una marca radiactiva o fluorescente, pueden
detectarse las interacciones entre la sonda y los genes diana.
Las sondas oligonucleotídicas y las sondas
oligonucleotídicas de las colecciones de la presente invención se
sintetizan usando métodos convencionales. Véase, por ejemplo,
Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for
Oligonucleotides and Analogs 165-89 (S. Agrawal,
ed., 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach
87-108 (F. Eckstein, ed., 1991).
En una realización preferida de la presente
invención, las sondas oligonucleotídicas tienen dos dominios
distintos: un dominio 5' (o de marcaje) y un dominio 3' (o diana
específico de gen) (Véase la Figura 1A). En realizaciones más
preferidas de la presente invención, la sonda oligonucleotídica
tiene un dominio de marcaje que consta de la secuencia
(CTATTTT)n. También se muestran otras realizaciones en este
documento, que incluyen una realización de triple dominio que tiene
dos dominios de marcaje terminales, y un dominio diana específico de
gen central. Específicamente, las SEC ID Nº 125 - 126 representan
este esquema de marcaje. Las sondas oligonucleotídicas de la
presente invención se marcan de tal manera que la hibridación entre
dichas sondas y ácidos nucleicos diana en una célula o tejido
particular pueda detectarse. Los marcadores que son aceptables para
su uso en análisis de hibridación in situ (ISH) son
conocidas para los especialistas en la técnica. Dichos marcadores
permiten interacciones entre las sondas y los genes diana a detectar
usando, por ejemplo, métodos de detección directa basados en
radiactividad, métodos de detección directa basados en
fluorescencia, sondas marcadas con digoxigenina o marcadas con
biotina acopladas con métodos de detección basados en fluorescencia,
o sondas marcadas con digoxigenina o marcadas con biotina acopladas
con métodos de detección basados en
anticuerpos-enzimas. En realizaciones preferidas de
la presente invención, las sondas oligonucleotídicas se marcan con
fluoresceína. En realizaciones más preferidas de la presente
invención, la sonda oligonucleotídica tiene un dominio de marcaje
que consta de la secuencia (CTATTTT)n, donde los nucleótidos
de citosina pueden marcarse con un fluoróforo para detección
directa, o un hapteno para detección indirecta. En cualquier caso,
el conjugado de fluoresceína y nucleótido citosina, y la molécula
de fluoresceína se unen en la posición N4 de la citosina a través de
un enlace OBEA (Véase Mishra et al., Patente de Estados
Unidos Nº 5.684.142). De acuerdo con la Patente de Estados Unidos
Nº 5.684.142, un enlace OBEA se basa en
2,2'-oxi-bis(etilamina). En
una realización preferida, la densidad de fluoróforo unido al
dominio marcador es al menos el 7 por ciento en moles,
preferiblemente al menos el 10 por ciento en moles, y mucho más
preferiblemente al menos el 16 por ciento en moles, cuando se mide
frente al dominio marcador solamente. Por ejemplo, si se considera
que la sonda 401 (una sonda de 2 dominios) comprende un dominio
marcador de 30 bases incluyendo una CT 3' terminal donde la C
también está marcada, el porcentaje molar es 5/30 = 16,7 por ciento
en moles de marcador. En la sonda global, el porcentaje molar es
8,3.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se analizan simultáneamente varios genes diana exponiendo
una muestra celular o tisular a una pluralidad de sondas de ácido
nucleico que se han marcado con una pluralidad de diferentes marcas
de ácido nucleico. Por ejemplo, puede marcarse una pluralidad de
sondas de ácido nucleico con una pluralidad de compuestos
fluorescentes que tienen diferentes longitudes de onda de emisión,
permitiendo de este modo realizar el análisis multicoloreado
simultáneo en una única etapa sobre una única muestra celular o
tisular diana.
Las sondas oligonucleotídicas y colecciones de
sondas oligonucleotídicas de la presente invención pueden usarse en
análisis de ISH para detectar o localizar genes diana de ácido
nucleico dentro de una muestra celular o tisular. La ISH puede
realizarse como se describe, por ejemplo, en In Situ
Hybridization: Medical Applications (G. R. Coulton y J. de
Belleroche, eds., Kluwer Academic Publishers, 1992); In Situ
Hybridization: In Neurobiology; Advances in Methodology (J. H.
Eberwine, K. L Valentino, y J. D. Barchas, eds., Oxford University
Press, 1994); o In Situ Hybridization: A Practical Approach
(D. G. Wilkinson, ed., Oxford University Press, 1992)).
La realización preferida de las sondas y
colecciones de sondas de la presente invención se entienden mejor
por referencia a las Figuras 1-21 y los Ejemplos
1-2. Los siguientes Ejemplos son ilustrativos de
realizaciones específicas de la invención, y diversos usos de las
mismas. Se exponen solamente para propósitos explicatorios, y no
deben adoptarse como limitantes de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se diseñaron colecciones de sondas que constan
de una pluralidad de sondas oligonucleotídicas de 55 a 60 bases de
longitud del siguiente modo. En este Ejemplo, cada sonda
oligonucleotídica tenía dos dominios distintos: un dominio 5' (o de
marcaje) y un dominio 3' (o específico de gen diana) (Véase la
Figura 1).
En esta realización, el dominio de marcaje
consta de la secuencia (CTATTTT)n, donde el nucleótido
citosina representa un conjugado
fluoresceína-nucleótido citosina y la molécula
fluoresceína se une en la posición N4 de citosina a través de un
enlace OBEA.
El dominio específico de gen diana consta de una
secuencia de 25-30 bases que es complementaria a un
gen diana de ácido nucleico específico. Se diseñaron sondas
oligonucleotídicas que tenían dominios específicos de gen diana
correspondientes a la región variable de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina humana (Véase la Tabla 1; sondas oligonucleotídicas
401-416), la región variable de cadena ligera lambda
de inmunoglobulina humana (sondas oligonucleotídicas
501-515), secuencias de citomegalovirus humano (CMV)
(sondas oligonucleotídicas 221-241), secuencias de
EBER (ARN temprano de Epstein-Barr) del virus
Epstein-Barr (EBV) humano (sondas oligonucleotídicas
100A2, 100C2, 100A1, y 100B1), secuencias Alu repetitivas humanas
(sondas oligonucleotídicas 301 y 302), y poli d(T) (sonda
oligonucleotídica 320).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se usaron cuatro sondas todas frente a la
secuencia repetitiva humana Alu para evaluar el diseño del dominio
marcador. Las sondas numeradas 301 (SEC ID Nº 55), 301A (SEC ID Nº
116), 301A2/2 (SEC ID Nº 121), y 301A3/2 (SEC ID Nº 122) se
muestran en la Tabla 1.
Las cuatro sondas se evaluaron a las
concentraciones de 100, 75, 50, y 25 ng/ml por ml de sonda en la
reacción, respectivamente. Este análisis de hibridación se hizo
manualmente, usando protocolos convencionales. La diana, la línea
celular embebida en parafina MBA MD 468 (Oncor INFORM^{TM}
Portaobjetos de Control Her-2/neu, Nº Cat. S8100,
Nivel 1, disponibles en Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ)
era la muestra diana y se procesó retirando la parafina por métodos
de xileno convencionales. El tejido se sometió a Proteasa 1 de
Ventana durante 12 minutos a 50 grados C en forma de una dilución
1:2 con Tampón APK de Ventana. La reacción de hibridación se
consiguió con la adición de diluyente de sonda en forma de 100
\mul de sonda (formamida al 25%, sulfato de dextrano al 5%, 2X
SSC, Triton al 1%) a un volumen residual de 100 \mul de
2XSSC/Triton X-100. El portaobjetos se calentó a 85
grados C durante 5 minutos y después se incubó durante 1 h a 37
grados C. Siguieron lavados con SSC convencionales para retirar el
exceso de sonda. Los híbridos se detectaron con un anticuerpo contra
FITC. El anticuerpo de ratón se detectó de forma colorimétrica
usando Detección Azul con Fosfatasa Alcalina Potenciada de Ventana
(nº cat. 760-061). A menos que se indique otra cosa,
todos los reactivos se obtuvieron de Ventana Medical Systems, Inc.,
Tucson, AZ. Los resultados se observaron por detección colorimétrica
usando microscopía de campo claro.
Los resultados de estos experimentos fueron que
la intensidad de señal era una función de la cantidad total de
hapteno fluoresceína conjugado con la sonda y la señal era del
diseño de dominio marcador específico. Cuando mayor es la cantidad
de fluoresceína por molécula sonda, mayor es la señal observada. La
comparación del diseño y la colocación de los haptenos en la sonda
mostró que esto no era un factor en la intensidad de señal. Las dos
sondas que contenían cinco fluoresceínas (301A3/2 (SEC ID Nº 122) y
301 (SEC ID Nº 55)) produjeron ambas una señal equivalente. Estas
dos sondas produjeron mayor señal que la observada para 301A2/2, una
sonda con un diseño de dominio marcador dividido con cuatro
fluoresceínas. La sonda 301A2/2 produjo una señal mayor que la
sonda 301A, una sonda con un diseño de dominio marcador único en el
extremo 5' y con tres fluoresceínas.
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Ejemplo
3
Este experimento comparó dos diseños y
secuencias de dominio marcador para determinar si el mayor espaciado
entre los haptenos fluoresceína mejora la producción de señal
durante las etapas de detección de sondas durante el análisis de
hibridación in situ.
El tejido usado era un tejido esplénico humano
infectado con EBV fijado en sección embebida en parafina tamponada
con formalina neutra de 4 micrómetros de grosor colocada en
portaobjetos de microscopio de vidrio más silano. Las secciones
tisulares se desparafinaron en una máquina Ventana DISCOVER^{TM},
seguido de una digestión de 6 min. con Proteasa 1 de Ventana, a una
temperatura de 37ºC. La sonda se disolvió en diluyente de tampón de
hibridación a una concentración de 50 ng/ml en forma de 100 \mul
aplicados a un volumen igual de 2 X SSC/Triton
X-100 de volumen residual dejado sobre el
portaobjetos después de prepararlo por el sistema de tinción por
ISH automatizado de Ventana Medical Systems, Inc., Discovery. El
diluyente de sonda se mezcló con el volumen residual sobre el
portaobjetos durante 6 min. a 37ºC, después la solución se calentó a
85ºC y se mantuvo durante un total de 10 min. El portaobjetos
después se llevó a una temperatura de 37ºC y se mantuvo a esa
temperatura durante 1 hora. Todas estas reacciones acuosas sobre el
portaobjetos se hicieron sobre una película de LIQUID
COVERSLIP^{TM}, para evitar las pérdidas por evaporación de agua
durante el procesamiento. Cada portaobjetos después de la
hibridación se lavó 3 veces con 2X SSC/solución Triton, con una
incubación de 6 min. entre cada lavado, siendo el volumen del
portaobjetos aproximadamente 300 \mul (+/- 10% vol). Los híbridos
se detectaron con un anticuerpo contra FITC. El anticuerpo de ratón
se detectó colorimétricamente usando Detección Azul con Fosfatasa
Alcalina Potenciada de Ventana (nº cat.
760-061).
760-061).
Las dos sondas oligonucleotídicas usadas para
este estudio eran las sondas 100A1 (SEC ID Nº 53) y 1002A32 (SEC ID
Nº 120). Las dos diferencias entre estas sondas eran la secuencia y
estructura del dominio marcador. En la sonda 100A1 el dominio
marcador estaba 5' del dominio de gen diana, contenía 5
fluoresceínas unidas a restos de citosina mediante un enlazador
OBEA, con la fórmula de secuencia de (CTATTTT)_{4}CT (SEC
ID Nº 58). El dominio marcador de la oligosonda 1002A32, era
similar (SEC ID Nº 125). Más allá de la diferente secuencia, la
diferencia principal era que las citosinas marcadas con fluoresceína
estaban espaciadas por 10 bases en comparación con el oligo 100A1
donde el espaciado de citosina estaba más cerca a 7 bases. El
resultado de esta comparación deducido por análisis de valores H
era que estos oligonucleótidos eran equivalentes en cuanto a la
cantidad de señal generada sobre el portaobjetos. Los datos fueron
que para 100A2, para las 368 células analizadas en un total de 3
campos, el valor H era 106, y para la sonda 1002A32 para las 345
células analizadas en tres campos, el valor H era 109. El valor H
es un análisis espectro-gráfico hecho con
microscopio que toma en consideración el valor de fondo a una
proporción de señal sobre la sección tisular para producir una
comparación relativa de señal específica de diana total sobre el
portaobjetos. (Véase la referencia Giroud, F. Perrin C, y Simony
Lafontaine, J.; Quantitative Immunocytochemistry and
Immunohistochemistry. Third Conference of the European Society for
Analytical Cellular Pathology, 1994; y AutoCyte Quic Immuno User's
Manual, 1998, número de documento PA-029, Co
AutoCyte Inc. Burlington NC 2721). Los histogramas y la hoja de
valores indicaron que cada oligo era igual de eficaz para producir
una señal colorimétrica. Esto indica que la posición del dominio
marcador puede ser 3 prima o 5 prima a la secuencia de diana génica
o la secuencia de diana génica puede posicionarse entre dos
dominios marcadores.
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Ejemplo
4
Las colecciones de sondas preparadas en el
Ejemplo 1 se diluyeron primero en una solución compuesta por sulfato
de dextrano al 20% (p/vol), formamida al 50% (vol/vol), 2X SSC,
Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, y Brij-35
al 0,05%, a un pH final de 7,3. Las colecciones de sondas después
se mezclaron con un volumen igual de una solución compuesta por 2X
SSC y Triton X-100 al 0,05%.
Las muestras para el análisis de ISH se
prepararon cortando muestras celulares o tisulares embebidas en
parafina y fijadas en formalina en secciones de 4 \mum y
colocando las secciones sobre un portaobjetos de vidrio. El
posterior procesamiento e ISH de las muestras se realizó en un
dispositivo automatizado, tal como el Instrumento de Tinción
ISH/IHC Automatizado DISCOVERY^{TM} (Ventana Medical Systems,
Inc., Tucson, AZ) descrito en las Solicitudes de Patente de Estados
Unidos del mismo propietario que la presente y pendientes junto con
la presente Nº de Serie 60/076.198 y 09/259.240, ambas incorporadas
en este documento por referencia. Para retirar la parafina de las
muestras, los portaobjetos se sumergieron en una solución acuosa, se
calentaron durante aproximadamente 20 minutos, y después se
aclararon. El procedimiento de desparafinación automatizado se
describe más completamente en los documentos de Estados Unidos Nº
de Serie 60/099.018, 09/259.240 ambos incorporados en este documento
por referencia. Las muestras después se trataron con proteasa y los
portaobjetos se calentaron a 85ºC (para hibridación con genes diana
de ARN) o 90-95ºC (para hibridación con genes diana
de ADN) durante 4 a 10 minutos.
Las reacciones de hibridación se realizaron
típicamente en un tampón de hibridación compuesto por sulfato de
dextrano al 10% (p/vol), formamida al 25% (vol/vol), 2X SSC, Tris 5
mM, EDTA 2,5 mM, Brij-35 al 0,025%, Triton
X-100 al 0,25%, y entre 25 y 125 ng/ml de cada
molécula sonda individual. Las reacciones de ISH se realizaron a
entre 37ºC y 54ºC. Para ISH usando las colecciones de sondas
descritas en el Ejemplo 1, las reacciones de hibridación se
realizaron de forma óptima durante 1 h a 47ºC (excepto para la sonda
poli d(T), donde la reacción de hibridación se realizó de
forma óptima a 37ºC durante 1 h).
La hibridación de las moléculas de sonda
marcadas con fluoresceína con un gen diana particular en la muestra
se detectó usando una serie secuencial de proteínas de unión, es
decir, detección de anticuerpo secundario. Sin embargo, es
igualmente posible usar detección directa cuando se visualizan
sondas unidas. En detección secundaria, primero, se añadió un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-fluoresceína
dirigido contra la molécula de sonda marcada con fluoresceína a la
muestra. Después, se añadió un anticuerpo de cabra policlonal
marcado con biotina dirigido contra el anticuerpo de ratón a la
muestra. Finalmente, las reacciones de hibridación se detectaron
colorimétricamente usando un sustrato de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT). Esta técnica, llamada
"detección de anticuerpo secundario" es rutinaria para los
especialistas en la técnica. Los anticuerpos primarios y
secundarios están disponibles en numerosos proveedores, incluyendo
Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, que están optimizados para su
uso en los sistemas de auto-tinción de Ventana
(ES®, NexES®, DISCOVERY^{TM}, y BENCHMARK^{TM}).
Las Figuras 2-21 ilustran los
resultados obtenidos para análisis de hibridación in situ de
diversas líneas celulares o muestras tisulares usando las sondas
descritas y reivindicadas en este documento que tienen el motivo
estructural ilustrado en la Figura 1 o las colecciones de sondas
compuestas por dichas sondas.
La Figura 1 ilustra una estructura de sonda
genérica del diseño de sonda de dos dominios. Éste es el diseño de
oligonucleótido usado para las sondas en los cócteles específicos de
gen descritos en los siguientes ejemplos. Cada sonda está compuesta
por dos dominios: un dominio de marcaje 5' y un dominio específico
de gen diana 3'. El dominio de marcaje consta de esta secuencia
específica (CTATTTT)n, donde el nucleótido citosina es un
conjugado citosina-hapteno, siendo el hapteno
fluoresceína en esta realización. Esta ilustración muestra
específicamente secuencias de ácido nucleico para las sondas 301
(SEC ID Nº 55) y 302 (SEC ID Nº 56), cada una de las cuales tiene
dominios específicos de gen diana correspondientes a las secuencias
Alu repetitivas humanas y dominios de marcaje que tienen un hapteno
de fluoresceína.
La Figura 2 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de hibridación in situ (ISH) de tejido
cutáneo humano usando una sonda que comprende el dominio de marcaje
(sonda 330; SEC ID Nº 58). La ausencia de una señal detectable
indica que la fórmula de secuencia, (CTATTTT)n, del dominio
de marcaje común a los oligonucleótidos usados en estos ejemplos de
ISH es no específico, y no reactivo en su capacidad de formar
apareamiento de bases de Watson-Crick con
secuencias de ácido nucleico humanas porque no hibridan.
La Figura 3 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido cutáneo humano usando una sonda
que comprende el dominio de marcaje y un dominio específico de gen
diana poli d(T) (sonda 320; SEC ID Nº 57). La presencia de
una señal detectable localizada en el citoplasma indica que esta
sonda es capaz de hibridar específicamente con la región
poliadenilada del ARN mensajero.
Las Figuras 4A-4B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido cutáneo
humano usando la sonda 320, donde la muestra tisular no se trataba
con ribonucleasa A antes de la hibridación in situ (A), o se
trataba con ribonucleasa A antes de la hibridación in situ
(B). La disminución en la señal detectable en (B) indica que esta
sonda hibrida específicamente con una región poliadenilada común al
ARN mensajero.
Las Figuras 5A-5B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando la sonda 320, donde la hibridación y el lavado
riguroso se realizaron a temperatura ambiente (A), o a 37ºC (B).
Este resultado ilustra que la intensidad de color está relacionada
con la rigurosidad de las condiciones de hibridación, indicando el
color más intenso condiciones menos rigurosas.
La Figura 6 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular Raji humana usando la
sonda 320. Esto muestra que este diseño de sonda también es
funcional con líneas celulares embebidas así como tejido
embebido.
La Figura 7 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular Raji humana usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302.
La Figura 8 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de la línea celular HT humana usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302.
La Figura 9 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular de rata usando una
colección de sondas compuesta por las sondas 301 y 302. La ausencia
de una señal detectable indica que esta colección de sondas es
específica para secuencias de ácido nucleico humanas.
La Figura 10 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular HT humana negativa al
virus Epstein-Barr (EBV) usando una sonda que tiene
un dominio específico de gen diana correspondiente al ARN nuclear
de EBER de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
La Figura 11 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido esplénico humano usando una
colección de sondas compuesta por sondas que tienen dominios
específicos de gen diana correspondientes al ARN nuclear de EBER 1
y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
La Figura 12 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano usando una
colección de sondas compuesta por sondas que tienen dominios
específicos de gen diana correspondientes al ARN nuclear de EBER 1
y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54].
Las Figuras 13A-13B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando una colección de sondas compuesta por sondas que
tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al ARN
nuclear de EBER 1 y 2 de EBV [SEC ID Nº 51 a SEC ID Nº 54], donde la
muestra tisular no se trató con ribonucleasa A antes de la
hibridación in situ (A), o se trató con ribonucleasa A antes
de la hibridación in situ (B). La disminución en la señal
detectable en (B) indica que esta sonda hibrida específicamente con
el ARN nuclear de EBER 1 y EBER 2 humano.
La Figura 14 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano positivo a la
cadena ligera kappa usando una sonda que tiene un dominio específico
de gen diana correspondiente al ARNm de cadena ligera lambda de
inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 15].
La Figura 15 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejidos de linfoma usando una colección
de sondas compuesta por sondas que tienen dominios específicos de
gen diana correspondientes al ARNm de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 2 - 4, SEC ID Nº 7 - 12, SEC ID Nº
14, 15]. El tejido de linfoma en (A) sobre-expresa
la cadena ligera kappa y el tejido en (B)
sobre-expresa la cadena ligera lambda. La ausencia
de una señal detectable en (B) indica que la colección de sondas de
cadena ligera kappa es específica para el ARNm de cadena ligera
kappa.
La Figura 16 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido de amígdala humano positivo a la
cadena ligera lambda usando una sonda que tiene un dominio
específico de gen diana correspondiente al ARNm de la región
variable de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana [SEC
ID Nº 19 a 29].
La Figura 17 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular RPMI 8226 humana
positiva a la cadena ligera lambda usando una colección de sondas
compuesta por sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARNm de cadena ligera lambda de inmunoglobulina
humana [SEC ID Nº 19 a 29].
Las Figuras 18A-18B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de tejido esplénico
humano usando una colección de sondas compuesta por sondas que
tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al ARNm
de cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana [SEC ID Nº 19 a
29]. El tejido en (A) sobre-expresa la cadena
ligera lambda y el tejido en (B) sobre-expresa la
cadena ligera kappa. La ausencia de una señal detectable en (B)
indica que la colección de sondas de cadena ligera lambda es
específica para el ARNm de cadena ligera lambda humana.
La Figura 19 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de tejido pulmonar humano positivo a
citomegalovirus (CMV) usando una colección de sondas compuesta por
sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARN temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 -
32, SEC ID Nº 34 - 35, SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50]. La flecha
indica la célula infectada por CMV.
La Figura 20 ilustra los resultados obtenidos
para el análisis de ISH de una línea celular 9G de rata en que la
expresión del ARN temprano inmediato de CMV no se ha inducido por
ciclohexamida usando una colección de sondas compuesta por sondas
que tienen dominios específicos de gen diana correspondientes al ARN
temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 - 32, SEC ID Nº 34 - 35,
SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50].
Las Figuras 21A-21B ilustran los
resultados obtenidos para el análisis de ISH de una línea celular 9G
de rata en que la expresión del ARN temprano inmediato de CMV se ha
inducido por ciclohexamida usando una colección de sondas compuesta
por sondas que tienen dominios específicos de gen diana
correspondientes al ARN temprano inmediato de CMV [SEC ID Nº 30 -
32, SEC ID Nº 34 - 35, SEC ID Nº 38, SEC ID Nº 50]. El tejido en (A)
se muestra a un aumento de 40X y el tejido en (B) se muestra a un
aumento de 20X.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las Tablas 1 y 2, las Figuras y la Lista de
Secuencias contienen ejemplos de acuerdo con la presente invención
así como ejemplos de referencia.
<110> Utermohlen, Joseph
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Connaughton, John
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fórmula de secuencia
oligonucleotídica para marcar Sondas Oligonucleotídicas y Proteínas
para Análisis In Situ
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 355/001/PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
06-09-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/233.177
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
15-09-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 60
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 47
\hskip1cm
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<210> 48
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<211> 55
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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Sonda oligonucleotídica
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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Sonda oligonucleotídica
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211>
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<211>
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<210> 123
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<211>
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 123
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<210> 124
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<211>
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Sonda oligonucleotídica
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<400> 124
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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Sonda oligonucleotídica
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sonda oligonucleotídica
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<400> 126
\hskip1cm
Claims (8)
1. Una sonda oligonucleotídica sintética que
comprende un primer dominio que tiene un dominio marcador compuesto
por una secuencia no específica de gen de un polímero de la
secuencia repetitiva (CTATTTT)_{n}, y un segundo dominio
que comprende un dominio diana que tiene una secuencia diana
específica de gen, donde el dominio marcador está marcado de forma
detectable.
2. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el marcador es fluoresceína, unido al
nitrógeno N4 de la(s) citosina(s) del dominio marcador
a través de un enlazador OBEA.
3. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el marcador es un fluoróforo.
4. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 3, donde el fluoróforo está presente a una densidad
de más del 7 por ciento en moles del dominio marcador.
5. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde al menos el 7 por ciento en moles de
la(s) citosina(s) del dominio marcador están unidas a
un resto detectable por un enlazador OBEA.
6. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el dominio marcador está localizado en el
extremo 5' de la sonda oligonucleotídica, y la secuencia diana
específica de gen está 3' al dominio marcador.
7. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el dominio marcador está localizado en el
extremo 3' de la sonda oligonucleotídica, y la secuencia diana
específica de gen está 5' al dominio marcador.
8. Una serie de sondas sintéticas para detectar
el ARNm de cadena ligera de inmunoglobulina Kappa o el ARN
heteronuclear correspondiente, donde las sondas se seleccionan entre
el grupo compuesto por la SEC ID Nº 1 a 16 inclusive.
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