ES2316487T3 - Composiciones y metodos para modular la inmunidad e infeccion de rsv. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una molécula bloqueante que inhibe la actividad biológica de un motivo CX3C de una glicoproteína G del virus respiratorio sincitial, en donde C es un residuo cisteína y X es cualquier residuo de aminoácido distinto de cisteína, en donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ó 11, o un anticuerpo generado contra un péptido que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ó 11, para inhibir la fijación de la glicoproteína G del virus respiratorio sincitial a un receptor CX3CR1, en donde el anticuerpo se fija específicamente a las posiciones de los aminoácidos 182-186 de una glicoproteína G nativa del virus respiratorio sincitial o bloquea la actividad asociada con la fijación al receptor CX3CR1.
Description
Composiciones y métodos para modular la
inmunidad e infección de RSV.
La invención se refiere en líneas generales a
los campos de la inmunología y virología y se refiere más
particularmente a métodos y composiciones para modular o prevenir la
infección por el virus respiratorio sincitial.
El virus respiratorio sincitial (RSV) se ha
reconocido desde hace mucho tiempo como el patógeno viral más
importante del tracto respiratorio inferior de los bebés. El mismo
se ha visto implicado también en la enfermedad del tracto
respiratorio inferior de los adultos, especialmente los ancianos y
las personas inmunodeficientes. RSV constituye una prioridad alta
para el desarrollo de vacunas, pero los esfuerzos para desarrollar
una vacuna han fracasado hasta ahora. El fracaso en el desarrollo
de una vacuna ha conducido a un interés renovado en la patogénesis
de la enfermedad y los mecanismos inmunitarios que envuelven la
protección.
El RSV fue identificado por primera vez como el
agente que causa la coriza de los chimpancés en 1956 y fue aislado
posteriormente de niños con enfermedad pulmonar. Hoy en día, de
acuerdo con estimaciones de la Organización Mundial de la Salud
(WHO), un tercio de los 12,2 millones de fallecimientos anuales en
los niños de edad inferior a 5 años son debidos a infecciones
agudas del tracto respiratorio inferior. Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, y RSV son los patógenos
predominantes que causan estas infecciones. De estos patógenos, RSV
se ha descrito como la única y más importante causa de infecciones
graves del tracto respiratorio en los bebés y los niños
pequeños.
Las epidemias de RSV son estacionales, aunque el
virus persiste probablemente en el seno de las comunidades. Las
tasas de infección máximas aparecen durante las estaciones frías en
los climas templados. El virus afecta aproximadamente al 90% de los
bebés y los niños pequeños hasta la edad de 2 años. En la mayoría de
los casos, la infección aparece en los bebés entre las edades de 6
semanas y 6 meses, con la máxima incidencia en los niños de menos
de 3 meses de edad. La infección previa no evita infecciones
repetidas, que son comunes en todos los grupos de edad. Por
ejemplo, en un estudio realizado en Houston, Texas, las tasas de
fusión fueron 68,8 por 100 niños-año en la
infancia, y 82,6% niños-año en el segundo año de
vida. En un estudio realizado en Suecia, se producían anticuerpos
para RSV en el 87% de los niños de 18 meses de edad, y prácticamente
en todos los niños de 3 años.
El RSV puede ser también la causa de hasta el 5%
de las infecciones del tracto respiratorio inferior adquiridas en
la comunidad en los adultos. En los ancianos, la infección por RSV
puede ser especialmente grave, conduciendo a la muerte hasta el 10%
de los casos hospitalizados.
RSV causa muy frecuentemente una infección del
tracto respiratorio superior. Tales infecciones se caracterizan por
rinitis, tos, y a veces fiebre. Hasta un tercio de los niños con
enfermedad RSV sufren otitis media aguda. Tanto RSV como patógenos
bacterianos han sido aislados de los oídos medios de los niños con
RSV. RSV causa también crup, pero las manifestaciones graves más
comunes de la infección son bronquiolitis y neumonía en los niños.
Los signos de implicación del tracto respiratorio superior preceden
comúnmente a los del tracto respiratorio inferior (bronquiolitis y
neumonía), durante unos cuantos días, y la fiebre, cuando está
presente, es usualmente de bajo nivel. La muerte puede producirse
en aproximadamente el 1% de los niños hospitalizados con infección
por RSV, apareciendo el mayor riesgo de complicaciones graves de la
infección en los niños (y los adultos) con función cardiaca,
pulmonar, o inmunitaria deficiente. En los adultos, el RSV puede
causar la exacerbación de la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica e insuficiencia cardiaca congestiva.
El genoma del RSV comprende una sola cadena de
RNA de sentido negativo que tiene una longitud de 15.222 nucleótidos
y produce 11 proteínas principales. (Falsey, A.R., y E.E. Walsh,
2000, Respiratory syncytial virus infection in adults, Clinical
Microbiological Reviews, 13:371-84.) Dos de
estas proteínas, las glicoproteínas F (fusión) y G (fijación) son
las proteínas principales de la superficie y las más importantes en
la inducción de inmunidad protectora. La proteína SH (hidrófoba
pequeña), la proteína M (matriz), y la proteína M2 (22 kDa) están
asociadas con la envoltura viral, pero no inducen una respuesta
protectora inmune. Las proteínas N (proteína principal asociada con
la nucleocápsida), P (fosfoproteína), y L (proteína principal de
polimerasa) se encuentran asociadas con el RNA del virión. Las dos
proteínas no estructurales, NS1 y NS2, participan supuestamente en
la replicación viral, pero no están presentes en los viriones
infecciosos.
RSV infecta a lo largo del tracto respiratorio
superior (particularmente la nasofaringe) y los ojos. El virus
tiene un periodo de incubación de aproximadamente 3 a 5 días. Las
infecciones con RSV se producen anualmente en los primeros años de
la vida. Por ello, la respuesta inmunológica protectora es
incompleta. Se cree que la IgA secretora local contribuye a la
resistencia a la infección en el tracto respiratorio superior. La
protección del tracto respiratorio inferior está mediada
parcialmente por la IgG del suero. Las lipoproteínas F y G de la
superficie son las únicas proteínas de RSV que se sabe inducen
anticuerpos protectores neutralizantes. La glicoproteína G parece
jugar un papel tanto en la inducción de la inmunidad protectora como
en la patogénesis de la enfermedad. Por ejemplo, estudios
realizados en ratones han demostrado que la glicoproteína G ceba una
respuesta de las células T Th2 CD4^{+}, caracterizada por la
producción de IL-4, IL-5,
IL-13 y eosinofilia pulmonar. El reclutamiento y la
activación de eosinófilos son promovidos por varios factores, tales
como IL-4 e IL-5. La eosinofilia
pulmonar está asociada con patología pulmonar importante a grave y
está mediada supuestamente, en parte, por células Th2 CD4^{+}
inducidas por la glicoproteína G del RSV. La expresión de la
glicoproteína G durante la infección aguda en los ratones se ha
asociado con una respuesta inmune innata modificada caracterizada
por la expresión reducida de citoquinas Th1 (v.g.,
IL-2 e interferón gamma), expresión alterada de mRNA
de quimioquinas (v.g., MIP-1 alfa,
MIP-1 beta, MIP-2,
IP-10, MCF-1), y tráfico reducido de
células NK al pulmón infectado.
Las cepas de RSV humanas se han clasificado en
dos grupos principales, A y B. Se ha demostrado que la glicoproteína
G es la más divergente entre las proteínas del RSV. Se cree que la
variabilidad de la glicoproteína G del RSV entre y dentro de los
dos grupos de RSV es importante en relación con la capacidad del RSV
para causar brotes anuales de la enfermedad. La glicoproteína G
comprende 289-299 aminoácidos (dependiendo de la
cepa del RSV), y tiene una estructura de tallo intracelular,
transmembranal, y altamente glicosilada de 90 kDa, así como dominios
de fijación de heparina. La glicoproteína existe en formas secretada
y fijada a la membrana.
La inmunidad celular parece jugar un papel
prominente en la recuperación de la infección por RSV. Así, los
individuos con inmunodeficiencia celular (heredada o adquirida)
sufren infecciones por RSV más graves y de mayor duración que los
individuos normales. Después de la infección por RSV, los niños
normales presentan una proliferación de linfocitos específica de
RSV, lo que sugiere la estimulación de las células T. Se ha
descrito también una respuesta de linfocitos T citotóxicos
específicos de RSV y es probablemente importante para la
recuperación de la enfermedad. Están implicados tanto subconjuntos
de linfocitos T CD4 como CD8 en la terminación de la replicación
del RSV durante la infección. La misma respuesta de linfocitos T
citotóxicos puede exacerbar o aumentar también la enfermedad
clínica asociada con la infección por RSV. Esta hipótesis se ha
utilizado para explicar la enfermedad más grave observada con la
vacuna del RSV desactivada con formalina testada a principios de los
años 1960.
Actualmente no se dispone de métodos eficaces de
tratamiento de la infección por RSV. La infección del tracto
respiratorio inferior con RSV es una condición autolimitante en la
mayoría de los casos. No existen directrices o criterios
definitivos en cuanto al modo de tratar o al momento de ingresar o
rechazar los bebés y los niños que padecen la enfermedad. La
hipoxia, que puede presentarse en asociación con la infección por
RSV, puede tratarse con oxígeno por medio de una cánula nasal. La
ventilación mecánica para los niños con insuficiencia respiratoria,
choque, o apnea recurrente puede disminuir la mortalidad. Algunos
médicos prescriben esteroides. Sin embargo, varios estudios han
demostrado que la terapia con esteroides no afecta a la evolución
clínica de los bebés y los niños ingresados en el hospital con
bronquiolitis. Así pues, los corticosteroides, solos o en
combinación con broncodilatadores, pueden ser inútiles en el
tratamiento de la bronquiolitis en pacientes no ventilados sanos en
otros aspectos. Se han utilizado también esteroides en los bebés y
los niños con enfermedades cardiopulmonares subyacentes, tales como
disfasia broncopulmonar y asma.
La ribavirina, un análogo de guanosina con
actividad antiviral, ha sido utilizada para tratar bebés y niños
con bronquiolitis por RSV desde mediados de los años 1980, pero
muchos estudios de evaluación de su utilización han presentado
resultados conflictivos. En la mayoría de los centros, el uso de
ribavirina está restringido actualmente a los pacientes con
inmunodeficiencia y a aquéllos que están gravemente enfermos.
La gravedad de la bronquiolitis por RSV se ha
asociado a concentraciones bajas de retinol en suero, pero pruebas
realizadas en niños hospitalizados con bronquiolitis por RSV han
demostrado que el suplemento vitamina A no proporciona efecto
beneficioso alguno. Pruebas terapéuticas de 1500 mg/kg de
inmunoglobulina de RSV intravenosa o 100 mg/kg de inmunoglobulina
inhalada para la infección por RSV en el tracto respiratorio
inferior no han logrado tampoco demostrar efectos beneficiosos
sustanciales.
En los países desarrollados, el tratamiento de
la infección del tracto respiratorio inferior por RSV se limita
generalmente a terapia sintomática. La terapia antiviral está
limitada usualmente a situaciones que constituyen una amenaza para
la vida debido a su alto coste y a la falta de consenso en cuanto a
su eficacia. En los países en desarrollo, la principal terapia es
el oxígeno (cuando está disponible), y la única vía para reducir la
mortalidad es mediante
prevención.
prevención.
La vacunación contra el RSV es, por
consiguiente, el método preferido para reducir la morbilidad
relacionada con el RSV. En los años 1960, se encontró que una
vacuna de RSV testada desactivada con formalina, era inmunógena,
con tasas elevadas de seroconversión. Sin embargo, se encontró que
los niños vacunados carecían de protección contra la infección por
RSV subsiguiente. Adicionalmente, los bebés naíf de RSV que recibían
la vacuna de RSV desactivada con formalina, y que se infectaron
naturalmente con RSV más tarde, desarrollaron una enfermedad más
grave que un grupo de control inmunizado con una vacuna trivalente
contra la parainfluenza. Esta experiencia ha exigido un enfoque muy
cuidadoso para testar vacunas de virus no vivos en los bebés naíf de
RSV.
Sin embargo, la vacuna de RSV desactivada con
formalina no logró causar una enfermedad más leve en los niños de
mayor edad infectados previamente. Además, estudios realizados en
ratones BALB/c sugieren que la infección previa con virus vivos
predispone a un individuo para una respuesta inmunitaria segura para
vacunas no vivas. Por consiguiente, se están testando vacunas no
vivas en niños de mayor edad y en adultos infectados previamente
con RSV. Las vacunas no vivas testadas hasta ahora parecen ser
seguras en los niños de mayor edad y los adultos, pero se desconoce
su eficacia. Es de esperar que, con nuevas herramientas
inmunológicas, los investigadores puedan llegar a entender la
patogénesis de la enfermedad mejorada y utilizar esta información
para diseñar vacunas de virus no vivos que sean seguras en el
individuo naíf frente al RSV.
Los esfuerzos hacia el desarrollo de una vacuna
para bebés y niños pequeños están enfocados actualmente en vacunas
de virus vivos. Cierto número de vacunas candidato han sido testadas
en humanos, pero ninguna de ellas ha demostrado ser suficientemente
segura para poder considerarse como una vacuna viable para
administración a niños pequeños.
Por tanto, existe necesidad de vacunas seguras y
eficaces contra RSV, especialmente para bebés y niños. Existe
también necesidad de agentes terapéuticos y métodos para tratamiento
de la infección por RSV en todas las edades y en individuos
inmunodeficientes. Existe asimismo necesidad de métodos científicos
para caracterizar la respuesta protectora inmune para RSV de tal
modo que pueda estudiarse la patogénesis de la enfermedad, y pueda
facilitarse el cribado de agentes terapéuticos y vacunas. La
presente invención resuelve los inconvenientes previos en la
técnica proporcionando métodos y composiciones eficaces para modular
o prevenir la infección por RSV.
Se proporcionan composiciones para el
tratamiento o la prevención de la enfermedad RSV por modulación de
la infección por RSV y la inmunidad. En particular, se identifican
en esta memoria secuencias de aminoácidos en la glicoproteína G del
RSV que son esenciales para causar la infección por RSV y la
enfermedad. Estas secuencias de aminoácidos contienen un motivo de
quimioquina, definido como
C-X-X-X-C
(o CX3C), que es a la vez biológicamente activo (es decir, actúa
como una quimioquina CX3C) y participa en la fijación del virus a
las células susceptibles y la infección de las mismas. En este
motivo, C es un residuo cisteína y X es cualquier residuo de
aminoácido. Cada uno de los tres residuos X puede ser un aminoácido
diferente o el mismo aminoácido, pero no cisteína. El motivo
quimioquina se encuentra en las posiciones de los aminoácidos
182-186 de la glicoproteína G nativa del RSV. El
motivo CX3C se fija al receptor de CX3C (CX3CR1) en la superficie de
las células humanas y animales.
Las composiciones proporcionadas en esta memoria
utilizan el conocimiento recién adquirido de la importancia
biológica y estructural del motivo CX3C para infectar las células,
modificar la inmunidad, y causar la enfermedad, a fin de prevenir o
inhibir la enfermedad del RSV. Básicamente, la inmunidad y el
tratamiento se consiguen por 1) alteración del motivo CX3C en un
virus de tipo salvaje de tal modo que el virus no puede utilizar el
mismo para fijarse a las células e infectar éstas, o modular la
respuesta del hospedador a la infección viral, y utilizar el virus
que contiene el motivo alterado como una vacuna de virus vivo; 2)
mejora de la inducción de anticuerpos que bloquean la fijación de
la glicoproteína G del RSV a CX3CR1 o la actividad biológica
asociada con la fijación de la glicoproteína G del RSV a CX3CR1 por
una vacuna de virus no vivo; 3) bloqueo de la actividad del motivo
CX3C por fijación de fármacos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos u
otras moléculas bloqueantes al motivo de un virus infectante; 4)
desactivación del sitio CX3C por fijación de fármacos, anticuerpos,
péptidos, polipéptidos u otras moléculas bloqueantes proximales al
motivo CX3C de un virus infectante (preferiblemente la fijación de
las moléculas bloqueantes proximales al motivo ocurre en regiones
que alteran la estructura secundaria del motivo, cambiando con ello
la actividad biológica, o que previenen estéricamente la fijación
de la glicoproteína G del RSV a CX3CR1 o la actividad biológica
asociada con la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 por
una vacuna de virus no vivo); y/o 5) utilización de ensayos que
detectan el bloqueo de la fijación de la glicoproteína G de RSV al
receptor de CX3C (CX3CR1) o que detectan el bloqueo de la actividad
iniciada por la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 in
vitro para identificar fármacos, anticuerpos, péptidos,
polipéptidos u otras moléculas bloqueantes, anticuerpos que pueden
utilizarse como antivirales del RSV o vacunas que pueden ser seguras
y eficaces para prevenir la enfermedad RSV.
En la presente invención, se producen vacunas
RSV vivas por modificación del motivo CX3C de la glicoproteína G
del RSV haciéndolo no funcional para la fijación viral e infección
de las células hospedadoras. Las vacunas RSV preferidas se
modifican por ingeniería genética causando mutaciones de deleción o
inserción en el motivo CX3C en un virus de RSV vivo.
Otro aspecto de esta invención proporciona
vacunas de RSV vivas o no vivas que se producen, o vacunas de RSV
vivas o no vivas existentes mejoradas, por modificación del motivo
CX3C de la glicoproteína G de RSV o regiones proximales del mismo
de tal manera que, cuando se administran las vacunas a un humano o
animal, se producen títulos mayores de anticuerpos que bloquean la
función biológica del motivo CX3C en las glicoproteínas G de virus
RSV posteriormente infectantes.
En otro aspecto de esta invención, se
proporcionan vacunas de RSV vivas y no vivas que, cuando se
administran a un humano o animal, inducen la producción de
anticuerpos que bloquean la función biológica del motivo CX3C en la
glicoproteína G de virus RSV infectantes ulteriormente. De modo
alternativo, la vacuna comprende uno o más péptidos o polipéptidos
de la glicoproteína G de cepas RSV diferentes que tienen la
propiedad que antecede.
Se proporciona también un método para mejorar o
identificar in vitro fármacos, anticuerpos, péptidos,
polipéptidos u otras moléculas bloqueantes que pueden utilizarse
para tratar la enfermedad del RSV y/o como vacunas para prevenir la
enfermedad del RSV.
La inmunización se consigue por administración a
un humano o animal de una cantidad inmunógena de una o más de las
composiciones de vacuna de esta invención en un vehículo
farmacéuticamente aceptable. El tratamiento del RSV se proporciona
por administración de una cantidad eficaz de una molécula bloqueante
de CX3C en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un humano o
animal infectado por el RSV. Por "farmacéuticamente aceptable"
se entiende un material que no es indeseable biológicamente o por
cualquier otro motivo, es decir, que el material puede
administrarse a un individuo junto con el agente seleccionado sin
causar efectos biológicos indeseables de ningún tipo o
interaccionar de manera perjudicial con cualquiera de los otros
componentes de la composición farmacéutica en la que está
contenido. Una molécula bloqueante se define en esta memoria como
un fármaco, compuesto químico, anticuerpo, péptido, polipéptido u
otra molécula que bloquea la actividad biológica del motivo CX3C, o
bloquea la fijación de la glicoproteína G de CX3C al receptor de la
glicoproteína G de CX3C, que puede ser el receptor CX3CR1.
Anticuerpos monoclonales que son específicos
para el motivo CX3C de la glicoproteína G del RSV o para el receptor
al que se fija el motivo CX3C (particularmente el receptor CX3CR1),
o que puede demostrarse que bloquean la fijación o la actividad
asociada con la fijación al receptor CX3CR1 de muchas o la totalidad
de las cepas RSV son útiles para el tratamiento de pacientes
infectados con RSV. Estos anticuerpos se utilizan también
profilácticamente para prevenir a los pacientes que se hallan en
riesgo de adquirir el RSV.
Los anticuerpos policlonales, suero concentrados
o preparaciones de inmunoglobulina que contienen títulos elevados
de anticuerpos específicos para el motivo CX3C de la glicoproteína G
de RSV o para el receptor al que se fija el motivo CX3C o que puede
demostrarse bloquean la fijación o la actividad asociada con la
fijación al receptor CX3CR1 de muchas o todas las cepas de RSV, son
también útiles para el tratamiento o la prevención de la enfermedad
RSV.
La administración de anticuerpos, péptidos,
polipéptidos o moléculas afines que bloquean los efectos semejantes
a quimioquinas del motivo CX3C de la glicoproteína G sobre la
migración o activación celular es útil también para el tratamiento
de la infección por RSV.
Por consiguiente, es un objeto de la presente
invención proporcionar vacunas y otras composiciones farmacéuticas
para la prevención, reducción y tratamiento de la enfermedad RSV, en
donde las composiciones interfieren con la actividad biológica del
motivo CX3C de la glicoproteína G del RSV o la fijación del motivo a
su receptor en las células hospedadoras.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una composición para el tratamiento o prevención de la
infección por RSV.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una composición para tratamiento o la prevención de la
bronquiolitis, una infección del tracto respiratorio superior o una
infección del tracto respiratorio inferior causada por infección con
RSV.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una vacuna segura y eficaz contra RSV, especialmente
adecuada para uso en bebés y ancianos y otros grupos de riesgo
frente a la enfermedad del RSV.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar ensayos in vitro que pueden utilizarse para
cribar vacunas o antivirales candidato a fin de identificar aquéllos
que sean probablemente seguros y eficaces en el tratamiento y/o la
prevención de la infección por RSV.
Estos y otros objetos, características y
ventajas de la presente invención resultarán evidentes después de
una revisión de la descripción detallada que sigue de las
realizaciones descritas y las reivindicaciones del apéndice.
Las Figuras 1A-L muestran la
fijación de glicoproteína G (G), glicoproteína G recombinante de
polihistidina (G_{HIS}) y Fkn a células 293-CX3CR1
y 293 en presencia y ausencia de los péptidos de glicoproteína G
RT32, RT33, RT34, \bullet+1 y \bullet-1 y
anticuerpos monoclonales anti-glicoproteína G
(131-2G) y anti-glicoproteína F
(131-2A), como se determina por citometría de flujo.
Se muestran perfiles de histogramas para la fijación de la
glicoproteína G 10 nM, G_{HIS} o Fkn a las células
CX3CR1-293 y 293. Los histogramas oscuros
representan células teñidas con un anticuerpo de control. Los
histogramas claros representan células teñidas con un cóctel
biotinilado anti-glicoproteína G
(130-2G, 131-2G) o anticuerpo
anti-Fkn (51637.11). Se muestra el porcentaje de
tinción positiva de Fkn o glicoproteína G para un experimento
representativo: A) 88% de tinción de Fkn de células
CX3CR1-293; B) 8% de tinción de Fkn de células 293;
C) 84% de tinción de glicoproteína G de células
CX3CR1-293; D) 16% de tinción de glicoproteína G de
células 293; E) 72% de tinción de glicoproteína G en presencia del
péptido RT32 y 74% de tinción en presencia del péptido RT34 de
células CX3CR1-293; F) 48% de tinción de
glicoproteína G en presencia del péptido RT33 de células
CX3CR1-293; G) 65% de tinción de glicoproteína G en
presencia del péptido \bullet+1; H) 73% de tinción de
glicoproteína G en presencia del péptido
\bullet-1; I) 68% de tinción de G_{HIS} de
células CX3CR1-293; J) 12% de tinción de G_{HIS}
de células 293; K) 10% de tinción de G_{HIS} de células
CX3CR1-293 en presencia de anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína G (131-2G); y L)
60% de tinción de G_{HIS} de células CX3CR1-293 en
presencia de anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína F (131-2A).
Las Figuras 2A-B muestran
células 293-CX3CR1 y 293 que se incubaron con
^{125}I-fractalquino 1 nM que comprende el dominio
de 76 aminoácidos de la quimioquina CX3C, en presencia de cantidades
crecientes de Fkn o glicoproteína G sin marcar durante 2 h a 37ºC en
presencia de azida. Se determinó la radiactividad asociada a las
células: A) los datos son el valor medio \pm SE de medidas
triplicadas ajustadas a las células 293 representativas de tres
experimentos separados; B) análisis Scatchard de los datos de
fijación. En los tres experimentos, los valores medios \pm SD de
los parámetros de fijación eran: K_{d} (Fkn) = 5,8 \pm
1,4 nM y K_{d} (glicoproteína G) = 2,1 \pm 1,6 nM. La
fijación inespecífica de ^{125}I-fractalquino a
las células 293 se define como la cantidad total de radiactividad
asociada a las células en presencia de un exceso de 1000 veces de
Fkn sin marcar, y era \leq 5% de la fijación total a las
concentraciones examinadas.
La Figura 3 muestra los resultados de los
experimentos de quimiotaxis. El índice de quimiotaxis se determinó a
partir del aumento expresado en número de veces de la migración de
las células leucocitarias de bazo murino hacia el quimioatrayente
(v.g., Fkn o glicoproteína G) respecto a la migración de los
leucocitos hacia un control de medio solo, utilizando cámaras Boyden
modificadas. Se añadieron Fkn, glicoproteína G, glicoproteína G
recombinante marcada con polihistidina (GHIS), anticuerpo
monoclonal anti-CX3CR1 (2A9-1),
suero normal de conejo, suero de conejo anti-CX3CR1,
anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína G
(131-2G) o anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína F (131-2A) a la
cámara superior para examinar el antagonismo de la migración celular
hacia el quimioatrayente en la cámara inferior.
Las Figuras 4A-E muestran la
caracterización de las preparaciones de glicoproteína G: A) una
SDS-PAGE teñida con plata y no reducida de la
preparación de glicoproteína G de un lisado de células Vero
infectadas con RSV purificado de lectina de germen de trigo (Pista
1); (B), (C) análisis por transferencia Western de las fracciones
secuenciales recogidas durante el procedimiento de purificación y
sondadas con anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína G (131-2A) o
anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína F
(131-2A): Pista 1 = lisado de células Vero
infectadas con RSV sin purificar, Pista 2 = material eluido de la
columna de lectina de germen de trigo, Pista 3 = flujo directo de
la columna Q, Pista 4 = material eluido de la columna Q con NaCl 100
mM, Pista 5 = material eluido de la columna Q con NaCl 200 mM, Pista
6 = material eluido de la columna Q con NaCl 300 mM; D) una
SDS-PAGE teñida con plata y no reducida de la
preparación de glicoproteína G recombinante marcada con
polihistidina (G_{HIS}): Pista 1 = material eluido G_{HIS} de la
columna de afinidad Ni-NTA concentrado; E) un
análisis por transferencia Western de la preparación
G_{HIS}:
Pista 1 = preparación de glicoproteína G de células Vero infectadas con RSV purificado con lectina de germen de trigo, Pista 2 = lisado G_{HIS} de células Vero transfectadas establemente con pcDNA codificante de G_{HIS}, Pista 3 = flujo directo de la columna de afinidad NI-NTA, Pista 4 = G_{HIS} purificada en el material eluido de la columna de afinidad NI-NTA. MW = marcadores de peso molecular. Para el análisis SDS-PAGE teñido con plata y no reducido, una flecha indica la glicoproteína G predicha.
Pista 1 = preparación de glicoproteína G de células Vero infectadas con RSV purificado con lectina de germen de trigo, Pista 2 = lisado G_{HIS} de células Vero transfectadas establemente con pcDNA codificante de G_{HIS}, Pista 3 = flujo directo de la columna de afinidad NI-NTA, Pista 4 = G_{HIS} purificada en el material eluido de la columna de afinidad NI-NTA. MW = marcadores de peso molecular. Para el análisis SDS-PAGE teñido con plata y no reducido, una flecha indica la glicoproteína G predicha.
La figura 5A es un gráfico de barras que muestra
la quimiotaxis de los leucocitos hacia la glicoproteína G o el
fractalquino (Fkn) en presencia o ausencia de anticuerpo
anti-CX3CR1 o suero normal de conejo. El índice de
quimiotaxis determinado a partir del aumento expresado en número de
veces de la migración de los leucocitos de murino hacia el
quimioatrayente (v.g., Fkn o glicoproteína G) sobre la migración de
los leucocitos hacia el control de medio solo utilizando cámaras
Boyden modificadas. Se añadieron Fkn, glicoproteína G, anticuerpo
anti-CX3CR1 (10 \mug) o suero normal de conejo (10
\mug) a la cámara superior para examinar el antagonismo de la
migración celular hacia el quimioatrayente en la cámara inferior. La
Figura 5B es un gráfico de barras que muestra el tráfico de células
hacia el pulmón de ratones naíf BALB/c tratados por vía intranasal
con glicoproteína G, fractalquino o los péptidos RT32, RT33 o RT34
de glicoproteína G. Se fijaron células BAL y se tiñeron con H&E.
Se determinaron subconjuntos de células como porcentaje de las
células BAL totales contado a partir de > 200
células/portaobjetos contando dos portaobjetos para cada
experimento. El tipo porcentual de células representa la mediana
\pm SE de tres experimentos separados. * indica diferencia
significativa comparada con el medio de cultivo de tejido solo (p
< 0,05). Los ratones BALB/c naíf se trataron por vía i.n. con
glicoproteína G 1 \muM o fractalquino o con péptidos de
glicoproteína G 1 \muM. Las células BAL se recogieron dos días
después del tratamiento para análisis.
La Figura 6 es una representación generada por
ordenador de un gel electroforético que muestra el Análisis de
Protección de RNA (RPA) de mRNA de células Vero de células
infectadas con RSV/A2 (pista A) y células CX3CR1-293
(Pista B). El mRNA se sondó respecto al receptor-2
de la quimioquina CXC (CXCR2), el receptor-4 de la
quimioquina CXC (CXCR4), CX3CR1 y los genes propios L32 y GAPDH.
La presente invención puede entenderse más
fácilmente haciendo referencia a la descripción detallada que sigue
de las realizaciones preferidas de la invención y el ejemplo que se
incluye en esta memoria.
Antes de exponer y describir los presentes
compuestos y métodos, debe entenderse que esta invención no se
limita a proteínas específicas, métodos específicos, o ácidos
nucleicos específicos, dado que los mismos pueden variar, por
supuesto. Debe entenderse también que la terminología utilizada en
esta memoria se utiliza para el propósito de describir
realizaciones particulares únicamente y no debe considerarse como
limitante.
Debe indicarse que, como se utilizan en la
memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas
singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los
plurales correspondientes a no ser que el contexto indique
claramente otra cosa.
En esta memoria se describen composiciones para
el tratamiento o la prevención de la enfermedad RSV por modulación
de la infección RSV y la inmunidad frente al mismo. Se identifican
secuencias de aminoácidos en la glicoproteína G de RSV, a la que se
hace referencia en esta memoria como el motivo de quimioquina
C-X-X-X-C
(o CX3C), que son esenciales para causar la infección y enfermedad
RSV. El motivo de quimioquina CX3C está localizado en las
posiciones de los aminoácidos 182-186 en una región
conservada y rica en prolina de la molécula de la glicoproteína G
de RSV. La administración de una o más composiciones que interfieren
directa o indirectamente con o que bloquean la actividad normal o
la fijación de este motivo es útil para inmunización contra el
tratamiento de la enfermedad RSV y es útil también para estudiar la
patología de RSV orientada al desarrollo y cribado de composiciones
terapéuticas y estrategias de tratamiento.
Las quimioquinas median el tráfico de leucocitos
en las respuestas inflamatorias y se producen a menudo en
condiciones patológicas tales como infección viral. Las quimioquinas
se definen por tener cuatro cisteínas conservadas y se dividen en
subfamilias basadas en el motivo formado por las dos primeras
cisteínas. Por ejemplo, las quimioquinas CXC tienen las dos
primeras cisteínas separadas por un aminoácido, mientras que las dos
primeras cisteínas son adyacentes en el caso de las quimioquinas
CC. Las quimioquinas C forman un tercer puente disulfuro además de
los dos puentes disulfuro usuales, y las quimioquinas CX3C tienen
las dos primeras cisteínas separadas por tres amino-ácidos.
El motivo quimioquina de la glicoproteína G del
RSV localizado en las posiciones de los aminoácidos
182-186 es un motivo
C-X-X-X-C
(o CX3C). El motivo es biológicamente activo (es decir, actúa como
una quimioquina CX3C) y participa en la fijación del virus a las
células susceptibles, y la infección de las mismas. En este motivo,
C es un residuo cisteína y X es cualquier residuo de aminoácido.
Cada uno de los 3 residuos X puede ser un aminoácido diferente o el
mismo aminoácido, pero no cisteína. El motivo CX3C se fija al
receptor de CX3C (CX3CR1) en la superficie de las células humanas y
animales, facilitando con ello la infección de las células por el
RSV.
Las composiciones descritas en esta memoria
proporcionan inmunidad contra y tratamiento de la infección por RSV
de varias maneras por interferir directa o indirectamente con la
función o la estructura normales del motivo CX3C. Las composiciones
incluyen virus RSV vivos o no vivos, o fragmentos de los mismos, en
los cuales el motivo CX3C ha sido alterado, e incluyen también
moléculas bloqueantes que inhiben la función del motivo CX3C.
Por ejemplo, se producen vacunas de virus RSV
vivos por alteración del motivo CX3C en un virus de tipo salvaje de
tal manera que el virus no puede utilizarlo para fijarse a e
infectar las células o modular la respuesta del hospedador a la
infección viral. El virus que contiene el motivo alterado se
administra como una vacuna de virus vivo para inducir una respuesta
inmune que confiere protección subsiguiente contra la infección por
RSV.
Fármacos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos u
otras moléculas bloqueantes que se fijan a y bloquean con ello la
actividad normal del motivo CX3C de la glicoproteína G de un virus
RSV infectante se administran para tratar la infección por RSV. El
sitio CX3C se desactiva también por fijación de fármacos,
anticuerpos, péptidos, polipéptidos u otras moléculas bloqueantes
proximales al motivo CX3C de un virus RSV infectante de tal manera
que la actividad normal del motivo se inhibe o se pone en
compromiso. Los anticuerpos preferidos no reconocen específicamente
el dominio CX3C, limitando así la posibilidad de inducir
autoinmunidad a quimioquinas endógenas estructuralmente similares,
tales como fractalquino.
Las actividades biológicas normales del virus
RSV vivo de tipo salvaje que son inhibidas, terminadas o moduladas
por las composiciones y métodos proporcionados en esta memoria
incluyen, pero sin carácter limitante, quimiotaxis, migración
celular y adherencia del virus a las células.
En la presente invención, se producen vacunas
vivas de RSV por modificación del motivo CX3C de la glicoproteína G
del RSV para hacerlo no funcional para la fijación viral e infección
de las células hospedadoras. Las vacunas RSV preferidas se
modifican por ingeniería genética introduciendo o seleccionando
mutaciones de deleción, inserción y/o sustitución en la secuencia
de aminoácidos del motivo CX3C en un virus RSV vivo. Las vacunas
especialmente preferidas contienen variaciones de la secuencia
nativa de aminoácidos (los aminoácidos 182-186 del
genoma de la glicoproteína G del RSV, tales como CWAIC) que añaden
un residuo adicional (tales como CWAIAC) o delecionan un residuo
(tales como CWAC). Alternativamente, el motivo CX3C se altera para
delecionar uno o ambos residuos C o por aumento o disminución del
número de residuos X entre los residuos C.
Se proporcionan también por esta invención
vacunas de RSV vivas que se producen, o vacunas de RSV vivas
existentes que se mejoran, por modificación del motivo CX3C de la
glicoproteína G de RSV o residuos de aminoácidos proximales u otras
partes de la glicoproteína G de tal modo que, cuando se administran
a un humano o animal, se producen títulos más altos de anticuerpos
que bloquean la función biológica del motivo CX3C sobre las
glicoproteínas G de virus RSV posteriormente infectantes. "Título
más alto" significa un título de anticuerpos que es mayor que un
título de anticuerpos detectado previamente después de la
inmunización con vacunas de RSV vivos existentes.
Es otro aspecto de la invención, se proporcionan
vacunas de RSV vivos y no vivos que, cuando se administran a un
humano o animal, inducen la producción de anticuerpos que bloquean
la función biológica del motivo CX3C en la glicoproteína G de virus
RSV posteriormente infectantes. Por ejemplo, la vacuna puede
comprender uno o más fragmentos de glicoproteína G, péptidos o
polipéptidos de glicoproteína G de diferentes cepas de RSV,
glicoproteínas G de vacunas de virus no vivos, o glicoproteínas G de
una vacuna de virus vivo, tal como un clon infeccioso de RSV que,
cuando se administra a un humano o animal, inducen la producción de
anticuerpos que inhiben la función biológica de CX3C, tal como la
fijación al receptor de CX3C o la formación de calvas de RSV en
monocapas de células susceptibles o migración de leucocitos inducida
por la glicoproteína G. El clon infeccioso de RSV está disponible
de varias fuentes tales como los National Institutes of Health (Dr.
Brian Murphy) o de Aviron Corporation (Mountain View, California).
Alternativamente, la vacuna puede comprender uno o más péptidos o
polipéptidos de glicoproteína G de cepas de RSV diferentes que
tienen la propiedad indicada anteriormente.
La inmunización se consigue por administración a
un humano o animal de una cantidad inmunógena de una o más de las
composiciones de vacuna de esta invención en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
El tratamiento del RSV se proporciona por
administración, a un individuo humano o animal infectado por RSV,
de una cantidad eficaz de una molécula bloqueante de CX3C en un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Una molécula bloqueante se
define en esta memoria como un fármaco, compuesto químico,
anticuerpo, péptido, polipéptido u otra molécula que bloquea la
actividad biológica del motivo CX3C o bloquea la fijación de la
glicoproteína G de CX3C al receptor de la glicoproteína G de CX3C,
que es muy preferiblemente el receptor CX3CR1.
Los anticuerpos monoclonales, específicos para
el motivo CX3C de la glicoproteína G de RSV o para el receptor al
cual se fija el motivo CX3C (particularmente el receptor CX3CR1) o
para otras partes de la glicoproteína G de RSV tales que bloquean
la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o la actividad
asociada con la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 para
todas las cepas RSV, son útiles, en asociación con anticuerpos
monoclonales neutralizantes, para tratar pacientes que sufren la
enfermedad o para uso profiláctico a fin de prevenir la infección
por RSV en individuos que se encuentran en riesgo de contraer la
enfermedad RSV.
Los anticuerpos policlonales, suero concentrados
o preparaciones de inmunoglobulina que contienen títulos altos de
anticuerpos específicos para el motivo CX3C de glicoproteína G de
RSV o para el receptor al cual se fija el motivo CX3C son útiles
también para tratamiento o prevención de la enfermedad RSV.
La administración de anticuerpos, péptidos,
polipéptidos o moléculas afines que bloquean los efectos semejantes
a quimioquina del motivo CX3C de la glicoproteína G sobre la
migración celular o la activación es útil también para tratamiento y
prevención del RSV.
Las proteínas o péptidos aislados, recombinantes
o sintéticos que contienen el motivo CX3C de la glicoproteína G de
RSV, o fragmentos activos de los mismos o proteínas de fusión de los
mismos, pueden utilizarse como moléculas bloqueantes como se ha
descrito arriba, pero son útiles también como herramientas de
investigación científica para identificar y producir otras
moléculas bloqueantes, favoreciendo con ello la comprensión de los
mecanismos de la patología viral del RSV y el desarrollo de
terapias antivirales. Adicionalmente, las proteínas aisladas,
recombinantes o sintéticas, o porciones antigénicas de las mismas
(con inclusión de fragmentos portadores de epítope), o proteínas de
fusión de las mismas pueden administrarse a animales como
inmunógenos o antígenos, solos o en combinación con un adyuvante,
para la producción de antisuero reactivos con el motivo CX3C.
Adicionalmente, las proteínas pueden utilizarse para cribar
antisuero de pacientes hiperinmunes de los cuales pueden derivarse
anticuerpos que tengan una afinidad muy alta para las proteínas.
Las proteínas, péptidos o polipéptidos
preferidos de esta invención contienen el motivo CX3C. Muy
preferiblemente, las proteínas, péptidos o polipéptidos contienen
el motivo CX3C y la totalidad o una porción biológicamente activa o
inmunógena de la secuencia de aminoácidos
VPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKP (SEQ ID NO: 1).
Alternativamente, las proteínas, péptidos o
polipéptidos de esta invención contienen el motivo CX3C y la
totalidad o una porción biológicamente activa o inmunógena de la
secuencia de aminoácidos VPCSICSNNPTC (a la que se hace referencia
en esta memoria como RT32) (SEQ ID NO: 2), TCWAICKRIPNK (a la que se
hace referencia en esta memoria como RT33) (SEQ ID NO: 3),
NKKPGKKTTTKP (a la que se hace referencia en esta memoria como RT34)
(SEQ ID NO: 4), o combinaciones de las mismas. Otros péptidos que
pueden utilizarse como moléculas bloqueantes incluyen, pero sin
carácter limitante, TCAAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 5), TCWAACKRIPNKK (SEQ
ID NO: 6), TCNAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 7), TCDAACKRIPNKK (SEQ ID NO:
8), TCDAAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 9), TCMAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 10),
TCFAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 11).
Los métodos descritos en los ejemplos de esta
memoria se utilizaron para demostrar que estos péptidos 1) inhiben
> 90% de la infección por RSV de las células susceptibles (v.g.,
células Vero), 2) inhiben > 90% de la fijación de CX3C de la
glicoproteína G a CX3CR1, y 3) inhiben la formación de calvas de
RSV.
La presente invención proporciona también ácidos
nucleicos aislados que codifican los péptidos de la glicoproteína G
de RSV de la presente invención y fragmentos de los mismos. Estos
ácidos nucleicos pueden utilizarse para producir los péptidos de
esta invención o como vacunas de ácido nucleico, en cuyo caso los
péptidos de esta invención se producen en un individuo.
Un ácido nucleico como se utiliza en esta
memoria hace referencia a moléculas mono o bicatenarias que pueden
ser DNA, que comprende las bases nucleotídicas A, T, C y G, o RNA,
que comprende las bases A, U (que sustituye a T), C y G. El ácido
nucleico puede representar una cadena codificante o su complemento.
Los ácidos nucleicos pueden ser idénticos en secuencia a la
secuencia que existe naturalmente o pueden incluir codones
alternativos que codifican el mismo aminoácido que el que se
encuentra en la secuencia existente naturalmente. Adicionalmente,
los ácidos nucleicos pueden incluir codones que representan
sustituciones conservativas de aminoácidos como las que son bien
conocidas en la técnica.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"ácido nucleico aislado" significa un ácido nucleico separado
o sustancialmente exento de al menos algunos de los otros
componentes del organismo existente naturalmente, por ejemplo, los
componentes estructurales de las células que se encuentran
comúnmente asociados con los ácidos nucleicos en un ambiente
celular y/u otros ácidos nucleicos. El aislamiento de ácidos
nucleicos puede realizarse por tanto por técnicas tales como lisis
celular seguida por extracción con fenol más cloroformo, seguida por
precipitación de los ácidos nucleicos con etanol (48). Los ácidos
nucleicos de esta invención pueden aislarse de las células de
acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica de aislamiento de
ácidos nucleicos. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la
presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con protocolos
estándar bien descritos en la bibliografía para la síntesis de
ácidos nucleicos. Se contemplan también modificaciones de los
ácidos nucleicos de la invención con tal que se mantengan la
estructura y función esenciales del péptido o polipéptido codificado
por el ácido nucleico.
El ácido nucleico que codifica el péptido o
polipéptido de esta invención puede formar parte de una construcción
de ácido nucleico recombinante que comprende cualquier combinación
de sitios de restricción y/o elementos funcionales como son bien
conocidos en la técnica que facilitan la clonación molecular y otras
manipulaciones del DNA recombinante. Así, la presente invención
proporciona adicionalmente una construcción de ácido nucleico
recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido
y/o polipéptido de esta invención.
La presente invención proporciona adicionalmente
un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido
y/o polipéptido de esta invención. El vector puede ser un vector de
expresión que contiene la totalidad de los componentes genéticos
requeridos para la expresión del ácido nucleico en células en las
cuales se ha introducido el vector, como son bien conocidos en la
técnica. El vector de expresión puede ser un vector de expresión
comercial o el mismo puede construirse en el laboratorio de acuerdo
con protocolos estándar de biología molecular. El vector de
expresión puede comprender ácido nucleico viral que incluye, pero
sin carácter limitante, ácido nucleico de virus vaccinia,
adenovirus, retrovirus y/o virus adenoasociado. El ácido nucleico o
vector de esta invención puede encontrarse también en un liposoma o
un vehículo de suministro que puede ser capturado por una célula por
endocitosis mediada por receptores u otro tipo de endocitosis.
El ácido nucleico de esta invención puede
encontrarse en una célula, que puede ser una célula que exprese el
ácido nucleico, con lo cual se produce en la célula un péptido y/o
polipéptido de esta invención. Adicionalmente, el vector de esta
invención puede encontrarse en una célula, que puede ser una célula
que expresa el ácido nucleico del vector, con lo cual se produce en
la célula un péptido y/o polipéptido de esta invención. Se
contempla también que los ácidos nucleicos y/o vectores de esta
invención pueden estar presentes en un animal hospedador (v.g., un
animal transgénico) que expresa los ácidos nucleicos de esta
invención y produce los péptidos y/o polipéptidos de esta
invención.
El ácido nucleico que codifica los péptidos y
polipéptidos de esta invención puede ser cualquier ácido nucleico
que codifique funcionalmente los péptidos y polipéptidos de esta
invención. Para codificar funcionalmente los péptidos y
polipéptidos (es decir, permitir que se expresen los ácidos
nucleicos), el ácido nucleico de esta invención puede incluir, por
ejemplo, secuencias de control de la expresión, tales como un origen
de replicación, un promotor, un intensificador y los sitios de
procesamiento de la información necesarios, tales como sitios de
fijación de ribosoma, sitios de remodelación del RNA, sitios de
poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción.
Las secuencias de control de la expresión
preferidas son promotores derivados de genes de metalotioneína,
genes de actina, genes de inmunoglobulina, CMV, SV40, adenovirus,
virus del papiloma bovino, etc. Un ácido nucleico que codifica un
péptido o polipéptido seleccionado puede determinarse fácilmente
basándose en el código genético para la secuencia de aminoácidos
del péptido y/o polipéptido seleccionado, y muchos ácidos nucleicos
codificarán cualquier péptido o polipéptido seleccionado. Se
contemplan también modificaciones en la secuencia de ácido nucleico
que codifica el péptido y/o polipéptido. Modificaciones que pueden
ser útiles son modificaciones en las secuencias que controlan la
expresión del péptido o polipéptido que hacen inducible o
reprimible la producción del péptido o polipéptido tal como es
controlada por el inductor o represor apropiado. Tales métodos son
estándar en la técnica (49). El ácido nucleico de esta invención
puede generarse por medios estándar en la técnica, v.g. por
técnicas de ácido nucleico recombinante y por síntesis de ácido
nucleico o síntesis enzimática in vitro.
La presente invención proporciona también un
método para producir los péptidos y polipéptidos de esta invención
que comprende producir las células de esta invención que contienen
los ácidos nucleicos o vectores de esta invención como ácido
nucleico exógeno; cultivar las células en condiciones en las cuales
el ácido nucleico exógeno contenido en la célula puede expresarse y
el péptido y/o polipéptido codificado puede producirse; y aislar el
péptido y/o polipéptido de la célula. De este modo, se contempla que
los péptidos y polipéptidos de esta invención pueden producirse en
cantidad in vitro en sistemas de expresión procariotas o
eucariotas, como es bien conocido en la técnica.
Para expresión en un sistema procariota, existen
numerosos vectores de expresión de E. coli (Escherichia
coli) conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la
técnica, útiles para la expresión de ácido nucleico que codifica
péptidos y/o polipéptidos. Otros hospedadores microbianos adecuados
para uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y
otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia, así
como diversas especies de Pseudomonas. Estos hospedadores
procariotas pueden soportar vectores de expresión que contendrán
típicamente secuencias de control de la expresión compatibles con la
célula hospedadora (v.g., un origen de replicación).
Adicionalmente, estará presente cualquier número de una diversidad
de promotores bien conocidos, tales como el sistema del promotor
lactosa, un sistema promotor de triptófano (Trp), un sistema
promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor
del fago lambda. Los promotores controlarán típicamente la
expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen
secuencias de sitios de fijación de ribosoma, por ejemplo, para
iniciar y completar la transcripción y la traducción. En caso
necesario, puede proporcionarse una metionina
amino-terminal por inserción de un codón Met 5' y en
marco con el polipéptido. Asimismo, puede eliminarse la extensión
carboxi-terminal del polipéptido utilizando
procedimientos estándar de mutagénesis de oligonucleótidos.
Las secuencias de ácido nucleico pueden
expresarse en hospedadores después que las secuencias se han
posicionado para asegurar el funcionamiento de una secuencia de
control de la expresión. Estos vectores de expresión son
típicamente replicables en los organismos hospedadores, sea como
episomas o como una parte integral del DNA cromosómico del
hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión pueden contener
marcadores de selección, v.g., resistencia a la tetraciclina o
resistencia a la higromicina, a fin de permitir la detección y/o
selección de dichas células transformadas con las secuencias de
ácido nucleico deseadas (50).
Para expresión en sistemas eucariotas, puede
utilizarse un sistema de expresión de levadura. Los sistemas de
expresión de levadura presentan varias ventajas. En primer lugar,
existe evidencia de que los polipéptidos producidos en un sistema
de expresión de levadura exhiben un apareamiento correcto de
disulfuro. En segundo lugar, la glicosilación posterior a la
traducción es realizada eficientemente por los sistemas de expresión
de levadura. La región conductora del factor
pre-pro-alfa de Saccharomyces
cerevisiae (codificada por el gen
MF\alpha-1) se utiliza rutinariamente para
dirigir la secreción de proteínas por la levadura (51). La región
conductora del factor pre-pro-alfa
contiene un péptido señal y un segmento pro que incluye una
secuencia de reconocimiento para una proteasa de levadura codificada
por el gen KEX2. Esta enzima escinde la proteína precursora
en el lado del carboxilo de una secuencia señal de escisión del
dipéptido Lys-Arg. La secuencia codificante del
polipéptido puede fusionarse en marco a la región conductora del
factor pre-pro-alfa. Esta
construcción se pone luego bajo el control de un promotor fuerte de
la transcripción, tal como el promotor I de la
alcohol-deshidrogenasa o un promotor glicolítico. La
secuencia codificante va seguida por un codón de terminación de la
traducción, que va seguido a su vez por señales de terminación de la
transcripción. Alternativamente, la secuencia codificante de
interés puede fusionarse a una segunda secuencia de codificación de
polipéptidos, tal como Sj26 o
\beta-galactosidasa, utilizada para facilitar la
purificación del polipéptido de fusión resultante por cromatografía
de afinidad. La inserción de sitios de escisión de proteasas para
separar los componentes del polipéptido de fusión es aplicable a las
construcciones utilizadas para expresión en levadura.
La glicosilación y expresión eficientes
posteriores a la traducción de polipéptidos recombinantes pueden
lograrse también en sistemas de Baculovirus en células de
insecto, que son bien conocidos en la técnica.
Los ácidos nucleicos de esta invención pueden
expresarse también en células de mamífero para producir los
péptidos y polipéptidos de esta invención. Las células de mamífero
permiten la expresión de péptidos y polipéptidos en un ambiente que
favorece modificaciones importantes posteriores a la traducción
tales como el plegado y apareamiento de las cisteínas, la adición
de estructuras complejas de carbohidratos y la secreción de proteína
activa. Los vectores útiles para la expresión de péptidos y
polipéptidos en células de mamífero se caracterizan por inserción
de la secuencia codificante entre un promotor viral fuerte y una
señal de poliadenilación. Los vectores pueden contener genes que
confieren resistencia a gentamicina o metotrexato para uso como
marcadores seleccionables. Por ejemplo, la secuencia codificante
puede introducirse en una línea de células de ovario de hámster
chino (CHO) utilizando un vector codificante de resistencia al
metotrexato. La presencia del RNA vector en células transformadas
puede confirmarse por análisis mediante transferencia Northern, y la
producción de un cDNA o RNA de la cadena opuesta correspondiente a
la secuencia codificante del péptido o polipéptido puede
confirmarse por análisis mediante transferencias Southern y
Northern, respectivamente. Se han desarrollado en la técnica varias
otras líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de producir
péptidos y polipéptidos exógenos, que incluyen las líneas de
células CHO, células HeLa, líneas de células de mieloma, células
Jurkat y análogas. Vectores de expresión para estas células pueden
incluir secuencias de control de la expresión, como se ha descrito
arriba.
Los ácidos nucleicos y/o vectores de esta
invención pueden transferirse a la célula hospedadora por métodos
bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de célula
hospedadora. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se
utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que pueden
utilizarse el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación
para otros hospedadores celulares.
Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos
y polipéptidos de esta invención pueden administrarse también como
vacunas de ácido nucleico. Para los propósitos de suministro de
vacunas, un ácido nucleico codificante de un péptido o polipéptido
de esta invención puede encontrarse en un vector de expresión que
puede comprender ácido nucleico viral con inclusión, pero sin
carácter limitante, ácido nucleico de virus vaccinia, adenovirus,
retrovirus y/o virus adeno-asociado. El ácido
nucleico o vector de esta invención puede encontrarse también en un
liposoma o un vehículo de suministro que puede ser capturado por una
célula mediante endocitosis mediada por receptores u otro tipo de
endocitosis. Las vacunas de ácido nucleico de esta invención pueden
encontrarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable o
administrarse con un adyuvante. Los ácidos nucleicos que codifican
los péptidos y polipéptidos de esta invención pueden administrarse
también a las células in vivo o ex vivo.
Los anticuerpos generados contra los péptidos de
esta invención y aislados de antisuero de esta invención son útiles
para bloqueo de la fijación del motivo CX3C o como herramientas de
investigación. Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos",
como se utilizan en esta memoria, incluyen anticuerpos monoclonales,
policlonales, quiméricos, monocatenarios, biespecíficos,
simianizados, y humanizados, así como fragmentos Fab, con inclusión
de los productos de una genoteca de presión de inmunoglobulinas Fab.
El término "antígeno" hace referencia a la glicoproteína G de
RSV o cualquier porción de la glicoproteína G que se fija a CX3C o
un péptido de glicoproteína G que puede inducir una respuesta
inmunitaria en un mamífero.
Como se ha descrito arriba, los anticuerpos
proporcionados en esta memoria pueden ser monoclonales o
policlonales, preferiblemente un fragmento F(ab)'2 que
carece de la porción Fc del anticuerpo. Los anticuerpos pueden
prepararse por generación de hibridomas de células B, como se
describe con mayor detalle más adelante, o por utilización de
animales de laboratorio tales como ratones, ratones humanizados,
ratas, conejos o cabras que se inmunizan con los péptidos y/o
polipéptidos de esta invención. Los péptidos y/o polipéptidos pueden
contener mutaciones de deleción, inserción y/o sustitución en la
glicoproteína G que abarca parte de o la totalidad de los
aminoácidos 182-186 de la glicoproteína G de RSV, o
puede utilizarse para la inmunización la glicoproteína G de RSV
intacta, una porción de la glicoproteína G de RSV, o una
glicoproteína G de RSV modificada. Puede llevarse luego a cabo un
cribado para identificar anticuerpos que bloquean la fijación de la
glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o bloquean las actividades
inducidas por la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1.
Para mejorar la respuesta de anticuerpos, pueden incluirse
adyuvantes o modificadores inmunológicos, como se describe con
mayor detalle más adelante. Se prefieren especialmente vacunas
constituidas por variaciones de la secuencia de aminoácidos CWAIC
que añaden uno o más residuos adicionales (v.g., CWAIAC) y/o
delecionan uno o más residuos (v.g., CWAC) del motivo CXXXC
definido por la secuencia de aminoácidos CWAIC (v.g.,
182-186). La vacuna puede comprender también las
porciones de la glicoproteína G proximales al motivo CX3C.
Adicionalmente, el motivo CX3C puede alterarse de una diversidad de
maneras que incluyen, pero sin carácter limitante, deleción de uno
o ambos residuos cisteína ("C") o aumento o disminución del
número de residuos ("X") entre los residuos cisteína.
Los anticuerpos monoclonales se generan por
métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. El método
preferido es una versión modificada del método de Kearney et
al. (52), que se incorpora por referencia en su totalidad en
esta memoria. Resumidamente, animales tales como ratones o conejos
se inoculan con el inmunógeno en adyuvante, y se recogen células
del bazo que se mezclan a continuación con una línea de células de
mieloma. Se induce la fusión de las células por adición de
polietilenglicol. Se seleccionan químicamente hibridomas por
extensión en placa de las células en un medio de selección que
contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Los hibridomas
se criban subsiguientemente respecto a la aptitud para producir
anticuerpos monoclonales que bloqueen la fijación de la
glicoproteína G de RSV a CX3CR1 y/o modulen la actividad biológica
asociada con la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1. Los
anticuerpos que producen hibridomas se clonan, se expanden y se
guardan congelados para producción futura.
Métodos para la producción de anticuerpos
monocatenarios son conocidos por los expertos en la técnica y se
describen en la patente U.S. No. 4.946.778, y pueden utilizarse para
producir anticuerpos monocatenarios para los motivos descritos en
esta memoria. Puede utilizarse tecnología de presentación de fago
para seleccionar genes de anticuerpos que tengan actividades de
fijación para el motivo XC3C, procedentes de genes \mu
amplificados por PCR de linfocitos de humanos cribados respecto a
la posesión de anticuerpos para el motivo CX3C o genotecas naíf.
Los anticuerpos de esta invención son útiles
para bloquear la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o
para modular la actividad biológica asociada con la fijación de la
glicoproteína G de RSV a CX3CR1 por una vacuna de virus no vivo o
para inmunización pasiva. Preferiblemente, el anticuerpo se modifica
de tal manera que el mismo sea menos inmunógeno en el paciente al
que se administra. Por ejemplo, si el paciente es un humano, el
anticuerpo puede "humanizarse" por transplante de las regiones
determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de
hibridoma a un anticuerpo monoclonal humano como ha sido descrito
por Jones et al. (53).
Los anticuerpos policlonales se preparan por
cribado de donantes de sangre humanos y selección de aquéllos que
tienen títulos altos de anticuerpos que bloquean la fijación de la
glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o bloquean las actividades
inducidas por la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1, así
como anticuerpos que tienen otras funciones biológicas importantes,
v.g., anticuerpos neutralizantes. Pueden obtenerse también
anticuerpos policlonales por inmunización de donantes con vacunas
que inducen anticuerpos que bloquean la fijación de la
glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o que bloquean las actividades
inducidas por la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1,
y/o tienen otras funciones biológicas importantes, v.g., anticuerpos
neutralizantes. El suero procedente de los donantes seleccionados
se reagrupa luego y se convierte en preparaciones de
inmunoglobulina.
Se proporcionan ensayos para cribar vacunas y
fármacos, compuestos químicos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos
u otras moléculas en cuanto a la aptitud para bloquear la fijación
de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1, o para bloquear las
actividades inducidas por la fijación de la glicoproteína G de RSV a
CX3CR1. Ensayos de esta invención incluyen aquéllos 1) que detectan
la capacidad para neutralizar el virus RSV no neutralizado por
heparina; 2) que detectan la capacidad para bloquear la fijación de
la glicoproteína G de RSV a células transfectadas con el receptor
CX3CR1; o 3) que detectan la capacidad para bloquear la migración de
los leucocitos mediada por la glicoproteína G de RSV.
Composiciones inmunológicas que incluyen las
vacunas arriba descritas, y otras composiciones farmacéuticas que
contienen el RSV vivo modificado o RSV no vivo o las glicoproteínas
G, polipéptidos, péptidos o anticuerpos de RSV que contienen CX3C,
se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Una o más
de estas composiciones pueden formularse y envasarse, solas o en
combinación, utilizando métodos y materiales conocidos por los
expertos en la técnica de las vacunas. La respuesta inmunológica
puede utilizarse terapéutica o profilácticamente y puede
proporcionar inmunidad de anticuerpos o inmunidad celular tal como
la producida por linfocitos T tales como linfocitos T citotóxicos o
linfocitos T CD4^{+}.
Las composiciones inmunológicas, tales como
vacunas, y otras composiciones farmacéuticas pueden administrarse
solas o en cualquier combinación para tratar o proteger contra las
infecciones causadas por RSV. En particular, las composiciones
pueden utilizarse para proteger a los humanos contra la
bronquiolitis, una infección del tracto respiratorio superior o una
infección del tracto respiratorio inferior causada por infección de
RSV.
Para mejorar la inmunogenicidad, las
glicoproteínas G, polipéptidos o péptidos de esta invención de RSV
que contienen CX3C pueden conjugarse a una molécula portadora.
Portadores inmunógenos adecuados incluyen proteínas, polipéptidos,
o péptidos tales como albúmina, hemocianina, tiroglobulina y
derivados de los mismos, particularmente
sero-albúmina bovina (BSA) y hemocianina de lapa
perforada (KLH), polisacáridos, carbohidratos, polímeros, y fases
sólidas. Otras sustancias derivadas de proteínas o derivadas de
sustancias distintas a las proteínas son conocidas por los expertos
en la técnica. Un vehículo inmunógeno tiene típicamente un peso
molecular de al menos 1000 daltons, y preferiblemente mayor que
10.000 daltons. Las moléculas portadoras contienen a menudo un
grupo reactivo para facilitar la conjugación covalente al hapteno.
El grupo ácido carboxílico o grupo amino de los aminoácidos o los
grupos azúcar de las glicoproteínas se utilizan a menudo de esta
manera. Los vehículos que carecen de tales grupos pueden hacerse
reaccionar a menudo con productos químicos apropiados para producir
los mismos. Preferiblemente, se produce una respuesta inmunitaria
cuando el inmunógeno se inyecta en animales tales como humanos,
ratones, conejos, ratas, cabras, ovejas, cobayos, pollos, y otros
animales, muy preferiblemente ratones y conejos. Alternativamente,
un péptido antigénico múltiple que comprende múltiples copias de la
proteína o polipéptido, o un polipéptido antigénica o
inmunológicamente equivalente, puede ser suficientemente antigénico
para mejorar la inmunogenicidad sin el uso de un vehículo.
Las glicoproteínas G, polipéptidos o péptidos de
RSV que contienen CX3C o la glicoproteína G de RSV intacta,
polipéptidos o péptidos de glicoproteína G de RSV, o modificaciones
de la glicoproteína G de RSV que inducen anticuerpos que bloquean
la fijación de la glicoproteína G de RSV a CX3CR1 o que bloquean las
actividades inducidas por la fijación de la glicoproteína G de RSV
a CX3CR1 pueden administrarse con un adyuvante en una cantidad
eficaz para mejorar la respuesta inmunógena. Hasta ahora, el único
adyuvante utilizado de modo generalizado en humanos ha sido alumbre
(fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La saponina y su
componente purificado Quil A, adyuvante de Freund completo y otros
adyuvantes utilizados en investigación y aplicaciones veterinarias
tienen toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas humanas.
Sin embargo, preparaciones químicamente definidas, tales como
muramil-dipéptido,
monofosforil-lípido A, conjugados de fosfolípidos,
encapsulación del conjugado con un proteoliposoma, y encapsulación
de la proteína en vesículas lipídicas pueden ser también útiles.
Se describen también en esta memoria métodos
para el tratamiento de los individuos diagnosticados con enfermedad
RSV y afecciones asociadas con la infección por RSV, tales como
bronquiolítis, infección respiratoria superior e infección
respiratoria inferior por administración de las composiciones arriba
descritas.
Se proporciona también por esta invención una
composición para tratamiento o prevención de una infección de RSV
en un individuo, por administración al individuo de una cantidad
eficaz de péptido, polipéptido, anticuerpo monoclonal o ácido
nucleico codificante de péptidos de la glicoproteína G de RSV de
esta invención que altera la actividad biológica del motivo CX3C de
la glicoproteína G de RSV y una composición
anti-viral. Las composiciones
anti-virales pueden incluir inhibidores de la
replicación e infección por RSV de moléculas pequeñas semejantes a
fármacos: análogos de nucleósidos tales como ribavirina, EICAR,
Pirazofurina, 3-desazaguanina, GR92938X y LY253963.
Estos inhibidores están direccionados para inhibir la
inosina-monofosfato-deshidrogenasa
(IMPDH). Son también útiles inhibidores direccionados para inhibir
la adsorción y entrada de virus. Prominentes entre esta clase son
los polioxometalatos y CL387626 (Wyeth-Ayerst, Pearl
River, NY). Otros ejemplos de polioxometalatos son T118, benzatrona
de Trimeris, BABIM y RD30028. Son también útiles inhibidores de
oligonucleótidos antisentido de RSV, tales como V590, un inhibidor
que direcciona residuos en los genes NS1/NS2 de RSV.
Los péptidos de glicoproteína G de RSV pueden
incorporarse en un vehículo farmacéutico tal como solución salina,
dextrosa, agua, glicerol, etanol, otros compuestos terapéuticos, y
combinaciones de los mismos. La formulación debería ser apropiada
para el modo de administración que se describe más adelante y puede
incluir otros modificadores inmunitarios tales como heparina. La
composición puede contener también otros ingredientes biológicamente
inertes adicionales tales como saborizantes, cargas, etc.
Métodos de administración adecuados incluyen,
pero sin carácter limitante, suministro intramuscular, intravenoso,
intranasal, mucosal, por aerosol o por cualquier ruta que produzca
el efecto deseado de inhibir la actividad biológica del motivo (o
dominio) CX3C en la glicoproteína G. Otros ejemplos no limitantes de
tales rutas de administración incluyen administración oral,
parenteral y transdérmica.
Una vacuna de esta invención puede envasarse en
una dosificación simple para inmunización por administración
parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o
administración nasofaríngea (es decir, intranasal). La vacuna se
administra muy preferiblemente por inhalación. La vacuna está
combinada preferiblemente con un vehículo farmacéuticamente
aceptable para facilitar la administración. El vehículo es
usualmente agua o una solución salina tamponada, con o sin un
conservante. La vacuna puede estar liofilizada para resuspensión en
el momento de la administración; o en solución.
La microencapsulación de la vacuna proporcionará
también una liberación controlada. Numerosos factores contribuyen a
la selección de un polímero particular para microencapsulación. La
reproducibilidad de la síntesis de polímeros y el proceso de
microencapsulación, el coste de los materiales y el proceso de
microencapsulación, el perfil toxicológico, los requerimientos para
cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica
del polímero y los antígenos son todos ellos factores que deben
considerarse. Ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos,
poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres, poliamidas,
poli-(d,l-lactida-co-glicolida)
(PLGA) y otros polímeros biodegradables.
Una cantidad eficaz de las composiciones de esta
invención está comprendida entre cantidades de nanogramo/kg a
miligramo/kg para niños pequeños y adultos. Basándose en este
intervalo, pueden determinarse las dosificaciones equivalentes para
pesos corporales menores o mayores. La dosis debería ajustarse para
adaptarla al individuo al que se administra la composición y
variará con la edad, el peso y el metabolismo del individuo. La
vacuna puede contener adicionalmente estabilizadores tales como
timerosal (sal de sodio de
etil(2-mercaptobenzoato-S)mercurio)
(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o conservantes
fisiológicamente aceptables. La cantidad exacta de la composición
requerida variará de un individuo a otro, dependiendo de la especie,
la edad, el peso y el estado general del individuo, el péptido o
polipéptido particular utilizado, su modo de administración y
factores análogos. Así pues, no es posible especificar una cantidad
exacta para cada péptido o polipéptido. Sin embargo, una cantidad
apropiada puede ser determinada por una persona con experiencia
ordinaria en la técnica utilizando únicamente experimentación de
rutina una vez asimilada la doctrina de esta memoria. Un experto en
la técnica comprenderá que las dosificaciones se optimizan del
mejor modo posible por el médico que tenga a su cargo el
tratamiento, y métodos para la determinación de las cantidades y
regímenes de dosificación y la preparación de formas de dosificación
se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical
Sciences (47).
Como ejemplo, a un individuo diagnosticado con
una infección de RSV o que se sepa se encuentra en riesgo de sufrir
infección por RSV, pueden administrarse entre aproximadamente 50 y
1000 nM y, de modo más preferible, entre aproximadamente 100 y 500
nM de una composición de esta invención, y posiblemente en un
adyuvante, a intervalos de 1 a 3 semanas durante aproximadamente 12
semanas o hasta que una evaluación de los parámetros clínicos del
individuo (v.g., síntomas y niveles de RNA de RSV) indican que el
individuo no está infectado por RSV. El tratamiento puede
continuarse o reanudarse si los parámetros clínicos del individuo
indican que está presente infección por HCV (sic) y puede
mantenerse hasta que la infección ya no es detectada por estos
parámetros.
La invención se ilustra adicionalmente por los
elementos siguientes, que no deben interpretarse en modo alguno como
imposición de limitaciones en cuanto al alcance de la misma.
Se examinó glicoproteína G purificada en cuanto
a la fijación a células 293-CX3CR1^{33}. Se
utilizó un plásmido pcDNA 3.1 que contenía el gen CX3CR1 y un gen
de resistencia a la neomicina para transfectar de manera estable
células de riñón de embrión humano (HEK). Se utilizó la resistencia
a la neomicina para selección y mantenimiento de la transfección
plasmídica de las células de riñón de embrión humano. Para confirmar
la transfección, lisados de células de riñón de embrión humano
transfectadas con CX3CR1 se tiñeron con anticuerpo
anti-CX3CR1 en análisis de transferencias Western,
o se examinaron por citometría de flujo células transfectadas
intactas.
Todos los estudios de fijación se realizaron en
hielo y, o bien glicoproteína G o Fkn humano (R&D Diagnostics,
Minneapolis, MN) se diluyeron entre 1 nM y 100 nM en PBS (GIBCO) que
contenía 1% de seroalbúmina bovina (Sigma) y se incubaron con las
células 293-CX3CR1 o células 293 de control durante
30 min a 4ºC. Fijación de 293-CX3CR1 saturadas con
fractalquino entre 1 y 10 nM (sic). Para estudios de inhibición, se
preincubó Fkn humano 100 pM-1 \muM o
glicoproteína G con las células durante 30 min a 4ºC. Sin lavado, se
añadieron 100 pM de Fkn o glicoproteína G y se incubaron durante 30
min a 4ºC. Se lavaron las células, se bloquearon con anticuerpo de
bloqueo Fc\gammaRIII (HB197) durante 30 min en hielo, se lavaron y
se tiñeron en caso apropiado con un cóctel de anticuerpos
monoclonales anti-glicoproteína G
(132-5B, 132-5G,
130-2G, 232-1F) o un cóctel de
anticuerpos monoclonales anti-glicoproteína G
biotinilados (130-2G, 131-2G) o
anticuerpo monoclonal anti-Fkn (51637.11; R&D
Diagnostics). Se utilizaron en todos los experimentos
concentraciones de 1 \mug de anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína G
(131-2G)^{34}, suero de conejo
anti-CX3CR1^{33}, y anticuerpo monoclonal
anti-CX3CR1 que contenía 10 \mug/ml de heparina.
El porcentaje de inhibición en ausencia de heparina para la
inhibición de la glicoproteína G del anticuerpo
anti-glicoproteína G variaba desde 32 a 48% y desde
4 a 10% para Fkn, y la inhibición del anticuerpo
anti-CX3CR1 variaba desde 40 a 55% tanto para la
glicoproteína G como para Fkn. Los anticuerpos
anti-glicoproteína G 130-5F y
130-9G, que se había predicho se fijan fuera del
motivo CX3C^{35}, no inhibían la glicoproteína G ni Fkn
(intervalo 4-8%). Se detectó la tinción con
anticuerpo monoclonal anti-ratón (cadenas H&L)
de cabra con FITC adsorbido (PharMingen, San Diego, CA) o
estreptavidina-PE (PharMingen) utilizando
citometría de flujo (FACScan, Becton-Dickinson,
Mountain View, CA). Se utilizó un polipéptido
^{125}I-Fkn de 76 aminoácidos que comprendía el
dominio CX3CR (NEN, Boston, MA) en los estudios de
radioligandos^{33}. Como control, se examinó por citometría de
flujo el volumen vacío después del paso de la glicoproteína G
purificada por una columna de afinidad de anticuerpo
anti-glicoproteína G (130-2G)
respecto a la fijación a las células 293 o
293-CX3CR1. No se detectó fijación alguna de
glicoproteína G a las células 293 o 293-CX3CR1 por
citometría de flujo utilizando anticuerpo monoclonal
anti-G (131-2G). Los estudios de
inhibición utilizando el material eluido para competir por la
fijación de la glicoproteína G a las células 293 o
293-XC3CR1 no demostraron inhibición alguna, lo que
sugería que la glicoproteína G, y no un contaminante, se fijaba a
CX3CR1.
Para los estudios de inhibición de péptidos, se
identificaron una serie de péptidos de glicoproteína G en la
secuencia de aminoácidos de la cepa A2 de RSV (GENBANK; locus de la
proteína de fijación 1912305, Tabla 4). Los péptidos se
sintetizaron utilizando un método de síntesis de péptidos en fase
sólida simultáneo y múltiple en un sintetizador de péptidos
(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Berkeley, CA), y
se testaron en cuanto a homogeneidad por cromatografía líquida en
fase inversa y electroforesis capilar
(www.biotech.cdc.gov/protein/methods). Los ensayos de
inhibición se realizaron como se ha descrito anteriormente para los
estudios de fijación.
Se examinaron en este estudio dos preparaciones
diferentes de glicoproteína G: una glicoproteína G purificada
aislada de células Vero (RSV) infectadas con RSV/A2 (ATCC CCL 81;
infectadas con una multiplicidad de infección entre 0,5 y recogidas
entre los días 4 ó 5 p.i.), y una preparación purificada de
glicoproteína G soluble recombinante marcada con polihistidina. La
glicoproteína G purificada aislada de las células Vero infectadas
con RSV se utilizó en este estudio debido a que esta preparación
contenía la forma natural de la glicoproteína G; sin embargo, se
alcanzaron resultados comparables utilizando la preparación de
glicoproteína G soluble recombinante marcada con polihistidina. La
proteína G purificada aislada de las células Vero infectadas con
RSV se preparó utilizando una modificación de un procedimiento de
aislamiento en tres pasos descrito previamente^{44}.
Resumidamente, el lisado de virus recogido por
congelación-descongelación de matraces que contenían
células Vero infectadas por RSV se diluyó en PBS que contenía PMSF
1 mM y EDTA 2 mM, se trató por ultrasonidos en hielo, se centrifugó
a 100.000 g durante 30 min a 10ºC, y se recogió el sedimento. El
sedimento se resuspendió en tampón de carga (Tris 20 mM, NaCl 500
mM, PMSF 1 mM, DTT 2 mM, EDTA 2 mM,
N-acetil-glucosamina 10 mM y 1% de
Triton X-100, pH 7,5), se trató por ultrasonidos en
hielo, y se recogió un lisado aclarado después de centrifugación a
12.500 g durante 30 min a 4ºC. Las glicoproteínas virales se
capturaron utilizando una columna de lectina de germen de
trigo-Sepharose 4B eluida previamente con tampón de
carga que contenía
N-acetil-glucosamina 500 mM y
equilibrada con tampón de carga que contenía 1% de
n-octil-glucopiranosido (tampón
n-OG). La glicoproteína G se eluyó con tampón de
carga que contenía
N-acetil-glucosamina 500 mM y se
dializó contra dos cambios de tampón M (sacarosa 250 mM, MES 25
mM-NaOH, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM en tampón
n-OG, pH 5,7), y se cargó en una columna
Q-Sepharose de intercambio de anión eluida
previamente con tampón M que contenía NaCl 2 mM. La glicoproteína G
se eluyó utilizando un gradiente lineal de NaCl (desde 0,1 M a 1 M)
en tampón M. Las fracciones eluidas con NaCl 100 mM y 200 mM que
contenían la glicoproteína G se dializaron contra dos cambios de
PBS.
Se preparó glicoproteína G recombinante
purificada marcada con polihistidina a partir de células Vero
transfectadas establemente con pcDNA codificante de glicoproteína G
soluble marcada con polihistidina bajo selección con zeocina. Las
células transfectadas se congelaron a -70ºC, se recogieron las
células en PBS que contenía PMSF 1 mM, y se centrifugaron a 1000 g
durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspendió en tampón Gsol
(NaPO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM, sacarosa 250 mM, PMSF 1 mM, 1%
Triton X-100, pH 7,5), se trató por ultrasonidos en
hielo, y se centrifugó luego a 12.500 g durante 30 min a 4ºC. La
glicoproteína G marcada con polihistidina se capturó y se purificó
utilizando una columna de HisTrap-Sepharose 4B
(columna de afinidad Ni-NTA) como se describe por
el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). La
glicoproteína G marcada con polihistidina se eluyó con tampón Gsol
que contenía 1% de tampón n-OG e imidazol 250 mM, y
se dializó contra dos cambios de PBS.
La caracterización del contenido de la
preparación de glicoproteína G se realizó por electroforesis en gel
y transferencia Western. La fracción de la columna de lectina de
germen de trigo enriquecida a la vez en glicoproteínas G y F
procedentes del lisado de las células Vero infectadas con RSV
produjo bandas múltiples por electroforesis en gel y tinción con
plata (Figura 4). Las bandas localizadas aproximadamente a 90 kD y
45 kD corresponden a dos bandas detectadas por transferencia
Western con anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína
G (131-2 G)^{34} y una banda a
aproximadamente 70 kD corresponde a una banda detectada por
transferencia Western con un anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína F
(131-2A)^{34} (Figura 4). Después del paso
de purificación final, es decir, la elución con
Q-Sepharose, únicamente se detectaba la banda de
glicoproteína G por transferencia Western (Figura 4), lo que
indicaba que la preparación de glicoproteína G final no contenía
glicoproteína F detectable. La glicoproteína G recombinante
purificada marcada con polihistidina, recuperada de la columna
His-Trap-Sepharose 4B, contenía
glicoproteína G pero no glicoproteína F como se detectó por
transferencia Western (panel 4) y otras bandas de proteína indicadas
por electroforesis en gel y tinción con plata.
Se examinó el tráfico de células al pulmón en
ratones BALB/c naíf e inmunes frente a FI-RSV
después de tratamiento intranasal con fractalquino 1 \muM,
glicoproteína G de RSV o péptidos G de RSV. Todos los ratones eran
hembras adquiridas de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) y
mantenidas en los Centers para Disease Control and Prevention en
Atlanta, GA. Los ratones inmunes frente a FI-RSV se
inmunizaron en el músculo glúteo superficial utilizando 10^{5}
equivalentes pfu de FI-RSV de acuerdo con métodos
conocidos por los expertos en la técnica. Los ratones se
anestesiaron con 2,2,2-tribromoetanol y se trataron
por vía intranasal con 0,05 ml de fractalquino, glicoproteína G de
RSV o péptido diluido en PBS (GIBCO). El día 2 después del
tratamiento, se anestesiaron los ratones, se desangraron por corte
de la arteria caudal derecha, y las células broncoalveolares (BAL)
se recogieron en PBS que contenía 1% de BSA (Sigma). Las células
BAL se bloquearon con 10% de suero normal de ratón (Jackson
Laboratories, Bar Harbor, ME) en PBS, y se tiñeron luego con las
combinaciones apropiadas de anti-CD3 marcado con
FITC o PE (145-2C11), anti-CD4
(GK1.5), anti-CD8 (53-6.7),
anti-CD11B (M1/70), anti-CD45R/B220
(RA3-6B2), células anti-pan NK
(DX5), anti-neutrófilos (RB6-8C5), y
controles de ratón isotipo Ab (todos ellos de PharMingen, San
Diego, CA). La distribución de los marcadores de la superficie
celular se determinó en modo de dos colores en un FACScan con
software CellQUEST (Becton-Dickinson, Mountain View,
CA).
Se midió la quimiotaxis de los leucocitos hacia
Fkn, glicoproteína G o medio de acuerdo con Boyden^{46}
utilizando placas de 24 pocillos (Costar, Cambridge, MA) con
inserciones de filtros de 3 \mum (Nalge Nunc, Rochester, NY)
recubiertas con una matriz extracelular constituida primariamente
por laminina, colágeno IV y proteoglicano (ECM, Sigma, St. Louis,
MO). Para estudios en murinos, se pusieron 5 x 10^{5} células naíf
de bazo en la cámara superior y se pusieron Fkn de ratón 10 nM o
glicoproteína G 10 nM, anticuerpo anti-CX3CR1,
anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína G o
anti-glicoproteína F, suero normal de conejo, suero
de conejo anti-CCR5 o medio en la cámara superior o
la inferior según fuera apropiado. Para los estudios en humanos, se
pusieron 10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
purificadas en gradiente de densidad (Linfocito Separation Media,
ICN Biomedicals, Aurora, OH, según instrucciones del fabricante)
procedentes de donantes adultos humanos normales en la cámara
superior en presencia o ausencia de péptido RT33 1 \muM, y Fkn
humano 10 nM, glicoproteína G 10 nM o péptido RT33 1 \muM se
pusieron en las cámaras inferiores. La cámara Boyden modificada se
incubó a 37ºC durante 4-6 h, se retiraron las
inserciones, se lavaron en PBS (GIBCO BRL), se fijaron en aldehído
glutárico al 3% y se tiñeron en violeta cristal al 0,01% tamponado
con formalina. Las células quimiotácticas se visualizaron con un
microscopio. Las células quimiotácticas se analizaron respecto a la
expresión de CX3CR1 por recogida de las células de las cámaras
Boyden superiores o inferiores modificadas, tinción con anticuerpo
(2A9-1) y citometría de flujo como se ha descrito.
Los leucocitos quimiotácticos hacia G o Fkn expresaban un
porcentaje mayor de CX3CR1 en la cámara inferior
(25-30%) en comparación con la cámara superior
(7-11%).
Se realizaron diluciones de Fkn (R&D
Systems), SDF-1\alpha (R&D Systems),
glicoproteína G, heparina (Sigma), péptidos de glicoproteína G y
anticuerpo anti-CX3CR1 en Medio de Eagle modificado
de Dulbecco exento de suero (DMEM; GIBCO) que contenía 1% de BSA
(Sigma) y se preincubaron con las células Vero durante 1 h a 37ºC.
Se utilizaron en todos los experimentos 50 \mug de anticuerpo
anti-CX3CR1 o suero normales de conejo desactivados
por calentamiento (56ºC, 30 min) (control). El suero normal de
conejo no tenía efecto significativo alguno sobre el número de
calvas. Se realizaron diluciones de RSV en DMEM exento de suero
(GIBCO) y se añadieron a células Vero tratadas previamente durante
2 h a 37ºC. Después de la infección con el virus, se añadió a los
pocillos DMEM (GIBCO) que contenía 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT).
Se enumeraron las calvas utilizando inmunotinción para las
glicoproteínas F y G con utilización de anticuerpos monoclonales
biotinilados 131-2A
(anti-glicoproteína F) y 130-2G
(anti-glicoproteína G) como se ha
descrito^{45}.
El aislamiento de RNA y el análisis
multi-sonda de protección contra RNAsa (RPA) se
realizó de acuerdo con el fabricante (PharMingen, San Diego, CA).
El mRNA se aisló utilizando un kit Poli(A)Pure
(Ambron, Austin, TX). Se utilizaron células Vero para extracción
del RNA. El RNA total se extrajo utilizando RNA
STAT-50LS como se describe por el fabricante
(TEL-TEST Inc., Friendswood, TX). Se detectó el mRNA
V28 por RPA utilizando el RiboQuant Multi-Probe
RNase Protection Assay System (PharMingen, San Diego, CA).
Se identificó previamente el receptor para Fkn,
CX3CR1, y se caracterizó utilizando antisuero de conejo
anti-CX3CR1 y células de riñón de embrión humano
transfectadas con CX3CR1 (células
293-CX3CR1)^{33}. La citometría de flujo
utilizando antisuero de conejo anti-CX3CR1^{33}
indicó que el porcentaje de CX3CR1 detectable en las células
293-CX3CR1 aumentaba desde 4-10% en
las células 293 no transfectadas hasta 80-92% para
las células 293-CX3CR1. La fijación de Fkn a las
células 293-CX3CR1 alcanzaba un máximo y se mantenía
constante en 100 pM-10 nM, por lo que se utilizó
Fkn 10 nM para calcular el porcentaje de fijación máxima de Fkn
(Fkn-Maximum, Tabla 1). El examen de una fracción
de la columna de lectina de germen de trigo enriquecida a la vez en
las glicoproteínas G y F (Figura 4) demostró que la fijación de la
glicoproteína G aumentaba desde 18% en las células 293 hasta 70% en
las células 293-CX3CR1, mientras que la fijación de
la glicoproteína F aumentaba desde 8% en las células 293 hasta 12%
en las células 293-CX3CR1. Para confirmar la
fijación de la glicoproteína G a las células
293-CX3CR1 se utilizó un anticuerpo monoclonal para
glicoproteína G^{34} en un estudio de inhibición de la fijación
con una glicoproteína G purificada recombinante marcada con
polihistidina (10 nM, Tabla 2). El anticuerpo monoclonal
anti-glicoproteína G (131-2G), que
es reactivo con un fragmento de glicoproteína G (aminoácidos
1-173)^{35}, inhibía el 86 a 92% de la
fijación de glicoproteína G a las células 293-CX3CR1
como se detectaba por un panel de anticuerpos monoclonales
anti-glicoproteína G reactivos frente a 3 sitios
antigénicos diferentes en la glicoproteína G^{35}, pero no inhibía
la fijación de Fkn (0-4%). En contraste, el
anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína G
130-2G, reactivo con un dominio
COOH-terminal de la glicoproteína G (aminoácidos
215-298)^{35}, y un anticuerpo para
glicoproteína F, no inhibían la fijación de la glicoproteína G
(12-20% y 4-12%, respectivamente) o
Fkn (5-10% y 4-10%, respectivamente)
a las células 293-CX3CR1. Como era de esperar, la
fijación de la glicoproteína G recombinante marcada con
polihistidina aumentaba desde un intervalo de 7 a 12% para las
células 223 hasta un intervalo de 68-88% para las
células 293-CX3CR1, y la fijación a las células
293-CX3CR1 era inhibida (80-88%) por
el anticuerpo monoclonal 131-2G.
Para determinar si la glicoproteína G se fijaba
a las células 293-CX3CR1 por CX3CR1, se examinó la
capacidad de cuatro reactivos (antisuero
anti-CX3CR1 de conejo, anticuerpo monoclonal
anti-CX3CR1 (2A 9-1), Fkn y un
polipéptido de 76 aminoácidos ^{125}I-Fkn que
contenía el dominio CX3C) que se fijan a CX3CR1 para bloquear la
fijación de la glicoproteína G a las células
293-CX3CR1. Adicionalmente, para determinar si la
fijación de glicoproteína G a las células
293-CX3CR1 era dependiente del motivo CX3C, se
generaron péptidos de glicoproteína G con una sola inserción
(\Delta + 1) o deleción (\Delta - 1) de residuo en el motivo
CX3C, y asimismo péptidos que carecían de o incluían el motivo CX3C
(Tabla 4). Este panel de péptidos se analizó respecto a su
capacidad para bloquear la fijación de glicoproteína G o Fkn a las
células 293-CX3CR1.
Dado que tanto la glicoproteína G como Fkn
pueden fijarse a las células por interacciones
HBD-GAG^{22,37,38}, se incluyó heparina en estos
estudios para inhibir esto (Tabla 2). La fijación de glicoproteína G
a las células 293-CX3CR1 era inhibida mínimamente
(20-34%) por Fkn solo; sin embargo, la adición de
Fkn a heparina inhibía casi por completo la fijación de la
glicoproteína G (desde 78-84% hasta
85-98%). La interacción extensa de glicoproteína
G HBD-GAG con las células 293-CX3CR1
no es inesperada, dada la naturaleza altamente glicosilada de la
glicoproteína G^{28}. La fijación de la glicoproteína G a las
células 293-CX3CR1 en presencia de heparina era
inhibida también adicionalmente por el péptido RT33 que contenía el
motivo CX3C (desde 78-84% hasta
85-94%) y por la adición de los dos anticuerpos
anti-CX3CR1 (desde 78-84% hasta
88-94%). Se observó un aumento similar en la
inhibición de la fijación de Fkn a las células
293-CX3CR1 en presencia de heparina con la adición
de glicoproteína G (desde 57-65% hasta
80-85%) o péptido RT33 (desde 57-65%
hasta 70-80%) o los dos anticuerpos
anti-CX3CR1 (78-84% a
88-97%). Los péptidos que no contenían el motivo
CX3C (RT32, RT34) y los péptidos con cambios en el motivo CX3C
(\Delta +1 y \Delta -1) (Tabla 4) así como el suero normal de
conejo de control no afectaban a la fijación. Estos datos sugieren
que la mayor parte de la fijación de la glicoproteína G ocurre por
interacción HBD-GAG y la mayor parte de la fijación
restante se debe a la interacción de la glicoproteína G con CX3CR1.
El tratamiento con concentraciones 10 nM-10 \muM
de diferentes quimioquinas (MIP-2,
IP-10, proteína-1 afín a la
proteína inflamatoria de los macrófagos (C10) y el oncogén \alpha
regulado por el crecimiento, KC) era también incapaz de alterar la
fijación de Fkn o glicoproteína G a las células
293-CX3CR1. Estudios de inhibición de
radioligandos^{36} demostraron que Fkn y la glicoproteína G
inhibían más del 90% de la fijación del polipéptido
^{125}-I Fkn a las células
293-CX3CR1 a concentraciones de 10 pM a 10 nM
(Figura 2). El análisis Scatchard de los datos de fijación reveló
K_{d} para Fkn = 5,8 \pm 1,4 nM, y K_{d} para
glicoproteína G = 2,1 \pm 1,6 nM.
Se consideró también el impacto de la fijación
de glicoproteína G a CX3CR1 en el curso de la infección viral por
examen de la reducción de las calvas de RSV en células Vero después
de tratamiento con heparina, Fkn, glicoproteína G, péptidos de
glicoproteína G y anti-CX3CR1 (Tabla 3). Se detectó
la expresión de CX3CR1 en células Vero no infectadas
(31-51% de las células) y células Vero infectadas
con RSV (60-85% de las células) por citometría de
flujo, y se detectó mRNA de CX3CR1 por análisis de protección contra
RNAsa. Los resultados de los ensayos de infectividad (Tabla 3) eran
similares a los de los estudios de inhibición de la fijación de
glicoproteína G (Tabla 2), en los cuales glicoproteína G, Fkn,
péptido RT33, anticuerpo anti-CX3CR1 y heparina
inhibían todos ellos la reducción de calvas, pero \Delta +1,
\Delta -1, RT32 y los péptidos de glicoproteína RT34 (Tabla 4), y
el suero normal de conejo tenían efecto mínimo a nulo. El aumento
sobre la reducción de calvas asociada a heparina (66%) por la
adición de glicoproteína G (98%), Fkn (97%), péptido RT33 (92%) y
anticuerpo anti-CX3CR1 (91%), (Tabla 3) sugiere que
RSV se fija a CX3CR1 por la glicoproteína G. Los péptidos que
carecen del motivo CX3C (RT32, RT34) o con cambios en el motivo CX3C
(\Delta +1 y \Delta -1) (Tabla 4) no aumentaban la reducción de
calvas asociadas a heparina (Tabla 3).
Estas proteínas tenían efectos similares sobre
la reducción de calvas utilizando un inóculo de RSV 10 a 100 veces
mayor. La especificidad de la fijación de glicoproteína G a CX3CR1
estaba respaldada adicionalmente por la reducción de calvas después
de tratamiento con anticuerpo anti-CX3CR1 solo
(38%). La inhibición por los anticuerpos
anti-CX3CR1 era comparable a la inhibición por el
péptido RT33 solo (16%). Dado que el análisis de protección de RNA
demostraba que la infección por RSV aumentaba la expresión de mRNA
de CXCR4 (Figura 6), se realizó la reducción de calvas por
SDF-1\alpha, un ligando para CXCR4, pero no se
detectó efecto alguno sobre la formación de calvas de RSV (Tabla
3).
Dado que la glicoproteína G es un ligando para
CX3CR1, se testó si la misma podría actuar como mimético de Fkn
para inducir la quimiotaxis leucocitaria de los leucocitos naíf de
ratón^{39,40} y alterar posiblemente la quimiotaxis de los
leucocitos mediada por Fkn. (Figura 3). Tanto Fkn como la
glicoproteína G inducían índices de quimiotaxis similares
(4,5-5,0 en una cámara Boyden modificada. Los
anticuerpos CX3CR1 inhibían la quimiotaxis de los leucocitos hacia
la glicoproteína G o hacia Fkn (índices de quimiotaxis
1,8-2,2). Además, la glicoproteína G inhibía la
quimiotaxis de los leucocitos hacia Fkn aproximadamente en un 37%
(índice de quimiotaxis 3,2), en tanto que Fkn inhibía la
quimiotaxis de los leucocitos hacia la glicoproteína G
aproximadamente en un 75% (índice de quimiotaxis 1,2).
Adicionalmente, anti-glicoproteína G
(131-2G) inhibía la quimiotaxis de los leucocitos
hacia glicoproteína G (índice de quimiotaxis 1,1), pero no hacia Fkn
(índice de quimiotaxis 4,8), y la quimiotaxis hacia glicoproteína G
o Fkn no se veía afectada por tratamiento con
anti-glicoproteína F (131-2A)
(índices de quimiotaxis 3,9-4,8). Los resultados de
estos estudios de inhibición sugieren que glicoproteína G y Fkn
inducen quimiotaxis por un mecanismo similar.
Se observaron los resultados análogos en
estudios de quimiotaxis examinando células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) humana purificadas (Tabla 5). El porcentaje total
de expresión positiva de CX3CR1 para todos los tipos de células en
la población de PBMC antes de la quimiotaxis estaba comprendido
entre 38 y 49%; sin embargo, durante la incubación a 37ºC, la
expresión de CX3CR1 disminuye, y al cabo de 2 horas después de la
incubación está comprendida entre 21 y 37% de expresión, a las 4
horas después de la incubación está comprendida entre 11 y 26% de
expresión y al cabo de 6 horas después de la incubación está
comprendida entre 8 y 30% de expresión. La disminución de la
expresión de CX3CR1 en PBMC durante la incubación refleja
probablemente endocitosis del receptor y un reciclo que es común
entre los receptores de quimioquinas^{41}. Al cabo de 6 horas
después de la incubación en las cámaras de Boyden, el porcentaje de
leucocitos CX3CR1^{+} que migraban hacia glicoproteína G o Fkn en
la cámara Boyden inferior era mayor (25-30%)
comparado con los leucocitos que quedaban en la cámara Boyden
superior (7-11%). La quimiotaxis de los leucocitos
hacia el péptido RT33 en la cámara Boyden inferior era moderada
(intervalo 1,6-2,2). Los índices de quimiotaxis
sustanciales para glicoproteína G y Fkn (3,0-3,7),
la capacidad de la glicoproteína G y Fkn para reducir mutuamente la
quimiotaxis por el otro, y la mayor expresión de CX3CR1 en los
leucocitos quimiotácticos hacia glicoproteína G o Fkn 10 nM sugieren
que tanto glicoproteína G como Fkn inducen quimiotaxis por
mecanismos similares que implican CX3CR1. La adición de péptido RT33
1 \muM a las cámaras Boyden superiores reducía la quimiotaxis
tanto hacia glicoproteína G como hacia Fkn, pero los péptidos de
glicoproteína G que carecían del motivo CX3C (Tabla 4) no reducían
la quimiotaxis hacia G o Fkn.
Estudios realizados en ratones BALB/c naíf
demuestran que G y Fkn reclutan también leucocitos in vivo
(Figura 5B y Tabla 6). CX3CR1 se expresa en leucocitos de ratón y
de rata, y por inmunoprecipitación se detectó CX3CR1 en
esplenocitos naíf de ratón, una línea de células monocíticas de
ratón (LADMAC), así como en una línea de células epiteliales
humanas (HUT-292, datos no presentados). Los ratones
BALB/c naíf se trataron por vía intranasal con glicoproteína G, Fkn
o los péptidos RT32, RT33 y RT34 de glicoproteína G (Figura 2). El
número total de células BAL recuperadas al cabo de 48 horas después
del tratamiento se incrementaba por el tratamiento con Fkn,
glicoproteína G o péptido RT33. Los números medios de células BAL
(\pm SEM) recuperados después del tratamiento eran 3,8 (\pm
0,6) x 10^{5} células/ml para Fkn, 4,6 (\pm 1,1) x 10^{5}
células/ml para glicoproteína G, y 3,5 (\pm 0,3) x 10^{5}
células/ml para el péptido RT33, comparados con 2,2 (\pm 0,5) x
10^{5} células/ml para el péptido RT32 o 2,8 (\pm 0,2) x
10^{5} células/ml para el péptido RT34. Los macrófagos son el
tipo de células predominante en las células BAL con indiferencia del
tratamiento; sin embargo, el tratamiento con glicoproteína, Fkn y
péptido RT33 daba como resultado el reclutamiento de un mayor
porcentaje de PMNs y linfocitos al pulmón con relación al
tratamiento con los péptidos
RT32 o RT34.
RT32 o RT34.
Estos datos demuestran que la glicoproteína G
tiene semejanzas estructurales con Fkn y se fija a las células de
una manera similar a Fkn por CX3CR1 y GAG. La interacción entre
glicoproteína G y las células por CX3CR1 parece tener al menos dos
papeles importantes en la biología de la infección por RSV. En
primer lugar, la interacción del motivo CX3C sobre la glicoproteína
G con CX3CR1 en las células es capaz de modular la respuesta
inmunitaria como se demuestra por la capacidad de la glicoproteína G
para inducir la migración de los leucocitos en experimentos en
cámara Boyden. En segundo lugar, la fijación de glicoproteína G por
CX3CR1 facilita la infección. La especificidad de la interacción de
glicoproteína G con CXCR3 se analizó por ensayos de fijación y de
inhibición de la fijación con células 293-CX3CR1, y
por dos ensayos funcionales, los ensayos de reducción de calvas de
RSV y de migración e inhibición de la migración de los leucocitos.
Los resultados de estos ensayos demuestran que la fijación
incrementada de glicoproteína G está correlacionada con la expresión
incrementada de CX3CR1 en las células 293-CX3CR1, e
indicaban consistentemente que la glicoproteína G se fija a CX3CR1
por la vía del motivo CX3C. Los resultados consistentes de tres
preparaciones diferentes de glicoproteína G examinadas, el uso de
anticuerpos monoclonales anti-glicoproteína G para
detectar o inhibir la fijación a las células
293-CX3CR1, y la migración de los leucocitos hacia
la glicoproteína G demuestran el papel específico de la
glicoproteína G. Los estudios de inhibición con reactivos que se
sabe se fijan a CX3CR1 (Fkn, el polipéptido
^{125}I-Fkn, suero de conejo
anti-CX3CR1 y un anticuerpo monoclonal
anti-CX3CR1) respaldan el papel específico de
CX3CR1 en esta interacción. Los estudios de inhibición con péptidos
de glicoproteína G con o sin el motivo CX3C indican que la
interacción de la glicoproteína G con CX3CR1 ocurre, como era de
esperar, a través del motivo CX3C en la glicoproteína G. Los datos
presentados en esta memoria indican también que gran parte de la
fijación de glicoproteína G y RSV a las células ocurre por
interacción HBD-GAG, y que la fijación restante a
las células ocurre principalmente por fijación de glicoproteína G a
CX3CR1.
\newpage
La fijación de la glicoproteína G de RSV a
CX3CR1 en la superficie de las células facilita la infección de las
células por RSV. Estos datos demuestran que CX3CR1 así como GAG son
receptores para la infección de RSV y que la fijación del virus a
CX3CR1 por el motivo CX3C en la glicoproteína G explica algo y
posiblemente la totalidad de la fijación a las células no asociada a
GAG.
A lo largo de esta solicitud, se citan diversas
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América, representado por The Secretary, Department of Health and
Human Services
\hskip1cmTRIPP, RALPH A.
\hskip1cmJONES, LES
\hskip1cmANDERSON, LARRY J.
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<120> "COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA
MODULAR LA INFECCIÓN POR RSV Y LA INMUNIDAD"
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<130> 14114.0348P1
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<140> 160/241.521
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<141>
2000-10-18
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<160> 11
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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción sintética
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<400> 1
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<400> 2
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<220>
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Nota: Descripción de la Secuencia
Artificial = Construcción Sintética
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<400> 11
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\hskip1cm
Claims (36)
1. Una composición que comprende una molécula
bloqueante que inhibe la actividad biológica de un motivo CX3C de
una glicoproteína G del virus respiratorio sincitial, en donde C es
un residuo cisteína y X es cualquier residuo de aminoácido distinto
de cisteína, en donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene
una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ó
11, o un anticuerpo generado contra un péptido que tiene una
secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ó 11,
para inhibir la fijación de la glicoproteína G del virus
respiratorio sincitial a un receptor CX3CR1, en donde el anticuerpo
se fija específicamente a las posiciones de los aminoácidos
182-186 de una glicoproteína G nativa del virus
respiratorio sincitial o bloquea la actividad asociada con la
fijación al receptor CX3CR1.
2. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante se fija al virus respiratorio
sincitial.
3. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un anticuerpo que se fija al motivo
CX3C de la glicoproteína G de RSV o que se fija en posición proximal
al motivo CX3C y altera una estructura secundaria del motivo o
bloquea estéricamente la fijación de la glicoproteína G del virus
respiratorio sincitial a un receptor de CX3C o la actividad
biológica asociada con la fijación de la glicoproteína G del virus
respiratorio sincitial a un receptor de CX3C.
4. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante se fija al receptor de CX3C.
5. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCAAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 5).
6. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCWAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 6).
7. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCNAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 7).
8. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCDAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 8).
9. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCHAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 9).
10. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCMAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 10).
11. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCFAACKRIPNKK (SEQ ID NO: 11).
12. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
TCWAICKRIPNK (SEQ ID NO: 3).
13. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un péptido que tiene la secuencia
NKKPGKKTTKP (SEQ ID NO: 4).
14. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un anticuerpo que se fija al péptido
que tiene la secuencia TCWAICKRIPNK (SEQ ID NO: 3).
15. La composición de la reivindicación 1, en
donde la molécula bloqueante es un anticuerpo que se fija al péptido
que tiene la secuencia NKKPGKKTTKP (SEQ ID NO: 4).
16. La composición de la reivindicación 1, en
donde la actividad biológica es quimiotaxis, migración celular o
adherencia de virus a las células.
17. Un virus respiratorio sincitial que
comprende un motivo CX3C de la glicoproteína G respiratoria
sincitial que no es funcional para la fijación del virus a un
receptor CX3CR1 en una célula, en donde C es un residuo cisteína y X
es cualquier aminoácido distinto de cisteína.
18. El virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17, en donde el virus es un virus vivo.
19. El virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17, en donde el virus es un virus no vivo.
20. Una composición que comprende un péptido
como se define en la reivindicación 1 para uso en la inducción de
una respuesta inmunitaria en un individuo.
21. Un método in vitro para identificar
una sustancia útil para el tratamiento o la prevención de la
enfermedad del virus respiratorio sincitial, que comprende poner en
contacto la sustancia con un receptor de CX3C, en presencia de la
glicoproteína G del virus respiratorio sincitial, y detectar la
inhibición de la fijación de la glicoproteína al receptor CX3C, en
donde la detección de la inhibición de la fijación de la
glicoproteína G del virus respiratorio sincitial al receptor CX3C
identifica una sustancia útil para el tratamiento o la prevención de
la enfermedad del virus respiratorio sincitial.
22. El método de la reivindicación 21, en donde
la sustancia se fija al motivo CX3C de la glicoproteína G del virus
respiratorio sincitial.
23. El método de la reivindicación 21, en donde
la sustancia se fija al receptor CX3C.
24. Un método in vitro para identificar
una sustancia para el tratamiento o la prevención de la enfermedad
del virus respiratorio sincitial, que comprende poner en contacto la
sustancia con una célula que contiene un receptor de CX3C, en
presencia del virus respiratorio sincitial, y detectar la inhibición
de una actividad biológica asociada con la fijación del virus
respiratorio sincitial al receptor CX3C, en donde la detección de la
inhibición de una actividad biológica asociada con la fijación del
virus respiratorio sincitial al receptor de CX3C identifica una
sustancia útil para el tratamiento o la prevención de la enfermedad
del virus respiratorio sincitial.
25. Una composición que comprende un péptido
como se define en la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de
la infección del virus respiratorio sincitial en un individuo
infectado con el virus respiratorio sincitial.
26. Una composición que comprende un anticuerpo
de la glicoproteína G anti-RSV, anticuerpo que
inhibe la fijación de la glicoproteína G del virus respiratorio
sincitial a un receptor CX3CR1, para uso en el tratamiento de la
infección por el virus respiratorio sincitial en un individuo
infectado con el virus respiratorio sincitial.
27. Una composición de la reivindicación 14 ó 15
para uso en el tratamiento de la infección del virus respiratorio
sincitial en un individuo infectado con el virus respiratorio
sincitial.
28. Uso del virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17 para preparar una composición para prevención de
la infección con el virus respiratorio sincitial en un
individuo.
29. Uso de la composición de la reivindicación 1
para preparar una composición para inducir una respuesta inmunitaria
en un individuo, en donde la preparación comprende una cantidad
inmunógena de la composición de la reivindicación 1 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
30. Uso de la composición de la reivindicación
14 para preparar una composición para inducir una respuesta
inmunitaria en un individuo, en donde la preparación comprende una
cantidad inmunógena de la composición de la reivindicación 14 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
31. Uso de la composición de la reivindicación
15 para preparar una composición para inducir una respuesta
inmunitaria en un individuo, en donde la preparación comprende una
cantidad inmunógena de la composición de la reivindicación 15 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
32. Uso de un virus de la reivindicación 17 para
preparar una composición para inducción de una respuesta inmunitaria
en un individuo, en donde la preparación comprende una cantidad
inmunógena del virus de la reivindicación 17 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
33. El virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17, en donde el virus comprende una mutación por
deleción en la secuencia de aminoácidos del motivo CX3C.
34. El virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17, en donde la secuencia de aminoácidos del motivo
CX3C está delecionada.
35. El virus respiratorio sincitial de la
reivindicación 17, en donde el virus comprende una mutación de
inserción en la secuencia de aminoácidos del motivo CX3C.
36. Uso de un virus de las reivindicaciones 33,
34 ó 35 para preparar una composición para inducir una respuesta
inmunitaria en un individuo, en donde la preparación comprende una
cantidad inmunógena del virus de las reivindicaciones 33, 34 ó 35 y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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