ES2315054B1 - Celda porta-muestras para analisis de intercambio isotopico h/d e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmision y sus aplicaciones. - Google Patents
Celda porta-muestras para analisis de intercambio isotopico h/d e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmision y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Celda porta-muestras para
análisis de intercambio isotópico H/D e interacciones moleculares
para espectroscopia infrarroja de transmisión y sus
aplicaciones.
La invención presentada se refiere al diseño,
fabricación y uso de una nueva celda porta-muestras
para compuestos líquidos utilizable en espectroscopia infrarroja de
transmisión. Su ventaja principal es que permite medir, caracterizar
y observar, in situ y en tiempo real, el intercambio
isotópico de hidrógeno por deuterio desde el instante inicial de
este proceso hasta su final. Los sectores de aplicación son varios:
industria farmacéutica, química y biotecnológica, así como también
es de uso en el campo de la investigación científica de la
estructura electrónica, conformacional y evolución dinámica de
compuestos químicos y biológicos como, proteínas, ácidos nucleicos y
lípidos. Esta celda porta-muestras se ha diseñado
teniendo en cuenta futuros cambios de las técnicas de medida y en
los procedimientos empleo de la espectroscopia infrarroja por
transmisión.
Description
Celda porta-muestras para
análisis de intercambio isotópico H/D e interacciones moleculares
para espectroscopía infrarroja de transmisión y sus
aplicaciones.
La presente invención se refiere a un nuevo
celda o dispositivo porta-muestras para líquidos
utilizable en los equipos de espectroscopia infrarroja de
transmisión, y, en términos generales, los sectores de aplicación
son: industria farmacéutica, biotecnológica y química (alimenticia,
cosmética, etc.). También es de aplicación en la investigación
científica de la estructura electrónica y conformacional de
sustancias químicas y biológicas tales como proteínas, ácidos
nucleicos, lípidos, y en la investigación de la evolución dinámica
de las interacciones entre estos compuestos. Asimismo, la
fabricación de este accesorio porta-muestras
concierne a la industria de instrumentación científica que
manufactura equipos para espectroscopia infrarroja.
La espectroscopia infrarroja de transmisión es
una técnica analítica y estructural conocida de antiguo y muy
extendida en los ámbitos industriales y de la investigación
científica. Sus ventajas frente a otras técnicas usuales son:
a) Se pueden analizar muestras en cualquier
estado físico de la materia con una preparación sencilla y rápida,
a diferencia de otras técnicas.
b) Se precisan cantidades de muestra
relativamente pequeñas.
Más específicamente, se sabe dentro del campo de
la proteómica que el análisis infrarrojo de diversas regiones
espectrales puede proporcionar información sobre estructura y
dinámica de proteínas. Con esta finalidad se ha utilizado el
intercambio isotópico de hidrógeno por deuterio (H/D) (Barth y
Zscherp, Quart. Rev. Biophys., 35, 369-430
(2002)). La cinética de intercambio isotópico en grupos amida
polipeptídicos y cadenas laterales depende de la estructura
proteica y del entorno del medio que rodea a la proteína a estudiar.
Así, los grupos que están expuestos al disolvente intercambian
hidrógeno por deuterio con mayor rapidez. En cambio, los hidrógenos
de un fragmento proteico ordenado estructuralmente intercambian más
lentamente en comparación con los hidrógenos de otros segmentos
carentes de orden estructural polipeptídico. Esto es debido, entre
otras causas, a la presencia de enlaces de hidrógeno, a la baja
accesibilidad del disolvente o a impedimentos estéricos. Por ello,
en el caso frecuente de un hidrógeno amídico protegido se puede
considerar como "cerrado", o lento, al intercambio isotópico.
Ahora bien, existen dos posibilidades sobre cómo realizar el
proceso de intercambio. Una es disolver previamente la proteína
liofilizada en óxido de deuterio (agua pesada, D_{2}O) y tomar
después una parte alícuota de esta disolución e introducirla en los
porta-muestras convencionales para su posterior
análisis por espectroscopia infrarroja de transmisión (Wu y cols.,
J. Phys. Chem. B, 105, 6251-6259 (2001)).
Pero el uso de los porta-muestras convencionales
comporta una etapa inicial de intercambio isotópico que no se puede
medir durante el tiempo que media entre el momento de disolver la
sustancia liofilizada y su posterior introducción en la celda
porta-muestras disponibles hasta ahora. Además, la
liofilización previa de una sustancia biológica puede comportar
agregación de la misma, lo cual invalida su posterior análisis
espectroscópico por tratarse ya de un producto biológico
desnaturalizado. Para obviar esta dificultad se estableció, desde
los inicios de la practica técnica, el método de "stopped flow"
consistente en mezclar instantáneamente en una celda
porta-muestras convencional la disolución de la
sustancia a estudiar y agua pesada. Pero este procedimiento tiene el
inconveniente de diluir dicha sustancia, lo que implica la
consiguiente disminución de señal espectral. Otro método alternativo
que se ha utilizado es el de realizar el intercambio isotópico en
una bolsa de diálisis frente a un tampón de D_{2}O e ir tomando
sucesivas partes alícuotas de la disolución para su posterior
análisis. Sin embargo este método exige la disponibilidad de
cantidades relativamente grandes de sustancia biológica, lo que con
frecuencia es un problema insuperable. Por otra parte, si se
utiliza otra técnica alternativa como la de reflectancia total
atenuada (ATR) (De Jongh y cols., Biochemistry, 36,
13593-13602 (1997); Goormaghtigh y cols., Appl.
Spectrosc. 50, 1519-1527 (1996)), también se
necesitan cantidades relativamente grandes de muestra, y además,
esta técnica comporta una pérdida (alrededor del 50%) de la energía
del haz infrarrojo por reflexión múltiple (Miller y Stace, (Eds.),
Laboratoy Methods in Infrared Spectroscopy, Heyden & Son
Ltd., London, 1972, cap. 14, pp. 210). Por ello esta técnica de ATR
resulta menos sensible que la espectroscopia infrarroja de
transmisión, sobre todo en el caso de disoluciones que se deban
preparar muy diluidas (como es frecuente en las disoluciones
biológicas) para evitar agregaciones moleculares no deseadas.
De lo anteriormente expuesto surge la necesidad
de un nuevo accesorio porta-muestras para
espectroscopia infrarroja de transmisión, donde realizar, "in
situ", el intercambio isotópico y que además nos permita
observar y medir el proceso de intercambio isotópico desde el
momento inicial. Este nuevo accesorio, que se describe en esta
memoria, resulta de la inclusión de dos membranas de diálisis en
una celda de muestras líquidas que posee los elementos de diseño
que se indican más adelante. El mismo accesorio es utilizable no
solamente para el estudio analítico, estructural y dinámico de
proteínas y otras biomoléculas, sino también en investigaciones
relativas a interacciones proteína-ligando,
proteína-ácido nucleico y proteína-lípido e
interacciones fármaco-células biológicas en tiempo
real. En el continuo desarrollo de las técnicas de espectroscopia
infrarroja se prevén avances en la denominada espectroscopia de
correlación bidimensional, que exige la medida en función del
tiempo de numerosos espectros a diferentes porcentajes de
deuteración. Por ello, este invento tendría aquí su aplicación
práctica porque con él se acorta el tiempo de proceso y, también,
hace posible su observación integra.
Esta invención se refiere al diseño y uso de una
celda porta-muestras de líquidos utilizable en
espectroscopia infrarroja de transmisión para el estudio de
intercambio isotópico H/D. Esta celda
porta-muestras lleva incorporados dos cilindros en
donde se introduce el agua pesada y en cuyos extremos, en contacto
con la muestra, se sitúan dos membranas de diálisis (Fig. 1 y 2)
entre las cuales se realiza la reacción de intercambio.
La ventaja de este accesorio sobre la celda
porta-muestras convencional es que el intercambio
isotópico se puede realizar, in situ, en el mismo
porta-muestras desde el inicio del proceso. Como el
volumen de D_{2}O que se puede introducir en los cilindros es
aproximadamente 4 ml y el volumen necesario para rellenar el
espacio, entre los cristales de la celda y las membranas, es
aproximadamente 40 \mul, se pueden conseguir deuteraciones de
hasta el 99%, sin necesidad de renovar el agua pesada de los
cilindros. Resultado de ello es que el proceso completo se puede
medir en una sola etapa, acortando notablemente el tiempo de
operación. Un conocimiento más detallado de la invención se adquiere
a continuación, en donde se describen las características de este
accesorio y unos ejemplos de intercambio isotópico realizado para
la enzima tripsina y tampón acuoso.
La presente invención se basa en que los autores
de la misma han puesto a punto una celda
porta-muestras para medida espectral de líquidos,
por espectroscopia infrarroja de transmisión, en el curso del
intercambio isotópico H/D. Como ya se ha mencionado, la ventaja de
este accesorio porta-muestras sobre los
convencionales es que el intercambio isotópico H/D se puede
realizar in situ, y observar en la misma celda
porta-muestras, el proceso completo. La celda
utilizada posee las características geométricas indicadas en las
Figuras 1 y 2. El esquema de la Figura 1 (y, en detalle en la figura
2, sección lateral de los conductos de relleno y secciones del
soporte metálico frontal) muestra el ensamblaje de todos los
componentes de la celda. Además, en los orificios de entrada de los
líquidos (en nuestro prototipo, con un de un diámetro de 2,5
milímetros), se colocan dos membranas de diálisis para permitir la
difusión del agua pesada hacia la muestra en estudio. Se puede
aumentar el diámetro de los orificios de entrada (Figura 2.) de las
muestras líquidas, o el camino óptico en la celda, para el caso
necesario de querer acelerar la difusión del agua pesada hacia el
interior de la lámina líquida comprendida entre los dos cristales
del accesorio. Las dimensiones de dichos orificios de entrada de
líquido, no obstante, podrán tener un diámetro máximo de 4
milímetros. dependiendo del volumen de muestra liquida disponible.
Por otra parte, existe una diferencia adicional en comparación a las
celdas porta-muestras actuales, en cuanto al
espesor de la placa soporte frontal de la celda, que es de
suficiente grosor (6 milímetros.) como para poder insertar los dos
cilindros que contienen el agua pesada en los orificios de entrada
de la disolución problema. Los cilindros de relleno atraviesan
soporte metálico frontal junta metálica y primer cristal hasta
conducir el liquido-muestra hasta las membranas de
diálisis. Como el volumen de D_{2}O contenido en los cilindros
(aproximadamente, 4 mililitros) es muy superior al espacio entre los
cristales y las membranas de diálisis (aproximadamente 40
microlitros para espaciadores de 12 micrometros), se puede medir
espectros hasta niveles de deuteración del 99% sin necesidad de
renovar el agua pesada de los cilindros. Los soportes metálicos y
cilindros de la celda están fabricados de latón y las juntas
situadas entre estos soportes y los cristales son de estaño o
teflón. Los dos cristal son de un material transparente e insoluble
en el liquido, tal como, fluoruro cálcico, sulfuro de zinc,
seleniuro de zinc, bromuro de plata, etc. De igual modo, los otros
componentes de la celda porta-muestras en contacto
con la muestra liquida pueden ser de distinta composición (metálica
o plástica) pero necesariamente insolubles en ella. Los discos que
constituyen las membranas de diálisis son de un material polimérico
apropiado tal como celulosa y derivados. Cuatro tornillos de rosca
insertados entre el soporte metálico posterior y el frontal
aseguran el cierre y estanqueidad del conjunto.
Este accesorio celda
porta-muestras objeto de esta patente de invención
(descrito con detalle, en las figuras 1 y 2), se puede utilizar,
sin cambio alguno, para medidas espectrales que no sean de
intercambio isotópico, como por ejemplo, para el estudio de
mecanismos de reacción entre iones o ligandos de bajo peso molecular
y macromoléculas biológicas, o interacciones
lípido-proteína y fármaco-célula
biológica, siempre que las membranas de diálisis a usar posean un
corte molecular apropiado a cada caso, dependiendo de la magnitud
de los pesos moleculares de las sustancias a analizar.
Antes de insertar los cilindros que contienen el
agua pesada en la celda porta-muestras, se rellena
ésta mediante una micro-pipeta evitando la formación
de burbujas de aire que disminuirían la velocidad de intercambio.
Posteriormente se insertan las dos membranas de diálisis, una en
cada orificio de entrada de la celda, preparadas previamente con un
diámetro apropiado para evitar fuga de disolución desde la cavidad
de los cristales hasta los cilindros. Se acoplan éstos a presión en
los orificios de la placa frontal de la celda (Fig. 2) donde se han
colocado previamente las membranas de diálisis. A continuación se
tapan los cilindros y se mide entonces el espectro de la disolución
problema, que corresponde al tiempo inicial de la cinética de
intercambio. Se llenan, después, los cilindros de la celda con agua
pesada y se procede inmediatamente a realizar medidas de espectros
en función del tiempo. Para evitar una disminución de la cinética
de deuteración es esencial que siempre haya contacto entre la
disolución problema contenida entre las ventanas de la celda y el
agua pesada contenida en los cilindros. Una ventaja que posee este
accesorio es que las membranas de diálisis pueden aplicarse
mediante un único uso, evitando así la posible adherencia de
macromoléculas a las mismas tras su uso reiterado. Otra posibilidad
que ofrece este accesorio es la opción de, una vez completada la
deuteración de la disolución sujeto de estudio, poder realizar una
cinética de intercambio isotópico inverso al anterior utilizando la
misma disolución. Esta es una ventaja muy apreciada por los
espectroscopistas cuando se dispone de cantidades muy pequeñas de
sustancia biológica o volúmenes muy pequeños de disolución
problema.
Las medidas espectrales las hemos realizado en
un espectrómetro de infrarrojo por transformada de Fourier de la
firma Perkin-Elmer, modelo 1725X, dotado de un
detector de sulfato de glicina. Cada espectro considerado en la
cinética de intercambio resultó de promediar 16 barridos durante
1,5 minutos con una resolución de 2 cm^{-1} y un camino óptico de
12 \mum en la celda utilizada. Las bandas residuales generadas por
el vapor del agua de la cámara porta-muestras se
eliminaron mediante diferencia espectral, y posteriormente se
realizaron alisamientos según el procedimiento de
Savitzky-Golay, considerando grupos de 11 puntos.
En el caso de determinar cinéticas de intercambio para
macromoléculas biológicas es necesario restar el espectro del
disolvente o tampón puro con el mismo porcentaje de deuteración que
el disolvente de la muestra. Las sustracciones espectrales que se
realicen sin cumplir con este requisito pueden conducir a
resultados equívocos, sobre todo si se trata de medir perfiles
espectrales que se solapen con bandas del disolvente.
Figura 1. Esquema del ensamblaje de los
componentes de la celda porta-muestras. Los
cristales deben ser insolubles en los líquidos a analizar, y los
soportes y cilindros que contienen el líquido del isótopo a
intercambiar pueden ser de naturaleza metálica o de materiales
plásticos como teflon.
Figura 2. Secciones recta y transversal de,
cilindros de relleno y soporte metálico frontal (véase la figura
1). Dimensiones en milímetros.
Figura 3. Curva del porcentaje de intercambio
isotópico H/D determinada mediante las medidas de la intensidad de
la banda de deformación angular \deltaH_{2}O situada hacia 1643
cm^{-1}.
Figura 4. Secuencia espectral de deuteración de
una disolución acuosa de la enzima tripsina (30 mg/ml).
Figura 5. Espectros síncronos de una disolución
de tripsina (30 mg/ml) sometida a intercambio H/D.
Figura 6. Espectros asíncronos de una disolución
de tripsina (30 mg/ml) sometida a intercambio H/D.
Ejemplo
1
Hemos encontrado que la deuteración del agua
(H_{2}O/D_{2}O) mediante este accesorio
porta-muestras sigue una ecuación exponencial de
pseudo-primer orden (Li y cols. Biophys. J.,
65, 1963-1972 (1993)), y por tanto, el porcentaje de
intercambio (P) realizado al cabo de un tiempo, t, viene dado por
la expresión P = 100[1-exp(-kt)]. El ajuste
de la curva obtenida para el disolvente acuoso (Fig. 3) conduce a
un valor de k = 0.13 \pm 0.006 min^{-1}, lo que corresponde a
una constante de tiempo de deuteración de 7,7 \pm 0,3 minutos
para este accesorio porta-muestras. Según es bien
sabido por cinética química, esto significa que los procesos de
intercambio isotópico que transcurran con un tiempo inferior a éste
no se resolverán en el tiempo mediante esta celda, como por ejemplo
los procesos de apertura o disociación de pares de bases
Watson-Crick en dobles hélices oligonucleotídicas,
para los que k \approx 0,06 s^{-1} que corresponde a un tiempo
de apertura de bases de alrededor de 17 segundos. La cinética de
intercambio obviamente la podemos acelerar utilizando una celda con
orificios de entrada de diámetro superior al utilizado aquí. El
accesorio de esta invención permite resolver otras fluctuaciones
estructurales que ocurren en macromoléculas biológicas tales como
proteínas. Así, muchas proteínas sufren fluctuaciones estructurales
muy lentas como, por ejemplo, las que pueden ocurrir en proteínas
auto- o heteroasociadas en cápsidas de virus, proteínas de
membrana, etc., de tal manera que la deuteración subsiguiente a esas
fluctuaciones puede ocurrir al cabo de horas e incluso días (Barth
y Zscherp, Quart. Rev. Biophys., 35, 369-430
(2002)).
Un ejemplo típico se describe a continuación
para la cinética de intercambio H/D de la enzima tripsina que hemos
medido con el accesorio de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En este ejemplo se comprueba que nuestro
accesorio porta-muestras es adecuado para medidas
experimentales de intercambio H/D en sustancias biológicas tales
como proteínas.
La Figura 4 ilustra la secuencia espectral de
deuteración de tripsina en disolución acuosa (30 mg/ml) a lo largo
de 2 horas, tras las cuales ha intercambiado más del 98% del
disolvente mediante el uso de la celda
porta-muestras de líquidos de esta invención.
Observamos que al cabo de ese tiempo permanecen aún sin deuterar
algunos segmentos polipeptídicos, como muestra la banda residual de
deformación angular \deltaNH (banda Amida II) de los grupos amida
de la cadena principal proteica. Generalmente los segmentos que
intercambian lentamente suelen corresponder a estructuras
polipeptídicas ordenadas, como ocurre en este caso con la tripsina
que es rica en estructura \beta (De Jongh y cols.,
Biochemistry, 36, 13593-13602 (1997)), o a
grupos que están enterrados dentro de la macromolécula. La
deuteración sucesiva de los grupos NH del esqueleto polipeptídico
genera la denominada banda amida II', que suele aparecer hacia 1450
cm^{-1} solapada con las bandas de deformación angular \deltaCH
de las cadenas hidrocarbonadas de las proteínas. En la Figura 4 se
puede apreciar asimismo que la deuteración origina una disminución
de intensidad de las bandas situadas en la región de
1700-1660 cm^{-1}. Pero los cambios espectrales
que puedan sufrir varias bandas comparadas entre sí, que ocurren
sincronizados o no, se advierten con más claridad y precisión
mediante la moderna técnica de la espectroscopia infrarroja
bidimensional. Esta técnica consiste en que los cambios espectrales
generados en una muestra por una perturbación, ya sea un cambio de
temperatura, presión, intercambio isotópico, etc., se pueden
representar en mapas de contorno bidimensionales. Por ejemplo, en la
Figura 5 el centro de unas líneas de contorno de coordenadas
\nu_{1} y \nu_{2} correlaciona a dos bandas, de frecuencias
\nu_{1} y \nu_{2}. En el mapa de contorno de espectros
síncronos las bandas de estas frecuencias varían en fase, es decir,
o las intensidades de las dos bandas aumentan, o las dos
disminuyen, o una aumenta y otra disminuye en fase (al mismo
tiempo). En cambio, en los espectros asíncronos el centro de unas
líneas de contorno de coordenadas \nu_{1} y \nu_{2}
correlaciona a dos bandas de frecuencias \nu_{1} y \nu_{2}
cuyas intensidades varían sin sincronización alguna, es decir,
fuera de fase. El porta-muestras motivo de esta
patente facilita extraordinariamente la asignación de bandas y su
uso permite asimismo obtener información estructural más detallada.
También, una ventaja adicional es poder obtener información
estructural con más resolución que con los
porta-muestras convencionales, al poder medir
espectros desde el mismo instante del inicio del intercambio
isotópico.
Los espectros síncronos de la disolución de
tripsina (Fig. 5) contienen autópicos situados a lo largo de la
diagonal hacia 1676, 1547 y 1453 cm^{-1}, que se pueden atribuir
al modo vibracional amida I de acodamientos, amida II y amida II'.
En apoyo de esta asignación se presentan los picos cruzados de
coordenadas (1547, 1676) y (1453, 1676), cuyos caracteres positivo
(fondo blanco) y negativo (fondo oscuro) respectivamente son
indicativos de que en el primer pico cruzado las dos bandas cambian
su intensidad en el mismo sentido (disminución simultánea) y en
sentido opuesto (disminución y aumento simultáneos).
Los espectros asíncronos (Fig. 6) son de
especial interés para dar una idea de qué fragmentos de la
macromolécula están desacoplados cinéticamente en cuanto a la
deuteración y para saber por tanto cuáles son los grupos más
estructurados o menos expuestos al disolvente, es decir, situados
en el interior del espacio ocupado por la macromolécula. Además, la
aparición de espectros asíncronos es indicativa de que la cinética
de deuteración de la sustancia biológica es distinguible de la del
disolvente utilizando la celda porta-muestras de
esta invención. En la citada Figura 6 aparecen dos picos cruzados de
coordenadas (1676, 1695) y (1695, 1676), siendo de carácter
positivo el situado por encima de la diagonal y por tanto indica
que la deuteración de la banda situada hacia 1695 cm^{-1} es más
lenta que la de la banda a 1676 cm^{-1}. Este resultado es
consistente con la asignación de la banda de frecuencia 1695
cm^{-1} a estructuras \beta, porque es de sobra conocido que las
estructuras polipeptídicas ordenadas intercambian más lentamente
que las desordenadas o acodamientos (Earnest y cols., Biophys.
J., 58, 1539-1546, (1990)). El carácter
asíncrono de las variaciones de intensidad de las bandas hacia 1676
y 1695 cm^{-1} y sus consecuentes cambios en las intensidades de
las bandas hacia 1547 y 1453 cm^{-1} implica la asincronicidad de
parte de las intensidades a estas dos últimas frecuencias (Fig. 6).
Por estas mismas consideraciones es de esperar que el pico cruzado
de coordenadas (1618, 1674) se sitúe por debajo de la diagonal con
carácter positivo debido al intercambio lento (comparado con los
acodamientos) de las estructuras de cadenas que originan bandas
amida I situadas alrededor de 1620 cm^{-1} (Quart. Rev.
Biophys., 35, 369-430, (2002)).
Estos dos ejemplos descritos ilustran
aplicaciones operativas del nuevo accesorio descrito para el
estudio de estructura y dinámica de proteínas utilizando intercambio
isotópico H/D. La cinética de este intercambio se puede acelerar
aumentando el diámetro de los orificios de entrada del agua pesada
y/o aumentando el camino óptico de la celda. Si se utilizan
membranas de diálisis de corte molecular apropiado, mediante la
espectroscopia vibracional bidimensional se pueden seguir los
cambios espectrales originados por interacciones entre iones,
ligandos o lípidos y macromoléculas biológicas.
Claims (10)
1. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
caracterizada porque comprende las siguientes partes o
componentes:
- a)
- Dos soportes metálicos, frontal y posterior, en el primero de los cuales se insertan,
- b)
- Dos cilindros de relleno y conductos de entrada de la muestra liquida en estudio, a medir o en experimentación, con dos membranas de diálisis de corte molecular apropiado.
- c)
- Un espaciador en donde se realiza la reacción de intercambio isotópico,
- d)
- Dos láminas de cristal transparente a la radiación que sirven como separador de la muestra,
- e)
- Dos juntas intermedias.
- f)
- Cuatro tomillos metálicos de paso, con su correspondiente rosca, para lograr el debido cierre y estanqueidad de todos los elementos de la celda.
2. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según reivindicación 1, caracterizada porque está
especialmente diseñada y realizada para permitir medidas "in
situ" y en "tiempo real" de reacciones u operaciones
experimentales.
3. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque,
además, los elementos metálicos, como soportes y cilindros, de la
celda porta-muestras, descritos en la reivindicación
1 a) y b), están fabricados en latón. Igualmente, las dos láminas
cristalinas, reivindicación 1 d), se fabrican con un material
transparente a la radiación empleada, como pueden ser, fluoruro
cálcico, sulfuro de zinc, bromuro de plata, etc. Las juntas
intermedias, reivindicación 1 e), son de latón o teflón.
4. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2 y 3, caracterizada porque,
las dimensiones de los cilindros y el volumen del recinto de
reacción (reivindicación 1, b) y c)), vienen determinados por las
aplicaciones, medidas o experimentos a llevar a cabo.
5. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3 y 4, caracterizada
porque, los cilindros de relleno de la celda
porta-muestras, descritos en las reivindicaciones 1,
2 y 3, deben ser de un material insoluble en agua o en el líquido a
medir o caracterizar.
6. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 5, caracterizada
porque permite el análisis químico y estructural de compuestos
biológicos, orgánicos e inorgánicos, mediante medidas de cinéticas
de intercambio isotópico usando membranas de diálisis de corte
molecular adecuado.
7. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizada
porque permite realizar análisis de interacciones
biomolécula-ligando,
biomolécula-ión, lípido-proteína y
fármaco-célula biológica.
8. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, y en donde el
porta-muestras utilizado pueda diferir del descrito
en las figuras 1 y 2 de esta Memoria, en cuanto al número de
cilindros portadores del disolvente con el isótopo intercambiable,
diámetro de los mismos, separación entre ellos, diámetro de los
orificios de entrada de disolvente y espesor de las placas soportes
del accesorio.
9. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8,
caracterizada porque con el diseño descrito en la Memoria,
se acorta el tiempo de medida de espectros en espectroscopia
infrarroja de transmisión y, también, en la observación directa de
los procesos.
10. Celda porta-muestras de
líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su
integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión,
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, así como el
empleo o uso de otro cualquier porta-muestras con
características similares a las descritas en esta Memoria y en las
reivindicaciones anteriores, que pueda surgir de una futura
evolución de la tecnología en espectroscopia infrarroja de
transmisión y en especial en la llamada espectroscopia de
correlación bidimensional en análisis conformacional.
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|---|---|---|---|
| ES200501777A ES2315054B1 (es) | 2005-07-20 | 2005-07-20 | Celda porta-muestras para analisis de intercambio isotopico h/d e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmision y sus aplicaciones. |
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|---|---|---|---|
| ES200501777A ES2315054B1 (es) | 2005-07-20 | 2005-07-20 | Celda porta-muestras para analisis de intercambio isotopico h/d e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmision y sus aplicaciones. |
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| ES2315054A1 ES2315054A1 (es) | 2009-03-16 |
| ES2315054B1 true ES2315054B1 (es) | 2010-01-08 |
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| ES200501777A Expired - Fee Related ES2315054B1 (es) | 2005-07-20 | 2005-07-20 | Celda porta-muestras para analisis de intercambio isotopico h/d e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmision y sus aplicaciones. |
Country Status (1)
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|---|---|
| ES (1) | ES2315054B1 (es) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116759A (en) * | 1990-06-27 | 1992-05-26 | Fiberchem Inc. | Reservoir chemical sensors |
-
2005
- 2005-07-20 ES ES200501777A patent/ES2315054B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|---|
| ES2315054A1 (es) | 2009-03-16 |
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