ES2314268T3 - Proteina especifica de celulas pancreaticas beta de los islotes de langerhans y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Uso como marcador específico de células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans de al menos un polinucleótido aislado o de la proteína correspondiente, elegido de: - los polinucleótidos que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (a) la secuencia ID SEC Nº 1, (b) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 1 de al menos 15 nucleótidos consecutivos, (c) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% después de alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (a) o en (b), y (d) una secuencia complementaria, homosentido o antisentido de una de las secuencias definidas en (a), (b) o (c), y - las proteínas codificadas por los polinucleótidos definidos en (a), (b), (c) o (d) anteriores, que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (e) la secuencia ID SEC Nº 2, (f) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 2 de al menos 15 aminoácidos consecutivos, (g) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 60% después de alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (e) o en (f), preferiblemente 80% de identidad, o de forma todavía más preferida 90% de identidad.

Description

Proteína específica de células pancreáticas beta de los islotes de Langerhans y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a una proteína llamada ZnT-8, expresada de forma específica en las células pancreáticas beta de los islotes de Langerhans, al polinucleótido que codifica dicha proteína que está implicado en la maduración y la exocitosis de la insulina, así como a sus aplicaciones, en particular la selección y estudio de células beta, así como para el cribado de medicamentos activos para la diabetes y la hiperinsulinemia.

La diabetes es una de las enfermedades más frecuentes que afecta al 5% de la población de países industrializados y está en constante aumento en todos los países del mundo (previsión: 300 millones en 2025, de los cuales 2,4 millones en Francia). Entre las diversas formas de la diabetes, la diabetes de tipo I o dependiente de insulina afecta a aproximadamente 500.000 a 1 millón de individuos en los Estados Unidos y 150.000 en Francia, es decir 0,2 a 0,4% de la población. Los síntomas característicos comprenden un nivel alto de azúcar en la sangre y en la orina, una diuresis importante, hambre y sed intensos así como pérdida de peso.

La diabetes de tipo II no dependiente de insulina (DNDI), descrita también con el nombre de diabetes "grasa" o diabetes de la madurez, a menudo aparece alrededor de la cincuentena. Se trata mediante régimen, toma de medicamentos por vía oral e insulina, después de algunos años de evolución. Hoy en día, 2 millones de franceses son tratados con medicamentos antidiabéticos y/o insulina.

Aunque la diabetes se puede controlar mediante inyecciones de insulina y aportes controlados de glúcidos, las complicaciones asociadas a esta patología necesitan actualmente nuevos procedimientos para su prevención, tratamiento y diagnóstico.

El páncreas comprende dos estructuras distintas tanto morfológica como fisiológicamente:

- el páncreas exocrino que produce las enzimas que intervienen en la digestión (amilasa, lipasa, etc.) y el bicarbonato sódico;

- el páncreas endocrino que produce las hormonas que intervienen en el control de la glucosa en la sangre (insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático).

Las células del páncreas endocrino están organizadas en microórganos dispersos en el páncreas en forma de islotes (islotes de Langerhans o islotes pancreáticos). Cada islote pancreático está compuesto de 4 tipos celulares: las células alfa, beta, delta y las células PP. Las células alfa están situadas en la periferia del islote y segregan el glucagón. Las células beta se encuentran en el centro del islote y son las únicas células capaces de secretar insulina en respuesta a la glucosa. Las células delta están en la periferia y segregan la somatostatina. La función de las células PP es más controvertida (síntesis del polipéptido pancreático).

La ausencia de modelo celular de estudio de la célula beta, así como la ausencia de un medio fiable y eficaz de selección celular adaptado a este tipo de células, frena el estudio de su funcionamiento y por lo tanto la puesta a punto de nuevos procedimientos de tratamiento de la diabetes de tipo I y II.

Entre los tratamientos de la diabetes, además de la administración regular de insulina, una de las vías del control fisiológico de la glucemia y de la normalización de la glucemia en los diabéticos, es el paso por la restauración de una secreción de insulina in vivo a partir de células. Desde este punto de vista, se han propuesto varias soluciones:

- la obtención de células productoras de insulina en animales para realizar un xenotransplante;

- la diferenciación in vitro de células secretoras de insulina a partir de células madre aisladas, con el objetivo de reimplantarlas [1], con el fin de salvar los problemas de inmunidad y la necesidad de un tratamiento inmunosupresor del paciente. Pero la producción de cantidades importantes de células con bajo coste, productoras de insulina por diferenciación de células madre, necesita herramientas biomoleculares nuevas, en particular, útiles para el fenotipificación y la purificación de las células diferenciadas;

- el transplante de islotes pancreáticos; recientemente muchos trabajos han tenido por objeto la preparación de islotes o de células beta pancreáticas con fines terapéuticos. La primera etapa del transplante es extraer el páncreas del donante en estado de muerte cerebral. El aislamiento de los islotes empieza por una digestión enzimática del páncreas mediante una solución de colagenasa. No todos los transplantes requieren una purificación de los islotes digeridos. No obstante, hoy en día la mayoría de los investigadores están de acuerdo en que la purificación de los islotes es necesaria para un alotransplante [2]. Después los islotes se transplantan, a razón de una masa suficiente (mínimo 3000 IEQ/kg) por inyección intraportal (IEQ, por sus siglas en inglés Islet Equivalent, equivalente de
islote).

No obstante, el aislamiento de islotes o de células beta pancreáticas necesita medios de selección y de identificación de células beta, específicos y fiables.

Trabajos previos han intentado poner a punto procedimientos de marcaje de células beta. Se pueden citar:

- el marcaje por la GFP (proteína verde fluorescente) que permite un marcaje fluorescente de la célula. El principal inconveniente de esta técnica es la necesidad de introducir un gen exógeno o transgén en la célula, que necesita además el uso de un vector vírico (adenovirus) [1];

- la técnica basada en la autofluorescencia importante de las células beta [2]. Pero esta técnica carece de especificidad con respecto al tipo celular;

- la incubación de las células con un fluorocromo específico del cinc: el Newport Green [3] o la ditizona [4]. Esta técnica se basa en el contenido importante de cinc de la célula beta. El cinc es un constituyente importante de los gránulos de secreción de insulina, y además, tiene una función en el control de esta secreción [5]. Pero estas técnicas tienen numerosos inconvenientes: el uso de un producto químico tiene riesgo de toxicidad respecto a la célula beta y carece de especificidad con respecto al tipo celular.

\hbox{Además, la ditizona tiene  un
problema de fotodegradación rápida [6]:}

- se ha puesto de manifiesto de forma indirecta mediante reconocimiento por un clon de células T (documento WO 91/17186) de un antígeno expresado por las células beta. Los trabajos iniciales sobre este antígeno no aportaron resultados en términos de caracterización de la secuencia peptídica, ni en términos de la selectividad de la célula beta con respecto a los otros tipos celulares del islote, ni tampoco del páncreas y el organismo. Trabajos más recientes de los mismos autores muestran una distribución mucho más grande de este antígeno, que de hecho no es específico de la célula beta [7];

- la detección del transportador de glucosa GLUT-2 [15]; pero este transportador no es específico de las células beta.

Por lo tanto, falta un marcador específico y fiable de la célula beta de los islotes pancreáticos de Langerhans.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar dicho marcador.

El islote de Langerhan acumula grandes cantidades de cinc y por lo tanto necesita un transportador muy eficaz y muy especializado para acumular este cinc en las vesículas de secreción [8]. La insulina, producida y almacenada en la célula beta pancreática, se libera en el medio extracelular por exocitosis en respuesta a estímulos externos, como una elevación de la concentración de glucosa. Esta elevación de glucosa provoca una modificación de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio y la apertura de los canales de calcio, que provoca la exocitosis [9].

Se sabe que en presencia de cinc la insulina puede formar tetrámeros y hexámeros que fijan el cinc con una relación de insulina:cinc de 4:1 a 6:2, respectivamente. La insulina se almacena en los gránulos de secreción en forma de un sólido compuesto de hexámeros unidos a 2 átomos de cinc por hexámero. Las vesículas contienen cinc en un exceso de 1 a 1,5 veces la cantidad necesaria para formar los hexámeros de insulina-cinc. En el transcurso de la exocitosis de la insulina, las vesículas ricas en insulina se fusionan con la membrana plasmática de la célula beta y liberan la insulina, pero también el cinc, a la circulación. El cinc liberado actúa en un bucle de retrocontrol negativo sobre los canales de potasio, provocando su activación y la detención de la exocitosis.

En las células de mamíferos, se han clonado y caracterizado 7 proteínas homólogas que tienen una función de transportadoras de cinc, denominadas ZnT1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. El análisis de la estructura primaria de estas proteínas ha permitido definir un patrón estructural común compuesto de 6 dominios transmembrana y un bucle intracelular rico en histidina. ZnT-1 es un transportador ubicuo, localizado en la membrana plasmática que asegura el eflujo de cinc fuera de la célula [11]. ZnT-2 permite a la célula tolerar un exceso de cinc en el medio de cultivo, confiriendo así una resistencia al cinc por una localización de éste en las vesículas intracitoplasmáticas ácidas, asegurando así una acumulación del cinc en la célula muy superior a la normal [12]. ZnT-3 y ZnT-4 clonadas en el hombre, tienen funciones similares a ZnT-2. ZnT-3 es específica de ciertos tejidos y es expresada fuertemente en el cerebro, en las membranas de las vesículas sinápticas ricas en cinc, en las fibras musgosas del hipocampo y en los testículos. ZnT-4 es expresada de forma ubicua, pero se encuentran niveles más elevados en el cerebro y las células epiteliales. Este transportador es esencial en el epitelio de mamífero donde participa en el control del contenido de cinc de la leche materna. ZnT-5 y ZnT-6 también son transportadores ubicuos localizados en el aparato de Golgi. ZnT-7 es un transportador ubicuo, localizado específicamente en el retículo endoplásmico de las células.

También se ha descrito un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador de cinc llamado NOV2 en la solicitud internacional WO 02/24733. Dicho polipéptido se expresado no sólo en el páncreas, sino también en la médula ósea, el cartílago, la placenta y el riñón. Por consiguiente, debido a su expresión en varios tejidos, este polipéptido no se puede usar como marcador específico de las células beta pancreáticas.

Trabajos previos mencionan un intento de buscar los genes implicados en el metabolismo del cinc en la célula beta pancreática. Estos trabajos no han conducido a la prueba de una proteína o transportador específicos [10].

Los autores de la invención han aislado un polinucleótido de 1110 pares de bases (ID SEC Nº: 1) que representa el ADNc que corresponde a un ARNm expresado de forma específica en el islote de Langerhans, y más en particular en la célula secretora de insulina o célula beta.

El polinucleótido de la invención codifica una proteína denominada ZnT-8 (ID SEC Nº: 2), proteína de 369 aminoácidos correspondiente a una masa molecular calculada de 40,8 kDa, que presenta una estructura primaria homóloga a la de las proteínas de la familia ZnT. El gen que codifica dicha proteína se denomina ZnT-8.

El estudio del potencial transmembrana de la proteína ZnT-8 completa muestra que tiene 6 dominios transmembrana (aminoácidos 74-95, 107-126, 141-163, 177-196, 216-240, 246-267), con los extremos N- y C-terminales situados en el citoplasma. Este estudio muestra igualmente que la estructura secundaria de esta proteína presenta 3 bucles de aminoácidos extracelulares (aminoácidos 96-106, 164-176, 241-245).

Además, la localización de la proteína ZnT-8 en las vesículas de secreción de la insulina y sobre la membrana plasmática indican que está implicada en la acumulación de cinc en las vesículas que contienen insulina y por lo tanto, tiene una función en la maduración y la exocitosis de la insulina en las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans.

La proteína ZnT-8 y el polinucleótido correspondiente constituyen, por primera vez un marcador específico y fiable de la célula beta de los islotes pancreáticos de Langerhans; los usos de este marcador son principalmente los siguientes:

- selección celular; el marcador permite considerar una selección y localización selectiva de las células beta, sin modificación química o biológica de dichas células, en particular con ayuda de anticuerpos dirigidos contra dicha proteína.

- modelo de estudio in vitro ; el marcador se puede usar in vitro para estudiar: (1) la sobreexpresión del transportador (ZnT-8) en líneas de células modelo (por ejemplo, insulinoma de rata INS-1) y el impacto en la secreción de insulina en respuesta a una estimulación por glucosa, (ii) la sensibilidad de las células a la muerte celular (apoptosis) inducida por condiciones de estrés oxidante o la concentración débil o fuerte de cinc, y (iii) las etapas de diferenciación de células madre en células secretoras de insulina en respuesta a diferentes estimulaciones exógenas (factores de crecimiento, extractos pancreáticos).

- cribado de medicamentos: el marcador también representa un objetivo farmacológico útil para el cribado de sustancias capaces de modular la expresión del gen ZnT-8 y/o la actividad de la proteína ZnT-8, con uso potencial para el tratamiento de la diabetes y la hiperinsulinemia.

- diagnóstico de diabetes: el polinucleótido puede igualmente aplicarse de forma ventajosa en el procedimiento de diagnóstico de la diabetes en familias que tienen riesgo, en particular en cuanto que permite detectar mutaciones observables en el gen ZnT-8 y también disminuir o suprimir los exámenes aplicados habitualmente.

Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto el uso como marcador específico de células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans, al menos un polinucleótido aislado de la proteína correspondiente, elegido de:

- los polinucleótidos que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (a) la secuencia ID SEC Nº 1, (b) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 1, de al menos 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos, todavía más preferiblemente 25 a 30 nucleótidos, (c) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% después del alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (a) o en (b), y (d) una secuencia complementaria, homosentido o antisentido de una de las secuencias definidas en (a), (b) o (c), y

- las proteínas codificadas por los polinucleótidos definidos en (a), (b), (c) o (d) más arriba, que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (e) la secuencia ID SEC Nº 2, (f) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 2 de al menos 15 aminoácidos consecutivos, (g) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 60% después del alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (e) o en (f) o al menos una similitud de 65%, preferiblemente 80% de identidad o al menos 90% de similitud, o de forma más preferida 90% de identidad o al menos 95% de similitud.

La invención abarca los usos de la proteína ZnT-8 y del polinucleótido correspondiente como se han definido anteriormente.

El polinucleótido definido anteriormente se puede aislar a partir de células de Langerhans o a partir de bancos de ADN celular, en particular de bancos de ADN de células pancreáticas, muy particularmente a partir de un banco de ADN de células pancreáticas humanas. Preferiblemente, las células usadas son células de los islotes de Langerhans.

El polinucleótido definido anteriormente también se puede obtener por una reacción de polimerización en cadena (PCR) realizada en el ADN total de las células de Langerhans por RT-PCR realizada en los ARN totales de las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans o por síntesis química.

En el sentido de la presente invención se aplican las siguientes definiciones.

Por polinucleótido se entiende un encadenamiento preciso de nucleótidos, modificados o no, que consta o no de nucleótidos no naturales. Así pues, este término abarca cualquier secuencia que codifique una proteína ZnT-8 o un fragmento de dicha proteína (ADN genómico, ARNm, ADNc) pero también los oligonucleótidos, homosentido o antisentido, así como los ARN interferentes pequeños (ARNip) correspondientes.

Por "ácidos nucleicos o proteínas que presentan un porcentaje de identidad después de alineamiento óptimo con una secuencia de referencia" se entiende que se indican los ácidos nucleicos o las proteínas que presentan, en relación con la secuencia de referencia, algunas modificaciones como en particular una deleción, un truncamiento, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una sustitución, en particular puntual, y cuya secuencia de nucleótidos presenta al menos 80% de identidad y la secuencia de aminoácidos presenta al menos 65% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de referencia.

Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias (ácidos nucleicos o proteínas) se entiende que se indica un porcentaje de nucleótidos o de restos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se comparan, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando las diferentes entre las dos secuencias repartidas al azar y en toda su longitud.

Por "mejor alineamiento" o "alineamiento óptimo", se entiende que se indica el alineamiento para el cual el porcentaje de identidad determinado como se describe a continuación, es el más alto. Las comparaciones entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se realizan de forma tradicional: comparando estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, en particular con ayuda de uno de los siguientes algoritmos: el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970), el procedimiento de investigación de similitud de Pearson y Lipman (1988), los programas informáticos que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, BLASTX, TBLASTX, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o en los servidores de internet, en particular los de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), de EMBL (http://www.embl.org) y del proyecto Ensembl (http://www.ensembl.org)).

Con el fin de obtener el alineamiento óptimo, se usa preferiblemente el programa BALST, con la matriz BLOSUM 62. Se pueden usar igualmente las matrices PAM o PAM250, así como una matriz de identidad para las secuencias de nucleótidos.

Para obtener una "hibridación específica" se usan preferiblemente las condiciones de hibridación muy restrictivas, es decir condiciones de temperatura y de fuerza iónica elegidas de forma que permitan mantener la hibridación específica y la selectividad entre los polinucleótidos complementarios.

A modo de ilustración, condiciones muy restrictivas de la etapa de hibridación con el fin de definir los polinucleótidos descritos anteriormente, son ventajosamente las siguientes: la hibridación ADN-ADN o ADN-ARN se realiza en dos etapas: (1) prehibridación a 42ºC durante 3 horas en tampón de fosfato (20 mM pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCl 0,15 M + citrato sódico 0, 015 M), formamida al 50%, dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, 10 x Denhardt's, sulfato de dextrano al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridación propiamente dicha durante 20 horas a una temperatura que depende del tamaño de la sonda (es decir: 42ºC, para una sonda de un tamaño superior a 100 nucleótidos) seguido de 2 lavados de 20 minutos a 20ºC en 2 x SSC + SDS al 2%, 1 lavado de 20 minutos a 20ºC en 0,1 x SSC + SDS al 0,1%. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + SDS al 0,1% durante 30 minutos a 60ºC, para una sonda de un tamaño superior a 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación muy restrictivas descritas anteriormente para una sonda de tamaño definido pueden ser adaptadas por el experto en la técnica para sondas de tamaño más grande o más pequeño.

Por "técnicas o procedimientos adecuados" se entiende aquí que se refiere a técnicas o procedimientos conocidos y usados habitualmente por el experto en la técnica y que se exponen en numerosos trabajos, como en particular el titulado Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press) [13].

El polinucleótido definido en c) presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% después del alineamiento óptimo con una secuencia como la definida en a) o b), preferiblemente 90%, de forma más preferible 95%, de forma todavía más preferible 98%. El polinucleótido definido en c) incluye los polinucleótidos variantes de la secuencia ID SEC Nº 1, es decir el conjunto de polinucleótidos correspondientes a las variantes alélicas, es decir a variaciones individuales de la secuencia ID SEC Nº 1. Estas secuencias variantes naturales corresponden a polimorfismos presentes en los mamíferos, en particular en el ser humano, y en concreto a polimorfismos que pueden conducir a la aparición de una patología, como por ejemplo la muerte celular de los islotes de Langerhans y una diabetes.

Igualmente por polinucleótido variante se entiende que se indica cualquier ARN o ADNc que resulten de una mutación y/o una variación de un sitio de empalme de la secuencia genómica cuyo ARNm tiene como ADN complementario el polinucleótido de la secuencia ID SEC Nº 1.

La similitud de una proteína en relación a una proteína de referencia se aprecia en función del porcentaje de restos de aminoácidos que son idénticos o que difieren por las sustituciones conservadoras, cuando se alinean las dos secuencias de forma que se obtenga la máxima correspondencia entre ellas. En el sentido de la presente invención, se entiende por sustitución conservadora, la sustitución de un aminoácido por otro que presenta propiedades químicas similares (tamaño, carga o polaridad), que en general no modifica las propiedades funcionales de la proteína.

En la presente invención, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos X% de similitud con una secuencia de referencia, se define como una proteína cuya secuencia puede incluir hasta 100-X alteraciones no conservadoras por 100 aminoácidos de la secuencia de referencia. En el sentido de la presente invención, la expresión alteraciones no conservadoras incluye deleciones, sustituciones no conservadoras o inserciones consecutivas o dispersas de aminoácidos en la secuencia de referencia.

En las proteínas definidas en (g) se incluyen las proteínas variantes de la secuencia ID SEC Nº 2, es decir las proteínas variantes codificadas por los polinucleótidos variantes como se han definido previamente, en particular las proteínas cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos una mutación que corresponde en concreto a un truncamiento, una deleción, una sustitución y/o una adición de al menos un resto de aminoácido en relación a la secuencia ID SEC Nº 2.

De forma preferible, las proteínas variantes presentan una mutación asociada a la diabetes o a la hiperinsuli-
nemia.

Según un modo de realización ventajoso del uso según la presente invención, dicho polinucleótido aislado como se define en (c), es un polinucleótido variante de la secuencia ID SEC Nº 1, que conlleva una mutación que conduce a una modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la secuencia ID SEC Nº 1.

Según otro modo de realización ventajoso del uso según la presente invención, dichos polinucleótidos aislados como se definen en (b) o en (d) se eligen entre las parejas de cebadores ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 27 (secuencia complementaria del ID SEC Nº 4) y la pareja de cebadores ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 6.

Según otro modo adicional de realización ventajoso del uso según la presente invención, dicho polinucleótido aislado se puede obtener por amplificación con ayuda de la pareja de cebadores definidos anteriormente.

Según otro modo adicional de realización ventajoso del uso según la presente invención, dicho polinucleótido como se define en (d) es un ARN interferente pequeño (ARNip) que por interacción con los ARNm correspondientes a dicho polinucleótido, conducirá a su degradación.

Según otro modo adicional de realización ventajoso del uso según la presente invención, dicha proteína como se define en (g) es una variante de la secuencia ID SEC Nº 2, que presenta una mutación asociada a la diabetes o a la hiperinsulinemia.

Según otro modo adicional de realización ventajoso del uso según la presente invención, dicho fragmento como se define en (f) presenta una secuencia elegida entre las secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10.

La presente invención también tiene por objeto un polinucleótido como se ha definido anteriormente, con excepción de:

- los fragmentos de al menos 15 nucleótidos consecutivos incluidos en las secuencias que tienen los números de acceso en la base de datos NCBI nº AX526723 (ID SEC Nº 11), nº AX526725 (ID SEC Nº 12) y nº AX526727 (ID SEC Nº 13),

- los EST que tienen los números de acceso en la base de datos GenBank BM565129 (ID SEC Nº 14), BM310003 (ID SEC Nº 15), BM875526 (ID SEC Nº 16), BG655918 (ID SEC Nº 17), BQ417284 (ID SEC Nº 18), BQ267316 (ID SEC Nº 19), BU072134 (ID SEC Nº 20), BQ267526 (ID SEC Nº 21), BQ270198 (ID SEC Nº 22), BU581447 (ID SEC Nº 23), BU070173 (ID SEC Nº 24), BQ631692 (ID SEC Nº 25) y BU949895 (ID SEC Nº 26), así como las secuencias que tienen los números de acceso en la base de datos NCBI AX526723 (ID SEC Nº 11), AX526725 (ID SEC Nº 12) y AX526727 (ID SEC Nº 13).

Los fragmentos según la invención se pueden usar en concreto como sondas o como cebadores para detectar/amplificar los polinucleótidos (ARN o ADN genómico) correspondientes al polinucleótido según la invención en otros organismos.

Preferiblemente, los pares de cebadores que se pueden usar según la invención son los que corresponden a los pares definidos por las secuencias ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4 y por las secuencias ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 6.

La invención tiene también por objeto los polinucleótidos que se pueden obtener por amplificación con ayuda de cebadores como los definidos anteriormente.

Según un modo de realización ventajoso del polinucleótido según la invención, se trata de un ARN interferente pequeño que corresponde al polinucleótido definido anteriormente, de un tamaño inferior a 30 nucleótidos, preferiblemente de un tamaño comprendido entre 20 y 23 nucleótidos, que por interacción con los ARNm correspondientes a dicho polinucleótido, conducirá a su degradación. Estos ARNip se pueden obtener por cualquier procedimiento conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, por síntesis química o por expresión a partir de un vector.

La invención abarca los oligonucleótidos homosentido correspondientes a los polinucleótidos de la invención, que por interacción con proteínas implicadas en la regulación de la expresión de dicho polinucleótido de la invención, inducirán una inhibición o una activación de esta expresión.

Las sondas y cebadores según la invención pueden marcarse de forma directa o indirecta con un compuesto radiactivo o no radiactivo por procedimientos conocidos para el experto en la técnica, con el fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

El marcaje de cebadores o de sondas según la invención se realiza con elementos radiactivos o con moléculas no radiactivas. Entre los isótopos radiactivos usados, se pueden citar ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{3}H o ^{125}I. Las entidades no radiactivas se seleccionan entre los ligandos tales como la biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, haptenos, colorantes, agentes luminiscentes tales como agentes radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes, fluorescentes y fosforecentes.

Los polinucleótidos según la invención se pueden usar, por lo tanto, como cebador y/o sonda en procedimientos que aplican concretamente la técnica de la PCR (amplificación en cadena de la polimerasa) (documento nº 4.683.202). Se pueden usar de forma ventajosa otras técnicas de amplificación del ácido nucleico objetivo como alternativa a la PCR. Actualmente existen numerosos procedimientos que permiten esta amplificación, como por ejemplo, la técnica de SDA (Strand Displacement Amplification) o técnica de amplificación por desplazamiento de hebra, la técnica TAS (Transcription-based Amplification System, sistema de amplificación basado en transcripción), la técnica 3SR (Self-Sustained Sequence Replication, Replicación autosostenida de secuencia), la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico), la técnica TMA (Transcription Mediated Amplification, amplificación mediada por transcripción), la técnica LCR (Ligase Chain Reaction, reacción en cadena por la ligasa), la técnica de RCR (Repair Chain Reaction, reacción de reparación en cadena), la técnica CPR (Cycling Probe Reaction, reacción de ciclación con sonda), la técnica de la amplificación por Q-beta-replicasa. Se puede citar también la PCR-SSCP que permite detectar mutaciones puntuales.

Estas técnicas son bien conocidas para el experto en la técnica.

Como sondas o como cebadores, los diferentes polinucleótidos de la invención permiten determinar el perfil de transcripción del gen correspondiente o una alteración eventual de este perfil en una muestra biológica, poner en evidencia el gen correspondiente, las variantes alélicas de ese gen o una eventual alteración funcional de ese gen (cambio sustancial de la actividad de la proteína codificada por dicho gen) que resulta de una mutación (inserción, deleción o sustitución) de uno o varios nucleótidos a nivel de al menos un exón de dicho gen. Dichas mutaciones incluyen en particular deleciones, inserciones o sustituciones no conservadoras a nivel de los codones que corresponden a restos de aminoácidos situados en un dominio esencial para la actividad biológica de la proteína.

Así pues, la invención tiene por objeto un procedimiento de determinación del perfil de transcripción del gen correspondiente al polinucleótido de la invención o de una alteración de dicho perfil, en una muestra biológica, que comprende una primera etapa de obtención de los ARN totales a partir de la muestra biológica, una segunda etapa de poner en contacto dichos ARN con una sonda marcada constituida por un polinucleótido según la invención en condiciones adecuadas de hibridación entre los ARN y la sonda y una tercera etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los híbridos formados.

Según un procedimiento de poner en práctica dicho procedimiento, la segunda etapa puede ser una etapa de retrotranscripción y/o amplificación de los transcritos realizados con ayuda de un par de cebadores como se han descrito previamente, y la tercera etapa, una etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los ácidos nucleicos amplificados formados.

Dicho procedimiento de determinación del perfil de transcripción del gen puede conllevar además una etapa de evaluación de la tasa de transcripción del gen en comparación con una muestra testigo previamente elegida y opcionalmente el estudio de su correlación con un fenotipo detectable, como por ejemplo la tasa de proinsulina convertida en insulina madura, el contenido de células con insulina, la tasa de insulina secretada en respuesta a una estimulación por la glucosa, la concentración intracelular o intravesicular de cinc o también la cantidad de proteína (producto génico) expresada en la superficie de la célula. Dicha muestra testigo puede estar constituida, por ejemplo, por una muestra biológica que presente una transcripción normal o alterada del gen correspondiente al polinucleótido de la invención, al que se aplica dicho procedimiento de determinación del perfil de transcripción del gen en las mismas condiciones.

La invención también tiene por objeto un procedimiento para poner en evidencia el gen correspondiente al polinucleótido de la invención o las variantes alélicas de dicho gen o una alteración funcional de ese gen, en una muestra biológica, que comprende una primera etapa de obtención por cualquier medio adecuado del ADN a partir de la muestra biológica, una segunda etapa de poner en contacto dichos ADN con una sonda marcada constituida por un polinucleótido según la invención en condiciones adecuadas de hibridación específica entre los ADN y la sonda, y una tercera etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los híbridos formados.

Según un modo ventajoso de poner en práctica dicho procedimiento, la segunda etapa puede ser una etapa de amplificación realizada con ayuda de un par de cebadores como se han descrito previamente y la tercera etapa, una etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los ácidos nucleicos amplificados formados. El procedimiento puede constar opcionalmente de una cuarta etapa de aislamiento y secuenciación de los ácidos nucleicos puestos en evidencia.

Este último procedimiento puede permitir también aislar un alelo del gen correspondiente al polinucleótido de la invención, asociado a un fenotipo detectable, como por ejemplo, una variación de la glucemia postprandial, la presencia o no de una secreción de insulina, la tasa de glucosa en la circulación o la insulina secretada en respuesta a una estimulación por la glucosa, y de una forma general a una patología de tipo diabetes de tipo I o II, o también a una anomalía del metabolismo de cinc. El cinc excretado en el transcurso de la liberación de insulina actúa en los canales de potasio responsables por medio de los canales de calcio, de esta exocitosis. Por lo tanto, hay un bucle de retrocontrol [14]. El polipéptido de la invención está implicado en la acumulación del cinc en las vesículas que contienen insulina, y se encuentra también en el curso de la exocitosis en la membrana plasmática. Por lo tanto, mutantes de la proteína podrían modificar la cantidad de cinc presente en las vesículas o la concentración pericelular de cinc, y por lo tanto modificar el estado de apertura del canal de potasio, conduciendo siguiendo el efecto de la mutación a una disminución o un aumento de la excreción de insulina (diabetes de tipo I o hiperinsulinemia). En este procedimiento particular, la muestra biológica será una muestra procedente de un individuo que exprese dicho fenotipo detectable.

Estos procedimientos, en particular los basados en la búsqueda de mutaciones en el gen, pueden permitir poner de manifiesto de forma preventiva una predisposición a la diabetes, o el diagnóstico de la diabetes o de cualquier enfermedad ligada a la diabetes, o la adaptación en términos de molécula o de posología del o de los tratamientos antidiabéticos.

La invención tiene igualmente por objeto un paquete de reactivos para llevar a cabo los procedimientos descritos previamente, que comprende:

a) al menos una sonda o un par de cebadores según la invención;

b) los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de hibridación entre dicha sonda y/o dichos cebadores y el ácido nucleico de la muestra biológica que se va a ensayar;

c) los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación;

d) los reactivos necesarios para la detección y/o dosificación del híbrido formado entre dicha sonda y el ácido nucleico de la muestra biológica o de los ácidos nucleicos amplificados formados.

Dichos paquetes de reactivos también pueden contener controles positivos o negativos con el fin de asegurar la calidad de los resultados obtenidos. También pueden contener los reactivos necesarios para preparar ácidos nucleicos a partir de la muestra biológica.

Otro objeto de la invención es un biochip de ADN que comprende al menos un polinucleótido según la invención.

Otro objetivo más de la invención es el uso de un polinucleótido como se ha definido anteriormente para preparar un biochip de ADN. El experto en la técnica, en función del soporte seleccionado, sabe elegir la técnica de realización adecuada para preparar dicho biochip, tal como por ejemplo por depósito de oligonucleótidos sobre soporte de vidrio o de nailon, sea por injerto químico o electroquímico de oligonucleótidos.

El polinucleótido de la invención se puede usar in vitro, como medio de estudio:

a) de la sobreexpresión del transportador (ZnT-8) en líneas de células modelo (por ejemplo insulinoma de rata INS-1), y del impacto en la secreción de insulina como respuesta a una estimulación por glucosa;

b) de la sensibilidad de las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans a la muerte celular (apoptosis) inducida por condiciones de estrés oxidante o de la concentración alta o baja de cinc;

c) de las etapas de diferenciación de células madre en células secretoras de insulina en respuesta a diferentes estimulaciones exógenas (factores de crecimiento, extractos pancreáticos).

La invención se refiere igualmente a la proteína codificada por el polinucleótido según la invención.

Por "proteína" se entiende, en el sentido de la presente invención, que se indica un encadenamiento preciso de aminoácidos, modificados o no, que constan o no de aminoácidos no naturales.

La proteína según al invención se obtiene a partir de una célula beta, por síntesis química, por técnicas de ADN recombinante, en concreto a partir de un vector de expresión que comprende un inserto constituido por el polinucleótido como se ha definido anteriormente.

La invención se refiere también al uso de un polinucleótido como se ha definido anteriormente, para producir una proteína ZnT-8 como se ha definido anteriormente.

La proteína según la presente invención, cuando se obtiene por síntesis química, se puede obtener por una de las numerosas vías de síntesis peptídica conocidas, por ejemplo con las técnicas que aplican fases sólidas o técnicas que usan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o por una síntesis en solución clásica. En este caso, la secuencia de la proteína se puede modificar con el fin de mejorar su solubilidad, en particular en disolventes acuosos. Dichas modificaciones son conocidas para el experto en la técnica, como por ejemplo, la deleción de dominios hidrófobos o la sustitución de aminoácidos hidrófobos por aminoácidos hidrófilos.

Preferiblemente, una proteína según la invención es una proteína que comprende o presenta la secuencia ID SEC Nº 2 (correspondiente a la proteína codificada por el gen ZnT-8).

La invención tiene también por objeto un fragmento de la proteína como se ha definido anteriormente, caracterizado porque se selecciona del grupo constituido por las secuencias ID SEC Nº7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10.

Otro objeto de la invención es un biochip de proteína que comprende una proteína o un fragmento de proteína como se ha definido anteriormente.

Otro objeto más de la invención es el uso de una proteína o de un fragmento de proteína como se ha definido anteriormente, para preparar un biochip de proteína. Como para los biochips de ADN, el experto en la técnica, en función del soporte elegido, sabe elegir la técnica de realización adecuada para preparar dicho biochip.

La proteína, el fragmento de proteína o el biochip de proteína como se han definido anteriormente, se pueden usar para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas, en el suero de un individuo.

La invención se refiere también al uso de la proteína o el fragmento de proteína como se han definido anteriormente, para mediciones por métodos inmunoquímicos e inmunoenzimáticos, así como para la búsqueda de anticuerpos dirigidos contra la proteína según la invención.

La invención también tiene por objeto un vector de clonación y/o de expresión, en el que se ha insertado el polinucleótido de la invención.

Dicho vector puede contener los elementos necesarios para la expresión y opcionalmente la secreción de la proteína en una célula huésped.

Dichos vectores constan preferiblemente de: un promotor, señales de iniciación y de terminación de la traducción, así como regiones adecuadas de regulación de la transcripción. Se deben poder mantener de forma estable en la célula y pueden comprender opcionalmente secuencias que codifican señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida, tal como por ejemplo, un promotor fuerte de naturaleza ubicua o un promotor selectivo de un tipo de célula y/o tejido particular, como por ejemplo el páncreas. Estas diferentes secuencias de control se eligen en función del huésped celular usado.

El polinucleótido según la invención se puede insertar en vectores de replicación autónoma en el seno del huésped elegido o de vectores integrantes del huésped elegido.

Entre los sistemas de replicación autónoma se usa preferiblemente, en función de la célula huésped, sistemas de tipo plasmídico o vírico. Los vectores víricos pueden ser en concreto adenovirus, retrovirus, lentivirus, poxvirus o virus del herpes. El experto en la técnica conoce las tecnologías que se pueden usar para cada uno de estos sistemas.

Cuando se desea la integración de la secuencia en los cromosomas de la célula huésped, se pueden usar, por ejemplo, sistemas de tipo plasmídico o vírico; dichos virus son, por ejemplo, retrovirus o virus asociados a adenovirus (virus adenoasociado o AAV).

Entre los vectores no víricos, se prefieren los polinucleótidos desnudos, tales como ADN o ARN desnudos, cromosomas artificiales de bacterias (BAC, bacterial artificiel chromosome), cromosomas artificiales de levaduras (YAC, yeast artificiel chromosome) para la expresión en la levadura, cromosomas artificiales de ratón (MAC, mouse artificial chromosome) para la expresión en células murinas y de forma preferible cromosomas artificiales del hombre (HAC human artificial chormosome) para la expresión en células humanas.

Dichos vectores se preparan según los procedimientos usados habitualmente por el experto en la técnica, y los vectores recombinantes resultantes se pueden introducir en el huésped adecuado por procedimientos estándar, tales como por ejemplo, lipofección, electroporación, choque térmico, transformación después de permeabilización química de la membrana y fusión celular.

La invención también tiene por objeto las células huésped modificadas, en concreto células eucariotas y procariotas, en las que se ha introducido al menos un polinucleótido según la invención o al menos un vector según la invención.

Entre las células que se pueden usar en el sentido de la presente invención, se pueden citar las células bacterianas, células de levadura, células animales, en particular células de mamíferos o también células vegetales. También se pueden citar células de insectos en las que se pueden usar procedimientos que aplican, por ejemplo, baculovirus.

La invención también tiene por objeto los organismos no humanos transgénicos, tales como animales o vegetales transgénicos, en los que todas o parte de las células contienen el polinucleótido según la invención o el vector de la invención, en forma libre o integrada.

Preferiblemente según la invención, los organismos no humanos transgénicos son los portadores de células que contienen un polinucleótido según la invención no funcional o portador de una mutación.

Según la invención, los animales transgénicos son preferiblemente mamíferos, más preferiblemente roedores, en particular ratones, ratas o conejos, y suidos, en particular el cerdo.

Los animales transgénicos se pueden obtener por cualquier procedimiento conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, por recombinación homóloga en células madre embrionarias, transferencia de estas células madre a embriones, selección de quimeras afectadas a nivel de líneas reproductoras y crecimiento de dichas quimeras.

Las células animales o vegetales transgénicas según la invención pueden así expresar o sobreexpresar el gen que codifica la proteína según la invención o su gen homólogo, o expresar dicho gen en el que se ha introducido la mutación.

Los animales transgénicos se pueden usar, por ejemplo, como modelos para el estudio de la etiología de la dia-
betes.

Los organismos transgénicos según la invención se pueden usar para la producción de la proteína según la invención.

La proteína según la invención se puede purificar según las técnicas conocidas para el experto en la técnica. Así pues, la proteína se puede purificar a partir de lisatos y extractos celulares, del líquido sobrenadante del medio de cultivo, por procedimientos usados individualmente o combinados, tales como fraccionamiento, procedimientos de cromatografía, técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos, etc. Preferiblemente, la proteína según la invención se purifica según un procedimiento que comprende una primera etapa de separación de las proteínas de membrana por centrifugación, seguido de una segunda etapa de purificación por inmunoafinidad según el procedimiento descrito por T.C. Thomas, M.G. McNamee, (Purification of membrane proteins. Section IX, pp 499-520, en Methods in Enzymology, Guide to Protein Purification, Editado por M.P. Deutscher, vol 182, Academic press, New-York, 1990'').

La invención también tiene por objeto un procedimiento de preparación de la proteína ZnT-8 recombinante, caracterizado porque comprende el cultivo de los modificados de la presente invención, en concreto las células de mamífero o células de organismos no humanos transgénicos según la invención, en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína, y la purificación de dicha proteína recombinante.

La invención tiene también por objeto una proteína, caracterizada porque se puede obtener por uno cualquiera de los procedimientos de preparación descritos anteriormente.

La proteína obtenida como se ha indicado anteriormente, se puede presentar tanto en forma glicosilada como no glicosilada y puede presentar o no la estructura terciaria de la proteína natural.

Los autores de la invención también han podido mostrar, mediante un estudio del potencial transmembrana, que la estructura secundaria de la proteína de la invención presenta 3 bucles de aminoácidos extracelulares (aminoácidos 96-106, 164-176, 241-245) contra los que se pueden producir anticuerpos monoclonales o policlonales.

La invención tiene también por objeto anticuerpos mono o policlonales, caracterizados porque son capaces de reconocer específicamente una proteína según la invención.

Preferiblemente, los anticuerpos reconocen específicamente la proteína del ID SEC Nº 2, sus fragmentos o las variantes de dicha proteína, como se han definido anteriormente.

De forma preferida, los anticuerpos según la invención reconocen específicamente los bucles extracelulares de la proteína según al invención, que corresponden a los ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8 e ID SEC Nº 10 (PEP1, PEP2 y PEP4) y/o un bucle intracelular de la proteína según la invención que corresponde al ID SEC Nº 9 (PEP3).

Los anticuerpos según la invención son, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fab o F(ab')2. También pueden presentarse en forma de inmunoconjugados o de anticuerpos marcados con el fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

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Dichos anticuerpos se pueden obtener directamente a partir del suero humano, o a partir del suero de animales inmunizados con las proteínas según la invención, en concreto las producidas por recombinación genética o por síntesis peptídica.

Los anticuerpos policlonales específicos se pueden obtener según los modos de operación habituales. Los anticuerpos monoclonales específicos se pueden obtener según el procedimiento clásico de cultivo de hibridomas.

Otro objeto de la invención es un biochip de proteína que comprende al menos un anticuerpo según la inven-
ción.

La invención se refiere también al uso de un anticuerpo según la invención para preparar un biochip de proteína que comprende dicho anticuerpo. El experto en la técnica sabe en función del soporte elegido, elegir la técnica de preparación adecuada para preparar dicho biochip.

La invención también tiene por objeto el uso de los anticuerpos o de un biochip de anticuerpo según la invención para detectar y/o purificar una proteína según la invención, preferiblemente los bucles extracelulares o intracelulares de dicha proteína, de forma preferida las secuencias correspondientes a los ID SEC Nº 7 a ID SEC Nº 10.

De forma general, los anticuerpos de la invención se pueden usar ventajosamente en cualquier situación en la que deba observarse la expresión de una proteína según la invención, normal o mutada.

En particular, los anticuerpos monoclonales se pueden usar para detectar estas proteínas en una muestra biológica. Constituyen, por lo tanto, un medio de análisis inmunocitoquímico o inmunohistoquímico de la expresión de proteínas según la invención, en concreto la proteína de secuencia ID SEC Nº 2, o una de sus variantes, en cortes de tejidos específicos. En general, para dichos análisis, los anticuerpos usados se marcan con el fin de que sean detectables, por ejemplo, con compuestos inmunofluorescentes, por marcaje con oro o en forma de inmunoconjugados
enzimáticos.

En concreto, pueden permitir poner de manifiesto una expresión anómala de estas proteínas en los tejidos o extracciones biológicas.

Los autores de la invención también describen un procedimiento de detección en una muestra biológica de la proteína ZnT-8, que comprende una primera etapa de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo según la invención, y una segunda etapa de poner de manifiesto por cualquier medio adecuado el complejo de antígeno-anticuerpo formado.

La invención también tiene por objeto un paquete de reactivos que permite llevar a cabo el procedimiento descrito anteriormente, que comprende:

a) al menos un anticuerpo monoclonal o policlonal según la invención;

b) los reactivos que permiten la detección del complejo de antígeno-anticuerpo producido durante la reacción inmunológica.

Según un modo de realización particular, el paquete de reactivos comprende opcionalmente reactivos para la constitución de un medio que permita la reacción inmunológica.

Los anticuerpos según la invención también pueden usarse para detectar y/o seleccionar islotes de Langerhans, preferiblemente células beta, a partir de páncreas humano o animal, en concreto páncreas de ratón, rata, conejo y cerdo. Esta selección se puede realizar con un equipo de citometría de flujo (FACS) en relación a las células aisladas. Para los islotes, su marcaje podría mejorar los procedimientos de separación actuales: separación por gradiente de densidad con Ficoll, Euro-Ficoll, Ficoll-diatrizoato sódico o el procedimiento de elección es un gradiente de albúmina sobre un separador de células.

Por lo tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento de selección de las células beta de islotes de Langerhans, que comprende una primera etapa de poner en contacto las células de una muestra biológica susceptible de contener dichos islotes y/o células con un anticuerpo según la invención, una segunda etapa de poner de manifiesto por cualquier medio adecuado las células marcadas por el anticuerpo y una tercera etapa de aislamiento por cualquier medio adecuado de las células marcadas.

Los anticuerpos según la invención se pueden usar también para seguir el proceso de diferenciación de las células madre en células beta de los islotes de Langerhans, en particular humanas o animales, así como para seleccionar las células que expresan la proteína ZnT-8, en particular la proteína de la secuencia ID SEC Nº 2 después de diferenciación.

Por lo tanto, también se describe un procedimiento para seguir el proceso de diferenciación de células madre en células del islote pancreático o en células beta, que comprende una etapa de poner en contacto las células de una muestra biológica susceptible de contener dichas células madre que se están diferenciando con un anticuerpo según la invención, una segunda etapa de poner de manifiesto por cualquier medio adecuado las células marcadas por el anticuerpo, y una tercera etapa de visualización por cualquier medio adecuado de las células marcadas.

Dicho procedimiento puede comprender además, una etapa complementaria de aislamiento por cualquier medio adecuado, de las células marcadas.

El polinucleótido, la célula, el organismo transgénico o el biochip de ADN según la invención, se pueden usar para el cribado de compuestos químicos o bioquímicos que pueden interactuar in vitro o in vivo, directa o indirectamente, con el polinucleótido según la invención y/o modular la expresión de dicho polinucleótido.

Por lo tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que puede interactuar in vitro o in vivo, directa o indirectamente con el polinucleótido según la invención, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con el polinucleótido, célula, organismo no humano transgénico o biochip de ADN según la invención, y una segunda etapa de detección del complejo formado entre el compuesto químico o bioquímico candidato y el polinucleótido, célula, organismo no humano transgénico o el biochip de ADN según la invención.

La invención también tiene por objeto un procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que pueda modular in vitro o in vivo, directa o indirectamente, la expresión del polinucleótido según la invención, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con el polinucleótido, célula, organismo no humano transgénico o biochip de ADN según la invención, y una segunda etapa de medición por cualquier medio adecuado de la expresión de dicho polinucleótido.

La proteína, célula, organismo transgénico o biochip de proteína según la invención, se pueden usar para el cribado de compuestos químicos o bioquímicos que puedan interactuar in vitro o in vivo, directa o indirectamente, con la proteína según la invención, y/o que puedan modular la expresión o la actividad de dicha proteína.

Por lo tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que pueda interactuar in vitro o in vivo, directa o indirectamente, con la proteína según la invención, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con la proteína, célula, organismo no humano transgénico o biochip de proteína según la invención, y una segunda etapa de detección del complejo formado entre el compuesto químico o bioquímico candidato y la proteína, célula, organismo no humano transgénico o el biochip de proteína según la invención.

La invención también tiene por objeto un procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que pueda modular in vitro o in vivo, directa o indirectamente, la expresión y/o la actividad de la proteína según la invención, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con la proteína, célula, organismo no humano transgénico o biochip de proteína según la invención, y una segunda etapa de medición por cualquier medio adecuado de la expresión y/o actividad de dicha proteína.

La invención también tiene por objeto el polinucleótido, la proteína, los anticuerpos, los vectores o las células transformados según la invención, como medicamentos.

El polinucleótido, la proteína, los anticuerpos, los vectores o las células transformados según la invención, pueden usarse en la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la diabetes, en particular la asociada con la presencia de al menos una mutación del gen correspondiente al ID SEC Nº 1, y/o con una expresión anómala de la proteína correspondiente al ID SEC Nº 2, o destinado a la prevención y/o al tratamiento de hiperinsulinemias cuando se observa una expresión, maduración o secreción anómala del gen de la insulina, o destinado a regular la maduración y la secreción de la insulina en las células beta o en células modificadas para la secreción de insulina, o destinado a regular los fenómenos de apoptosis de las células beta.

Una expresión anómala significa una sobreexpresión, una subexpresión o la expresión de una proteína mutada. Una maduración anómala significa una proteolisis ausente o insuficiente de la proinsulina en insulina o una cocristalización ausente, insuficiente o demasiado importante de la insulina y el cinc en las vesículas de secreción intracelulares.

La invención también tiene por objeto el uso de un polinucleótido, una proteína o un anticuerpo según la invención para determinar una variabilidad alélica, una mutación, una deleción, una pérdida de heterocigosis o cualquier anomalía genética del gen que codifica la proteína según la invención. Se pueden detectar las mutaciones en la secuencia del gen ZnT-8 directamente por análisis del ácido nucleico y de las secuencias según la invención (ADN genómico, ARN o ADNc), pero también mediante la proteína según la invención. En particular, el uso de un anticuerpo según la invención que reconoce un epítopo que lleva una mutación permite diferenciar una proteína "sana" de una proteína "asociada a una patología".

El experto en la técnica también sabe poner en práctica las técnicas que permiten el estudio de la alteración de la expresión de un gen, por ejemplo, por análisis del ARNm, en particular por transferencia Northern o por RT-PCR con sondas o cebadores según la invención, o por análisis de la proteína expresada, en particular por transferencia Western, usando los anticuerpos según la invención.

Además de las disposiciones precedentes, la invención comprende también otras disposiciones que saldrán de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos para llevar a cabo la invención, así como a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 ilustra el análisis por RT-PCR de la expresión tisular del ARN mensajero que codifica la proteína ZnT-8 (A) por comparación con la expresión del ARN mensajero ubicuo de la actina (B). 1: Cerebro, 2: Corazón, 3: Riñón, 4: Bazo, 5: Hígado, 6: Colon, 7: Pulmón, 8: Intestino delgado, 9: Músculo, 10: Estómago, 11: Testículo, 12: Placenta, 13: Glándulas salivares, 14: Tiroides, 15: Glándulas suprarrenales, 16: Páncreas, 17: Ovarios, 18: Útero, 19: Próstata, 20: Piel, 21: Leucocitos, 22: Médula ósea, 23: Cerebro fetal, 24: Hígado fetal. La expresión de dicho ARNm se detecta solo en el páncreas (pista 16).

La Figura 2 ilustra el análisis por RT-PCR de la expresión del ARN mensajero que codifica la proteína ZnT-8, en: una línea de insulinoma de rata (INS-1, pista 1), islotes pancreáticos humanos fetales (pista 2) y adultos (pista 3), por comparación con la línea de células epiteliales (línea Hela). El ARNm se detecta en la línea de insulinoma de rata y los islotes pancreáticos adultos y fetales, mientras que no se detecta ningún transcrito en las células epiteliales (línea Hela). Se utiliza como control el ARN mensajero de la actina.

La Figura 3 ilustra el análisis por microscopía de fluorescencia, de la localización de la proteína de fusión ZnT-8-GFP en células epiteliales (línea Hela) transfectadas. La fluorescencia se localiza en las vesículas intracitoplasmáticas, así como al nivel de la membrana plasmática.

La Figura 4 ilustra el análisis por microscopía de fluorescencia, de la localización de la proteína de fusión ZnT-8-GFP en células de insulinoma de rata (línea INS-1) transfectadas. La fluorescencia se localiza en vesículas de secreción que indican una función de ZnT-8 en la maduración y exocitosis de la insulina.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no la limitan de ninguna forma.

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Ejemplo 1

Clonación del ADNc que codifica la proteína Znt-8

El gen que codifica la proteína Znt-8, llamado gen Znt-8, se identificó por bioinformática, por búsqueda de los genes homólogos a los de la familia ZnT, usando las secuencias del genoma humano disponibles. El análisis de las secuencias genómicas ha permitido localizar y definir la organización intrón/exón del gen Znt-8.

El ADN que codifica ZnT-8 se amplificó por RT-PCR a partir del ARNm de islotes de páncreas humano preparados según la técnica de Kenmochi T. y col. (Pancreas, 2000, 20, 2, 184-90), con ayuda del par de cebadores (ID SEC Nº 5: 5'-ACTCTAGAATGGAGTTTCTTGAAAGAACGT A e ID SEC Nº 6: 5'-AATCTA GAGTCACAGGGGTCTTCA
CAGA), definido a partir de la secuencia del gen Znt-8.

De forma más precisa, los ARN totales se extrajeron a partir de los islotes, usando el kit "ARN extraction kit" (Roche) según las instrucciones del fabricante. Los ARN así obtenidos se dosificaron por medición de la absorbancia a 250 nm y se conservaron a -80ºC.

La amplificación se realizó usando el kit "Titan one tube RT-PCR kit" (Roche) según las instrucciones del fabricante y la pareja de cebadores ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 6. La transcripción inversa se realizó a 52ºC durante 30 min y después los ADN sintetizados se amplificaron por 30 ciclos (30 s a 94ºC, 30 s a 53ºC, 1 min a 72ºC) y una elongación final de 5 min a 72ºC. Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en gel de agarosa (1,5%) en presencia de bromuro de etidio y el producto de amplificación de 1123 pares de bases que comprende la secuencia de ADN que presenta la secuencia ID SEC Nº 1 se purificó con ayuda del kit Nucleic acid purification kit (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 2

Análisis de la expresión tisular del ARN mensajero que codifica la proteína Znt-8

La expresión del ARN mensajero que codifica la proteína Znt-8 se analizó por PCR con los ADNc comerciales preparados a partir de diferentes tejidos humanos usando los siguientes cebadores: ID SEC Nº 3: 5'-GAT GCT GCC CAC CTC TTA ATT GAC e ID SEC Nº 27: CCA AGA CCA GGA TGG TTT AGA TGA (secuencia complementaria del ID SEC Nº 4: 5'-TCA TCT TTT CCA TCC TGG TCT TGG). Los cebadores (ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 27) se eligieron en 2 exones diferentes para evitar la amplificación de una secuencia genómica. Los tejidos ensayados son: 1: Cerebro, 2: Corazón, 3: Riñón, 4: Bazo, 5: Hígado, 6: Colon, 7: Pulmón, 8: Intestino delgado, 9: Músculo, 10: Estómago, 11: Testículo, 12: Placenta, 13: Glándulas salivares, 14: Tiroides, 15: Glándulas suprarrenales, 16: Páncreas, 17: Ovario, 18: Útero, 19: Próstata, 20: Piel, 21: Leucocitos sanguíneos, 22: Médula ósea, 23: Cerebro fetal, 24: Hígado fetal.

De forma más precisa: se mezclaron 2 \mul de ADNc con los 2 cebadores específicos (1 \muM final) y una mezcla clásica de PCR (1 unidad de ADN polimerasa Taq, tampón con magnesio 1,5 mM, dNTP 10 mM). La amplificación se realizó mediante 30 ciclos (30 s a 94ºC, 30 s a 53ºC, 1 min a 72ºC) y una etapa final de elongación de 5 min a 72ºC. Los productos después se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (1,5%) en presencia de bromuro de
etidio.

Los resultados ilustrados por la figura 1 muestran que, por comparación con el ARN mensajero de la actina usado como control (figura 1B), el ARNm correspondiente al polinucleótido de la invención es expresado solamente en las células del páncreas (pista 16 de la figura 1A) pero no en las células de los 23 otros tejidos analizados (pistas 1 a 15 y 17 a 24 de la figura 1A).

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Ejemplo 3

Expresión del ARN mensajero correspondiente al polinucleótido de la invención en células de páncreas fetal y adulto y en una línea de insulinoma de rata (INS-1)

El análisis de la expresión del ARN mensajero que codifica la proteína ZnT-8 se realizó por RT-PCR a partir de ARN de diferentes tejidos humanos: islotes pancreáticos humanos adultos y fetales, línea de insulinoma de rata (INS-1; Asfari M. y col., Endocrinology, 1992, 130, 1, 167-78), por comparación con una línea de células epiteliales humanas (Hela), usada como control. Se lavaron 10^{6} células dos veces con tampón de fosfato (PBS) y después se centrifugaron 3 min a 2000 g. Los ARN totales se extrajeron como se ha descrito en el ejemplo 1 y la concentración de ARN se ajustó a 1 ng/\mul para ZnT-8 o 1 pg/\mul para el control de \beta-actina. Los transcritos se amplificaron y después los productos de amplificación se analizaron, como se ha descrito en el ejemplo 2.

Los resultados ilustrados por la figura 2, muestran que el ARN que codifica la proteína ZnT-8 es expresado en las células de los islotes pancreáticos humanos fetales y adultos y en una línea de insulinoma de rata (INS-1), pero no en una línea de células epiteliales (línea Hela).

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Ejemplo 4

Expresión de una proteína de fusión ZnT-8/GFP

La proteína es la proteína humana, codificada por el ADNc que corresponde a la secuencia ID SEC Nº 1 (ZnT-8). El producto de la PCR de 1123 pares de bases obtenido según el ejemplo 1, se hizo digerir con la enzima de restricción XbaI, y después se clonó en el vector pcDNA3.1-CT-GFP (Invitrogen), para dar el vector denominado pZnT-8-GFP que se verificó por secuenciación.

El vector pZnT-8-GFP se transfectó de forma transitoria en una línea de células epiteliales (Hela) y de forma estable en una línea de insulinoma de rata (INS-1).

Las células epiteliales HeLa (número ATCC CCL-2) se cultivaron en medio Opti-MEM (medio de Eagle modificado, Life Technologies) complementado con suero de ternero al 5% descomplementado y glutamina 2 mM. Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada enriquecida con CO_{2} al 5%.

Las células INS-1 se cultivaron en medio RPMI (Life Technologies) complementado con: suero de ternero fetal (10%), 2-mercaptoetan-1-ol (50 \muM), piruvato sódico (1 mM), HEPES (10 mM), L-glutamina (2 mM), penicilina 100 U/ml y estreptomicina (100 \mug/ml).

Las células cultivadas en las cajas de Petri de 35 mm se transfectaron con el vector pZnT-8-GFP (1 \mug de ADN por 10^{6} células), usando el reactivo Exgen500 (Euromedex) según las instrucciones del fabricante. Después de transfección con el vector pZnT-8-GFP, las células INS-1 se seleccionaron, se clonaron en el mismo medio que se añadió previamente de G418 400 \mug/ml, y después se observó la fluorescencia de los clones con un microscopio invertido de fluorescencia (Axiovert, Zeiss) usando los siguientes parámetros: longitud de onda de excitación: 450-490 nm; longitud de onda de emisión: 520 nm.

La expresión de la proteína de fusión ZnT-8-GFP en las células Hela, se analizó 48 horas después de la transfección, por observación de la fluorescencia como se ha indicado antes para los clones de las células INS-1 transfectadas de forma estable.

Los resultados ilustrados en la figura 3 (línea Hela) muestran que la proteína ZnT-8 está localizada en las vesículas intracitoplasmáticas, así como en la membrana plasmática; esta localización demuestra que la proteína ZnT-8 toma la vía de la excreción extracelular y se encuentra en la superficie de la célula.

Los resultados ilustrados en la figura 4 (línea INS-1) muestran que la proteína ZnT-8 está localizada en las vesículas de secreción de insulina; esta localización indica que ZnT-8 está implicada en la maduración de la insulina; además, en la medida en que esta experiencia se realiza en el estado basal (en ausencia de estimulación por la glucosa) la proteína estará igualmente presente sobre la membrana plasmática en el curso de la exocitosis de la insulina, después de estimulación por la glucosa.

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Ejemplo 5

Análisis de la secuencia de la proteína ZnT-8

El análisis de la secuencia primaria de ZnT-8 y la predicción de los dominios transmembrana se realizaron con los programas TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) y SOSUI (http://sosui.pro teome.bio.tuat.ac.jp/sosuimenu0.html).

La proteína ZnT-8 completa tiene 6 dominios transmembrana predichos (aminoácidos 74-95, 107-126, 141-163, 177-196, 216-240, 246-267), estando situados los extremos C y N terminales en el citoplasma.

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Ejemplo 6

Preparación de un anticuerpo policlonal dirigido contra los bucles extracelulares (PEP1, PEP2 y PEP4) y contra un bucle intracelular (PEP3) de ZnT-8

Los péptidos correspondientes a los epítopos que presentan las secuencias ID SEC Nº 7: PEP1: HIAGSLAVVT
DAAHLL; ID SEC Nº 8: PEP2: CERLLYPDYQIQATV; ID SEC Nº 9: PEP3: CLGHNHKEVQANASVR, ID SEC Nº 10: PEP4: YFKPEYKIADPIC se sintetizaron en fase sólida, según el procedimiento descrito originalmente por Merrifield y col. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) (1964), se purificaron y se conjugaron con una proteína transportadora (por ejemplo, albúmina). Los péptidos conjugados se inyectaron en conejos según el siguiente protocolo de inmunización:

D0: primera inmunización; D14: segunda inmunización; D28: tercera inmunización; D38: verificación de la especificidad; D56: cuarta inmunización; D66 y D80: recuperación del suero. El suero se puede usar directamente o después de purificación en columna de proteína A con una elución en medio ácido. Estas operaciones fueron realizadas por la sociedad Eurogentec SA, Bélgica.

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Ejemplo 7

Marcaje fluorescente del anticuerpo obtenido en el ejemplo 6

El anticuerpo se purifica por cromatografía de afinidad en una columna de proteína G (Pharmacia). La columna (1 ml) se equilibra con un tampón de fosfato sódico 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4, se carga con 5 ml de suero, y después se lava con 20 ml del mismo tampón para eluir las proteínas no fijadas. El anticuerpo después se desengancha con una solución de glicina, HCl 0,1 M, ph 2,5, y después se neutraliza con 40 \mul de tampón de Tris HCl 2 M, pH 10,0.

Se diluyen 2 mg de anticuerpo en 1 ml de tampón de fosfato, pH 8,0. Se prepara extemporáneamente una solución de NGS-FITC (SIGMA; 1 mg/ml en DMSO). Se mezclan 75 \mul de la solución de NHS-FITC con la solución de anticuerpo y después la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos. El anticuerpo marcado se purifica en columna PD-10 (PHARMACIA) de la siguiente forma: la columna se lava con 30 ml de PBS, se carga con 1 ml de la solución de anticuerpo marcado que se va a purificar, después con 5 ml de PBS y después se recogen fracciones de 2 ml; se conserva la segunda fracción que contiene el anticuerpo marcado.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el autor de la solicitud es sólo para la conveniencia del lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.

Documentos de patente citados en la descripción

WO 9117186 A

WO 0224733 A

US 4683202 A

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<110> COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE/UNIVERSITE JOSEPH FOURIER

{}\hskip1cm SEVE, Michel

{}\hskip1cm FAVIER, Alain

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<120> Proteína específica de células pancreáticas beta de los islotes de Langerhans y sus aplicaciones

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<130> CGA263S85

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<160> 27

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 1110

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip0,7cm

1

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<210> 2

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<211> 369

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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2

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3

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<210> 3

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 3

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<210>4

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<211> 24

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<212>ADN

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<213> Artificial

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<223> Cebador

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<400> 4

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<210> 5

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<210> 7

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<210> 9

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 1431

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<212> ADN

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<213> sin identificar

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 1623

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<212> ADN

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<400> 12

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<210> 13

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<212> ADN

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<213> sin identificar

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<210> 14

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<211> 592

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<221> misc_feature

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<222>(591)..(591)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 14

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<210> 20

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<211> 618

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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\hskip0,7cm

20

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<210> 21

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<211> 554

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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\hskip0,7cm

21

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<210> 22

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<211> 535

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

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\hskip0,7cm

22

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<210> 23

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<211> 474

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

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\hskip0,7cm

23

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<210> 24

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<211> 572

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (29)..(29)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 24

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\hskip0,7cm

24

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<210> 25

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<211> 443

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

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\hskip0,7cm

25

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<210> 26

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<211> 554

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

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\hskip0,8cm

26

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<210> 27

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 27

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\hskip0,8cm

27

Claims (38)

1. Uso como marcador específico de células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans de al menos un polinucleótido aislado o de la proteína correspondiente, elegido de:

- los polinucleótidos que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (a) la secuencia ID SEC Nº 1, (b) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 1 de al menos 15 nucleótidos consecutivos, (c) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% después de alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (a) o en (b), y (d) una secuencia complementaria, homosentido o antisentido de una de las secuencias definidas en (a), (b) o (c), y

- las proteínas codificadas por los polinucleótidos definidos en (a), (b), (c) o (d) anteriores, que comprenden o presentan una de las siguientes secuencias: (e) la secuencia ID SEC Nº 2, (f) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 2 de al menos 15 aminoácidos consecutivos, (g) una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 60% después de alineamiento óptimo con una de las secuencias definidas en (e) o en (f), preferiblemente 80% de identidad, o de forma todavía más preferida 90% de identidad.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polinucleótido aislado como se define en c), es un polinucleótido variante de la secuencia ID SEC Nº 1 que consta de una mutación que conduce a una modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la secuencia ID SEC Nº 1.

3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polinucleótido aislado como se define en b) o en d) se elige entre la pareja de

\hbox{cebadores ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 27 y la pareja de
cebadores ID SEC Nº  5 e ID SEC Nº 6.}

4. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polinucleótido aislado se puede obtener por amplificación con ayuda de la pareja de cebadores definidos en la reivindicación 3.

5. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polinucleótido como se define en (d) es un ARN interferente pequeño (ARNip) que por interacción con los ARNm correspondientes a dicho polinucleótido, conducirá a su degradación.

6. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteína como se define en (g) es una variante de la secuencia del ID SEC Nº 2 que presenta una mutación asociada a la diabetes o a la hiperinsulinemia.

7. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento como se define en (f) presenta una secuencia elegida de las secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10.

8. Polinucleótido aislado, caracterizado porque se puede usar según la reivindicación 1, y porque comprende o presenta una secuencia elegida de:

(a) la secuencia ID SEC Nº 1,

(b) un fragmento de la secuencia ID SEC Nº 1 de al menos 20 nucleótidos consecutivos,

(c) una secuencia complementaria, homosentido o antisentido de una de las secuencias definidas en (a) o (b),

excepto los fragmentos de al menos 15 nucleótidos consecutivos incluidos en las secuencias que tienen los números de acceso en la base de datos NCBI nº AX526723 (ID SEC Nº 11), nº AX526725 (ID SEC Nº 12) y nº AX526727 (ID SEC Nº 13), las secuencias EST que tienen los números de acceso en la base de datos GenBank BM565129 (ID SEC Nº 14), BM310003 (ID SEC Nº 15), BM875526 (ID SEC Nº 16), BG655918 (ID SEC Nº 17), BQ417284 (ID SEC Nº 18), BQ267316 (ID SEC Nº 19), BU072134 (ID SEC Nº 20), BQ267526 (ID SEC Nº 21), BQ270198 (ID SEC Nº 22), BU581447 (ID SEC Nº 23), BU070173 (ID SEC Nº 24), BQ631692 (ID SEC Nº 25) y BU949895 (ID SEC Nº 26) así como las secuencias que tienen los números de acceso en la base de datos NCBI AX526723 (ID SEC Nº 11), AX526725 (ID SEC Nº 12) y AX526727 (ID SEC Nº 13).

9. Sonda para detectar, identificar o dosificar los ácidos nucleicos correspondientes a los polinucleótidos como se definen en la reivindicación 1, caracterizada porque está constituida por un polinucleótido según la reivindicación 8.

10. Pajera de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos que se pueden usar según la reivindicación 1, caracterizados porque se elige de las parejas de cebadores como se definen en la reivindicación 3.

11. Polinucleótido aislado que se puede usar según la reivindicación 1, que se puede obtener por amplificación con ayuda de los cebadores según la reivindicación 10.

12. Polinucleótido según la reivindicación 8, caracterizado porque se trata de un ARN interferente pequeño correspondiente al polinucleótido como se define en la reivindicación 1, que por interacción con los ARNm correspondientes a dicho polinucleótido, conducirá a su degradación.

13. Procedimiento de determinación del perfil de transcripción del gen correspondiente al polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, o de una alteración de dicho perfil, en una muestra biológica, que comprende una primera etapa de obtención por cualquier medio adecuado de los ARN a partir de la muestra biológica, una segunda etapa de poner en contacto dichos ARN con una sonda marcada constituida por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 u 11 en las condiciones de hibridación adecuadas entre los ARN y la sonda, y una tercera etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los híbridos formados.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en la que la segunda etapa es una etapa de retrotranscripción y/o de amplificación de los transcritos, realizada con ayuda de una pareja de cebadores según la reivindicación 10, y la tercera etapa es una etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los ácidos nucleicos amplificados.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque consta además de una etapa de evaluación de la tasa de transcripción del gen por comparación con un testigo previamente elegido.

16. Procedimiento para poner de manifiesto el gen correspondiente al polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, o las variantes alélicas de dicho gen o una alteración funcional de este gen, en una muestra biológica, que comprende una primera etapa de obtención por cualquier medio adecuado del ADN a partir de la muestra biológica, una segunda etapa de poner en contacto dichos ADN con una sonda marcada constituida por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 u 11, en las condiciones adecuadas de hibridación entre los ADN y la sonda, y una tercera etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los híbridos
formados.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en la que la segunda etapa es una etapa de amplificación realizada con ayuda de una pareja de cebadores según la reivindicación 10, y la tercera etapa es una etapa de revelado por cualquier medio adecuado de los ácidos nucleicos amplificados formados.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque consta además de una etapa de aislamiento y de secuenciación de los ácidos nucleicos puestos de manifiesto.

19. Paquete de reactivos para llevar a cabo los procedimientos según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende:

a) al menos una sonda según la reivindicación 9 y/o una pareja de cebadores según la reivindicación 10;

b) los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de hibridación entre dicha sonda y/o dichos cebadores y el ácido nucleico de la muestra biológica;

c) los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación;

d) los reactivos necesarios para detectar y/o dosificar el híbrido formado entre dicha sonda y el ácido nucleico de la muestra biológica o de los ácidos nucleicos amplificados formados.

20. Biochip de ADN que comprende al menos un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11.

21. Uso de un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, para preparar un biochip de ADN.

22. Uso in vitro del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, como medio de estudio:

a) de la sobreexpresión del transportador codificado por el polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, en las líneas de células modelo, y del impacto en la secreción de insulina en respuesta a una estimulación por la glucosa;

b) de la sensibilidad de las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans a la muerte celular (apoptosis) inducida por condiciones de estrés oxidante o la concentración débil o fuerte de cinc;

c) de las etapas de diferenciación de las células madre en células secretoras de insulina en respuesta a diferentes estimulaciones exógenas.

23. Vector de clonación y/o de expresión, caracterizado porque comprende un inserto constituido por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12.

24. Célula modificada por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, o un vector según la reivindicación 23.

25. Organismos no humanos transgénicos, caracterizados porque todas o parte de sus células contienen un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, o un vector según la reivindicación 23, en forma libre o integrada.

26. Uso de una célula modificada según la reivindicación 24, o de un organismo no humano transgénico según la reivindicación 25, para la producción de una proteína o de un fragmento de proteína codificado por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, elegido de las secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10.

27. Procedimiento de preparación de una proteína o de un fragmento de proteína codificada por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, o elegida de las secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10, caracterizado porque comprende el cultivo de células modificadas según la reivindicación 24, en concreto células de mamífero, o células de organismos no humanos transgénicos como se definen en la reivindicación 25, en las condiciones que permiten la expresión de dicha proteína y la purificación de dicha proteína recombinante.

28. Uso de un anticuerpo mono o policlonal específico de la proteína de ID SEC Nº 2, para detectar y/o seleccionar islotes de Langerhans o células beta.

29. Uso de un anticuerpo mono o policlonal específico de la proteína de ID SEC Nº 2, para analizar la diferenciación de células madre en células de islote pancreático, preferiblemente en células beta.

30. Procedimiento de selección de células beta de los islotes de Langerhans, que comprende una primera etapa de poner en contacto las células de una muestra biológica que puede contener dichos islotes y/o células con un anticuerpo mono o policlonal específico de la proteína de ID SEC Nº 2, una segunda etapa de poner de manifiesto por cualquier medio adecuado las células marcadas por el anticuerpo, y una tercera etapa de aislamiento por cualquier medio adecuado de las células marcadas.

31. Procedimiento de análisis de la diferenciación de células madre en células de islote pancreático o en células beta, que comprende una etapa de poner en contacto las células de una muestra biológica que puede contener dichas células madre en el proceso de diferenciación con un anticuerpo mono o policlonal específico de la proteína de ID SEC Nº 2, una segunda etapa de poner de manifiesto por cualquier medio adecuado las células marcadas por el anticuerpo y una tercera etapa de visualización por cualquier medio adecuado de las células marcadas.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, que comprende además una etapa complementaria de aislar por cualquier medio adecuado las células marcadas.

33. Procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que pueda interactuar in vitro o in vivo, directa o indirectamente con el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 u 11, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 u 11 o una célula según la reivindicación 24 o un organismo no humano transgénico según la reivindicación 25, o un biochip de ADN según la reivindicación 20, y una segunda etapa de detección del complejo formado entre el compuesto químico o bioquímico candidato y el polinucleótido o la célula o el organismo no humano transgénico o el biochip de ADN.

34. Procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que puede modular in vitro o in vivo, directa o indirectamente la expresión del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 u 11, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 u 11 o una célula según la reivindicación 24 o un organismo no humano transgénico según la reivindicación 25, o un biochip de ADN según la reivindicación 20, y una segunda etapa de medición por cualquier medio adecuado de la expresión del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 u 11.

35. Procedimiento de cribado de un compuesto químico o bioquímico que puede tener uso potencial para el tratamiento de la diabetes y de la hiperinsulinemia, caracterizado porque comprende una primera etapa de poner en contacto un compuesto químico o bioquímico candidato con una proteína o un fragmento de proteína codificada por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, o elegido de las secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10, o una célula según la reivindicación 24 o un organismo no humano transgénico según la reivindicación 25, y una segunda etapa de detección del complejo formado entre el compuesto químico o bioquímico candidato y la proteína o la célula o el organismo no humano transgénico.

36. Medicamento que comprende un producto elegido de los polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, las proteínas o fragmentos de proteína codificadas por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, los polipéptidos de secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10, los anticuerpos específicos de la proteína de ID SEC Nº 2, los vectores según la reivindicación 23 y las células modificadas según la reivindicación 24.

37. Uso de un producto elegido de: los polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, las proteínas o fragmentos de proteína codificadas por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, los polipéptidos de secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10, los anticuerpos específicos de la proteína de ID SEC Nº 2, los vectores según la reivindicación 23 y las células modificadas según la reivindicación 24, para preparar un medicamento dirigido a la prevención y/o al tratamiento de la diabetes, en particular a la asociada con la presencia de al menos una mutación del gen correspondiente al ID SEC Nº 1, y/o una expresión anómala de la proteína correspondiente al ID SEC Nº 2, o dirigido a la prevención y/o al tratamiento de hiperinsulinemias cuando se observa una expresión, una maduración o una secreción anómalas del gen de la insulina o dirigido a regular la maduración y/o la secreción de insulina en las células beta o en las células modificadas en vista de una secreción de insulina, o dirigido a regular los fenómenos de apoptosis de células beta.

38. Uso de un producto elegido de: los polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, las proteínas o fragmentos de proteína codificadas por un polinucleótido según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, los polipéptidos de secuencias ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 8, ID SEC Nº 9 e ID SEC Nº 10, los anticuerpos específicos de la proteína de ID SEC Nº 2, para determinar una variabilidad alélica, una mutación, una deleción, una pérdida de heterocigosis o cualquier anomalía del gen que codifica dicha proteína.